CN114341197A - 新的融合蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的融合蛋白及其用途，并且更特别地，涉及与CD154特异性结合的融合蛋白，其包含：与CD154特异性结合的Fab或scFv，和Fc区，其中所述Fc区是变体Fc区，其被改变以便不与Fcγ受体结合。

Description

新的融合蛋白及其用途
技术领域
本发明涉及新的融合蛋白及其用途。特别地，本发明涉及可以用于治疗自身免疫性疾病的新的融合蛋白及其用途。
背景技术
自身免疫反应是将体内细胞识别为异物并通过各种免疫反应破坏其的现象。代表性的自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病、炎性肠病和多发性硬化，并且这些自身免疫性疾病由于病因不明而难以治疗。另外，自身免疫反应可能由于触发免疫应答的移植器官而发生。因此，需要开发各种免疫抑制剂，以抑制此类自身免疫性疾病或自身免疫反应。
常用的免疫抑制剂包括他克莫司(钙调磷酸酶抑制剂)、霉酚酸吗啉乙酯(基因合成抑制剂)和泼尼松(抗炎类固醇)。然而，由于这些免疫抑制剂应该长时间施用，因此它们可以引起严重的副作用(Kalluri和Hardinger，World J. Translant. 2(4): 51-68，2012；Tanabe等人，Translantation，93(7): 709-719，2012；Zaza等人，Toxins 6(3): 869-891，2014)。
相应地，正在开发各种生物药物，以替换常规免疫抑制剂或增加药物的持续时间，其中之一是共刺激抑制剂。代表性的共刺激免疫应答包括CD28-CD80/CD86、CTLA4-CD80/CD86、CD40-CD40L(CD154)和PD-1/PD-L1，并且CTLA4-Fc、抗CD40和抗CD154抗体等目前作为上述生物制品进行研究，以便抑制共刺激免疫应答(Kinnear等人，Transplantation 95(4): 527-535，2013；Riella等人，Am. J. Transplant. 12(10): 2575-2587，2012；Hardinger和Brennan，World J. Transplant. 3(4): 68-77，2013)。同时，CD40不仅在抗原呈递细胞如B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、胸腺上皮细胞中表达，而且还在正常细胞如上皮细胞和成纤维细胞中表达。CD154，也称为CD40L，主要在活化的T细胞和天然杀伤细胞中表达。CD40-CD154信号传导激活B细胞和巨噬细胞，并且间接激活T细胞，促进免疫应答(Karimi和Pour fathollah，Iran. J. Allergy Asthma Immunol. 11(1): 1-13，2012)。
因此，为了通过调控CD154的作用来抑制免疫应答，开发了抗CD154抗体，并且该抗体在包括猴的动物实验中显示了良好的效应。然而，作为人的临床试验的结果，抗CD154抗体显示出严重的血栓形成副作用，并且靶向CD154的抗体药物的开发目前暂停(Kalunian等人，Arthritis. Rheum. 46(12): 3251-3258，2002；Boumpas等人，Arthritis Rheum. 48(3): 719-727，2003；Pilat等人，Curr. Opin. Organ Translant. 17: 368-375，2012)。
另一方面，尽管IL-10基本上是免疫抑制剂，但已知它具有双重特性，其也具有免疫刺激活性的相反效应。在这方面，具体而言，IL-10刺激B细胞活化，延长B细胞的存活，并且可能促成B细胞的类别转换。它还可以刺激NK细胞增殖和细胞因子产生，并且可以充当促进CD8+ T细胞的特定亚群增殖的生长因子(Mosser & Yhang，Immunol. Rev. 226: 205-218，2009；Cai等人，Eur. J. Immunol. 29: 2658-2665，1999；Santin等人，J. Virol. 74:4729-4737，2000；Rowbottom等人，Immunol. 160: 3188-3193，1998)。重要的是，已报道在人中高剂量的IL-10 (分别为20和25 μg/kg)可以增加IFNγ的产生(Lauw等人，J. Immunol.，165: 2783-2789，2000；Tilg等人，Gut 50: 191-195，2002)。
如上所述的血栓形成的原因已知是由于抗CD154抗体和血小板表面上的FcγRII的结合(Shields等人，J. Biol. Chem. 276(9): 6591-6604，2001)。为此，新的抗CD154抗体已由本发明人开发，以维持与FcγRI和FcγRIII的结合，但阻断与FcγRII的结合，从而减少血栓形成的副作用(WO2016/182335A1)。
发明内容
技术问题
然而，该抗体作为药物具有局限性，因为它不能完全克服血栓形成的副作用。
本发明是为了解决包括上述问题的各种问题，并且本发明的目的是提供新的抗CD154融合蛋白，当在体内施用时，其能够通过有效阻断CD154的功能，同时去除血栓形成的可能性，显示出用于自身免疫性疾病的疗效。然而，本发明的范围并不限于此。
发明概述
在本发明的一个方面，提供了融合蛋白，其包含与人CD154特异性结合的Fab或scFv、以及免疫球蛋白的Fc区，其中所述Fc区是突变以便不与Fcγ受体结合的修饰的Fc区。
在本发明的另一个方面，提供了融合蛋白，其序贯地包含a)与CD154特异性结合的抗体的抗原结合片段或抗体类似物；b)修饰的Fc区，其已进行突变以便不与Fcγ受体结合；以及c) IL-10蛋白。
在本发明的另一个方面，提供了编码融合蛋白的多核苷酸。
在本发明的另一个方面，提供了包含多核苷酸的载体。
在本发明的另一个方面，提供了用于免疫抑制的药物组合物，其包含融合蛋白作为活性成分。
在本发明的另一个方面，提供了用于治疗自身免疫性疾病的药物组合物，其包含融合蛋白作为活性成分。
在本发明的另一个方面，提供了用于治疗患有自身免疫性疾病的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的融合蛋白。
发明效果
根据本发明的一个实施方案的融合蛋白是血栓形成的可能性极低的安全材料，并且可以用作免疫抑制剂和自身免疫性疾病治疗，所述血栓形成是现有技术的抗CD154抗体的缺点。
附图说明
图1是示意性地显示由本发明人开发的、WO2016/182335A1中所述的与CD154特异性结合的抗体(C10M)的结构的示意图解。
图2是显示在将野生型IgG1 Fc区应用于其的抗CD154抗体(左)和WO2016/182335A1中所述的用于抑制FcγRIIα结合的变体IgG1 Fc区应用于其的抗CD154嵌合抗体(C10M，右)施用于野生型小鼠和人FcγRIIα转基因小鼠后，所生成的血栓染色和计数分析结果的一系列照片。
图3是显示根据本发明的一个实施方案，与CD154特异性结合的融合蛋白(左：PG-400，和右：PG-410)的结构的示意图解。
图4A是显示在细胞中暂时表达根据本发明的一个实施方案的嵌合杂合抗体(PG-400-1)后，通过SDS-PAGE在纯化方法中分析蛋白质的结果的照片；图4B是显示使用抗IgG4Fc抗体分析嵌合杂合抗体(PG-400-1)的蛋白质印迹分析结果的照片；图4C是表示为测量最终纯化产物的纯度而执行的SEC-HPLC分析的色谱图；图4D是显示在从稳定的细胞系表达嵌合杂合抗体(PG-400-1)后，通过SDS-PAGE分析最终纯化蛋白质的结果的照片；并且图4E是显示执行SEC-HPLC分析以确认从稳定细胞系表达的最终蛋白质的纯度结果的色谱图。
图5是表示BLI分析结果的一系列图，所述BLI分析分别分析CD40L与WO2016/182335A1中所述的用于抑制FcγRIIα结合的变体IgG1 Fc区应用于其的抗CD154嵌合抗体(C10M，右)、以及实施例2中制备的嵌合杂合抗体(PG-400-1，左)的结合亲和力。
图6A是显示在HEK293细胞中表达根据本发明的一个实施方案的重组人源化抗CD154抗体(PG-400-2)后，对细胞培养溶液执行的还原型PAGE分析的结果的照片；并且图6B是显示在通过蛋白A亲和色谱和凝胶过滤纯化细胞培养基后，在还原(左)和非还原(右)条件下蛋白质的PAGE分析的照片；并且图6C是表示纯化的PG-400-2的HPLC分析的色谱图。
图7A是显示在HEK293细胞中表达根据本发明的一个实施方案的重组人源化抗CD154抗体(PG-410)后，对细胞培养溶液执行的还原型PAGE分析的结果的照片；图7B是表示在通过蛋白A亲和色谱和凝胶过滤纯化细胞培养基后，在还原(左)和非还原(右)条件下蛋白质的PAGE分析结果的照片；并且图7C是表示纯化的PG-410的HPLC分析的色谱图。
图8A是显示通过BLI分析来分析根据本发明的一个实施方案的重组人源化抗CD154抗体(PG-400-2)与CD154的结合程度的结果的传感图；图8B是显示通过BLI分析来分析根据本发明的一个实施方案的重组人源化抗CD154抗体(PG-410)与CD154的结合程度的结果的传感图。
图9A是显示用于调查通过根据本发明的一个实施方案的重组人源化抗CD154抗体(PG-410)的IL-10的免疫抑制活性的实验方案的示意图解；并且图9B是显示当分别用重组IL-10 (左)和根据本发明的一个实施方案的重组人源化抗CD154抗体(PG-410)处理巨噬细胞系Raw264时，测量TNFα表达的结果的图。
图10A是显示通过施用根据本发明的一个实施方案的重组人源化抗CD154抗体(PG-410)，用于确认GVHD治疗效应的动物实验方案的示意图；图10B是显示在对照组和PG-410施用组中，随着时间过去的体重变化的图；并且图10C是显示在施用PBMC的对照组和施用PG-410的实验组中，随着时间过去的存活率的图。
图11是显示在对照组(媒介物)和根据本发明的一个实施方案的重组人源化抗CD154抗体(PG-410)施用组中，测量随着时间过去的人CD45+细胞群体比率的结果的图。
图12是显示BLI分析结果的一系列传感图，所述BLI分析比较了根据本发明的一个实施方案的修饰的Fc区蛋白和利妥昔单抗(对照)与Fcγ受体I和IIIa的结合亲和力。
图13显示根据本发明的一个实施方案的修饰的Fc区蛋白和利妥昔单抗(对照)对于各种Fcγ受体的结合亲和力的比较分析结果；图13A是显示为了确认基线，在用PBS处理后的BLI分析结果的传感图；图13B是显示BLI分析结果的传感图，所述BLI分析比较了根据本发明的一个实施方案的修饰的Fc区蛋白和利妥昔单抗(对照)与Fcγ受体IIa的结合亲和力；图13C是显示BLI分析结果的传感图，所述BLI分析比较了根据本发明的一个实施方案的修饰的Fc区蛋白和利妥昔单抗(对照)与Fcγ受体IIb的结合亲和力；并且图13D是显示BLI分析结果的传感图，所述BLI分析比较了根据本发明的一个实施方案的修饰的Fc区蛋白和利妥昔单抗(对照)与Fcγ受体IIIb的结合亲和力。
具体实施方式
在本发明的一个方面，提供了融合蛋白，其包含与人CD154特异性结合的Fab或scFv、以及免疫球蛋白的Fc区，其中所述Fc区是突变以便不与Fcγ受体结合的修饰的Fc区。
在融合蛋白中，与CD154特异性结合的Fab可以由以下组成：由通过SEQ ID NO: 2表示的氨基酸组成的轻链(VL-CL)、以及由通过SEQ ID NO: 9表示的氨基酸组成的重链VH-CH1片段；或由通过SEQ ID NO: 4表示的氨基酸序列组成的轻链(VL-CL)、以及由通过SEQ IDNO: 11表示的氨基酸序列组成的重链VH-CH1片段。
在融合蛋白中，可以通过用接头肽连接轻链可变结构域(VL)和重链可变区(VH)来制备scFv，所述轻链可变结构域(VL)由通过SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列组成，所述重链可变区(VH)由通过SEQ ID NO: 15表示的氨基酸序列组成。作为接头肽，可以使用下述中的任何一种。
在融合蛋白中，Fcγ受体可以是FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB1、FcγRIIB2、FcγRIIIA和/或FcγRIIIB。
在融合蛋白中，Fab或scFv与CD154特异性结合，并且Fc区可以通过铰链或接头肽进行连接。铰链可以衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgD、或者其中至少两种或更多种混合的杂合铰链。铰链可以包括SEQ ID NO: 40至42中任何一个中所示的氨基酸序列。可以使用任何一种接头肽，只要接头肽并不抑制融合蛋白的融合配偶体的功能，并且优选地可以使用下文定义的那些接头肽。
在融合蛋白中，Fc区可以进行突变，以便基本上不与Fcγ受体结合，并且可以使用不与Fcγ受体结合的任何常规已知的Fc区变体，并且它可以衍生自IgA、IgG、IgM、IgD或IgE，或者可以是其中特定免疫球蛋白或其结构域的Fc区，例如CH2和CH3的全部或部分混合的杂合Fc。IgG可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。更具体而言，Fc区可以是变体Fc，其负责抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)的功能部分(效应子)进行突变，以便降低对于Fcγ受体(FcγRc)和补体(C1a)的亲和力，和/或Fc变体，其进行改造以改善对新生儿Fc受体(FcRn)的选择性亲和力，从而具有延长的血液半衰期。在其中，杂合Fc可以是韩国专利号897938、1380732、1380729等中描述的那些杂合Fc，并且变体Fc可以是国际专利申请PCT/KR2020/006346中描述的修饰的免疫球蛋白Fc蛋白(NTIG)。优选地，Fc区可以是具有SEQ ID NO: 5或6的氨基酸序列的修饰的Fc区，或者其中SEQ ID NO: 5或6的氨基酸序列中的第18个和第196个氨基酸分别由苏氨酸(T)和甲硫氨酸(M)取代的修饰的Fc区。
融合蛋白可以是其中IL-10蛋白添加到Fc区的C末端的形式。
IL-10蛋白可以是包含氨基酸序列第19位至第178位的成熟形式的蛋白质，其中信号序列已从UniProtKB P22301中描述的氨基酸序列中去除，并且它可以是其中成熟蛋白的第87个氨基酸异亮氨酸由丙氨酸取代的IL-10变体蛋白，并且它可以是其中长度为6至12个a.a.的接头(间隔区)肽插入在第116个氨基酸天冬酰胺和第117个氨基酸赖氨酸之间的单体IL-10变体蛋白。
在本发明的另一个方面，提供了融合蛋白，其序贯地包含a)与CD154特异性结合的抗体的抗原结合片段或抗体类似物；b)修饰的Fc区，其已进行突变以便不与Fcγ受体结合；以及c) IL-10蛋白。在融合蛋白中，抗体的抗原结合片段可以是Fab、F(ab')2 、Fab'、scFv、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、sdAb (单结构域抗体)、VNAR 或VHH，并且抗体类似物可以是亲和体(affibody)、affilin、affimer、affitin、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单抗体(monobody)、repebody、VLR或nanoCLAMP。
在融合蛋白中，Fcγ受体可以是FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB1、FcγRIIB2、FcγRIIIA和/或FcγRIIIB。
在融合蛋白中，在a)和b)之间以及在b)和c)之间可以通过铰链或接头肽进行连接。铰链可以衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgD、或者其中至少两种或更多种混合的杂合铰链。铰链可以包括SEQ ID NO: 40至42中任何一个中所示的氨基酸序列。可以使用任何一种接头肽，只要接头肽并不抑制融合蛋白的融合配偶体的功能，并且优选地可以使用下文定义的那些接头肽。
在融合蛋白中，Fc区可以进行突变，以便基本上不与Fcγ受体结合，并且可以使用不与Fcγ受体结合的任何常规已知的Fc区变体。优选地，Fc区可以是具有SEQ ID NO: 5或6的氨基酸序列的修饰的Fc区，或者其中SEQ ID NO: 5或6的氨基酸序列中的第18个和第196个氨基酸分别由苏氨酸(T)和甲硫氨酸(M)取代的修饰的Fc区。
在融合蛋白中，IL-10蛋白可以是包含氨基酸序列第19位至第178位的成熟形式的蛋白质，其中信号序列已从UniProtKB P22301中描述的氨基酸序列中去除，并且它可以是其中成熟蛋白的第87个氨基酸异亮氨酸由丙氨酸取代的IL-10变体蛋白，并且它可以是其中长度为6至12个a.a.的接头(间隔区)肽插入在第116个氨基酸天冬酰胺和第117个氨基酸赖氨酸之间的单体IL-10变体蛋白。IL-10变体蛋白可以由通过SEQ ID NO: 7或8表示的氨基酸序列组成。
如本文使用的，术语“融合蛋白”指这样的重组蛋白质，其中两个或更多个蛋白质或负责蛋白质中的特定功能的结构域进行连接，使得每个蛋白质或结构域负责其原始功能。具有柔性结构的接头肽一般可以插入两个或更多个蛋白质或结构域之间。接头肽可以是AAGSGGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 12)、GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 16)、GGSGG(SEQ ID NO: 17)、GGSGGSGGS (SEQ ID NO: 18)、GGGSGG (SEQ ID NO: 19)、(G4S)n (单位：SEQ ID NO: 20，n为1至10的整数)、(GGS)n (n为1至10的整数)、(GS)n(n为1至10的整数)、(GSSGGS)n (单位：SEQ ID NO: 21，n为1至10的整数)、KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO:22)、EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO: 23)、GSAGSAAGSGEF (SEQ ID NO: 24)、(EAAAK)n(单位：SEQ ID NO: 25，n为1至10的整数)、CRRRRRREAEAC (SEQ ID NO: 26)、A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A (SEQ ID NO: 27)、GGGGGGGG (SEQ ID NO: 28)、GGGGGG (SEQ ID NO: 29)、AEAAAKEAAAAKA (SEQ ID NO: 30)、PAPAP (SEQ ID NO: 31)、(Ala-Pro)n (n为1至10的整数)、VSQTSKLTRAETVFPDV (SEQ ID NO: 32)、PLGLWA (SEQ ID NO: 33)、TRHRQPRGWE (SEQID NO: 34)、AGNRVRRSVG (SEQ ID NO: 35)、RRRRRRRR (SEQ ID NO: 36)、GFLG (SEQ IDNO: 37)、GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE (SEQ ID NO: 38)、GSTSGSGKPGSGEGS (SEQID NO: 39)、EPKSCDKTHTCPPC (SEQ ID NO: 40)、 EPKSSDKTHGGTCPPC (SEQ ID NO: 41)和THTCPPKPGS (SEQ ID NO: 42)、RNTGRGGEEKKGSKEKEEQEERETKTPECP (SEQ ID NO: 44)、GGGGSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 45)、GSGGGSGTLVTVSSESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO: 46)、GGGGSGGGGSGGGGSEPKSSDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 47)、以及GGGGSGGGGSGGGGSAKNTTAPATTRNTTRGGEEKKKEKEKEEQEERTHTCPPCP (SEQ ID NO: 48)等等。特别地，SEQID NO: 40至48是衍生自抗体的铰链或其中铰链和其它接头肽混合的杂合铰链肽。当与CD154特异性结合的Fab与Fc区连接时，抗体的基本结构照原样利用是有利的。
如本文使用的，术语“抗体”指免疫球蛋白分子，其是通过结合两条相同的重链和两条相同的轻链而产生的异源四聚体蛋白质，并且通过由轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)组成的抗原结合位点，执行抗原特异性结合，从而引起抗原特异性体液免疫应答。
如本文使用的，术语“抗体的抗原结合片段”指具有衍生自抗体的抗原结合能力的片段，并且包括通过用蛋白质切割酶切割抗体产生的片段以及以重组方式产生的单链片段两者，并且其实例包括Fab、F(ab')2、scFv、双链抗体、三链抗体、sdAb或VHH。
如本文使用的，术语“Fab”指通过用蛋白水解酶木瓜蛋白酶切割抗体分子产生的抗原结合抗体片段(抗原结合片段)，是VH-CH1和VL-CL的两个肽的异源二聚体，并且由木瓜蛋白酶产生的另一个片段被称为Fc (可结晶片段)。
如本文使用的，术语“F(ab')2”指在通过用作为蛋白酶的胃蛋白酶切割抗体产生的片段中包括抗原结合位点的片段，并且是其中两个Fab'通过二硫键连接的四聚体的形式。由胃蛋白酶产生的另一个片段被称为pFc'。
如本文使用的，术语“Fab”指具有与通过在弱还原条件下分离上述F(ab’)2而产生的Fab相似的结构的分子。
如本文使用的，术语“scFv”是“单链可变片段”的缩写，并且指这样的片段，其并非实际抗体的片段，而是通过经由大小为约25 a.a.的接头肽，将抗体的重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)连接而制备的一种融合蛋白，并且已知即使该片段不是独特的抗体片段，也具有抗原结合能力(Glockshuber等人，Biochem. 29(6): 1362-1367，1990)。
如本文使用的，术语“双链抗体”和“三链抗体”分别指以通过接头连接的两个和三个scFv形式的抗体片段。
如本文使用的，术语“单结构域抗体(sdAb)”指也被称为纳米抗体(nanobody)并且由抗体的单个可变区片段组成的抗体片段。主要使用衍生自重链的sdAb，但衍生自轻链的单个可变区片段也被报道与抗原特异性结合。与由重链和轻链组成的常规抗体不同，仅由单链二聚体组成的由鲨鱼抗体的可变区片段组成的VNAR以及由骆驼抗体的可变区片段组成的VHH也包括在sdAb中。
如本文使用的，术语“抗体模拟物”或可替代地“抗体类似物”是包括蛋白质的概念，所述蛋白质具有与由非抗体衍生的蛋白质支架制备的抗体类似的功能，例如单抗体(monobody)和可变淋巴细胞受体(VLR)，即具有抗原结合能力，不同于其中两条重链和两条轻链形成异源四聚体的四级结构以发挥功能的正常全长抗体。此类抗体模拟物的实例包括衍生自蛋白A的Z结构域的亲和体(Nygren，P. A.，FEBS J. 275(11): 2668至2676，2008)、衍生自γ-B晶体蛋白或泛素的Affilin (Ebersbach等人，J. Mol. Biol. 372(1): 172-185，2007)、衍生自胱抑素的Affimer (Johnson等人，Anal. Chem. 84(15): 6553-6560，2012)、衍生自Sac7d的Affitin (Krehenbrink等人，J. Mol. Biol. 383 (5): 1058-1068，2008)、衍生自三螺旋卷曲螺旋蛋白的Alphabody (Desmet等人，Nat. Commun. 5: 5237，2014)、衍生自脂质运载蛋白的Anticalin (Skerra等人，FEBS J. 275(11): 2677-2683，2008)、衍生自各种膜受体的结构域的Avimer (Silverman等人，Nat. Biotechnol. 23(12): 1556-1561，2005)、衍生自锚蛋白重复基序的DARPin (Stumpp等人，Drug Discov. Today. 13(15-16): 695-701，2008)、衍生自Fyn蛋白的SH3结构域的Fynomer(Grabulovski等人，J. Biol. Chem. 282(5): 3196-3204，2007)、衍生自各种蛋白质抑制剂的Kunitz结构域的Kunitz结构域肽(Nixon和Wood，Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 9(2): 261-268，2006)、衍生自纤连蛋白的第10个3型结构域的单体(Koide和Koide，Methods Mol. Biol. 352: 95-109，2007)、衍生自碳水化合物结合模块32-2的nanoCLAMP(Suderman等人，Protein Exp. Purif. 134: 114-124，2017)、衍生自盲鳗的可变淋巴细胞受体(VLR) (Boehm等人，Ann. Rev. Immunol. 30: 203-220，2012)、以及基于VLR的改造为增强抗原亲和力的repebody (Lee等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，109: 3299-3304，2012)。
在本发明的另一个方面，提供了编码融合蛋白的多核苷酸。
在本发明的另一个方面，提供了包含多核苷酸的重组载体。
在重组载体中，多核苷酸可以以与调控序列可操作地连接的基因构建体的形式包含。
如本文使用的，术语“可操作地连接的”意指靶核酸序列(例如，体外转录/翻译系统或在宿主细胞中)以这样的方式与调控序列连接，使得靶核酸序列可以表达。
如本文使用的，术语“调控序列”意欲包括启动子、增强子和其它调控元件(例如，多腺苷酸化信号)。调控序列的实例包括这样指导使得靶核酸在许多宿主细胞中不断表达的序列，这样指导使得靶核酸仅在特定组织细胞中表达的序列(例如，组织特异性调控序列)，以及这样指导使得表达由特定信号诱导的序列(例如，诱导型调控序列)。本领域技术人员可以理解，表达载体的设计可以根据因素例如待转化的宿主细胞的选择和所需的蛋白质表达水平而变。可以将本发明的表达载体引入宿主细胞内，以表达融合蛋白。使得能够在真核细胞和原核细胞中表达的调控序列是本领域技术人员众所周知的。如上所述，这些调控序列一般包括负责转录起始的调控序列，以及任选地负责转录终止和转录物稳定的多聚A信号。除转录调控因子之外，另外的调控序列还可以包括翻译增强因子和/或天然组合的或异源的启动子区。例如，使得能够在哺乳动物宿主细胞中表达的可能的调控序列包括CMV-HSV胸苷激酶启动子、SV40、RSV (劳斯肉瘤病毒)启动子、人肾尿素1α启动子、糖皮质激素诱导MMTV (莫洛尼小鼠肿瘤病毒)启动子、金属硫蛋白或四环素诱导型启动子、或扩增剂如CMV扩增剂和SV40扩增剂。对于神经细胞中的表达，考虑可以使用神经丝启动子、PGDF启动子、NSE启动子、PrP启动子或thy-1启动子。上述启动子是本领域已知的，并且在文献(Charron，J. Biol. Chem. 270: 25739至25745，1995)中进行描述。对于在原核细胞中的表达，已公开了许多启动子，包括lac启动子、tac启动子或trp启动子。除能够启动转录的因子之外，调控序列还可以包括在根据本发明的一个示例性实施方案的多核苷酸的下游的转录终止信号，例如SV40-多聚A位点和TK-多聚A位点。在本说明书中，合适的表达载体是本领域已知的，并且其实例包括Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1 (Parmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3 (Invitrogen)、pSPORT1 (GIBCO BRL)、pGX-27 (韩国专利号1442254)、pX(Pagano等人，Science 255: 1144-1147，1992)、酵母双杂交载体如pEG202和dpJG4-5(Gyuris等人，Cell 75: 791-803，1995)、以及原核表达载体例如λgt11和pGEX (AmershamPharmacia)。除本发明的核酸分子之外，载体还可以进一步包括编码分泌信号的多核苷酸。分泌信号是本领域技术人员众所周知的。此外，取决于所使用的表达系统，可以将根据本发明的一个示例性实施方案的融合蛋白引导至细胞区室的前导序列，与根据本发明的一个示例性实施方案的多核苷酸的编码序列组合，并且优选是能够将解码的蛋白质或其蛋白质直接分泌到细胞质周或细胞外培养基内的前导序列。
另外，本发明的载体可以例如通过标准重组DNA技术进行制备，并且标准重组DNA技术的实例包括平滑末端和粘附末端的连接、限制性酶处理以提供适当的末端、通过碱性磷酸酶处理去除磷酸基以防止不适当的结合、以及通过T4 DNA连接酶的酶促连接。本发明的载体可以通过以下进行制备：重组通过化学合成或遗传重组技术获得的编码信号肽的DNA、根据本发明的一个示例性实施方案的免疫球蛋白Fc结构域变体蛋白、或编码含有其与含有适当调控序列的载体的融合蛋白的DNA。含有调控序列的载体可以商业上购买或制备，并且在本发明的一个示例性实施方案中，pBispecific主链载体(Genexine，Inc.，韩国)、pAD15载体、pGP30 (Genexine，Inc. 韩国)或pN293F载体(Y-Biologics，Inc.，韩国)用作主链载体。
表达载体可以进一步包括编码分泌信号序列的多核苷酸，并且分泌信号序列诱导在细胞中表达的重组蛋白质的细胞外分泌，并且可以是组织纤溶酶原激活物(tPA)信号序列、单纯疱疹病毒糖蛋白D (HSV gD)信号序列、或生长激素信号序列。
根据本发明的一个示例性实施方案的表达载体可以是能够在宿主细胞中表达蛋白质的表达载体，并且表达载体可以是任何形式，例如质粒载体、病毒载体、粘粒载体、噬菌粒载体或人工人染色体。
在本发明的另一个方面，提供了用于免疫抑制的药物组合物，其包含融合蛋白作为活性成分。
用于免疫抑制的药物组合物可以用于治疗自身免疫性疾病或用于已接受器官移植的患者的免疫抑制。
根据本发明的另一个方面，提供了用于治疗自身免疫性疾病的药物组合物，其包含融合蛋白作为活性成分。
药物组合物可以进一步含有已知的免疫抑制剂组分。这些已知的免疫抑制剂包括糖皮质激素、细胞抑制剂、抗CD20抗体、抗CD3抗体、抗IL-2抗体、亲免素抑制剂、干扰素β、阿片样物质、TNFα结合蛋白、霉酚酸酯、芬戈莫德或多球壳菌素。糖皮质激素可以是泼尼松、地塞米松或氢化可的松。细胞抑制剂可以是氮芥、亚硝基脲、铂配位络合物、叶酸类似物、硫唑嘌呤、巯嘌呤、氟尿嘧啶、氨甲蝶呤、更生霉素、蒽环霉素、丝裂霉素C、博来霉素或光神霉素。亲免素抑制剂可以是环孢菌素、他克莫司、西罗莫司或依维莫司。
在药物组合物中，自身免疫性疾病可以是1型糖尿病、斑秃、抗磷脂抗体综合征、类风湿性关节炎、银屑病或银屑病关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、炎性肠病、艾迪生病、格雷夫斯病、干燥综合征、格巴二氏综合征、桥本氏甲状腺炎、重症肌无力、炎性肌病、自身免疫性血管炎、自身免疫性肝炎、出血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、原发性胆汁性肝硬化、硬皮病、白癜风、恶性贫血或慢性乳糜泻。
组合物可以含有药学上可接受的载体，并且除载体之外，还可以进一步包括药学上可接受的佐剂、赋形剂或稀释剂。
如本文使用的，术语“药学上可接受的”指这样的组合物，其是生理学上可接受的，并且当施用于人时，一般不引起变态反应，例如胃肠道病症和眩晕，或类似反应。载体、赋形剂和稀释剂的实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。此外，可以进一步含有填料、抗凝集剂、润滑剂、润湿剂、香料、乳化剂和防腐剂。
此外，当根据本发明的一个示例性实施方案的药物组合物施用于哺乳动物时，可以使用本领域已知的方法来配制药物组合物，以允许活性成分的快速、持续或延迟释放。制剂的实例包括粉末、颗粒、片剂、乳状液、糖浆剂、气溶胶、软或硬明胶胶囊、无菌可注射溶液和无菌粉末形式。
根据本发明的一个示例性实施方案的组合物可以通过各种途径进行施用，所述途径例如经口施用和胃肠外施用，例如栓剂、经皮、静脉内、腹膜内、肌内、病灶内、鼻内或脊柱内施用，并且可以使用用于持续释放或者连续或重复释放的植入装置进行施用。施用可以在所需范围内一天执行一次或数次，并且可以以间隔如一周一次、一周两次和一个月一次来执行，并且施用的持续时间也没有特别限制。
根据本发明的一个示例性实施方案的组合物可以与常用的药学上可接受的载体一起以合适形式进行配制。药学上可接受的载体的实例包括用于胃肠外施用的载体，例如水、合适的油、盐水溶液、水性葡萄糖和二醇，并且可以进一步含有稳定剂和防腐剂。合适稳定剂的实例包括抗氧化剂，例如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸。合适防腐剂的实例包括苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和三氯叔丁醇。此外，取决于施用方法或制剂，需要时，根据本发明的组合物可以适当地含有助悬剂、增溶剂、稳定剂、等渗剂、防腐剂、吸附抑制剂、表面活性剂、稀释剂、赋形剂、pH调节剂、无痛剂、缓冲剂、抗氧化剂等等。适合于本发明的药学上可接受的载体和制剂，包括上文举例说明的那些，在文献[Remington’s Pharmaceutical Sciences，最新版本]中得到详细描述。
组合物对患者的剂量取决于许多因素，包括患者的身高、体表面积、年龄、施用的具体化合物、性别，施用的时间和途径，一般健康和同时施用的其它药物。可以以100 ng/体重(kg)至10 mg/体重(kg)，更优选1至500 μg/kg(体重)，且最优选5至50 μg/kg(体重)的量施用药物活性蛋白，但可以考虑上述因素来调整剂量。
在本发明的另一个方面，提供了用于治疗患有自身免疫性疾病的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的融合蛋白。
如本文使用的，术语“治疗有效量”意指足以以适用于医学治疗的合理益处/风险比治疗疾病的量，并且有效剂量水平是受试者的类型和严重性、年龄、性别、药物活性、对药物的敏感性、施用时间、施用途径和排泄率、治疗持续时间、包括同时使用的药物的因素以及医学领域众所周知的其它因素。本发明的组合物的治疗有效量可以为0.1 mg/kg至1 g/kg，更优选1 mg/kg至500 mg/kg，但有效剂量可以根据患者的年龄、性别和状况，适当地进行调整。
实施例
在下文中，将通过实施例和实验例更详细地描述本发明。然而，本发明并不限于下文描述的实施例和实验例，并且可以以各种其它形式实施，并且提供下文描述的实施例和实验例，以使得本发明的公开内容完整，并且对本发明所属领域的技术人员充分传达本发明的内容。
实施例1：嵌合抗CD154抗体的制备
本发明人制备了抗CD154抗体，其中WO2016/182335A1中所述的小鼠衍生的抗CD154抗体的Fc区由人IgG1 Fc区替换，所述人IgG1 Fc区是引入抗体(C10)的重链CH2和CH3结构域内的FcγRIIα结合抑制突变体，并且将嵌合抗体命名为'C10M' (图1)。
实验例1：嵌合抗CD154抗体的血块形成的分析
将138 μg如上所述制备的嵌合抗体C10M分别静脉内注射到野生型小鼠和用FcγRIIα基因转导的转基因小鼠内，并且10分钟后，从眼眶中收集血液并且置于EDTA管中，以执行CBC血小板分析。然后处死动物，切除肺以制备冷冻切片，然后执行组织染色，以计数血栓数目。
结果，如图2中所示，尽管与常规野生型IgG1 Fc应用于其的C10相比，实施例1的C10M显著减少了FcγRIIα转基因小鼠中的血栓形成，然而，C10M显示与野生型小鼠相比，FcγRIIα转基因小鼠中的血栓形成是两倍多，指示不能完全抑制血栓形成。
实施例2：融合蛋白的制备
根据实施例1的结果，本发明人设计了融合蛋白，其中C10M抗体的Fab部分连接至不与FcγR结合的修饰的Fc区(图3)。特别地，修饰的Fc区被设计为通过引入IgD和IgG4的CH2和CH3的混合形式，同时照原样应用IgG1的铰链部分进行修饰，以便不与FcγR结合。
对于融合蛋白的表达，制备编码杂合重链的多核苷酸，其中C10M抗体的Fab的重链部分(VH-CH1，SEQ ID NO: 9)与修饰的Fc区(SEQ ID NO: 6)连接，并且插入pBispecific表达载体(Genexine，Inc.)内。另外，将编码C10M抗体的Fab的轻链部分(VL-CL，SEQ ID NO: 2)的多核苷酸插入pBispecific表达载体内，使得它可以在双启动子下进行控制。
使用Thermo Fisher的ExpiCHO试剂盒瞬时表达上文制备的表达载体。具体而言，在将如上所述制备的载体构建体与试剂盒中包括的ExpiCHO-S细胞和ExpiFectamine试剂混合，并且使混合物在配备有8% CO2 和37℃条件的培养箱中温育1天后，然后将温度降低至32°C并培养直至第7天。
然后，执行蛋白A捕获纯化，并且通过在非还原条件和还原条件下的PAGE分析和蛋白质印迹分析确认候选材料是否得到纯化，并且用考虑到候选材料的pI值的配制缓冲液执行配制。使用Nano drop来定量配制的材料，并且使用SEC-HPLC确认最终纯度。
结果，如图4A至4C中所示，确认了不仅轻链和重链正常表达，而且在非还原条件下也作为单一条带出现，指示形成了正常的异源四聚体。另外，作为SEC-HPLC分析的结果，纯度高达97.9%。
相应地，本发明人将由瞬时表达结果产生的嵌合抗体命名为"PG-400-1"，并且产生了能够稳定产生其的稳定细胞系。
具体而言，为了开发表达PG-400-1蛋白的稳定细胞系，将上文制备的基因构建体通过亚载体克隆步骤克隆到pGP30表达载体内。此后，使用Neon转染系统，将表达载体转染到CHO DG44 (来自Dr. Chasin，Columbia University，USA)细胞内。作为第一个筛选过程，不含HT (5-羟色胺)的10% dFBS (Gibco，USA，30067-334)、MEMα (Gibco，12561，USA，目录号12561-049)和HT+ (Gibco，USA，11067-030)培养基用于执行HT选择，并且执行LDC (有限稀释克隆；96孔，30块板)，以获得最终细胞系。在400 ml HyCell CHO细胞培养基中，对最终得到的细胞系执行补料分批培养，并且对培养第15天时获得的培养基执行蛋白A纯化，以确认所纯化的蛋白质。通过SDS-PAGE和SEC-HPLC分析纯化蛋白质的数量和纯度。
结果，如图4D中所示，确认了在稳定细胞系中产生的嵌合抗体也是正常表达的。另外，如图4E中所示，作为SEC-HPLC分析的结果，发现嵌合抗体被纯化至99.97%的极高纯度。
实验例2：hCD154结合亲和力分析
本发明人通过生物层干涉测量法(BLI)分析，来分析实施例2中制备的嵌合抗体与hCD154的结合亲和力。
为此，本发明人首先使用Dip and ReadTM Amine Reactive 2nd Generation(AR2G) Reagent Kit (forteBio，目录号18-5092)，将CD154蛋白附着到96孔板。具体而言，在96孔板中分配200 μl DW后，插入试剂盒中包括的胺生物传感器并水合10分钟。随后，在将另外200 μl DW分配到板中之后，EDC:NHS以1:1的比率在对应于所需样品的1/20的体积中混合，然后在DW中稀释，并且将200 μl分配到96孔板内。随后，将CD154蛋白在10 mM乙酸盐溶液(pH 6.0)中稀释至5 μg/ml，并且将200 μl分配到96孔板内。然后，将200 μl 1 M乙醇胺加入96孔板中，并且将生物传感器板和样品板插入Octet® K2 BLI分析仪内，并且测量信号。在测量完成后，将200 μl 1x动力学缓冲液加入样品板中，然后确定基线。随后，在上文实施例1和2中制备的嵌合抗体(C10M)和嵌合杂合抗体(PG-400)分别在1x动力学缓冲液中以不同浓度(200 pM至12.5 nM)稀释，然后以200 μl分配到样品板中，然后使用Octet®K2 BLI分析仪执行BLI (生物层干涉测量法)分析，以测量结合亲和力。
表1
实施例 1 2
平均K<sub>D</sub> (nM) < 1E-12 < 1E-12
平均K<sub>on</sub> (1/Ms) 509,500±8,890 807,000±4,250
平均K<sub>dis</sub> (1/s) < 1E-07 < 1E-07
平均R<sup>2</sup> 0.96 0.93
结果，如图5和表1中所示，确认了本发明的实施例1的嵌合抗体和本发明的实施例2的嵌合杂合抗体分别对于CD154具有足够高的亲和性，但由于测量装置的局限性，无法区分1.0 pM或更小的值。
实施例3：人源化杂合抗体的制备
尽管本发明人已通过将不与FcγR结合的修饰的Fc区引入PG-400-1中，充分改善了常规人抗体的缺点，但抗原结合位点仍然是小鼠衍生的抗体，并且因此它可能在人体中诱导不必要的免疫应答。因此，为了产生更安全的杂合抗体，本发明人设计了人源化抗体，其中除了作为抗体的抗原结合片段的Fab的抗原决定簇之外的构架的剩余部分，本发明的基础由相应的人抗体序列取代，并且将其命名为"PG-400-2" (表2和3)。在PG-400-1和PG-400-2两者中，修饰的Fc的C末端具有以赖氨酸(K)终止的SEQ ID NO: 6的氨基酸序列，因为没有其它蛋白质与C末端融合。
另外，本发明人通过用具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的接头肽，将具有免疫抑制活性的细胞因子IL-10蛋白与修饰的Fc的C末端连接，设计了融合蛋白，并且这被称为"PG-410" (表2)。在PG-410的情况下，使用缺失型(SEQ ID NO: 5)，其中由于向Fc区的C末端添加IL-10蛋白，在Fc区的C末端处的赖氨酸残基被缺失。
表2
人源化杂合抗体(PG-400-2和PG-410)的重链构建
Figure DEST_PATH_IMAGE002
表3
人源化杂合抗体(PG-400-2和PG-410)的轻链构建
Figure DEST_PATH_IMAGE004
实施例4：抗CD154 scFv修饰的Fc-IL-10融合蛋白的制备
本发明人选择了人源化抗CD154抗体的Fab的可变区部分，然后使用该Fab设计了scFv，并且将其引入实施例3的融合蛋白内代替抗CD154抗体的重链构建体的VH-CH1部分。通过插入基于单链的抗体结合片段内，设计了融合蛋白，将其命名为'PG-420' (表4)。尽管在该实施方案中，抗CD154 scFv由轻链可变区(VL)-接头-重链可变区(VH)组成，但可以使用替代物例如VH-接头-VL序列，因为它维持与CD154的结合亲和力，并且此外，能够使用各种类型的接头。
表4
抗CD154 scFv修饰的Fc-IL-10融合蛋白的构成
Figure DEST_PATH_IMAGE006
实施例5：融合蛋白样品的产生
实施例2中的融合蛋白不是人源化抗体，而是嵌合抗体，并且它在实验室规模上小量生产。另外，由于宿主细胞是并非衍生自人细胞的CHO细胞，因此所产生的蛋白质的糖链模式可能与人蛋白质的糖链模式不同。相应地，本发明人通过将宿主细胞改变为人细胞HEK293细胞，并且将培养规模扩大至3 L，尝试确认实施例3的重组人源化抗体(PG-400和PG-410)是否正常产生。
5-1：PG-400-2蛋白的产生
在制备编码实施例4中设计的PG-400-2蛋白的重链和轻链各自的多核苷酸，并且与实施例2类似，将其插入N293F载体系统(YBiologics，韩国)内之后，然后将载体共转染到HEK293细胞内。共转染的HEK293细胞通过生物反应器(FreeStyle 293 ExpressionMedium，Gibco)在3 L规模下，在37℃、5% CO2下培养6天，然后在还原条件下通过PAGE分析确认蛋白质表达。结果，如图6A中所示，确认了蛋白质正常产生。随后，本发明人通过将细胞培养溶液加载到填充有蛋白A珠的柱上，来执行亲和色谱。在用洗涤缓冲液(D-PBS，pH 7.4)洗涤后，加入0.1 mM甘氨酸缓冲液(pH 3.3)，以洗脱蛋白质。接下来，使用Superdex 200柱、运行缓冲液(D-PBS，pH 7.4)和洗脱缓冲液(D-PBS，pH 7.4)，通过凝胶过滤进一步纯化蛋白质。
通过最终纯化的蛋白质在还原条件和非还原条件下的PAGE分析，来确认蛋白质的产生和纯化。结果，如图6B中所示，确认了它以高纯度进行纯化。
接下来，本发明人首先将纯化的蛋白质放入预先水合的再生纤维素(RC)管内，然后将其放入含有适合于候选材料的pI值的配制缓冲液(PBS，pH 7.4)的2 L烧杯中，并且在4°C下透析过夜以配制蛋白质。使用Nano drop来定量配制的材料，并且使用SEC-HPLC确认最终纯度。结果，如表5和图6C中所示，蛋白质的总量为184 mg，且生产率为61 mg/L，纯度达到99.4%，指示它以极高纯度进行纯化，并且内毒素含量小于0.38 EU/mg。
表5
PG-400-2测试样品纯化的结果
Figure DEST_PATH_IMAGE008
因此，确认了即使在人细胞中扩大培养规模，根据本发明的一个实施方案的人源化抗CD154抗体(PG-400-2)也可以以高纯度进行生产。
5-2：PG-410蛋白的产生
另外，本发明人制备了编码实施例4中设计的PG-410蛋白的重链和轻链各自的多核苷酸，然后以与实施例5-1相同的方式，将其克隆到N293F载体系统(YBiologics，韩国)内。将载体共转染到HEK293细胞内。
以与实施例5-1相同的方式纯化根据本发明的一个实施方案的PG-410蛋白，除了将共转染的HEK293细胞培养至2.3 L并且省略凝胶过滤步骤之外。
表6
PG-410测试样品纯化的结果
Figure DEST_PATH_IMAGE010
结果，如表6以及图7A至7C中所示，即使另外的蛋白质(IL-10)连接到C末端并且省略了凝胶过滤步骤，根据本发明的一个实施方案的IL-10连接的人源化抗CD154抗体(PG-410)也以高纯度进行纯化。特别地，尽管培养规模比PG-400-2小，但蛋白质产率高达128.2mg/L，并且内毒素的含量也极低，为0.021 EU/mg。
实验例3：与CD154的结合亲和力分析
本发明人通过生物层干涉测量法(BLI)分析，来分析实施例4中制备的PG-400-2和PG-410是否也如同实施例2中制备的融合蛋白与CD154特异性结合。
具体而言，将200 μl蒸馏水分配到平底96孔黑色板内，然后在黑色板上放置生物传感器托盘，并且插入胺生物传感器并水合10分钟。为了确定初始基线，将200 μl蒸馏水分配到新的96孔黑色样品板内。随后，EDC:NHS以1:1的比率在对应于所需样品的1/20的体积中混合，然后在蒸馏水中稀释，然后将200 μl分配到水合的96孔黑色样品板内。将样品CD154在10 mM乙酸溶液(pH 6.0)中稀释至5 μg/ml，并且将200 μl分配到96孔黑色板内。然后，将200 μl 1 M乙醇胺加入96孔黑色板中，并且将生物传感器板和样品板插入Octet® K2BLI分析仪内，并且诱导CD154与测量信号的胺传感器的结合。在测量完成后，将96孔黑色样品板从装置中取出，然后加入200 μl 1x动力学缓冲液以测量基线。然后，将作为待分析的抗体的PG-400-2/PG-410在1X动力学缓冲液中序贯地进行稀释，使得浓度为200至12.5 nM，然后将200 μl溶液分配到96孔黑色板内。随后，将96孔黑色板插入Octet® K2 BLI分析装置内，并且在执行与CD154的反应的同时测量信号。
表7
PG-400-2和PG-410的BLI分析结果
样品ID PG-400-2 PG-410
K<sub>D</sub> (nM) 0.36 M < 1E-12
K<sub>on</sub> (1/Ms) 8.47E+05 1.96E+05
K<sub>dis </sub>(1/s) 3.11E-04 < 1E-07
结果，如表7以及图8A和8B中所示，PG-400-2和PG-410两者均与CD154特异性结合。特别地，在PG-410的情况下，Kon值是PG-400-2的约1/4.3，但PG-410的Kdis值< 1E-07，显示了与CD154的高亲和力。这显示了由于其比PG-400-2更低的结合后解离速率，PG-410具有比PG-400-2更高的整体结合亲和力(多于3000倍)，尽管PG-410与CD154的结合比PG-400-2略微更晚发生。然而，总体而言，发现PG-400-2和PG-410两者均与CD154特异性结合，并且在PG-410的情况下，在结合后较低的解离速率预计帮助维持IL-10在表达CD154的靶细胞中的有效性。
实验例4：通过IL-10的免疫抑制活性的评估
本发明人调查了单体IL-10变体(IL-10Vm)对免疫细胞的免疫应答的作用，以便确定添加到重链C末端的重组人源化抗体(PG-410)的IL-10是否正确地发挥功能。
具体而言，去除含有培养的巨噬细胞Raw264.7细胞的T75烧瓶的上清液，并且用PBS洗涤一次。在添加3 ml TrypLETM Select Enzyme后，使细胞在37°C培养箱中温育3-5分钟。随后，将10 ml新培养基加入T75烧瓶中，将从板中分离的细胞悬浮液分配到50 mL离心管内，然后将管以1500 rpm离心5分钟。然后，去除上清液，并且用手轻轻敲击离心管数次，以使细胞悬浮。随后，在与5 mL培养基混合后，对细胞进行计数。加入培养基并进行稀释，使得细胞浓度调整至1X105个细胞/ml，然后将100 μl分配到96孔平底板上。在10小时后，序贯地稀释至具有1000至0.003 nM的最终浓度的PG-410在96孔平底板上按50 μl进行处理。在20分钟后，用400 ng/ml LPS进行处理。然后使它在37°C的培养箱中温育16小时，并且第二天收集上清液，并且根据制造商的方案，使用TNFα ELISA试剂盒测量TNFα的浓度(图9A)。同时，重组IL-10用作阳性对照。
结果，如表8和图9B中确认的，与重组IL-10相比，根据本发明的一个实施方案的重组人源化抗体具有约1/100的免疫抑制活性。
表8
PG-410和IL-10的巨噬细胞免疫抑制活性分析的结果
Figure DEST_PATH_IMAGE012
实验例5：单次毒性评估
据报道，随着剂量增加或重复施用，常规重组IL-10随着血液中的血红蛋白浓度降低引起贫血症状，并且随着血小板浓度引起血小板减少症(Tilg等人，J. Immunol. 164(4): 2204-2209，2002；Fedorak等人，Gastroendocrinol. 119(6): 1473-1482，2000)。相应地，本发明人通过请求Biotoxtech (韩国)，对于上文实施例4中制备的PG-410，根据食品和药物管理局公告编号(Food and Drug Administration Notification No.) 2017-183(2017年8月30日)的‘非临床测试管理标准(Non-Clinical Test Management Standard)’，执行了关于GLP应用测试的毒性测试。
具体而言，由Biotoxtech进行的单次剂量毒性测试方法如下进行。使用5周龄的雌性ICR小鼠执行毒性测试，并且在指定的饲养条件下每笼饲养3只动物。适应期设为1周，在此期间观察一般症状，并且测试中仅使用健康动物，并且食物和饮用水自由消耗。测量实验中使用的动物的重量，使得每组的平均重量相等，并且在动物的尾部上标记个体身份，并且个体身份卡附着至饲养箱。作为测试物质，PG-410静脉内施用于小鼠一次，具有无菌生理盐水作为对照，并且基于紧在施用前的体重施用最多300 mg/kg，并且通过尸检检查毒性测试。
结果，没有观察到与测试物质的施用有关的死亡率、一般症状、重量变化和肉眼可见的尸检发现。
实验例6：移植物抗宿主病(GVHD)相关动物实验
本发明人通过动物模型实验调查了根据本发明的一个实施方案的重组人源化抗体PG-410是否可以用于治疗移植物抗宿主病，其是在器官移植过程中发生的主要副作用。
为此，从Orient Bio (韩国)购买6周龄的雄性NSG小鼠，并且在用于该测试的动物房中经历7天适应的同时，每天观察一般症状。关于通过动物供应商提供的病原体的测试报告的审查没有显示可以影响检测的因素。在适应期过程中，对确定为健康的动物的重量进行排序并随机分布，使得每组的平均重量是均匀分布的。然后，将测试物质以5 mpk (100 μg/头)进行配制，并且在GVHD诱导前和诱导后28天静脉内施用于小鼠，使用无菌生理盐水作为对照。在测试物质施用后的第二天，将200 μl人外周血单核细胞(PBMC，1×10 7个细胞/动物)静脉内施用于20只NSG小鼠。在PBMC施用之前和之后，每周测量两次体重。通过GVHD的五种医学症状每周评价GVHD诱导两次：重量减轻、活动、姿势、毛皮质地和皮肤完整性。作为对照，使用载体。
结果，如图10B和10C中可见的，与阴性对照组不同，施用PG-410的组并未丧失重量，并且存活率明显高于阴性对照组。
据报道，在PBMC施用后的GVHD发作以及由施用的PBMC分化的人CD45+白细胞的比例具有密切关系(Ehx等人，Front. Immunol. 9: 1943，2018)。因此，分别在PBMC施用后的第7、14、21、28、35和42天，从阴性对照组和PG-410施用组收集血液，并且通过流式细胞术分析人CD45+细胞群体。具体而言，将PBMC施用后的第7天(D7)收集的血液按50 μl分配到96孔圆底板内。血液用FACS缓冲液进行洗涤，然后以1500 rpm离心5分钟。在弃去上清液后，将形成的细胞团块悬浮于用0.5 μl水性荧光反应性染料稀释的50 μl FACS缓冲液中，并且在4°C下反应20分钟。在用FACS缓冲液洗涤且弃去上清液后，将50 μl抗体混合物(抗人CD45、抗小鼠CD45)加入每孔中，并且在室温下反应20分钟。然后，它用FACS缓冲液洗涤两次，并且使用流式细胞仪进行分析。在PBMC施用后的第14、21、28和35天时，同样地重复该测定。
结果，如图11中所示，确认了与阴性对照组相比，人CD45细胞群体(GVHD发病机制的重要标记物)在PG-410施用组是降低的。
实验例7：修饰的Fc区与各种Fcγ受体的结合亲和力分析
如上所述，在本发明的一个实施方案中使用的修饰的Fc区蛋白是设计为去除与Fcγ受体的结合能力的变体。相应地，本发明人试图调查根据本发明的一个实施方案的修饰的Fc区蛋白是否实际上不与各种Fcγ受体结合。
为此，本发明人使用通过以下制备的GLP-1E-Fc融合蛋白(称为"PG-11")调查了修饰的Fc区对于各种Fcγ受体的结合亲和力：使用具有通过SEQ ID NO: 43表示的氨基酸序列的接头肽，将由通过SEQ ID NO: 49表示的氨基酸组成的GLP-1受体激动剂与修饰的Fc区蛋白的N末端连接，所述修饰的Fc区蛋白具有与应用于根据本发明的一个实施方案制备的抗CD154抗体融合蛋白的修饰的Fc区蛋白(SEQ ID NO: 5或6)相同的氨基酸序列。通过BLI分析来分析结合亲和力。这次，IgG1亚类重组抗体利妥昔单抗用作对照。
结果，如图12中所示，基于IgG1的抗体利妥昔单抗与FcγRI和FcγRIIIa特异性结合，而根据本发明的一个实施方案的含有NTIG的融合蛋白PG-11不与这些受体特异性结合。
此外，本发明人比较且分析了根据本发明的一个实施方案的GLP-1E-Fc融合蛋白和利妥昔单抗与FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIIb的结合亲和力。结果，如图13A至13D中所示，确认了利妥昔单抗与三种Fcγ受体特异性结合，而根据本发明的一个实施方案的融合蛋白显示出极弱的结合。然而，考虑到传感图的概况，估计为非特异性结合。
如上所述，由于本发明中使用的修饰的Fc区蛋白不与各种Fcγ受体结合，因此常规抗体治疗剂的不希望的副作用例如ADCC或CDC可以降到最低。
本发明已参考上述实施方案和实验例进行描述，但这些仅仅是示例性的，并且本领域的普通技术人员将了解，各种修改和等价的其它实施方案由此是可能的。因此，本发明真正的技术保护范围应该由所附权利要求的技术精神决定。
<110> PROGEN CO., LTD.
<120> 新的融合蛋白及其用途
<130> PO21-5243
<150> KR 10-2019-0082151
<151> 2019-07-08
<160> 49
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗CD154抗体重链
<400> 1
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1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ile Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
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Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
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210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
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Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
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Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
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<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗CD154抗体轻链(VL-CL)
<400> 2
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65 70 75 80
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115 120 125
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<212> PRT
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<220>
<223> 人源化抗CD154抗体重链
<400> 3
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<220>
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Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
115 120 125
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
130 135 140
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
145 150 155 160
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
165 170 175
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
180 185 190
Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
195 200 205
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215
<210> 7
<211> 169
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体IL-10变体
<400> 7
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ala Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Ser Lys
115 120 125
Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly
130 135 140
Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu
145 150 155 160
Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
165
<210> 8
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 以前的单体IL-10变体
<400> 8
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ala Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Gly Gly Gly Ser Gly Gly Lys Ser Lys Ala Val Glu
115 120 125
Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys
130 135 140
Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met
145 150 155 160
Thr Met Lys Ile Arg Asn
165
<210> 9
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗CD154抗体重链的VH-CH1
<400> 9
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ile Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
210 215
<210> 10
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG重链的信号肽
<400> 10
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 11
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗CD154重链的VH-CH1
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
210 215
<210> 12
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 12
Ala Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 13
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG轻链的信号肽
<400> 13
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly
20
<210> 14
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗CD154抗体的VL
<400> 14
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser
20 25 30
Thr Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Val Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
115
<210> 15
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗CD154抗体的VH
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Asp Gly Arg Asn Asp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 16
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 17
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 18
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 19
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 19
Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 20
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 21
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 21
Gly Ser Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 22
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 22
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 23
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 23
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr
1 5 10
<210> 24
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 24
Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe
1 5 10
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 25
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 26
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 26
Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Glu Ala Glu Ala Cys
1 5 10
<210> 27
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 27
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
20 25 30
Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala
35 40 45
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 28
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 29
Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 30
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Ala Lys Ala
1 5 10
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 31
Pro Ala Pro Ala Pro
1 5
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 32
Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp
1 5 10 15
Val
<210> 33
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 33
Pro Leu Gly Leu Trp Ala
1 5
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 34
Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu
1 5 10
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 35
Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly
1 5 10
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 36
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 37
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 37
Gly Phe Leu Gly
1
<210> 38
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 38
Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asp
1 5 10 15
Glu Ala Asp Gly Ser Arg Gly Ser Gln Lys Ala Gly Val Asp Glu
20 25 30
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 39
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
1 5 10 15
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 40
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 41
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 42
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 43
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 43
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
1 5 10 15
Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
20 25 30
Pro
<210> 44
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 44
Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Gly Ser Lys Glu Lys
1 5 10 15
Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
20 25 30
<210> 45
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 45
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
1 5 10 15
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
<210> 46
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 46
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser
1 5 10 15
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
20 25
<210> 47
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 47
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
1 5 10 15
Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
<210> 48
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 48
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
1 5 10 15
Lys Asn Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Thr Arg Gly Gly
20 25 30
Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Thr
35 40 45
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
50 55
<210> 49
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-1/Exendin 4杂合体
<400> 49
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35

Claims (26)

1.一种融合蛋白，其包含与人CD154特异性结合的Fab或scFv、以及免疫球蛋白的Fc区，其中所述Fc区是突变以便不与Fcγ受体结合的修饰的Fc区。
2. 根据权利要求1的融合蛋白，其中与CD154特异性结合的Fab由以下组成：
由通过SEQ ID NO: 2表示的氨基酸组成的轻链(VL-CL)、以及由通过SEQ ID NO: 9表示的氨基酸组成的重链VH-CH1片段；或
由通过SEQ ID NO: 4表示的氨基酸序列组成的轻链(VL-CL)、以及由通过SEQ ID NO:11表示的氨基酸序列组成的重链VH-CH1片段。
3. 根据权利要求1的融合蛋白，其中通过用接头肽连接轻链可变结构域(VL)和重链可变区(VH)来制备scFv，所述轻链可变结构域(VL)由通过SEQ ID NO: 14表示的氨基酸序列组成，所述重链可变区(VH)由通过SEQ ID NO: 15表示的氨基酸序列组成。
4.根据权利要求1的融合蛋白，其中Fcγ受体是FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB1、FcγRIIB2、FcγRIIIA和/或FcγRIIIB。
5.根据权利要求1的融合蛋白，其中所述Fab或scFv与CD154特异性结合，并且所述Fc区通过铰链或接头肽进行连接。
6. 根据权利要求1的融合蛋白，其中所述融合蛋白由以下组成：
具有通过SEQ ID NO: 1表示的氨基酸序列的Ig重链肽、以及具有通过SEQ ID NO: 2表示的氨基酸序列的Ig轻链肽；或
具有通过SEQ ID NO: 3表示的氨基酸序列的Ig重链肽、以及具有通过SEQ ID NO: 4表示的氨基酸序列的Ig轻链肽。
7. 根据权利要求1的融合蛋白，其中所述Fc区是具有SEQ ID NO: 5或6的氨基酸序列的修饰的Fc区。
8. 根据权利要求1的融合蛋白，其中所述Fc区是修饰的Fc区，其中SEQ ID NO: 5或6的氨基酸序列中的第18个和第196个氨基酸分别由苏氨酸(T)和甲硫氨酸(M)取代。
9.根据权利要求1的融合蛋白，其中IL-10蛋白添加到Fc区的C末端。
10.根据权利要求9的融合蛋白，其中所述IL-10蛋白是其中成熟蛋白的第87个氨基酸异亮氨酸由丙氨酸取代的IL-10变体蛋白。
11.根据权利要求10的融合蛋白，其中所述IL-10蛋白是其中长度为6至12个a.a.的肽插入在第116个氨基酸天冬酰胺和第117个氨基酸赖氨酸之间的单体IL-10变体蛋白。
12. 一种融合蛋白，其序贯地包含a)与CD154特异性结合的抗体的抗原结合片段或抗体类似物；b)修饰的Fc区，其已进行突变以便不与Fcγ受体结合；以及c) IL-10蛋白。
13.根据权利要求12的融合蛋白，其进一步包含独立地在a)和b)和/或b)和c)之间的至少一种接头肽。
14.根据权利要求13的融合蛋白，在a)和b)之间的接头肽是衍生自抗体的铰链。
15. 根据权利要求12的融合蛋白，其中所述抗体的抗原结合片段是Fab、F(ab')2 、Fab'、scFv、双链抗体、三链抗体、sdAb (单结构域抗体)、VNAR 或VHH。
16.根据权利要求12的融合蛋白，其中所述抗体类似物是亲和体、affilin、affimer、affitin、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer、Kunitz结构域肽、单抗体、repebody、VLR或nanoCLAMP。
17. 根据权利要求12的融合蛋白，其中所述Fc区是具有SEQ ID NO: 5或6的氨基酸序列的修饰的Fc区。
18. 根据权利要求12的融合蛋白，其中所述Fc区是修饰的Fc区，其中SEQ ID NO: 5或6的氨基酸序列中的第18个和第196个氨基酸分别由苏氨酸(T)和甲硫氨酸(M)取代。
19.根据权利要求12的融合蛋白，其中所述IL-10蛋白是其中基于人IL-10蛋白的成熟形式的第87个氨基酸异亮氨酸由丙氨酸取代的IL-10变体蛋白。
20.根据权利要求20的融合蛋白，其中所述IL-10蛋白是其中长度为6至12个a.a.的接头(间隔区)肽插入在基于人IL-10的成熟形式的第116个氨基酸天冬酰胺和第117个氨基酸赖氨酸之间的单体IL-10变体蛋白。
21.一种多核苷酸，其编码权利要求12至20中任一项的融合蛋白。
22.一种载体，其包含权利要求21的多核苷酸。
23.一种用于免疫抑制的药物组合物，其包含权利要求1至20中任一项的融合蛋白作为活性成分。
24.根据权利要求23的药物组合物，其中所述组合物用于已接受器官移植的患者的免疫抑制。
25.一种用于治疗自身免疫性疾病的药物组合物，其包含权利要求1至20中任一项的融合蛋白作为活性成分。
26.根据权利要求25的药物组合物，其中所述自身免疫性疾病是1型糖尿病、斑秃、抗磷脂抗体综合征、类风湿性关节炎、银屑病或银屑病关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、炎性肠病、艾迪生病、格雷夫斯病、干燥综合征、格巴二氏综合征、桥本氏甲状腺炎、重症肌无力、炎性肌病、自身免疫性血管炎、自身免疫性肝炎、出血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、原发性胆汁性肝硬化、硬皮病、白癜风、恶性贫血或慢性乳糜泻。
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