JP2022540187A - 新規融合タンパク質及びその用途 - Google Patents
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Abstract
本発明は新規融合タンパク質及びその用途に関し、より詳しくは、ＣＤ１５４に特異的に結合するＦａｂまたはｓｃＦｖ、及びＦｃ領域を含むＣＤ１５４に特異的に結合する融合タンパク質において、前記Ｆｃ領域はＦｃγ受容体に結合しないように変異された変形Ｆｃ領域である、ＣＤ１５４に特異的に結合する融合タンパク質に関する。【選択図】図３
Description
本発明は新規融合タンパク質及びその用途に関し、詳しくは、自己免疫疾患の治療に使用可能な新規融合タンパク質及びその用途に関する。
自己免疫疾患とは、体の細胞を外部物質と認識し、各種免疫反応によって細胞組織を破壊する現象である。代表的な自己免疫疾患としては、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬、炎症性腸疾患、多発性硬化症などがあり、このような自己免疫疾患はその原因が明確ではないため治療することが難しい。また、自己免疫疾患は移植された臓器が免疫発症を誘発こして発生することもある。よって、このような自己免疫疾患や自己免疫反応を抑制するために多様な免疫抑制剤の開発が求められている。
一般に使用されている免疫抑制剤としては、カルシニューリン抑制剤であるタクロリムス（ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）、遺伝子合成抑制剤であるミコフェノール酸モフェチル（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅｍｏｆｅｔｉｌ）、抗炎症ステロイドであるプレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）などがある。しかし、このような免疫抑制剤は長期間投与されるため深刻な副作用を誘発する恐れがある（Ｋａｌｌｕｒｉ ａｎｄ Ｈａｒｄｉｎｇｅｒ，Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｔｒａｎｓｌａｎｔ．２（４）：５１－６８，２０１２； Ｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｌａｎｔａｔｉｏｎ，９３（７）： ７０９－７１９，２０１２；Ｚａｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｎｓ ６（３）：８６９－８９１，２０１４）。
そこで、従来の免疫抑制剤を代替するか薬物の持続期間を増やすために多様な生物医薬品が開発されているが、そのうち一つが共刺激（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）抑制剤である。代表的な共刺激免疫反応としては、ＣＤ２８－ＣＤ８０／ＣＤ８６、ＣＴＬＡ４－ＣＤ８０／ＣＤ８６、ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）及びＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１などがあり、それを抑制するためにＣＴＬＡ４－Ｆｃ、抗－ＣＤ４０及び抗－ＣＤ１５４抗体などが上述した生物医薬品として研究されている（Ｋｉｎｎｅａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ９５（４）：５２７－５３５， ２０１３； Ｒｉｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１２（１０）：２５７５－２５８７，２０１２；Ｈａｒｄｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．３（４）：６８－７７，２０１３）。一方、ＣＤ４０はＢ細胞、マクロファージ 、胸腺上皮細胞のような抗原提示細胞だけでなく、上皮細胞及び線維芽細胞などの一般細胞でも発現される。ＣＤ４０Ｌとも知られているＣＤ１５４は活性化されたＴ細胞とナチュラルキラー（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ）細胞で主に発現される。ＣＤ４０－ＣＤ１５４信号伝達を介してＢ細胞とマクロファージが活性化されて間接的にＴ細胞も活性化させ、免疫反応を促進する（Ｋａｒｉｍｉ ａｎｄ Ｐｏｕｒ ｆａｔｈｏｌｌａｈ，Ｉｒａｎ．Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（１）：１－１３，２００１２）。
そこで、ＣＤ１５４の作用を調節することで免疫反応を抑制するために抗－ＣＤ１５４抗体が開発されたが、前記抗体はサルをはじめとする動物実験でよい効果を示している。しかし、人を対象とする臨床実験の結果、抗－ＣＤ１５４抗体は血栓の生成という深刻な副作用を示したため、現在ＣＤ１５４を標的にする抗体医薬品の開発は中断された状態である（Ｋａｌｕｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｈｅｕｍ．４６（１２）：３２５１－３２５８，２００２；Ｂｏｕｍｐａｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４８（３）： ７１９－７２７， ２００３； Ｐｉｌａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｒｇａｎ Ｔｒａｎｓｌａｎｔ．１７：３６８－３７５，２０１２）。
一方、ＩＬ－１０は免疫刺激活性という正反対の作用も有するという二重特性を有すると知られている。それに関し、詳しくは、ＩＬ－１０はＢ細胞の活性化を刺激し、Ｂ細胞の生存を延長し、Ｂ細胞のクラススイッチ（ｃｌａｓｓ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）に寄与する。また、ＮＫ細胞の増殖とサイトカインの生成を刺激し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の特定部分の集団の増殖を促進する成長因子の役割をする（Ｍｏｓｓｅｒ＆Ｙｈａｎｇ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２２６：２０５－２１８，２００９；Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：２６５８－２６６５，１９９９；Ｓａｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：４７２９－４７３７，２０００；Ｒｏｗｂｏｔｔｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３１８８－３１９３，１９９８）。人間において高容量（それぞれ２０及び２５μｇ／ｋｇ）のＩＬ－１０はＩＦＮγの生産を増加させると重要に報告されている（Ｌａｕｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６５：２７８３－２７８９，２０００；Ｔｉｌｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｕｔ ５０：１９１－１９５，２００２）。
前記のような血栓形成の原因は、抗－ＣＤ１５４抗体と血小板のＦｃγＲＩＩＩとの結合に起因すると知られている（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１－６６０４，２００１）。このような理由で、本出願人によって、ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩとの結合は維持するが、ＦｃγＲＩＩとの結合は遮断することで血栓の生成という副作用が低くなった新たな抗－ＣＤ１５４抗体が開発されている（ＷＯ２０１６／１８２３３５Ａ１）。
しかし、前記抗体は血栓の生成という副作用を完全に克服していないという側面から、医薬としての限界を有する短所がある。
本発明は上述した問題点を含み様々な問題点を解決するためのものであって、生体内に投与したら血栓が形成される可能性を除去しながらも、ＣＤ１５４の機能を効果的に遮断することで自己免疫疾患に対する治療効果を示す新たな抗－ＣＤ１５４融合タンパク質を提供することを目的とする。しかし、本発明の保護範囲は前記目的に制限されない。
本発明の一観点によると、ヒトＣＤ１５４に特異的に結合するＦａｂまたはｓｃＦｖ、及びＦｃ領域を含むＣＤ１５４に特異的に結合する融合タンパク質において、前記Ｆｃ領域はＦｃγ受容体に結合しないように変異された変形Ｆｃ領域である、融合タンパク質が提供される。
本発明の他の一観点によると、ａ）ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体の抗原－結合断片または抗体ミメティックと、ｂ）Ｆｃγ受容体に結合しないように変異された変形Ｆｃ領域と、ｃ）ＩＬ－１０タンパク質と、を順次に含む、融合タンパク質が提供される。
本発明のまた他の一観点によると、前記融合タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドが提供される。
本発明の更に他の一観点によると、前記ポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
本発明の更に他の一観点によると、前記融合タンパク質を有効成分として含む、免疫抑制用薬学的組成物が提供される。
本発明の更に他の一観点によると、前記融合タンパク質を有効成分として含む自己免疫疾患治療用薬学的組成物が提供される。
本発明の更に他の一観点によると、治療的に有効な量の前記融合タンパク質を自己免疫疾患の患者に投与する前記個体の自己免疫疾患の治療方法が提供される。
本発明の一実施例による融合タンパク質は、従来技術の抗－ＣＤ１５４抗体の短所である血栓形成の可能性を非常に下げた安全な物質であって、免疫抑制剤及び自己免疫疾患の治療剤として使用される。
本発明の一観点によると、ＣＤ１５４に特異的に結合するＦａｂまたはｓｃＦｖ、及びＦｃ領域を含むＣＤ１５４に特異的に結合する融合タンパク質において、前記Ｆｃ領域はＦｃγ受容体に結合しないように変異された変形Ｆｃ領域である、融合タンパク質が提供される。
前記融合タンパク質において、前記ＣＤ１５４に特異的に結合するＦａｂは、配列番号２で記載されるアミノ酸で構成される軽鎖（ＶL－ＣＬ）及び配列番号９で記載されるアミノ酸で構成される重鎖ＶＨ－ＣＨ１断片、または配列番号４で記載されるアミノ酸で配列構成される軽鎖（ＶL－ＣＬ）及び配列番号１１で記載されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＶＨ－ＣＨ１断片で構成される。
前記融合タンパク質において、前記ｓｃＦｖは、配列番号１４で記載されるアミノ酸配列で構成される軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び配列番号１５で記載されるアミノ酸配列で構成される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）がリンカーペプチドによって連結されているものである。前記リンカーペプチドは後述のもののうちいずれか一つを使用する。
前記融合タンパク質において、前記Ｆｃγ受容体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ１、ＦｃγＲＩＩＢ２、ＦｃγＲＩＩＩＡ、及び／またはＦｃγＲＩＩＩＢである。
前記融合タンパク質において、前記ＣＤ１５４に特異的に結合するＦａｂまたはｓｃＦｖ、及びＦｃ領域はヒンジまたはリンカーペプチドによって連結される。前記ヒンジは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはこれらのうち少なくとも２つ以上の混合されたハイブリッドヒンジである。前記ヒンジは、配列番号４０乃至４２のうちいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含む。前記リンカーペプチドは、融合タンパク質の融合パートナーの機能を阻害しないものであればいかなるものでも使用されるが、好ましくは下記に定義されたもののうちいずれか一つを使用する。
前記融合タンパク質において、前記Ｆｃ領域はＦｃγ受容体と実質的に結合しないように変異されたものであって、従来知られているＦｃγ受容体非結合性変異体であればいかなるものでも使用されるが、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥのＦｃ領域またはこれらのドメイン、例えば、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３の全部または一部が混合されたハイブリッドＦｃであってもよく、前記ＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４であってもよいが、特に、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲｃ）及び補体（Ｃ１ａ）に対する親和度が低いよう、Ｆｃの効果器（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）機能である抗体依存性細胞障害作用（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞障害作用（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）を担当する機能基部分に変異が誘導された変異体Ｆｃ及び／または胎児性Ｆｃ受容体（ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＦｃＲｎ）に対する選択的親和度が高くて血中半減期が増加されるように変異された変異体Ｆｃである。このうち、前記ハイブリッドＦｃは韓国特許第８９７９３８号、第１３８０７３２号、第１３８０７２９号などの記載のものを使用し、前記変異体Ｆｃは国際特許出願ＰＣＴ／ＫＲ２０２０／００６３４６に記載の変形免疫グロブリンＦｃタンパク質（ＮＴＩＧ）である。好ましくは、配列番号５または６のアミノ酸配列、または前記配列番号５または６のアミノ酸配列の１８番目アミノ酸がＴに、１９６番目アミノ酸配列がＭに変異されたもので構成された、変形Ｆｃ領域を使用する。
前記融合タンパク質は、前記Ｆｃ領域のＣ－末端にＩＬ－１０タンパク質が付加された形態である。
前記ＩＬ－１０タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ２２３０１に記載のアミノ酸配列から信号配列が除去された１９－１７８番目アミノ酸配列を含む成熟型（ｍａｔｕｒｅ ｆｏｒｍ）タンパク質であり、前記成熟型タンパク質の８７番目アミノ酸であるイソロイシンがアラニンに置換されたＩＬ－１０変異体タンパク質であり、１１６番目アミノ酸であるアスパラギンと１１７番目アミノ酸であるリシンの間に６乃至１２ａ．ａ．の長さを有するリンカー（スペーサー）ペプチドが挿入された単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質である。
本発明の他の一観点によると、ａ）ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体の抗原－結合断片または抗体ミメティックと、ｂ）Ｆｃγ受容体に結合しないように変異された変形Ｆｃ領域と、ｃ）ＩＬ－１０タンパク質と、を順次に含む、融合タンパク質が提供される。前記融合タンパク質において、前記抗体の抗原－結合断片はＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉａｂｏｄｙ、ｓｄＡｂ（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ＶＮＡＲまたはＶＨＨであり、前記抗体ミメティックはａｆｆｉｂｏｄｙ、ａｆｆｉｌｉｎ、ａｆｆｉｍｅｒ、ａｆｆｉｔｉｎ、ａｌｐｈａｂｏｄｙ、ａｎｔｉｃａｌｉｎ、ａｖｉｍｅｒ、ＤＡＲＰｉｎ、Ｆｙｎｏｍｅｒ、Ｋｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ、ｍｏｎｏｂｏｄｙ、ｒｅｐｅｂｏｄｙ、ＶＬＲ、またはｎａｎｏＣＬＡＭＰである。
前記融合タンパク質において、前記Ｆｃγ受容体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ１、ＦｃγＲＩＩＢ２、ＦｃγＲＩＩＩＡ、及び／またはＦｃγＲＩＩＩＢである。
前記融合タンパク質において、前記ａ）とｂ）の間、ｂ）とｃ）の間はヒンジまたはリンカーペプチドによって連結される。前記ヒンジは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはこれらのうち少なくとも２つ以上の混合されたハイブリッドヒンジである。前記ヒンジは、配列番号４０乃至４２のうちいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含む。前記リンカーペプチドは、融合タンパク質の融合パートナーの機能を阻害しないものであればいかなるものでも使用されるが、好ましくは下記に定義されたもののうちいずれか一つを使用する。
前記融合タンパク質において、前記Ｆｃ領域はＦｃγ受容体と実質的に結合しないように変異されたものであって、従来知られているＦｃγ受容体非結合性変異体であればいかなるものでも使用されるが、好ましくは、配列番号５または６のアミノ酸配列、または前記配列番号５または６のアミノ酸配列の１８番目アミノ酸がＴに、１９６番目アミノ酸がＭに変異されたもので構成された、変形Ｆｃ領域を使用する。
前記融合タンパク質において、前記ＩＬ－１０タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ２２３０１に記載のアミノ酸配列から信号配列が除去された１９－１７８番目アミノ酸配列を含む成熟型タンパク質であり、前記成熟型タンパク質の８７番目アミノ酸であるイソロイシンがアラニンに置換されたＩＬ－１０変異体タンパク質であり、１１６番目アミノ酸であるアスパラギンと１１７番目アミノ酸であるリシンの間に６乃至１２ａ．ａ．の長さを有するリンカー（スペーサー）ペプチドが挿入された単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質であり、配列番号７または８で記載されるアミノ酸配列で構成される。
本発明で使用される用語である「融合タンパク質」は、２つ以上のタンパク質またはタンパク質内の特定機能を担当するドメインがそれぞれのタンパク質またはドメインの本然の機能を担当するように連結された組換えタンパク質（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を意味する。前記２つ以上のタンパク質またはドメインの間には通常的に柔軟な構造を有するリンカーペプチド（ｌｉｎｋｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅ）が挿入される。前記リンカーペプチドは、ＡＡＧＳＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１6）、ＧＧＳＧＧ（配列番号１７）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１８）、ＧＧＧＳＧＧ（配列番号１９）、（Ｇ４Ｓ）ｎ（単位体：配列番号２０、ｎは１乃至１０の整数）、（ＧＧＳ）ｎ（ｎは１乃至１０の整数）、（ＧＳ）ｎ（ｎは１乃至１０の整数）、（ＧＳＳＧＧＳ）ｎ（単位体：配列番号２１、ｎは１乃至１０の整数）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号２２）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号２３）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号２４）、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（単位体：配列番号２５、ｎは１乃至１０の整数）、ＣＲＲＲＲＲＲＥＡＥＡＣ（配列番号２６）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａ（配列番号２７）、ＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２８）、ＧＧＧＧＧＧ（配列番号２９）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＡＫＡ（配列番号３０）、ＰＡＰＡＰ（配列番号３１）、（Ａｌａ－Ｐｒｏ）ｎ（ｎは１乃至１０の整数）、ＶＳＱＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶ（配列番号３２）、ＰＬＧＬＷＡ（配列番号３３）、ＴＲＨＲＱＰＲＧＷＥ（配列番号３４）、ＡＧＮＲＶＲＲＳＶＧ（配列番号３５）、ＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号３６）、ＧＦＬＧ（配列番号３７）、ＧＳＳＧＧＳＧＳＳＧＧＳＧＧＧＤＥＡＤＧＳＲＧＳＱＫＡＧＶＤＥ（配列番号３８）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳ（配列番号３９）、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣ（配列番号４０）、ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣ（配列番号４１）及びＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号４２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＫＥＫＥＥＱＥＥＲＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号４３）、ＲＮＴＧＲＧＧＥＥＫＫＧＳＫＥＫＥＥＱＥＥＲＥＴＫＴＰＥＣＰ（配列番号４４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号４５）、ＧＳＧＧＧＳＧＴＬＶＴＶＳＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号４６）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号４７）、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＫＮＴＴＡＰＡＴＴＲＮＴＴＲＧＧＥＥＫＫＫＥＫＥＫＥＥＱＥＥＲＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号４８）などが含まれる。特に、配列番号４０乃至４８は抗体由来のヒンジペプチドまたはヒンジとは異なるリンカーペプチドが混在するハイブリッドヒンジペプチドであって、ＣＤ１５４に特異的に結合するＦａｂがＦｃ領域と連結される際に使用すれば、抗体の基本的な構造がそのまま活用されるという点で有利である。
本文書で使用される用語である「抗体」は、免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）分子であって２つの同じ重鎖及び２つの同じ軽鎖が結合して生成される二重四量体タンパク質で前記軽鎖の可変領域（ＶＬ）及び前記重鎖の可変領域（ＶＨ）によって構成される抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）によって抗原特異的結合をし、それによって抗原特異的体液性免疫反応（ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を誘発する。
本文書で使用される用語である「抗体の抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、抗体から由来する抗原結合能を有する断片であって、抗体をタンパク質切断酵素で切断して生成された断片はもちろん、組換え方式で生成された単一鎖断片をいずれも含むが、これにはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉａｂｏｄｙ、ｓｄＡｂ、及びＶＨＨが含まれる。
本文書で使用される用語である「Ｆａｂ」は、抗原結合抗体断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ）であり、抗体分子をタンパク質分解酵素であるパパインで切断して生成される断片で、ＶＨ－ＣＨ１及びＶＬ－ＣＬの２つのペプチドの二量体であって、パパインによって生成された他の断片はＦｃ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）と称する。
本文書で使用される用語である「Ｆ（ａｂ’）２」は、抗体をタンパク質分解酵素であるペプシンで切断して生成される断片のうち抗原結合部位を含む断片であって、前記２つのＦａｂが二硫化結合で連結された四量体状を示す。ペプシンによって生成された他の断片はｐＦｃ’と称する。
本文書で使用される用語である「Ｆａｂ」は、前記Ｆ（ａｂ’）２を弱い還元条件で分離することで生成されるＦａｂと構造が類似した分子である。
本文書で使用される用語である「ｓｃＦｖ」は「ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ」の略語であって実際の抗体の断片ではないが、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）を約２５ａ．ａ．サイズのリンカーペプチドで連結して製造した一種の融合タンパク質であり、固有の抗体断片ではないにもかかわらず、抗原結合能を有すると知られている（Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９（６）：１３６２－１３６７，１９９０）。
本文書で使用される用語である「ｄｉａｂｏｄｙ」及び「ｔｒｉａｂｏｄｙ」は、それぞれ２つ及び３つのｓｃＦｖがリンカーによって連結された形態の抗体断片を意味する。
本文書で使用される用語である「ｓｄＡｂ（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）とも呼ばれる抗体の単一可変領域断片からなる抗体断片である。主に重鎖から由来するｓｄＡｂが使用されるが、軽鎖から由来する単一可変領域断片も抗原に対して特異的結合をすると報告されている。重鎖及び軽鎖からなる通常の抗体とは異なって、単一鎖の二量体のみからなるサメ抗体の可変領域断片からなるＶＮＡＲ、及びラクダ類抗体の可変領域断片からなるＶＨＨもｓｄＡｂに含まれる。
本文書で使用される「抗体ミメティック（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｉｍｅｔｉｃ）」は、２つの重鎖及び２つの軽鎖が異種四合体の４次構造を形成して機能を発揮する通常の全長抗体とは異なって、ｍｏｎｏｂｏｄｙ、可変性リンパ球受容体（ＶＬＲ）などのように非抗体由来のタンパク質の骨組から製造される抗体と類似した機能、つまり、抗原結合能を有するタンパク質を含む概念である。このような抗体ミメティックとしては、タンパク質ＡのＺドメイン由来のＡｆｆｉｂｏｄｙ（Ｎｙｇｒｅｎ，Ｐ．Ａ．，ＦＥＢＳ Ｊ．２７５（１１）：２６６８－２６７６，２００８）、Ｇａｍｍａ－Ｂ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎまたはＵｂｉｑｕｉｔｉｎ由来のＡｆｆｉｌｉｎ（Ｅｂｅｒｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７２（１）：１７２－１８５，２００７）、Ｃｙｓｔａｔｉｎ由来のＡｆｆｉｍｅｒ（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８４（１５）：６５５３－６５６０，２０１２）、Ｓａｃ７ｄ由来のＡｆｆｉｔｉｎ（Ｋｒｅｈｅｎｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８３ （５）：１０５８－１０６８，２００８）、Ｔｒｉｐｌｅ ｈｅｌｉｘ ｃｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌタンパク質由来のＡｌｐｈａｂｏｄｙ（Ｄｅｓｍｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．５：５２３７，２０１４）、ｌｉｐｏｃａｌｉｎ由来のＡｎｔｉｃａｌｉｎ（Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｊ．２７５（１１）：２６７７－２６８３，２００８）、多様な膜受容体のドメイン由来のＡｖｉｍｅｒ（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１２）：１５５６－１５６１，２００５）、Ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｍｏｔｉｆ由来のＤＡＲＰｉｎ（Ｓｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ．１３（１５－１６）：６９５－７０１，２００８）、Ｆｙｎタンパク質のＳＨ３ドメイン由来のＦｙｎｏｍｅｒ（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（５）：３１９６－３２０４，２００７）、多様なタンパク質阻害剤のＫｕｎｉｔｚドメイン由来のＫｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｎｉｘｏｎ ａｎｄ Ｗｏｏｄ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖ．９（２）：２６１－２６８，２００６）、フィブロネクチンの１０番目の第３型ドメイン由来のｍｏｎｏｂｏｄｙ（Ｋｏｉｄｅ ａｎｄ Ｋｏｉｄｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５２：９５－１０９，２００７）、炭水化物結合モジュール３２－２由来のｎａｎｏＣＬＡＭＰ（Ｓｕｄｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．１３４：１１４－１２４，２０１７）、ヌタウナギ由来の可変性リンパ球受容体（ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＶＬＲ）（Ｂｏｅｈｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：２０３－２２０，２０１２）、及び前記ＶＬＲを基に抗原親和性を向上させるように操作されたｒｅｐｅｂｏｄｙ（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ：Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０９：３２９９－３３０４，２０１２）などが含まれる。
本発明のまた他の一観点によると、前記融合タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドが提供される。
本発明の更に他の一観点によると、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターが提供される。
前記組換えベクターにおいて、前記ポリヌクレオチドは調節配列に作動可能に連結される遺伝子コンストラクトの形態で含まれる。
本文書で使用される用語である「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ）」とは、目的とする拡散配列（例えば、試験管内転写／翻訳システムで、または宿主細胞で）がその発現が行われるようにする方式で前記調節配列に連結されていることを意味する。
前記「調節配列」という用語は、プロモータ、エンハンサ、及び他の調節要素（例えば、ポリアデニル化信号）を含む意味である。調節配列には、多くの宿主細胞で目的とする核酸が恒常的に発現されるように指示すること、特定の組織細胞でのみ目的とする核酸が発現されるように指示すること（例えば、組織特異的調節配列）、そして特定信号によって発現が誘導されるように指示すること（例えば、誘導性調節配列）が含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、及び所望のタンパク質発現の水準などのような因子によって異なり得るということは当業者であれば理解できる。本発明の発現ベクターは宿主細胞に導入されて前記融合タンパク質を発現する。前記真核細胞及び原核細胞で発現を可能にする調節配列は当業者によく知られている。上述したように、これらは通常転写開始を担当する調節配列、及び選択的に転写物の転写終結及び安定化を担当するポリ－Ａ信号を含む。更なる調節配列は、転写調節因子以外にも翻訳増進因子及び／または天然組み合わせまたは異種性プロモータ領域を含む。例えば、哺乳類の宿主細胞で発現を可能にする可能な調節配列は、ＣＭＶ－ＨＳＶチミジンキナーゼプロモータ、ＳＶ４０、ＲＳＶ－プロモータ（ラウス肉腫ウイルス）、ヒト腎臓要素１α－プロモータ、糖質コルチコイド誘導性ＭＭＴＶ－プロモータ（モロニーマウス腫瘍ウイルス）、メタロチオネイン誘導性またはテトラシクリン誘導性プロモータ、またはＣＭＶ増幅剤またはＳＶ－４０増幅剤などのような増幅剤を含む。神経細胞内発現のために、神経細糸プロモータ（ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ－ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ＰＧＤＦ－プロモータ、ＮＳＥ－プロモータ、ＰｒＰ－プロモータ、またはｔｈｙ－１－プロモータなどが使用されるということが考慮されている。前記プロモータは当分野で知られており、文献（Ｃｈａｒｒｏｎ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２５７３９－２５７４５，１９９５）に記述されている。原核細胞内の発現のために、ｌａｃ－プロモータ、ｔａｃ－プロモータ、またはｔｒｐプロモータを含む多数のプロモータが開示されている。転写を開始する因子の他、前記調節配列は本発明の一実施例によるポリヌクレオチドの下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）にＳＶ－４０－ポリ－Ａ部位またはＴＫ－ポリ－Ａ部位のような転写終結信号を含む。本文書において、適当な発現ベクターは当分野で知られており、その例としては、Ｏｋａｙａｍａ－Ｂｅｒｇ ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐａｒｍａｃｉａ）、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）、ｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、ｐＧＸ－２７（特許第１４４２２５４号）、ｐＸ（Ｐａｇａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１１４４－１１４７，１９９２）、酵母ツーハイブリッド（ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ）ベクター、例えば、ｐＥＧ２０２及びｄｐＪＧ４－５（Ｇｙｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７５：７９１－８０３，１９９５）、または原核発現ベクター、例えば、λｇｔ１１またはｐＧＥＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）がある。本発明の核酸分子以外にも、ベクターは分泌信号を暗号化するポリヌクレオチドを更に含んでもよい。前記分泌信号は当業者によく知られている。そして、使用された発現システムによって、融合タンパク質を細胞区画に導くリーダ配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が本発明の一実施例によるポリヌクレオチドのコード配列に組み合わせられるが、好ましくは解読されたタンパク質またはそのタンパク質を細胞質周辺または細胞外媒質に直接分泌するリーダ配列である。
また、本発明のベクターは、例えば、標準組換えＤＮＡ技術によって製造されるが、標準組換えＤＮＡ技術には、例えば、平滑末端及び接着末端ライゲーション、適切な末端を提供するための制限酵素処理、不適合な結合を防止鵜するためにアルカリホスファターゼ処理によるリン酸基の除去、及びＴ４ ＤＮＡライゲーズによる酵素的連結などが含まれる。化学的合成または遺伝子組換え技術によって得られた信号ペプチドをコードするＤＮＡ、本発明の変異体ＩＬ－１０タンパク質またはそれを含む融合タンパク質を暗号化するＤＮＡを適切な調節配列が含まれているベクターに組み換えることで、本発明のベクターが製造される。前記調節配列が含まれているベクターは商業的に購入または製造することができるが、本発明の一実施例ではｐＢｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｖｅｃｔｏｒ（Ｇｅｎｅｘｉｎｅ， Ｉｎｃ．，韓国）、またはｐＡＤ１５ ｖｅｃｔｏｒを骨格ベクターとして使用している。
前記発現ベクターは分泌信号配列を暗号化するポリヌクレオチドを更に含むが、前記分泌信号配列は、細胞内で発現する組換えタンパク質の細胞外への分泌を誘導し、ｔＰＡ（ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）信号配列、ＨＳＶ ｇＤｓ（単純ヘルペスウィルス糖タンパク質Ｄｓ）信号配列、または成長ホルモン信号配列である。
本発明の一実施例による前記発現ベクターは宿主細胞で前記融合タンパク質を発現するようにする発現ベクターであり、前記発現ベクターはプラスミドベクター、ウィルスベクター、コスミドベクター、ファージミドベクター、ヒト人工染色体など、いかなる形態を示してもよい。
本発明の更に他の一観点によると、前記融合タンパク質を有効成分として含む、免疫抑制用薬学的組成物が提供される。
前記免疫抑制用薬学的組成物は、自己免疫疾患の治療や臓器移植を受けた患者の免疫抑制のために使用される。
本発明の更に他の一観点によると、前記融合タンパク質を有効成分として含む自己免疫疾患治療用薬学的組成物が提供される。
前記薬学的組成物は、公知の免疫抑制剤成分を更に含む。このような公知の免疫抑制剤としては、糖質コルチコイド、細胞増殖抑制剤（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ ａｇｅｎｔ）、抗－ＣＤ２０抗体、抗－ＣＤ３抗体、抗－ＩＬ－２抗体、イムノフィリン阻害剤（ｉｍｍｕｎｏｐｈｉｌｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、インターフェロンβ、オピオイド（ｏｉｐｏｉｄ）、ＴＮＦα結合タンパク質、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ）、フィンゴリモド（ｆｉｎｇｏｌｉｍｏｄ）、またはミリオシン（ｍｙｒｉｏｃｉｎ）である。前記糖質コルチコイドは、プレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、またはヒドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）であり、前記細胞増殖抑制剤はナイトロジェンマスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、白金錯体化合物（ｐｌａｔｉｎｕｍ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）、葉酸類似体（ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅ）、アザチオプリン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ）、メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、アントラサイクリン（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、マイトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、またはミトラマイシン（ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ）である。前記イムノフィリン阻害剤は、シクロスポリン（ｃｉｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）、タクロリムス（ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）、シロリムス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）、またはエベロリムス（ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）である。
前記薬学的組成物において、前記自己免疫疾患は、１型糖尿病、円形脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ ａｒｅａｔａ）、抗リン脂質抗体症候群（ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、関節リウマチ、乾癬または乾癬性関節炎、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｅｌｅｒｏｓｉｓ）、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）、炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ）、アジソン病（Ａｄｄｉｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、グレーブス病（Ｇｒａｖｅｓ’ ｄｉｓｅａｓｅ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｅｇｒｅｎ’ｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｌｉａｎ－Ｂａｒｒｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ハシモト甲状腺炎（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ’ｓ ｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ）、重症筋無力症（Ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ ｇｒａｖｉｓ）、炎症性筋疾患(ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｙｏｐｈａｔｈｙ)、自己免疫性血管炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）、自己免疫性肝炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、溶血性貧血（ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｎｅｍｉａ）、特発性血小板減少性紫斑病（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａ）、原発性胆汁性肝硬変（ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、強皮症（ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、白斑（ｖｉｔｉｌｉｇｏ）、悪性貧血（ｐｅｒｎｉｃｉｏｕｓ ａｎｅｍｉａ）、またはセリアック病（ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ）である。
前記組成物は薬学的に許容可能な担体を含むが、前記担体以外にも薬学的に許容可能な補助剤、賦形剤、または希釈剤を更に含んでもよい。
本文書で使用される用語である「薬学的に許容可能な」とは、生理学的に許容され、人に投与される際に通常胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応またはこれと類似した反応を起こさない組成物をいう。前記担体、賦形剤、及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱物油などが挙げられる。また、充填剤、抗凝固剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、及び防腐剤などを更に含んでもよい。
また、本発明の一実施例による薬学的組成物は、哺乳動物に投与する際、活性生物の迅速な放出、または持続または遅延された放出が可能であるように当業者に公知の方法を使用して剤形化される。剤形は、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアロゾル、軟質または硬質のセラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末の形態を含む。
本発明の一実施例による組成物は多様な経路で投与されるが、例えば、経口、非経口、例えば、坐剤、経皮、静脈、腹腔、筋肉内、病変内、鼻腔、脊椎管内投与で投与され、また、徐放型、または連続的または反復的放出のための移植装置を使用して投与される。投与回数は所望の範囲内で一日一回または数回に分けて投与し、投与期間も特に限らない。
本発明の一実施例による組成物は、一般に使用される薬学的に許容可能な担体と共に適合の形態で剤形化される。薬学的に許容可能な担体としては、例えば、水、適合のオイル、食塩水、水性グルコース、及びグリコールなどのような非経口投与用担体などがあり、安定化剤及び保存剤を更に含んでもよい。適合の安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、またはアスコルビン酸などのような抗酸化剤がある。適合の保存剤としては、ベンズアルコニウムクロリド、メチルまたはプロピルパラベン、及びクロロブタノールがある。また、本発明による組成物は、その投与方法や剤形によって、必要であれば懸濁剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、酸化防止剤などを適切に含んでもよい。前記例示したものをはじめ、本発明に適合の薬学的に許容可能な担体及び製剤は、文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、最新版］に詳細に記載されている。
前記組成物の患者に対する投与量は、患者の伸長、体表面積、年齢、投与される特定化合物、性別、投与時間及び経路、一般的な健康、及び同時に投与される他の薬物を含む多くの要素によって異なり得る。薬学的に活性のタンパク質は１００ｎｇ／体重（ｋｇ）－１０ｍｇ／体重（ｋｇ）の量で投与されるが、より好ましくは１乃至５００μｇ／ｋｇ（体重）で投与され、最も好ましくは５乃至５０μｇ／ｋｇ（体重）で投与されるが、前記要素を考慮して投与量が調節される。
本発明の更に他の一観点によって、治療的に有効な量の前記融合タンパク質を自己免疫疾患の患者に投与する前記個体の自己免疫疾患の治療方法が提供される。
本文書で使用される用語である「治療的に有効な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、医学的治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比率で疾患を治療するに十分な量を意味し、有効容量の水準は個体の種類及び重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出割合、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素、及びその他の医学分野でよく知られている要素によって決定される。本発明の組成物の治療的に有効な量は０．１ｍｇ／ｋｇ乃至１ｇ／ｋｇ、より好ましくは１ｍｇ／ｋｇ乃至５００ｍｇ／ｋｇであるが、有効投与量は患者の年齢、性別、及び状態によって適切に調整される。
以下、実施例及び実験例を介して本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は以下に開示される実施例及び実験例に限らず、互いに異なる様々な形態に具現されるものであって、以下の実施例及び実験例は本発明の開示を完全にし、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものである。
実施例１：キメラ抗－ＣＤ１５４抗体の製造
本発明者らは、ＷＯ２０１６／１８２３３５Ａ１に記載のマウス由来の抗－ＣＤ１５４抗体のＦｃ部位をヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部位に置換した抗体（Ｃ１０）の重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインにＦｃγＲＩＩα結合阻害変異体が導入された抗－ＣＤ１５４抗体を製造し、それを「Ｃ１０Ｍ」と命名した（図１）。
本発明者らは、ＷＯ２０１６／１８２３３５Ａ１に記載のマウス由来の抗－ＣＤ１５４抗体のＦｃ部位をヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部位に置換した抗体（Ｃ１０）の重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインにＦｃγＲＩＩα結合阻害変異体が導入された抗－ＣＤ１５４抗体を製造し、それを「Ｃ１０Ｍ」と命名した（図１）。
実験例１：キメラ抗－ＣＤ１５４抗体の血栓形成の分析
前記のように製造されたキメラ抗体Ｃ１０Ｍを野生型マウスとＦｃγＲＩＩα遺伝子が形質導入された形質転換マウスに１３８μｇ静脈注射した後、１０分後眼窩から採血しＥＤＴＡチューブに入れてＣＢＣ－ｐｌａｔｅｌｅｔ分析を行い、実験動物を犠牲させた後、肺を摘出して凍結薄片を製造し、組織染色を行うことで血栓形成の回数を計数した。
前記のように製造されたキメラ抗体Ｃ１０Ｍを野生型マウスとＦｃγＲＩＩα遺伝子が形質導入された形質転換マウスに１３８μｇ静脈注射した後、１０分後眼窩から採血しＥＤＴＡチューブに入れてＣＢＣ－ｐｌａｔｅｌｅｔ分析を行い、実験動物を犠牲させた後、肺を摘出して凍結薄片を製造し、組織染色を行うことで血栓形成の回数を計数した。
その結果、図２に示したように、実施例１のＣ１０Ｍの場合、従来の野生型ＩｇＧ１ Ｆｃが適用されたＣ１０に比べＦｃγＲＩＩα形質転換マウスにおける血栓形成を著しく下げてはいるが、野生型マウスに比べては発生する血栓に対しＦｃγＲＩＩα形質転換マウスから２倍以上の血栓が測定されて、血栓形成を完全に抑制することはできないと示された。
実施例２：融合タンパク質の製造
前記実施例１の結果から、本発明者らは、前記Ｃ１０Ｍ抗体のＦａｂ部分を、ＦｃγＲと結合しない変形されたＦｃ領域に連結した融合タンパク質を考案しており（図３）、前記変形されたＦｃ領域はＩｇＧ１のヒンジ部分はそのまま適用するが、ＩｇＤ及びＩｇＧ４のＣＨ２及びＣＨ３が混合された形態を導入することで、ＦｃγＲと結合しない変形されたＦｃ領域を導入した。
前記実施例１の結果から、本発明者らは、前記Ｃ１０Ｍ抗体のＦａｂ部分を、ＦｃγＲと結合しない変形されたＦｃ領域に連結した融合タンパク質を考案しており（図３）、前記変形されたＦｃ領域はＩｇＧ１のヒンジ部分はそのまま適用するが、ＩｇＤ及びＩｇＧ４のＣＨ２及びＣＨ３が混合された形態を導入することで、ＦｃγＲと結合しない変形されたＦｃ領域を導入した。
前記融合タンパク質は、前記Ｃ１０Ｍ抗体のＦａｂの重鎖部分（ＶＨ－ＣＨ１、配列番号９）を変形されたＦｃ領域（配列番号６）と連結したハイブリッド重鎖を暗号化するポリヌクレオチドを製造し、それをｐＢｉｓｐｅｃｉｆｉｃ発現ベクター（Ｇｅｎｅｘｉｎｅ，Ｉｎｃ．）に挿入した。併せて、前記Ｃ１０Ｍ抗体のＦａｂの軽鎖部分（ＶＬ－ＣＬ、配列番号２）を暗号化するポリヌクレオチドを、ｄｕａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ下でコントロールされるように前記ｐＢｉｓｐｅｃｉｆｉｃ 発現ベクターに挿入した。
前記で製造された発現ベクターはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社のＥｘｐｉＣＨＯ ｋｉｔを利用して一時的発現を行った。詳しくは、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ ｃｅｌｌに前記のように製造されたベクターコンストラクトとキット内に含まれているＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ試薬を混合した後、８％ＣＯ２及び３７℃の条件を備えている培養器で１日間培養してから、温度を３２℃まで下げて７日目まで培養を行った。
次に、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ捕獲精製を行い、非還元及び還元条件におけるＰＡＧＥ分析及びウェスタンブロット分析によって候補物質が精製されたのかを確認して、候補物質のｐＩ値を考慮した剤形化緩衝液の剤形化を行った。剤形化が完了された物質をＮａｎｏ ｄｒｏｐを利用して定量し、ＳＥＣ－ＨＰＬＣを利用して最終純度を確認した。
その結果、図４ａ及び４ｃに示したように、軽鎖及び重鎖が正常に発現されているだけでなく、非－還元条件で単一バンドで示されて、正常的な異種四量体を形成したことが分かった。併せて、ＳＥＣ－ＨＰＬＣの分析結果、純度は９７．９％で非常に高く示された。
そこで、本発明者らは、前記一時的発現結果から製造された前記キメラ抗体を「ＰＧ－４００－１」と命名し、それを安定的に生産する安定細胞株（ｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）を製造した。
詳しくは、ＰＧ－４１０－１タンパク質を発現する安定細胞株を開発するために、前記で製造された遺伝子コンストラクトをｓｕｂ－ｖｅｃｔｏｒ ｃｌｏｎｉｎｇステップを経てｐＧＰ３０発現ベクターにクローニングした。次に、前記発現ベクターをＣＨＯ ＤＧ４４（ｆｒｏｍ Ｄｒ．Ｃｈａｓｉｎ， Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＵＳＡ）細胞にＮｅｏｎ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍを利用して形質感染させた。１次スクリーニング過程でＨＴ（５－ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐａｍｉｎｅ）がない１０％ ｄＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，３００６７－３３４），ＭＥＭα（Ｇｉｂｃｏ，１２５６１，ＵＳＡ，Ｃａｔ Ｎｏ．１２５６１－０４９），ＨＴ＋（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ，１１０６７－０３０）培地を使用してＨＴ選別を行い、ＬＤＣ（Ｌｉｍｉｔｉｎｇ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ；９６ ｗｅｌｌｓ，３０ ｐｌａｔｅｓ）を行って最終細胞株を確保した。最終確保された細胞株をｈｙＣｅｌｌＣＨＯ培地４００ｍｌでＦｅｄ－ｂａｔｃｈ培養を行い、培養１５日目に収得された培養液に対してＰｒｏｔｅｉｎ Ａ精製を行って精製されたタンパク質を確認し、精製されたタンパク質はＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣによって量及び純度を分析した。
その結果、図４ｄに示したように、安定的細胞株で生産されたキメラ抗体も正常に発現されることが分かった。併せて、前記キメラ抗体は図４ｅに示したように、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析結果９９．９７％という非常に高い純度で精製されたことが分かった。
実験例２：ｈＣＤ４０Ｌ結合親和度の分析
本発明者らは、実施例２で製造されたキメラ抗体のｈＣＤ４０Ｌとの結合親和度をバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）分析によって分析した。
本発明者らは、実施例２で製造されたキメラ抗体のｈＣＤ４０Ｌとの結合親和度をバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）分析によって分析した。
そのために、まず本発明者らは、Ｄｉｐ ａｎｄ ＲｅａｄＴＭ Ａｍｉｎｅ Ｒｅａｃｔｉｖｅ ２ｎｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（ＡＲ２Ｇ） Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ｆｏｒｔｅＢｉｏ，Ｃａｔ Ｎｏ．１８－５０９２）を利用し、９６プレートにＣＤ４０Ｌタンパク質を付着した。詳しくは、９６ウェルプレートにＤ．Ｗ．２００μｌを分注した後、前記キットに含まれているａｍｉｎｅ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒを差し込んで１０分間水和させた。次に、Ｄ．Ｗ．２００μｌを更に分注した後、必要な試料量の１／２０でＥＤＣ：ＮＨＳを１：１で混合した後、Ｄ．Ｗ．に希釈して９６ウェルプレートに２００μｌずつ分注した。次に、ＣＤ４０Ｌタンパク質を１０ｍＭ酢酸ｐＨ ６．０溶液に５μｇ／ｍｌになるように希釈した後、前記９６ウェルプレートに２００μｌずつ添加した。次に、１Ｍエタノールアミンを２００μｌずつ９６ウェルプレートに添加した後、ＢｉｏｓｅｎｓｏｒプレートとサンプルプレートをＯｃｔｅｔ－Ｋ２機器に入れて測定した。測定終了後、サンプルプレートに１ｘ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液を２００μｌ添加した後、基底値（ｂａｓｅｌｉｎｅ）を決めた。次に、前記実施例１及び２でそれぞれ製造されたキメラ抗体（Ｃ１０Ｍ）及びキメラハイブリッド抗体（ＰＧ－４００）を多様な濃度（２００ｐＭ乃至１２．５ｎＭ）で１ｘ Ｋｉｎｅｔｉｃ緩衝液に希釈した後、サンプルプレートに２００μｌで分注し、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）－Ｋ２機器でＢＬＩ（Ｂｉｏ－ｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）を測定した。
その結果、図５及び表１に示したように、本発明の実施例１及び２でそれぞれ製造されたキメラ抗体及びキメラハイブリッド抗体は測定機器の限界のため１．０ｐＭ以下の値は区分することができなかったが、２つの物質はいずれもＣＤ４０Ｌに十分に高い親和度を有することが分かった。
実施例３：ヒト化ハイブリッド抗体の製造
本発明者らは、前記ＰＧ－４００－１にＦｃγＲと結合しない変形されたＦｃ領域を導入することで、従来のヒト抗体が有する短所を十分に改善したにもかかわらず、抗原結合部位が依然としてマウス由来抗体ということから、人体内不必要な免疫反応を誘発する恐れがあると判断し、より安全なハイブリッド抗体を製造するために、本発明の基盤になる抗体の抗原結合断片であるＦａｂの抗原決定基を除いた残りのフレームワーク部分をヒト抗体の配列に置換したヒト化抗体を考案し、それを「ＰＧ－４００－２」と命名した（表２及び表３）。ＰＧ－４００－１及びＰＧ－４００－２の場合、いずれもＣ－末端に他のタンパク質が融合されないため、変形ＦｃのＣ－末端がリシン（Ｋ）で終結する配列番号６のアミノ酸配列を有するものを使用した。
本発明者らは、前記ＰＧ－４００－１にＦｃγＲと結合しない変形されたＦｃ領域を導入することで、従来のヒト抗体が有する短所を十分に改善したにもかかわらず、抗原結合部位が依然としてマウス由来抗体ということから、人体内不必要な免疫反応を誘発する恐れがあると判断し、より安全なハイブリッド抗体を製造するために、本発明の基盤になる抗体の抗原結合断片であるＦａｂの抗原決定基を除いた残りのフレームワーク部分をヒト抗体の配列に置換したヒト化抗体を考案し、それを「ＰＧ－４００－２」と命名した（表２及び表３）。ＰＧ－４００－１及びＰＧ－４００－２の場合、いずれもＣ－末端に他のタンパク質が融合されないため、変形ＦｃのＣ－末端がリシン（Ｋ）で終結する配列番号６のアミノ酸配列を有するものを使用した。
併せて、本発明者らは、変形されたＦｃ領域のＣ－末端に免疫抑制活性を有するサイトカインであるＩＬ－１０タンパク質を配列番号１２のアミノ酸配列を有するリンカーペプチドで連結するように考案し、それを「ＰＧ－４１０」と命名した（表２）。前記ＰＧ－４１０の場合、Ｆｃ領域のＣ－末端にＩＬ－１０タンパク質が付加されるため、Ｆｃ領域のＣ－末端のリシン残基を除去した欠失型（配列番号５）を使用した。
ヒト化ハイブリッド抗体（ＰＧ－４００－２及びＰＧ－４１０）の重鎖構成
ヒト化ハイブリッド抗体（ＰＧ－４００－２及びＰＧ－４１０）の軽鎖構成
実施例４：抗－ＣＤ１５４ ｓｃＦｖ－変形Ｆｃ－ＩＬ－１０融合タンパク質の製造
本発明者らは、前記ヒト化抗－ＣＤ１５４抗体のＦａｂのうち可変領域部分を選別した後、それを利用してｓｃＦｖを考案して、それを前記実施例３で使用した抗－ＣＤ１５４抗体の重鎖コンストラクトのＶＨ－ＣＨ１部分の代わりに挿入することで、単一鎖基盤の抗体結合－断片融合タンパク質を考案し、それを「ＰＧ－４２０」と命名した（表４）。本実施例において、前記抗－ＣＤ４０Ｌ ｓｃＦｖは軽鎖可変領域（ＶＬ）－リンカー－重鎖可変領域（ＶＨ）で構成されているが、逆にＶＨ－リンカー－ＶＬの順に構成されるものを使用してもＣＤ４０Ｌ結合能が維持されるためそれを使用してもよく、リンカーの種類も多様な種類を使用してもよい。
本発明者らは、前記ヒト化抗－ＣＤ１５４抗体のＦａｂのうち可変領域部分を選別した後、それを利用してｓｃＦｖを考案して、それを前記実施例３で使用した抗－ＣＤ１５４抗体の重鎖コンストラクトのＶＨ－ＣＨ１部分の代わりに挿入することで、単一鎖基盤の抗体結合－断片融合タンパク質を考案し、それを「ＰＧ－４２０」と命名した（表４）。本実施例において、前記抗－ＣＤ４０Ｌ ｓｃＦｖは軽鎖可変領域（ＶＬ）－リンカー－重鎖可変領域（ＶＨ）で構成されているが、逆にＶＨ－リンカー－ＶＬの順に構成されるものを使用してもＣＤ４０Ｌ結合能が維持されるためそれを使用してもよく、リンカーの種類も多様な種類を使用してもよい。
抗－ＣＤ１５４ ｓｃＦｖ－変形Ｆｃ－ＩＬ－１０融合タンパク質（ＰＧ－４２０）の構成
実施例５：融合タンパク質試料の生産
前記実施例２の融合タンパク質の生産はヒト化抗体ではなくキメラ抗体の生産であり、実験室規模の少量生産である上、宿主細胞がＣＨＯ細胞でヒト細胞由来ではないため、生産されたタンパク質の糖鎖パターンがヒトタンパク質とは異なる側面が存在する。そこで、本発明者らは、宿主細胞をヒト細胞であるＨＥＫ２９３細胞に変更し、生産規模を３Ｌ規模に増やして、前記実施例３のヒト型組換え抗体（ＰＧ－４００及びＰＧ－４１０）が正常に生産されるのか否かを確認することにした。
前記実施例２の融合タンパク質の生産はヒト化抗体ではなくキメラ抗体の生産であり、実験室規模の少量生産である上、宿主細胞がＣＨＯ細胞でヒト細胞由来ではないため、生産されたタンパク質の糖鎖パターンがヒトタンパク質とは異なる側面が存在する。そこで、本発明者らは、宿主細胞をヒト細胞であるＨＥＫ２９３細胞に変更し、生産規模を３Ｌ規模に増やして、前記実施例３のヒト型組換え抗体（ＰＧ－４００及びＰＧ－４１０）が正常に生産されるのか否かを確認することにした。
５－１：ＰＧ－４００－２タンパク質の生産
前記実施例４で考案されたＰＧ－４００－２タンパク質の重鎖及び軽鎖をそれぞれ暗号化するポリヌクレオチドを製作した後、それを実施例２と類似してＮ２９３Ｆ Ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｙ－Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）に挿入した後、それをＨＥＫ２９３細胞に共形質感染した。共形質感染されたＨＥＫ２９３細胞に対して生物反応器を介して３７℃ ５％ＣＯ２条件で３Ｌ規模で６日間培養した後（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｇｉｂｃｏ）、タンパク質の発現可否を還元条件のＰＡＧＥ分析で確認した。その結果、図６ａで確認されるように、正常にタンパク質が生産されたことが分かった。次に、本発明者らは、前記細胞培養液をＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ｂｅａｄで充填されたカラムに積載し、親和性クロマトグラフィを行った後、ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（Ｄ－ＰＢＳ，ｐＨ ７．４）で洗浄し、０．１ ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ３．３）を入れてタンパク質を溶出させた。次に、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｃｕｌｕｍｎ，ｒｕｎｎｉｎｇ （Ｄ－ＰＢＳ，ｐＨ ７．４）及びｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｄ－ＰＢＳ，ｐＨ ７．４）を利用したゲルろ過によってタンパク質を更に精製した。
前記実施例４で考案されたＰＧ－４００－２タンパク質の重鎖及び軽鎖をそれぞれ暗号化するポリヌクレオチドを製作した後、それを実施例２と類似してＮ２９３Ｆ Ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｙ－Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）に挿入した後、それをＨＥＫ２９３細胞に共形質感染した。共形質感染されたＨＥＫ２９３細胞に対して生物反応器を介して３７℃ ５％ＣＯ２条件で３Ｌ規模で６日間培養した後（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｇｉｂｃｏ）、タンパク質の発現可否を還元条件のＰＡＧＥ分析で確認した。その結果、図６ａで確認されるように、正常にタンパク質が生産されたことが分かった。次に、本発明者らは、前記細胞培養液をＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ｂｅａｄで充填されたカラムに積載し、親和性クロマトグラフィを行った後、ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（Ｄ－ＰＢＳ，ｐＨ ７．４）で洗浄し、０．１ ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ３．３）を入れてタンパク質を溶出させた。次に、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｃｕｌｕｍｎ，ｒｕｎｎｉｎｇ （Ｄ－ＰＢＳ，ｐＨ ７．４）及びｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｄ－ＰＢＳ，ｐＨ ７．４）を利用したゲルろ過によってタンパク質を更に精製した。
前記で最終精製されたタンパク質を、還元及び非還元条件のＰＡＧＥ分析によってタンパク質の生産及び精製可否を確認した。その結果、図６ｂで確認されるように、高い純度で生成されたことが分かった。
次に、本発明者らは、前記生成されたタンパク質を事前に水和された再生セルロース（ＲＣ）チュービングに入れ、候補物質のｐＩ値に合う剤形化緩衝液（ＰＢＳ，ｐＨ ７．４）が入っている２Ｌビーカーに入れて、４℃の温度条件で一晩透析して剤形化を行った。剤形化が完了された物質に対してＮａｎｏ ｄｒｏｐを利用して定量し、ＳＥＣ－ＨＰＬＣを利用して最終純度を確認した。その結果、表５及び図６ｃで確認されるように、タンパク質の総生産量は１８４ｍｇで生産性は６１ｍｇ／Ｌであり、純度は９９．４％に至って非常に高純度に精製されたことが分かり、内毒素（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）の含量は０．３８ＥＵ／ｍｇ未満であることが分かった。
ＰＧ－４００－２試験試料の精製結果
よって、本発明の一実施例によるヒト化抗－ＣＤ１５４抗体（ＰＧ－４００－２）はヒト細胞で規模を増やしても高純度に生産されることが分かった。
よって、本発明の一実施例によるヒト化抗－ＣＤ１５４抗体（ＰＧ－４００－２）はヒト細胞で規模を増やしても高純度に生産されることが分かった。
５－２：ＰＧ－４１０タンパク質の生産
併せて、本発明者らは、前記実施例４で考案されたＰＧ－４１０タンパク質の重鎖及び軽鎖をそれぞれ暗号化するポリヌクレオチドを製作した後、前記実施例５－１と同じ方式でＮ２９３Ｆ Ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｙ－Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）にクローニングし、それをＨＥＫ２９３細胞に共形質感染した。
併せて、本発明者らは、前記実施例４で考案されたＰＧ－４１０タンパク質の重鎖及び軽鎖をそれぞれ暗号化するポリヌクレオチドを製作した後、前記実施例５－１と同じ方式でＮ２９３Ｆ Ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｙ－Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）にクローニングし、それをＨＥＫ２９３細胞に共形質感染した。
共形質感染されたＨＥＫ２９３細胞を培養規模を２．３Ｌに調整し、ゲルろ過ステップを省略したことを除いては前記実施例５－１と同じ方法で本発明の一実施例によるＰＧ－４１０タンパク質を精製した。
ＰＧ－４１０試験試料の精製結果
その結果、表６及び図７ａ乃至図７ｃで確認されるように、本発明の一実施例によるＩＬ－１０付加ヒト化抗－ＣＤ１５４抗体（ＰＧ－４１０）はゲルろ過ステップがなく、重鎖のＣ－末端に付加的なタンパク質（ＩＬ－１０Ｖｍ）が付加されているにもかかわらず高純度に精製されることが分かった。特に、タンパク質の生産性は培養規模がＰＧ－４００－２に比べてより小さかったにもかかわらず１２８．２ｍｇ／Ｌでより高く、内毒素の含量も０．０２１ＥＵ／ｍｇで非常に低く示された。
その結果、表６及び図７ａ乃至図７ｃで確認されるように、本発明の一実施例によるＩＬ－１０付加ヒト化抗－ＣＤ１５４抗体（ＰＧ－４１０）はゲルろ過ステップがなく、重鎖のＣ－末端に付加的なタンパク質（ＩＬ－１０Ｖｍ）が付加されているにもかかわらず高純度に精製されることが分かった。特に、タンパク質の生産性は培養規模がＰＧ－４００－２に比べてより小さかったにもかかわらず１２８．２ｍｇ／Ｌでより高く、内毒素の含量も０．０２１ＥＵ／ｍｇで非常に低く示された。
実験例３：ＣＤ１５４との結合親和度親和度の分析
本発明者らは、前記実施例４で考案されたＰＧ－４００－２及びＰＧ－４１０も実施例２で製造された融合タンパク質と同じくＣＤ１５４に特異的な結合をするのか否かを、Ｂｉｏ－ｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）分析によって分析した。
本発明者らは、前記実施例４で考案されたＰＧ－４００－２及びＰＧ－４１０も実施例２で製造された融合タンパク質と同じくＣＤ１５４に特異的な結合をするのか否かを、Ｂｉｏ－ｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）分析によって分析した。
詳しくは、平底９６ウェルブラックプレートに蒸留水２００μｌを分注した後、バイオセンサトレイを前記ブラックプレートの上に置き、アミンバイオセンサを差し込んで１０分間水和させた。初期基底線を決定するために、新しい９６ウェルブラック試料プレートに蒸留水２００μｌを分注した。次に、必要な量の１／２０でＥＤＣ：ＮＨＳを１：１で混合した後、蒸留水に希釈して、前記水和された９６ウェルブラック試料プレートに２００μｌずつ分注した。試料であるＣＤ１５４を１０ｍＭ硝酸溶液（ｐＨ ６．０）に５μｇ／ｍｌになるように希釈して、９６ウェルブラックプレートに２００μｌずつ分注した。次に、１Ｍエタノールアミンを９６ウェルブラックプレートに２００μｌずつ添加し、バイオセンサプレートと試料プレートをＯｃｔｅｔ（登録商標） Ｋ２ ＢＬＩ分析装置に挿入して、信号を測定ながらアミンセンサにＣＤ１５４を結合させた。測定完了後、９６ウェルブラック試料プレートを測定機器から取り出し、１ｘ ｋｉｎｅｔｉｃ ｂｕｆｆｅｒを２００μｌずつ追加して基底線を測定した。次に、分析対象体抗体であるＰＧ－４００－２／ＰＧ－４１０を濃度が２００～１２．５ｎＭになるように１ｘ ｋｉｎｅｔｉｃ ｂｕｆｆｅｒに順次希釈した後、９６ウェルブラックプレートに２００μｌずつ分注した。次に、前記９６ウェルブラックプレートをＯｃｔｅｔ（登録商標） Ｋ２ ＢＬＩ分析装置に挿入し、ＣＤ１５４と反応を行いながら信号を測定した。
ＰＧ－４００－２及びＰＧ－４１０に対するＢＬＩ分析結果
その結果、表７そして図８ａ及び図８ｂで確認されるように、ＰＧ－４００-2及びＰＧ－４１０はいずれもＣＤ１５４に特異的に結合することが分かった。特に、ＰＧ－４１０の場合、Ｋｏｎ値がＰＧ－４００-2に比べ約４．３倍程度低いが、Ｋｄｉｓ値は＜１Ｅ－０７で高い特定を示した。これはＰＧ－４１０がＰＧ－４００－２に比べＣＤ１５４に対する結合が多少遅く起こるが、結合後の解離速度はＰＧ－４１０に比べ高いため、全体的な結合力はＰＧ－４１０がより高いと示された（３，０００倍以上高い）。しかし、全体的にはＰＧ－４００－２及びＰＧ－４１０はいずれもＣＤ１５４に特異的に結合することが分かり、ＰＧ－４１０の場合、結合後の回路速度がより低いことがＣＤ１５４を発現するターゲット細胞でＩＬ－１０の効果を持続するのに役に立つと期待される。
その結果、表７そして図８ａ及び図８ｂで確認されるように、ＰＧ－４００-2及びＰＧ－４１０はいずれもＣＤ１５４に特異的に結合することが分かった。特に、ＰＧ－４１０の場合、Ｋｏｎ値がＰＧ－４００-2に比べ約４．３倍程度低いが、Ｋｄｉｓ値は＜１Ｅ－０７で高い特定を示した。これはＰＧ－４１０がＰＧ－４００－２に比べＣＤ１５４に対する結合が多少遅く起こるが、結合後の解離速度はＰＧ－４１０に比べ高いため、全体的な結合力はＰＧ－４１０がより高いと示された（３，０００倍以上高い）。しかし、全体的にはＰＧ－４００－２及びＰＧ－４１０はいずれもＣＤ１５４に特異的に結合することが分かり、ＰＧ－４１０の場合、結合後の回路速度がより低いことがＣＤ１５４を発現するターゲット細胞でＩＬ－１０の効果を持続するのに役に立つと期待される。
実験例４：ＩＬ－１０による免疫抑制活性の評価
本発明者らは、単量体性ＩＬ－１０変異体（ＩＬ－１０Ｖｍ）が重鎖のＣ－末端に付加された形態のヒト型組換え抗体（ＰＧ－４１０）のＩＬ－１０が本来の機能を発揮するのか否かを確認するために、免疫細胞の免疫反応に及ぼす影響を調べた。
本発明者らは、単量体性ＩＬ－１０変異体（ＩＬ－１０Ｖｍ）が重鎖のＣ－末端に付加された形態のヒト型組換え抗体（ＰＧ－４１０）のＩＬ－１０が本来の機能を発揮するのか否かを確認するために、免疫細胞の免疫反応に及ぼす影響を調べた。
詳しくは、培養中のマクロファージ株Ｒａｗ２６４．７細胞が入っているＴ７５フラスコの上澄み液を除去した後、ＰＢＳで一回洗浄した。ＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅ ３ｍｌを添加した後、３７℃培養器で３－５分間培養した。次に、新しい培地１０ｍｌをＴ７５フラスコに添加した後、プレートから分離された細胞浮遊液を５０ｍＬ遠心分離チューブに入れて、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次に、上澄み液を除去し、遠心分離チューブを手で数回弱く打撃して細胞を懸濁した。次に、培地５ｍＬで混合した後、細胞を計数した。細胞の濃度が１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように培地を添加して希釈した後、９６ウェル平底プレートに１００μｌずつ分注した。１０時間経過後、最終濃度が１０００～０．００３ｎＭになるように順次希釈されたＰＧ－４１０を９６ウェル平底プレートに５０μｌずつ処理した。２０分経過後、ＬＰＳ ４００ｎｇ／ｍｌを処理した。次に、３７℃培養器で１６時間培養し、翌日上澄み液を集め、ＴＮＦα ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を利用して製造会社のプロトコールに従ってＴＮＦαの濃度を測定した（図９）。一方、陽性対照群として組換えＩＬ－１０を使用した。
その結果、表８及び図９ｂで確認されるように、本発明の一実施例によるヒト型組換え抗体は組換えＩＬ－１０に比べ約１００倍程度の免疫抑制活性が低かった。
ＰＧ－４１０及びＩＬ－１０のマクロファージ免疫抑制活性の分析結果
実験例５：単回毒性評価
従来の組換えＩＬ－１０は投与濃度を上げるか繰り返し投与したら血液内のヘモグロビン濃度が減少することで貧血症状を起こし、血小板濃度が減少することで血小板減少症（ｔｈｒｏｍｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）を起こす副作用が報告されている（Ｔｉｌｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（４）：２２０４－２２０９，２００２；Ｆｅｄｏｒａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１９（６）：１４７３－１４８２，２０００）。そこで、本発明者らは、実施例４で製造されたＰＧ－４１０を対象に食品医薬品安全庁告示第２０１７－１８３号（２０１７年８月３０日）の「非臨床試験の管理基準」によるＧＬＰ適用試験を行うために、毒性検査をＢｉｏｔｏｘｔｅｃｈに依頼し実施した。
従来の組換えＩＬ－１０は投与濃度を上げるか繰り返し投与したら血液内のヘモグロビン濃度が減少することで貧血症状を起こし、血小板濃度が減少することで血小板減少症（ｔｈｒｏｍｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）を起こす副作用が報告されている（Ｔｉｌｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（４）：２２０４－２２０９，２００２；Ｆｅｄｏｒａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１９（６）：１４７３－１４８２，２０００）。そこで、本発明者らは、実施例４で製造されたＰＧ－４１０を対象に食品医薬品安全庁告示第２０１７－１８３号（２０１７年８月３０日）の「非臨床試験の管理基準」によるＧＬＰ適用試験を行うために、毒性検査をＢｉｏｔｏｘｔｅｃｈに依頼し実施した。
詳しくは、Ｂｉｏｔｏｘｔｅｃｈで実施する単回投与毒性試験法は下記のように行われた。５週齢のメスＩＣＲマウスを使用して毒性試験を行い、規定された飼育条件でケージ当たり３匹ずつ飼育した。１週間の順化期間を置き、その期間中に一般症状を観察して健康な動物のみ試験に使用し、飼料と水は自由に摂取するようにした。実験に使用された動物の体重を測定して各群の平均体重が均等になるようにし、個体識別は動物の尻尾に個体表示をし、飼育箱には個体識別カードを取り付けた。試験物質は滅菌生理食塩水を対照にしてＰＧ－４１０をマウスに一回静脈投与しており、投与直前の体重を基準にして最大３００ｍｇ／ｋｇを投与し剖検して毒性試験を検査した。
その結果、試験物資の投与に関して死亡率、一般症状、体重変化、及び肉眼的な剖検所見は観察されなかった。
実験例６：移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に関する動物実験
本発明者らは、本発明の一実施例によるヒト型組換え抗体ＰＧ－４１０が臓器移植の際に発生する主な副作用である移植片対宿主病の治療に使用可能であるのか否かを動物モデルを介した実験によって調べた。
本発明者らは、本発明の一実施例によるヒト型組換え抗体ＰＧ－４１０が臓器移植の際に発生する主な副作用である移植片対宿主病の治療に使用可能であるのか否かを動物モデルを介した実験によって調べた。
そのために、詳しくは、６週齢のオスＮＳＧマウスをＯｒｉｅｎｔｂｉｏから購入し、本試験を実施する動物室内で７日間順化過程を経て、毎日一般症状を観察した。動物供給先から提供した、試験系の病原体検査成績書を検討した結果、試験に影響を及ぼすような要因はなかった。順化期間中に健康と判定された動物の体重を順位化し、各群の平均体重が均一に分布するようにランダムに分配した。次に、試験物質を５ｍｐｋ（１００μｇ／ｈｅａｄ）に調整した後、試験物質は滅菌生理食塩水を対照にしてマウスにＧＶＨＤの誘導前、誘導後２８日目になる日に静脈投与した。試験物質を投与した翌日、ＮＳＧマウス２０頭に各頭当たり１×１０７ｃｅｌｌｓのヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を２００μｌずつ静脈投与した。ＰＢＭＣ投与前と投与後、週２回体重を測定した。ＧＶＨＤの誘発可否は、ＧＶＨＤの５つの医学的症状である体重減少（ｗｅｉｇｈｔ ｌｏｓｓ）、活動性（ａｃｔｉｖｉｔｙ）、姿勢（ｐｏｓｔｕｒｅ）、毛の状態（ｆｕｒ ｔｅｘｔｕｒｅ）、皮膚の状態（ｓｋｉｎ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）によって一週間に２回ずつ評価した。対照群としては担体を使用した。
その結果、図１０ｂ及び１０ｃで確認されるように、ＰＧ－４１０を投与した群は陰性対照群とは異なって体重減少が起こっておらず、陰性対照群に比べ生存率が著しく高く示された。
ＰＢＭＣ投与後のＧＶＨＤの発病と、投与されたＰＢＭＣから分化したヒトＣＤ４５＋白血球細胞の比率に密接な関連性があると報告されている（Ｅｈｘ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１９４３，２０１８）。そこで、陰性対照群及びＰＧ－４１０投与群を対象にヒトＰＢＭＣ投与７日、１４日、２１日、２８日、３５日、４２日に採決し、ヒトＣＤ４５＋細胞集団をフローサイトメトリーで分析した。詳しくは、ＰＢＭＣ投与７日目（Ｄ７）に確保した血液を９６ウェル丸底プレートに５０μｌずつ分析した。血液をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上澄み液を除去し、形成された細胞ペレットを０．５μｌ ａｑｕａ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｙｅを希釈した５０μｌ ＦＡＣＳ緩衝液に懸濁させて、４℃で２０分間反応させた。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、上澄み液を除去した後、各ウェルに抗体混合物（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４５、ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ４５）を５０μｌずつ入れて、常温で２０分間反応させた。次に、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、フローサイトメトリーを利用して分析した。前記分析をＰＢＭＣ投与１４、２１、２８、及び３５日目に同じく繰り返し行った。
その結果、図１１で確認されるように、ＧＶＨＤ発病機転の主な標示因子であるヒトＣＤ４５細胞集団が陰性対照群に比べＰＧ－４１０投与群で減少されていることが分かった。
実験例７：変形Ｆｃ領域の多様なＦｃγ受容体との結合親和度の分析
上述したように、本発明の一実施例で使用された変形Ｆｃ領域タンパク質はＦｃγ受容体との結合力が除去されるように考案された変異体である。そこで、本発明者らは、本発明の一実施例によって使用された前記変形Ｆｃ領域タンパク質が実際に多様なＦｃγ受容体と結合しないのか否かを調べることにした。
上述したように、本発明の一実施例で使用された変形Ｆｃ領域タンパク質はＦｃγ受容体との結合力が除去されるように考案された変異体である。そこで、本発明者らは、本発明の一実施例によって使用された前記変形Ｆｃ領域タンパク質が実際に多様なＦｃγ受容体と結合しないのか否かを調べることにした。
そのために、本発明の一実施例によって製造された抗－ＣＤ１５４抗体融合タンパク質に適用された変形Ｆｃ領域タンパク質（配列番号５または６）と同じアミノ酸配列を有する変形Ｆｃ領域タンパク質のＮ－末端に配列番号４９で記載されるアミノ酸配列を有するＧＬＰ－１受容体作用剤が配列番号４３で記載されるアミノ酸配列を有するリンカーペプチドで連結されたＧＬＰ－１Ｅ－Ｆｃ融合タンパク質（「ＰＧ－１１」と命名）を利用して、多様なＦｃγ受容体との結合親和度をＢＬＩ分析によって分析した。この際、対照群としてはＩｇＧ１系組換え抗体であるリツキシマブが使用された。その結果、図１２で確認されるように、ＩｇＧ１系抗体であるリツキシマブはＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩａと特異的に結合することに対し、本発明の一実施例によるＮＴＩＧを含む融合タンパク質であるＰＧ－１１はこれらの抗体受容体と特異的に結合しないことが分かった。
更に、本発明者らは、本発明の一実施例による前記ＧＬＰ－１Ｅ－Ｆｃ融合タンパク質とリツキシマブのＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、及びＦｃγＲＩＩＩｂとの結合親和度を比較分析した。その結果、図１３ａ乃至１３ｄで確認されるように、リツキシマブは前記３つのＦｃ受容体と特異的に結合すると確認されたが、本発明の一実施例による融合タンパク質は非常に弱い結合を示しており、センソグラムの形態からすると、これは非－特異的結合であると判断される。
前記で調べたように、本発明で使用された変形Ｆｃ領域タンパク質は多様なＦｃγ受容体と結合しないため、ＡＤＣＣやＣＤＣのような従来の抗体治療剤の意図しない副作用を最小化する。
本発明上述した実施例及び実験例を参考に説明されたがこれは例示に過ぎず、該当技術分野の通常の知識を有する者であれば、これから多様な変形及び均等な他の実施例が可能であることを理解できるはずである。よって、本発明の真の技術的保護範囲は、添付した特許請求の範囲の技術的思想によって決められるべきである。
本発明の一実施例による組換え融合タンパク質は、自己免疫疾患の治療剤の開発に有用に使用される。
Claims (26)
- ヒトＣＤ１５４に特異的に結合するＦａｂまたはｓｃＦｖ、及びＦｃ領域を含むＣＤ１５４に特異的に結合する融合タンパク質において、
前記Ｆｃ領域はＦｃγ受容体に結合しないように変異された変形Ｆｃ領域である、ＣＤ１５４に特異的に結合する融合タンパク質。 - 前記ヒトＣＤ１５４に特異的に結合するＦａｂは、配列番号２で記載されるアミノ酸で構成される軽鎖、及び配列番号９で記載されるアミノ酸で構成される重鎖ＶＨ－ＣＨ１断片、または
配列番号４で記載されるアミノ酸配列で構成される軽鎖、及び配列番号１１で記載されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＶＨ－ＣＨ１断片で構成される、請求項１に記載のＣＤ１５４に特異的に結合する融合タンパク質。 - 前記ｓｃＦｖは、配列番号１４で記載されるアミノ酸配列で構成される軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び配列番号１５で記載されるアミノ酸配列で構成される重鎖可変領域がリンカーペプチドによって連結されたものである、請求項１に記載のＣＤ１５４に特異的に結合する融合タンパク質。
- 前記Ｆｃγ受容体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ１、ＦｃγＲＩＩＢ２、ＦｃγＲＩＩＩＡ、及び／またはＦｃγＲＩＩＩＢである、請求項１に記載のＣＤ１５４に特異的に結合する融合タンパク質。
- 前記ヒトＣＤ１５４に特異的に結合するＦａｂまたはｓｃＦｖ、及びＦｃ領域は抗体由来のヒンジまたはリンカーペプチドによって連結される、請求項１に記載のＣＤ１５４に特異的に結合する融合タンパク質。
- 配列番号１で記載されるアミノ酸配列で構成されるＩｇ重鎖ペプチド、及び配列番号２で記載されるアミノ酸配列で構成されるＩｇ軽鎖ペプチド、または
配列番号３で記載されるアミノ酸配列で構成されるＩｇ重鎖ペプチド、及び配列番号４で記載されるアミノ酸配列で構成されるＩｇ軽鎖ペプチドで構成される、請求項１に記載のＣＤ１５４に特異的に結合する融合タンパク質。 - 前記Ｆｃ領域は配列番号５または６のアミノ酸配列で構成される、請求項１に記載のＣＤ１５４に特異的に結合する融合タンパク質。
- 前記Ｆｃ領域は配列番号５または６のアミノ酸配列の１８番目アミノ酸配列がＴに、１９６番目アミノ酸配列がＭに変異されたものである、請求項１に記載のＣＤ１５４に特異的に結合する融合タンパク質。
- Ｆｃ領域のＣ－末端にＩＬ－１０タンパク質が付加される、請求項１に記載のＣＤ１５４に特異的に結合する融合タンパク質。
- 前記ＩＬ－１０タンパク質は、ヒトＩＬ－１０タンパク質の成熟型（ｍａｔｕｒｅ ｆｏｒｍ）を基準に８７番目アミノ酸であるイソロイシンがアラニンに置換されたＩＬ－１０変異体タンパク質である、請求項９に記載のＣＤ１５４に特異的に結合する融合タンパク質。
- 前記ＩＬ－１０タンパク質は、ヒトＩＬ－１０タンパク質の成熟型を基準に１１６番目アミノ酸であるアスパラギンと１１７番目アミノ酸であるリシンの間に６乃至１２ａ．ａ．の長さを有するペプチドが挿入された単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質である、請求項１０に記載のＣＤ１５４に特異的に結合する融合タンパク質。
- ａ）ＣＤ１５４に特異的に結合する抗体の抗原－結合断片または抗体ミメティックと、
ｂ）Ｆｃγ受容体に結合しないように変異された変形Ｆｃ領域と、
ｃ）ＩＬ－１０タンパク質と、を順次に含む、ＣＤ１５４に特異的に結合する融合タンパク質。 - ａ）及びｂ）、及び／または、ｂ）及びｃ）の間には独立して少なくとも一つ以上のリンカーペプチドが含まれる、請求項１２に記載のＣＤ１５４に特異的に結合する融合タンパク質。
- 前記ａ）及びｂ）の間のリンカーペプチドは抗体由来のヒンジである、請求項１３に記載のＣＤ１５４に特異的に結合する融合タンパク質。
- 前記抗体の抗原－結合断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉａｂｏｄｙ、ｓｄＡｂ（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ＶＮＡＲまたはＶＨＨである、請求項１２に記載のＣＤ１５４に特異的に結合する融合タンパク質。
- 前記抗体ミメティックは、ａｆｆｉｂｏｄｙ、ａｆｆｉｌｉｎ、ａｆｆｉｍｅｒ、ａｆｆｉｔｉｎ、ａｌｐｈａｂｏｄｙ、ａｎｔｉｃａｌｉｎ、ａｖｉｍｅｒ、ＤＡＲＰｉｎ、Ｆｙｎｏｍｅｒ、Ｋｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ、ｍｏｎｏｂｏｄｙ、ｒｅｐｅｂｏｄｙ、ＶＬＲ、またはｎａｎｏＣＬＡＭＰである、請求項１２に記載のＣＤ１５４に特異的に結合する融合タンパク質。
- 前記Ｆｃ領域は配列番号５または６のアミノ酸配列で構成される、請求項１２に記載のＣＤ１５４に特異的に結合する融合タンパク質。
- 前記Ｆｃ領域は配列番号５または６のアミノ酸配列の１８番目アミノ酸配列がＴに、１９６番目アミノ酸配列がＭに変異されたものである、請求項１２に記載のＣＤ１５４に特異的に結合する融合タンパク質。
- 前記ＩＬ－１０タンパク質は、ヒトＩＬ－１０タンパク質の成熟型を基準に８７番目アミノ酸であるイソロイシンがアラニンに置換されたＩＬ－１０変異体タンパク質である、請求１２に記載のＣＤ１５４に特異的に結合する融合タンパク質。
- 前記ＩＬ－１０タンパク質は、ヒトＩＬ－１０タンパク質の成熟型を基準に１１６番目アミノ酸であるアスパラギンと１１７番目アミノ酸であるリシンの間に６乃至１０ａ．ａ．の長さを有するペプチドが挿入された単量体性ＩＬ－１０変異体タンパク質である、請求項１２に記載のＣＤ１５４に特異的に結合する融合タンパク質。
- 請求項１２乃至請求項２０のうちいずれか一項に記載の融合タンパク質を暗号化するポリヌクレオチド。
- 請求項２１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項１乃至請求項２０のうちいずれか一項に記載の融合タンパク質を有効成分として含む、免疫抑制用薬学的組成物。
- 臓器移植患者の免疫抑制に使用される、請求項２３に記載の薬学的組成物。
- 請求項１乃至請求項２０のうちいずれか一項に記載の融合タンパク質を有効成分として含む、自己免疫疾患治療用薬学的組成物。
- 前記自己免疫疾患は、１型糖尿病、円形脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ ａｒｅａｔａ）、抗リン脂質抗体症候群（ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、関節リウマチ、乾癬または乾癬性関節炎、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｅｌｅｒｏｓｉｓ）、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）、炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ）、アジソン病（Ａｄｄｉｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、グレーブス病（Ｇｒａｖｅｓ’ ｄｉｓｅａｓｅ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｅｇｒｅｎ’ｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｌｉａｎ－Ｂａｒｒｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ハシモト甲状腺炎（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ’ｓ ｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ）、重症筋無力症（Ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ ｇｒａｖｉｓ）、炎症性筋疾患(ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｙｏｐｈａｔｈｙ)、自己免疫性血管炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）、自己免疫性肝炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、溶血性貧血（ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｎｅｍｉａ）、特発性血小板減少性紫斑病（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａ）、原発性胆汁性肝硬変（ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、強皮症（ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、白斑（ｖｉｔｉｌｉｇｏ）、悪性貧血（ｐｅｒｎｉｃｉｏｕｓ ａｎｅｍｉａ）、またはセリアック病（ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ）である、請求項２５に記載の薬学的組成物。
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