TWI837156B - 新穎的cd137及pd-l1特異性融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本發明提供CD137與PD-L1兩者之特異性融合蛋白，該融合蛋白可用於以PD-L1標靶依賴性方式共同刺激淋巴細胞活化。此融合蛋白可在許多醫藥應用中使用，舉例而言，作為抗癌劑及/或免疫調節劑，用於治療或預防人類疾病，如許多類的腫瘤。本發明亦有關製備本文所述融合蛋白以及包含此類融合蛋白之組合物的方法。本發明進一步有關編碼此類融合蛋白的核酸分子，以及有關用於產生此類融合蛋白與核酸分子的方法。此外，本申請案揭示此類融合蛋白以及包含一或多個此類融合蛋白之組合物的治療及/或診斷用途。

Description

新穎的CD137及PD-L1特異性融合蛋白
本發明係關於新穎的CD137及PD-L1特異性融合蛋白。
計畫性死亡配體1或PD-L1 (亦稱作分化叢集274或CD274與B7同源物1或B7-H1)為一單程第I型膜蛋白，其隸屬抗原呈遞之共同刺激/共抑制分子之B7家族。PD-L1之細胞外部分含有二個結構域，一N端IgV型結構域與一IgC型結構域。PD-L1具有短的細胞質結構域而無任何明顯的信號轉導模體，這導致最初相信，作為受體，PD-L1沒有內在傳訊。然而，最近的數據顯示，PD-L1之細胞質結構域含有非典型的傳訊模體保留，能抑制干擾素(IFN)傳導且保護癌細胞免於IFN細胞毒性(Gato-Canas et al.,Cell Rep , 2017)。
PD-L1在懷孕、慢性感染、組織同種異體移植、自體免疫性疾病、及癌症過程的免疫系統抑制作用中扮演重要角色。PD-L1在多類細胞中表現，包括B細胞、T細胞、巨噬細胞、髓樣樹突狀細胞、肥大細胞、上皮細胞、及血管內皮細胞。其亦在數類癌症中表現，包括但不侷限於，黑素瘤、肺癌、膀胱癌、結腸癌、及乳癌。高PD-L1表現含量與增加的腫瘤侵襲性相關聯，其係利用介導腫瘤浸潤性T細胞的衰竭與無反應性、免疫抑制性細胞激素的分泌、及防止遭受細胞毒性T細胞的裂解。
PD-L1為計畫性細胞死亡蛋白1 (PD-1)之配體，PD-1為一關鍵免疫檢查點抑制受體，主要表現在活化的T細胞上，亦可在免疫系統之其他細胞上表現，包括B細胞與單核細胞。PD-1為免疫球蛋白家族的成員，其含有類IgV細胞外結構域、跨膜結構域、及具備ITIM (基於免疫受體酪胺酸之抑制模體模體)與ITSM (基於免疫受體酪胺酸之開關模體)的細胞質尾端。PD-1與PD-L1之結合導致將含有src同源體2結構域之酪胺酸去磷酸酶1與2 (SHP 1與2)募集至細胞內PD-1開關模體及CBL家族之E3泛素連接酶的表現。彼等泛素連接酶隨後泛素化並使關鍵TCR信號傳導介質失活，導致從細胞表面移除TCR (Karwacz et al.,EMBO Mol Med , 2011)。SHP 1與SHP 2去磷酸酶利用終止ZAP70與PI3K磷酸化而直接抑制TCR傳訊。此外，PD-L1與PD-1結合可導致藉由影響CK2與周期蛋白依賴型激酶(CDKs)之表現與活性而抑制TCR傳訊途徑(Arasanz et al.,Oncotarget , 2017)。亦有報導顯示，PD-1的結合導致T細胞代謝從增加的醣解作用中重新編程，其為產生效應子功能所需能量至脂肪酸β-氧化作用(其與長壽細胞相關聯)所需。此亦可解釋高PD-1表現細胞在慢性感染與癌症病患中的存活力與持久性(Patsoukis et al.,Nat Commun , 2015)。
利用抗PD-1或抗PD-L1標靶試劑阻斷PD-1/PD-L1交互作用，可逆轉免疫檢查點功能及釋放對T細胞反應的阻斷反應。目前有三個PD-L1抗體，阿特珠單抗(atezolizumab)(TECENTRIQ，MPDL3280A，RG7466)、阿維魯單抗(avelumab)(BAVENCIO，MSB0010718C)、及度伐魯單抗(durvalumab) (IMFINZI，MEDI4736)，經批准用於治療癌症。數項使用彼等抗體的成功臨床試驗顯示，在膀胱癌、皮膚癌、及肺癌中有高的客觀反應率、反應持久性、或改進的存活率(Xu-Monette et al.,Front Immunol , 2017)。
分化叢集137或CD137 (亦稱作4-1BB或TNFRS9)為一共同刺激性免疫受體及腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族之成員。其主要表現在經活化之CD4+與CD8+ T細胞、經活化之B細胞、及天然殺手(NK)細胞，但亦可在靜息之單核細胞與樹突狀細胞(Li and Liu,Clin Pharmacol , 2013)，或內皮細胞(Snell et al.,Immunol Rev , 2011)中發現。CD137在調節免疫反應中扮演重要作用，因此是癌症免疫療法的標靶。CD137配體(CD137L)為CD137之唯一習知天然配體，且組成性表現在數類抗原存在細胞中，如經活化之B細胞、單核細胞、及脾臟樹突狀細胞，且可在T淋巴球中誘導。
CD137L為三聚體蛋白，其以膜結合形式及可溶性變體形式存在。可溶性CD137L在表現CD137之淋巴球上活化CD137的能力受限，需要高濃度才能產生效用(Wyzgol et al.,J Immunol , 2009)。活化CD137的天然方法為通過CD137陽性細胞與CD137L陽性細胞的結合。接著認為，CD137之活化作用為在相對細胞上通過CD137L之叢集而誘導，導致經由TRAF1、2、及3傳訊(Yao et al.,Nat Rev Drug Discov , 2013, Snell et al.,Immunol Rev , 2011)且在CD137陽性T細胞中另外附加下游效用。在藉由辨識其各別同源靶標而活化T細胞之情況下，利用共同刺激CD137而引起的效用為進一步增強的活化作用、增強的存活率與增殖、促炎性細胞激素的產生、及改進的殺傷能力。
在許多體內模型中已經證實了CD137共同刺激對消除癌細胞的益處。CD137L在腫瘤上的強力表現，舉例而言，導致腫瘤排斥(Melero et al.,Eur J Immunol , 1998)。同樣地，抗CD137 scFv在腫瘤上的強力表現，導致CD4+ T細胞與NK細胞依賴性腫瘤消除(Yang et al.,Cancer Res , 2007, Zhang et al.,Mol Cancer Ther , 2006, Ye et al.,Nat Med , 2002)。亦證實，全身性投予抗CD137抗體可導致腫瘤生長遲緩(Martinet et al.,Gene Ther , 2002)。
據報導顯示，CD137為人類腫瘤中天然存在之腫瘤反應性T細胞的極佳標記(Ye et al.,Clin Cancer Res , 2014)，且抗CD137抗體可用於改進CD8+ 黑色素瘤浸潤性淋巴球的擴增與活性，以用於過繼性T細胞治療(Chacon et al.,PLoS One , 2013)。
CD137共同刺激在臨床前的潛在治療益處論證，刺激了靶向CD137之治療性抗體的開發，包括BMS-663513 (描述於美國專利號7,288,638)與PF-05082566 (Fisher et al.,Cancer Immunol Immunother , 2012)。
本發明提供一新穎方法，其經由一或多個具有CD137結合特異性及PD-L1結合特異性的融合蛋白同時結合CD137與PD-L1。定義
下表定義本說明書中使用的術語、短語、及縮寫。本文列出與定義之所有術語係旨在涵蓋所有語法形式。
除非另有說明，本文中使用的「CD137」意指人類CD137 (huCD137)。人類CD137意指如UniProt Q07011定義之全長蛋白、其片段、或其變體。CD137亦稱作4-1BB、腫瘤壞死因子受體超家族成員9 (TNFRSF9)、及淋巴球活化誘導(ILA)。在一些特定具體實施例中，使用非人類物種的CD137，如食蟹猴CD137與小鼠CD137。
除非另有說明，本文中使用的「計畫性細胞死亡1配體1」或「PD-L1」意指人類PD-L1 (huPD-L1)。人類PD-L1意指如UniProt Q9NZQ7定義之全長蛋白、其片段、或其變體。人類PD-L1係由CD274 基因編碼。PD-L1亦稱作分化叢集 274 (CD274)或B7同源物1 (B7-H1)。在一些特定具體實施例中，使用非人類物種的PD-L1，如食蟹猴PD-L1與小鼠PD-L1。
本文中使用的「結合親和力」說明本發明生物分子(如，多胜肽或蛋白質，例如，脂質運載蛋白(lipocalin)突變蛋白、抗體、融合蛋白、或任何其他胜肽或蛋白質)結合所選標靶並形成複合體的能力。結合親和力係利用本領域技術人員已知之許多方法測定，包括但不侷限於，螢光滴定法、酵素免疫吸附分析法(ELISA)為主之試驗，包括直接競爭型ELISA、熱量法，如等溫滴定熱量法(ITC)及表面電漿共振法(SPR)。彼等方法在本領域中完整建立，且本文將進一步說明此類方法的一些實例。利用彼等方法測定，結合親和力從而報導為解離常數(KD )、半最大有效濃度(EC50 )、或半最大抑制濃度(IC50 )等數值。較低的KD 、EC50 、或IC50 值反映出較好的(較高的)結合能力(親和力)。據此，可測定與比較二生物分子對一所選標靶的結合親和力。當比較二生物分子對所選標靶的結合親和力時，術語「約相同」、「實質上相同」、或「實質上類似」意指一生物分子所具有的結合親和力，其以KD 、EC50 、或IC50 值報導，在結合親和力測定之實驗變異性範圍內與另一分子相同或類似。結合親和力測定之實驗變異性取決於所使用之特定方法，且為本領域技術人員已知。
本文中使用的術語「實質上」亦可指表現出感興趣之特徵或性質之全部或幾乎全部範圍或程度的定性條件。生物學領域之普通技術人員應理解到，生物學及化學現像，若有的話，很少完成及/或進行至完成或達到或避免絕對結果。因此，術語「實質上」在本文中用於擷取許多生物學及化學現像中固有的潛在完整性缺乏情況。
本文中使用的術語「檢測」、「檢測出」、「可檢測」、或「探測」 可在定量與定性程度及其組合上理解。因此，其包括對本發明生物分子進行的定量、半定量、及定性的測定。
本文中使用的「可檢測之親和力」一般而言意指生物分子與其標靶之間的結合能力，其以KD 、EC50 、或IC50 值報導，係至多約10-5 M或更低。結合親和力，其以KD 、EC50 、或IC50 值報導，高於10-5 M者一般而言不再以ELISA與SPR等常規方法測定，因此具有次要重要性。
應注意到，本發明生物分子與其標靶之間形成的複合物受許多不同因素影響，如個別標靶濃度、競爭劑存在、所使用緩衝液系統之pH值與離子強度、用於決定結合親和力之實驗方法(如，螢光滴定法、競爭性ELISA (亦稱作競爭ELISA)、及表面電漿共振)、及用於評估實驗數據之數學演算法。因此，本領域技術人員清楚的是，利用KD 、EC50 、或IC50 值報導的結合親和力，可在一特定實驗範圍內變化，其取決於方法與實驗設置。此意味，所測得的KD 、EC50 、或IC50 值或容許限度可能略有偏差，其取決於這些值是否由ELISA (包括直接或競爭ELISA)、SPR、或另一方法確定。
本文中使用的「特異性」、「特異性結合」、「 特異地結合」、或「結合特異性」係有關生物分子在所需標靶(如，CD137與PD-L1)與一或多個參考標靶(如，嗜中性球明膠酶相關聯之脂質運載蛋白的細胞受體)之間的區分能力。應理解的是，此特異性並非絕對性質，而是相對性質，且可依據，例如，SPR、西方墨點法、ELISA、螢光活化細胞分選法(FACS)、放射線免疫試驗(RIA)、電化學放光法(ECL)、免疫放射分析法(IRMA)、免疫組織化學法(IHC)、及胜肽掃描分析而定。
當本文中之本發明融合蛋白結合至CD137與PD-L1時，術語「特異性」、「特異性結合」、「 特異地結合」、或「結合特異性」意指融合蛋白結合至、反應於、或針對CD137與PD-L1，如本文所述，但基本上不結合另一蛋白質。術語「另一蛋白質」包括任何非CD137或PD-L1，或是與CD137或PD-L1蛋白緊密相關或同源之蛋白質。然而，術語「另一蛋白質」未排除人類以外物種的CD137或PD-L1及CD137或PD-L1之片段及/或變體。術語「基本上不結合」意指本發明之融合蛋白以比CD137及/或PD-L1更低之結合親和力結合另一蛋白，亦即，顯示交叉反應性小於30%，較佳地20%，更佳地10%，特別較佳地小於9、8、7、6、或5%。可易於測試融合蛋白是否如本文前面所定義的特異地反應，尤其是藉由比較本發明融合蛋白與CD137及/或PD-L1的反應，以及該融合蛋白與其他蛋白質的反應。
本文中使用的術語「脂質運載蛋白」意指一分子量約18-20 kDa的蛋白質單體，其具有圓柱形β折疊片型超二級結構區域，該區域包含複數個β股(較佳地A到H等八個β鏈)，其藉由複數個(較佳地四個)圈環在一端成對連接，從而包含一配體結合袋點，並定義配體結合袋點入口。較佳地，本發明所使用含有配體結合袋點的圈環，為連接β股A與B、C與D、E與F、及G與H之開放端的圈環，並稱作圈環AB、CD、EF、及GH。習知，在其他剛性脂質運載蛋白骨架中，該圈環之多樣性在脂質運載蛋白家族成員中，產生多個不同結合模式，每一者能容納不同大小、形狀、及化學性質之標靶(回顧，如Skerra,Biochim Biophys Acta , 2000；Flower et al.,Biochim Biophys Acta , 2000；Flower,Biochem J , 1996)。應理解到，脂質運載蛋白家族的蛋白質自然演化以結合多種配體，通常共有低程度之整體序列保留性(序列一致性常小於20%)，但保有高度保留性之整體折疊特性。對本領域技術人員而言，多個脂質運載蛋白之位置間之對應關係亦已知(請見，如美國專利號7,250,297)。如本文所使用的，落入「脂質運載蛋白」定義中之蛋白質包括但不侷限於，人類脂質運載蛋白，包括淚液脂質運載蛋白(Tlc、Lcn1)、脂質運載蛋白-2 (Lcn2)、或嗜中性球明膠酶相關聯之脂質運載蛋白(NGAL)、脂蛋白元D (ApoD)、脂蛋白元M、α1 -酸醣蛋白1、α1 -酸醣蛋白2、α1 -微球蛋白、補體成分8γ、視黃醇結合蛋白(RBP)、附睾視黃酸結合蛋白、免疫抑制性醣蛋白(glycodelin)、氣味結合蛋白IIa、氣味結合蛋白IIb、脂質運載蛋白-15 (Lcn15)、及前列腺素D合成酶。
除非另有說明，本文中使用的「淚液脂質運載蛋白」意指人類淚液脂質運載蛋白(hTlc)且進一步意指成熟人類淚脂質運載蛋白。當術語「成熟型」用於確認一蛋白質時，意指蛋白質基本上無傳訊胜肽。本發明之「成熟型hTlc」意指成熟型之人類淚液脂質運載蛋白，其不具有傳訊胜肽。成熟型hTlc係以登錄在SWISS-PROT Data Bank之登錄號P31025的殘基19-176序列說明，且其胺基酸以SEQ ID NO: 1表示。
本文中使用的「脂質運載蛋白-2」或「嗜中性球明膠酶相關聯之脂質運載蛋白」意指人類脂質運載蛋白-2 (hLcn2)或人類嗜中性球明膠酶相關聯之脂質運載蛋白(hNGAL)，且進一步意指成熟人類脂質運載蛋白-2或成熟人類嗜中性球明膠酶相關聯之脂質運載蛋白。當術語「成熟型」用於確認一蛋白質時，意指蛋白質基本上無傳訊胜肽。本發明之「成熟型hNGAL」意指成熟型之人類嗜中性球明膠酶相關聯之脂質運載蛋白，其不具有傳訊胜肽。成熟型hNGAL係以登錄在SWISS-PROT Data Bank之登錄號P80188的殘基21-198序列說明，且其胺基酸以SEQ ID NO: 2表示。
本文中使用的「原始序列」意指蛋白質或多胜肽具有天然存在之序列或具有野生型序列，不論其製備方式。此原始序列蛋白質或多胜肽可從自然界中分離，或可利用其他方式產生，如重組型或合成方法。
「原始序列脂質運載蛋白」意指脂質運載蛋白具有與天然衍生之多胜肽相對應之相同胺基酸序列。因此，原始序列脂質運載蛋白可具有任何有機體，特別是哺乳類動物，個別天然存在之(野生型)脂質運載蛋白胺基酸序列。當用於脂質運載蛋白之文意時，術語「原始序列」特別涵蓋天然存在之截短形式或分泌形式之脂質運載蛋白，天然存在之變體形式如脂質運載蛋白之交替拼接形式與天然存在之等位基因變體。術語「原始序列脂質運載蛋白」與「野生型脂質運載蛋白」在本文中可互換使用。
本文中使用的「突變蛋白」、「經突變之」實體(不論蛋白質或核酸)、或「突變體」意指相較於天然存在之(野生型)蛋白質或核酸，交換、刪除、或插入一或多個胺基酸或核苷酸。該術語亦包括本文所述突變蛋白之片段。本發明明確涵蓋本文所述之脂質運載蛋白突變蛋白，其具有圓柱形β折疊片型超二級結構區域，該區域包含八個β股，其藉由四個圈環在一端成對連接，從而包含一配體結合袋點，並定義配體結合袋點入口，其中相較於原始序列脂質運載蛋白，該四個圈環之至少三者之每一者之至少一胺基酸係經突變。本發明之脂質運載蛋白突變蛋白較佳地具有結合本文所述CD137之功能。
本文中使用的術語「片段」，當與本發明之脂質運載蛋白突變蛋白相關時，意指衍生自全長成熟型hTlc或hNGAL或脂質運載蛋白突變蛋白之蛋白質或多胜肽係N端及/或C端截短，亦即，缺少N端及/或C端胺基酸之至少一者。此類片段可包括至少10或多個，如20或30或多個連續的胺基酸，其衍生自成熟型hTlc或hNGAL或脂質運載蛋白突變蛋白之主要序列，且通常可由成熟型hTlc或hNGAL之免疫分析中檢測出。此片段可能缺少至多2、至多3、至多4、至多5、至多10、至多15、至多20、至多25、或至多30 (包括其間之所有數目)個N端及/或C端胺基酸。作為示例，此片段可能缺少成熟型hTlc之一、二、三、或四個N端 (His-His-Leu-Leu)及/或一或二個C端胺基酸(Ser-Asp)。應理解到，此片段較佳地為從成熟型hTlc或hNGAL或脂質運載蛋白突變蛋白衍生之功能性片段，意指成熟型hTlc/hNGAL或脂質運載蛋白突變蛋白之衍生物較佳地保留對CD137之結合特異性。作為示例，此功能性片段可包含相對應於成熟型hTlc線性多胜肽序列之至少胺基酸位置5-153、5-150、9-148、12-140、20-135、或26-133。作為另一示例，此功能性片段可包含相對應於成熟型hNGAL之線性多胜肽序列之至少胺基酸位置 13–157、15-150、18-141、20-134、25-134、或28-134。
本發明融合蛋白相關之相對應標靶CD137或PD-L1之「片段」意指N端及/或C端截短之CD137或PD-L1或CD137或PD-L1之蛋白質結構域。本文所述之CD137片段或PD-L1片段保留在全長CD137或PD-L1時可由本發明融合蛋白辨識及/或結合的能力。作為示例，該片段可為CD137或PD-L1之細胞外結構域。作為示例，此細胞外結構域可包含CD137之細胞外次結構域的胺基酸，如結構域1 (UniProt Q07011之殘基24-45)、結構域2 (殘基46-86)、結構域3 (87-118)、及結構域4 (殘基119-159)之個別或組合之胺基酸序列。作為另一示例，此細胞外結構域可包含UniProt Q9NZQ7之胺基酸殘基19-238。
本文中使用的術語「變體」係有關蛋白質或多胜肽之衍生物，其包括突變，例如胺基酸序列或核苷酸序列之取代、刪除、插入、及/或化學修飾。在一些具體實施例中，此類突變及/或化學修飾不會減少蛋白質或胜肽之功能性。此類取代可為保留性取代，亦即，胺基酸殘基以化學上類似之胺基酸殘基替代。保留性取代之實例為下列群組成員中之替換：1)丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、及纈胺酸；2)天門冬胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、及天門冬醯胺酸、及組胺酸；3)精胺酸、離胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺酸、及組胺酸；4)異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸、丙胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、及脯胺酸；以及5)異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、及色胺酸。此類變體包括蛋白質或多胜肽，其中一或多個胺基酸係以其個別之D-空間異構物或天然存在之20個胺基酸以外的胺基酸(如，鳥胺酸、羥基脯胺酸、瓜胺酸、高絲胺酸、羥基離胺酸、正纈胺酸)取代。此類變體亦包括，舉例而言，在N及/或C端添加或刪除一或多個胺基酸殘基之蛋白質或多胜肽。一般而言，變體與蛋白質或多胜肽原始序列具有至少約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、或至少約98%之胺基酸序列一致性。由蛋白質或多胜肽衍生之變體係較佳地保留生物活性，如結合相同標靶。
本文中使用的有關本發明融合蛋白之相對應蛋白質配體CD137或PD-L1的「變體」乙詞，係分別有關其CD137或PD-L1或片段，相較於本文所述之CD137或PD-L1原始序列(野生型CD137或PD-L1)，如登錄於UniProt Q07011之CD137或登錄於UniProt Q9NZQ7之PD-L1，具有一或多個，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、40、50、60、70、80或多個胺基酸取代、刪除、及/或插入。個別的CD137變體或PD-L1變體與野生型CD137或PD-L1，較佳地具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、或95%之胺基酸一致性。本文所述之CD137變體或PD-L1變體保留結合本發明之CD137與PD-L1特異性融合蛋白之能力。
本文中使用的有關本發明脂質運載蛋白突變蛋白之「變體」 乙詞，係有關本發之脂質運載蛋白突變蛋白或其片段，其中該序列具有突變，包括取代、刪除、及插入、及/或化學修飾。本文所述之脂質運載蛋白突變蛋白衍生之脂質運載蛋白突變蛋白之變體保留生物活性，如結合至CD137。一般而言，脂質運載蛋白突變蛋白變體與衍生其之脂質運載蛋白突變蛋白具有至少約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、98%之胺基酸序列一致性。
本文中使用的術語「突變反應」意指將突變導入多核苷酸或胺基酸序列。較佳地在實驗條件下導入突變，使得可改變蛋白質或多胜肽序列之給定位置上天然存在之胺基酸，例如，以至少一胺基酸取代。術語「突變反應」亦包括利用刪除或插入一或多個胺基酸，(額外)修飾序列片段之長度。因此，在本發明之範疇內，舉例而言，在選定序列位置上之一個胺基酸係經一連串三個胺基酸取代，導致相較於原始蛋白質或多胜肽胺基酸序列之個別片段長度，增加了二個胺基酸殘基。在本發明可進行突變反應之任何序列片段中，此插入或刪除可彼此獨立導入。在本發明之一示例性具體實施例中，可將一插入體導入相對應於原始序列脂質運載蛋白之圈環AB的胺基酸序列片段(參見國際專利公開號WO 2005/019256，其全部在此併入本案以作為參考資料)。
本文中使用的術語「隨機突變反應」意指在特定序列位置不存在預定的突變(胺基酸之改變)，但在突變反應過程中，可以一定概率在預定之序列位置併入至少二個胺基酸。
本文中使用的術語「序列一致性」或「一致性」表示序列之一性質，用於衡量其相似性或相關性。如本發明中所使用的，術語「序列一致性」或「一致性」意指在本發明蛋白質或多胜肽序列與有疑問序列的(同源性)比對之後，成對相同殘基之百分比，係有關彼等二序列中較長者之殘基數目。序列一致性之測定方法為，將相同胺基酸殘基之數目除以殘基總數，再乘以100。
本文中使用的術語「序列同源性」或「同源性」具有其常用意義，且同源性胺基酸包括相同的胺基酸以及在本發明蛋白質或多胜肽(如，本發明之任何融合蛋白或脂質運載蛋白突變蛋白)之線性胺基酸序列相同位置上視為保留性取代之胺基酸。
熟習技術的人將可理解電腦程式，如BLAST (Altschul et al.,Nucleic Acids Res , 1997)、BLAST2 (Altschul et al.,J Mol Biol , 1990)、及Smith-Waterman (Smith and Waterman,J Mol Biol , 1981)，以利用標準參數決定序列同源性或序列一致性。序列同源性或序列一致性之百分比，舉例而言，於此可利用BLASTP程式，版本2.2.5 (November 16, 2002；(Altschul et al.,Nucleic Acids Res , 1997)決定。在此具體實例中，同源性之百分比係基於整個蛋白質或多胜肽(包括原胜肽序列)序列之比對(矩陣：BLOSUM 62；間隙成本：11.1；截止值設定為10-3 )，在配對比較中，較佳地以野生型蛋白質骨架作為參考體。其計算如BLASTP程式輸出結果之「陽性」 (同源性胺基酸)數目百分比所示，並除以程式選擇用於比對的胺基酸總數。
特別的是，欲確定脂質運載蛋白突變蛋白胺基酸序列之胺基酸殘基是否與野生型脂質運載蛋白胺基酸序列中相對應於特定位置之野生型脂質運載蛋白的不同，技術人員可使用本領域習知之工具與方法，如比對法，不論是以手動方式或利用電腦程式如BLAST 2.0，其意指Basic Local Alignment Search Tool，或ClustalW，或任何其他適合產生序列比對結果的適用程式。據此，脂質運載蛋白之野生型序列可作為「主體序列」或「參考體序列」，而與本文所述之野生型脂質運載蛋白不同的脂質運載蛋白突變蛋白胺基酸序列則作為「查詢序列」。「野生型序列」、「參考體序列」、及「主體序列」等詞在本文中可互換使用。較佳之脂質運載蛋白野生型序列為如SEQ ID NO: 1所示之hTLc序列或如SEQ ID NO: 2所示之hNGAL序列。
「間隙」為比對中的空間，其係胺基酸之添加或刪除的結果。因此，二個序列完全相同的拷貝子具有100%一致性，但序列較不具高度保留性，且具有刪除、添加、或取代時，可具有較低程度的序列一致性。
本文中使用的術語「位置」意指胺基酸在本文所述胺基酸序列中之位置或核苷酸在本文所述核苷酸序列中之位置。應理解到，當一或多個脂質運載蛋白突變蛋白之胺基酸序列位置在上下文中使用術語「相應於」或「相對應於」時，該相對應之位置不僅由前述核苷酸或胺基酸之編號決定。據此，本發明中一給定胺基酸之絕對位置可因(突變體或野生型)脂質運載蛋白中其他位置之胺基酸的刪除或添加而與相對應之位置不同。類似地，本發明中一給定核苷酸之絕對位置可因突變蛋白或野生型脂質運載蛋白5’-未轉譯區(UTR)(包括啟動子及/或任何其他調節序列或基因(包括外顯子與內含子))中其他位置之核苷酸的刪除或添加而與相對應之位置不同。
本發明之「相對應之位置」可為，在本發明之配對或多重序列比對中與其對應之序列位置對齊的序列位置。較佳地應理解到，在本發明之「相對應之位置」中，核苷酸或胺基酸之絕對位置可不同於相鄰之核苷酸或胺基酸，但該經交換、刪除、或添加之相鄰之核苷酸或胺基酸可由相同的一或多個「相對應之位置」組成。
此外，針對基於本發明參考體序列之脂質運載蛋白突變蛋白之相對應位置，較佳地應理解到，脂質運載蛋白突變蛋白之核苷酸或胺基酸之位置可在結構上相對應於參考體脂質運載蛋白(野生型脂質運載蛋白)或另一脂質運載蛋白突變蛋白中之其他位置，即使其絕對位置編號可能不同，而本領域技術人員可鑑於脂質運載蛋白中高度保留之整體折疊特性而理解。
如本文中可互換使用的，術語「共軛」、「接合」、「融合」、「融接」、或「連接」意指通過所有形式之共價或非共價連接，將二或多個次單元連接在一起，其方法係利用包括但不侷限於，基因融合法、化學共軛法、經由連接子或交聯劑之偶聯法、及非共價結合法。
本文中使用的術語「融合多胜肽」或「融合蛋白」意指含有二或多個次單元的多胜肽或蛋白質。在一些具體實施例中，本文所述之融合蛋白包含二或多個次單元，彼等次單元之至少一者係能特異性結合至CD137，以及另一次單元能特異性結合至PD-L1。在融合蛋白之中，彼等次單元可利用共價或非共價結合方式連接。較佳地，融合蛋白為二或多個次單元之間的轉譯融合體。利用基因工程讀框中之次單元編碼序列與另一次單元之編碼序列，產生轉錄融合體。兩個次單元可穿插編碼一連接子之核苷酸序列。然而，本發明融合蛋白之次單元亦可通過化學共軛法連接。形成融合蛋白之次單元典型上彼此以 are typically linked to each other of 一次單元之C端連接另一次單元之N端、或一次單元之C端連接另一次單元之C端、或一次單元之N端連接另一次單元之N端、或一次單元之N端連接另一次單元之C端。融合蛋白之次單元可以任何順序連接，且可包括一個以上的組成性次單元之任一者。若次單元之一或多者為一個以上的多胜肽鏈組成的蛋白質(複合體)之一部分，則術語「融合蛋白」亦可指含有經融合序列與蛋白質(複合體)之所有其他多胜肽鏈的蛋白質。作為示例，當全長免疫球蛋白經由免疫球蛋白之重鏈或輕鏈融合至脂質運載蛋白突變蛋白時，術語「融合蛋白」可指含有脂質運載蛋白突變蛋白與免疫球蛋白之重鏈或輕鏈的單一多胜肽鏈。術語「融合蛋白」亦可指整個免疫球蛋白(輕鏈與重鏈)及脂質運載蛋白突變蛋白融合至其重鏈及/或輕鏈之一或兩者。
本文中使用的融合蛋白之「次單元」乙詞意指單一蛋白質或單獨的多胜肽鏈，其本身可形成穩定之折疊結構，並具有向標靶提供結合模體的獨特功能。在一些具體實施例中，本發明之較佳次單元為脂質轉移蛋白突變蛋白。在一些其他具體實施例中，本發明之較佳次單元為全長免疫球蛋白或其抗原結合結構域。
如本文所述，可由本發明融合蛋白包含的「連接子」將融合蛋白的二或多個次單元連接在一起。連接可為共價或非共價。較佳之共價連接係經由胜肽鍵，如胺基酸之間的胜肽鍵。較佳之連接子為胜肽連接子。據此，在一較佳具體實施例中，該連接子包含一或多個胺基酸，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或多個胺基酸。本文說明較佳之胜肽連接子，包括甘胺酸-絲胺酸(GS)連接子、經醣化之GS連接子、及脯胺酸-丙胺酸-絲胺酸聚合物(PAS)連接子。在一些較佳之具體實施例中，GS連接子為如SEQ ID NO: 13所述之(G4 S)3 ，用於連接融合蛋白之次單元。其他較佳之連接子包括化學連接子。
本文中使用的術語「白蛋白」包括所有哺乳類動物之白蛋白，如人類血清白蛋白或牛血清白蛋白或大鼠血清白蛋白。
本文中使用的術語「有機分子」或「小型有機分子」表示一含有至少二個碳原子之有機分子，但較佳地不超過7或12個可旋轉碳鍵，分子量範圍在100到2,000道耳吞之間，較佳地在100到1,000道耳吞之間，且任意地包括一或二個金屬原子。
「樣本」定義為取自任何受試者之生物樣本。生物樣本包括但不侷限於，血液、血清、尿液、糞便、精液、或組織，包括腫瘤組織。
「受試者」為脊椎動物，較佳地哺乳類動物，更佳地人類。本文中使用的術語「哺乳類動物」意指任何歸類為哺乳類動物之動物，包括但不侷限於，人類、家畜、及農場動物，以及動物園、運動場、或寵物動物，如綿羊、狗、馬、貓、牛、大鼠、豬、猿，如食蟹猴，僅舉幾個說明例。 此處所用的較好地，「哺乳類動物之」是人類。較佳地，本文中使用的「哺乳類動物」為人類。
「有效量」為足以產生有益或需要之結果的量。有效量可以一或多個單獨投藥量或劑量投予。
本文中使用的「抗體」包括整個抗體或任何抗原結合片段 (亦即，「抗原結合部分」)或其單鏈。整個抗體意指一包含由雙硫鍵相互連接之至少二個重鏈(HCs)與二個輕鏈(LCs)的醣蛋白。各重鏈係由重鏈可變結構域(VH 或HCVR)與重鏈恆定區(CH )構成。重鏈恆定區由三個結構域CH1 、CH2 、及CH3 構成。各輕鏈由輕鏈可變結構域(VL 或LCVR)與輕鏈恆定區(CL )構成。輕鏈恆定區由一結構域CL 構成。VH 與VL 區可進一步細分成高度變異區，稱作互補決定區(CDRs)，其間散佈更保留性區域，稱作框架區(FRs)。各VH 與VL 由三個CDRs與四個FRs構成，從胺基端至羧基端以下列順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈與輕鏈之可變區含有與抗原(如，PD-L1)交互作用的結合結構域。抗體之恆定區可任意地介導免疫球蛋白結合至宿主組織或因子，包括免疫系統的各種細胞(如，效應子細胞)及典型補體系統之第一組分(C1q)。
本文中使用的抗體「抗原結合片段」意指抗體之一或多個片段保留特異性結合抗原(如，PD-L1)的能力。已經顯示，抗體的抗原結合功能可利用全長抗體之片段進行。涵蓋於術語「抗原結合片段」之內的抗體之結合片段的實例包括：(i)由VH 、VL 、CL 、及CH1 結構域組成的Fab片段；(ii)含有二個Fab片段且在鉸鏈區以雙硫鍵橋連接的F(ab′)2 片段；(iii)由VH 、VL 、CL 、及CH1 結構域與CH1 和CH2 結構域之間的區域組成的Fab′片段；(iv)由VH 與CH1 結構域組成的Fd片段；(v)由抗體單臂之VH 與VL 結構域組成的單鏈Fv片段；(vi)由VH 結構域組成的dAb片段 (Ward et al.,Nature , 1989)；以及(vii)一經分離之補體決定區(CDR)或二或多個經分離之CDRs之結合物，其可任意地利用合成之連接子連接；(viii)含有在相同多胜肽鏈處以短連接子相接之VH 與VL 的「雙抗體」(請見，如專利文件EP 404,097；WO 93/11161；以及Holliger et al.,Proc Natl Acad Sci U S A , 1993)；(ix)含有僅VH 或VL 的「結構域抗體片段」，其中在一些情況下，二或多個VH 區係共價連接。
抗體可為多株或單株；異種、同種異體、或同種；或其修飾型(如，人源化、嵌合性、或多重特異性)。抗體亦可為完全人類型。
本文中使用的「框架」或「FR」意指高度可變區(CDR)殘基以外的可變結構域殘基。
「可結晶區域片段」或「Fc區」 意指免疫球蛋白重鏈之C端區域，包括原始序列Fc區及變體Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈Fc區之邊界可變，但人類IgG重鏈Fc區通常定義為從位置Cys226或Pro230之胺基酸殘基延伸至其羧基端，其係依據Kabat歐盟索引之編號(Johnson and Wu,Nucleic Acids Res , 2000)。在產生或純化抗體，或利用重組方式進行編碼抗體重鏈核酸之基因工程過程中，可移除Fc區C端離胺酸(殘基447，依據Kabat歐盟索引)。據此，完整抗體之組合物可包含移除所有K447殘基之抗體群、無K447殘基移除之抗體群、及有或無K447殘基之抗體混合物抗體群。本發明抗體使用的適用原始序列Fc區包括人類IgG1、IgG2 (IgG2A、IgG2B)、IgG3、及IgG4。
「Fc受體」或「FcR」意指結合至抗體Fc區之受體。
本文中使用的「經分離之抗體」意指脫離其原始環境之抗體。 舉例而言，經分離之抗體實質上不含來自其來源細胞或組織之細胞材料與其他蛋白質。「經分離之抗體」進一步意指一抗體實質上不含其他具有不同抗原特異性之抗體。在目前情況下，特異性結合PD-L1之經分離之抗體實質上不含特異性結合PD-L1以外之抗原的抗體。然而，與PD-L1特異性結合之經分離之抗體可與其他抗原，如源自其他物種之PD-L1分子，交叉反應。
本文中使用的「單株抗體」意指單一分子組合物之抗體分子製備物。單株抗體組合物對特定表位展現單一結合特異性與親和力。
本文中使用的「人源化抗體」意指由源自人類以外之哺乳類動物抗體CDR，以及人類抗體或源自人類抗體之FR區與恆定區所組成之抗體。在一些具體實施例中，人源化抗體包含可變結構域，其具有可變區胺基酸序列，利用Ehrenmann et al. (2010)所述之Immunogenetics Information System (IMGT)結構域GapAlign工具評估，其在整體分析上，比其他物種更接近人類。在一些具體實施例中，由於抗原性減少，人源化抗體可用作治療劑之有效組分。本文中使用的術語「治療劑」或「治療上活性劑」意指一試劑在治療上適用。治療劑可為用於預防、改善、或治療疾病、生理狀況、症狀，或用於其評估或診斷的任何試劑。
本文中使用的「人類抗體」包括具有可變區之抗體，其中框架區與CDR區兩者源自人類種系免疫球蛋白序列。此外，若抗體含有恆定區，則該恆定區亦源自人類種系免疫球蛋白序列。本發明人類抗體可包括非由人類種系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(如，利用體外隨機突變法或位點特異性突變法或體內體細胞突變法導入之突變)。然而，本文中使用的術語「人類抗體」未旨在包括源自另一哺乳類動物種系(如小鼠)之CDR序列且移植至人類框架序列的抗體。
如本文所述，本發明涵蓋之認知為，雙價CD137結合劑，如抗體，自身可能不足以使CD137叢集在T細胞或NK細胞上且導致有效之活化作用，類似於三價可溶性CD137L之缺乏活性。在利用臨床前小鼠模型之最新出版品中，體內證據表明，其他抗TNFR抗體之作用方式需要抗體經由其Fc部分與表現Fc-γ受體之細胞上的Fc-γ-受體交互作用(Bulliard et al.,Immunol Cell Biol , 2014, Bulliard et al.,J Exp Med , 2013)。取決於表現Fc-γ受體之細胞的存在，彼等抗TNFR抗體之作用方式可從而以經由Fc-γ受體之非靶向叢集為主，相較於正常組織，其不一定在標靶之腫瘤微環境中過度表現。
因此，在以特定、靶向腫瘤之作用方式而叢集與活化CD137以產生治療劑的需求方面尚未得到滿足。
欲滿足此未滿足之需求，本發明提供一經由具有CD137結合特異性與PD-L1結合特異性之一或多個融合蛋白而同時結合CD137與PD-L1之新穎方法。提供之融合蛋白經設計以促進CD137聚集，其係藉由橋接CD137陽性T細胞與表現於腫瘤微環境中之PD-L1。此類雙特異性分子可結合CD137誘導之T細胞活化與擴增抗PD-L1介導之免疫檢查點阻斷，從而可克服單劑治療的某些侷限，並為抗藥性或無反應之病患提供優勢。融合蛋白亦經設計以在一分子中提供組合療法的潛力，同時容許在腫瘤微環境中局部誘導抗原特異性T細胞，潛在能降低週邊毒性。
在一些態樣中，本發明提供結合CD137與PD-L1的融合蛋白，以及其方法與適用之應用。本發明亦提供製備本文所述之結合CD137與PD-L1之融合蛋白的方法，以及包含此類蛋白之組合物。本發明之結合CD137與PD-L1的融合蛋白及其組合物可用於檢測樣本中CD137及/或PD-L1之方法、用於受試者中結合CD137及/或PD-L1之方法、或用於調控受試者免疫反應之方法。先前未描述具有與本發明提供之用途相關之該些特徵的此類融合蛋白。與本文提供之融合蛋白相反的是，先前習知之靶向CD137與PD-L1的融合蛋白具有藥物動力學差、無法接受之脫靶結合程度、結合至特定融合蛋白(如，PD-L1及/或CD137)之標靶之一或兩者的能力降低或以其他方式降解、及/或無法接受之非特異性(如，PD-L1非依賴性)免疫系統活化作用程度。A. 本發明示例性融合蛋白 CD137 與 PD-L1 特異性
在一些具體實施例中，所提供之融合蛋白含有至少二個任何順序的次單元：(1)一含有PD-L1特異性之全長免疫球蛋白或其抗原結合結構域的第一次單元，以及(2) 一含有CD137特異性之脂質運載蛋白突變蛋白的第二次單元。
在一些具體實施例中，所提供之融合蛋白亦可含有至少一額外之次單元，例如，一第三次單元。舉例而言，融合蛋白可含有一CD137特異性的第三次單元。在一些具體實施例中，第三次單元可為或包含一CD137特異性之脂質運載蛋白突變蛋白。舉例而言，二個脂質運載蛋白突變蛋白可融合至第一免疫球蛋白次單元，一者位於免疫球蛋白之C端且一者位於免疫球蛋白之N端。在一些具體實施例中，脂質運載蛋白突變蛋白可融合至免疫球蛋白之重鏈或輕鏈。
在一些具體實施例中，所提供之融合蛋白可包含一或多個額外之次單元(如，第四、第五、或第六次單元)。
在一些具體實施例中，至少一次單元之N端及/或C端可融合至另一次單元。
在一些具體實施例中，至少一次單元可經由連接子連接至另一次單元。在一些進一步之具體實施例中，連接子為胜肽連接子，舉例而言，一非結構之甘胺酸-絲胺酸(GS)連接子、經醣化之GS連接子、或一脯胺酸-丙胺酸-絲胺酸聚合物(PAS)連接子。在一些具體實施例中，GS連接子為如SEQ ID NO: 13所示之(Gly4 Ser)3 連接子((G4 S)3 )。其他示例性連接子如SEQ ID NOs: 14-23所示。在一些具體實施例中，胜肽連接子可具有1至50個胺基酸，如1、2、3、4、5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、或50個胺基酸。舉例而言，當第一次單元含有全長免疫球蛋白時，第二次單元可經由一胜肽連接子在第二次單元N端與該免疫球蛋白重鏈恆定區(CH) C端之間連接。在一些進一步之具體實施例中，第三次單元可經由一胜肽連接子在第三次單元N端與該免疫球蛋白輕鏈恆定區(CL) C端之間連接。
在一些具體實施例中，一次單元可連接至另一次單元，基本上如圖 1 所示。一般而言，一次單元之N端及/或C端可融合至另一次單元。舉例而言，在一些具體實施例中，脂質運載蛋白突變蛋白次單元之N端及/或C端可融合至免疫球蛋白次單元。進一步舉例，一脂質運載蛋白突變蛋白較佳地可經由一胜肽鍵連接至免疫球蛋白重鏈結構域(HC) C端、HC N端、免疫球蛋白輕鏈(LC) C端、及/或LC N端(圖 1A-1D )。
在一些具體實施例中，脂質運載蛋白突變蛋白次單元之N端及/或C端可融合至一免疫球蛋白片段。舉例而言，在一些具體實施例中，脂質運載蛋白突變蛋白較佳地可經由一胜肽連接子連接至免疫球蛋白之重鏈恆定區(CH) C端或輕鏈恆定區(CL) C端。
在一些具體實施例中，當一次單元包含全長免疫球蛋白時，第二次單元可在該免疫球蛋白之重鏈恆定區(CH) C端與第二次單元N端之間連接。
在一些具體實施例中，第三次單元可在該免疫球蛋白之第三次單元N端與輕鏈恆定區(CL) C端之間連接。
在一些具體實施例中，關於本發明之融合蛋白，其中至少一次單元可為或包含全長免疫球蛋白，當融合蛋白同時結合CD137與PD-L1時，可保留全長免疫球蛋白Fc區對Fc受體陽性細胞的Fc功能。
在一些具體實施例中，其中所提供之融合蛋白之至少一次單元可為或包含全長免疫球蛋白，Fc受體陽性細胞之全長免疫球蛋白Fc區之Fc功能可因蛋白質工程而下降或完全抑制，而融合蛋白則同時結合CD137與PD-L1。在一些具體實施例中，這可藉由從IgG1主鏈轉換至IgG4而達成，係因IgG4已知相較於IgG1，顯示Fc-γ受體交互作用下降。在一些具體實施例中，欲進一步減少殘餘物結合Fc-γ受體，可將突變(如，F234A與L235A)導入IgG4主鏈。在一些具體實施例中，亦可將S228P突變導入IgG4主鏈，以最小化IgG4半抗體之交換(Silva et al.,J Biol Chem , 2015)。在一些具體實施例中，可導入F234A與L235A突變以降低ADCC與ADCP (Glaesner et al.,Diabetes Metab Res Rev , 2010)及/或導入M428L與N434S突變或M252Y、S254T、及T256E突變以延長血清半衰期(Dall'Acqua et al.,J Biol Chem , 2006, Zalevsky et al.,Nat Biotechnol , 2010)。在一些具體實施例中，融合蛋白之免疫球蛋白重鏈可存在額外的N297A突變，以移除天然醣化作用模體。
在一些具體實施例中，涵蓋於本發明融合蛋白之免疫球蛋白Fc部分可有助於維持融合蛋白之血清含量。舉例而言，當Fc部分結合至內皮細胞與吞噬細胞上之Fc受體時，融合蛋白可內化且循環回到血流中，增進其體內半衰期。
在一態樣中，本發明之融合蛋白以高親和力結合CD137。在另一態樣中，所提供融合蛋白以高親和力結合PD-L1。在一些較佳之具體實施例中，所提供融合蛋白同時結合CD137與PD-L1。在一些具體實施例中，該同時結合至CD137與PD-L1容許所提供融合蛋白呈現持久之抗腫瘤或抗感染反應。
在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可能以KD 值至多約2 nM或甚而更低，如約1.5 nM或更低、約1 nM或更低、約0.6 nM或更低、或約0.4 nM或更低，結合PD-L1。在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可能以KD 值可比擬或低於包含於此類融合蛋白之PD-L1特異性免疫球蛋白(如，具有SEQ ID NOs: 86與87提供之重鏈與輕鏈之抗體)之KD 值結合PD-L1。可在表面電漿共振(SPR)試驗(如基本上實施例 3 所述之SPR試驗)中測定提供之融合蛋白之KD 值。
在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可能以KD 值至多約10 nM或甚而更低，如約7 nM、約6 nM,或約5 nM、約4 nM、約3 nM、約2 nM或甚而更低，結合CD137。在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可能以KD 值可比擬或低於包含於特定融合蛋白(如，SEQ ID NO: 42)或融合至抗體Fc區之脂質運載蛋白突變蛋白(如，SEQ ID NO: 89)之CD137特異性脂質運載蛋白突變蛋白之KD 值結合CD137。可在SPR試驗(如基本上實施例 3 所述之SPR試驗)中測定提供之融合蛋白之KD 值。
在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可能以EC50 值至多約0.5 nM或甚而更低，如約0.3 nM或更低、約0.2 nM或更低、約0.15 nM或更低、或約0.1 nM或更低，結合PD-L1。在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可能以EC50 值可比擬或低於包含於特定融合蛋白(如，具有SEQ ID NOs: 86與87提供之重鏈與輕鏈之抗體)之PD-L1特異性免疫球蛋白之EC50 值結合PD-L1。可在酵素免疫吸附分析法(ELISA)試驗(如基本上實施例 4 所述之ELISA試驗)中測定提供之融合蛋白之EC50 值。
在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可能以EC50 值至多約0.6 nM或甚而更低，如約0.5 nM或更低、約0.2 nM或更低、約0.15 nM或更低、或約0.1 nM或更低，結合CD137。在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可能以EC50 值可比擬或低於包含於特定融合蛋白(如，SEQ ID NO: 42)或融合至抗體Fc區之脂質運載蛋白突變蛋白(如，SEQ ID NO: 89)之CD137特異性脂質運載蛋白突變蛋白之EC50 值結合CD137。可在ELISA試驗(如基本上實施例 4 所述之ELISA試驗)中測定提供之融合蛋白之EC50 值。
在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白係交叉反應於食蟹猴PD-L1。在一些具體實施例中，所提供融合蛋白可能以EC50 值至多約0.5 nM或甚而更低，如約0.2 nM或更低、約0.1 nM或更低、或約0.05 nM或更低，結合食蟹猴PD-L1。可在ELISA試驗(如基本上實施例 4 所述之ELISA試驗)中測定提供之融合蛋白之EC50 值。
在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白係交叉反應於食蟹猴CD137。在一些具體實施例中，所提供融合蛋白可能以EC50 值至多約15 nM或甚而更低，如約10 nM或更低、約8 nM或更低、約6 nM或更低、約3 nM或更低、約1 nM或更低、約0.5 nM或更低、約3 nM或更低、或約0.1 nM或更低，結合食蟹猴CD137。可在ELISA試驗(如基本上實施例 4 所述之ELISA試驗)中測定提供之融合蛋白之EC50 值。在一些具體實施例中，親和效應(avidity effect)可增進所提供融合蛋白結合至食蟹猴CD137，如實施例 22 所述。
在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可能同時結合CD137與PD-L1。在一些具體實施例中，所提供融合蛋白可能以EC50 值至多約1 nM或甚而更低，如0.8 nM或更低、0.6 nM或更低、或0.4 nM或更低，同時結合CD137與PD-L1。在一些其他具體實施例中，所提供融合蛋白可能以EC50 值至多約10 nM或甚而更低，如8 nM或更低、6 nM或更低、3 nM或更低、或2 nM或更低，同時結合CD137與PD-L1。可在ELISA試驗(如基本上實施例 5 所述之ELISA試驗)中測定同時結合作用。
在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可能以EC50 值至多約60 nM或甚而更低，如約50 nM或甚而更低、約40 nM或甚而更低、約30 nM或更低、約10 nM或更低、約7 nM或更低、約5 nM或更低、約3 nM或更低、或約1 nM或甚而更低，結合表現在細胞上的CD137。可在基本上實施例 6 所述之流式細胞儀分析中測定所提供融合蛋白之EC50 值。表現CD137之細胞可為，舉例而言，以人類CD137或食蟹猴CD137轉染之CHO細胞。
在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可能以EC50 值至多約10 nM或甚而更低，如約8 nM或更低、約6 nM或更低、約4 nM或更低、約2 nM或更低、或約1或甚而更低，結合表現在細胞上的PD-L1。可在基本上實施例 6 所述之流式細胞儀分析中測定所提供融合蛋白之EC50 值。表現PD-L1之細胞可為，舉例而言，以人類PD-L1或食蟹猴PD-L1轉染之CHO細胞。
在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可能結合表現在腫瘤細胞上的PD-L1。在一些具體實施例中，所提供融合蛋白可能以EC50 值至多約2 nM或甚而更低，如約1.5 nM或更低、約1 nM或更低、約0.6 nM或更低、或約0.3 nM或甚而更低，結合表現在腫瘤細胞上的PD-L1。可在基本上實施例 7 所述之流式細胞儀分析中測定融合蛋白結合至表現PD-L1之腫瘤細胞之EC50 值。表現PD-L1之腫瘤細胞可為，舉例而言，RKO細胞。
在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白基本上不影響CD137結合至CD137L。在一些具體實施例中，當本發明融合蛋白與CD137L形成複合物時，可能結合CD137。在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白 可能以類似於抗CD137抗體(其具有SEQ ID NO: 28與29提供之重鏈與輕鏈)之方式結合CD137。可在基本上實施例 8 所述之SPR試驗中測定融合蛋白結合至CD137之方式。
在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可能與PD-1競爭結合至PD-L1。在一些具體實施例中，所提供融合蛋白可能以IC50 值至多約5 nM或甚而更低，如約3 nM或更低、約2 nM或更低、或約1或甚而更低，與PD-1競爭結合至PD-L1。可在ELISA試驗(如基本上實施例 9 所述之ELISA試驗)中測定抑制作用方式。
在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可能與SEQ ID NOs: 28與29所示之抗CD137抗體競爭結合至CD137。此競爭作用可利用基本上實施例 17 所述之ELISA試驗評估。在一些具體實施例中，所提供融合蛋白可具有與SEQ ID NOs: 28與29所示之抗CD137抗體重疊的表位。
在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可能共同刺激T細胞反應。在一些具體實施例中，相較於PD-L1抗體(如，結構單元PD-L1抗體SEQ ID NOs: 86與87或參考體PD-L1抗體SEQ ID NOs: 26與27)或CD137抗體(如，參考體抗體SEQ ID NOs: 28與29)，所提供之融合蛋白產生可比擬或更強的T細胞活化。在一些具體實施例中，相較於結合抗PD-L1抗體與CD137標靶分子(如，抗CD137抗體)或先前習知之CD137特異性脂質運載蛋白突變蛋白，所提供融合蛋白產生之T細胞活化具有可比擬或更好的功效。在基本上實施例 10 所述之CD137生物試驗中、在如實施例 18 所述之PD-1/PD-L1阻斷生物試驗中、或在基本上如實施例 11 、實施例 12 、實施例 19 、及實施例 20 所述之功能性T細胞活化試驗中，可測定經刺激之T細胞反應或T細胞活化。
在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可能誘導IL-2分泌增加。在一些較佳之具體實施例中，所提供之融合蛋白可能誘導濃度依賴性IL-2分泌及/或證實在更高濃度時，較佳地塗佈濃度，有誘導增進IL-2分泌的趨勢。在一些具體實施例中，所提供之融合蛋白可產生增加的IL-2分泌，相較於結合抗PD-L1抗體與CD137標靶分子(如，抗CD137抗體)或先前習知之CD137特異性脂質運載蛋白突變蛋白，具有可比擬更好的功效。在基本上實施例 11 與實施例 19 所述之功能性T細胞活化試驗中，可測定IL-2分泌。
在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可能以PD-L1依賴性方式共同刺激T細胞反應。在一些具體實施例中，所提供之融合蛋白可造成T細胞在PD-L1陽性細胞(如，PD-L1轉染之細胞或PD-L1陽性腫瘤細胞)附近局部誘導IL-2產生。當本文中使用「在PD-L1陽性細胞附近」時，意指T細胞與PD-L1陽性細胞經由同時結合CD137與PD-L1之所提供融合蛋白而彼此靠近。在基本上實施例 10 所述之CD137生物試驗中、在基本上實施例 18 所述之PD-1/PD-L1阻斷生物試驗中、或在基本上實施例 12 與實施例 20 所述之功能性T細胞活化試驗中，可測定所提供融合蛋白之PD-L1依賴性T細胞活化作用。
在一些較佳之具體實施例中，所提供之融合蛋白可能在表現PD-L1之腫瘤細胞存在下及/或在腫瘤微環境中共同刺激T細胞反應。在一些具體實施例中，所提供融合蛋白可能在PD-L1陽性腫瘤細胞存在下以EC50 值約1 nM或更低、約0.5 nM或更低、約0.3 nM或更低、約0.1 nM或更低、或約0.05 nM或更低之濃度共同刺激T細胞反應。在表現PD-L1之腫瘤細胞存在下及/或在腫瘤微環境中，舉例而言，在基本上實施例 10 所述之CD137生物試驗中或在基本上實施例 12 所述之功能性T細胞活化試驗中，可評估所提供融合蛋白之T細胞活化。
在一些具體實施例中，所提供之融合蛋白在不存在PD-L1之情況下，不能共同刺激T細胞反應。在一些具體實施例中，所提供之融合蛋白在不存在表現PD-L1之細胞的情況下，不能共同刺激T細胞反應。在一些具體實施例中，所提供融合蛋白可能識別PD-L1的存在，並造成相對應之T細胞活化，其優於SEQ ID NOs：28與29所示之CD137抗體。在基本上實施例 10 所述之CD137生物試驗中、在基本上實施例 18 所述之PD-1/PD-L1阻斷生物試驗中、或在基本上實施例 12 與實施例 20 所述之功能性T細胞活化試驗中，可測定融合蛋白之PD-L1依賴性作用。
在一些具體實施例中，所提供之融合蛋白可能阻斷PD-1與PD-L1結合介導之抑制信號。在一些具體實施例中，所提供之融合蛋白可能藉由阻斷PD-1/PD-L1交互作用，使T細胞活化停止或成功活化T細胞。在如實施例 18 所述之PD-1/PD-L1阻斷生物試驗中，可測定PD-1抑制信號之阻斷作用。
在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可能刺激T細胞 增生及/或活化。在一些具體實施例中，所提供之融合蛋白可能刺激CD4+ T細胞增生及/或活化。在一些具體實施例中，所提供之融合蛋白可能誘導IL-2分泌，較佳地劑量依賴性IL-2分泌。在一些具體實施例中，相較於結合抗PD-L1抗體與CD137標靶分子(如，抗CD137抗體)或先前習知之CD137特異性脂質運載蛋白突變蛋白，所提供之融合蛋白可能誘導更高的IL-2分泌。本文使用之IL-2分泌可為測定T細胞活化。由所提供融合蛋白刺激之CD4+ T細胞增生及/或活化，可利用基本上實施例 14 所述之混合式淋巴球反應(MLR)試驗評估。
在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可能刺激CD8+ T細胞增生及/或活化。在一些具體實施例中，所提供之融合蛋白可能誘導產生IL-2與效應子分子，如穿孔素、顆粒酶A、及顆粒酶B。在一些具體實施例中，所提供之融合蛋白可能誘導產生增加的IL-2與細胞毒性因子，如穿孔素、顆粒酶B、及顆粒酶A, 相較於結合抗PD-L1抗體與CD137標靶分子(如，抗CD137抗體)或先前習知之CD137特異性脂質運載蛋白突變蛋白。由所提供融合蛋白刺激之CD8+ T細胞增生及/或活化，可利用基本上實施例 15 所述之MLR試驗評估。
在一些具體實施例中，所提供之融合蛋白具有良好的穩定性與藥物動力學概況。在一些具體實施例中，所提供融合蛋白具有可比擬結構單元抗體SEQ ID NOs: 86與87的藥物動力學概況。在一些具體實施例中，所提供融合蛋白具有類似抗體的藥物動力學。在一些具體實施例中，所提供融合蛋白具有終端半衰期約200小時或更長、約250小時或更長、約300小時或更長、約350小時或更長、約400小時或更長、或甚而更長。在一些具體實施例中，所提供融合蛋白具有比SEQ ID NO: 147更好的藥物動力學概況。在一些具體實施例中，所提供融合蛋白具有比SEQ ID NO: 148更好的藥物動力學概況。所提供融合蛋白之藥物動力學概況可如實施例 21 與實施例 22 所述進行分析。在一些具體實施例中，若在336 h之後cmax 百分比(%)高於10%，則可視為達到良好的藥物動力學概況或類似抗體的藥物動力學。
在一些具體實施例中，所提供融合蛋白包含如SEQ ID NOs: 88-94之任一者所示之胺基酸序列。
在一些具體實施例中，所提供融合蛋白之胺基酸序列具有與SEQ ID NOs: 88-94之任一者所示之胺基酸序列至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%、或甚而更高之序列一致性。
在一些具體實施例中，所提供融合蛋白包含SEQ ID NOs: 90與87、SEQ ID NOs: 86與91、SEQ ID NOs: 92與87、SEQ ID NOs: 86與93、SEQ ID NOs: 94與87、或SEQ ID NOs: 90與91所示之胺基酸。
在一些具體實施例中，所提供融合蛋白之胺基酸序列具有與SEQ ID NOs: 90與87、SEQ ID NOs: 86與91、SEQ ID NOs: 92與87、SEQ ID NOs: 86與93、SEQ ID NOs: 94與87、或SEQ ID NOs: 90與91所示之胺基酸序列至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%、或甚而更高之序列一致性。B. 包含於融合蛋白 之示例性免疫球蛋白
在一些具體實施例中，關於提供之融合蛋白，第一次單元可為或包含PD-L1特異性全長免疫球蛋白或其抗原結合結構域。在一些具體實施例中，免疫球蛋白，舉例而言，可為IgG1、IgG2、或IgG4。在一些具體實施例中，免疫球蛋白為或包含IgG4。在一些具體實施例中，免疫球蛋白為抗PD-L1之單株抗體。
本發明PD-L1結合抗體之說明例可包含一抗原結合區，其交叉阻斷或結合至相同表位，以作為PD-L1結合抗體，其包含習知抗體之重鏈可變結構域(VH )與輕鏈可變結構域(VL )區域，如阿特珠單抗(atezolizumab) (亦稱作MPDL3280A或RG7446，商品名Tecentriq® )、阿維魯單抗(avelumab) (亦稱作MSB0010718C，商品名Bavencio® )、度伐魯單抗(durvalumab) (先前稱作MEDI4736，商品名Imfinzi® )、及BMS-936559 (亦稱作MDX-1105)、5C10 (包括人源化5C10)、5F10 (包括人源化5F10)、及9F6 (包括人源化9F6)。在一些具體實施例中，本發明之PD-L1結合抗體可包含一抗原結合區，如選自於由阿特珠單抗、阿維魯單抗、度伐魯單抗、BMS-936559、5C10、5F10、及9F6所組成群組之抗體之三重鏈互補決定區(CDRs) (HCDR1、HCDR2、及HCDR3)與三輕鏈 CDRs (LCDR1、LCDR2、及LCDR3)之任一者。
在一些具體實施例中，所提供之PD-L1抗體或其抗原結合結構域可具有一選自於由SEQ ID NOs: 75-79之群組所組成之重鏈可變區(HCVR)及/或一選自於由SEQ ID NOs: 80-84之群組所組成之輕鏈可變區 (LCVR)。
在一些具體實施例中，所提供之PD-L1抗體或其抗原結合結構域可具有一重鏈，其為SEQ ID NOs: 85-86之任一者，及/或一輕鏈，其為SEQ ID NO: 87。
在一些具體實施例中，the pair of a 提供之PD-L1抗體或其抗原結合結構域之重鏈與輕鏈配對分別為或包含HCVR與LCVR，如下：SEQ ID NOs: 75與80、SEQ ID NOs: 76與81、SEQ ID NOs: 77與82、SEQ ID NOs: 78與83、或SEQ ID NOs:79與84。
在一些具體實施例中，所提供PD-L1抗體之重鏈與輕鏈配對為或包含如SEQ ID NOs: 85與87或SEQ ID NO: 86與87所示之胺基酸序列。
在一些具體實施例中，所提供之PD-L1抗體或其抗原結合結構域可具有HCVR，其與選自於由SEQ ID NOs: 75-79所組成群組之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%、或甚而更高之序列一致性，及/或LCVR，其與選自於由SEQ ID NOs: 80-84所組成群組之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%、或甚而更高之序列一致性。在其他具體實施例中，所提供PD-L1抗體之或其抗原結合結構域可具有重鏈，其與選自於由SEQ ID NOs: 85-86所組成群組之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%、或甚而更高之序列一致性，及/或輕鏈，其與SEQ ID NO: 87之胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%、或甚而更高之序列一致性。
在一些具體實施例中，所提供PD-L1 抗體之重鏈可變區或其抗原結合結構域可具有三個CDRs，其具有下列序列：GFSLSNYD (HCDR1，SEQ ID NO: 60)、IWTGGAT (HCDR2，SEQ ID NO: 61)、VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3；SEQ ID NO: 62)。在一些具體實施例中，所提供PD-L1抗體之重鏈可變區或其抗原結合結構域可具有三個CDRs，其具有下列序列：GFDIKDTY (HCDR1，SEQ ID NO: 65)、IDPADGNT (HCDR2，SEQ ID NO: 66)、ARGLGAWFAS (HCDR3；SEQ ID NO: 67)。在一些具體實施例中，所提供PD-L1抗體之重鏈可變區或其抗原結合結構域可具有三個CDRs，其具有下列序列：GFNIKDTY (HCDR1，SEQ ID NO: 70)、IDPANGNT (HCDR2，SEQ ID NO: 71)、SRGPPGGIGEYIYAMDY (HCDR3；SEQ ID NO: 72)。
在一些具體實施例中，所提供PD-L1抗體之輕鏈可變區或其抗原結合結構域可具有三個CDRs，其具有下列序列：QSIGTN (LCDR1，SEQ ID NO: 63)、YAS (LCDR2)、QQSNSWPYT (LCDR3；SEQ ID NO: 64)。在一些具體實施例中，所提供PD-L1抗體之輕鏈可變區或其抗原結合結構域可具有三個CDRs，其具有下列序列：QDITNS (LCDR1，SEQ ID NO: 68)、YTS (LCDR2)、QQGHTLPPT (LCDR3；SEQ ID NO: 69)。在一些具體實施例中，所提供PD-L1抗體之輕鏈可變區或其抗原結合結構域可具有三個CDRs，其具有下列序列：SSVSSSY (LCDR1，SEQ ID NO: 73)、STS (LCDR2)、HQYHRSPPT (LCDR3；SEQ ID NO: 74)。
在一些具體實施例中，所提供之PD-L1抗體或其抗原結合結構域包含重鏈可變區，其具有三個CDRs，具有下列序列：GFSLSNYD (HCDR1，SEQ ID NO: 60)、IWTGGAT (HCDR2，SEQ ID NO: 61)、VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3；SEQ ID NO: 62)，以及輕鏈可變區，其具有三個CDRs，具有下列序列：QSIGTN (LCDR1，SEQ ID NO: 63)、YAS (LCDR2)、QQSNSWPYT (LCDR3；SEQ ID NO: 64)。在一些具體實施例中，所提供之PD-L1抗體或其抗原結合結構域包含重鏈可變區，其具有三個CDRs，具有下列序列：GFDIKDTY (HCDR1，SEQ ID NO: 65)、IDPADGNT (HCDR2，SEQ ID NO: 66)、ARGLGAWFAS (HCDR3；SEQ ID NO: 67)，以及輕鏈可變區，其具有三個CDRs，具有下列序列：QDITNS (LCDR1，SEQ ID NO: 68)、YTS (LCDR2)、QQGHTLPPT (LCDR3；SEQ ID NO: 69)。在一些具體實施例中，所提供之PD-L1抗體或其抗原結合結構域包含重鏈可變區，其具有三個CDRs，具有下列序列：GFNIKDTY (HCDR1，SEQ ID NO: 70)、IDPANGNT (HCDR2，SEQ ID NO: 71)、SRGPPGGIGEYIYAMDY (HCDR3；SEQ ID NO: 72)，以及輕鏈可變區，其具有三個CDRs，具有下列序列：SSVSSSY (LCDR1，SEQ ID NO: 73)、STS (LCDR2)、HQYHRSPPT (LCDR3；SEQ ID NO: 74)。
除非另有指明，本文揭示之所有CDR序列皆依據IMGT方法定義，如Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999)所述。CDR1由位置27至38組成，CDR2由位置56至65組成，種系V基因之CDR3由位置105至116組成，重排V-J基因或V-D-J基因之CDR3由位置105至117組成(J-PHE或J-TRP 118之前的位置)，其中圈環頂部留有間隙，對於少於13個胺基酸之重排CDR3-IMGT，或對於多於13個胺基酸之重排CDR3-IMGT，則具有額外的位置112.1、111.1、112.2、111.2等。本段落給定之位置係依據IMGT編號，如Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999)所述。
抗體特異性結合至PD-L1，如本發明之融合蛋白所涵蓋，可包含Fc部分，其使得延長本發明雙特異性結合分子之體內半衰期。在一些具體實施例中，此Fc部分較佳地源自人類來源，更佳地人類IgG1或lgG4抗體之Fc部分，甚而更佳地經基因工程之人類IgG1或lgG4之Fc部分，其中活化或靜默效應子功能。在一些具體實施例中，靜默效應子功能可能優於活化效應子功能。在一些具體實施例中，此Fc部分經基因工程以靜默效應子功能，其具有突變位置234及/或235，其依據Kabat歐盟索引之編號(Johnson and Wu,Nucleic Acids Res , 2000)。在一些具體實施例中，所提供之抗PD-L1抗體可導入突變位置F234與L235，以靜默效應子功能。在其他具體實施例中，所提供之抗PD-L1抗體可導入突變位置D265與P329，以靜默效應子功能。兩組彼等潛在突變之編號係依據Kabat歐盟索引(Shields et al.,J Biol Chem , 2001)。
各種產生抗體及其片段之技術為本領域中習知，並如Altshuler et al. (2010)所述。因此，舉例而言，多株抗體可在將添加劑與佐劑混合抗原而進行動物免疫注射後從血液中取得，且單株抗體可利用任何技術產生，其連續細胞株培養以產生抗體。此類技術實例之說明，如Harlow and Lane (1999)、(1988)，且包括最初由Köhler and Milstein，1975提出的融合瘤技術，三體瘤(trioma)技術，人類B細胞融合瘤技術(請見如，Li et al.,Proc Natl Acad Sci U S A , 2006, Kozbor and Roder,Immunol Today , 1983)，及EBV-融合瘤技術，以產生人類單株抗體(Cole et al.,Cancer Res , 1984)。此外，可從單株抗體取得重組型抗體，或可利用各種顯示方法，如噬菌體、核醣體、mRNA、或細胞顯示法從頭製備。在一些具體實施例中，表現重組型(人源化)抗體或其片段之適用系統可選自於，舉例而言，細菌、酵母菌、昆蟲、哺乳類動物細胞株或轉基因動物或植物(請見，如美國專利號6,080,560；Holliger and Hudson,Nat Biotechnol , 2005)。此外，描述產生單鏈抗體之技術(請見，除其他外，美國專利號4,946,778)可用於產生本發明標靶特異性之單鏈抗體。BIAcore系統中採用的表面電漿共振可用於增加噬菌體抗體之功效。C. 本發明之示例性脂質運載蛋白突變蛋白
脂質運載蛋白為蛋白質性結合分子，其自然演化以結合配體。脂質運載蛋白出現在許多生物體中，包括脊椎動物、昆蟲、植物、及細菌。脂質運載蛋白之蛋白質家族成員(Pervaiz and Brew,FASEB J , 1987)典型上為小型分泌蛋白質，且具有單一多胜肽鏈。其特徵在於，具有一範圍之不同分子識別性質：其結合至各種，主要是疏水性小分子(如，類視黃醇、脂肪酸、膽固醇、前列腺素、聯肝素、費洛蒙、促味劑、及氣味劑)，且其結合至特異性細胞表面受體及其形成巨分子複合物。儘管其在過去主要歸類為轉運蛋白，但現在很清楚的是，脂質運載蛋白具有多種生理功能。彼等包括在視黃醇轉運、嗅覺、費洛蒙傳訊、及前列腺素之合成中的角色。脂質運載蛋白亦涉及免疫反應之調節及細胞恆定之介導(綜述於，如Flower et al.,Biochim Biophys Acta , 2000, Flower,Biochem J , 1996)。
脂質運載蛋白之整體序列保留性程度異常的低，通常序列一致性低於20%。與之形成強烈對比的是，其整體折疊樣式高度保留。脂質運載蛋白結構之中央部分由單一個八股之反平行β折疊組成，其自身封閉，形成一連續的氫鍵β桶形。此β桶形成一中央空腔。桶形之一端在空間上受到穿過其底部之N端胜肽片段阻斷，且三個胜肽圈環連接該β股。β桶形之另一端對溶劑開放，並包含一個標靶結合位點，該位點由四個撓性胜肽圈環 (AB、CD、EF、及GH)形成。由於剛性脂質運載蛋白骨架中圈環之多樣性，導致各種不同結合方式，每一者能容納不同大小、形狀、及化學特徵的標靶(綜述於，如Skerra,Biochim Biophys Acta , 2000, Flower et al.,Biochim Biophys Acta , 2000, Flower,Biochem J , 1996)。
本發明之脂質運載蛋白突變蛋白可為任一脂質運載蛋白之突變蛋白。適用之脂質運載蛋白(有時亦稱作「參考體脂質運載蛋白」、「野生型脂質運載蛋白」、「參考體蛋白質骨架」、或僅「骨架」)之突變蛋白之實例包括但不侷限於，淚液脂質運載蛋白(脂質運載蛋白-1、Tlc、或馮埃布納腺(von Ebner’s gland)蛋白)、視黃醇結合蛋白、嗜中性球脂質運載蛋白型前列腺素D合酶酶、β乳球蛋白、膽汁結合蛋白(BBP)、脂蛋白元D (APOD)、嗜中性球明膠酶相關聯之脂質運載蛋白(NGAL)、α2微球蛋白相關之蛋白(A2m)、24p3/子宮鈣蛋白(24p3)、馮埃布納腺蛋白1 (VEGP 1)、馮埃布納腺蛋白2 (VEGP 2)、及主要過敏原Can f 1 (ALL-1)。在相關之具體實施例中，脂質運載蛋白突變蛋白係衍生自脂質運載蛋白群組，其由人類淚液脂質運載蛋白(hTlc)、人類嗜中性球明膠酶相關聯之脂質運載蛋白(hNGAL)、人類脂蛋白元D (hAPOD)、及歐洲粉蝶(Pieris brassicae)之膽汁結合蛋白質。
相較於從其衍生之參考體(或野生型)脂質運載蛋白(如，hTlc或hNGAL)，當與另一脂質運載蛋白(亦見上文)比較序列一致性時，本發明脂質運載蛋白突變蛋白之胺基酸序列可具有高度序列一致性。在此一般情況下，本發明脂質運載蛋白突變蛋白之胺基酸序列至少實質上類似於相對應之參考體(野生型)脂質運載蛋白的胺基酸序列，條件是在比對時可能有間隙(如本文所定義)，其係胺基酸添加或刪除的結果。本發明脂質運載蛋白突變蛋白之個別序列，係實質上類似於相對應之參考體(野生型)脂質運載蛋白之序列，具有與相對應之脂質運載蛋白序列，在一些具體實施例中，至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少82%、至少85%、至少87%、至少90%之一致性，包括至少95%之一致性。在此情況下，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白當然可包含本文所述之取代，其使得脂質運載蛋白突變蛋白能結合至CD137。
典型而言，脂質運載蛋白突變蛋白含有一或多個經突變之胺基酸殘基 – 相對於野生型或參考體脂質運載蛋白之胺基酸序列，如hTlc與hNGAL – 在一開放端之四個圈環中包含配體結合袋點並定義出配體結合袋點之入口(參見上文)。如上面所述，彼等區域在確定脂質運載蛋白突變蛋白對所需標靶之結合特異性上至關重要。在一些具體實施例中，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白亦可含有四個圈環之外的經突變之胺基酸殘基區域。在一些具體實施例中，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白在連接脂質運載蛋白封閉端之β股之三個胜肽圈環(命名為BC、DE、及FG)之一或多者中可含有一或多個經突變之胺基酸殘基。在一些具體實施例中，衍生自淚液脂質運載蛋白、NGAL脂質運載蛋白或其同源物之突變蛋白，在N端區域及/或在β桶形結構(其與天然脂質運載蛋白結合袋點相對)末端排列之三個胜肽圈環BC、DE、及FG之任何序列位置，可具有1、2、3、4、或多個經突變之胺基酸殘基。在一些具體實施例中，衍生自淚液脂質運載蛋白、NGAL脂質運載蛋白或其同源物之突變蛋白，相較於野生型淚液脂質運載蛋白序列，在β桶形結構末端排列之胜肽圈環DE中可不具有經突變之胺基酸殘基。
在一些具體實施例中，相較於相對應之參考體(野生型)脂質運載蛋白之胺基酸序列，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白可包括一或多個，如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或甚而更多經突變之胺基酸殘基，條件為此脂質運載蛋白突變蛋白應能結合至CD137。在一些具體實施例中，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白包括至少二個，包括2、3、4、5、或甚而更多個，經突變之胺基酸殘基，其中相對應之參考體(野生型)脂質運載蛋白之原始胺基酸殘基係由精胺酸殘基取代。
設想任何類型與數量之突變，包括取代、刪除、及插入，只要所提供之脂質運載蛋白突變蛋白保持結合CD137的能力，及/或其具有序列一致性，其與參考體(野生型)脂質運載蛋白(如，成熟型hTlc或成熟型hNGAL)之胺基酸序列具有至少60% (如，至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、或更高)之一致性。
在一些具體實施例中，取代為保留性取代。在一些具體實施例中，取代為非保留性取代或下列示例性取代之一或多者。
特別的是，欲確定脂質運載蛋白突變蛋白胺基酸序列之胺基酸殘基是否不同於參考體(野生型)脂質運載蛋白且相對應於參考體(野生型)脂質運載蛋白胺基酸序列之特定位置，熟習之技術人員可使用本領域習知之工具與方法，如比對，以手動方式或利用電腦程式，如BLAST2.0，其代表Basic Local Alignment Search Tool或ClustalW，或任何其他適用於產生序列比對之程式。據此，參考體(野生型)脂質運載蛋白之胺基酸序列可作為「主體序列」或「參考體序列」，而脂質運載蛋白突變蛋白之胺基酸序列則作為「查詢序列」 (亦見上文)。
保留性取代一般而言為下列取代，依據欲突變之胺基酸列出，每一者之後有一或多個可認定為保留性的置換：Ala → Ser、Thr、或Val；Arg → Lys、Gln、Asn、或His；Asn → Gln、Glu、Asp、或His；Asp → Glu、Gln、Asn、或His；Gln → Asn、Asp、Glu、或His；Glu → Asp、Asn、Gln、或His；His → Arg、Lys、Asn、Gln、Asp、或Glu；Ile → Thr、Leu、Met、Phe、Val、Trp、Tyr、Ala、或Pro；Leu → Thr、Ile、Val、Met、Ala、Phe、Pro、Tyr、或Trp；Lys → Arg、His、Gln、或Asn；Met → Thr、Leu、Tyr、Ile、Phe、Val、Ala、Pro、或Trp；Phe → Thr、Met、Leu、Tyr、Ile、Pro、Trp、Val、或Ala；Ser → Thr、Ala、或Val；Thr → Ser、Ala、Val、Ile、Met、Val、Phe、Pro、或Leu；Trp → Tyr、Phe、Met、Ile、或Leu；Tyr → Trp、Phe、Ile、Leu、或Met；Val → Thr、Ile、Leu、Met、Phe、Ala、Ser、或Pro。亦允許其他取代，且可憑經驗或依據其他已知保留性或非保留性取代而確定。進一步指引，以下各群組均含有典型上彼此可定義為保留性取代的胺基酸： (a)  丙胺酸(Ala)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、纈胺酸(Val) (b) 天門冬胺酸(Asp)、麩胺酸(Glu)、麩醯胺酸(Gln)、天門冬醯胺酸(Asn)、組胺酸(His) (c)  精胺酸(Arg)、離胺酸(Lys)、麩醯胺酸(Gln)、天門冬醯胺酸(Asn)、組胺酸(His) (d) 異白胺酸(Ile)、白胺酸(Leu)、甲硫胺酸(Met)、纈胺酸(Val)、丙胺酸(Ala)、苯丙胺酸(Phe)、蘇胺酸(Thr)、脯胺酸(Pro) (e)  異白胺酸(Ile)、白胺酸(Leu)、甲硫胺酸(Met)、苯丙胺酸(Phe)、酪胺酸(Tyr)、色胺酸(Trp)
若此類保留性取代導致生物活性改變，則可導入更實質上的變化，如以下或如下列有關胺基酸類別之進一步說明，並針對所需之特性篩選產物。此類更實質上改變之實例包括：Ala → Leu或Phe；Arg → Glu；Asn → Ile、Val、或Trp；Asp → Met；Cys → Pro；Gln → Phe；Glu → Arg；His → Gly；Ile → Lys、Glu、或Gln；Leu → Lys或Ser；Lys → Tyr；Met → Glu；Phe → Glu、Gln、或Asp；Trp → Cys；Tyr → Glu或Asp；Val → Lys、Arg、His。
在一些具體實施例中，脂質運載蛋白(突變蛋白)物理學與生物學特性之實質上改良，係藉由選擇對維持(a)取代區域中多胜肽主鏈之結構，如折疊或螺旋構形，(b)標靶位點處分子之電荷或疏水性，或(c)大部分側鏈之效果明顯不同的取代而完成。
依據共同的側鏈性質，將天然存在之殘基分組：(1)疏水性：甲硫胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸；(2)中性親水性：半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺酸；(3)酸性：天門冬胺酸、麩胺酸；(4)鹼性：組胺酸、離胺酸、精胺酸；(5)影響鏈方位之殘基：甘胺酸、脯胺酸；以及(6)芳香性：色胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸。在一些具體實施例中，取代可能需要將彼等類別之其中一成員替換為另一類別。
亦可將任何未涉及維持個別脂質運載蛋白適當構形之半胱胺酸殘基取代，通常使用絲胺酸，以改進分子的氧化穩定性並防止異常交聯。相反地，可將半胱胺酸鍵加至脂質運載蛋白以改進其穩定性。D. 本發明之示例性 CD137 特異性脂質運載蛋白突變蛋白
如上述，脂質運載蛋白為一多胜肽，係由其超二級結構定義，亦即圓柱形β折疊片型超二級結構區域，其包含八個β股，在一端由四個圈環配對相連接，從而定義一結合袋點。本發明未侷限於本文具體揭示之脂質運載蛋白突變蛋白。在此情況下，本發明係有關脂質運載蛋白突變蛋白，其具有圓柱形β‑折疊片型超二級結構區域，其包含八個β股，在一端由四個圈環配對相連接，從而定義一結合袋點，其中該四個圈環之至少三者之每一者之至少一胺基酸係經突變，且其中該脂質運載蛋白以可檢測之親和力有效結合CD137。
在一些具體實施例中，本文揭示之脂質運載蛋白突變蛋白可為或包含成熟人類淚脂質運載蛋白(hTlc)之突變蛋白。成熟型hTlc之突變蛋白於此可定為「hTlc突變蛋白」。在一些其他具體實施例中，本文揭示之脂質運載蛋白突變蛋白為成熟人類嗜中性球明膠酶相關聯之脂質運載蛋白(hNGAL)的突變蛋白。成熟型hNGAL之突變蛋白於此可定為「hNGAL突變蛋白」。
在一態樣中，本發明包括任何數量之衍生自參考體(野生型)脂質運載蛋白，較佳地衍生自成熟型hTlc或成熟型hNGAL，的脂質運載蛋白突變蛋白，其以可檢測之親和力結合CD137。在一相關態樣中，本發明包括各種脂質運載蛋白突變蛋白，其藉由結合至CD137，能活化CD137之下游傳訊途徑。在此意義上，CD137可當作參考體(野生型)脂質運載蛋白，較佳地hTlc或hNGAL，的非天然標靶，其中「非天然標靶」意指一物質在生理條件下不結合至參考體(野生型)脂質運載蛋白。藉由在參考體(野生型)脂質運載蛋白之特定序列位置上一或多個突變的基因工程，發明人證實，非天然標靶CD137可能有高親和力與高特異性。在一些具體實施例中，可在編碼野生型脂質運載蛋白特定序列位置之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或甚而更多個核苷酸三聯體上進行隨機突變，其係利用一子集合之核苷酸三聯體在彼等位置進行取代，目的為產生能結合CD137的脂質運載蛋白突變蛋白。
在一些具體實施例中，可將本發明之脂質運載蛋白突變蛋白突變，包括在相對應於參考體脂質運載蛋白(較佳地hTlc或hNGAL)之線性多胜肽序列之一或多個序列位置上將胺基酸殘基取代、刪除、及插入。在一些具體實施例中，相較於參考體脂質運載蛋白之胺基酸序列(較佳地hTlc或hNGAL)，本發明脂質運載蛋白突變蛋白胺基酸殘基之突變數目，為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或多個，如25、30、35、40、45、或50個，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11個係較佳，且9、10、或11個係甚而更佳。然而，較佳的是，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白仍能結合CD137。
在一些具體實施例中，相較於個別參考體(野生型)脂質運載蛋白；舉例而言，SEQ ID NOs: 34-40，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白在其N端可能缺少1、2、3、4、或多個胺基酸且/或在其C端可能缺少1、2、或多個胺基酸。在一些具體實施例中，本發明涵蓋如前面定義之hTlc突變蛋白，其中成熟型hTlc (His-His-Leu-Leu；位置1-4)序列之前四個(一、二、三、或N端)胺基酸殘基及/或成熟型hTlc之線性多胜肽序列之後一或二個C端胺基酸殘基(Ser-Asp；位置157-158)係經刪除(如，SEQ ID NOs: 34-40)。在一些具體實施例中，本發明涵蓋如前面定義之hNGAL突變蛋白，其中成熟型hNGAL之線性多胜肽序列胺基酸殘基(Lys-Asp-Pro，位置46-48)係經刪除(SEQ ID NO: 45)。此外，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白可包括經突變之胺基酸序列位置以外的參考體(野生型)脂質運載蛋白之野生型(原始)胺基酸序列，較佳地hTlc或hNGAL。
在一些具體實施例中，併入本發明脂質運載蛋白突變蛋白之一或多個經突變之胺基酸殘基不妨礙或不干擾與指定標靶之結合活性及突變蛋白之摺疊。此類突變，包括取代、刪除、及插入，可以建立之標準方法(Sambrook and Russell, 2001, Molecular cloning: a laboratory manual)在DNA程度上完成。在一些具體實施例中，在一或多個相對應於參考體(野生型)脂質運載蛋白(較佳地hTlc或hNGAL)線性多胜肽序列之序列位置之經突變之胺基酸殘基，係經由隨機突變反應導入，其中以一子集之核苷酸三聯體取代編碼相對應於參考體脂質運載蛋白之序列位置之核苷酸三聯體。
在一些具體實施例中，所提供之以可檢測之親和力結合CD137之脂質運載蛋白突變蛋白可包括原始半胱胺酸殘基由另一胺基酸(如，絲胺酸殘基)進行至少一胺基酸取代。在一些具體實施例中，以可檢測之親和力結合CD137之脂質運載蛋白突變蛋白可包括一或多個非原始半胱胺酸殘基取代參考體(野生型)脂質運載蛋白(較佳地hTlc或hNGAL)之一或多個胺基酸。在一些具體實施例中，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白包括原始胺基酸由半胱胺酸殘基進行至少二胺基酸取代，從而形成一或多個半胱胺酸橋聯。在一些具體實施例中，該半胱胺酸橋聯可連接至少二個圈環區域。於此使用之彼等區域之定義係依據(Biochim Biophys Acta , 2000)、Flower (1996)、及Breustedt et al. (2005)。
一般而言，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白與成熟型hTlc (SEQ ID NO: 1)或成熟型hNGAL (SEQ ID NO: 2)之胺基酸序列可具有約至少70%，包括至少約80%，如至少約85%，之胺基酸序列一致性。
在一些態樣中，本發明提供結合CD137之hTlc突變蛋白。在此情況下，本發明提供一或多個hTlc突變蛋白，其能以經測定之KD 約300 nM、200 nM、150 nM、100 nM、或更低之親和力結合CD137。在一些具體實施例中，所提供之hTlc突變蛋白能以EC50 值約250 nM、150 nM、100 nM、50 nM、20 nM、或甚而更低結合CD137。在一些其他具體實施例中，結合CD137之hTlc突變蛋白可與食蟹猴CD137 (cyCD137)交叉反應。
在一些具體實施例中，本發明之hTlc突變蛋白可干擾CD137L結合至CD137。
在一些具體實施例中，所提供之hTlc突變蛋白可包含，在相對應於成熟型hTlc之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 1)之位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150、及153一或多個位置，經突變之胺基酸殘基。
在一些具體實施例中，所提供之hTlc突變蛋白可包含，在相對應於成熟型hTlc之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 1)之位置26-34、55-58、60-61、65、104-106、及108的一或多個位置上，經突變之胺基酸殘基。
在一些具體實施例中，所提供之hTlc突變蛋白可進一步包含，在相對應於成熟型hTlc之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 1)之位置101、111、114、及153的一或多個位置上，經突變之胺基酸殘基。
在一些具體實施例中，所提供之hTlc突變蛋白可包含，相對應於成熟型hTlc之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 1)之位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150、及153，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、或甚而更多個位置之經突變之胺基酸殘基。在一些較佳之具體實施例中，所提供之hTlc突變蛋白能結合CD137，特別是人類CD137。
在一些具體實施例中，所提供之hTlc突變蛋白可包含，相對應於成熟型hTlc之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 1)之位置26-34、55-58、60-61、65、104-106、及108，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或甚而更多個位置之經突變之胺基酸殘基。在一些較佳之具體實施例中，所提供之hTlc突變蛋白能結合CD137，特別是人類CD137。
在一些具體實施例中，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白可包括原始半胱胺酸殘基由至少一胺基酸(如，絲胺酸殘基)取代。在一些具體實施例中，本發明之hTlc突變蛋白包括在與成熟型hTlc之線性多胜肽序列(SEQ ID NO:1)之位置61及/或153之相對應位置上原始半胱胺酸殘基之胺基酸由另一胺基酸(如，絲胺酸殘基)取代。在此情況下，發現到，移除由半胱胺酸殘基61與153形成之野生型hTlc之雙硫鍵結構(在個別原始核酸庫之程度上) (參見，Breustedt et al.,J Biol Chem , 2005)，可提供hTlc突變蛋白不僅穩定摺疊，且亦可以高親和力結合給定之非天然靶標。在一些具體實施例中，消除雙硫鍵結構可提供進一步優勢，即容許在本發明之突變蛋白中產生或故意導入非原始雙硫鍵，從而增加突變蛋白之穩定性。然而，結合CD137並具有在Cys 61與Cys 153之間形成雙硫鍵橋聯的hTlc突變蛋白，亦為本發明之一部分。
在一些特定具體實施例中，本發明之hTlc突變蛋白可包括，相對應於成熟型hTlc之線性多胜肽序列(SEQ ID NO:1)之位置61及/或153， 一或多個位置之胺基酸取代Cys 61 → Ala、Phe、Lys、Arg、Thr、Asn、Gly、Gln、Asp、Asn、Leu、Tyr、Met、Ser、Pro、或Trp，及/或Cys 153 → Ser或Ala, at。
在一些具體實施例中，相對應於成熟型hTlc之線性多胜肽序列(SEQ ID NO:1)之位置61、101、及153之二或全部三個半胱胺酸密碼子位置，由另一胺基酸之密碼子替代。此外，在一些具體實施例中，本發明之hTlc突變蛋白包括，相對應於成熟型hTlc之線性多胜肽序列(SEQ ID NO:1)之位置101之原始半胱胺酸殘基位置，由絲胺酸殘基或組胺酸殘基進行胺基酸取代。
在一些具體實施例中，本發明之突變蛋白包含一原始胺基酸由半胱胺酸殘基進行相對應於成熟型hTlc之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 1)之位置28或105之位置的胺基酸取代。此外，在一些具體實施例中，本發明之突變蛋白包含一原始精胺酸殘基由脯胺酸殘基進行相對應於成熟型hTlc之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 1)之位置111之位置的胺基酸取代。此外，在一些具體實施例中，本發明之突變蛋白包含一原始離胺酸殘基由色胺酸或麩胺酸殘基進行相對應於成熟型hTlc之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 1)之位置114之位置的胺基酸取代。
在一些具體實施例中，所提供之結合CD137之hTlc突變蛋白可包含，在相對應於成熟型hTlc之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 1)之位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150、及153的一或多個位置上，下列經突變之胺基酸殘基之一或多者：Ala 5 → Val或Thr；Arg 26 → Glu；Glu 27 → Gly；Phe 28 → Cys；Pro 29 → Arg；Glu 30 → Pro；Met 31 → Trp；Leu 33 → Ile；Glu 34 → Phe；Thr 42 → Ser；Gly 46 → Asp；Lys 52 → Glu；Leu 56 → Ala；Ser 58 → Asp；Arg 60 → Pro；Cys 61 → Ala；Lys 65 → Arg或Asn；Thr 71 → Ala；Val 85 → Asp；Lys 94 → Arg或Glu；Cys 101 → Ser；Glu 104 → Val；Leu 105 → Cys；His 106 → Asp；Lys 108 → Ser；Arg 111 → Pro；Lys 114 → Trp；Lys 121 → Glu；Ala 133 → Thr；Arg 148 → Ser；Ser 150 → Ile；以及Cys 153 → Ser。在一些具體實施例中，本發明之hTlc突變蛋白包含，在成熟型hTlc之彼等序列(SEQ ID NO: 1)位置之二或多個，如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、或多個，或甚而全部經突變之胺基酸殘基。
在一些具體實施例中，相較於成熟型hTlc之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 1)，所提供之結合CD137之hTlc突變蛋白可包含下列各組經突變之胺基酸殘基之一者： (a)         Arg 26 → Glu；Glu 27 → Gly；Phe 28 → Cys；Pro 29 → Arg；Glu 30 → Pro；Met 31 → Trp；Leu 33 → Ile；Glu 34 → Phe；Leu 56 → Ala；Ser 58 → Asp；Arg 60 → Pro；Cys 61 → Ala；Cys 101 → Ser；Glu 104 → Val；Leu 105 → Cys；His 106 → Asp；Lys 108 → Ser；Arg 111 → Pro；Lys 114 → Trp；以及Cys 153 → Ser； (b)        Ala 5 → Thr；Arg 26 → Glu；Glu 27 → Gly；Phe 28 → Cys；Pro 29 → Arg；Glu 30 → Pro；Met 31 → Trp；Leu 33 → Ile；Glu 34 → Phe；Leu 56 → Ala；Ser 58 → Asp；Arg 60 → Pro；Cys 61 → Ala；Lys 65 → Arg；Val 85 → Asp；Cys 101 → Ser；Glu 104 → Val；Leu 105 → Cys；His 106 → Asp；Lys 108 → Ser；Arg 111 → Pro；Lys 114 → Trp；Lys 121 → Glu；Ala 133 → Thr；以及Cys 153 → Ser； (c)         Arg 26 → Glu；Glu 27 → Gly；Phe 28 → Cys；Pro 29 → Arg；Glu 30 → Pro；Met 31 → Trp；Leu 33 → Ile；Glu 34 → Phe；Leu 56 → Ala；Ser 58 → Asp；Arg 60 → Pro；Cys 61 → Ala；Lys 65 → Asn；Lys 94 → Arg；Cys 101 → Ser；Glu 104 → Val；Leu 105 → Cys；His 106 → Asp；Lys 108 → Ser；Arg 111 → Pro；Lys 114 → Trp；Lys 121 → Glu；Ala 133 → Thr；以及Cys 153 → Ser； (d)        Ala 5 → Val；Arg 26 → Glu；Glu 27 → Gly；Phe 28 → Cys；Pro 29 → Arg；Glu 30 → Pro；Met 31 → Trp；Leu 33 → Ile；Glu 34 → Phe；Leu 56 → Ala；Ser 58 → Asp；Arg 60 → Pro；Cys 61 → Ala；Lys 65 → Arg；Lys 94 → Glu；Cys 101 → Ser；Glu 104 → Val；Leu 105 → Cys；His 106 → Asp；Lys 108 → Ser；Arg 111 → Pro；Lys 114 → Trp；Lys 121 → Glu；Ala 133 → Thr；以及Cys 153 → Ser； (e)         Arg 26 → Glu；Glu 27 → Gly；Phe 28 → Cys；Pro 29 → Arg；Glu 30 → Pro；Met 31 → Trp；Leu 33 → Ile；Glu 34 → Phe；Thr 42 → Ser；Leu 56 → Ala；Ser 58 → Asp；Arg 60 → Pro；Cys 61 → Ala；Cys 101 → Ser；Glu 104 → Val；Leu 105 → Cys；His 106 → Asp；Lys 108 → Ser；Arg 111 → Pro；Lys 114 → Trp；Ser 150 → Ile；以及Cys 153 → Ser； (f)          Arg 26 → Glu；Glu 27 → Gly；Phe 28 → Cys；Pro 29 → Arg；Glu 30 → Pro；Met 31 → Trp；Leu 33 → Ile；Glu 34 → Phe；Lys 52 → Glu；Leu 56 → Ala；Ser 58 → Asp；Arg 60 → Pro；Cys 61 → Ala；Thr 71 → Ala；Cys 101 → Ser；Glu 104 → Val；Leu 105 → Cys；His 106 → Asp；Lys 108 → Ser；Arg 111 → Pro；Lys 114 → Trp；Ala 133 → Thr；Arg 148 → Ser；Ser 150 → Ile；以及Cys 153 → Ser；以及 (g)         Ala 5 → Thr；Arg 26 → Glu；Glu 27 → Gly；Phe 28 → Cys；Pro 29 → Arg；Glu 30 → Pro；Met 31 → Trp；Leu 33 → Ile；Glu 34 → Phe；Gly 46 → Asp；Leu 56 → Ala；Ser 58 → Asp；Arg 60 → Pro；Cys 61 → Ala；Thr 71 → Ala；Cys 101 → Ser；Glu 104 → Val；Leu 105 → Cys；His 106 → Asp；Lys 108 → Ser；Arg 111 → Pro；Lys 114 → Trp；Ser 150 → Ile；以及Cys 153 → Ser。
在一些具體實施例中，本發明hTlc突變蛋白之剩餘區域，亦即不同於相對應於成熟型hTlc之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 1)之位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150、及153之位置的區域，可包含經突變之胺基酸序列位置以外的成熟型hTlc線性多胜肽序列之野生型(原始)胺基酸序列。
在一些具體實施例中，本發明hTlc突變蛋白與成熟型hTlc序列(SEQ ID NO: 1)具有至少70%序列一致性或至少70%序列同源性。作為示例，SEQ ID NO: 34之突變蛋白與成熟型hTlc之胺基酸序列具有約84%之胺基酸序列一致性或序列同源性。
在一些具體實施例中，本發明之hTlc突變蛋白包含如SEQ ID NOs: 34-40之任一者所示之胺基酸序列或其片段或變體。
在一些具體實施例中，本發明之hTlc突變蛋白與選自於由SEQ ID NOs: 34-40所組成群組之胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或更高之序列一致性。
本發明亦包括hTlc突變蛋白之結構同源物，其具有選自於由SEQ ID NOs: 34-40所組成群組之胺基酸序列，相對於該hTlc突變蛋白，其結構同源物具有大於約60%，較佳地大於65%、大於70%、大於75%、大於80%、大於85%、大於90%、大於92%、及最佳地大於95%之胺基酸序列同源性或序列一致性。
在一些態樣中，本發明提供結合CD137之hNGAL突變蛋白。在此情況下，本發明提供一或多個hNGAL突變蛋白，其能以經測定之KD 約800 nM、700 nM、200 nM、140 nM、100 nM、或更低，較佳地約70 nM、50 nM、30 nM、10 nM、5 nM、2 nM、或甚而更低之親和力結合CD137。在一些具體實施例中，所提供之hNGAL突變蛋白能以EC50 值約1000 nM、500 nM、100 nM、80 nM、50 nM、25 nM、18 nM、15 nM、10 nM、5 nM、或更低結合CD137。
在一些具體實施例中，所提供之結合CD137之hNGAL突變蛋白可與食蟹猴CD137交叉反應。在一些具體實施例中，所提供之hNGAL突變蛋白能以經測定之KD 約50 nM、20 nM、10 nM、5 nM、2 nM、或甚而更低之親和力結合食蟹猴CD137。在一些具體實施例中，所提供之hNGAL 突變蛋白能以EC50 值約100 nM、80 nM、50 nM、30 nM、或甚而更低結合食蟹猴CD137。
在一些具體實施例中，本發明之hNGAL突變蛋白可干擾或競爭CD137L結合至CD137。在一些其他具體實施例中，本發明之hNGAL突變蛋白可能在CD137L存在下結合CD137及/或結合CD137/CD137L複合體。
在一些具體實施例中，所提供之hNGAL突變蛋白可包含，在相對應於成熟型hNGAL之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 2)之位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132、及134的一或多個位置上，經突變之胺基酸殘基。
在一些具體實施例中，所提供之hNGAL突變蛋白可包含，在相對應於成熟型hNGAL之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 2)之位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132、及134之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、或甚而更多個位置，經突變之胺基酸殘基。在一些較佳之具體實施例中，所提供之hNGAL突變蛋白能結合CD137，特別是人類CD137。
在一些具體實施例中，所提供之hNGAL突變蛋白可包含，在相對應於成熟型hNGAL之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 2)之位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132、及134的一或多個位置上，經突變之胺基酸殘基。在一些較佳之具體實施例中，所提供之hNGAL突變蛋白能結合CD137，特別是人類CD137。
在一些具體實施例中，所提供之hNGAL突變蛋白可包含，在相對應於成熟型hNGAL之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 2)之位置36、87、及96的一或多個位置上，且在相對應於成熟型hNGAL之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 2)之位置28、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、94、100、103、106、125、127、132、及134的一或多個位置上，經突變之胺基酸殘基。
在其他一些具體實施例中，所提供之hNGAL突變蛋白可包含，在相對應於成熟型hNGAL之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 2)之位置20、25、28、33、36、40-41、44、49、52、59、68、70-73、77-82、87、92、96、98、100、101、103、122、125、127、132、及134的一或多個位置上，經突變之胺基酸殘基。
在其他具體實施例中，所提供之hNGAL突變蛋白可包含，在相對應於成熟型hNGAL之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 2)之位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、125、127、132、及134的一或多個位置上，且在相對應於成熟型hNGAL之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 2)之位置20、25、33、44、59、71、78、80、82、87、92、98、101、及122的一或多個位置上，經突變之胺基酸殘基。
在一些具體實施例中，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白可包含原始半胱胺酸殘基由諸如絲胺酸殘基進行至少一胺基酸取代。在一些具體實施例中，本發明之hNGAL突變蛋白可包含，在相對應於成熟型hNGAL之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 2)之位置76及/或175的位置上，原始半胱胺酸殘基由另一胺基酸(如，絲胺酸殘基)進行胺基酸取代。在此情況下，發現到，移除由半胱胺酸殘基76與175形成之野生型hNGAL之雙硫鍵結構(在個別原始核酸庫之程度上) (參見，Breustedt et al.,J Biol Chem , 2005)，可提供hNGAL突變蛋白不僅穩定摺疊，且亦可以高親和力結合給定之非天然靶標。在一些具體實施例中，消除雙硫鍵結構可提供進一步優勢，即容許在本發明之突變蛋白中產生或故意導入非原始雙硫鍵，從而增加突變蛋白之穩定性。然而，結合CD137並具有在Cys 76與Cys 175之間形成雙硫鍵橋聯的hNGAL突變蛋白，亦為本發明之一部分。
在一些具體實施例中，所提供之CD137結合hNGAL突變蛋白可包含，在相對應於成熟型hNGAL之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 2)之位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132、及134的一或多個位置上，一或多個下列經突變之胺基酸殘基：Gln 28 → His；Leu 36 → Gln；Ala 40 → Ile；Ile 41 → Arg或Lys；Gln 49 → Val、Ile、His、Ser或Asn；Tyr 52 → Met；Asn 65 → Asp；Ser 68 → Met、Ala或Gly；Leu 70 → Ala、Lys、Ser或Thr；Arg 72 → Asp；Lys 73 → Asp；Asp 77 → Met、Arg、Thr或Asn；Trp 79 → Ala或Asp；Arg 81 → Met、Trp或Ser；Phe 83 → Leu；Cys 87 → Ser；Leu 94 → Phe；Asn 96 → Lys；Tyr 100 → Phe；Leu 103 → His；Tyr 106 → Ser；Lys 125 → Phe；Ser 127 → Phe；Tyr 132 → Glu及Lys 134 → Tyr。在一些具體實施例中，本發明之hNGAL突變蛋白包含，在彼等成熟型hNGAL之序列 (SEQ ID NO: 2)位置之二或多個，如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、甚而更多個，如13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或所有的，經突變之胺基酸殘基。
在一些具體實施例中，所提供之結合CD137之hNGAL突變蛋白可包含，在相對應於成熟型hNGAL之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 2)之位置20、25、28、33、36、40-41、44、49、52、59、68、70-73、77-82、87、92、96、98、100、101、103、122、125、127、132、及134的一或多個位置上，下列經突變之胺基酸殘基之一或多者：Gln 20 → Arg；Asn 25 → Tyr或Asp；Gln 28 → His；Val 33 → Ile；Leu 36 →Met；Ala 40 → Asn；Ile 41 → Leu；Glu 44 → Val或Asp；Gln 49 → His；Tyr 52 →Ser或Gly；Lys 59 → Asn；Ser 68 → Asp；Leu 70 → Met；Phe 71 → Leu；Arg 72 → Leu；Lys 73 → Asp；Asp 77 → Gln或His；Tyr 78 → His；Trp 79 → Ile；Ile 80 → Asn；Arg 81 → Trp或Gln；Thr 82 → Pro；Cys 87 → Ser；Phe 92 → Leu或Ser；Asn 96 → Phe；Lys 98 → Arg；Tyr 100 → Asp；Pro 101 → Leu；Leu 103 → His或Pro；Phe 122 → Tyr；Lys 125 → Ser；Ser 127 → Ile；Tyr 132 → Trp；以及Lys 134 → Gly。
在一些具體實施例中，所提供之結合CD137之hNGAL突變蛋白可包含，在相對應於成熟型hNGAL之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 2)之位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、125、127、132、及134的一或多個位置上，下列經突變之胺基酸殘基之一或多者：Leu 36 →Met；Ala 40 → Asn；Ile 41 → Leu；Gln 49 → His；Tyr 52 →Ser或Gly；Ser 68 → Asp；Leu 70 → Met；Arg 72 → Leu；Lys 73 → Asp；Asp 77 → Gln或His；Trp 79 → Ile；Arg 81 → Trp或Gln；Asn 96 → Phe；Tyr 100 → Asp；Leu 103 → His或Pro；Lys 125 → Ser；Ser 127 → Ile；Tyr 132 → Trp；以及Lys 134 → Gly。在一些具體實施例中，所提供之結合CD137之hNGAL突變蛋白進一步可包含，在相對應於成熟型hNGAL之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 2)之位置20、25、33、44、59、71、78、80、82、87、92、98、101、及122的一或多個位置上，一或多個下列經突變之胺基酸殘基：Gln 20 → Arg；Asn 25 → Tyr或Asp；Val 33 → Ile；Glu 44 → Val或Asp；Lys 59 → Asn；Phe 71 → Leu；Tyr 78 → His；Ile 80 → Asn；Thr 82 → Pro；Phe 92 → Leu或Ser；Lys 98 → Arg；Pro 101 → Leu；以及Phe 122 → Tyr。
在一些具體實施例中，相較於成熟型hNGAL之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 2)，所提供之結合CD137之hNGAL突變蛋白可包含下列各組經突變之胺基酸殘基之一者： (a)         Gln 28 → His；Leu 36 → Gln；Ala 40 → Ile；Ile 41 → Lys；Gln 49 → Asn；Tyr 52 → Met；Ser 68 → Gly；Leu 70 → Thr；Arg 72 → Asp；Lys 73 → Asp；Asp 77 → Thr；Trp 79 → Ala；Arg 81 → Ser；Cys 87 → Ser；Asn 96 → Lys；Tyr 100 → Phe；Leu 103 → His；Tyr 106 → Ser；Lys 125 → Phe；Ser 127 → Phe；Tyr 132 → Glu；以及Lys 134 → Tyr； (b)        Gln 28 → His；Leu 36 → Gln；Ala 40 → Ile；Ile 41 → Arg；Gln 49 → Ile；Tyr 52 → Met；Asn 65 → Asp；Ser 68 → Met；Leu 70 → Lys；Arg 72 → Asp；Lys 73 → Asp；Asp 77 → Met；Trp 79 → Asp；Arg 81 → Trp；Cys 87 → Ser；Asn 96 → Lys；Tyr 100 → Phe；Leu 103 → His；Tyr 106 → Ser；Lys 125 → Phe；Ser 127 → Phe；Tyr 132 → Glu；以及Lys 134 → Tyr； (c)         Gln 28 → His；Leu 36 → Gln；Ala 40 → Ile；Ile 41 → Arg；Gln 49 → Asn；Tyr 52 → Met；Asn 65 → Asp；Ser 68 → Ala；Leu 70 → Ala；Arg 72 → Asp；Lys 73 → Asp；Asp 77 → Thr；Trp 79 → Asp；Arg 81 → Trp；Cys 87 → Ser；Asn 96 → Lys；Tyr 100 → Phe；Leu 103 → His；Tyr 106 → Ser；Lys 125 → Phe；Ser 127 → Phe；Tyr 132 → Glu；以及Lys 134 → Tyr； (d)        Gln 28 → His；Leu 36 → Gln；Ala 40 → Ile；Ile 41 → Lys；Gln 49 → Asn；Tyr 52 → Met；Asn 65 → Asp；Ser 68 → Ala；Leu 70 → Ala；Arg 72 → Asp；Lys 73 → Asp；Asp 77 → Thr；Trp 79 → Asp；Arg 81 → Trp；Cys 87 → Ser；Asn 96 → Lys；Tyr 100 → Phe；Leu 103 → His；Tyr 106 → Ser；Lys 125 → Phe；Ser 127 → Phe；Tyr 132 → Glu；以及Lys 134 → Tyr； (e)         Gln 28 → His；Leu 36 → Gln；Ala 40 → Ile；Ile 41 → Lys；Gln 49 → Ser；Tyr 52 → Met；Asn 65 → Asp；Ser 68 → Gly；Leu 70 → Ser；Arg 72 → Asp；Lys 73 → Asp；Asp 77 → Thr；Trp 79 → Ala；Arg 81 → Met；Cys 87 → Ser；Asn 96 → Lys；Tyr 100 → Phe；Leu 103 → His；Tyr 106 → Ser；Lys 125 → Phe；Ser 127 → Phe；Tyr 132 → Glu；以及Lys 134 → Tyr； (f)          Gln 28 → His；Leu 36 → Gln；Ala 40 → Ile；Ile 41 → Lys；Gln 49 → Val；Tyr 52 → Met；Asn 65 → Asp；Ser 68 → Gly；Leu 70 → Thr；Arg 72 → Asp；Lys 73 → Asp；Asp 77 → Arg；Trp 79 → Asp；Arg 81 → Ser；Cys 87 → Ser；Leu 94 → Phe；Asn 96 → Lys；Tyr 100 → Phe；Leu 103 → His；Tyr 106 → Ser；Lys 125 → Phe；Ser 127 → Phe；Tyr 132 → Glu；以及Lys 134 → Tyr； (g)         Gln 28 → His；Leu 36 → Gln；Ala 40 → Ile；Ile 41 → Arg；Gln 49 → His；Tyr 52 → Met；Asn 65 → Asp；Ser 68 → Gly；Leu 70 → Thr；Arg 72 → Asp；Lys 73 → Asp；Asp 77 → Thr；Trp 79 → Ala；Arg 81 → Ser；Cys 87 → Ser；Asn 96 → Lys；Tyr 100 → Phe；Leu 103 → His；Tyr 106 → Ser；Lys 125 → Phe；Ser 127 → Phe；Tyr 132 → Glu；以及Lys 134 → Tyr； (h)        Gln 28 → His；Leu 36 → Gln；Ala 40 → Ile；Ile 41 → Lys；Gln 49 → Asn；Tyr 52 → Met；Asn 65 → Asp；Ser 68 → Gly；Leu 70 → Thr；Arg 72 → Asp；Lys 73 → Asp；Asp 77 → Thr；Trp 79 → Ala；Arg 81 → Ser；Phe 83 → Leu；Cys 87 → Ser；Leu 94 → Phe；Asn 96 → Lys；Tyr 100 → Phe；Leu 103 → His；Tyr 106 → Ser；Lys 125 → Phe；Ser 127 → Phe；Tyr 132 → Glu；以及Lys 134 → Tyr；或者 (i)           Gln 28 → His；Leu 36 → Gln；Ala 40 → Ile；Ile 41 → Arg；Gln 49 → Ser；Tyr 52 → Met；Asn 65 → Asp；Ser 68 → Ala；Leu 70 → Thr；Arg 72 → Asp；Lys 73 → Asp；Asp 77 → Asn；Trp 79 → Ala；Arg 81 → Ser；Cys 87 → Ser；Asn 96 → Lys；Tyr 100 → Phe；Leu 103 → His；Tyr 106 → Ser；Lys 125 → Phe；Ser 127 → Phe；Tyr 132 → Glu；以及Lys 134 → Tyr。
在一些進一步之具體實施例中，在剩餘區域，亦即不同於成熟型hNGAL之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 2)之位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132、及134的區域中，本發明之hNGAL突變蛋白可包括經突變之胺基酸序列位置以外之成熟型hNGAL的野生型(原始)胺基酸序列。
在一些其他具體實施例中，相較於成熟型hNGAL之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 2)，所提供之結合CD137之hNGAL突變蛋白可包含下列各組經突變之胺基酸殘基之一者： (a)         Leu 36 → Met；Ala 40 → Asn；Ile 41 → Leu；Gln 49 → His；Tyr 52 → Ser；Ser 68 → Asp；Leu 70 → Met；Arg 72 → Leu；Lys 73 → Asp；Asp 77 → Gln；Trp 79 → Ile；Arg 81 → Trp；Asn 96 → Phe；Tyr 100 → Asp；Leu 103 → His；Lys 125 → Ser；Ser 127 → Ile；Tyr 132 → Trp；以及Lys 134 → Gly； (b)        Leu 36 → Met；Ala 40 → Asn；Ile 41 → Leu；Gln 49 → His；Tyr 52 → Ser；Ser 68 → Asp；Leu 70 → Met；Arg 72 → Leu；Lys 73 → Asp；Asp 77 → Gln；Trp 79 → Ile；Arg 81 → Trp；Phe 92 → Leu；Asn 96 → Phe；Lys 98 → Arg；Tyr 100 → Asp；Pro 101 → Leu；Leu 103 → His；Lys 125 → Ser；Ser 127 → Ile；Tyr 132 → Trp；以及Lys 134 → Gly； (c)         Asn 25 → Tyr；Leu 36 → Met；Ala 40 → Asn；Ile 41 → Leu；Gln 49 → His；Tyr 52 → Gly；Ser 68 → Asp；Leu 70 → Met；Phe 71 → Leu；Arg 72 → Leu；Lys 73 → Asp；Asp 77 → Gln；Trp 79 → Ile；Arg 81 → Gln；Phe 92 → Ser；Asn 96 → Phe；Tyr 100 → Asp；Leu 103 → His；Lys 125 → Ser；Ser 127 → Ile；Tyr 132 → Trp；以及Lys 134 → Gly； (d)        Leu 36 → Met；Ala 40 → Asn；Ile 41 → Leu；Gln 49 → His；Tyr 52 → Gly；Ser 68 → Asp；Leu 70 → Met；Arg 72 → Leu；Lys 73 → Asp；Asp 77 → Gln；Tyr 78 → His；Trp 79 → Ile；Arg 81 → Trp；Phe 92 → Leu；Asn 96 → Phe；Tyr 100 → Asp；Leu 103 → His；Lys 125 → Ser；Ser 127 → Ile；Tyr 132 → Trp；以及Lys 134 → Gly； (e)         Asn 25 → Asp；Leu 36 → Met；Ala 40 → Asn；Ile 41 → Leu；Gln 49 → His；Tyr 52 → Gly；Ser 68 → Asp；Leu 70 → Met；Arg 72 → Leu；Lys 73 → Asp；Asp 77 → Gln；Trp 79 → Ile；Arg 81 → Trp；Phe 92 → Leu；Asn 96 → Phe；Tyr 100 → Asp；Leu 103 → His；Lys 125 → Ser；Ser 127 → Ile；Tyr 132 → Trp；以及Lys 134 → Gly； (f)          Val 33 → Ile；Leu 36 → Met；Ala 40 → Asn；Ile 41 → Leu；Gln 49 → His；Tyr 52 → Gly；Ser 68 → Asp；Leu 70 → Met；Arg 72 → Leu；Lys 73 → Asp；Asp 77 → Gln；Trp 79 → Ile；Arg 81 → Trp；Phe 92 → Leu；Asn 96 → Phe；Tyr 100 → Asp；Leu 103 → His；Lys 125 → Ser；Ser 127 → Ile；Tyr 132 → Trp；以及Lys 134 → Gly； (g)         Gln 20 → Arg；Leu 36 → Met；Ala 40 → Asn；Ile 41 → Leu；Glu 44 → Val；Gln 49 → His；Tyr 52 → Gly；Ser 68 → Asp；Leu 70 → Met；Arg 72 → Leu；Lys 73 → Asp；Asp 77 → Gln；Trp 79 → Ile；Arg 81 → Trp；Phe 92 → Leu；Asn 96 → Phe；Tyr 100 → Asp；Leu 103 → His；Phe 122 → Tyr；Lys 125 → Ser；Ser 127 → Ile；Tyr 132 → Trp；以及Lys 134 → Gly； (h)        Leu 36 → Met；Ala 40 → Asn；Ile 41 → Leu；Gln 49 → His；Tyr 52 → Ser；Ser 68 → Asp；Leu 70 → Met；Arg 72 → Leu；Lys 73 → Asp；Asp 77 → Gln；Trp 79 → Ile；Ile 80 → Asn；Arg 81 → Trp；Thr 82 → Pro；Asn 96 → Phe；Tyr 100 → Asp；Pro 101 → Leu；Leu 103 → Pro；Lys 125 → Ser；Ser 127 → Ile；Tyr 132 → Trp；以及Lys 134 → Gly； (i)           Leu 36 → Met；Ala 40 → Asn；Ile 41 → Leu；Gln 49 → His；Tyr 52 → Gly；Lys 59 → Asn；Ser 68 → Asp；Leu 70 → Met；Arg 72 → Leu；Lys 73 → Asp；Asp 77 → Gln；Trp 79 → Ile；Arg 81 → Trp；Phe 92 → Leu；Asn 96 → Phe；Tyr 100 → Asp；Leu 103 → His；Lys 125 → Ser；Ser 127 → Ile；Tyr 132 → Trp；以及Lys 134 → Gly；以及 (j)           Leu 36 → Met；Ala 40 → Asn；Ile 41 → Leu；Glu 44 → Asp；Gln 49 → His；Tyr 52 → Ser；Ser 68 → Asp；Leu 70 → Met；Phe 71 → Leu；Arg 72 → Leu；Lys 73 → Asp；Asp 77 → His；Trp 79 → Ile；Arg 81 → Trp；Phe 92 → Leu；Asn 96 → Phe；Tyr 100 → Asp；Leu 103 → His；Lys 125 → Ser；Ser 127 → Ile；Tyr 132 → Trp；以及Lys 134 → Gly。
在一些具體實施例中，在剩餘區域，亦即不同於成熟型hNGAL之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 2)之位置20、25、28、33、36、40-41、44、49、52、59、68、70-73、77-82、87、92、96、98、100、101、103、122、125、127、132、及134的區域中，本發明之hNGAL突變蛋白可包括經突變之胺基酸序列位置以外之成熟型hNGAL的野生型(原始)胺基酸序列。
在一些具體實施例中，本發明之hNGAL突變蛋白與成熟型hNGAL之序列(SEQ ID NO: 2)具有至少70%序列一致性或至少70%序列同源性。作為示例，SEQ ID NO: 42之突變蛋白與成熟型hNGAL之胺基酸序列具有約87%的胺基酸序列一致性或序列同源性。
在一些具體實施例中，本發明之hNGAL突變蛋白包含如SEQ ID NOs: 41-59或其片段或變體之任一者所示之胺基酸序列。
在一些具體實施例中，本發明之hNGAL突變蛋白與選自於由SEQ ID NOs: 41-59所組成群組之胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或更高之序列一致性。
本發明亦包括hNGAL突變蛋白之結構同源物，其具有選自於由SEQ ID NOs: 41-59所組成群組之胺基酸序列，相對於該hNGAL突變蛋白，其結構同源物具有大於約60%，較佳地大於65%、大於70%、大於75%、大於80%、大於85%、大於90%、大於92%、及最佳地大於95%之胺基酸序列同源性或序列一致性。
在一些具體實施例中，本發明提供一脂質運載蛋白突變蛋白，其以經測定之親和力KD 約5 nM或更低結合CD137，其中脂質運載蛋白突變蛋白與SEQ ID NO: 42之胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或更高的序列一致性。
在一些具體實施例中，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白可在其N或C端，較佳地C端，包含異源性胺基酸序列，如Strep II標記(SEQ ID NO: 12)或特定限制酶之切割位點序列，而不影響脂質運載蛋白突變蛋白的生物活性(結合至其標靶，如CD137)。
在一些具體實施例中，可導入脂質運載蛋白突變蛋白之進一步修飾，以調控突變蛋白之特定特徵，如改進摺疊穩定性、血清穩定性、蛋白質抗性或水溶性、或降低凝集現象，或將新特徵導入突變蛋白。在一些具體實施例中，修飾作用可導致所提供之突變蛋白之二或多個(如，2、3、4、5、6、7、8、9、或10)特徵受調控。
舉例而言，有可能使脂質運載蛋白突變蛋白之一或多個胺基酸序列位置發生突變，以導入新的反應基團，例如，用於鍵聯其他化合物，如聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、生物素、胜肽、或蛋白質，或用於形成非天然存在之雙硫鍵。鍵聯之化合物(如，PEG與HES)在一些情況下可增加相對應之脂質運載蛋白突變蛋白之血清半衰期。
在一些具體實施例中，脂質運載蛋白突變蛋白之反應性基團可天然存在於其胺基酸序列中，如天然存在於該胺基酸序列中之半胱胺酸殘基。在一些其他具體實施例中，此反應性基團可經由突變導入。在經由突變導入反應性基團之情況中，一可能性為在適當位置之胺基酸突變為半胱胺酸殘基。將半胱胺酸殘基導入hTlc突變蛋白胺基酸序列中之此一突變的示例性可能性包括hTlc (SEQ ID NO: 1)之野生型序列的取代Thr 40→ Cys、Glu 73→ Cys、Arg 90→ Cys、Asp 95→ Cys、及Glu 131→ Cys。將半胱胺酸殘基導入hNGAL突變蛋白胺基酸序列之此一突變的示例性可能性包括，在相對應於hNGAL之野生型序列(SEQ ID NO: 2)之序列位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146、或158的一或多個序列位置導入半胱胺酸殘基。所產生之硫醇部分可用於聚乙二醇化(PEGylate)或羥乙基化(HESylate)突變蛋白，舉例而言，以增加個別脂質運載蛋白突變蛋白之血清半衰期。
在一些具體實施例中，欲提供適用之胺基酸側鏈作為新的反應性基團，將上述化合物之一者鍵聯至脂質運載蛋白突變蛋白，可將人工胺基酸導入脂質運載蛋白突變蛋白之胺基酸序列。一般而言，此類人工胺基酸設計成更具反應性，從而促進與所需之化合物鍵聯。此類人工胺基酸可利用突變導入，舉例而言，人工tRNA使用對乙醯基苯丙胺酸。
在一些具體實施例中，本發明脂質運載蛋白突變蛋白以其N端或其C端融合至蛋白質、蛋白質結構域、或胜肽，舉例而言，抗體、信息序列、及/或親和力標記。在一些其他具體實施例中，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白以其N端或其C端鍵聯至伴侶分子，其為蛋白質、蛋白質結構域、或胜肽；舉例而言，抗體、信息序列、及/或親和力標記。
親和力標記，如Strep標記或Strep標記II (Schmidt et al.,J Mol Biol , 1996)、c-myc標記、FLAG標記、His標記、或HA標記，或蛋白質如穀胱甘肽S轉移酶(glutathione-S-transferase)，其容許輕易檢測及/或純化重組型 蛋白質，為適用之融合伴侶分子之實例。具有顯色(chromogenic)或螢光特性之蛋白，如綠色螢光蛋白(GFP)或黃色螢光蛋白(YFP)，亦為脂質運載蛋白突變蛋白之適用融合伴侶分子。一般而言，可以任何合適之化學物質或酵素標記本發明之脂質運載蛋白突變蛋白，其在化學、物理、光學、或酵素反應中直接或間接產生可檢測之化合物或信號。舉例而言，可將螢光或放射性標記鍵聯至脂質運載蛋白突變蛋白，產生螢光或X射線以作為可檢測信號。鹼性磷酸酶、山葵過氧化酶、及β半乳糖苷酶為催化形成顯色反應產物的酵素標記(且同時為光學標記)實例。一般而言，常用於抗體之所有標記(除了專門與免疫球蛋白Fc部分之糖部分一起使用之彼等以外)亦可用於鍵聯至本發明之脂質運載蛋白突變蛋白。
在一些具體實施例中，本發明之脂質運載蛋白突變蛋白可融合或鍵聯一部份以延長突變蛋白之血清半衰期(此方面亦可參見，國際專利公開號WO 2006/056464，其中所述策略為參考人類嗜中性球明膠酶相關聯之脂質運載蛋白(hNGAL)突變蛋白對CTLA-4之結合親和力)。延長血清半衰期之部分可為PEG分子、HES分子、脂肪酸分子，如棕櫚酸(Vajo and Duckworth,Pharmacol Rev , 2000)、免疫球蛋白之Fc部分、免疫球蛋白之CH 3結構域、免疫球蛋白之CH 4結構域、白蛋白結合胜肽、白蛋白結合蛋白、或轉鐵蛋白，僅舉數例。
在一些具體實施例中，若將PEG作為鍵聯伴侶分子，則PEG分子可為經取代、未經取代、直鏈型、或支鏈型。其亦可為活化型聚乙烯衍生物。適用之化合物實例為PEG分子，如國際專利公開號WO 1999/64016、美國專利號6,177,074、或美國專利號6,403,564所述之關於干擾素，或如所述，針對其他蛋白質，如PEG修飾之天冬醯胺酸酶、PEG腺核苷脫胺酶(PEG-ADA)、或PEG超氧化物歧化酶(Fuertges and Abuchowski,Journal of Controlled Release , 1990)。此類聚合物(如，聚乙二醇)之分子量範圍可為約300至約70,000道耳吞，包括例如，具有分子量約10,000、約20,000、約30,000、或約40,000道耳吞之聚乙二醇。此外，如美國專利號6,500,930或6,620,413所述，欲延長血清半衰期，可將碳水化合物寡聚物與聚合物(如HES)鍵聯至本發明之突變蛋白。
在一些具體實施例中，若免疫球蛋白Fc部分之使用目的在於延長本發明脂質運載蛋白突變蛋白之血清半衰期，則可使用商購自Syntonix Pharmaceuticals, Inc. (MA，USA)的SynFusion™技術。此Fc融合技術之使用可產生作用時間更長的生物藥物，且可由二個拷貝子之突變蛋白組成，其連接至抗體Fc區，以改進藥物動力學、溶解度、及生產效率。
可用於延長脂質運載蛋白突變蛋白之血清半衰期之白蛋白結合胜肽的實例為，舉例而言，彼等具有Cys-Xaa1 -Xaa2 -Xaa3 -Xaa4 -Cys一致序列者，其中Xaa1 為Asp、Asn、Ser、Thr、或Trp；Xaa2 為Asn、Gln、His、Ile、Leu、或Lys；Xaa3 為Ala、Asp、Phe、Trp、或Tyr；以及Xaa4 為Asp、Gly、Leu、Phe、Ser、或Thr，如美國專利號20030069395或Dennis et al. (2002)所述。融合或鍵聯至脂質運載蛋白突變蛋白以延長血清半衰期的白蛋白結合蛋白可為細菌白蛋白結合蛋白質、抗體、抗體片段，包括結構域抗體(例如參見，美國專利號6,696,245)、或具有白蛋白結合活性之脂質運載蛋白突變蛋白。細菌白蛋白結合蛋白之實例包括鏈球菌蛋白質G (Konig and Skerra,J Immunol Methods , 1998)。
在一些具體實施例中，若白蛋白結合蛋白質為抗體片段，則其可為結構域抗體。結構域抗體(dAbs)係經基因工程以容許精準控制生物物理性質與體內半衰期，產生最佳的安全性與功效產物樣貌。結構域抗體可購自Domantis Ltd. (Cambridge，UK及MA，USA)。
在一些具體實施例中，白蛋白本身(Osborn et al.,J Pharmacol Exp Ther , 2002)，或白蛋白之生物上活性片段可作為本發明脂質運載蛋白突變蛋白之伴侶分子，以延長血清半衰期。術語「白蛋白」包括所有哺乳類動物之白蛋白，如人類血清白蛋白或牛血清白蛋白或大鼠白蛋白。白蛋白或其片段可以重組方式產生，如美國專利號5,728,553或歐洲專利公開號EP0330451與EP0361991所述。據此，重組型人類白蛋白(如，Recombumin® from Novozymes Delta Ltd.，Nottingham，UK)可鍵聯或融合至本發明之脂質運載蛋白突變蛋白。
在一些具體實施例中，若以轉鐵蛋白作為延長本發明脂質運載蛋白突變蛋白之血清半衰期的伴侶分子，則該突變蛋白可以基因工程方式融合至非經醣化之轉鐵蛋白N端或C端或兩者。非經醣化之轉鐵蛋白之半衰期為14-17天，而轉鐵蛋白融合蛋白之半衰期類似。轉鐵蛋白載體亦提供高的生物可利用率、生物分佈性、及循環穩定性。此技術購自BioRexis (BioRexis Pharmaceutical Corporation，PA，USA)。用作蛋白質穩定劑/半衰期延長伴侶分子的重組型人類轉鐵蛋白(DeltaFerrin™)係購自Novozymes Delta Ltd. (Nottingham，UK)。
延長本發明脂質運載蛋白突變蛋白半衰期之另一選擇為，將一長的、非結構的、撓性富含甘胺酸之序列(例如，具有約20至80個連續甘胺酸殘基之多甘胺酸)融合至突變蛋白N端或C端。此方法揭示在國際專利公開號WO2007/038619，亦稱作「rPEG」 (重組型PEG)。E. CD137 與 PD-L1 特異性融合蛋白之示例性用途及應用
在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可經由雙重靶向(dual-targeting) CD137與PD-L1產生協同作用。在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可經由CD137共同刺激作用及PD-1/PD-L1途徑阻斷作用產生協同作用。在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可經由雙重靶向CD137與PD-L1產生局部抗腫瘤作用。因此，本發明融合蛋白在醫學上存在許多可能的應用。
在一些具體實施例中，本發明涵蓋一或多個本文揭示之融合蛋白或一或多個含有此類融合蛋白而同時結合CD137與PD-L1之組合物的用途。
本發明亦涉及一或多個所述融合蛋白與CD137及/或PD-L1形成複合體的用途。
因此，在本發明之一態樣中，所提供之融合蛋白可用於檢測CD137與PD-L1。此用途之步驟可包括，在適當條件下，以一或多個該融合蛋白與預期含有CD137及/或PD-L1之樣本接觸，從而容許在融合蛋白與CD137及/或PD-L1之間形成複合體，並利用合適之信號檢測複合體。如上面所述，可檢測信號可由標記引起，或者由結合本身(即形成複合體)之物理性質改變引起。一實例為表面電漿共振，其值在結合伴侶分子的結合過程中改變，其中將該結合伴侶分子固定在諸如金箔之表面上。
本發明之融合蛋白亦可用於分開CD137及/或PD-L1。此用途之步驟可包括，在適當條件下，以一或多個該融合蛋白與預期含有CD137及/或PD-L1之樣本接觸，從而容許在融合蛋白與CD137及/或PD-L1之間形成複合體，並將複合體與樣本分開。
在一些態樣中，本發明提供含有本發明之一或多個融合蛋白的診斷及/或分析套組。
除了診斷用途以外，在又另一態樣中，本發明考慮到含有一或多個本發明之融合蛋白與醫藥上可接受賦形劑的醫藥組合物。
此外，在一些具體實施例中，本發明提供同時結合CD137及/或PD-L1之融合蛋白，用於諸如抗腫瘤劑及/或抗感染劑，以及免疫調節劑。在一些具體實施例中，設想本發明之融合蛋白用於預防、改善、或治療人類疾病(如各種癌症，包括PD-L1陽性癌症)之方法。據此，針對有需求之受試者，亦提供預防、改善、或治療人類疾病(如各種癌症，包括PD-L1陽性癌症)之方法，包含投予該受試者一治療上有效量之一或多個本發明融合蛋白。
可使用本發明融合蛋白治療之癌症實例，包括肝癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭頸癌、乳癌、肺癌、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、腎癌、子宮癌、卵巢癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肛門區域癌症、胃癌、睾丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、兒童實體瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統腫瘤(CNS)、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊髓軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、腦垂腺瘤、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、環境誘導性癌症，包括彼等石棉誘導之癌症、血液系統惡性腫瘤，包括多發性骨髓瘤、B細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤/原發性縱隔B細胞淋巴瘤(Hodgkin lymphoma/primary mediastinal B-cell lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphomas)、急性髓樣淋巴瘤、慢性粒細胞性白血病、慢性淋巴樣白血病、濾泡性淋巴瘤、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、免疫原性大型細胞淋巴瘤、前驅B淋巴母細胞淋巴瘤、外膜細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)、急性淋巴母細胞白血病、漸進性蕈狀肉芽腫(mycosis fungoides)、退行性大型細胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphoma)、T細胞淋巴瘤、及前驅T淋巴母細胞淋巴瘤，以及該癌症之任一組合。
在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可同時靶向表現PD-L1之腫瘤細胞，並活化與該腫瘤細胞相鄰之宿主免疫系統的淋巴球。在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可增加抗腫瘤T細胞之標靶活性、增進抗腫瘤免疫性、及/或對腫瘤生長具有直接抑制作用，從而產生協同性抗腫瘤結果。在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可在腫瘤微環境中活化免疫反應。在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可經由局部抑制致癌基因活性及誘導淋巴球活化，降低效應子淋巴球對健康細胞之副作用，即脫靶毒性。
在一些具體實施例中，本發明涵蓋本發明之融合蛋白或含有所提供融合蛋白之組合物在PD-L1陽性腫瘤細胞附近誘導局部化淋巴球反應的用途。據此，在一些具體實施例中，本發明提供在PD-L1陽性腫瘤細胞附近誘導局部化淋巴球反應的方法，包含施加一或多個本發明之融合蛋白或一或多個含有此類融合蛋白之組合物。「局部化」意指在經由CD137同時結合T細胞並結合PD-L1陽性腫瘤細胞之後，T細胞在PD-L1陽性細胞附近產生細胞激素，特別是IL-2及/或IFNγ。此類細胞激素反映出T細胞的活化，其隨後可藉由吸引其他殺手細胞(如，T細胞或NK細胞)，能直接或間接殺死PD-L1陽性細胞。
在一些具體實施例中，本發明涵蓋本發明之融合蛋白或含有此類融合蛋白之組合物的用途，用於共同刺激T細胞及/或活化CD137之下游傳訊途徑。較佳地，當與表現PD-L1之腫瘤細胞結合時，所提供之融合蛋白共同刺激T細胞及/或活化CD137下游傳訊途徑。據此，本發明提供誘導T淋巴球增生及/或活化CD137下游傳訊途徑的方法，較佳地在與表現PD-L1之腫瘤細胞結合時，包含施加一或多個本發明之融合蛋白及/或一或多個包含此類融合蛋白之組合物。
在一些具體實施例中，本發明涵蓋本發明之融合蛋白或含有此類融合蛋白之組合物的用途，用於誘導CD137聚集與活化T細胞，並將此類T細胞導入表現PD-L1的腫瘤細胞。
藉由檢查以下實施例及其附圖，本發明之額外目的、優點、及特徵對本領域技術人員將變得顯而易見，其未旨在侷限。因此，應理解到，儘管本發明通過示例性具體實施例與任意特徵而具體揭示，但本領域技術人員可對本文所體現之揭示進行改良與變化，且彼等改良與變化可視為落入本發明之範疇。F. 示例性所提供之 CD137 與 PD-L1 特異性融合蛋白之產生
在一些具體實施例中，本發明提供核酸分子(DNA與RNA)，其包括編碼所提供融合蛋白之核苷酸序列。在一些具體實施例中，本發明包括含有所提供核酸分子之宿主細胞。由於遺傳密碼退化性，容許特定密碼子由指定之相同胺基酸之其他密碼子取代，因此本發明不侷限於編碼本文所述融合蛋白之特定核酸分子，而是涵蓋所有的核酸分子，包括編碼功能性融合蛋白之核苷酸。在此情況下，本發明亦有關編碼所提供融合蛋白之核苷酸序列。
若核酸分子(如DNA)包括含有關於轉錄及/或轉譯調節信息之序列元件，則稱作「能表現核酸分子」或「能容許核苷酸序列之表現」，且此類序列係「可操作地連接」至編碼蛋白質之核苷酸序列。可操作之連接係其中調節序列元件與欲表現之序列以能夠基因表現之方式連接。基因表現所需之調節區的確切性質可能因物種而異，但通常彼等區域包括啟動子，其在原核生物中，既包含啟動子本身，即引導轉錄起始之DNA元件，亦包含DNA元件，其在轉錄成RNA時，將傳訊啟動轉譯。此類啟動子區域正常地包括涉及啟動轉錄與轉譯之5’端非編碼序列，如原核生物或TATA盒中之-35/-10盒與夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno)元件、CAAT序列、及真核生物中之5'加帽元件。彼等區域亦可包括增強子或抑制子元件，以及轉譯信號與前導序列，以將原始蛋白質靶向宿主細胞的特定隔室。
此外，3’端非編碼序列可包含涉及轉錄終止、聚腺苷酸化、或其類似物之調節元件。然而，若彼等終止序列在特定宿主細胞中無法發揮令人滿意的功能，則其可由在該細胞中發揮功能的信號取代。
因此，本發明之核酸分子可為「可操作地連接」至一或多個調節序列，如啟動子序列，以容許此核酸分子之表現。在一些具體實施例中，本發明之核酸分子包括啟動子序列及轉錄終止序列。適用之原核生物啟動子為，舉例而言，tet啟動子、lacUV5啟動子、或T7啟動子。用於在真核細胞中表現之啟動子實例為SV40啟動子或CMV啟動子。
在一些具體實施例中，編碼本申請案揭示之脂質運載蛋白突變蛋白之核酸分子可為「可操作地連接」至另一編碼本發明免疫球蛋白之核酸分子，以容許本文所揭示融合蛋白之表現。
在一些具體實施例中，所提供之方法可包括使至少一編碼成熟型hTlc之核酸分子在核苷酸三聯體上突變，該三聯體編碼相對應於hTlc之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 1)之位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150、及153之一或多個位置，以取得包含於所提供融合蛋白中之脂質運載蛋白突變蛋白。在一些具體實施例中，所提供之方法可包括使至少一編碼成熟型hNGAL之核酸分子在核苷酸三聯體上突變，該三聯體編碼相對應於hNGAL之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 2)之位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132、及134之一或多個位置，以取得包含於所提供融合蛋白中之脂質運載蛋白突變蛋白。在一些具體實施例中，所提供之方法可包括使至少一編碼成熟型hNGAL之核酸分子在核苷酸三聯體上突變，該三聯體編碼相對應於hNGAL之線性多胜肽序列(SEQ ID NO: 2)之位置20、25、28、33、36、40-41、44、49、52、59、68、70-73、77-82、87、92、96、98、100、101、103、122、125、127、132、及134之一或多個位置，以取得包含於所提供融合蛋白中之脂質運載蛋白突變蛋白。
此外，關於包含於融合蛋白中之本發明hTlc突變蛋白或hNGAL突變蛋白，在一些具體實施例中，可分別移除在Cys 61與Cys 153或Cys 76與Cys 175之間天然存在之雙硫鍵。據此，此類突變蛋白可在具有還原性氧化還原環境之細胞隔室中產生，例如，在革蘭氏陰性菌之細胞質中產生。
另關於融合蛋白中所包括之本發明所提供之hTlc突變蛋白或hNGAL突變蛋白，本發明亦包括編碼此類突變蛋白之核酸分子，在一些具體實施例中，其可在突變實驗所示序列位置之外包括一或多個其他突變。 若此類突變有助於脂質運載蛋白突變蛋白及/或融合蛋白改進摺疊功效、血清穩定性、熱穩定性、或配體結合親和力，則其通常具有耐受性或甚而可證明有益。
在一些具體實施例中，所提供之核酸分子亦可為載體或任何其他類型之選殖載具，如質體、噬菌體質體、噬菌體、桿狀病毒、黏粒、或人工染色體，之一部分。
在一些具體實施例中，所提供之核酸分子可包括在噬菌體質體中。如本文中所用，噬菌體質體載體是指編碼溫帶噬菌體(如，M13或f1)基因間區(intergenic region)之載體，或其功能性部分融合至感興趣之cDNA。舉例而言，在一些具體實施例中，在以所提供之噬菌體質體載體與合適之輔助噬菌體(如，M13K07、VCS-M13、或R408)對細菌宿主細胞進行超感染之後，產生完整噬菌體顆粒，從而使得編碼之異源性cDNA能夠物理性偶聯至其相對應之呈現於噬菌體表面上之多胜肽(Lowman,Annu Rev Biophys Biomol Struct , 1997, Rodi and Makowski,Curr Opin Biotechnol , 1999)。
依據各種具體實施例，選殖載體除上述調節序列及編碼本文所述融合蛋白之核酸序列以外，亦可包括衍生自與表現用之宿主細胞相容之物種的複製與控制序列，以及在轉形或轉染之細胞上賦予可選擇表型之選擇標記。大量合適之選殖載體為本領域已知且可商購。
在一些具體實施例中，本發明亦有關使用遺傳工程方法，從編碼融合蛋白或其任何次單元之核酸，開始產生本發明融合蛋白的方法。 在一些具體實施例中，所提供之方法可在體內進行，其中所提供之融合蛋白可在細菌或真核宿主生物體中產生，然後從該宿主生物體或其培養基中分離。利用體外轉錄系統，亦可在體外產生本發明之融合蛋白。
當在體內產生融合蛋白時，利用本領域習知之重組型DNA技術，將編碼此類融合蛋白之核酸導入適用之細菌或真核宿主生物體中。 在一些具體實施例中，可將編碼本文所述融合蛋白(如，SEQ ID NOs: 138-144)之DNA分子，特別是含有此融合蛋白之編碼序列的選殖載體，轉形至能表現該基因之宿主細胞。可使用標準技術進行轉形作用。因此，本發明亦針對含有本文揭示之核酸分子的宿主細胞。
在一些具體實施例中，可在適合表現編碼本發明融合蛋白之核苷酸序列之條件下培養轉形之宿主細胞。在一些具體實施例中，宿主細胞可為原核(如，大腸桿菌(E. coli )或枯草芽孢桿菌)，或真核(如，釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母、SF9、或High5昆蟲細胞)、永生化之哺乳類動物細胞株(如，HeLa細胞或CHO細胞)或哺乳類動物初代細胞。
在一些具體實施例中，其中本發明之脂質運載蛋白突變蛋白(包括如，包含於本文揭示之融合蛋白)包括分子內雙硫鍵，其可較佳地使用適當信號序列，將新生蛋白質引導至具有氧化還原環境之細胞隔室。 適當的信號序列。此氧化環境可由革蘭氏陰性菌(如大腸桿菌)之周質(periplasm)、革蘭氏陽性菌之細胞外環境、或真核細胞內質網之內腔提供，且通常有利於形成雙硫鍵結構。
在一些具體實施例中，亦可能在宿主細胞(較佳地大腸桿菌)之細胞質中產生本發明之融合蛋白。在此情況下，可直接取得可溶性與褶疊狀態之融合蛋白，或以包涵體之形式回收，然後在體外復性(renaturation)。 另一選項為，使用具有氧化性細胞內環境之特定宿主菌株，可容許在細胞質中形成雙硫鍵(Venturi et al.,J Mol Biol , 2002)。
在一些具體實施例中，本發明之本文所述融合蛋白不一定需要全部或部分經由使用基因工程而產生或製造。而是，此類蛋白質亦可利用許多常規與眾所周知技術之任一者取得，如普通有機合成策略、固相輔助合成技術、市售自動化合成儀、或利用體外轉錄與轉譯。舉例而言，可能使用分子模型，鑑定有利之融合蛋白或脂質運載蛋白突變蛋白、體外合成、及研究感興趣靶標之結合活性。蛋白質之固相及/或溶液相合成方法為本領域中習知(參見如，Bruckdorfer et al.,Curr Pharm Biotechnol , 2004)。
在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可使用本領域技術人員已知之公認方法，利用體外轉錄/翻譯產生。
在一些進一步之具體實施例中，本文所述之融合蛋白亦可利用常規之重組型技術單獨或結合常規之合成技術進行製備。
此外，在一些具體實施例中，本發明之融合蛋白可藉由共軛結合各個次單元(如，包含於融合蛋白之免疫球蛋白與突變蛋白)而取得。此共軛反應，舉例而言，可以常規方法經由所有形式之共價或非共價鍵聯而達成。
技術人員將理解可用於製備本發明所預設融合蛋白之方法，但該蛋白或核酸序列未在本文中明確揭示。整體而言，此類胺基酸序列之修飾包括，例如，單一胺基酸位置之導向式突變，以簡化蛋白質基因或其部分之次選殖，係藉由併入特定限制酶之切割位點。同時，可併入彼等突變，以進一步改進融合蛋白對其標靶(如，CD137與PD-L1)之親和力。此外，視需要，可導入突變，以調控蛋白質之一或多個特徵，如改進摺疊穩定性、血清穩定性、蛋白質抗性、或水溶性，或降低凝集現象。實施例
實施例 1. 代表性融合蛋白之表現與分析
在此實施例中，代表性抗體-脂質運載蛋白突變蛋白融合蛋白的產生，係將具有SEQ ID NO: 86提供之重鏈，或包含SEQ ID NO: 77之重鏈可變結構域，或包含GFSLSNYD (HCDR1，SEQ ID NO: 60)、IWTGGAT (HCDR2，SEQ ID NO: 61)、VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3；SEQ ID NO: 62)之CDRs，及SEQ ID NO: 87提供之輕鏈，或包含SEQ ID NO: 82之重鏈可變結構域，或包含QSIGTN (LCDR1，SEQ ID NO: 63)、YAS (LCDR2)、QQSNSWPYT (LCDR3；SEQ ID NO: 64)之CDRs的PD-L1特異性抗體，與SEQ ID NO: 42之CD137特異性脂質運載蛋白突變蛋白融合在一起，其係經由一連接子，如SEQ ID NO: 13之非結構(G4 S)3 連接子，以同時接合PD-L1與CD137。所產生之不同形式如圖 1 所示。舉例而言，此類融合蛋白，如SEQ ID NOs: 90與87、SEQ ID NOs: 86與91、SEQ ID NOs: 92與87、SEQ ID NOs: 86與93、SEQ ID NOs: 94與87、及SEQ ID NOs: 90與91，係經由融合SEQ ID NO: 42之脂質運載蛋白突變蛋白之一或多者與抗體四端之一或多者而產生，該抗體包含SEQ ID NO: 86提供之重鏈，或包含SEQ ID NO: 77之重鏈可變結構域，或包含GFSLSNYD (HCDR1，SEQ ID NO: 60)、IWTGGAT (HCDR2，SEQ ID NO: 61)、VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3；SEQ ID NO: 62)之CDRs，及SEQ ID NO: 87提供之輕鏈，或包含SEQ ID NO: 82之重鏈可變結構域，或包含QSIGTN (LCDR1，SEQ ID NO: 63)、YAS (LCDR2)、QQSNSWPYT (LCDR3；SEQ ID NO: 64)之CDRs。所產生之融合蛋白可為對CD137雙價(如，圖 1A-1D 所示)或對CD137四價(如，圖 1E-1H 所示)，或對CD137具有甚而更高的價數(如，圖 1I 所示)。
本實施例描述之PD-L1特異性抗體及所有抗體-脂質運載蛋白突變蛋白融合蛋白具有經工程化之IgG4主鏈，其含有S228P突變以最小化體外與體內IgG4半-抗體交換(Silva et al.,J Biol Chem , 2015)。IgG4主鏈之其他突變亦可存在於本文所述之所有抗體與融合蛋白中，包括突變F234A、L235A、M428L、N434S、M252Y、S254T、及T256E之任何一或多者。可導入F234A與L235A突變，以減少ADCC與ADCP (Glaesner et al.,Diabetes Metab Res Rev , 2010)。可導入M428L與N434S突變或M252Y、S254T、及T256E突變，以延長血清半衰期(Dall'Acqua et al.,J Biol Chem , 2006, Zalevsky et al.,Nat Biotechnol , 2010)。所有表現的抗體無羧基端離胺酸，以避免異質性。
此外，經由一連接子，如SEQ ID NO: 13之非結構(G4S)3連接子，融合SEQ ID NO: 42之CD137特異性脂質運載蛋白突變蛋白之一或多者與SEQ ID NO: 30提供之抗體Fc區C端，產生單特異性脂質運載蛋白突變蛋白Fc融合體，如圖 1J-1K 所示。所得構築體如SEQ ID NOs: 88-89所提供。
本發明亦體現不對稱的抗體-脂質運載蛋白突變蛋白融合形式，舉例而言，抗體之一輕鏈可融合至脂質運載蛋白突變蛋白，而其他則否。
利用基因合成產生融合蛋白構築體，並選殖至哺乳類動物表現載體。其隨後在Expi293FTM細胞(Life Technologies)中短暫表現。利用HPLC (Agilent Technologies)測定細胞培養基中融合蛋白的濃度，其採用POROS®蛋白質A親和性管柱(Applied Biosystems)。融合蛋白之效價摘錄於表 1 。
在磷酸緩衝鹽液(PBS)中，利用蛋白質A層析法及隨後的粒徑篩析層析法(SEC)純化融合蛋白。在SEC純化後，將含有單體型蛋白質之部分合併，並再次以分析型SEC分析。
表 1 ： 短暫表現效價
實施例 2. 融合蛋白之表現
利用基因合成，包括密碼子優化，產生示例性融合蛋白構築體，並選殖至哺乳類動物表現載體。其隨後在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中穩定表現。利用Octet (ForteBio，Pall Corp.)，其配備蛋白質-A感測器，測定細胞培養基中融合蛋白之濃度，並以人類IgG1標準品定量。表 2 摘錄融合蛋白效價。數據顯示，融合蛋白之幾何形狀可對產物產率與細胞生產力產生影響。
表 2 ： 穩定表現效價
實施例 3. 利用表面電漿共振 (SPR) 確定融合蛋白對 PD-L1 或 CD137 之結合作用
利用表面電漿共振(SPR)，如Biacore 8K或Biacore T200 (GE Healthcare)，測定示例性融合蛋白與huPD-L1-His或huCD137-His (人類PD-L1或人類CD137，其中C端具有多組胺酸標記，R&D Systems)之結合動力學與親和力。
利用標準胺化學：以1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)-碳二亞胺 (EDC)與N-羥基琥珀醯胺亞胺(NHS)活化晶片上的羧基，將抗人類IgG Fc抗體(GE Healthcare)固定在CM5感測晶片上。隨後，在10 mM醋酸鈉(pH 5.0)中，以濃度25 µg/mL且流速5 µL/min施加抗人類IgG Fc抗體溶液(GE Healthcare)，直到固定化程度達到6000-10000共振單位(RU)。利用將1M乙醇胺溶液流過表面，阻斷殘餘之非反應性NHS酯類。以類似方式處理參考體通道。隨後，利用抗人類IgG-Fc抗體，以流速10 µL/min在晶片表面上180 s，捕捉溶於HBS-EP+緩衝液之0.25 µg/ml或0.5 µg/mL之待測融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87、SEQ ID NOs: 86與91、SEQ ID NOs: 92與87、SEQ ID NOs: 86與93、SEQ ID NOs: 94與87、SEQ ID NOs: 90與91、SEQ ID NO: 88、及SEQ ID NO: 89)。在每個捕捉步驟之後，清洗針頭。作為對照組，亦測試抗PD-L1抗體，包括參考體抗體(SEQ ID NOs: 26與27)與融合蛋白中包含的抗體(SEQ ID NOs: 86與87)及參考體抗CD137抗體(SEQ ID NOs: 28與29)。
在親和力測定方面，在HBS-EP +緩衝液中製備huPD-L1-His (10 nM、5 nM、及2.5 nM)或huCD137-His (900 nM、300 nM、及100 nM)稀釋液，並施加至備妥之晶片表面。進行結合試驗，其中接觸時間為180 s，解離時間為900 s，且流速為30 µL/min。所有測定皆於25°C下進行。以3 M MgCl2 注入120 s，達到晶片表面再生。在進行蛋白質測定之前，進行三次啟動循環，以調整條件。以Biacore T200評估軟體(v2.0)或Biacore 8K評估軟體(V1.1.1)評估數據。使用雙重參考法(double referencing)，並以1:1結合模型擬合原始數據。
表 3 摘錄代表性融合蛋白之kon 、koff 、及平衡解離常數(KD )等數值。所有雙特異性融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87、SEQ ID NOs: 86與91、SEQ ID NOs: 92與87、SEQ ID NOs: 86與93、SEQ ID NOs: 94與87、及SEQ ID NOs: 90與91)以次奈莫耳至低奈莫耳親和力結合PD-L1及CD137。單特異性CD137特異性脂質運載蛋白突變蛋白-Fc融合體(SEQ ID NO: 88與SEQ ID NO: 89)僅以低奈莫耳親和力結合CD137。
表 3 ： 利用SPR測定融合蛋白之動力學常數與親和力
實施例 4. 融合蛋白在酵素免疫吸附分析法 (ELISA) 中結合至 PD-L1 或 CD137
以酵素免疫吸附分析法(ELISA)確定示例性融合蛋白結合人類PD-L1與食蟹猴PD-L1的能力。
溶於PBS之重組型huPD-L1-His或cyPD-L1-His (人類或食蟹猴PD-L1，其C端為多組胺酸標記，R&D Systems或Sino Biologics)在4°C下以濃度1 µg/mL隔夜塗佈在微滴定盤上。在以PBS-0.05%T (PBS，其中補充0.05% (v/v) Tween 20)清洗後，培養盤在室溫下以溶於PBS-0.1%T (PBS，其中補充0.1% (v/v) Tween 20)之2% BSA (w/v)阻斷1 h。在以100 µL PBS-0.05%T清洗五次之後，示例性融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87、SEQ ID NOs: 86與91、SEQ ID NOs: 92與87、SEQ ID NOs: 86與93、SEQ ID NOs: 94與87、SEQ ID NOs: 90與91)、Fc融合體CD137特異性脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NOs: 88及SEQ ID NO: 89)、及抗PD-L1抗體(SEQ ID NOs: 26與27、SEQ ID NOs: 86與87)在不同濃度下加入培養孔中，並在室溫下培養1 h，隨後進行另一清洗步驟。藉由與溶於PBS-0.1%T-2%BSA之1:5000稀釋之抗人類IgG Fc-HRP (Jackson Laboratory)一起培養，檢測所研究之結合分子。在另一清洗步驟之後，將螢光HRP受質(QuantaBlu，Thermo)加入各培養孔，並以螢光微讀盤儀檢測螢光強度。
亦使用相同的ELISA設定，以確定融合蛋白結合CD137的能力，其中huCD137-His (人類CD137，其C端具有多組胺酸標記，R&D Systems)或cyCD137-Fc (食蟹猴CD137，其C端融合至Fc)另外塗佈在微滴定盤上。待測試劑以類似方式滴定，並以抗NGAL-HRP檢測結合之試劑。
示例性實驗之結果如圖 2A-2D 所示，伴隨1:1結合S形擬合所得之擬合曲線，其中EC50 值與最大信號值為自由參數，且斜率固定為1。表 4 提供所得之EC50 值。
觀察到所提供之融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87、SEQ ID NOs: 86與91、SEQ ID NOs: 92與87、SEQ ID NOs: 86與93、SEQ ID NOs: 94與87、SEQ ID NOs: 90與91、SEQ ID NO: 88、及SEQ ID NO: 89)對二個人類標靶的EC50 值非常類似或可比擬經測試之PD-L1抗體(包含於融合蛋白中之SEQ ID NOs: 26與27之參考體PD-L1抗體與SEQ ID NOs: 86與87之PD-L1抗體)及/或包含於融合蛋白(SEQ ID NO: 42)之CD137特異性脂質運載蛋白突變蛋白。
所有待測融合蛋白顯示對食蟹猴PD-L1具有交叉反應性，且EC50 值可比擬包含於融合蛋白(SEQ ID NOs: 86與87)之參考體PD-L1抗體(SEQ ID NOs: 26與27)或PD-L1抗體。僅CD137四價之融合蛋白(SEQ ID NOs: 94與87、SEQ ID NOs: 90與91、及SEQ ID NO: 88)以可比擬人類CD137之含量對食蟹猴CD137產生交叉反應性，亦即結合食蟹猴CD137之EC50 值與結合人類CD137之相對應EC50 在相同範圍。
表 4. PD-L1或CD137結合作用之ELISA數據
實施例 5. 在 ELISA 中 融合蛋白同時結合 PD-L1 與 CD137
欲證實示例性融合蛋白同時結合PD-L1與CD137，使用雙結合ELISA形式。
溶於PBS (1 µg/mL)之重組型huPD-L1-His (R&D Systems)在4°C下隔夜塗佈在微滴定盤上。在各個100 µL PBS-0.05%T培養步驟之後，清洗培養盤五次。培養盤在室溫下以溶於PBS-0.1%T之2% BSA (w/v)阻斷1 h，接著再次清洗。將不同濃度之待測融合蛋白加入培養孔中，並在室溫下培養1 h，隨後進行清洗步驟。隨後，生物素化huCD137-His (huCD137-His-Bio，Sino Biological)以溶於PBS-0.1%T-2%BSA之恆定濃度1 µg/mL加入1 h。在清洗之後，將溶於PBS-0.1%T-2%BSA之1:5000稀釋之ExtrAvidin-HRP (Sigma-Aldrich)加入培養孔中，並培養1 h。在另一清洗步驟之後，將螢光HRP受質(QuantaBlu，Thermo)加入各培養孔中，並以螢光微讀盤儀檢測螢光強度。
亦以逆向設定測試示例性融合蛋白之雙重結合作用(dual binding)，其中將重組型1 µg/ml huCD137-His (R&D Systems)塗佈在微滴定盤上，並經由加入生物素化huPD-L1-His (R&D Systems)檢測結合之融合蛋白。
融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87、SEQ ID NOs: 86與91、SEQ ID NOs: 92與87、SEQ ID NOs: 86與93、SEQ ID NOs: 94與87、及SEQ ID NOs: 90與91)之雙重結合數據顯示於圖 3A 與3B ，伴隨由1:1 S型結合擬合得到的擬合曲線，其中EC50 值與最大信號值為自由參數，且斜率固定為1。EC50 值摘錄於表 5 。所有雙特異性融合蛋白顯示清楚的結合信號，證實融合蛋白能同時結合PD-L1與CD137。數據進一步顯示，融合CD137特異性脂質運載蛋白突變蛋白與PD-L1-特異性抗體之C端，可比N端更具優勢。
表 5. PD-L1與CD37之同時標靶結合之ELISA數據
實施例 6. 融合蛋白結合至表現人類與食蟹猴 CD137 與 PD-L1 之細胞的流式細胞儀分析
利用流式細胞術，分析融合蛋白標靶特異性結合表現人類與食蟹猴PD-L1之細胞及表現人類與食蟹猴CD137之細胞。
以人類PD-L1、食蟹猴PD-L1、人類 CD137、食蟹猴CD137、或假性對照組穩定轉染CHO細胞，其係使用Flp-In系統(Life technologies)，並依據製造商之說明。
經轉染之CHO細胞維持在Ham´s F12培養基(Life technologies)中，其中補充10%胎牛血清(Biochrom)與500 µg/ml潮黴素B (Hygromycin B) (Roth)。細胞培養在細胞培養瓶中，並依據製造商之說明(37°C，5% CO2大氣環境)。
在流式細胞儀分析方面，個別細胞株與融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87、SEQ ID NOs: 86與91、SEQ ID NOs: 92與87、SEQ ID NOs: 86與93、SEQ ID NOs: 94與87、SEQ ID NOs: 90與91、SEQ ID NO: 88、及SEQ ID NO: 89)一起培養，糗在FACS分析中，以螢光標記之抗人類IgG抗體檢測， 如以下所述：
每一培養孔5 × 104 個細胞在含有5%胎牛血清之冰冷PBS (PBS-FCS)中培養1 h。將系列稀釋之融合蛋白與對照組抗體加入細胞，並在冰上培養1 h。細胞以PBS清洗二次，隨後在冰上以山羊抗hIgG Alexa647標記之抗體培養30 min。細胞隨後清洗，並以iQue流式細胞儀(Intellicyte Screener)分析。繪製平均幾何螢光信號，並以Graphpad軟體進行非線性迴歸擬合(共有底部，SLOPE =1)。
融合蛋白結合人類與食蟹猴PD-L1與CD137之能力如圖 4 所示。雙特異性融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87、SEQ ID NOs: 86與91、SEQ ID NOs: 92與87、SEQ ID NOs: 86與93、SEQ ID NOs: 94與87、及SEQ ID NOs: 90與91)與表現人類與食蟹猴PD-L1之細胞的結合親和力(EC50 s)係位於一位數(single digit)奈莫耳範圍，證實有完全的犬交叉反應性(cyno-crossreactivity)(摘錄於表 6 )。融合蛋白與表現人類CD137之細胞的結合親和力係位於低奈莫耳範圍。待測融合蛋白係完全與食蟹猴CD137 (SEQ ID NOs: 94與87、SEQ ID NOs: 90與91、及SEQ ID NO: 88)交叉反應，其相較於相對應之人類CD137 (SEQ ID NOs: 90與87、SEQ ID NOs: 86與91、及SEQ ID NO: 89)結合親和力，結合食蟹猴CD137之親和力減少6-13倍，或不結合食蟹猴CD137 (SEQ ID NO: 92與87及86與93)。未有融合蛋白結合至假性轉染細胞。
表 6. 融合蛋白與表現人類與食蟹猴PD-L1或CD137之細胞的結合親和力
實施例 7. 融合蛋白與 PD-L1 陽性腫瘤細胞之結合親和力
利用流式細胞術評估融合蛋白與表現PD-L1之腫瘤細胞的結合作用。
在37°C之潮濕5% CO2 環境中，將表現PD-L1之大腸癌細胞株RKO維持RPMI1640 (Life technologies)中，其中補充10% FCS。
在流式細胞儀分析方面，將RKO細胞與融合蛋白一起培養，並以螢光標記之抗人類IgG抗體檢測，如實施例 6 所述。
融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87、SEQ ID NOs: 86與91、SEQ ID NOs: 92與87、SEQ ID NOs: 86與93、SEQ ID NOs: 94與87、及SEQ ID NOs: 90與91)結合PD-L1陽性腫瘤細胞之能力如圖 5 所示，且相對應之結合親和力(EC50 s)摘錄於表 7 。相較於包含於融合蛋白之PD-L1抗體(SEQ ID NOs: 86與87)，融合蛋白與表現PD-L1之RKO細胞的結合親和力係位於低奈莫耳或次奈莫耳範圍。
表 7. 融合蛋白與PD-L1陽性腫瘤細胞之結合親和力
實施例 8. 利用 SPR 確定 CD137L 與融合蛋白之間對 CD137 之競爭作用
利用SPR試驗，探討人類CD137L (huCD137L-His，R&D Systems)與示例性融合蛋白之間對人類CD137的競爭作用。競爭試驗係於25°C下之Biacore T200儀器(GE Healthcare)上進行。
以濃度50 µg/ml與流速2 µL/min，將BiotinCAPture試劑(GE Healthcare)固定在CAP感測晶片上300 s。參考體通道以類似方式進行。在晶片表面之另一通道上，以濃度1 µg/mL與流速5 µL/min捕捉生物素化huCD137-Fc (R&D systems) 300 s。
欲分析是否待測融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87、SEQ ID NOs: 86與91、SEQ ID NOs: 92與87、SEQ ID NOs: 86與93、SEQ ID NOs: 90與91、SEQ ID NO: 88、及SEQ ID NO: 89)與CD137L競爭結合至CD137，以流速30 µL/min將運行緩衝液(HBS-EP+ 緩衝液)或500 nM huCD137L-His施加至晶片表面上180 s。隨後，以一固定濃度1 µM，將待測融合蛋白施加至備妥之含有HBS-EP+緩衝液之晶片表面。進行結合試驗，其中接觸時間為180 s，解離時間為15 s，且流速為30 µL/min。以相同參數注射緩衝液，作為對照組。以流速10 µL/min，注射6M Gua-HCl與0,25M NaOH 120 s，達到晶片表面再生，隨後以H2 O (120 s，10 µl/min)進行額外的清洗步驟。
圖 6 提供所得之SEQ ID NOs: 90與87、SEQ ID NOs: 86與91、SEQ ID NOs: 92與87、SEQ ID NOs: 86與93、SEQ ID NOs: 90與91、SEQ ID NO: 88、及SEQ ID NO: 89之融合蛋白之傳感圖相關部分的代表性實例。實心箭頭標記個別融合蛋白與單獨huCD137-Fc結合作用之SPR追蹤。斷裂箭頭標記融合蛋白與huCD137L-His飽和之huCD137-Fc結合作用之SPR追蹤。數據顯示，所有融合蛋白在huCD137L存在下結合至huCD137，但相較於在不存在CD137L之結合作用，信號稍微減少。這顯示，待測融合蛋白在一定程度上受到CD137L結合CD137的空間障礙影響。此融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87、SEQ ID NOs: 86與91、SEQ ID NOs: 92與87、SEQ ID NOs: 86與93、SEQ ID NOs: 90與91、SEQ ID NO: 88、及SEQ ID NO: 89)之結合行為類似於SEQ ID NOs: 28與29之抗CD137抗體。
實施例 9. 利用 ELISA 確定融合蛋白與 PD-L1 在結合 PD-1 上的競爭作用
欲證實融合蛋白抑制PD-1與PD-L1間之交互作用的能力，使競爭性ELISA形式。
溶於PBS (1 µg/mL)之重組型huPD-1-His (Acrobiosystems)在4°C下在微滴定盤上塗佈隔夜。在各個100 µL PBS-0.05%T (PBS，其中補充0.05% (v/v) Tween 20)培養步驟之後，清洗培養盤五次。培養盤在室溫下以溶於PBS-0.1%T (PBS，其中補充0.1% (v/v) Tween 20)之2% BSA (w/v)阻斷1 h，接著再次清洗。將不同濃度之融合蛋白混合15 nM之重組型huPD-L1-Fc (R&D systems)(作為追蹤劑)，並在室溫下培養1 h。將融合蛋白與追蹤劑之混合物加入培養盤中，並在室溫下培養20 min，接著以100 µL PBS-0.05%T清洗五次。隨後，將1:5000稀釋之山羊抗人類IgG-Fc HRP (Jackson)加入培養孔中並培養1h。在另一清洗步驟之後，將螢光HRP受質(QuantaBlu，Thermo)加入各培養孔中，並以螢光微讀盤儀檢測螢光強度。
示例性融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87、SEQ ID NOs: 86與91、SEQ ID NOs: 92與87、SEQ ID NOs: 86與93、及SEQ ID NOs: 90與91)之競爭作用數據如圖 7 所示，伴隨由1:1 S型結合擬合得到的擬合曲線，其中EC50 值與最大信號值為自由參數，且斜率固定為1。IC50 值摘錄於表 9 。所有雙特異性融合蛋白顯示清楚的PD-1/PD-L1交互作用抑制效果，其中IC50 值比擬抗體結構單元(SEQ ID NOs: 86與87)與參考體PD-L1抗體(SEQ ID NOs: 26與27)。
表 8. 融合蛋白與PD-L1結合至PD-1之競爭作用
實施例 10. 利用 CD137 生物試驗進行 PD-L1 依賴性 T 細胞共同刺激作用
利用市售雙重穩定轉染之表現CD137與luc2 基因(螢火蟲螢光素酶之人源化版本，其中luc2 表現係由NFκB回應元件驅動)之Jurkat細胞株，評估所選融合蛋白在PD-L1存在下誘導CD137傳訊途徑活化的能力。在此生物試驗中，CD137結合作用產生CD137細胞內傳訊，導致NFκB介導之發光。
表現PD-L1之大腸癌細胞株RKO之培養如實施例 7 所述。在試驗前一天，RKO細胞以每孔1.25 x 104 個細胞分盤，並在37°C之5% CO2 潮濕環境中黏附隔夜。
隔天，將3.75 x 104 個NF-kB-Luc2/CD137 Jurkat細胞加入各孔，隨後加入各種濃度(典型而言範圍為0.001 nM至5 nM)的融合蛋白或參考體CD137抗體(SEQ ID NOs: 28與29)。培養盤以透氣密封墊覆蓋，並於37°C之5% CO2 潮濕環境中培養。在4h後，將30 µL Bio-Glo™ Reagent加入各培養孔，並利用發光計(PHERAstar)定量生物發光信號。以GraphPad Prism®進行四參數邏輯曲線分析，以計算EC50 值(共有底部，固定斜率)，其摘錄於表 9 。欲證實融合蛋白與CD137結合的PD-L1依賴性，在沒有RKO細胞之情況下並行進行相同實驗。試驗以三重複進行。
代表性實驗之結果如圖 8A-8D 所示。數據證實，所有待測融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87、SEQ ID NOs: 86與91、SEQ ID NOs: 92與87、及SEQ ID NOs: 86與93)誘導強的CD137介導之T細胞共同刺激作用。圖 8B 與 8D 顯示，融合蛋白活化CD137具有PD-L1依賴性，係因在表現PD-L1之腫瘤細胞不存在下，未檢測到NF-kB-Luc2/CD137 Jurkat細胞的活化作用。相反地，參考體抗CD137 mAb (SEQ ID NOs: 28與29)顯示CD137介導之T細胞共同刺激作用，其與標靶細胞無關。
表 9. 利用CD137生物試驗評估T細胞活化
實施例 11. 利用人類週邊血液單核細胞 (PBMCs) 評估 T 細胞活化作用
利用T細胞試驗評估所選融合蛋白共同刺激T細胞反應的能力，以及防止PD-L1與PD-1結合介導之共同抑制作用。為此，將不同濃度的融合蛋白加入葡萄球菌腸毒素B (SEB)刺激之人類週邊血液單核細胞(PBMCs)中，並在37°C下培養4天。測定上清液中之IL-2分泌含量。
依據Biochrom的方法，利用多蔗糖密度梯度離心法(Biocoll，1.077 g/mL，Biochrom)，從健康自願者供體之膚色血球層中分離出PBMCs。將純化的PBMCs再懸浮於由90% FCS與10% DMSO組成之緩衝液，立即冷凍並保存在液態氮中直到進一步使用。在試驗時，將PBMCs解凍，並在37°C之5% CO2 潮濕環境中，靜置在補充10% FCS與1%青黴素-鏈黴素(Life Technologies)的培養基(RPMI 1640，Life Technologies)中16 h。
針對各實驗條件，以三重複進行下列程序：2.5x104 個PBMCs細胞培養在384孔平底組織培養盤各孔之培養基中。將系列稀釋之融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87、SEQ ID NOs: 86與91、SEQ ID NOs: 92與87、SEQ ID NOs: 86與93、SEQ ID NOs: 94與87、及SEQ ID NOs: 90與91)、結構單元PD-L1抗體(SEQ ID NOs: 86與87)、參考體PD-L1抗體(SEQ ID NOs: 26與27)、參考體CD137抗體(SEQ ID NO: 28與29)、參考體CD137抗體(SEQ ID NOs: 28與29)與PD-L1抗體(SEQ ID NOs: 86與87或SEQ ID NOs: 26與27)之雞尾酒、或同型對照組(SEQ ID NOs: 24與25)，典型而言範圍為10至0.002 nM，及0.1 ng/ml之SEB加入個別培養孔中。培養盤以透氣密封墊(4titude)覆蓋，並在37°C之5% CO2 潮濕環境中培養四天。隨後，利用人類IL-2 DuoSet套組(R&D Systems)評估上清液中IL-2含量，如下列程序中所述。
在室溫下，384孔培養盤以溶於PBS之1 μg/mL 「人類IL-2捕捉抗體」塗佈2 h。隨後，培養孔以80 µl PBS清洗5次，其中補充0.05 % Tween (PBS-T)。在含有1%酪蛋白(w/w)的PBS-0.05%T中阻斷1 h之後，將試驗上清液及在培養基中稀釋之一系列濃度之IL-2標準品移至各孔中，並在4°C下培養隔夜。隔天，將溶於含有0.5%酪蛋白之PBS-T的100 ng/mL山羊抗hIL-2-Bio檢測抗體(R&D Systems)與1µg/mL Sulfotag標記之鏈親和素(Mesoscale Discovery)混合物加入，並在室溫下培養1 h。在清洗之後，將25 μL的判讀用緩衝液(Mesoscale Discovery)加入各培養孔中，並以Mesoscale Discovery讀盤儀檢測所產生之電化學發光(ECL)信號。利用Mesoscale Discovery軟體進行分析與定量。
代表性實驗之結果如圖 9 所示。SEQ ID NOs: 90與87、SEQ ID NOs: 86與91、SEQ ID NOs: 92與87、SEQ ID NOs: 86與93、SEQ ID NOs: 94與87、及SEQ ID NOs: 90與91之雙特異性融合蛋白能誘導T細胞活化，其證實相較於同型對照組(hIgG4，Sigma)，IL-2分泌含量增加。利用對CD137 (SEQ ID NOs: 94與87及SEQ ID NOs: 90與91)四價之融合蛋白及隨後對CD137雙價之融合蛋白，其中脂質運載蛋白突變蛋白融合至PD-L1-特異性抗體之C端(SEQ ID NOs: 90與87及SEQ ID NOs: 86與91)，觀察到IL-2分泌的最強增加。利用對CD137雙價之融合蛋白，其中脂質運載蛋白突變蛋白融合至PD-L1-特異性抗體之N端(SEQ ID NOs: 92與87及SEQ ID NOs: 86與93)，觀察到最低增加，然而，其仍可比擬參考體CD137抗體(SEQ ID NOs: 28與29)與參考體PD-L1抗體(SEQ ID NOs: 26與27)之雞尾酒。所有融合蛋白顯示比單一結構單元，亦即CD137特異性脂質運載蛋白突變蛋白-Fc (SEQ ID NO: 88或SEQ ID NO: 89)或結構單元PD-L1 mAb (SEQ ID NOs: 86與87)，有更高的IL-2分泌含量。
實施例 12. 在表現不同 PD-L1 含量之腫瘤細胞存在下評估 T 細胞活化
進行另一T細胞試驗，以評估融合蛋白以PD-L1標靶依賴性方式共同刺激T細胞活化的能力。在具有不同PD-L1表現含量之腫瘤細胞株存在下，以不同濃度之融合蛋白施加至抗CD3刺激之T細胞。待測腫瘤細胞株包括RKO (PD-L1高含量)、HCC827 (PD-L1中含量)、及Hep-G2 (PD-L1陰性)。測定上清液中的IL-2分泌含量。
從健康自願者供體之膚色血球層中分離出PBMC，如實施例 11 所述。利用Pan T細胞純化套組(Miltenyi Biotec GmbH)，遵照製造商說明，以磁性細胞分選方式進一步從PBMC純化出T淋巴球。將純化之Pan T細胞再懸浮於由90% FCS與10% DMSO組成之緩衝液中，立即冷凍並保存在液態氮中直到進一步使用。
在試驗時，將T細胞解凍，並在37°C之5% CO2 潮濕環境中，靜置在補充10% FCS與1%青黴素-鏈黴素(Life Technologies)的培養基(RPMI 1640，Life Technologies)中16 h。
針對各實驗條件，以三重複進行下列程序：平底組織培養盤在37°C下預先以0.25 μg/mL抗CD3抗體塗佈1 h，隨後以PBS清洗二次。腫瘤細胞株RKO、HCC827、或Hep-G2以30 µg/ml絲裂黴素C (Sigma Aldrich)處理30 min，以阻斷細胞增生。隨後，絲裂黴素處理之腫瘤細胞以PBS清洗二次，並以每孔2.5 x 104 個細胞分盤在培養基中，使其在37°C之5% CO2 潮濕環境中黏附隔夜。標靶細胞先前於標準條件下生長，以Accutase (PAA Laboratories)脫附，然後再懸浮於培養基中。
隔天，在培養盤以PBS清洗二次以後，以每孔1.25 x 104 個T細胞加入腫瘤細胞。將系列稀釋之單獨或結合的融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87、SEQ ID NOs: 86與91、SEQ ID NOs: 92與87、及SEQ ID NOs: 86與93)、參考體PD-L1抗體(SEQ ID NOs: 26與27)、及參考體CD137抗體(SEQ ID NO: 28與29)，或同型對照組(SEQ ID NOs: 24與25)，典型而言範圍為0.005 nM至10 nM，加入相對應之培養孔中。培養盤以透氣密封墊覆蓋，並在37°C之5% CO2潮濕環境中培養3天。
在共同培養3天之後，評估上清液中IL-2含量，如實施例 11 所述。
示例性數據顯示於圖 10 。在融合蛋白與融合至PD-L1-特異性抗體C端之脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NOs: 90與87及SEQ ID NOs: 86與91)存在下，共同培養Pan T細胞與RKO細胞(PD-L1高含量)或HCC827 (PD-L1中含量)，其相較於hIgG4同型對照組，明顯增加IL-2分泌。利用融合蛋白與融合至PD-L1-特異性抗體N端之脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NOs: 92與87及SEQ ID NOs: 86與93)誘導的IL-2分泌增加情況較弱，但仍高於參考體CD137抗體(SEQ ID NOs: 28與29)與參考體PD-L1抗體(SEQ ID NO: 26與27)之雞尾酒。結構單元、CD137特異性脂質運載蛋白突變蛋白(Fc融合體，SEQ ID NO: 89)、及PD-L1抗體(SEQ ID NO: 86與87)之雞尾酒未觀察到IL-2分泌增加。此外，與Hep-G2 (PD-L1陰性)共同培養，任何融合蛋白皆不增加IL-2分泌含量，但參考體CD137抗體(SEQ ID NO: 28與29)與參考體PD-L1抗體(SEQ ID NO: 26與27)之雞尾酒則會。
數據指出，藉由測定活化T細胞或增加IL-2分泌之能力，融合蛋白之功能活性具有PD-L1依賴性。相反地，利用參考體CD137抗體(SEQ ID NOs: 28與29)誘導的T細胞活化或IL-2分泌，當結合參考體PD-L1抗體(SEQ ID NOs: 26與27)使用時，不一定依賴PD-L1且難以預測。此外，數據顯示，在表現PD-L1之標靶細胞存在下，靶向PD-L1與CD137的雙特異性形式，優於靶向CD137與PD-L1的二個別分子之雞尾酒。
實施例 13. 融合蛋白之儲存穩定性評估
欲評估儲存穩定性，示例性融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87、SEQ ID NOs: 86與91、SEQ ID NOs: 92與87、SEQ ID NOs: 86與93、SEQ ID NOs: 94與87、SEQ ID NO: 88、及SEQ ID NO: 89)在37°C下以濃度1 mg/ml在PBS中培養1週。隨後，利用分析型粒徑篩析確定單體型融合蛋白，係以流速0.15 ml/min施加20 µg之樣本至Superdex 200，3.2/300 Increase (GE Healthcare)管柱，並以PBS作為運行緩衝液。在37°C之PBS中培養1週之後，所有測試之融合體胜肽皆穩定。示例性結果顯示於圖 11A 。
針對所選SEQ ID NOs: 90與87之融合蛋白，進行進一步之儲存穩定性評估。融合蛋白(20 mg/ml)在40°C之25 mM組胺酸、60 mM NaCl、200 mM精胺酸(pH 6)中培養四週。在定量ELISA設定中測定功能性融合蛋白含量，其係使用如實施例 5 所述之同時結合試驗。示例性結果顯示於圖 11B 。
實施例 14. 以 CD4+ T 細胞評估混合式淋巴球反應 (MLR)
利用混合式淋巴球反應(MLR)試驗評估在抗原呈現細胞存在下示例性融合蛋白誘導CD4+ T細胞活化的能力。在取自未匹配健康供體之單核細胞衍生之樹突狀細胞(moDCs)與CD4+ T細胞存在下，測試不同濃度的融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87)。在待測分子存在下培養6天之後，定量上清液中IL-2與IFN-γ之分泌。
遵照製造商的說明(StemCell)，利用Lymphoprep溶液，從血小板單採血液袋中純化PBMCs。利用Miltenyi套組，從PBMC中純化出總CD4+ T淋巴球，並冷凍在90% FBS與10% DMSO之溶液中。以CD14+ 微珠套組(Miltenyi)純化出CD14+ 單核細胞，並新鮮使用。
藉由在50 ng/mL之IL-4與100 ng/mL之GMCSF (Miltenyi)存在下的RPMI1640加上10% FBS與Pen/Strep (LifeTech)中培養CD14+ 單核細胞(2x106 個細胞/mL) 6天，取得MoDCs。在第3天時，將10 ml含有細胞激素之新鮮培養基加入。在分化第7天時，利用FACS評估表型(CD14、CD1a、HLADR、PD-L1)。
利用U型底96孔培養盤與完全RPMI培養基，在50000個CD4+ T細胞存在下，培養10000個moDC，其中在三重複之RPMI培養基中，以待測分子培養6天。在培養結束後，立即將上清液冷凍並儲存，以進行細胞激素定量。
利用Luminex技術，測定上清液中之IL-2含量，且示例性數據顯示於圖 12 。圖 12A 顯示，在數組MLR實驗中(N=8)，相較於相對應之單獨的結構單元(SEQ ID NO: 89及SEQ ID NOs: 86與87)或參考體CD137或PD-L1抗體(SEQ ID NOs: 28與29或SEQ ID NOs: 26與27)，融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87)在10與0.1 µg/mL時，IL-2誘導作用明顯更好。圖 12B 顯示，相較於同型抗體對照組，融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87)誘導IL-2之劑量依賴性分泌。相較於等莫耳濃度之參考體PD-L1抗體(SEQ ID NOs: 26與27)與參考體CD137抗體(SEQ ID NOs: 28與29)之雞尾酒(濃度範圍0.001至20 µg/mL)，融合蛋白SEQ ID NOs: 90與87誘導之IL-2含量更高。
實施例 15. 以 CD8+ T 細胞評估混合式淋巴球反應
鑑於在人類CD8+ T細胞中CD137表現與活性的報導，在MLR試驗中，評估在抗原呈現細胞存在下誘導CD8+ T細胞活化的能力。在未匹配健康供體之moDCs與總CD8+ T細胞存在下，測試融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87)。在待測分子存在下培養6天之後，定量上清液中IL-2與CD8效應子分子(穿孔素、顆粒酶B、及顆粒酶A)之分泌。
遵照製造商的說明(StemCell)，利用Lymphoprep溶液，從血小板單採血液袋中純化PBMCs。利用Miltenyi套組，從PBMC中純化出總CD8+ T淋巴球，並新鮮使用。以CD14+ 微珠套組(Miltenyi)純化出CD14陽性單核細胞，並新鮮使用。
藉由在50 ng/mL之IL-4與100 ng/mL之GMCSF (Miltenyi)存在下的RPMI1640加上10% FBS與Pen/Strep (LifeTech)中培養CD14+ 單核細胞(2x106 個細胞/mL) 6天，取得MoDCs。在第3天時，將10 ml含有細胞激素之新鮮培養基加入。在分化第7天時，利用FACS評估表型(CD14、CD1a、HLADR、PD-L1)。
利用U型底96孔培養盤(三重複之培養孔)與完全RPMI培養基，在50000個CD8+ T細胞存在下，培養10000個moDC，其中以待測分子培養6天。在培養結束後，立即將上清液冷凍並儲存，以進行分泌因子定量。
利用Luminex技術，定量上清液中之IL-2、穿孔素、顆粒酶A、及顆粒酶B。示例性數據顯示於圖 13 。
圖 13 顯示，相較於等莫耳濃度之參考體PD-L1抗體(SEQ ID NOs: 26與27)、參考體CD137抗體(SEQ ID NOs: 28與29)、或二者(10 µg/mL)之雞尾酒(N=4)，融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87)顯示IL-2、穿孔素、顆粒酶B、及顆粒酶A之分泌增加。數據進一步顯示，融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87)對細胞毒性CD8+ T細胞具有活性。
實施例 16. 在植入人類 PBMCs 之異種移植小鼠模型中評估功能性體內活性
欲探討所提供融合蛋白之體內活性，將使用細胞株衍生之異種移植小鼠模型。據此，將人類癌症細胞株皮下植入免疫缺陷雌性NOG小鼠，並在4-6週齡時交付，且至少1週的保證。在腫瘤達到約80-100 mm3 之體積後，以小鼠替代人類PBMCs。待測化合物注射至少3次，並定時測量腫瘤生長與活性。在研究結束後，將小鼠犧牲。以免疫組織化學法評估 CD3、CD4、及CD8陽性細胞之腫瘤內浸潤。進行IFN-γ RNAscope，以進一步判讀。
實施例 17. 融合蛋白之表位分析
欲探討融合蛋白辨別之表位，及其是否在臨床上相關，使用競爭型ELISA形式，以確定融合蛋白與參考體CD137抗體之間的競爭作用。
在4°C下，以溶於PBS (4 µg/mL)之參考體CD137抗體SEQ ID NOs: 28與29塗佈微滴定盤隔夜。在各個100 µL PBS-0.05%T (PBS，其中補充0.05% (v/v) Tween 20)培養步驟之後，清洗培養盤五次。培養盤在室溫下以溶於PBS-0.1%T (PBS，其中補充0.1% (v/v) Tween 20)之2% BSA (w/v)阻斷1 h，接著再次清洗。將不同濃度的融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87及SEQ ID NOs: 86與91)、CD137特異性脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NO: 42)、參考體CD137抗體(SEQ ID NOs: 28與29)、及對照組抗體(SEQ ID NOs: 86與87)與 were mixed with 1 nM的生物素化人類CD137 Fc融合體 (huCD137-Fc-bio)混合以作為追蹤劑，並在室溫下培養1 h。將待測分子與追蹤劑之混合物加入培養盤中，並在室溫下培養20 min，接著進行五次100 µL PBS-0.05%T的清洗步驟。隨後，將溶於PBS-0.1%T-2%BSA之1:5000稀釋之ExtrAvidin-HRP (Sigma-Aldrich)加入培養孔中，並培養1 h。在另一清洗步驟之後，將螢光HRP受質(QuantaBlu，Thermo)加入各培養孔，並以螢光微讀盤儀檢測螢光強度。
示例性實驗之競爭作用數據顯示於圖 14 ，其中x軸代表待測分子濃度，且y軸代表所測得之追蹤分子濃度。將數據擬合至1:1 S型曲線，其中IC50 值與最大信號值為自由參數，且斜率固定為1。結果證實，示例性融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87及SEQ ID NOs: 86與91)與CD137抗體SEQ ID NOs: 28與29競爭CD137的結合，顯示融合蛋白與抗體結合重疊之表位。
表 10. 融合蛋白之競爭作用
實施例 18. 利用 PD-1/PD-L1 阻斷生物試驗評估 T 細胞活化作用
利用PD-1-NFAT-luc Jurkat T細胞(Jurkat細胞株經基因工程以表現PD-1與luc 基因(螢火蟲螢光素酶基因)，其由NFAT回應元件(NFAT-RE)驅動)，並與PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞(此CHO-K1細胞表現人類PD-L1與經基因工程之細胞表面蛋白質，其經設計以抗原非依賴性方式活化同源TCR)共同培養，評估所選融合蛋白阻斷PD-1/PD-L1介導之抑制作用的能力。在此生物試驗中，當共同培養PD-1-NFAT-luc Jurkat T細胞與PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞時，PD-1/PD-L1交互作用抑制TCR傳訊與NFAT-RE介導之發光。添加PD-1/PD-L1阻斷劑，如本文所述之CD137與PD-L1特異性融合蛋白，釋放抑制信號，且造成TCR活化與NFAT-RE介導之發光。
將PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞生長在補充10% FCS之Ham´s F12培養基中，且每孔以8.00 x 103 個細胞分盤，使其在37°C之5% CO2潮濕環境中黏附隔夜。隔天，移除培養基。將1.00 x 104 個PD-1-NFAT-luc Jurkat T細胞加入各孔，隨後添加各種濃度，典型而言範圍為0.005 nM至50 nM的融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87)或PD-L1抗體(SEQ ID NOs: 86與87或SEQ ID NOs: 26與27)。培養盤以透氣密封墊覆蓋，並在37°C之5% CO2 潮濕環境中培養。在6h之後，將30 µL Bio-Glo™ Reagent加入各培養孔，並以光度計定量生物發光信號。以GraphPad Prism®進行四參數邏輯曲線分析，以計算EC50 值，其摘錄於表 11 。試驗以三重複進行。
代表性實驗之結果如圖 15 所示。數據證實，待測融合蛋白抑制PD-1/PD-L1阻斷效果，並以劑量依賴性方式活化T細胞，其中EC50 值可與PD-L1抗體(SEQ ID NOs: 86與87或SEQ ID NOs: 26與27)的比擬。作為陰性對照組，參考體CD137抗體(SEQ ID NOs: 28與29)或同型對照組抗體(SEQ ID NOs: 24與25)皆無法造成發光信號增加。
表 11. 利用PD-1/PD-L1阻斷生物試驗評估T細胞活化
實施例 19. 利用人類 PBMCs 評估 T 細胞活化
進行額外之T細胞試驗，以評估所選融合蛋白共同刺激T細胞反應之能力，其中將不同濃度之融合蛋白添加至SEB刺激之人類PBMCs中，並在37°C下培養3天。測定上清液中之IL-2分泌含量。
從健康自願者供體中分離出PBMCs並儲存，如實施例 11 所述。在試驗時，將PBMCs解凍，並在37°C之5% CO2 潮濕環境中，靜置在補充10% FCS與1%青黴素-鏈黴素(Life Technologies)的培養基(RPMI 1640，Life Technologies)中24 h。
針對各實驗條件，以三重複進行下列程序：2.5x104 個PBMCs細胞培養在384孔平底組織培養盤各孔之培養基中。將系列稀釋之所選融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87)、結構單元PD-L1抗體(SEQ ID NOs: 86與87)、參考體CD137抗體(SEQ ID NO: 28與29)單獨或結合參考體PD-L1抗體(SEQ ID NOs: 26與27)使用，或同型對照組(SEQ ID NOs: 24與25)，典型而言範圍為0.0002至10 nM，並將0.1 ng/ml SEB加入個別培養孔中。培養盤以透氣密封墊(4titude)覆蓋，並在37°C之5% CO2 潮濕環境中培養三天。隨後，評估上清液中之IL-2，如實施例 11 所述。
代表性實驗之結果如圖 16 所示。誘導IL-2分泌之待測分子的EC50 值摘錄於表 12 。在IL-2分泌方面，相較於結構單元PD-L1抗體、參考體CD137抗體、及參考體PD-L1與CD137抗體之雞尾酒，SEQ ID NOs: 90與87之雙特異性融合蛋白誘導強的劑量依賴性增加，直到更高含量，同時相對於單獨使用或結合的PD-L1與CD137抗體，減少有效EC50 值。
表 12. 利用人類PBMCs評估T細胞活化
實施例 20. 評估融合蛋白誘導之 PD-L1 依賴性 T 細胞活化
以T細胞活化試驗進一步分析融合蛋白之PD-L1標靶依賴性T細胞共同刺激作用。將不同濃度之融合蛋白施加至抗CD3刺激之T細胞，並與人類PD-L1轉染或假性轉染之Flp-In-CHO細胞共同培養。測定上清液中之IL-2分泌含量。
從健康自願者供體之膚色血球層中分離出PBMC，如實施例 11 所述。進一步純化出T淋巴球並儲存，如實施例 12 所述。
在試驗時，將T細胞解凍，並在37°C之5% CO2 潮濕環境中，靜置在補充10% FCS與1%青黴素-鏈黴素(Life Technologies)的培養基(RPMI 1640，Life Technologies)中隔夜。
針對各實驗條件，以三重複進行下列程序：平底組織培養盤在37°C下預先以0.25 μg/mL抗CD3抗體塗佈2 h，隨後以PBS清洗二次。以30 µg/ml絲裂黴素C (Sigma Aldrich)處理轉染人類PD-L1或假性轉染之CHO細胞30 min，以阻斷細胞增生。隨後，絲裂黴素處理之腫瘤細胞以PBS清洗二次，並以每孔1.0 x 107 個細胞分盤在培養基中，使其在37°C之5% CO2 潮濕環境中黏附隔夜。CHO細胞先前於標準條件下生長，以Accutase (PAA Laboratories)脫附，然後再懸浮於培養基中。
隔天，CHO細胞之各孔加入8.33 x 103 個T細胞。將系列稀釋之示例性融合蛋白SEQ ID NOs: 90與87、結構單元PD-L1抗體(SEQ ID NOs: 86與87)、參考體CD137抗體(SEQ ID NOs: 28與29)、及參考體PD-L1抗體(SEQ ID NOs: 26與27)與參考體CD137抗體(SEQ ID NO: 28與29)之雞尾酒，或同型對照組(SEQ ID NOs: 24與25)，典型而言範圍為0.003 nM至50 nM，加入相對應之培養孔中。培養盤以透氣密封墊覆蓋，並在37°C之5% CO2 潮濕環境中培養2天。
在共同培養2天之後，評估上清液中之IL-2含量，如實施例 11 所述。
示例性數據顯示於圖 17 。在融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87及SEQ ID NOs: 86與91)存在下，共同培養Pan T細胞與轉染人類PD-L1之CHO細胞，其相較於hIgG4同型對照組，造成強的劑量依賴性IL-2分泌，且比參考體抗體的更強，其中在參考體CD137抗體或參考體CD137抗體與參考體PD-L1抗體之雞尾酒，觀察到僅稍微增加IL-2分泌。當與假性轉染之CHO細胞(PD-L1陰性)共同培養時，僅參考體CD137抗體及參考體CD137抗體與參考體PD-L1抗體之雞尾酒顯示稍微劑量依賴性增加IL-2分泌。結果顯示，融合蛋白以PD-L1依賴性方式活化T細胞，對比參考體CD137抗體(SEQ ID NOs: 28與29)，顯示CD137介導之T細胞共同刺激作用，不論存在或不存在標靶細胞。
實施例 21. 融合蛋白在小鼠中之藥物動力學
在小鼠中進行代表性融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87、SEQ ID NOs: 86與91、SEQ ID NOs: 92與87、SEQ ID NOs: 86與93、SEQ ID NOs: 94與87、及SEQ ID NOs: 90與91)之藥物動力學分析。以融合蛋白(劑量為10 mg/kg)進行約5週大年齡之雄性CD-1小鼠(每一時間點3隻小鼠；Charles River Laboratories，Research Models and Services，Germany GmbH)之尾靜脈注射。測試物以5 mL/kg體積之推注體(bolus)投予。在時間點5 min、1 h、4 h、8 h、24 h、48 h、4 d、8 d、14 d、21 d、及28 d取得小鼠血漿樣本。收集足夠的全血-在異氟烷麻醉下採集-每隻動物與每一時間點取得至少100 μL的Li-肝素血漿。利用夾層ELISA檢測藥物含量，其經由標靶PD-L1與CD137檢測完整雙特異性構築體。數據以Prism GraphPad 5軟體之二間隔模型(two-compartmental model)擬合。
圖 18 顯示融合蛋白SEQ ID NOs: 90與87、SEQ ID NOs: 86與91、SEQ ID NOs: 92與87、SEQ ID NOs: 86與93、SEQ ID NOs: 94與87、及SEQ ID NOs: 90與91之血漿濃度與時間圖，並與參考體結構單元PD-L1抗體(SEQ ID NOs: 86與87)取得之數值一起繪圖。藥物動力學在所有情況中看起來類似。使於血漿濃度約200 µg/mL，血漿含量在48小時內降至約50 µg/mL之含量，接著在28天後之實驗結束時以更慢之速度進一步下降至約10 µg/mL之含量。數據進行非間隔分析(non-compartmental analysis)。終端半衰期摘錄於表 13 。
數據證實，融合蛋白在小鼠中具有持久的、類似抗體的終端半衰期。由於所用決定融合蛋白血漿濃度之試驗需要對PD-L1與CD137皆具有保留的活性，該結果亦證實，雙特異性分子在28天時間過程中保持完整。
表 13. 利用非間隔分析測定小鼠之終端半衰期
實施例 22. 融合蛋白在小鼠中之藥物動力學
在小鼠中進行代表性融合蛋白SEQ ID NOs: 90與87之藥物動力學分析，並比較二個前面描述之CD137與PD-L1結合之融合蛋白(SEQ ID NO: 147及SEQ ID NO: 148)。以各個分子(劑量為2 mg/kg)進行約5週大年齡之雄性CD-1小鼠(每一時間點2隻小鼠；Charles River Laboratories，Research Models and Services，Germany GmbH)之尾靜脈注射。測試物以5 mL/kg體積之推注體(bolus)投予。在時間點5 min、24 h、168 h、及336 h取得小鼠血漿樣本。收集足夠的全血-在異氟烷麻醉下採集-每隻動物與每一時間點取得至少30-50 μL的Li-肝素血漿。
隨後，以ELISA分析血漿藥物含量。將HuCD137-His (人類 CD137，其中C端具有多組胺酸標記)溶於PBS (1 µg/mL)，並在4°C下塗佈在微滴定盤上隔夜。在各個80 µL PBS (其中補充0.05% (v/v) Tween 20)培養步驟之後，清洗培養盤五次。培養盤在室溫下以PBS/BSA/Tween (含有2% BSA (w/v)與0.1% (v/v) Tween 20之PBS)阻斷1 h，且隨後清洗。血漿樣本以PBS/BSA/Tween稀釋至20%血漿濃度，加入培養孔，並在室溫下培養1 h。接著進行另一清洗步驟。在與生物素化人類PD-L1和鏈親和素SULFO標記 (Mesoscale Discovery)之混合物(各以含有2% BSA (w/v)與0.1% (v/v) Tween 20之PBS稀釋成1 µg/mL)培養1 h之後，檢測結合之研究試劑。在另一清洗步驟之後，將35 µL判讀用緩衝液加入各培養孔中，並以Mesoscale Discovery讀盤儀讀取各孔之電化學發光(ECL)信號。將數據移至Excel進行分析與定量。製備含有標準蛋白質稀釋液之校正曲線。
圖 19 顯示SEQ ID NOs: 90與87、SEQ ID NO: 147、及SEQ ID NO: 148隨時間之血漿濃度圖。SEQ ID NOs: 90與87呈現良好的藥物動力學概況或類似抗體的藥物動力學，而SEQ ID NO: 147及SEQ ID NO: 148則否。如本文所述，若在336 h之後cmax 百分比(%)高於10%，則可視為達到良好的藥物動力學概況或類似抗體的藥物動力學。
可在本文中未具體公開之任何要素或元件、侷限或限制之情況下適當地實踐本文中示例性描述之具體實施例。因此，舉例而言，術語"包含"、"包括"、"含有"等應廣泛地解讀而無侷限。此外，於此使用之術語與表達可用作說明用之術語而無侷限，且未旨在以該術語與表達排除所示與描述之特徵或其部分的任何等同形式，但應理解到，在本發明之申請範圍內可進行各種改良。因此，應理解到，儘管藉由較佳之具體實施例與任意之特徵特別地揭示本發明之具體實施例，但本領域技術人員可對其進行改良與變型，且彼等改良與變型視為落於本發明之範疇內。本文所述之所有專利、專利申請案、教科書、同行評審之出版品，在此全部併入本案以作為參考資料。此外，若參考體中引用之術語之定義或用途與本文中引用之術語的定義不一致或相反，則本文提供之該術語的定義適用，而參考文獻中該術語的定義則否。落入一般公開範圍內之各個較窄之物種與亞種群組，亦構成本發明之一部分。這包括本發明之一般性描述，但有條件或否定的限制，從該種類中移除任何主題，不論本文中是否具體敘述該移除之材料。此外，在以馬庫西群組描述特徵之情況下，本領域技術人員應理解到，本發明亦可以馬庫西群組成員之任何單獨成員或子群組說明。依據下列申請專利範圍，本發明之其他具體實施例將變得顯而易見。
等同物：本領域技術人員應理解到，或僅使用常規實驗，即可確定本文所述特定之具體實施例之許多等同物。該些等同物旨在由所附申請專利範圍所涵蓋。本說明書中提及之所有出版品、專利、及專利申請案皆以參考資料之方式併入本說明書，其程度與參考資料具體地和單獨地指出各出版品、專利、或專利申請案併入本案之程度相同。非專利文獻 1.      GATO-CANAS, M., ZUAZO, M., ARASANZ, H., IBANEZ-VEA, M., LORENZO, L., FERNANDEZ-HINOJAL, G., VERA, R., SMERDOU, C., MARTISOVA, E., AROZARENA, I., WELLBROCK, C., LLOPIZ, D., RUIZ, M., SAROBE, P., BRECKPOT, K., KOCHAN, G. & ESCORS, D. 2017. PDL1 Signals through Conserved Sequence Motifs to Overcome Interferon-Mediated Cytotoxicity.Cell Rep, 20, 1818-1829. 2.      KARWACZ, K., BRICOGNE, C., MACDONALD, D., ARCE, F., BENNETT, C. L., COLLINS, M. & ESCORS, D. 2011. PD-L1 co-stimulation contributes to ligand-induced T cell receptor down-modulation on CD8+ T cells.EMBO Mol Med, 3, 581-92. 3.      ARASANZ, H., GATO-CANAS, M., ZUAZO, M., IBANEZ-VEA, M., BRECKPOT, K., KOCHAN, G. & ESCORS, D. 2017. 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無
圖 1 ： 提供本申請案中描述之代表性融合蛋白的設計概述，其對靶標CD137與PD-L1具有雙特異性。代表性融合蛋白係依據抗體PD-L1特異性 (例如，一抗體，其重鏈如SEQ ID NO: 86所提供，或包含SEQ ID NO: 77之重鏈可變結構域，或包含GFSLSNYD (HCDR1，SEQ ID NO: 60)、IWTGGAT (HCDR2，SEQ ID NO: 61)、及VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3；SEQ ID NO: 62)之CDR序列，以及其輕鏈如SEQ ID NO: 87所提供，或包含SEQ ID NO: 82之重鏈可變結構域，或包含QSIGTN (LCDR1，SEQ ID NO: 63)、YAS (LCDR2)、及QQSNSWPYT (LCDR3；SEQ ID NO: 64)之CDR序列)及一或多個脂質運載蛋白突變蛋白CD137特異性(如，SEQ ID NO: 42之脂質運載蛋白突變蛋白)製造。如圖 1A-1I 所示，一或多個脂質運載蛋白突變蛋白係基因融合至PD-L1特異性抗體重鏈或輕鏈之C及/或N端，產生如SEQ ID NOs: 90與87、SEQ ID NOs: 86與91、SEQ ID NOs: 92與87、SEQ ID NOs: 86與93、SEQ ID NOs: 94與87、及SEQ ID NOs: 90與91之融合蛋白。所產生之融合蛋白可對CD137二價(如圖 1A-1D 所示)，或對CD137四價(如圖 1E-1H 所示)，或甚而對CD137具有更高價數(如圖 1I 所示)。利用將一或多個CD137特異性脂質運載蛋白突變蛋白(如圖 1J-1K 所示)融合至抗體Fc區的C端，如本文所述經由一胜肽連接子，產生額外的單特異性融合蛋白。所得之單特異性融合蛋白如SEQ ID NO: 88與SEQ ID NO: 89所提供。
圖 2 ： 顯示ELISA實驗結果，其中代表性融合蛋白結合至PD-L1或CD137係如實施例 4 所述方式決定。將PD-L1或CD137 (具有C端His或Fc標記)塗佈在微滴定盤上，且待測試劑從最高濃度100 nM開始滴定。在研究中結合之試劑係分別以抗人類IgG Fc-HRP或抗NGAL-HRP檢測。數據以1:1結合模型擬合，其中以EC50 值與最大訊號作為自由參數，且斜率固定為1。表 4 提供所得之EC50 值。
圖 3 ： 顯示ELISA實驗結果，其中測定代表性融合蛋白同時結合兩標靶PD-L1與CD137之能力如實施例 5 所述。將重組型huPD-L1-His或huCD137-His塗佈在微滴定盤上，接著以融合蛋白滴定，其始於最高濃度100 nM。隨後，分別將固定濃度之生物素化huCD137-His或生物素化huPD-L1-His加入，其係利用ExtrAvidin-過氧化酶檢測。
圖 4 ： 顯示利用流式細胞術，以表現人類或食蟹猴CD137 (圖 4A-4B )及人類或食蟹猴PD-L1 (圖 4C-4D )之Flp-In-CHO細胞評估融合蛋白結合標靶之結果，如實施例 6 所述。當使用假性轉染Flp-In-CHO細胞，未觀察到結合作用(圖 4E )。以螢光強度幾何平均值結合非線性迴歸(共有底部，SLOPE = 1)計算EC50 值。表6中提供了EC50值。
圖 5 ： 顯示利用流式細胞術，培養RKO細胞與融合蛋白，評估融合蛋白與PD-L1陽性腫瘤細胞之結合作用，如實施例 7 所述。
圖 6 ： 提供以多重結合SPR為主之實驗的實例，其設計係用於評估融合蛋白與CD137之交互作用是否阻礙CD137L結合至CD137，如實施例 8 所述。藉由在SPR傳感器晶片上產生huCD137 (C端Fc融合)與huCD137L (具有C端His標記)的複合體，並檢查融合蛋白是否仍可結合huCD137與CD137L之複合體，以進行評估。作為參考體，當不存在huCD137L時，huCD137亦培養於待測融合蛋白。以帶有實心之箭頭標記個別融合蛋白與單獨之huCD137結合的SPR曲線。以帶有斷裂桿狀之箭頭標記，個別融合蛋白與huCD137L飽和化之huCD137結合的SPR曲線。作為對照組，使用無融合蛋白的空白注射劑。實驗顯示，在CD137L存在下，所有待測融合蛋白皆能結合CD137。
圖 7 ： 顯示融合蛋白與PD-L1競爭結合至PD-1，如實施例 9 所述之競爭性ELISA研究所示。將恆定濃度的huPD-1-His塗佈在微滴定盤上，接著添加不同濃度之待測分子與固定濃度之追蹤劑huPD-L1-Fc的混合物。以HRP標記之抗IgG Fc抗體檢測結合之追蹤劑。觀察到CD137與PD-L1雙特異性融合蛋白或PD-L1特異性抗體對huPD-L1-Fc結合至PD-1的劑量依賴性抑制作用。
圖 8 ： 利用CD137生物試驗，評估代表性融合蛋白以PD-L1靶標依賴性方式共同刺激T細胞活化之潛力。在各濃度之融合蛋白或對照組存在下，將NFκB-luc2/CD137 Jurkat細胞與表現PD-L1之腫瘤細胞株RKO共同培養。在4小時後，添加螢光素酶試驗試劑並測定發光信號。以GraphPad Prism®進行四參數邏輯曲線分析，以計算EC50 值(請參見表 9 )。融合蛋白僅於PD-L1 (圖 8A 與8C )存在下而非PD-L1不存在下(圖 8B 與8D )共同刺激T細胞活化。相反地，於存在與不存在PD-L1陽性RKO細胞之情況下，參照體抗CD137mAb (SEQ ID NO：28與29)顯示類似的活化作用。
圖 9 ： 顯示代表性實驗之結果，其中研究經選擇之融合蛋白誘導T細胞活化的能力。PD-L1抗體，包括個別的PD-L1抗體結構單元、作為Fc融合體的CD137結合脂質運載蛋白突變蛋白、及抗CD137基準抗體，可單獨或結合成抗PD-L1/抗CD137雞尾酒測試。在該實驗中，在1 ng/mL葡萄球菌腸毒素B (SEB)存在下，將人類週邊血液單核細胞(PBMCs)培養於融合蛋白、抗體、脂質運載蛋白突變蛋白Fc融合蛋白、雞尾酒、或對照組。利用以電化學發光為主之測定法，讀取T細胞活化，以確定代表T細胞活化之分泌之白介素2 (IL-2)含量，並標準化為相對應之IgG4對照組之含量，如實施例 11 所述。所有融合蛋白皆能誘導T細胞活化，且比單一構件或基準抗PD-L1抗CD137抗體之雞尾酒更強或至少可比擬。
圖 10 ： 顯示融合蛋白以PD-L1標靶依賴性方式共同刺激T細胞活化的能力。PD-L1抗體，包括個別的PD-L1抗體結構單元、作為Fc融合體的CD137結合脂質運載蛋白突變蛋白、及抗CD137基準抗體，可單獨或結合成抗PD-L1/抗CD137雞尾酒測試。將表現不同PD-L1含量的多個腫瘤細胞株(高度：RKO；中度：HCC827；陰性：HepG)種植至抗人類CD3塗佈之培養盤上。將Pan T細胞與各濃度之融合蛋白和單一構件加入，並培養3天。利用以電化學發光為主之測定法，確定分泌之IL-2含量，如實施例12所述。所有融合蛋白皆能以PD-L1依賴性方式增加IL-2分泌。
圖11：說明融合蛋白在PBS(圖11A)或25mM組胺酸、60mM NaCl、200mM精胺酸(pH 6)(圖11B)中，在37℃或40℃下，以濃度1mg/ml或20mg/mL培養1、2、3、或4週後的儲存穩定性。藉由從分析型粒徑篩析中回收單體或藉由從定量ELISA中回收功能性蛋白質，評估穩定性，如實施例13所述。
圖12：顯示代表性融合蛋白(SEQ ID NOs：90與87)在混合式淋巴球反應(MLR)中與CD4+ T細胞刺激IL-2分泌的能力。融合蛋白、PD-L1抗體結構單元(SEQ ID NOs：86與87)、以CD137結合脂質運載蛋白突變蛋白作為Fc融合體(SEQ ID NO：89)、及抗CD137基準抗體或抗PD-L1基準抗體，可以等莫耳濃度單獨或結合成抗PD-L1/抗CD137雞尾酒測試，如實施例14所述。在與源自不同健康供體之總人類CD4+ T細胞及單核細胞衍生之樹突狀細胞(moDCs)培養6天後，測定上清液之IL-2分泌。圖12A顯示相較於單獨的結構單元(PD-L1抗體SEQ ID NOs：86與87或CD137特異性脂質運載蛋白突變蛋白SEQ ID NO：89)及參考體抗PD-L1或抗CD137抗體(分別為SEQ ID NOs：26與27或SEQ ID NOs：28與29)，在等莫耳濃度(相當於10或0.1μg/ml的待測融合蛋白)時，融合蛋白SEQ ID NOs：90與87之IL-2分泌明顯增加。所顯示之數據源自8個獨立實驗。圖12B顯示融合蛋白SEQ ID NOs：90與87在0.001至20μg/mL之濃度範圍內能誘導劑量依賴性之IL-2分泌。相較於等莫耳濃度之參考體抗PD-L1抗體(SEQ ID NOs：26與27)與參考體抗CD137抗體(SEQ ID NOs：28與29)之雞尾酒，融合蛋白誘導的IL-2含量更高。所顯示之數據源自代表性供體。
圖 13 ：顯示示例性融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87)誘導CD8+ T細胞效應子分子分泌的能力。將融合蛋白培養在未匹配(mismatching)健康供體之moDCs與CD8+ T細胞6天，接著利用Luminex試驗定量上清液中IL-2與CD8+ T細胞效應子分子之分泌，如實施例 15 所述。相較於參考體抗PD-L1抗體(SEQ ID NOs: 26與27)與參考體抗CD137抗體(SEQ ID NOs: 28與29)，當單獨或作為雞尾酒使用時，融合蛋白SEQ ID NOs: 90與87顯示，在10 µg/mL時，IL-2與細胞毒性因子(穿孔素、顆粒酶B、及顆粒酶A)的分泌增加。
圖 14 ： 競爭性ELISA研究顯示，融合蛋白與具有臨床活性之CD137抗體(SEQ ID NOs: 28與29)結合重疊的表位，如實施例 17 所述。將恆定濃度之SEQ ID NOs: 28與29塗佈在微滴定盤上，隨後加入不同濃度之待測分子與固定濃度之生物素化huCD137-Fc追蹤劑的混合物。利用ExtrAvidin-過氧化酶檢測結合之追蹤劑。融合蛋白與CD137抗體競爭CD137之結合。
圖 15 ： 顯示代表性融合蛋白阻斷PD-1/PD-L1交互作用介導之抑制信號的潛力，其係利用PD-1/PD-L1阻斷生物試驗評估，如實施例 18 所述。在各種待測分子濃度存在下，共同培養PD-1-NFAT-luc Jurkat T細胞(表現PD-1與NFAT啟動子控制下之NFAT介導之螢光素酶基因的Jurkat細胞株)與PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞。在6小時之後，加入螢光素酶試驗試劑並測定發光信號。背景信號為PD-1-NFAT-luc Jurkat T細胞與僅有PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞共同培養。SEQ ID NOs: 90與87之融合蛋白阻斷PD-1/PD-L1途徑，可比擬測試之PD-L1抗體，包括SEQ ID NOs: 86與87顯示之結構單元PD-L1抗體與SEQ ID NOs: 26與27顯示之參考體PD-L1抗體。
圖 16 ： 顯示代表性融合蛋白誘導T細胞活化之能力。PD-L1抗體結構單元與參考體CD137抗體，當單獨與結合PD-L1抗體使用時，亦進行測試。在實驗中，人類PBMCs在0.1 ng/mL SEB存在下培養於融合蛋白、抗體、雞尾酒、或對照組。利用以電化學發光為主之測定法，讀取T細胞活化，以確定分泌之IL-2含量，如實施例 19 所述且顯示於圖 16A 。圖 16B 顯示相較於背景IL-2分泌含量(PBMCs以0.1 ng/mL SEB且無任何待測分子刺激)，待測分子誘導之IL-2分泌含量之增加倍數。融合蛋白導致IL-2分泌的劑量依賴性增加，其比PD-L1抗體或CD137抗體之單獨或結合形式更強。
圖 17 ： 證實在PD-L1存在下代表性融合蛋白共同刺激T細胞活化的能力。以並行方式測試PD-L1抗體結構單元、參考體CD137抗體、CD137抗體與參考體PD-L1抗體之雞尾酒。將轉染人類PD-L1 (圖 17A )或假性轉染(人類PD-L1陰性，圖 17B )的CHO細胞種植在抗人類抗CD3塗佈之培養盤上。將Pan T細胞及各種濃度的待測分子加入並培養2天。利用以電化學發光為主之測定法，確定上清液中分泌之IL-2含量，如實施例 20 所述。將IL-2分泌含量歸一化至背景含量(Pan T細胞 + 抗CD3 + CHO細胞)，以說明在表現人類PD-L1之CHO細胞(圖 17C )或假性轉染CHO細胞(圖 17D )之存在下，IL-2分泌的增加倍數。融合蛋白僅在PD-L1存在下誘導IL-2分泌之強的劑量依賴性增加，其比參考體CD137抗體單獨的或結合參考體PD-L1抗體的更強。
圖 18 ： 提供雙特異性融合蛋白與結構單元PD-L1抗體(SEQ ID NOs: 86與87)在小鼠中藥物動力學分析結果，如實施例 21 所述。雄性CD-1小鼠(每一時間點3隻小鼠)靜脈注射融合蛋白，劑量為10 mg/kg。利用夾層ELISA，透過標靶PD-L1與CD137檢測整個分子，以檢測藥物含量。抗PD-L1抗體的血漿含量是 利用三明治ELISA和靶標PD-L1和人類Fc測定的。利用夾層ELISA，配合標靶PD-L1與人類Fc，確定抗PD-L1抗體血漿含量。
圖 19 ： 提供相較於二個先前描述之小鼠中CD137與PD-L1結合融合蛋白(SEQ ID NO: 147與SEQ ID NO: 148)，代表性融合蛋白(SEQ ID NOs: 90與87)之藥物動力學分析結果，如實施例 22 所述。雄性CD-1小鼠(每一時間點2隻小鼠)靜脈注射待測分子，劑量為2 mg/kg。在指定時間點，利用ELISA檢測藥物含量。數據以時間對照濃度繪圖。於此所述之SEQ ID NOs: 90與87，而非SEQ ID NO: 147或SEQ ID NO: 148，顯示良好的藥物動力學概況或類抗體藥物動力學。
無
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<210> 3
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 3
Figure 108127283-A0305-02-0123-5
Figure 108127283-A0305-02-0124-6
<210> 4
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 4
Figure 108127283-A0305-02-0124-7
Figure 108127283-A0305-02-0125-8
<210> 5
<211> 4
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Figure 108127283-A0305-02-0125-9
<210> 6
<211> 272
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Figure 108127283-A0305-02-0126-10
Figure 108127283-A0305-02-0127-11
<210> 7
<211> 232
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Figure 108127283-A0305-02-0127-12
Figure 108127283-A0305-02-0128-13
<210> 8
<211> 272
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 8
Figure 108127283-A0305-02-0128-14
Figure 108127283-A0305-02-0129-15
Figure 108127283-A0305-02-0130-17
<210> 9
<211> 231
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 9
Figure 108127283-A0305-02-0130-18
Figure 108127283-A0305-02-0131-19
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割位點
<400> 10
Figure 108127283-A0305-02-0131-20
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合胜肽
<400> 11
Figure 108127283-A0305-02-0132-21
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Step-Tag II胜肽
<400> 12
Figure 108127283-A0305-02-0132-22
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 13
Figure 108127283-A0305-02-0132-23
<210> 14
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 14
Figure 108127283-A0305-02-0132-24
<210> 15
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 15
Figure 108127283-A0305-02-0133-25
<210> 16
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 16
Figure 108127283-A0305-02-0133-26
<210> 17
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 17
Figure 108127283-A0305-02-0133-27
Figure 108127283-A0305-02-0134-28
<210> 18
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 18
Figure 108127283-A0305-02-0134-29
<210> 19
<211> 74
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 19
Figure 108127283-A0305-02-0134-30
Figure 108127283-A0305-02-0135-31
<210> 20
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 20
Figure 108127283-A0305-02-0135-32
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 21
Figure 108127283-A0305-02-0135-33
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 22
Figure 108127283-A0305-02-0136-34
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 23
Figure 108127283-A0305-02-0136-35
<210> 24
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Figure 108127283-A0305-02-0136-36
Figure 108127283-A0305-02-0137-37
Figure 108127283-A0305-02-0138-38
<210> 25
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 25
Figure 108127283-A0305-02-0138-39
Figure 108127283-A0305-02-0139-40
<210> 26
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體重鏈
<400> 26
Figure 108127283-A0305-02-0139-41
Figure 108127283-A0305-02-0140-42
Figure 108127283-A0305-02-0141-273
<210> 27
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體輕鏈
<400> 27
Figure 108127283-A0305-02-0142-44
Figure 108127283-A0305-02-0143-45
<210> 28
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體重鏈
<400> 28
Figure 108127283-A0305-02-0143-46
Figure 108127283-A0305-02-0144-47
Figure 108127283-A0305-02-0145-48
<210> 29
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體輕鏈
<400> 29
Figure 108127283-A0305-02-0146-49
Figure 108127283-A0305-02-0147-50
<210> 30
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體片段
<400> 30
Figure 108127283-A0305-02-0147-51
Figure 108127283-A0305-02-0148-52
<210> 31
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體片段
<400> 31
Figure 108127283-A0305-02-0148-53
Figure 108127283-A0305-02-0149-54
<210> 32
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體片段
<400> 32
Figure 108127283-A0305-02-0150-55
Figure 108127283-A0305-02-0151-56
<210> 33
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體片段
<400> 33
Figure 108127283-A0305-02-0151-57
Figure 108127283-A0305-02-0152-58
<210> 34
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 34
Figure 108127283-A0305-02-0152-59
Figure 108127283-A0305-02-0153-60
<210> 35
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 35
Figure 108127283-A0305-02-0153-61
Figure 108127283-A0305-02-0154-62
<210> 36
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 36
Figure 108127283-A0305-02-0154-63
Figure 108127283-A0305-02-0155-64
<210> 37
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 37
Figure 108127283-A0305-02-0155-65
Figure 108127283-A0305-02-0156-66
<210> 38
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 38
Figure 108127283-A0305-02-0156-67
Figure 108127283-A0305-02-0157-68
<210> 39
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 39
Figure 108127283-A0305-02-0157-69
Figure 108127283-A0305-02-0158-70
<210> 40
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 40
Figure 108127283-A0305-02-0158-71
Figure 108127283-A0305-02-0159-72
<210> 41
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 41
Figure 108127283-A0305-02-0159-73
Figure 108127283-A0305-02-0160-74
<210> 42
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 42
Figure 108127283-A0305-02-0161-75
<210> 43
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 43
Figure 108127283-A0305-02-0162-76
Figure 108127283-A0305-02-0163-77
<210> 44
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 44
Figure 108127283-A0305-02-0163-78
Figure 108127283-A0305-02-0164-79
<210> 45
<211> 175
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 45
Figure 108127283-A0305-02-0164-80
Figure 108127283-A0305-02-0165-81
<210> 46
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 46
Figure 108127283-A0305-02-0165-82
Figure 108127283-A0305-02-0166-83
<210> 47
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 47
Figure 108127283-A0305-02-0166-84
Figure 108127283-A0305-02-0167-85
<210> 48
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 48
Figure 108127283-A0305-02-0167-86
Figure 108127283-A0305-02-0168-87
<210> 49
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 49
Figure 108127283-A0305-02-0169-88
Figure 108127283-A0305-02-0170-89
<210> 50
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 50
Figure 108127283-A0305-02-0170-90
Figure 108127283-A0305-02-0171-91
<210> 51
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 51
Figure 108127283-A0305-02-0171-92
Figure 108127283-A0305-02-0172-93
<210> 52
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 52
Figure 108127283-A0305-02-0172-94
Figure 108127283-A0305-02-0173-95
<210> 53
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 53
Figure 108127283-A0305-02-0173-96
Figure 108127283-A0305-02-0174-97
<210> 54
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 54
Figure 108127283-A0305-02-0174-98
Figure 108127283-A0305-02-0175-99
<210> 55
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 55
Figure 108127283-A0305-02-0176-100
<210> 56
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 56
Figure 108127283-A0305-02-0177-101
Figure 108127283-A0305-02-0178-102
<210> 57
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 57
Figure 108127283-A0305-02-0178-103
Figure 108127283-A0305-02-0179-104
<210> 58
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 58
Figure 108127283-A0305-02-0179-105
Figure 108127283-A0305-02-0180-106
<210> 59
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 59
Figure 108127283-A0305-02-0180-107
Figure 108127283-A0305-02-0181-108
<210> 60
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體重鏈CDR1
<400> 60
Figure 108127283-A0305-02-0181-109
<210> 61
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體重鏈CDR2
<400> 61
Figure 108127283-A0305-02-0182-110
<210> 62
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體重鏈CDR3
<400> 62
Figure 108127283-A0305-02-0182-111
<210> 63
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體輕鏈CDR1
<400> 63
Figure 108127283-A0305-02-0182-112
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體輕鏈CDR3
<400> 64
Figure 108127283-A0305-02-0183-113
<210> 65
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體重鏈CDR1
<400> 65
Figure 108127283-A0305-02-0183-114
<210> 66
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體重鏈CDR2
<400> 66
Figure 108127283-A0305-02-0183-115
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體重鏈CDR3
<400> 67
Figure 108127283-A0305-02-0183-116
<210> 68
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體輕鏈CDR1
<400> 68
Figure 108127283-A0305-02-0184-117
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體輕鏈CDR3
<400> 69
Figure 108127283-A0305-02-0184-118
<210> 70
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體重鏈CDR1
<400> 70
Figure 108127283-A0305-02-0184-119
<210> 71
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體重鏈CDR2
<400> 71
Figure 108127283-A0305-02-0184-120
<210> 72
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體重鏈CDR3
<400> 72
Figure 108127283-A0305-02-0185-121
<210> 73
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體輕鏈CDR1
<400> 73
Figure 108127283-A0305-02-0185-122
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體輕鏈CDR3
<400> 74
Figure 108127283-A0305-02-0185-123
<210> 75
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體重鏈可變區
<400> 75
Figure 108127283-A0305-02-0186-124
<210> 76
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體重鏈可變區
<400> 76
Figure 108127283-A0305-02-0187-125
<210> 77
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體重鏈可變區
<400> 77
Figure 108127283-A0305-02-0187-126
Figure 108127283-A0305-02-0188-127
<210> 78
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體重鏈可變區
<400> 78
Figure 108127283-A0305-02-0188-128
Figure 108127283-A0305-02-0189-129
<210> 79
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體重鏈可變區
<400> 79
Figure 108127283-A0305-02-0189-130
Figure 108127283-A0305-02-0190-131
<210> 80
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體輕鏈可變區
<400> 80
Figure 108127283-A0305-02-0190-132
<210> 81
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體輕鏈可變區
<400> 81
Figure 108127283-A0305-02-0191-133
<210> 82
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體輕鏈可變區
<400> 82
Figure 108127283-A0305-02-0191-134
Figure 108127283-A0305-02-0192-135
<210> 83
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體輕鏈可變區
<400> 83
Figure 108127283-A0305-02-0192-136
Figure 108127283-A0305-02-0193-137
<210> 84
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體輕鏈可變區
<400> 84
Figure 108127283-A0305-02-0193-138
<210> 85
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體重鏈
<400> 85
Figure 108127283-A0305-02-0194-139
Figure 108127283-A0305-02-0195-140
Figure 108127283-A0305-02-0196-141
<210> 86
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體重鏈
<400> 86
Figure 108127283-A0305-02-0196-142
Figure 108127283-A0305-02-0197-143
Figure 108127283-A0305-02-0198-144
<210> 87
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體輕鏈
<400> 87
Figure 108127283-A0305-02-0199-145
Figure 108127283-A0305-02-0200-146
<210> 88
<211> 614
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 88
Figure 108127283-A0305-02-0200-147
Figure 108127283-A0305-02-0201-148
Figure 108127283-A0305-02-0202-149
Figure 108127283-A0305-02-0203-150
<210> 89
<211> 422
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 89
Figure 108127283-A0305-02-0203-151
Figure 108127283-A0305-02-0204-152
Figure 108127283-A0305-02-0205-153
<210> 90
<211> 639
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 90
Figure 108127283-A0305-02-0206-154
Figure 108127283-A0305-02-0207-155
Figure 108127283-A0305-02-0208-156
Figure 108127283-A0305-02-0209-157
<210> 91
<211> 407
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 91
Figure 108127283-A0305-02-0209-158
Figure 108127283-A0305-02-0210-159
Figure 108127283-A0305-02-0211-160
<210> 92
<211> 639
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 92
Figure 108127283-A0305-02-0211-161
Figure 108127283-A0305-02-0212-162
Figure 108127283-A0305-02-0213-163
Figure 108127283-A0305-02-0214-164
<210> 93
<211> 407
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 93
Figure 108127283-A0305-02-0215-165
Figure 108127283-A0305-02-0216-166
Figure 108127283-A0305-02-0217-167
<210> 94
<211> 832
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 94
Figure 108127283-A0305-02-0217-168
Figure 108127283-A0305-02-0218-169
Figure 108127283-A0305-02-0219-170
Figure 108127283-A0305-02-0220-171
Figure 108127283-A0305-02-0221-172
<210> 95
<211> 474
<212> DNA
<213> 智人
<400> 95
Figure 108127283-A0305-02-0221-173
Figure 108127283-A0305-02-0222-174
<210> 96
<211> 534
<212> DNA
<213> 智人
<400> 96
Figure 108127283-A0305-02-0222-178
<210> 97
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 97
Figure 108127283-A0305-02-0222-177
Figure 108127283-A0305-02-0223-179
<210> 98
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 98
Figure 108127283-A0305-02-0223-180
<210> 99
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 99
Figure 108127283-A0305-02-0223-181
Figure 108127283-A0305-02-0224-182
<210> 100
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 100
Figure 108127283-A0305-02-0224-184
<210> 101
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 101
Figure 108127283-A0305-02-0224-185
Figure 108127283-A0305-02-0225-186
<210> 102
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 102
Figure 108127283-A0305-02-0225-187
<210> 103
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 103
Figure 108127283-A0305-02-0225-189
Figure 108127283-A0305-02-0226-190
<210> 104
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 104
Figure 108127283-A0305-02-0226-191
<210> 105
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 105
Figure 108127283-A0305-02-0227-193
<210> 106
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 106
Figure 108127283-A0305-02-0227-194
<210> 107
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 107
Figure 108127283-A0305-02-0228-195
<210> 108
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 108
Figure 108127283-A0305-02-0228-196
<210> 109
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 109
Figure 108127283-A0305-02-0229-197
<210> 110
<211> 525
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 110
Figure 108127283-A0305-02-0229-198
Figure 108127283-A0305-02-0230-199
<210> 111
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 111
Figure 108127283-A0305-02-0230-200
<210> 112
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 112
Figure 108127283-A0305-02-0230-201
Figure 108127283-A0305-02-0231-202
<210> 113
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 113
Figure 108127283-A0305-02-0231-204
<210> 114
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 114
Figure 108127283-A0305-02-0232-206
<210> 115
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 115
Figure 108127283-A0305-02-0232-207
<210> 116
<211> 535
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 116
Figure 108127283-A0305-02-0233-208
<210> 117
<211> 535
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 117
Figure 108127283-A0305-02-0233-209
Figure 108127283-A0305-02-0234-210
<210> 118
<211> 535
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 118
Figure 108127283-A0305-02-0234-211
<210> 119
<211> 535
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 119
Figure 108127283-A0305-02-0234-212
Figure 108127283-A0305-02-0235-213
<210> 120
<211> 535
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 120
Figure 108127283-A0305-02-0235-215
<210> 121
<211> 535
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 121
Figure 108127283-A0305-02-0235-216
Figure 108127283-A0305-02-0236-217
<210> 122
<211> 535
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 122
Figure 108127283-A0305-02-0236-219
<210> 123
<211> 535
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 123
Figure 108127283-A0305-02-0237-221
<210> 124
<211> 535
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂質運載蛋白突變蛋白
<400> 124
Figure 108127283-A0305-02-0237-222
<210> 125
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體重鏈可變區
<400> 125
Figure 108127283-A0305-02-0238-224
<210> 126
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體重鏈可變區
<400> 126
Figure 108127283-A0305-02-0238-225
<210> 127
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體重鏈可變區
<400> 127
Figure 108127283-A0305-02-0239-227
<210> 128
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體重鏈可變區
<400> 128
Figure 108127283-A0305-02-0239-228
<210> 129
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體重鏈可變區
<400> 129
Figure 108127283-A0305-02-0239-230
Figure 108127283-A0305-02-0240-232
<210> 130
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體輕鏈可變區
<400> 130
Figure 108127283-A0305-02-0240-233
<210> 131
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體輕鏈可變區
<400> 131
Figure 108127283-A0305-02-0240-234
Figure 108127283-A0305-02-0241-235
<210> 132
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體輕鏈可變區
<400> 132
Figure 108127283-A0305-02-0241-236
<210> 133
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體輕鏈可變區
<400> 133
Figure 108127283-A0305-02-0241-237
<210> 134
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體輕鏈可變區
<400> 134
Figure 108127283-A0305-02-0242-238
<210> 135
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體重鏈
<400> 135
Figure 108127283-A0305-02-0242-239
Figure 108127283-A0305-02-0243-240
<210> 136
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體重鏈
<400> 136
Figure 108127283-A0305-02-0243-241
Figure 108127283-A0305-02-0244-242
<210> 137
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體輕鏈
<400> 137
Figure 108127283-A0305-02-0244-243
Figure 108127283-A0305-02-0245-244
<210> 138
<211> 1842
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 138
Figure 108127283-A0305-02-0245-245
Figure 108127283-A0305-02-0246-246
<210> 139
<211> 1266
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 139
Figure 108127283-A0305-02-0246-247
Figure 108127283-A0305-02-0247-248
<210> 140
<211> 1917
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 140
Figure 108127283-A0305-02-0248-249
Figure 108127283-A0305-02-0249-250
<210> 141
<211> 1221
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 141
Figure 108127283-A0305-02-0249-252
Figure 108127283-A0305-02-0250-253
<210> 142
<211> 1917
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 142
Figure 108127283-A0305-02-0250-256
Figure 108127283-A0305-02-0251-255
<210> 143
<211> 1221
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 143
Figure 108127283-A0305-02-0252-257
<210> 144
<211> 2496
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 144
Figure 108127283-A0305-02-0253-258
Figure 108127283-A0305-02-0254-259
<210> 145
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體重鏈
<400> 145
Figure 108127283-A0305-02-0254-260
Figure 108127283-A0305-02-0255-261
Figure 108127283-A0305-02-0256-262
Figure 108127283-A0305-02-0257-263
<210> 146
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗體輕鏈
<400> 146
Figure 108127283-A0305-02-0257-264
Figure 108127283-A0305-02-0258-265
<210> 147
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 147
Figure 108127283-A0305-02-0258-266
Figure 108127283-A0305-02-0259-267
Figure 108127283-A0305-02-0260-268
Figure 108127283-A0305-02-0261-269
<210> 148
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 148
Figure 108127283-A0305-02-0261-270
Figure 108127283-A0305-02-0262-271
Figure 108127283-A0305-02-0263-272

Claims (59)

  1. 一種能結合CD137與PD-L1兩者的融合蛋白，其中該融合蛋白包含至少二個次單元，其中該第一次單元包含PD-L1特異性全長免疫球蛋白，且其中該第二次單元包含CD137特異性脂質運載蛋白突變蛋白，其中該融合蛋白包含胺基酸序列具有至少90%序列等同於SEQ ID NOs：90與87所示之胺基酸序列，其中該免疫球蛋白之重鏈包含下組CDR序列：HCDR1具有如SEQ ID NO：60所示之GFSLSNYD序列；HCDR2具有如SEQ ID NO：61所示之IWTGGAT序列，以及HCDR3具有如SEQ ID NO：62所示之VRDSNYRYDEPFTY序列；以及該免疫球蛋白之輕鏈包含下組CDR序列：LCDR1具有如SEQ ID NO：63所示之QSIGTN序列，LCDR2具有YAS序列，以及LCDR3具有如SEQ ID NO：64所示之QQSNSWPYT序列，其中該脂質運載蛋白突變蛋白之胺基酸序列與該成熟hNGAL之如SEQ ID NO：2所示之線性多胜肽序列相較，包含下列各組經突變之胺基酸殘基：Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Arg；Gln 49→Ile；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Met；Leu 70→Lys；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Met；Trp 79→Asp；Arg 81→Trp；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；以及Lys 134→Tyr。
  2. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白能以KD值至多2nM，或等於或低於僅包含在該第一次單元之免疫球蛋白或其抗原結合結構域的KD值結合PD-L1。
  3. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白能以KD值至多7nM，或等於或低於僅包含在該第二次單元之CD137特異性脂質運載蛋白突變蛋白的KD值結合CD137。
  4. 如請求項2或3之融合蛋白，其中該KD值係利用表面電漿共振(SPR)試驗測定。
  5. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白能以EC50值至多0.5nM，或等於或低於僅包含在該第一次單元之免疫球蛋白或其抗原結合結構域的EC50值結合PD-L1。
  6. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白能以EC50值至多0.6nM，或等於或低於僅包含在該第二次單元之CD137特異性脂質運載蛋白突變蛋白的EC50值結合CD137。
  7. 如請求項5至6中任一項之融合蛋白，其中該EC50值係利用酵素免疫吸附分析法(ELISA)測定。
  8. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白與食蟹猴PD-L1交叉反應。
  9. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白與食蟹猴CD137交叉反應。
  10. 如請求項1之融合蛋白，其中當該融合蛋白在ELISA試驗中測定時，該融合蛋白能以EC50值至多10nM同時結合CD137與PD-L1。
  11. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白能以EC50值至多60nM結合表現在細胞上的CD137。
  12. 如請求項1項之融合蛋白，其中當該融合蛋白在流式細胞儀分析中測定時，該融合蛋白能以EC50值至多10nM結合表現在細胞上的PD-L1。
  13. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白能結合表現PD-L1的腫瘤細胞。
  14. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白能在CD137配體存在下結合CD137。
  15. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白能與PD-1競爭結合至PD-L1。
  16. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白能與SEQ ID NOs：28與29所示之抗體競爭結合至CD137。
  17. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白具有與SEQ ID NOs：28與29所示之抗體重疊的CD137結合表位。
  18. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白能刺激T細胞增生及/或反應。
  19. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白能刺激CD4+及/或CD8+ T細胞增生。
  20. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白能誘導IL-2及/或IFN-γ之分泌增加。
  21. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白能誘導細胞毒性因子之分泌增加。
  22. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白能以PD-L1依賴性方式共同刺激T細胞反應。
  23. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白能在腫瘤微環境中共同刺激T細胞反應。
  24. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白能阻斷PD-1的抑制信號。
  25. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白具有類抗體的藥物動力學概況。
  26. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白具有比SEQ ID NO：147或SEQ ID NO：148更有利的藥物動力學概況。
  27. 如請求項1之融合蛋白，其中該脂質運載蛋白突變蛋白之胺基酸序列具有至少90%序列等同於SEQ ID NOs：42之胺基酸序列。
  28. 如請求項1之融合蛋白，其中該脂質運載蛋白突變蛋白之胺基酸序列具有至少95%序列等同於SEQ ID NOs：42之胺基酸序列。
  29. 如請求項1之融合蛋白，其中該脂質運載蛋白突變蛋白之胺基酸序列包含SEQ ID NOs：42之胺基酸序列。
  30. 如請求項1之融合蛋白，其中次單元經由連接子連接至另一次單元。
  31. 如請求項1之融合蛋白，其中該第二次單元之N端經由連接子連接至該第一次單元之各重鏈恆定區(CH)之C端。
  32. 如請求項30之融合蛋白，其中該連接子為非結構之如SEQ ID NO：13所示之(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3連接子。
  33. 如請求項30之融合蛋白，其中該連接子為非結構之甘胺酸-絲胺酸連接子、多脯胺酸連接子、脯胺酸-丙胺酸-絲胺酸聚合物、或選自於由SEQ ID NOs：13-23所組成群組之連接子。
  34. 如請求項1之融合蛋白，其中該免疫球蛋白包含重鏈可變區與輕鏈可變區，包含如SEQ ID NOs：77與82所示之胺基酸序列。
  35. 如請求項1之融合蛋白，其中該免疫球蛋白包含重鏈與輕鏈，包含如SEQ ID NOs：86與87所示之胺基酸序列。
  36. 如請求項1之融合蛋白，其中該免疫球蛋白具有IgG4主鏈。
  37. 如請求項36之融合蛋白，其中該IgG4主鏈具有下列突變之一或多者：S228P、N297A、F234A、L235A、M428L、N434S、M252Y、S254T、及T256E。
  38. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白包含具有至少92%、至少95%、至少97%、至少98%或更高序列之胺基酸序列等同於SEQ ID NOs：90與87所示之胺基酸序列。
  39. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白包含SEQ ID NOs：90與87所示之胺基酸序列。
  40. 一種核酸分子，其包含一編碼請求項1至39中任一項之融合蛋白的核苷酸序列。
  41. 如請求項40之核酸分子，其中該核酸分子以可操作方式連接至調節序列，以容許該核酸分子之表現。
  42. 如請求項40之核酸分子，其中該核酸分子包含於載體或噬菌體質體載體中。
  43. 一種宿主細胞，其含有如請求項40至42中任一項之核酸分子。
  44. 一種依據請求項1至39中任一項產生融合蛋白之方法，其中該融合蛋白從編碼該融合蛋白之核酸開始產生。
  45. 如請求項44之方法，其中該融合蛋白在細菌或真核宿主生物體中產生，並從此宿主生物體或其培養物中分離出來。
  46. 一種請求項1至39中任一項之融合蛋白或包含此類融合蛋白之組合物的用途，用於製造醫藥組合物以同時活化下游CD137之傳訊途徑及結合PD-L1陽性腫瘤細胞。
  47. 一種請求項1至39中任一項之融合蛋白或包含此類融合蛋白之組合物的用途，用於製造醫藥組合物以同時共同刺激T細胞及結合PD-L1陽性腫瘤細胞。
  48. 一種請求項1至39中任一項之融合蛋白或包含此類融合蛋白之組合物的用途，用於製造醫藥組合物以同時誘導淋巴球活性及結合PD-L1陽性腫瘤細胞。
  49. 一種請求項1至39中任一項之融合蛋白或包含此類融合蛋白之組合物的用途，用於製造醫藥組合物以誘導CD137聚集與活化T細胞及引導該T細胞至PD-L1陽性腫瘤細胞。
  50. 一種請求項1至39中任一項之融合蛋白或包含此類融合蛋白之組合物的用途，用於製造醫藥組合物以在PD-L1陽性腫瘤細胞附近誘導局部淋巴球反應。
  51. 一種請求項1至39中任一項之融合蛋白或包含此類融合蛋白之組合物的用途，用於製造醫藥組合物以在PD-L1陽性腫瘤細胞附近誘導T細胞分泌IL-2及/或細胞毒性因子增加。
  52. 如請求項51之用途，其中該細胞毒性因子係選自於由穿孔素、顆粒酶B、及顆粒酶A組成之群組。
  53. 一種請求項1至39中任一項之融合蛋白或包含此類融合蛋白之組合物的用途，用於製造醫藥組合物以在PD-L1陽性腫瘤細胞附近誘導T細胞分泌細胞毒性因子增加。
  54. 一種醫藥組合物，其包含一或多個如請求項1至39中任一項之融合蛋白。
  55. 一種請求項1至39中任一項之融合蛋白或包含此類融合蛋白之組合物的用途，用於製造醫藥組合物以預防、改善、或治療PD-L1陽性癌症的方法。
  56. 如請求項1至39中任一項之融合蛋白以用於治療。
  57. 如請求項56所使用之融合蛋白，其中該用途為治療癌症。
  58. 一種如請求項1至39中任一項之融合蛋白之用途，以製造藥劑。
  59. 如請求項58之用途，其中該藥劑係用於治療癌症。
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期刊 A. Richter, E. Eggenstein, and A. Skerra, "Anticalins: exploiting a non-Ig scaffold with hypervariable loops for the engineering of binding proteins", FEBS Letters, Vol.588, Issue 2, 無, 12 November 2013, Pages 213-218 *
期刊 Christine Rothe and Arne Skerra, "Anticalin® Proteins as Therapeutic Agents in Human Diseasese", BioDrugs, Vol.32, No.3, 無, 10 May 2018, Pages 233-243; *

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