CN107082812A - 一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种恢复衰竭免疫细胞功能的融合蛋白，所述融合蛋白包含识别衰竭免疫细胞的功能区和激活扩增衰竭免疫细胞的功能区，两个功能区通过一定长度的非功能性氨基酸片段连接。识别功能区是利用免疫检查点特异性抗体识别衰竭性免疫细胞的表型受体；激活扩增功能区采用细胞因子或功能类似突变体、或者表面受体的配体或功能类似突变体、或者激活性抗体来激活衰竭性免疫细胞；其还涉及该融合蛋白的应用。试验表明，本发明制备的融合蛋白既能识别衰竭性免疫细胞，又能激活扩增识别的免疫细胞，恢复免疫细胞杀伤抗原阳性细胞的功能，其可增强抑制肿瘤生长和控制病毒感染的功能，具有很好的临床前景和广泛的应用范围。

Description

一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及融合蛋白技术领域，尤其涉及一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白及其应用。
背景技术
癌症是常见且威胁人们生命和生活质量的最为严重疾病，由病毒感染而引起的慢性疾病更是困扰世界的难题。当前针对癌症的临床应用药物存在着各种不足，例如化疗药物副作用大，靶向药物容易产生耐药性(Curr Pharm Des.2010，16:3-10)，免疫检查点抑制剂有效率低(N Engl J Med 2012，366:2443-2454)，嵌合抗原受体T(Car-T)细胞疗法又有细胞因子风暴和复发率高的缺点(Curr Opin Pediatr.2017，29:27-33)。中国HBV(乙肝病毒)感染的人群达上亿人(APJCP,2011，12:1405-1408)，长期的病毒感染还会导致肝硬化、AIDS、子宫颈癌、肝癌等更为严重的疾病(PNAS 2012，109:1802-1829)，而市场上还缺乏治疗由HBV病毒引起疾病的有效药物(Clinical Science 2013，124:77-85)。因此，发现高效低毒新型治疗癌症与慢性病毒感染的药物，减少死亡率，提高患者的生活质量，是我国乃至世界医疗卫生领域最为迫切的课题和需求。
肿瘤的发生是由于机体细胞分裂过程中发生基因突变，突变细胞的生长失去调节控制的结果。如果肿瘤细胞不能在短期内被清除，会逐渐造成肿瘤抗原特异性T细胞的功能性衰竭(Nature Medicine 1999，5:677-685)，形成对肿瘤的耐受，免疫系统对肿瘤细胞不再敏感，造成肿瘤进一步的生长和扩散，形成癌症(PNAS.2002，99:12293-7)。由病毒感染导致的慢性疾病的发生也是抗原特异性细胞衰竭的结果(Trends Immunol.2014，35:51-60；Blood 2007，109:4671-4678；Cell Death and Disease 2015，6:e1694)。研究表明，大部分肿瘤侵润性淋巴细胞(TIL)和抗病毒特异性T细胞都表达免疫抑制性受体(PNAS 2010，107:7875-7880；JI 2007，178:2714-2720)，处于衰竭状态，丧失了特异性识别与杀伤抗原阳性靶细胞的功能。衰竭性T细胞丧失分泌细胞因子的能力，如伽马干扰素(IFN-γ)等(Blood2013，121:1367-1376；J.Biomed.Biotechnol.2011，451694)。即使机体内存在大量的特异性T细胞，衰竭的免疫细胞也不能清除抗原阳性靶细胞(J Immunol 2005；175:6169-6176)。在表型上，衰竭性T细胞普遍高表达免疫抑制检查点受体，例如程序性死亡受体(PD-1)，程序性死亡配体(PD-L)，T细胞免疫球蛋白3(Tim-3)，细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)和淋巴细胞活化基因3(Lag-3)等(Nat Immunol.2011；12:492-9)。这些信号通路的激活会抑制T细胞的扩增，降低效应T细胞的功能，促进T细胞的凋亡，引起免疫耐受(J Clin Invest.2011，121:2350-2360)。所以，激活这一类抗原特异性的免疫细胞群体，让他们重新恢复杀灭抗原阳性靶细胞的功能，才能清除肿瘤或病毒感染细胞(Trends Immunol.2015；36:265-276)，最终达到治愈的目的。
抗体可以特异性地识别靶细胞表面的蛋白抗原，检查点抑制性抗体可以阻抑衰竭性细胞表面的免疫抑制性信号，例如通过PD-1抗体Pembrolizumab和Nivolumab与PD-1的结合防止抑制性信号的传导与激活，恢复衰竭性免疫细胞的功能，已经在临床上产生治疗癌症的临床效果，尤其是在部分患者上获得了肿瘤完全消失(N Engl J Med 2012，366:2455-2465；N Engl J Med 2012，366:2443-2454)。但是，对缺乏效应细胞的患者临床效果不理想(NATURE 2014，515:568-571)，而且这种T细胞的恢复持续时间短(Science 2016，354:1160-1165)，患者体内的特异性免疫细胞又会很快回到衰竭状态(Science 2016，354:1165-1169)。同时，只是阻断T细胞抑制信号不会导致免疫细胞数量的增加，而缺乏T效应细胞的患者基本又不会产生临床效果(Nature 2014，515:568-571)，限制其临床的治疗效果。
利用白细胞生长因子的临床应用治疗肿瘤具有一定的效果和不同程度的副作用(Semin Oncol.2015，42:539–548)。白介素2(IL-2)的临床应用是第一个癌症治疗的免疫疗法，能彻底清除肿瘤细胞，在部分癌症患者达到完全治愈的效果(Cancer 2008，113:293–301；JCO 2005，23:133-141)。但是，细胞因子对所有表达其受体的细胞都会产生激活作用，从而可能激活非目的性细胞，临床应用会产生一系列毒副作用，限制它的临床应用(JI2014，192:5451-5458)，所以目前IL-2的临床应用范围和疗效有非常大的局限性(Immunity2013，38:13-25)。利用激活性4-1BB抗体(Oncology 2010，37:508-516)和ox-40抗体(Cancer Science 2008 99:361-367)激活患者的免疫系统同样也会产生副作用。同样，利用激活性配体4-1BBL和OX-40L也会激活T细胞，但这些作用都不能针对衰竭的特异性细胞(J.Leukoc.Biol.21011，89:989–999)
截止目前，还没有一种既能针对性地识别衰竭的特异性T细胞，又能恢复其功能和扩增其数量的蛋白药物。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其既可识别衰竭性免疫细胞，又能扩增免疫细胞的数量，恢复免疫细胞的功能。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，包含识别衰竭性免疫细胞的功能区和激活扩增衰竭性免疫细胞的功能区，两个功能区通过一定长度的非功能性氨基酸片段连接，从而使两个功能区的蛋白折叠不存在相互干扰，保证融合蛋白的双功能特征。
为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：
优选地，所述识别衰竭性免疫细胞的功能区是利用免疫检查点特异性抗体识别衰竭性免疫细胞的表型受体，所述衰竭性免疫细胞的表型受体是具有共抑制性功能的免疫检查点。
优选地，所述衰竭性免疫细胞的表型受体包括(但不限于)PD-1、PD-L1、TIM-3、CTLA-4、LAG-3，此类受体基因在免疫细胞表面的过度表达，导致免疫细胞的衰竭和功能缺少。
优选地，所述PD-1的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示序列，所述PD-L1的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示序列，所述TIM-3的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示序列，所述CTLA-4的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示序列，所述LAG-3的氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示序列。
优选地，所述表型受体的特异性抗体包括(但不限于)PD-1抗体、CTLA-4抗体、PD-L1抗体、TIM-3抗体、LAG-3抗体，通过抗体与受体的结合，一方面阻断受体与其配体的结合与信号传达，防止肿瘤组织或肿瘤微环境中检查点配体对免疫系统产生抑制作用，同时将融合蛋白的活化功能部分携带到靶细胞表面，使激活功能区更容易发生效应，防止脱靶效应产生的副作用。
优选地，所述PD-1抗体的氨基酸序列包括SEQ ID NO：6～9所示序列，所述CTLA-4抗体的氨基酸序列包括SEQ ID NO：10～11所示序列，所述PD-L1抗体的氨基酸序列包括SEQID NO：12～13所示序列。
优选地，所述激活扩增衰竭性免疫细胞的功能区用于激活衰竭性免疫细胞，其采用细胞因子或功能类似突变体、或者表型受体的配体或功能类似突变体、或者激活性抗体。
优选地，所述细胞因子或功能类似突变体包括(但不限于)IL-2、IL-15、IL-21；其受体主要表达在T细胞和NK细胞表面。细胞因子功能类似突变体是指在不改变其基本功能的前提下，通过氨基酸序列突变或只是利用功能区多肽，增加其对目的细胞的激活反应，减少其对非目的细胞的作用。例如，通过IL-2上氨基酸序列的改变，突变体可能降低与T调节性细胞的激活，减少对非靶细胞及器官的作用，从而减少临床应用的副作用。
优选地，所述表型受体的配体或功能类似突变体包括(但不限于)4-1BBL、OX-40L。免疫细胞表面的激活性受体可以与相应的配体结合，通过激活与信号传递，达到激活与扩增靶细胞的目的；其功能类似突变体可能通过氨基酸序列突变或只是包含功能区部分，目的是改变与受体的亲和力或者部分功能。
优选地，所述激活性抗体包括针对4-1BB的抗体、XO-40L的抗体、CD28的抗体、CD3的抗体、CD27的抗体。通过与激活性受体上激活位点的结合，激活性抗体可以达到类似于配体的功能，刺激靶细胞上的激活信号，达到扩增靶细胞的目的。
优选地，所述IL-2的氨基酸序列为SEQ ID NO：14所示序列，所述IL-15的氨基酸序列为SEQ ID NO：15所示序列，所述IL-21的氨基酸序列为SEQ ID NO：16所示序列。
优选地，所述4-1BBL的氨基酸序列为SEQ ID NO：17所示序列，所述OX-40L的氨基酸序列为SEQ ID NO：18所示序列。
优选地，所述4-1BB的抗体的氨基酸序列包括SEQ ID NO：19～20所示序列，所述XO-40L的抗体的氨基酸序列包括SEQ ID NO：21～22所示序列。
优选地，识别衰竭性免疫细胞的功能区是利用PD-1抗体识别衰竭性免疫细胞的表型受体PD-1，激活扩增衰竭性免疫细胞的功能区采用IL-2来激活衰竭性免疫细胞。
优选地，一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白的制备步骤如下：
步骤1)由人PD-1抗体重链的C端和白介素2的N端氨基酸序列通过非功能氨基酸连接，组成融合蛋白重链构造基因；
步骤2)将步骤1)所述的融合蛋白构造基因和合成的PD-1抗体的轻链基因共转入表达载体，并转染至仓鼠卵巢细胞；
步骤3)将步骤2)所述的仓鼠卵巢细胞放置在孵箱中培养一段时间，取上清液，纯化后制得重组融合蛋白。
优选地，所述人PD-1抗体重链为SEQ ID NO：6所示序列，所述合成的PD-1抗体的轻链为SEQ ID NO：7所示序列，所述白介素2为SEQ ID NO：14所示序列，所述非功能氨基酸的氨基酸序列为SGGGGSGGGGSGGGGSG，所述融合蛋白重链构造基因为SEQ ID NO：23所示序列，所述表达载体为真核动物表达载体pcDNA3.1。
优选地，所述衰竭性免疫细胞为衰竭的特异性T细胞、衰竭的NK细胞中的至少一种。
本发明还提供一种上述恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白的的应用，该融合蛋白的医药用途用于非诊断或非治疗目的。
优选地，所述应用为融合蛋白的单独应用或为融合蛋白与化疗、靶向药物、抗体药物、细胞治疗组成的联合应用，以用于制备治疗因免疫细胞衰竭而引起的疾病的药物。
优选地，所述疾病包括癌症和慢性病毒感染疾病。
优选地，所述癌症包括肾细胞癌、黑色素瘤、淋巴瘤、结直肠癌，肝癌、软巢癌、头颈部鳞癌、膀胱癌、肺癌；所述慢性病毒感染疾病中的病毒包括HIV、HBV、HCV、EBV，HPV、CMV。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述的融合蛋白能够满足患者免疫恢复的需要，该重组融合蛋白既能识别衰竭的免疫细胞，又能扩增其数量，恢复其功能；且其临床应用可以增强抑制肿瘤生长和控制病毒感染的功能，具有很好的临床前景和广泛的应用范围。
附图说明
图1为本发明一实施例中制备的重组融合蛋白的凝胶电泳分析图：A带为还原状态下的蛋白，B带为原始状态下的蛋白，MK为蛋白标准分子量标记。
图2为本发明一实施例中制备的重组融合蛋白人PBMC体外试验CD8+T细胞的比例的示意图：其中融合蛋白组为图2的第1部分，PD-1抗体组为图2的第2部分，白介素2组为图2的第3部分。
图3为本发明一实施例中制备的重组融合蛋白人PBMC体外试验PD-1+细胞在CD8+T细胞中的比例的示意图：其中融合蛋白组为图3的第1部分，PD-1抗体组为图3的第2部分，白介素2组为图3的第3部分。
图4为本发明一实施例中的重组融合蛋白小鼠体内试验CD8+T细胞和NK细胞在外周血淋巴细胞中的比例的示意图：其中融合蛋白组为图4的第3部分，白介素2组为图4的第2部分，PBS对照组为图4的第1部分。
具体实施方式
本发明提供了一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，包含识别衰竭性免疫细胞的功能区和激活扩增衰竭性免疫细胞的功能区，两个功能区通过一定长度的非功能性氨基酸片段连接；本发明还提供了上述融合蛋白在制备治疗因免疫细胞衰竭而引起的疾病的药物中的应用。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例为重组融合蛋白的基因构建和生产纯化。
根据人PD-1抗体重链(SEQ ID NO：6)C端和白介素2(SEQ ID NO：14)的N端氨基酸序列，通过基因合成，酶切和进一步克隆，将两部分通过17个非功能氨基酸(SGGGGSGGGGSGGGGSG)连接，组成融合蛋白重链构造基因(SEQ ID NO：23)，然后转入真核动物表达载体pcDNA3.1。通过基因合成，酶切和进一步克隆，将PD-1抗体的轻链(SEQ ID NO：7)基因转入真核动物表达载体pcDNA3.1。最后将融合蛋白的重链表达载体和轻链表达载体同时转染到中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中。转染的细胞置于37℃、5％CO2孵箱中培养，72小时后取上清液，进一步通过ProteinA亲和层析纯化，最后纯化的蛋白为双功能重组融合蛋白。同时，根据PD-1抗体序列(SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7)和白介素2序列(SEQ ID NO：14)用上述方法制作做非融合蛋白，作为试验的对照。纯化的蛋白经过电泳检测确认分子量(图1)，证明依据本发明设计的重组融合蛋白可以通过CHO细胞生产。最后用分光光度计测试蛋白浓度，稀释在PBS中，用作进一步体内外的活性测试及功能研究。
实施例2
本实施例为双功能重组融合蛋白对人PBMC细胞体外培养的活性及功能测定。
人外周血经利用淋巴细胞密度梯度离心法(Ficoll)分离纯化，在24孔板中用X-Vivo15培养基中稀释细胞密度到5×106/ml，加入试验蛋白至最终浓度为2μg/ml。37℃孵育30分钟，离心后更换X-Vivo15培养基，至最终细胞密度为5x105/ml。然后置于37℃、5％CO2孵箱中培养72小时后取出，细胞收集后用CD8和PD-1抗体染色，用流式细胞仪进行表型测定和数据分析。图2中显示，与未融合的PD-1抗体(图2的第2部分)和白介素2(图2的第3部分)相比，融合蛋白处理(图2的第1部分)能显著增加培养细胞中CD8+细胞的比例(58.8％，52.9％，51.4％)。同时，如图3显示，培养后融合蛋白处理组中PD-1+的细胞占CD8+T细胞的比例为3.16％(图3的第1部分)，而PD-1抗体处理组为1.53％(图3的第2部分)，白介素2处理组为1.31％(图3的第3部分)，所以，融合蛋白能显著加强CD8+T细胞中衰竭性细胞(PD-1+)的扩增。试验证明，依据本发明设计的重组融合蛋白不但能选择性地扩增CD8+的T细胞，还能定向性扩增衰竭性的CD8+PD-1+的细胞，达到融合蛋白的预期目的。
实施例3
本实施例为双功能重组融合蛋白对体内效应细胞的影响。
小黑鼠分别通过腹腔连续3天注射融合蛋白(4μg/只/天)或白介素2(40μg/只/天)或PBS(对照组)，第4天从尾部取外周血，用抗小鼠CD8和NK1.1流式抗体染色后检测，数据分析如图4。与对照组(图4的第1部分，4.0％)和白介素2组(图4的第2部分，15.3％)相比，重组融合蛋白显著增加了NK细胞在淋巴细胞中的比例(图4的第3部分，27.0％)。同时，在CD8+T细胞部分，与对照组(图4的第1部分，15.5％)相比，原生性白介素2没有增加CD8+细胞的比例(图4的第2部分，15.1％)，而融合蛋白处理的小鼠外周血中CD8+T细胞比例(图4的第3部分)达22.8％。体内试验证明，即使只有原生性IL-210％的剂量，本发明合成的融合蛋白免疫学效应可以远远超过原生性的非融合蛋白。
实施例4
本实施例为双功能重组融合蛋白在制备治疗因免疫细胞衰竭而引起的疾病的药物中的应用。上述双功能重组融合蛋白可单独应用或与化疗，靶向药物，抗体药物，细胞治疗组成联合应用，用于制备治疗因免疫细胞衰竭而引起的疾病的药物，例如治疗癌症药物和治疗慢性病毒感染的药物等。
由上述实施例可知，本发明所述的恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，既能识别衰竭性免疫细胞，又能激活扩增识别的免疫细胞，恢复免疫细胞杀伤抗原阳性细胞的功能。由于肿瘤的发生与扩散和慢性病毒感染是免疫细胞衰竭与免疫系统耐受的结果，而恢复衰竭性免疫细胞的功能可以增强机体抗肿瘤和抗慢性病毒感染的能力，因此，上述融合蛋白的临床应用可以增强抑制肿瘤生长和控制病毒感染的功能，具有很好的临床前景和广泛的应用范围。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
<110> 上海科医联创生物科技有限公司
<120> 一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白及其应用
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PD-1
<400> 1
Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu
1 5 10 15
Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser
20 25 30
Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser
35 40 45
Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro
50 55 60
Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp
65 70 75 80
Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr
85 90 95
Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser
100 105 110
Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg
115 120
<210> 2
<211> 142
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PD-L1
<400> 2
Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro Val Thr
1 5 10 15
Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys Ala Glu
20 25 30
Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys Thr Thr
35 40 45
Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr Phe Arg
65 70 75 80
Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile Pro Glu
85 90 95
Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His Leu Val Ile Leu
100 105 110
Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr Phe Ile Phe Arg
115 120 125
Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys Gly Ile
130 135 140
<210> 3
<211> 301
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TIM-3
<400> 3
Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln
20 25 30
Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu
35 40 45
Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly
50 55 60
Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser
65 70 75 80
Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile
100 105 110
Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val
115 120 125
Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Leu Gln Arg Asp Phe
130 135 140
Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala
145 150 155 160
Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile
165 170 175
Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu
180 185 190
Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Gly
195 200 205
Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile Phe
210 215 220
Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu Ile
225 230 235 240
Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala Glu
245 250 255
Gly Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val Tyr
260 265 270
Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg Gln
275 280 285
Gln Pro Ser Gln Pro Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro
290 295 300
<210> 4
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTLA-4
<400> 4
Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile
1 5 10 15
Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val
20 25 30
Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys
35 40 45
Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser
50 55 60
Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln
65 70 75 80
Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu
85 90 95
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile
100 105 110
Tyr Val Ile
115
<210> 5
<211> 326
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LAG-3
<400> 5
Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala
1 5 10 15
Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser
20 25 30
Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly
35 40 45
Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu
65 70 75 80
Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro
85 90 95
Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu
100 105 110
Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala
115 120 125
Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu
130 135 140
Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser
145 150 155 160
Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala
165 170 175
Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg
180 185 190
Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln
195 200 205
Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg
210 215 220
Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly Leu
225 230 235 240
Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Arg Val
245 250 255
Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val Gly Thr Arg Ser Phe Leu
260 265 270
Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val Thr
275 280 285
Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln Ala
290 295 300
Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His Leu Gln Glu Gln Gln Leu
305 310 315 320
Asn Ala Thr Val Thr Leu
325
<210> 6
<211> 440
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PD-1抗体
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
115 120 125
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
180 185 190
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
210 215 220
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
245 250 255
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
260 265 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
305 310 315 320
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
325 330 335
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
340 345 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
355 360 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
370 375 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
385 390 395 400
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
405 410 415
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
420 425 430
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 7
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PD-1抗体
<400> 7
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 8
<211> 447
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PD-1抗体
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 9
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PD-1抗体
<400> 9
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 10
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTLA-4抗体
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 11
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTLA-4抗体
<400> 11
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PD-L1抗体
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Asp Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Lys Ala His Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Pro His Phe Val Ser Gly Ser Pro Phe Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 13
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PD-L1抗体
<400> 13
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 14
<211> 133
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-2
<400> 14
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
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100 105 110
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Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 15
<211> 130
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-15
<400> 15
Met Val Leu Gly Thr Ile Asp Leu Cys Ser Cys Phe Ser Ala Gly Leu
1 5 10 15
Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys
20 25 30
Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr
35 40 45
Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe
50 55 60
Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile
65 70 75 80
His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser
85 90 95
Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu
100 105 110
Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val
115 120 125
Gln Met
130
<210> 16
<211> 153
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-21
<400> 16
Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met
1 5 10 15
Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln
20 25 30
Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln
35 40 45
Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro
50 55 60
Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln
65 70 75 80
Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile
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Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala
100 105 110
Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr
115 120 125
Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu
130 135 140
Gln Lys Val Ser Thr Leu Ser Phe Ile
145 150
<210> 17
<211> 254
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4-1BBL
<400> 17
Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro
1 5 10 15
Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe
35 40 45
Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser
50 55 60
Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
65 70 75 80
Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
85 90 95
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
100 105 110
Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu
115 120 125
Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe
130 135 140
Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala
165 170 175
Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala
180 185 190
Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala
195 200 205
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
210 215 220
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
225 230 235 240
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
245 250
<210> 18
<211> 133
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OX-40L
<400> 18
Met Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe
1 5 10 15
Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu
20 25 30
Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp
35 40 45
Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn
50 55 60
Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys
65 70 75 80
Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys
85 90 95
Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp
100 105 110
Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly
115 120 125
Glu Phe Cys Val Leu
130
<210> 19
<211> 460
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4-1BB抗体
<400> 19
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asp Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Asp Ile Lys Asn Asp Gly Ser Tyr Thr Asn Tyr Ala
65 70 75 80
Pro Ser Leu Thr Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Leu Thr Gly Thr Trp Gly Gln Gly Thr Met
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
130 135 140
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
145 150 155 160
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
165 170 175
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
180 185 190
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
195 200 205
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
210 215 220
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
225 230 235 240
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
245 250 255
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
260 265 270
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
275 280 285
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
290 295 300
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
305 310 315 320
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
325 330 335
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
340 345 350
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
355 360 365
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
370 375 380
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
385 390 395 400
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
405 410 415
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
420 425 430
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
435 440 445
Trp Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
450 455 460
<210> 20
<211> 235
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4-1BB抗体
<400> 20
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
20 25 30
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Asn Gln Lys Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
50 55 60
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Trp Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr
100 105 110
Asp Arg Asp Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
130 135 140
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
165 170 175
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
180 185 190
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
195 200 205
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
210 215 220
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 21
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> XO-40L抗体
<400> 21
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Thr Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Thr Val
35 40 45
Ser Ile Ile Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Leu Val Ala Pro Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> XO-40L抗体
<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 23
<211> 589
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 融合蛋白重链构造基因
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
115 120 125
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
180 185 190
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
210 215 220
Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
245 250 255
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
260 265 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
305 310 315 320
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
325 330 335
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
340 345 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
355 360 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
370 375 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
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Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
405 410 415
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
420 425 430
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys
450 455 460
Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile
465 470 475 480
Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu
485 490 495
Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu
500 505 510
Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu
515 520 525
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530 535 540
Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met
545 550 555 560
Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg
565 570 575
Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
580 585

Claims (17)

1.一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，包含识别衰竭性免疫细胞的功能区和激活扩增衰竭性免疫细胞的功能区，两个功能区通过一定长度的非功能性氨基酸片段连接。
2.根据权利要求1所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，所述识别衰竭性免疫细胞的功能区是利用免疫检查点特异性抗体识别衰竭性免疫细胞的表型受体，所述衰竭性免疫细胞的表型受体是具有共抑制性功能的免疫检查点。
3.根据权利要求2所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，所述衰竭性免疫细胞的表型受体包括PD-1、PD-L1、TIM-3、CTLA-4、LAG-3，所述表型受体的特异性抗体包括PD-1抗体、CTLA-4抗体、PD-L1抗体、TIM-3抗体、LAG-3抗体。
4.根据权利要求3所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，所述PD-1为SEQ ID NO：1所示序列，所述PD-L1为SEQ ID NO：2所示序列，所述TIM-3为SEQ IDNO：3所示序列，所述CTLA-4为SEQ ID NO：4所示序列，所述LAG-3为SEQ ID NO：5所示序列。
5.根据权利要求3所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，
所述PD-1抗体包括SEQ ID NO：6～9所示序列，所述CTLA-4抗体包括SEQ ID NO：10～11所示抗体，所述PD-L1抗体包括SEQ ID NO：12～13所示序列。
6.根据权利要求1所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，所述激活扩增衰竭性免疫细胞的功能区是采用细胞因子或功能类似突变体、或者表型受体的配体或功能类似突变体、或者激活性抗体来激活衰竭性免疫细胞。
7.根据权利要求6所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，所述细胞因子或功能类似突变体包括IL-2、IL-15、IL-21。
8.根据权利要求7所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，所述IL-2为SEQ ID NO：14所示序列，所述IL-15为SEQ ID NO：15所示序列；所述IL-21为SEQ IDNO：16所示序列。
9.根据权利要求6所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，所述表型受体的配体或功能类似突变体包括4-1BBL、OX-40L。
10.根据权利要求9所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，所述4-1BBL为SEQ ID NO：17所示序列；所述OX-40L为SEQ ID NO：18所示序列。
11.根据权利要求6所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，所述激活性抗体包括针对4-1BB的抗体、XO-40L的抗体、CD28的抗体、CD3的抗体、CD27的抗体。
12.根据权利要求11所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，所述4-1BB的抗体包括SEQ ID NO：19～20所示序列，所述XO-40L的抗体包括SEQ ID NO：21～22所示序列。
13.根据权利要求1所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，识别衰竭性免疫细胞的功能区利用PD-1抗体识别衰竭性免疫细胞的表型受体PD-1，激活扩增衰竭性免疫细胞的功能区采用IL-2来激活衰竭性免疫细胞。
14.根据权利要求13所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，根据如下步骤制备所述融合蛋白：
步骤1)由人PD-1抗体重链的C端和IL-2的N端氨基酸序列通过非功能氨基酸连接，组成融合蛋白重链构造基因；
步骤2)将步骤1)所述的融合蛋白重链构造基因和合成的PD-1抗体的轻链基因共转入表达载体，并转染至仓鼠卵巢细胞；
步骤3)将步骤2)所述的仓鼠卵巢细胞放置在孵箱中培养一段时间，取上清液，纯化后制得重组融合蛋白。
15.根据权利要求14所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，所述人PD-1抗体重链为SEQ ID NO：6所示序列；所述IL-2为SEQ ID NO：14所示序列；所述合成的PD-1抗体的轻链为SEQ ID NO：7所示序列；所述融合蛋白重链构造基因为SEQ ID NO：23所示序列；所述非功能氨基酸的氨基酸序列为SGGGGSGGGGSGGGGSG；所述表达载体为真核动物表达载体pcDNA3.1。
16.根据权利要求1所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其特征在于，所述衰竭性免疫细胞为衰竭的特异性T细胞、衰竭的NK细胞中的至少一种。
17.一种如权利要求1～12中任一项所述的恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白的应用。
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