CN104080909A

CN104080909A - 包含进入细胞内以形成免疫复合体的搬运体(载体)的药物

Info

Publication number: CN104080909A
Application number: CN201280068428.9A
Authority: CN
Inventors: 井川智之; 广庭奈绪香
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2011-11-30
Filing date: 2012-11-30
Publication date: 2014-10-01
Also published as: KR20140100532A; JP7441284B2; EP3517550A1; WO2013081143A1; CA2857159A1; JP2020055872A; US11820793B2; KR20210074395A; US20190218309A1; SG11201402750SA; JP6124800B2; HK1198771A1; CA3233142A1; CN113416257A; RU2739792C1; MX2018009688A; EP2787081A4; KR20230143201A; JPWO2013081143A1; SG10201609301QA

Abstract

通过形成包含含有两个以上抗原结合单元(表位)的抗原和两分子以上的抗原结合分子(例如抗体)的大的免疫复合体，可以加速含有两个以上抗原结合单元的抗原从血浆中消失，还发现通过利用该特征，并使用还具备离子依赖性抗原结合活性的抗原结合分子，由此进一步加速该抗原的消失，从而可以解决上述课题。

Description

包含进入细胞内以形成免疫复合体的搬运体(载体)的药物

技术领域

本发明提供：用于使抗原从血浆中消失的抗原结合分子的应用；使抗原从血浆中消失的方法，该方法包括给予抗原结合分子；药物组合物，该组合物包含可以使抗原从血浆中消失的抗原结合分子；用于使抗原从血浆中消失的抗原结合分子的筛选方法；以及用于使抗原从血浆中消失的抗原结合分子的制备方法。

背景技术

抗体在血浆中的稳定性高、副作用也少，因此作为药品而受到关注。其中，有多种IgG型抗体药物已上市，目前还有多种抗体药物正在开发中(非专利文献1和非专利文献2)。另一方面，作为可适用于第二代抗体药物的技术，人们开发了各种技术，有人报道了提高效应子功能、抗原结合能力、药物动力学、稳定性的技术、或者降低免疫原性风险的技术等(非专利文献3)。认为课题在于：由于抗体药物的给药量通常非常大，所以难以制备皮下给药制剂；以及制造成本高等。作为减少抗体药物的给药量的方法，人们在考虑提高抗体的药物动力学的方法和提高抗体与抗原的亲和力的方法。

作为提高抗体的药物动力学的方法，有人报道了恒定区的人工氨基酸取代(非专利文献4和5)。作为增强抗原结合能力、抗原中和能力的技术，有人报道了亲和力成熟技术(非专利文献6)，通过向可变区的CDR区等的氨基酸中导入突变，可以增强与抗原的结合活性。通过增强抗原结合能力，可以提高在体外的生物活性、或者可以减少给药量，还可以进一步提高在体内(生物体内)的药效(非专利文献7)。

另一方面，每1分子的抗体所能中和的抗原量取决于亲和力，通过增强亲和力，可以用少量的抗体中和抗原，可以通过各种方法增强抗体的亲和力(非专利文献6)。而且，只要与抗原进行共价键结合、并使亲和力达到无限大，就可以用1分子的抗体中和1分子的抗原(抗体为二价时，中和两分子的抗原)。但是，在现有方法中，1分子的抗体与1分子的抗原(抗体为二价时，与两分子的抗原结合)结合成为界限。另一方面，最近据报道，通过使用与抗原进行pH依赖性结合的抗原结合分子，可以实现一分子的抗原结合分子与多个分子的抗原结合(专利文献1、非专利文献8)。pH依赖性抗原结合分子在血浆中的中性条件下与抗原强力结合，而在核内体内的酸性条件下解离抗原。而且，在解离抗原后，该抗原结合分子通过FcRn再循环到血浆中时可以再次与抗原结合，因此可以利用一个pH依赖性抗原结合分子与多个抗原反复结合。

而且，有报道称：改变成增强中性条件下(pH7.4)的FcRn结合的pH依赖性抗原结合分子具有可以与抗原反复结合的效果、以及使抗原从血浆中消失的效果，因此通过给予这样的抗原结合分子，可以从血浆中除去抗原(专利文献2)。普通的包含IgG抗体Fc区的pH依赖性抗原结合分子，在中性条件下几乎看不到其与FcRn结合。因此，认为该抗原结合分子与抗原的复合体被摄入细胞内主要是非特异性摄入。根据该报告，与普通的包含IgG抗体Fc区的pH依赖性抗原结合分子相比，改变成增强中性条件下(pH7.4)的FcRn结合的pH依赖性抗原结合分子可以进一步加速该抗原的消失(专利文献2)。

与具有由FcRn介导的循环机制的抗体相比，抗原的血浆中滞留性非常短，所以抗原通过在血浆中与具有该循环机制(该结合是pH非依赖性的)的抗体结合，其血浆中滞留性通常会变长，血浆中抗原浓度上升。例如还认为：当血浆中抗原具有多种生理功能时，即使假设一种生理活性被抗体的结合所阻断，该抗原的血浆中浓度也会因抗体的结合而加重以其他生理功能作为病因的症状。从这样的观点考虑，在存在优选使血浆中的抗原消失的情形时，为了加速抗原的消失，有人报道了对增强如上所述的与FcRn的结合的Fc区进行改变的方法，但利用除此以外的方法来加速抗原消失的方法迄今未见报道。

需要说明的是，本发明中的现有技术文献如下所示。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第WO2009/125825号；

专利文献2：国际公开第WO2011/122011号；

非专利文献

非专利文献1：Monoclonal antibody successes in the clinic,Janice MReichert,Clark J Rosensweig,Laura B Faden & Matthew CDewitz,Nat.Biotechnol.(2005)23,1073-1078；

非专利文献2：Pavlou AK,Belsey MJ.,The therapeutic antibodies marketto 2008.,Eur.J.Pharm.Biopharm.(2005)59(3),389-396；

非专利文献3：Kim SJ,Park Y,Hong HJ.,Antibody engineering for thedevelopment of therapeutic antibodies.,Mol.Cells.(2005)20(1),17-29；非专利文献4：Hinton PR,Xiong JM,Johlfs MG,Tang MT,Keller S,Tsurushita N,J.Immunol.(2006)176(1),346-356；

非专利文献5：Ghetie V,Popov S,Borvak J,Radu C,Matesoi D,Medesan C,Ober RJ,Ward ES.,Nat.Biotechnol.(1997)15(7),637-640；

非专利文献6：Rajpal A,Beyaz N,Haber L,Cappuccilli G,Yee H,BhattRR,Takeuchi T,Lerner RA,CreaR.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(2005)102(24),8466-8471；

非专利文献7：Wu H,Pfarr DS,Johnson S,Brewah YA,Woods RM,Patel NK,White WI,Young JF,Kiener PA.,J.Mol.Biol.(2007)368,652-665；

非专利文献8：Igawa T等人,Nat.Biotechnol.(2010)28,1203-1207。

发明内容

发明所要解决的课题

本发明鉴于上述状况而设，其目的在于提供：用于使抗原从血浆中消失的抗原结合分子的应用；使抗原从血浆中消失的方法，该方法包括给予抗原结合分子；药物组合物，其包含可以使抗原从血浆中消失的抗原结合分子；用于使抗原从血浆中消失的抗原结合分子的筛选方法；以及用于使抗原从血浆中消失的抗原结合分子的制备方法。

用于解决课题的方法

本发明人为了达到上述目的而进行深入研究时，研制出一种可形成免疫复合体的抗原结合分子，该抗原结合分子包含(i)Fc区和(ii)两个以上的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域中的至少一个对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化，所述免疫复合体包含(a)两分子以上的所述抗原结合分子和(b)两分子以上的抗原，该抗原包含两个以上的抗原结合单元。另外，本发明人还发现该抗原结合分子可用于使抗原从血浆中消失。而且，本发明人发现该抗原结合分子作为药物组合物有效，同时还研制了使该抗原从血浆中消失的方法，该方法包括给予该抗原结合分子。另外，本发明者人还发现了具有上述性质的抗原结合分子的筛选方法，同时研发了它的制备方法，完成了本发明。

即，本发明提供以下的[1]～[29]。

[1]可形成免疫复合体的抗原结合分子在使该抗原从血浆中消失中的应用，是指包含(i)Fc区和(ii)两个以上的抗原结合结构域的抗原结合分子的应用，所述抗原结合结构域中的至少一个对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化；

所述免疫复合体包含(a)两分子以上的该抗原结合分子和(b)两分子以上的抗原，所述抗原包含两个以上的抗原结合单元。

[2][1]所述的应用，其中，离子浓度条件为钙离子浓度条件。

[3][2]所述的应用，其中，所述抗原结合结构域是在低钙离子浓度条件下对抗原的结合活性低于在高钙离子浓度条件下对抗原的结合活性的抗原结合结构域。

[4][1]～[3]中任一项所述的应用，其中，离子浓度条件为pH条件。

[5][4]所述的应用，其中，所述抗原结合结构域是在pH酸性范围内对抗原的结合活性低于在pH中性范围条件下对抗原的结合活性的抗原结合结构域。

[6][1]～[5]中任一项所述的应用，其中，包含两个以上的抗原结合单元的所述抗原为多聚体。

[7][6]所述的应用，其中，所述抗原为GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(肌肉生成抑制素)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFSF10(TRAILApo-2配体、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配体ODF、OPG配体)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配体、DR3配体)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配体、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配体AITR配体、TL6)、TNFSF1A(TNF-a肌联蛋白(Connectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40配体gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配体CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配体Apo-1配体、APT1配体)、TNFSF7(CD27配体CD70)、TNFSF8(CD30配体CD153)、TNFSF9(4-1BB配体CD137配体)、VEGF、IgE、IgA、IgG、IgM、RANKL、TGF-α、TGF-β、泛特异性的TGF-β或IL-8中的任一种。

[8][1]～[5]中任一项所述的应用，其中，包含两个以上的抗原结合单元的所述抗原为单体。

[9][1]～[8]中任一项所述的应用，其中，抗原结合分子为多特异性或多互补位的抗原结合分子、或者抗原结合分子混合物。

[10][1]～[9]中任一项所述的应用，其中，所述Fc区分别为SEQ IDNO:13、14、15或16中任一个所表示的Fc区。

[11][1]～[9]中任一项所述的应用，其中，所述Fc区为在pH酸性范围条件下对FcRn的结合活性与SEQ ID NO:13、14、15或16中任一个所表示的Fc区的结合活性相比增强的Fc区。

[12][11]所述的应用，其中，所述Fc区为下述Fc区：在SEQ IDNO:13、14、15或16中任一个所表示的Fc区的氨基酸序列中，选自以下的至少一个以上的氨基酸被取代的Fc区：以EU编号表示的238位、244位、245位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257位、258位、260位、262位、265位、270位、272位、279位、283位、285位、286位、288位、293位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、316位、317位、318位、332位、339位、340位、341位、343位、356位、360位、362位、375位、376位、377位、378位、380位、382位、385位、386位、387位、388位、389位、400位、413位、415位、423位、424位、427位、428位、430位、431位、433位、434位、435位、436位、438位、439位、440位、442位或447位的氨基酸。

[13][12]所述的应用，其中，所述Fc区为SEQ ID NO:13、14、15或16中任一个所表示的Fc区的氨基酸序列中以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸：

238位氨基酸为Leu；

244位氨基酸为Leu；

245位氨基酸为Arg；

249位氨基酸为Pro；

250位氨基酸为Gln或Glu中的任一个；或者

251位氨基酸为Arg、Asp、Glu或Leu中的任一个；

252位氨基酸为Phe、Ser、Thr或Tyr中的任一个；

254位氨基酸为Ser或Thr中的任一个；

255位氨基酸为Arg、Gly、Ile或Leu中的任一个；

256位氨基酸为Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Pro或Thr中的任一个；

257位氨基酸为Ala、Ile、Met、Asn、Ser或Val中的任一个；

258位氨基酸为Asp；

260位氨基酸为Ser；

262位氨基酸为Leu；

270位氨基酸为Lys；

272位氨基酸为Leu或Arg中的任一个；

279位氨基酸为Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一个；

283位氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一个；

285位氨基酸为Asn；

286位氨基酸为Phe；

288位氨基酸为Asn或Pro中的任一个；

293位氨基酸为Val；

307位氨基酸为Ala、Glu、Gln或Met中的任一个；

311位氨基酸为Ala、Glu、Ile、Lys、Leu、Met、Ser、Val或Trp中的任一个；

309位氨基酸为Pro；

312位氨基酸为Ala、Asp或Pro中的任一个；

314位氨基酸为Ala或Leu中的任一个；

316位氨基酸为Lys；

317位氨基酸为Pro；

318位氨基酸为Asn或Thr中的任一个；

332位氨基酸为Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser或Trp中的任一个；

339位氨基酸为Asn、Thr或Trp中的任一个；

341位氨基酸为Pro；

343位氨基酸为Glu、His、Lys、Gln、Arg、Thr或Tyr中的任一个；

375位氨基酸为Arg；

376位氨基酸为Gly、Ile、Met、Pro、Thr或Val中的任一个；

377位氨基酸为Lys；

378位氨基酸为Asp、Asn或Val中的任一个；

380位氨基酸为Ala、Asn、Ser或Thr中的任一个；

382位氨基酸为Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

385位氨基酸为Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser或Thr中的任一个；

386位氨基酸为Arg、Asp、Ile、Lys、Met、Pro、Ser或Thr中的任一个；

387位氨基酸为Ala、Arg、His、Pro、Ser或Thr中的任一个；

389位氨基酸为Asn、Pro或Ser中的任一个；

423位氨基酸为Asn；

427位氨基酸为Asn；

428位氨基酸为Leu、Met、Phe、Ser或Thr中的任一个；

430位氨基酸为Ala、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr中的任一个；

431位氨基酸为His或Asn中的任一个；

433位氨基酸为Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro或Ser中的任一个；

434位氨基酸为Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp或Tyr中的任一个；

436位氨基酸为Arg、Asn、His、Ile、Leu、Lys、Met或Thr中的任一个；

438位氨基酸为Lys、Leu、Thr或Trp中的任一个；

440位氨基酸为Lys；或者

442位氨基酸为Lys、308位氨基酸为Ile、Pro或Thr中的任一个。

[14][1]～[9]中任一项所述的应用，其中，所述Fc区为在pH中性范围条件下对FcRn的结合活性与SEQ ID NO:13、14、15或16中任一个所表示的Fc区的结合活性相比增强的Fc区。

[15][14]所述的应用，其中，所述Fc区为下述Fc区：在SEQ IDNO:13、14、15或16中任一个所表示的Fc区的氨基酸序列中，选自以下的至少一个以上的氨基酸被取代的Fc区：以EU编号表示的237位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265位、286位、289位、297位、298位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、315位、317位、332位、334位、360位、376位、380位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、424位、428位、433位、434位或436位。

[16][15]所述的应用，其中，所述Fc区为在SEQ ID NO:13、14、15、或16中任一个所表示的Fc区的氨基酸序列中，以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸：

237位氨基酸为Met；

248位氨基酸为Ile；

250位氨基酸为Ala、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp或Tyr中的任一个；

252位氨基酸为Phe、Trp或Tyr中的任一个；

254位氨基酸为Thr；

255位氨基酸为Glu；

256位氨基酸为Asp、Asn、Glu或Gln中的任一个；

257位氨基酸为Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr或Val中的任一个；

258位氨基酸为His；

265位氨基酸为Ala；

286位氨基酸为Ala或Glu中的任一个；

289位氨基酸为His；

297位氨基酸为Ala；

303位氨基酸为Ala；

305位氨基酸为Ala；

307位氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中的任一个；

308位氨基酸为Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln或Thr中的任一个；

309位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro或Arg中的任一个；

311位氨基酸为Ala、His或Ile中的任一个；

312位氨基酸为Ala或His中的任一个；

314位氨基酸为Lys或Arg中的任一个；

315位氨基酸为Ala、Asp或His中的任一个；

317位氨基酸为Ala；

332位氨基酸为Val；

334位氨基酸为Leu；

360位氨基酸为His；

376位氨基酸为Ala；

380位氨基酸为Ala；

382位氨基酸为Ala；

384位氨基酸为Ala；

385位氨基酸为Asp或His中的任一个；

386位氨基酸为Pro；

387位氨基酸为Glu；

389位氨基酸为Ala或Ser中的任一个；

424位氨基酸为Ala；

428位氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

433位氨基酸为Lys；

434位氨基酸为Ala、Phe、His、Ser、Trp或Tyr中的任一个；或者

436位氨基酸为His、Ile、Leu、Phe、Thr或Val。

[17][1]～[13]中任一项所述的应用，其中，所述Fc区包含对Fcγ受体的结合活性比天然型人IgG的Fc区对Fcγ受体的结合活性高的Fc区。

[18][17]所述的应用，其中，所述Fc区的氨基酸序列中，选自以下的至少一个以上的氨基酸包含与天然型人IgG的Fc区的氨基酸不同的氨基酸：以EU编号表示的221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位或440位。

[19][18]所述的应用，其中，所述Fc区的氨基酸序列中，包含以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸：

221位氨基酸为Lys或Tyr中的任一个；

222位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

223位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个；

224位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

225位氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个；

227位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

228位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

230位氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个；

231位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

232位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

233位氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

234位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

235位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

236位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

237位氨基酸为Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

238位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

239位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

240位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

241位氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

243位氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

244位氨基酸为His；

245位氨基酸为Ala；

246位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

247位氨基酸为Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中的任一个；

249位氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个；

250位氨基酸为Glu或Gln中的任一个；

251位氨基酸为Phe；

254位氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个；

255位氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个；

256位氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个；

258位氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个；

260位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

262位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个；

263位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

264位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一个；

265位氨基酸为Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

266位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

267位氨基酸为Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

268位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中的任一个；

269位氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

270位氨基酸为Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一个；

271位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

272位氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

273位氨基酸为Phe或Ile中的任一个；

274位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

275位氨基酸为Leu或Trp中的任一个；

276位氨基酸为、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

278位氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中的任一个；

279位氨基酸为Ala；

280位氨基酸为Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中的任一个；

281位氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

282位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

283位氨基酸为Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中的任一个；

284位氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一个；

285位氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中的任一个；

286位氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一个；

288位氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一个；

290位氨基酸为Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一个；

291位氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中的任一个；

292位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一个；

293位氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

294位氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

295位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

296位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中的任一个；

297位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

298位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

299位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中的任一个；

300位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中的任一个；

301位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

302位氨基酸为Ile；

303位氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一个；

304位氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一个；

305位氨基酸为Glu、Ile、Thr或Tyr中的任一个；

311位氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一个；

313位氨基酸为Phe；

315位氨基酸为Leu；

317位氨基酸为Glu或Gln；

318位氨基酸为His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中的任一个；

320位氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

322位氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

323位氨基酸为Ile；

324位氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

325位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

326位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

327位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

328位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

329位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

330位氨基酸为Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

331位氨基酸为Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

332位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；

333位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中的任一个；

334位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中的任一个；

335位氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中的任一个；

336位氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一个；

337位氨基酸为Glu、His或Asn中的任一个；

339位氨基酸为Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中的任一个；

376位氨基酸为Ala或Val中的任一个；

377位氨基酸为Gly或Lys中的任一个；

378位氨基酸为Asp；

379位氨基酸为Asn；

380位氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一个；

382位氨基酸为Ala或Ile中的任一个；

385位氨基酸为Glu；

392位氨基酸为Thr；

396位氨基酸为Leu；

421位氨基酸为Lys；

427位氨基酸为Asn；

428位氨基酸为Phe或Leu中的任一个；

429位氨基酸为Met；

434位氨基酸为Trp；

436位氨基酸为Ile；或者

440位氨基酸为Gly、His、Ile、Leu或Tyr中的任一个。

[20][1]～[16]中任一项所述的应用，其中，所述Fc区为对抑制型Fcγ受体的结合活性比对活性型Fcγ受体的结合活性高的Fc区。

[21][20]所述的应用，其中，所述抑制型Fcγ受体为人FcγRIIb。

[22][20]或[21]中任一项所述的应用，其中，所述活性型Fcγ受体为人FcγRIa、人FcγRIIa(R)、人FcγRIIa(H)、人FcγRIIIa(V)或人FcγRIIIa(F)。

[23][20]～[22]中任一项所述的应用，其中，所述Fc区的以EU编号表示的238位或328位的氨基酸包含与天然型人IgG的Fc区的氨基酸不同的氨基酸。

[24][23]所述的应用，其中，所述Fc区的以EU编号表示的238位氨基酸为Asp、或者328位氨基酸为Glu。

[25][23]或[24]所述的应用，其中，所述Fc区的氨基酸序列中，包含以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸：

233位氨基酸为Asp；

234位氨基酸为Trp或Tyr中的任一个；

237位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Leu、Met、Phe、Trp或Tyr中的任一个；

239位氨基酸为Asp；

267位氨基酸为Ala、Gln或Val中的任一个；

268位氨基酸为Asn、Asp或Glu中的任一个；

271位氨基酸为Gly；

326位氨基酸为Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、Leu、Met、Ser或Thr中的任一个；

330位氨基酸为Arg、Lys或Met中的任一个；

323位氨基酸为Ile、Leu或Met中的任一个；或者

296位氨基酸为Asp。

[26]具有使抗原从血浆中消失的功能的抗原结合分子的筛选方法，该方法包括以下的步骤(a)～(i)：

步骤(a)，得到对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；

步骤(b)，得到编码上述步骤(a)中选择的抗原结合结构域的基因；

步骤(c)，将上述步骤(b)中得到的基因与编码Fc区的基因进行有效连接；

步骤(d)，培养宿主细胞，所述宿主细胞包含在上述步骤(c)中进行了有效连接的基因；

步骤(e)，从上述步骤(d)中得到的培养液中分离抗原结合分子；

步骤(f)，使上述步骤(e)中得到的抗原结合分子与抗原接触；

步骤(g)，评价包含该抗原结合分子和该抗原的免疫复合体的形成。

[27]具有使抗原从血浆中消失的功能的抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下的步骤(a)～(d)：

步骤(a)，使包含Fc区和两个以上的抗原结合结构域的抗原结合分子与抗原接触，所述抗原结合结构域中的至少一个是对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；

步骤(b)，评价包含该抗原结合分子和该抗原的免疫复合体的形成；

步骤(c)，培养包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码在上述步骤(b)中确认到免疫复合体的形成的抗原结合分子的基因；

步骤(d)，从上述步骤(c)中得到的培养液中分离抗原结合分子。

[28]具有使抗原从血浆中消失的功能的抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下的步骤(a)～(i)：

步骤(f)，使上述步骤(e)中得到的抗原结合分子与抗原接触；

步骤(g)，评价包含该抗原结合分子和该抗原的免疫复合体的形成；

步骤(h)，培养包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码在上述步骤(g)中确认到免疫复合体的形成的抗原结合分子的基因；

步骤(i)，从上述步骤(h)中得到的培养液中分离抗原结合分子。

[29]具有使抗原从血浆中消失的功能的抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下的步骤(a)～(e)，还包括如下步骤：使通过该制备方法得到的抗原结合分子与抗原接触，以评价包含该抗原结合分子和该抗原的免疫复合体的形成；

步骤(e)，从上述步骤(d)中得到的培养液中分离抗原结合分子。

需要说明的是，上述的[1]～[25]可以换成以下的另一种表达方式：

[1’]包含可形成免疫复合体的抗原结合分子的、用于使该抗原从血浆中消失的药物组合物，该药物组合物是包含(i)Fc区和(ii)两个以上的抗原结合结构域的抗原结合分子的应用，所述抗原结合结构域中的至少一个是对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；

[2’][1’]所述的药物组合物，其中，离子浓度条件为钙离子浓度条件。

[3’][2’]所述的药物组合物，其中，所述抗原结合结构域是在低钙离子浓度条件下对抗原的结合活性比在高钙离子浓度条件下对抗原的结合活性低的抗原结合结构域。

[4’][1’]～[3’]中任一项所述的药物组合物，其中，离子浓度条件为pH条件。

[5’][4’]所述的药物组合物，其中，所述抗原结合结构域是在pH酸性范围对抗原的结合活性比在pH中性范围条件下对抗原的结合活性低的抗原结合结构域。

[6’][1’]～[5’]中任一项所述的药物组合物，其中，包含两个以上的抗原结合单元的所述抗原为多聚体。

[7’][6’]所述的药物组合物，其中，所述抗原为GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(肌肉生成抑制素)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFSF10(TRAILApo-2配体、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配体ODF、OPG配体)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配体、DR3配体)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配体、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配体AITR配体、TL6)、TNFSF1A(TNF-a肌联蛋白(Connectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40配体gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配体CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配体Apo-1配体、APT1配体)、TNFSF7(CD27配体CD70)、TNFSF8(CD30配体CD153)、TNFSF9(4-1BB配体CD137配体)、VEGF、IgE、IgA、IgG、IgM、RANKL、TGF-α、TGF-β、泛特异性的TGF-β或IL-8中的任一种。

[8’][1’]～[5’]中任一项所述的药物组合物，其中，包含两个以上的抗原结合单元的所述抗原为单体。

[9’][1’]～[8’]中任一项所述的药物组合物，其中，抗原结合分子为多特异性或多互补位的抗原结合分子、或者抗原结合分子混合物。

[10’][1’]～[9’]中任一项所述的药物组合物，其中，所述Fc区分别为SEQ ID NO:13、14、15或16中任一个所表示的Fc区。

[11’][1’]～[9’]中任一项所述的药物组合物，其中，所述Fc区为在pH酸性范围条件下对FcRn的结合活性与SEQ ID NO:13、14、15或16中任一个所表示的Fc区的结合活性相比增强的Fc区。

[12’][11’]所述的药物组合物，其中，所述Fc区为下述Fc区：在SEQ ID NO:13、14、15或16中任一个所表示的Fc区的氨基酸序列中，选自以下的至少一个以上的氨基酸被取代的Fc区：以EU编号表示的238位、244位、245位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257位、258位、260位、262位、265位、270位、272位、279位、283位、285位、286位、288位、293位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、316位、317位、318位、332位、339位、340位、341位、343位、356位、360位、362位、375位、376位、377位、378位、380位、382位、385位、386位、387位、388位、389位、400位、413位、415位、423位、424位、427位、428位、430位、431位、433位、434位、435位、436位、438位、439位、440位、442位或447位。

[13’][12’]所述的药物组合物，其中，所述Fc区为在SEQ ID NO:13、14、15或16中任一个所表示的Fc区的氨基酸序列中，以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸：

238位氨基酸为Leu；

244位氨基酸为Leu；

245位氨基酸为Arg；

249位氨基酸为Pro；

250位氨基酸为Gln或Glu中的任一个；或者

251位氨基酸为Arg、Asp、Glu或Leu中的任一个；

252位氨基酸为Phe、Ser、Thr或Tyr中的任一个；

254位氨基酸为Ser或Thr中的任一个；

255位氨基酸为Arg、Gly、Ile或Leu中的任一个；

257位氨基酸为Ala、Ile、Met、Asn、Ser或Val中的任一个；

258位氨基酸为Asp；

260位氨基酸为Ser；

262位氨基酸为Leu；

270位氨基酸为Lys；

272位氨基酸为Leu或Arg中的任一个；

285位氨基酸为Asn；

286位氨基酸为Phe；

288位氨基酸为Asn或Pro中的任一个；

293位氨基酸为Val；

307位氨基酸为Ala、Glu、Gln或Met中的任一个；

309位氨基酸为Pro；

312位氨基酸为Ala、Asp或Pro中的任一个；

314位氨基酸为Ala或Leu中的任一个；

316位氨基酸为Lys；

317位氨基酸为Pro；

318位氨基酸为Asn或Thr中的任一个；

339位氨基酸为Asn、Thr或Trp中的任一个；

341位氨基酸为Pro；

343位氨基酸为Glu、His、Lys、Gln、Arg、Thr或Tyr中的任一个；

375位氨基酸为Arg；

376位氨基酸为Gly、Ile、Met、Pro、Thr或Val中的任一个；

377位氨基酸为Lys；

378位氨基酸为Asp、Asn或Val中的任一个；

380位氨基酸为Ala、Asn、Ser或Thr中的任一个；

387位氨基酸为Ala、Arg、His、Pro、Ser或Thr中的任一个；

389位氨基酸为Asn、Pro或Ser中的任一个；

423位氨基酸为Asn；

427位氨基酸为Asn；

428位氨基酸为Leu、Met、Phe、Ser或Thr中的任一个；

431位氨基酸为His或Asn中的任一个；

433位氨基酸为Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro或Ser中的任一个；

434位氨基酸为Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp或Tyr中的任一个；

438位氨基酸为Lys、Leu、Thr或Trp中的任一个；

440位氨基酸为Lys；或者

442位氨基酸为Lys、308位氨基酸为Ile、Pro或Thr中的任一个。

[14’][1’]～[9’]中任一项所述的药物组合物，其中，所述Fc区为在pH中性范围条件下对FcRn的结合活性与SEQ ID NO:13、14、15或16中任一个所表示的Fc区的结合活性相比增强的Fc区。

[15’][14’]所述的药物组合物，其中，所述Fc区是下述Fc区：在SEQ ID NO:13、14、15或16中任一个所表示的Fc区的氨基酸序列中，选自以下的至少一个以上的氨基酸被取代的Fc区：以EU编号表示的237位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265位、286位、289位、297位、298位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、315位、317位、332位、334位、360位、376位、380位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、424位、428位、433位、434位或436位。

[16’][15’]所述的药物组合物，其中，所述Fc区为在SEQ ID NO:13、14、15或16中任一个所表示的Fc区的氨基酸序列中，以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸：

237位氨基酸为Met；

248位氨基酸为Ile；

252位氨基酸为Phe、Trp或Tyr中的任一个；

254位氨基酸为Thr；

255位氨基酸为Glu；

256位氨基酸为Asp、Asn、Glu或Gln中的任一个；

258位氨基酸为His；

265位氨基酸为Ala；

286位氨基酸为Ala或Glu中的任一个；

289位氨基酸为His；

297位氨基酸为Ala；

303位氨基酸为Ala；

305位氨基酸为Ala；

309位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro或Arg中的任一个；

311位氨基酸为Ala、His或Ile中的任一个；

312位氨基酸为Ala或His中的任一个；

314位氨基酸为Lys或Arg中的任一个；

315位氨基酸为Ala、Asp或His中的任一个；

317位氨基酸为Ala；

332位氨基酸为Val；

334位氨基酸为Leu；

360位氨基酸为His；

376位氨基酸为Ala；

380位氨基酸为Ala；

382位氨基酸为Ala；

384位氨基酸为Ala；

385位氨基酸为Asp或His中的任一个；

386位氨基酸为Pro；

387位氨基酸为Glu；

389位氨基酸为Ala或Ser中的任一个；

424位氨基酸为Ala；

433位氨基酸为Lys；

434位氨基酸为Ala、Phe、His、Ser、Trp或Tyr中的任一个；或者

436位氨基酸为His、Ile、Leu、Phe、Thr或Val。

[17’][1’]～[13’]中任一项所述的药物组合物，其中，所述Fc区包含对Fcγ受体的结合活性比天然型人IgG的Fc区对Fcγ受体的结合活性高的Fc区。

[18’][17’]所述的药物组合物，其中，在所述Fc区的氨基酸序列中，选自以下的至少一个以上的氨基酸包含与天然型人IgG的Fc区的氨基酸不同的氨基酸：以EU编号表示的221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位或440位。

[19’][18’]所述的药物组合物，其中，在所述Fc区的氨基酸序列中，包含以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸：

221位氨基酸为Lys或Tyr中的任一个；

222位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

223位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个；

224位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

225位氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个；

227位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

228位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

230位氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个；

231位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

232位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

240位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

241位氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

243位氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

244位氨基酸为His；

245位氨基酸为Ala；

246位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

249位氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个；

250位氨基酸为Glu或Gln中的任一个；

251位氨基酸为Phe；

254位氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个；

255位氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个；

256位氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个；

258位氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个；

260位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

262位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个；

263位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

266位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

273位氨基酸为Phe或Ile中的任一个；

275位氨基酸为Leu或Trp中的任一个；

279位氨基酸为Ala；

281位氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

282位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

284位氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一个；

285位氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中的任一个；

286位氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一个；

288位氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一个；

291位氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中的任一个；

292位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一个；

301位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

302位氨基酸为Ile；

303位氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一个；

304位氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一个；

305位氨基酸为Glu、Ile、Thr或Tyr中的任一个；

311位氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一个；

313位氨基酸为Phe；

315位氨基酸为Leu；

317位氨基酸为Glu或Gln；

323位氨基酸为Ile；

334位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中的任一个；

336位氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一个；

337位氨基酸为Glu、His或Asn中的任一个；

376位氨基酸为Ala或Val中的任一个；

377位氨基酸为Gly或Lys中的任一个；

378位氨基酸为Asp；

379位氨基酸为Asn；

380位氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一个；

382位氨基酸为Ala或Ile中的任一个；

385位氨基酸为Glu；

392位氨基酸为Thr；

396位氨基酸为Leu；

421位氨基酸为Lys；

427位氨基酸为Asn；

428位氨基酸为Phe或Leu中的任一个；

429位氨基酸为Met；

434位氨基酸为Trp；

436位氨基酸为Ile；或者

440位氨基酸为Gly、His、Ile、Leu或Tyr中的任一个。

[20’][1]～[16’]中任一项所述的药物组合物，其中，所述Fc区为对抑制型Fcγ受体的结合活性比对活性型Fcγ受体的结合活性高的Fc区。

[21’][20’]所述的药物组合物，其中，所述抑制型Fcγ受体为人FcγRIIb。

[22’][20’]或[21’]中任一项所述的药物组合物，其中，所述活性型Fcγ受体为人FcγRIa、人FcγRIIa(R)、人FcγRIIa(H)、人FcγRIIIa(V)或人FcγRIIIa(F)。

[23’][20’]～[22’]中任一项所述的药物组合物，其中，所述Fc区的以EU编号表示的238位或328位氨基酸包含与天然型人IgG的Fc区的氨基酸不同的氨基酸。

[24’][23’]所述的药物组合物，其中，所述Fc区的以EU编号表示的238位氨基酸为Asp、或者328位氨基酸为Glu。

[25’][23’]或[24’]所述的药物组合物，其中，在所述Fc区的氨基酸序列中，为以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸：

233位氨基酸为Asp；

234位氨基酸为Trp或Tyr中的任一个；

239位氨基酸为Asp；

267位氨基酸为Ala、Gln或Val中的任一个；

268位氨基酸为Asn、Asp或Glu中的任一个；

271位氨基酸为Gly；

330位氨基酸为Arg、Lys或Met中的任一个；

323位氨基酸为Ile、Leu或Met中的任一个；或者

296位氨基酸为Asp。

上述的[1]～[25]还可以换成以下的另外一种表达形式：

[1"]用于使抗原从对象的血浆中消失的方法，该方法是包含(i)Fc区和(ii)两个以上的抗原结合结构域的该抗原结合分子的应用，所述抗原结合结构域中的至少一个是对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；

该方法包括向对象给予可形成免疫复合体的抗原结合分子，所述免疫复合体包含(a)两分子以上的该抗原结合分子和(b)两分子以上的抗原，所述抗原包含两个以上的抗原结合单元。

[2"][1"]所述的方法，其中，所述离子浓度条件为钙离子浓度条件。

[3"][2"]所述的方法，其中，所述抗原结合结构域是在低钙离子浓度条件下对抗原的结合活性比在高钙离子浓度条件下对抗原的结合活性低的抗原结合结构域。

[4"][1"]～[3"]中任一项所述的方法，其中，所述离子浓度条件为pH条件。

[5"][4"]所述的方法，其中，所述抗原结合结构域是在pH酸性范围条件下对抗原的结合活性比在pH中性范围条件下对抗原的结合活性低的抗原结合结构域。

[6"][1"]～[5"]中任一项所述的方法，其中，包含两个以上的抗原结合单元的所述抗原为多聚体。

[7"][6"]所述的方法，其中，所述抗原为GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(肌肉生成抑制素)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFSF10(TRAILApo-2配体、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配体ODF、OPG配体)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配体、DR3配体)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配体、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配体AITR配体、TL6)、TNFSF1A(TNF-a肌联蛋白(Connectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40配体gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配体CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配体Apo-1配体、APT1配体)、TNFSF7(CD27配体CD70)、TNFSF8(CD30配体CD153)、TNFSF9(4-1BB配体CD137配体)、VEGF、IgE、IgA、IgG、IgM、RANKL、TGF-α、TGF-β、泛特异性的TGF-β或IL-8中的任一种。

[8"][1"]～[5"]中任一项所述的方法，其中，包含两个以上的抗原结合单元的所述抗原为单体。

[9"][1"]～[9"]中任一项所述的方法，其中，抗原结合分子为多特异性或多互补位的抗原结合分子、或者抗原结合分子混合物。

[10"][1"]～[9"]中任一项所述的方法，其中，所述Fc区分别为SEQID NO:13、14、15或16中任一个所表示的Fc区。

[11"][1"]～[9"]中任一项所述的方法，其中，所述Fc区为在pH酸性范围条件下对FcRn的结合活性与SEQ ID NO:13、14、15或16中任一个所表示的Fc区的结合活性相比增强的Fc区。

[12"][11"]所述的方法，其中，所述Fc区为下述Fc区：在SEQ IDNO:13、14、15或16中任一个所表示的Fc区的氨基酸序列中，选自以下的至少一个以上的氨基酸被取代的Fc区：以EU编号表示的238位、244位、245位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257位、258位、260位、262位、265位、270位、272位、279位、283位、285位、286位、288位、293位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、316位、317位、318位、332位、339位、340位、341位、343位、356位、360位、362位、375位、376位、377位、378位、380位、382位、385位、386位、387位、388位、389位、400位、413位、415位、423位、424位、427位、428位、430位、431位、433位、434位、435位、436位、438位、439位、440位、442位或447位。

[13"][12"]所述的方法，其中，所述Fc区为在SEQ ID NO:13、14、15或16中任一个所表示的Fc区的氨基酸序列中，以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸：

238位氨基酸为Leu；

244位氨基酸为Leu；

245位氨基酸为Arg；

249位氨基酸为Pro；

250位氨基酸为Gln或Glu中的任一个；或者

251位氨基酸为Arg、Asp、Glu或Leu中的任一个；

252位氨基酸为Phe、Ser、Thr或Tyr中的任一个；

254位氨基酸为Ser或Thr中的任一个；

255位氨基酸为Arg、Gly、Ile或Leu中的任一个；

257位氨基酸为Ala、Ile、Met、Asn、Ser或Val中的任一个；

258位氨基酸为Asp；

260位氨基酸为Ser；

262位氨基酸为Leu；

270位氨基酸为Lys；

272位氨基酸为Leu或Arg中的任一个；

285位氨基酸为Asn；

286位氨基酸为Phe；

288位氨基酸为Asn或Pro中的任一个；

293位氨基酸为Val；

307位氨基酸为Ala、Glu、Gln或Met中的任一个；

309位氨基酸为Pro；

312位氨基酸为Ala、Asp或Pro中的任一个；

314位氨基酸为Ala或Leu中的任一个；

316位氨基酸为Lys；

317位氨基酸为Pro；

318位氨基酸为Asn或Thr中的任一个；

339位氨基酸为Asn、Thr或Trp中的任一个；

341位氨基酸为Pro；

343位氨基酸为Glu、His、Lys、Gln、Arg、Thr或Tyr中的任一个；

375位氨基酸为Arg；

376位氨基酸为Gly、Ile、Met、Pro、Thr或Val中的任一个；

377位氨基酸为Lys；

378位氨基酸为Asp、Asn或Val中的任一个；

380位氨基酸为Ala、Asn、Ser或Thr中的任一个；

387位氨基酸为Ala、Arg、His、Pro、Ser或Thr中的任一个；

389位氨基酸为Asn、Pro或Ser中的任一个；

423位氨基酸为Asn；

427位氨基酸为Asn；

428位氨基酸为Leu、Met、Phe、Ser或Thr中的任一个；

431位氨基酸为His或Asn中的任一个；

433位氨基酸为Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro或Ser中的任一个；

434位氨基酸为Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp或Tyr中的任一个；

438位氨基酸为Lys、Leu、Thr或Trp中的任一个；

440位氨基酸为Lys；或者

442位氨基酸为Lys、308位氨基酸为Ile、Pro或Thr中的任一个。

[14"][1"]～[9"]中任一项所述的方法，其中，所述Fc区为在pH中性范围条件下对FcRn的结合活性与SEQ ID NO:13、14、15或16中任一个所表示的Fc区的结合活性相比增强的Fc区。

[15"][14"]所述的方法，其中，所述Fc区为下述Fc区：在SEQ IDNO:13、14、15或16中任一个所表示的Fc区的氨基酸序列中，选自以下的至少一个以上的氨基酸被取代的Fc区：以EU编号表示的237位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265位、286位、289位、297位、298位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、315位、317位、332位、334位、360位、376位、380位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、424位、428位、433位、434位或436位。

[16"][15"]所述的方法，其中，所述Fc区为在SEQ ID NO:13、14、15或16中任一个所表示的Fc区的氨基酸序列中，以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸：

237位氨基酸为Met；

248位氨基酸为Ile；

252位氨基酸为Phe、Trp或Tyr中的任一个；

254位氨基酸为Thr；

255位氨基酸为Glu；

256位氨基酸为Asp、Asn、Glu或Gln中的任一个；

258位氨基酸为His；

265位氨基酸为Ala；

286位氨基酸为Ala或Glu中的任一个；

289位氨基酸为His；

297位氨基酸为Ala；

303位氨基酸为Ala；

305位氨基酸为Ala；

309位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro或Arg中的任一个；

311位氨基酸为Ala、His或Ile中的任一个；

312位氨基酸为Ala或His中的任一个；

314位氨基酸为Lys或Arg中的任一个；

315位氨基酸为Ala、Asp或His中的任一个；

317位氨基酸为Ala；

332位氨基酸为Val；

334位氨基酸为Leu；

360位氨基酸为His；

376位氨基酸为Ala；

380位氨基酸为Ala；

382位氨基酸为Ala；

384位氨基酸为Ala；

385位氨基酸为Asp或His中的任一个；

386位氨基酸为Pro；

387位氨基酸为Glu；

389位氨基酸为Ala或Ser中的任一个；

424位氨基酸为Ala；

433位氨基酸为Lys；

434位氨基酸为Ala、Phe、His、Ser、Trp或Tyr中的任一个；或者

436位氨基酸为His、Ile、Leu、Phe、Thr或Val。

[17"][1"]～[13"]中任一项所述的方法，其中，所述Fc区包含对Fcγ受体的结合活性比天然型人IgG的Fc区对Fcγ受体的结合活性高的Fc区。

[18"][17"]所述的方法，其中，在所述Fc区的氨基酸序列中，选自以下的至少一个以上的氨基酸包含与天然型人IgG的Fc区的氨基酸不同的氨基酸：以EU编号表示的221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位或440位。

[19"][18"]所述的方法，其中，在所述Fc区的氨基酸序列中，包含以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸：

221位氨基酸为Lys或Tyr中的任一个；

222位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

223位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个；

224位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

225位氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个；

227位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

228位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

230位氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个；

231位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

232位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

240位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

241位氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

243位氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

244位氨基酸为His；

245位氨基酸为Ala；

246位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

249位氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个；

250位氨基酸为Glu或Gln中的任一个；

251位氨基酸为Phe；

254位氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个；

255位氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个；

256位氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个；

258位氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个；

260位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

262位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个；

263位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

266位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

273位氨基酸为Phe或Ile中的任一个；

275位氨基酸为Leu或Trp中的任一个；

279位氨基酸为Ala；

281位氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

282位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

284位氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一个；

285位氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中的任一个；

286位氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一个；

288位氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一个；

291位氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中的任一个；

292位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一个；

301位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

302位氨基酸为Ile；

303位氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一个；

304位氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一个；

305位氨基酸为Glu、Ile、Thr或Tyr中的任一个；

311位氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一个；

313位氨基酸为Phe；

315位氨基酸为Leu；

317位氨基酸为Glu或Gln；

323位氨基酸为Ile；

334位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中的任一个；

336位氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一个；

337位氨基酸为Glu、His或Asn中的任一个；

376位氨基酸为Ala或Val中的任一个；

377位氨基酸为Gly或Lys中的任一个；

378位氨基酸为Asp；

379位氨基酸为Asn；

380位氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一个；

382位氨基酸为Ala或Ile中的任一个；

385位氨基酸为Glu；

392位氨基酸为Thr；

396位氨基酸为Leu；

421位氨基酸为Lys；

427位氨基酸为Asn；

428位氨基酸为Phe或Leu中的任一个；

429位氨基酸为Met；

434位氨基酸为Trp；

436位氨基酸为Ile；或者

440位氨基酸为Gly、His、Ile、Leu或Tyr中的任一个。

[20"][1]～[16"]中任一项所述的方法，其中，所述Fc区为对抑制型Fcγ受体的结合活性比对活性型Fcγ受体的结合活性高的Fc区。

[21"][20"]所述的方法，其中，所述抑制型Fcγ受体为人FcγRIIb。

[22"][20"]或[21"]中任一项所述的方法，其中，所述活性型Fcγ受体为人FcγRIa、人FcγRIIa(R)、人FcγRIIa(H)、人FcγRIIIa(V)或人FcγRIIIa(F)。

[23"][20"]～[22"]中任一项所述的方法，其中，所述Fc区的以EU编号表示的238位或328位氨基酸包含与天然型人IgG的Fc区的氨基酸不同的氨基酸。

[24"][23"]所述的方法，其中，所述Fc区的以EU编号表示的238位氨基酸为Asp、或者328位氨基酸为Glu。

[25"][23"]或[24"]所述的方法，其中，在所述Fc区的氨基酸序列中，为以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸：

233位氨基酸为Asp；

234位氨基酸为Trp或Tyr中的任一个；

239位氨基酸为Asp；

267位氨基酸为Ala、Gln或Val中的任一个；

268位氨基酸为Asn、Asp、或Glu中的任一个；

271位氨基酸为Gly；

330位氨基酸为Arg、Lys或Met中的任一个；

323位氨基酸为Ile、Leu或Met中的任一个；或者

296位氨基酸为Asp。

附图说明

图1是显示pH依赖性结合抗体反复与可溶型抗原结合的图。(i)抗体与可溶型抗原结合；(ii)通过胞饮作用非特异性地摄入细胞内；(iii)在核内体内，抗体与FcRn结合，可溶型抗原从抗体上解离；(iv)可溶型抗原转移到溶酶体中被分解；(v)可溶型抗原解离后的抗体通过FcRn再循环到血浆中；(vi)再循环的抗体可以再次与可溶型抗原结合。

图2是显示通过在中性条件下增强与FcRn的结合，来进一步提高pH依赖性结合抗体可以与抗原反复结合的效果的图。(i)抗体与可溶型抗原结合；(ii)经由FcRn，通过胞饮作用摄入细胞内；(iii)在核内体内可溶型抗原从抗体上解离；(iv)可溶型抗原转移到溶酶体中被分解；(v)可溶型抗原解离后的抗体通过FcRn再循环到血浆中；(vi)再循环的抗体可以再次与可溶型抗原结合。

图3是显示使用了Biacore的显示抗人IgA抗体在1.2mM的Ca²⁺和3μM的Ca²⁺下与人IgA的相互作用的传感图的图。

图4是显示人IgA+GA1-IgG1抗体给药组、人IgA+GA2-IgG1抗体给药组、人IgA+GA2-FcγR(-)和GA2-N434W抗体给药组的正常小鼠血浆中抗体浓度变化的图。

图5是显示人IgA单独给药组、人IgA+GA1-IgG1抗体给药组、人IgA+GA2-IgG1抗体给药组、人IgA+GA2-FcγR(-)抗体给药组和人IgA+GA2-N434W抗体给药组的正常小鼠血浆中人IgA的浓度变化的图。

图6是显示人IgA+GA1-IgG1抗体给药组、人IgA+GA2-IgG1抗体给药组、人IgA+GA2-FcγR(-)抗体给药组和人IgA+GA2-N434W抗体给药组的正常小鼠血浆中非结合型人IgA的浓度变化的图。

图7是例示与多聚体抗原形成大的免疫复合体的、包含天然IgG1恒定区pH/Ca依赖性抗体的每1分子抗体的抗原消失效率的图。

图8是例示识别单体抗原中存在的两个以上表位并适合形成大的免疫复合体的多特异性pH/Ca依赖性抗体的每1分子抗体的抗原消失效率的图。

图9是显示确认到人IgE和作为pH依赖性抗IgE抗体的克隆278pH依赖性地形成大的免疫复合体的凝胶过滤层析分析结果的图。

图10是显示人IgE+克隆278给药组和人IgE+Xolair抗体给药组的正常小鼠血浆中抗体浓度变化的图。

图11是显示人IgE单独给药组、人IgE+克隆278抗体给药组和人IgE+克隆278抗体给药组的正常小鼠血浆中人IgE浓度变化的图。

图12是显示正常小鼠血浆中GA2-IgG1和GA2-F1087的抗体浓度变化的图。

图13是显示给予了GA2-IgG1和GA2-F1087的正常小鼠血浆中hIgA的浓度变化的图。

图14是显示C57BL/6J小鼠血浆中278-IgG1和278-F1087的抗体浓度变化的图。

图15是显示给予了278-IgG1和278-F1087的C57BL/6J小鼠的血浆中hIgE(Asp6)的浓度变化的图。

图16是显示给予了GA2-F760或GA2-F1331的人FcRn转基因小鼠的血浆中GA2-F760或GA2-F1331的浓度变化的图。

图17是显示给予了GA2-F760或GA2-F1331的人FcRn转基因小鼠的血浆中人IgA的浓度变化的图。

图18是显示给予了278-F760或278-F1331的人FcRn转基因小鼠的血浆中278-F760或278-F1331的浓度变化的图。

图19是显示给予了278-F760或278-F1331的人FcRn转基因小鼠的血浆中人IgE的浓度变化的图。

图20是显示在pH7.4、pH6.0下PHX-IgG1相对于hsIL-6R的传感图的图。

图21是通过ECL法(电化学发光法)评价Fv4-IgG1和PHX-F29能否同时与IL6R结合的结果。

图22是显示hsIL6R+Fv4-IgG1给药组和hsIL6R+Fv4-IgG1+PHX-IgG1给药组的正常小鼠血浆中抗IL6R抗体的浓度变化的曲线图。

图23是显示hsIL6R+Fv4-IgG1给药组和hsIL6R+Fv4-IgG1+PHX-IgG1给药组的正常小鼠血浆中人IL6R的浓度变化的曲线图。

图24是显示使FcγR与只含抗体的溶液或者与抗体和抗原的混合溶液作用时的Biacore传感图。虚线是显示与只含抗体的溶液作用的情形，实线是显示与混合有抗体和抗原的溶液作用时的传感图的图。

图25是使人FcRn与只含抗体的溶液或者与抗体和抗原的混合溶液作用时的Biacore传感图。实线是显示与只含抗体的溶液作用时的情形，虚线是显示与混合有抗体和抗原的溶液作用时的传感图的图。

图26是使小鼠FcRn与只含抗体的溶液或者与抗体和抗原的混合溶液作用时的Biacore传感图。虚线是显示与只含抗体的溶液作用的情形，实线是显示与混合有抗体和抗原的溶液作用时的传感图的图。

图27是使小鼠FcRn与只含抗体的溶液或者与抗体和抗原的混合溶液作用时的Biacore传感图。虚线是显示与只含抗体的溶液作用的情形，实线是显示与混合有抗体和抗原的溶液作用时的传感图的图。

具体实施方式

以下的定义和详细说明是为了容易理解本说明书中说明的本发明而提供。

氨基酸

本说明书中，以单字母码或三字母码或者该两种方式书写氨基酸，例如表示为Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/V。

氨基酸的修饰

为了修饰抗原结合分子的氨基酸序列中的氨基酸，可以适当采用位点特异性诱变法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或重叠延伸PCR等公知的方法。另外，作为取代成天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸修饰方法，还可以采用多种公知的方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。例如，还优选采用无细胞翻译系统(Clover Direct(Protein Express))等，该系统在作为终止密码子之一的UAG密码子(琥珀密码子)的互补性琥珀抑制基因tRNA中包含结合有非天然氨基酸的tRNA。

本说明书中，表示氨基酸的修饰位点时使用的“和/或”一词的意义包括“和”与“或”适当组合的所有组合。具体而言，例如“33位、55位和/或96位的氨基酸被取代”包括以下的氨基酸修饰的变异：

(a)33位、(b)55位、(c)96位、(d)33位和55位、(e)33位和96位、(f)55位和96位、(g)33位和55位和96位。

抗原结合单元

本说明书中，“抗原结合单元”是指“包含本发明的抗原结合分子所含的抗原结合结构域的一价结合单元所结合的表位的抗原分子在该抗原结合分子的不存在下在血浆中通常存在的形态的每一分子中存在的该表位数”。作为抗原结合单元为两单元的抗原的例子，例示包含通常以GDF、PDGF或VEGF等同源二聚体的形式存在于血浆中的多聚体的抗原。例如，在形成同源二聚体的GDF的分子中存在两单元的抗GDF抗体所含的可变区的一价结合单元所结合的表位，所述抗GDF抗体在其分子中包含同一序列的两个可变区(即，不是后述的双特异性抗体)。另外，作为抗原结合单元为两单元的抗原的例子，还例示IgE等免疫球蛋白分子。IgE在血浆中通常以包含重链二聚体和轻链二聚体的四聚体的形式存在，但在该四聚体中存在两单元的抗IgE抗体所含的可变区的一价结合单元所结合的表位，所述抗IgE抗体在其分子中包含同一序列的两个可变区(即，不是后述的双特异性抗体)。IgA在血浆中通常以包含重链二聚体和轻链二聚体的四聚体、或者该四聚体经由J链进一步形成复合体的八聚体这两种形式存在，但在该四聚体中和八聚体中分别存在两单元或四单元的抗IgA抗体所含的可变区的一价结合单元所结合的表位，所述抗IgA抗体在其分子中包含同一序列的两个可变区(即，不是后述的双特异性抗体)。另外，作为抗原结合单元为三单元的抗原的例子，例示包含通常以作为TNF超家族的TNFα、RANKL或CD154等同源三聚体的形式存在于血浆中的多聚体的抗原。

作为抗原结合单元为一单元的抗原分子的例子，例示通常以可溶型IL-6受体(以下还称作sIL-6R)、IL-6、HMGB-1、CTGF等单体形式存在于血浆中的分子。包含IL-12p40和IL-12p35的IL-12、包含IL-12p40(还称作IL-30B)和IL-23p19的IL-23、或包含EBI3和IL27p28的IL-23、或包含IL-12p35和EBI3的IL-35等异源二聚体包含结构彼此不同的两分子的亚单元。由于分子中包含两个这些亚单元中的任意一个所结合的可变区(即，不是后述的双特异性抗体)的抗亚单元抗体所含的可变区的一价结合单元所结合的表位是一单元，所以这些异源二聚体的抗原结合单元是一单元。同样，TNFα-TNFβ-hCG的多亚单元复合体等异源三聚体的抗原结合单元也是一单元。

需要说明的是，由于抗原结合单元是指抗原结合结构域的一价结合单元所结合的表位数，所以在抗原结合分子中的互补位存在一种和存在多种的情况下，即使这些抗原结合分子所结合的抗原是相同的抗原，但该抗原中的抗原结合单元也是不同的。例如，在上述的异源二聚体的例子中，在抗原结合分子所含的抗原结合结构域中的一价结合单元与该异源二聚体中的一种亚单元结合时，该抗原中的抗原结合单元是一单元，相对于此，在抗原结合分子为包含两个与形成异源二聚体的各亚单元结合的一价结合单元的双特异性或双互补位的抗原结合分子的情况下，该抗原中的抗原结合单元是两单元。

多聚体(multimer)

本说明书中，只记作两个以上的多聚体时，多聚体一词包括同源多聚体和异源多聚体两者。作为多聚体所含的亚单元间的结合方式，包括肽键或二硫键等共价键、或者离子键、范德华键或氢键等稳定的非共价键，但并不限于这些。同源多聚体包含多个相同的亚单元，而异源多聚体包含多个不同的亚单元。例如，二聚体一词包括同源二聚体和异源二聚体两者，同源二聚体包含两个相同的亚单元，而异源二聚体包含两个不同的亚单元。另外，关于表示形成多聚体的各单元的单体，当该单元为多肽时，所述单体是指通过肽键连接的连续的各结构单元。

抗原

本说明书中，“抗原”只要包含抗原结合结构域所结合的表位即可，其结构并不限于特定的结构。从另外的意义来讲，抗原既可以是无机物，也可以是有机物。作为抗原，可例示如下所述的分子：17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGF1a、8-异-PGF2a、8-氧代-dG、A1腺苷受体、A33、ACE、ACE-2、激活素、激活素A、激活素AB、激活素B、激活素C、激活素RIA、激活素RIA ALK-2、激活素RIB ALK-4、激活素RIIA、激活素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素(Addressins)、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α-1-抗胰蛋白酶、α-V/β-1拮抗剂、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗Id、ASPARTIC、心房钠尿因子、av/b3整联蛋白、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴细胞刺激因子(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2BMP-2a、BMP-3成骨蛋白(Osteogenin)、BMP-4BMP-2b、BMP-5、BMP-6 Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a、OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、蛙皮素、骨衍生神经营养因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、补体因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、降钙素、cAMP、癌胚抗原(CEA)、癌相关抗原、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C/DPPI、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V、组织蛋白酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒杆菌毒素、产气荚膜梭菌(Clostridium Perfringens)毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、细胞角蛋白肿瘤相关抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、补体抑制因子(衰变促进因子)、脱(1-3)-IGF-I(脑IGF-1)、Dhh、地高辛、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、内皮素受体、脑啡肽酶、eNOS、Eot、Eotaxin1、EpCAM、EphrinB2/EphB4、EPO、ERCC、E-选择素、ET-1、因子IIa、因子VII、因子VIIIc、因子IX、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、铁蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纤维蛋白、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、促卵胞激素、断裂因子、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(肌肉生长抑制素)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GITR、胰高血糖素、Glut4、糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、生长激素释放因子、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gB包膜糖蛋白、HCMV gH包膜糖蛋白、HCMVUL、造血生长因子(HGF)、HepB gp120、乙酰肝素酶、Her2、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、单纯疱疹病毒(HSV)gB糖蛋白、HSVgD糖蛋白、HGFA、高分子量黑色素瘤相关抗原(High molecular weightmelanoma-associated antigen)(HMW-MAA)、HIV gp120、HIV IIIB gp120 V3环、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFGPEM、HRG、Hrk、人心肌球蛋白、人巨细胞病毒(HCMV)、人生长激素(HGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受体、IgE、IGF、IGF结合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、干扰素(INF)-α、INF-β、INF-γ、抑制素、iNOS、胰岛素A链、胰岛素B链、胰岛素样生长因子1、整联蛋白α2、整联蛋白α3、整联蛋白α4、整联蛋白α4/β1、整联蛋白α4/β7、整联蛋白α5(αV)、整联蛋白α5/β1、整联蛋白α5/β3、整联蛋白α6、整联蛋白β1、整联蛋白β2、干扰素γ、IP-10、I-TAC、JE、激肽释放酶2、激肽释放酶5、激肽释放酶6、激肽释放酶11、激肽释放酶12、激肽释放酶14、激肽释放酶15、激肽释放酶L1、激肽释放酶L2、激肽释放酶L3、激肽释放酶L4、KC、KDR、角质形成细胞生长因子(KGF)、层连蛋白5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潜伏型TGF-1、潜伏型TGF-1bp1、LBP、LDGF、LECT2、Lefty、Lewis-Y抗原、Lewis-Y相关抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-选择素、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、促黄体激素、淋巴毒素β受体、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、金属蛋白酶、MGDF受体、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-α、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、粘蛋白(Muc1)、MUC18、缪勒管抑制物质、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-C粘附因子、NCA90、NCAM、NCAM、脑啡肽酶、神经营养素-3、神经营养素-4或神经营养素-6、Neurturin、神经生长因子(NGF)、NGFR、NGF-β、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、甲状旁腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-钙黏蛋白、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、PlGF、PLP、PP14、胰岛素原、松弛素原、蛋白C、PS、PSA、PSCA、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、松弛素A链、松弛素B链、肾素、呼吸道合胞体病毒(RSV)F、RSVFgp、Ret、类风湿因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T细胞受体(例如，T细胞受体α/β)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP样碱性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β泛特异性(泛特异性的TGF-β)、TGF-βRI(ALK-5)、TGF-βRII、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、凝血酶、胸腺Ck-1、促甲状腺激素、Tie、TIMP、TIQ、组织因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RI CD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4(OX40 ACT35、TXGP1R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFRSF25(DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配体、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配体ODF、OPG配体)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配体、DR3配体)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配体、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配体AITR配体、TL6)、TNFSF1A(TNF-a黏附素(Connectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40配体gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配体CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配体Apo-1配体、APT1配体)、TNFSF7(CD27配体CD70)、TNFSF8(CD30配体CD153)、TNFSF9(4-1BB配体CD137配体)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、运铁蛋白受体、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、肿瘤相关抗原CA125、肿瘤相关抗原表达病毒Y相关碳水化物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-钙黏蛋白、VE-钙黏蛋白-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整联蛋白、冯维勒布兰德因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81、CD97、CD98、DDR1、DKK1、EREG、Hsp90、IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL、PCSK9、激肽释放酶原、RON、TMEM16F、SOD1、嗜铬粒蛋白A、嗜铬粒蛋白B、tau、VAP1、高分子激肽原、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1、C1q、C1r、C1s、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、因子B、因子D、因子H、备解素、壳硬蛋白(sclerostin)、血纤蛋白原、血纤蛋白、凝血酶原、凝血酶、组织因子、因子V、因子Va、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子VIIIa、因子IX、因子IXa、因子X、因子Xa、因子XI、因子XIa、因子XII、因子XIIa、因子XIII、因子XIIIa、TFPI、抗凝血酶III、EPCR、血栓调节蛋白、TAPI、tPA、纤溶酶原、纤溶酶、PAI-1、PAI-2、GPC3、多配体蛋白聚糖-1、多配体蛋白聚糖-2、多配体蛋白聚糖-3、多配体蛋白聚糖-4、LPA、S1P以及用于激素和生长因子的受体。

如下所述，象双特异性抗体等在抗原结合分子与抗原分子中的多个表位结合的情况下，可与该抗原结合分子形成复合体的抗原可以是上述例示的抗原中的任一种、或者是其组合，换言之，可以是单体或异源多聚体。作为异源多聚体的非限定性例子，可以列举：包含IL-12p40和IL-12p35的IL-12、包含IL-12p40和(还称作IL-30B)IL-23p19的IL-23、或者包含EBI-3和IL27p28的IL-23、或者包含IL-12p35和EBI-3的IL-35等异源二聚体。

在上述抗原的例示中还记载有受体，但在这些受体以可溶型存在于血浆中等生物体液中的情况下，其可以和本发明的抗原结合分子形成复合体，所以上述列举的受体只要以可溶型存在于血浆中等生物体液中，则其可以用作与本发明的抗原结合分子结合能够形成本发明的复合体的抗原。作为这种可溶型受体的一个非限定性方案，例如可以例示：由Mullberg等人(J.Immunol.(1994)152(10),4958-4968)记载的作为可溶型IL-6R的、包含SEQ ID NO:1所表示的IL-6R多肽序列中第1位～第357位的氨基酸的蛋白。

在上述抗原的例示中，还记载有可溶型抗原，对该抗原所存在的溶液没有限定，该可溶型抗原可以存在于生物体液、即充满生物体内的脉管或组织·细胞间隙的所有液体。在一个非限定性方案中，本发明的抗原结合分子所结合的抗原可以存在于细胞外液中。细胞外液是指脊椎动物的血浆、组织间液、淋巴液、致密的结缔组织、脑脊髓液、髓液、穿刺液、或关节液等骨和软骨中的成分、肺胞液(支气管肺胞清洗液)、腹水、胸水、心包液、囊内液、或眼房水(房水)等细胞透过液(细胞的主动输送·分泌活动的结果产生的各种腺腔内的液体、和消化道管腔等其他体腔内液)的总称。

另外，当抗原结合分子所含的抗原结合结构域所结合的表位是单一表位时，作为与该抗原结合分子结合能够形成本发明的复合体的抗原的一个非限定性方案，可以例示抗原结合单元中包含同源二聚体或同源三聚体等的下述分子：GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(肌肉生成抑制素)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFSF10(TRAILApo-2配体、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配体ODF、OPG配体)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配体、DR3配体)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配体、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配体AITR配体、TL6)、TNFSF1A(TNF-a肌联蛋白(Connectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40配体gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配体CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配体Apo-1配体、APT1配体)、TNFSF7(CD27配体CD70)、TNFSF8(CD30配体CD153)、TNFSF9(4-1BB配体CD137配体)、VEGF、IgE、IgA、IgG、IgM、RANKL、TGF-α、TGF-β、泛特异性的TGF-β、IL-8。

表位

表示存在于抗原中的抗原决定簇的表位，意指本说明书中公开的抗原结合分子中的抗原结合结构域所结合的抗原上的位点。所以，例如表位可通过其结构来定义。另外，也可以通过相对于识别该表位的抗原结合分子中的抗原的结合活性来定义该表位。抗原为肽或者多肽时，还可以通过构成表位的氨基酸残基来规定表位。另外，表位为糖链时，也可以通过特定的糖链结构来规定表位。

线性表位是下述表位，其包含氨基酸一级序列得到识别的表位。线性表位在固有序列中典型地含有至少3个氨基酸、以及最普通地含有至少5个、例如约8至10个、6至20个氨基酸。

与线性表位相对地，立体结构表位是这样的表位，其中，含有表位的氨基酸的一级序列并非是被识别表位的单一规定成分(例如，氨基酸的一级序列不需要被规定表位的抗体所识别的表位)。立体结构表位相对于线性表位可以含有增大数目的氨基酸。关于立体结构表位的识别，抗体识别肽或蛋白的三维结构。例如，蛋白分子折叠形成三维结构时，形成立体结构表位的某氨基酸和/或多肽主链形成并排，使得抗体可以识别表位。确定表位的立体结构的方法例如包括：X射线结晶学、二维核磁共振分光学以及位点特异性旋转标记和电子顺磁共振分光学，但并非限定于此。例如，参照Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular Biology(1996),第66卷,Morris(编)。

与表位结合的抗原结合结构域的结构被称作互补位。表位和互补位通过在表位和互补位之间发生作用的氢键、静电引力、范德华力、疏水键等稳定地结合。该表位和互补位之间的结合力被称作亲和力(affinity)。多个表位与多个互补位结合时的结合力的总和被称作亲合力(avidity)。包含多个互补位(即多价)的抗体等与多个表位结合时，结合力(affinity)相加或协同地发挥作用，所以亲合力比亲和力高。

结合活性

下述例示了通过含有针对IgA的抗原结合结构域的被测抗原结合分子来确认对表位的结合的方法，但通过含有针对IgA以外的抗原的抗原结合结构域的被测抗原结合分子来确认对表位的结合的方法也可以基于下述例示而适当实施。

例如，含有针对IgA的抗原结合结构域的被测抗原结合分子是否识别存在于IgA分子中的线性表位，这可以通过如下所示的操作来确认。例如，为了上述目的，合成了包含构成IgA的恒定区的氨基酸序列的线性肽。该肽可进行化学合成。或者，可以利用IgA的cDNA中编码相当于恒定区的氨基酸序列的区域，通过基因工程技术得到。接下来，对包含构成恒定区的氨基酸序列的线性肽、和含有针对IgA的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的结合活性进行评价。例如，通过以固定化线性肽作为抗原的ELISA，可以评价该抗原结合分子对该肽的结合活性。或者，基于该抗原结合分子对IgA细胞的结合中的、线性肽造成的抑制水平，也可以明确对线性肽的结合活性。通过这些试验，可以明确该抗原结合分子对线性肽的结合活性。

另外，含有针对IgA蛋白的抗原结合结构域的被测抗原结合分子是否识别立体结构表位，这可以通过如下操作来确认。为了上述目的，如本说明书中所述，通过采用普通的重组基因方法，向可以形成IgA蛋白内的天然的立体表位的宿主细胞(例如，动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞)中形质导入编码IgA的重组基因。由如此制作的重组细胞的培养液制备含有立体结构表位的IgA。含有针对IgA的抗原结合结构域的被测抗原结合分子识别立体结构表位是指，该被测抗原结合分子与经固定化的含有立体结构表位的IgA接触时，强烈地与该IgA分子结合，但该抗原结合分子与经固定化的包含构成IgA的氨基酸序列的氨基酸序列的线性肽实质上不结合的情形等。还可以使用经二硫苏糖醇(dithiothreitol)、二硫赤鲜醇(dithioerythritol)β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)、膦衍生物(phosphines)、硼氢化钠(sodiumborohydride)等切断二硫键的还原剂和/或胍盐酸盐、尿素、十二烷基硫酸钠等表面活性剂等离液序列高的药物改性的针对IgA的该被测抗原结合分子来代替上述线性肽。这里，实质上不结合是指，对人IgA的结合活性的80％以下、通常50％以下、优选30％以下、特别优选15％以下的结合活性。

作为测定含有针对IgA的抗原结合结构域的被测抗原结合分子对IgA的结合活性的方法，例如可以列举Antibodies A Laboratory Manual记载的方法(Ed Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)359-420)。即，可以根据以IgA为抗原的ELISA或EIA的原理进行评价。

在ELISA形式中，含有针对IgA的抗原结合结构域的被测抗原结合分子对IgA的结合活性，通过比较由酶反应生成的信号水平而定量地进行评价。即，将被测抗原结合分子添加至固定有IgA的ELISA板，利用识别被测抗原结合分子的酶标记抗体，检测与固定在该板上的IgA结合的被测抗原结合分子。在上述ELISA中，制作被测抗原结合分子的稀释系列，确定相对于IgA的抗体结合效价(titer)，由此可以比较被测抗原结合分子对IgA的结合活性。

被测抗原结合分子与悬浮于缓冲液等中的细胞表面上表达的抗原的结合可以通过流式细胞仪检测出。作为流式细胞仪，已知例如如下的装置：

ACSCanto^TMII；

FACSAria^TM；

FACSArray^TM；

FACSVantage^TMSE；

FACSCalibur^TM(均为BD Biosciences公司的商品名)；

EPICS ALTRA HyPerSort；

Cytomics FC 500；

EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC；

Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(均为Beckman Coulter公司的商品名)。

例如，作为含有针对IgE的抗原结合结构域的被测抗原结合分子对抗原的结合活性的优选测定方法的一例，可以列举以下方法。首先，使表达IgE的细胞与被测抗原结合分子反应，将其用识别被测抗原结合分子的经FITC标记的二次抗体染色。将被测抗原结合分子用适当的优选缓冲液稀释，由此将该抗原结合分子制备成所期望的浓度来使用。例如，能够以10μg/ml至10ng/ml之间的任意浓度使用。接着，通过FACSCalibur(BD公司)测定荧光强度和细胞数。抗体对该细胞的结合量被反映为使用CELL QUEST软件(BD公司)进行分析而得到的荧光强度、即几何平均值。即，通过得到该几何平均值，能够测定由被测抗原结合分子的结合量表示的被测抗原结合分子的结合活性。

含有针对IgA的抗原结合结构域的被测抗原结合分子是否与某抗原结合分子共有表位，这可以通过两者对相同表位的竞争来确认。抗原结合分子间的竞争通过交叉阻断试验等来检测。例如竞争ELISA试验是优选的交叉阻断试验。

具体而言，在交叉阻断试验中，包被于微量滴定板的孔上的IgA蛋白在候选竞争抗原结合分子的存在下或不存在下经孵育后，添加被测抗原结合分子。与孔中的IgA蛋白结合的被测抗原结合分子的量与竞争结合相同表位的候选竞争抗原结合分子的结合能力间接地相关。即，竞争抗原结合分子对相同表位的亲和性越大，则被测抗原结合分子对包被有IgA蛋白的孔的结合活性越降低。

经由IgA蛋白而与孔结合的被测抗原结合分子的量可以通过预先标记抗原结合分子来容易地测定。例如，经生物素标记的抗原结合分子通过使用亲和素过氧化酶结合物和合适的底物来测定。利用过氧化酶等酶标记的交叉阻断试验特别被称为竞争ELISA试验。抗原结合分子能够用可检测或可测定的其它标志物质进行标记。具体而言，公知的是放射标记或荧光标记等。

与在候选竞争抗原结合分子缔合体的不存在下实施的对照试验中得到的结合活性进行比较，竞争抗原结合分子只要可以阻断至少20％、优选至少20-50％、进一步优选至少50％的含有针对IgA的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的结合，则该被测抗原结合分子是与竞争抗原结合分子实质上结合于相同表位、或者竞争结合于相同的表位的抗原结合分子。

在鉴定含有针对IgA的抗原结合结构域的被测抗原结合分子所结合的表位的结构时，被测抗原结合分子与对照抗原结合分子是否共有表位，这能够通过比较两抗原结合分子对在构成该表位的肽中导入氨基酸突变而得的肽的结合活性来进行评价。

作为这种测定结合活性的方法，例如，在上述ELISA形式中，可通过比较被测抗原结合分子和对照抗原结合分子对导入了突变的线性肽的结合活性来测定。作为ELISA以外的方法，通过使被测抗原结合分子与对照抗原结合分子流过该柱后，对洗脱液中洗脱的抗原结合分子进行定量，也可以测定对结合于柱的该突变肽的结合活性。使突变肽作为例如与GST的融合肽的形式而吸附于柱的方法是公知的。

另外，在细胞上表达的抗原中的鉴定的表位为立体表位时，被测抗原结合分子与对照抗原结合分子是否共有表位，这例如可通过如下所述的方法来评价。以抗原为IgE的情形为例，以下进行说明。首先，制备表达IgE的细胞和表达在表位中导入了突变的IgE的细胞。将这些细胞悬浮于PBS等适当的缓冲液中，向所得细胞悬浮液中添加被测抗原结合分子和对照抗原结合分子。接着，用合适的缓冲液清洗，向所得细胞悬浮液中添加能够识别被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的经FITC标记的抗体。被标记抗体染色的细胞的荧光强度和细胞数通过FACSCalibur(BD公司)来测定。被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的浓度通过合适的缓冲液适当稀释，由此可以制备成所期望的浓度来使用。例如，能够以10μg/ml至10ng/ml之间的任意浓度使用。标记抗体对该细胞的结合量被反映为使用CELLQUEST软件(BD公司)进行分析而得到的荧光强度、即几何平均值。即，通过得到该几何平均值，可以测定由标记抗体的结合量表示的被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的结合活性。

本方法中，例如“实质上不与突变IgE表达细胞结合”可通过以下方法判断。首先，用标记抗体染色与表达突变IgE的细胞结合的被测抗原结合分子和对照抗原结合分子。接着，检测细胞的荧光强度。荧光检测中使用作为流式细胞仪的FACSCalibur时，所得的荧光强度可以使用CELLQUEST软件进行分析。由多肽缔合体存在下和不存在下的几何平均值，通过下述计算式计算该比较值(ΔGeo-Mean)，由此可以求出抗原结合分子的结合造成的荧光强度的增加比例。

ΔGeo-Mean＝Geo-Mean(多肽缔合体存在下)/Geo-Mean(多肽缔合体不存在下)

将通过分析得到的、反映被测抗原结合分子对突变IgE表达细胞的结合量的几何平均比较值(突变IgE分子ΔGeo-Mean值)与反映被测抗原结合分子对IgE表达细胞的结合量的ΔGeo-Mean比较值进行比较。此时，计算相对于突变IgE表达细胞和IgE表达细胞的ΔGeo-Mean比较值时使用的被测抗原结合分子的浓度特别优选制备成彼此相同或者实质上相同的浓度。预先确定了识别IgE中的表位的抗原结合分子被用作对照抗原结合分子。

被测抗原结合分子相对于突变IgE表达细胞的ΔGeo-Mean比较值只要小于被测抗原结合分子相对于IgE表达细胞的ΔGeo-Mean比较值的至少80％、优选50％、进一步优选30％、特别优选15％，则认为“实质上不与突变IgE表达细胞结合”。计算Geo-Mean值(几何平均)的计算式记载于CELL QUEST软件用户指南(BD biosciences公司)。通过将比较值进行比较，只要是能够将其实质上视为相同的程度，则能够评价被测抗原结合分子与对照抗原结合分子的表位相同。

抗原结合结构域

本说明书中，“抗原结合结构域”只要与目标抗原结合，则可以使用任意结构的结构域。作为这类结构域的实例，例如可以列举：抗体的重链和轻链的可变区、生物体内存在的细胞膜蛋白Avimer中所含的35个氨基酸左右的被称为A结构域的组件(国际公开第WO2004/044011号、国际公开第WO2005/040229号)、含有与在细胞膜表达的糖蛋白即纤连蛋白中的蛋白结合的结构域即10Fn3结构域的Adnectin(国际公开第WO2002/032925号)、以构成蛋白A的包含58个氨基酸的3个螺旋束(bundle)的IgG结合结构域为构架的Affibody(国际公开第WO1995/001937号)、具有含33个氨基酸残基的转角和2个反向平行螺旋以及环的亚基重复重叠而成的结构的锚蛋白重复序列(ankyrin repeat：AR)的分子表面露出的区域DARPins(Designed Ankyrin Repeat proteins)(国际公开第WO2002/020565号)、支持嗜中性粒细胞明胶酶结合脂质运载蛋白(neutrophilgelatinase-associated lipocalin(NGAL))等脂质运载蛋白分子中高度保守的8个反向平行链在中央方向扭曲的桶结构的单侧的4个环区域Anticalin等(国际公开第WO2003/029462号)、作为七鳃鳗、八目鳗等无颚类的获得性免疫系统且不具有免疫球蛋白结构的可变性淋巴细胞受体(variable lymphocyte receptor(VLR))的富亮氨酸残基重复(leucine-rich-repeat(LRR))组件反复重叠而成的马蹄铁形的结构内部的平行型片层结构的凹陷区域(国际公开第WO2008/016854号)。作为本发明的抗原结合结构域的优选实例，可以列举含有抗体的重链和轻链的可变区的抗原结合结构域。作为这种抗原结合结构域的实例，优选列举“scFv(单链Fv)”、“单链抗体”、“Fv”、“scFv2(单链Fv2)”、“Fab”或“F(ab’)2”等。

本发明的抗原结合分子中的抗原结合结构域可以与相同的表位结合。这里，相同的表位可以存在于例如包含SEQ ID NO:2所记载的氨基酸序列的蛋白中。或者，本发明的抗原结合分子中的抗原结合结构域可以与彼此不同的表位结合。这里，不同的表位可以存在于例如包含SEQ ID NO:2所记载的氨基酸序列的蛋白中。

免疫复合体(Immune complex)

免疫复合体是指，至少一个抗原和至少一个抗原结合分子相互结合形成分子量更大的复合体时产生的比较稳定的结构。作为免疫复合体的一个非限定性方案，例示抗原-抗体聚集体。在本说明书中，评价包含两个以上抗原结合分子和两个以上抗原结合单元的免疫复合体的形成的方法见后述。

特异性

特异性是指特异性结合的分子中的一个分子对于它的一个或多个结合对象分子以外的分子不显示任何显著性结合的状态。另外，也可用于抗原结合结构域对某抗原中所含的多个表位中特定的表位是特异性的情形。另外，在多个不同的抗原中含有抗原结合结构域所结合的表位时，具有该抗原结合结构域的抗原结合分子可以与含有该表位的各种抗原结合。这里，不显示任何显著性结合是指，对于该对象分子以外的分子，显示出对该对象分子的结合活性的50％以下、通常为30％以下、优选15％以下、特别优选10％以下、进一步优选5％以下的结合活性。

抗体

本说明书中，抗体是指天然的免疫球蛋白或者通过部分或完全合成制造的免疫球蛋白。抗体可从其天然存在的血浆或血清等天然资源或产生抗体的杂交瘤细胞的培养上清中分离得到，或者通过使用基因重组等方法而部分或完全地合成。作为抗体的实例，优选列举免疫球蛋白的同种型和这些同种型的亚型。作为人的免疫球蛋白，已知有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM这9种类型(同种型)。本发明的抗体中可包含这些同种型中的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。作为人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4恒定区，由基因多态性形成的多个同种异型序列记载在Sequences of proteins ofimmunological interest,NIH Publication No.91-3242中，但在本发明中可以是其中的任一种。特别是，作为人IgG1的序列，以EU编号表示的356-358位氨基酸序列可以是DEL也可以是EEM。另外，作为人Igκ(Kappa)恒定区和人Igλ(Lambda)恒定区，由基因多态性形成的多个同种异型序列记载在Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242中，但在本发明可以是其中的任一种。

制作具有所期望的结合活性的抗体的方法对本领域技术人员来说是公知的。以下例示与IgA结合的抗体(抗IgA抗体)的制作方法。与IgA以外的抗原结合的抗体也可以根据下述例示而适当制作。

抗IgA抗体可以使用公知的方法以多克隆或单克隆抗体的形式获得。作为抗IgA抗体，可优选制作来源于哺乳动物的单克隆抗体。来源于哺乳动物的单克隆抗体包含：由杂交瘤产生的单克隆抗体、和利用基因工程技术通过用含有抗体基因的表达载体进行了转化的宿主细胞产生的单克隆抗体等。需要说明的是，本申请发明的单克隆抗体包含“人源化抗体”或“嵌合抗体”。

产生单克隆抗体的杂交瘤可以通过使用公知技术，例如如下制作。即，使用IgA蛋白作为致敏抗原，按照通常的免疫方法来免疫哺乳动物。通过通常的细胞融合法，将所得免疫细胞与公知的亲本细胞融合。接着，通过通常的筛选方法筛选单克隆抗体产生细胞，由此可以选择出产生抗IgA抗体的杂交瘤。

具体而言，单克隆抗体的制作例如如下进行。例如，纯化的天然IgA蛋白可以用作致敏抗原。另外，为了从培养上清中获得可溶型IgA，而纯化在IMGT/GENE-DB中以L00022|IGHE*02的形式记载的、由以SEQ ID NO:2表示的IgA多肽序列构成的重组蛋白。为了表达重组蛋白，首先，表达其核苷酸序列公开在SEQ ID NO:3中的IgA重链恒定区基因，由此可得到由SEQ ID NO:2表示的IgA蛋白，其用作致敏抗原用于抗体制备。即，将编码IgA的基因序列插入公知的表达载体，由此转化适当的宿主细胞。以公知的方法从该宿主细胞中或培养上清中纯化所期望的IgA蛋白。表达IgA重链恒定区基因时，可以将SEQ ID NO:3中记载的多核苷酸序列有效连接在信号序列的3’末端。另外，在另一非限定性方案中，可以在编码5’末端包含信号序列的重链可变区的多核苷酸序列的3’末端有效连接SEQ ID NO:3中记载的多核苷酸序列。另外，为了纯化重组蛋白，可以在SEQ ID NO:2的氨基末端或羧基末端添加用于进行适当纯化的标签肽。作为这种例子的一个非限定性方案，可以列举经由GGGGS(SEQ ID NO:31)接头连接的作为Avi标签的GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO:4)等。作为如上所述的重组蛋白的非限定性制作例，可以列举下述方法：从重组宿主细胞的培养液中回收如实施例1中记载的与轻链组合表达的重组IgA蛋白后进行纯化。

作为用于免疫哺乳动物的致敏抗原，可使用该纯化IgA蛋白。IgA的部分肽也可以用作致敏抗原。此时，该部分肽也可以根据人IgA的氨基酸序列通过化学合成获得。另外，也可以通过将一部分IgA基因插入到表达载体中使其表达来获得。进而，还可以使用蛋白分解酶分解IgA蛋白来获得，但用作部分肽的IgA肽的区域和大小并不特别限于特定的方案。对于优选的区域，可以从SEQ ID NO:2的氨基酸序列中选择任意的序列。构成作为致敏抗原的肽的氨基酸的数目优选为至少5个以上、例如6个以上、或7个以上。更具体而言，可以将8～50、优选10～30个残基的肽用作致敏抗原。

另外，也可以将IgA蛋白的所期望的部分多肽或肽与不同的多肽进行融合而得的融合蛋白用作致敏抗原。为了制造用作致敏抗原的融合蛋白，例如，可以优选利用抗体的Fc片段或肽标签等。表达融合蛋白的载体可如下制作：将编码所期望的两种或更多的多肽片段的基因框内融合，将该融合基因如上所述地插入表达载体中。融合蛋白的制作方法记载于Molecular Cloning第2版.(Sambrook,J等人,Molecular Cloning第2版,9.47-9.58(1989)Cold Spring Harbor Lab.press)。用作致敏抗原的IL-6受体的获得方法和使用它的免疫方法也具体记载于PCT/JP2011/077619等中。

作为用该致敏抗原免疫的哺乳动物，并不限定于特定的动物，优选考虑与细胞融合中使用的亲本细胞的适应性来选择。通常优选使用啮齿类的动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠、或兔、猴等。

按照公知的方法将上述动物用致敏抗原免疫。例如，作为通常的方法，通过注射将致敏抗原给予至哺乳动物的腹腔内或皮下来实施免疫。具体而言，将用PBS(磷酸缓冲盐水(Phosphate-Buffered Saline))或生理盐水等以适当稀释倍率稀释的致敏抗原根据需要与通常的佐剂、例如弗氏完全佐剂混合，在乳化后将该致敏抗原对哺乳动物每4至21日给予数次。另外，致敏抗原免疫时可以使用适当的载体。特别是将分子量小的部分肽用作致敏抗原时，有时希望将与白蛋白、匙孔血蓝蛋白等载体蛋白结合的该致敏抗原肽进行免疫。

另外，产生所期望抗体的杂交瘤可通过使用DNA免疫，如下所示来制作。DNA免疫是指下述免疫方法：被给予了以能在免疫动物中表达编码抗原蛋白的基因的方式构建的载体DNA的该免疫动物中，致敏抗原在该免疫动物的生物体内表达，由此赋予免疫刺激。与将蛋白抗原给予免疫动物的通常的免疫方法相比，DNA免疫期待如下的优越性：

-抗原为膜蛋白时，能够维持膜蛋白的结构而赋予免疫刺激；

-无需纯化免疫抗原。

为了通过DNA免疫获得本发明的单克隆抗体，首先，对免疫动物给予表达IgA蛋白的DNA。编码IgA的DNA可通过PCR等公知方法合成。将所得DNA插入适当的表达载体中，给予免疫动物。作为表达载体，可优选利用例如pcDNA3.1等市售的表达载体。作为将载体给予生物体的方法，可采用通常所使用的方法。例如，将吸附有表达载体的金颗粒用基因枪导入免疫动物个体的细胞内，由此进行DNA免疫。进而，识别IgA的抗体的制作也可以采用PCT/JP2011/077619中记载的方法来制作。

如此地将哺乳动物免疫，确认血清中与IgA结合的抗体效价上升后，从哺乳动物采集免疫细胞用于细胞融合。作为优选的免疫细胞，特别可使用脾细胞。

作为与上述免疫细胞融合的细胞，可使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞优选具备用于筛选的适当的选择标志物。选择标志物是指能够(或者不能)在特定培养条件下存活的形态。选择标志物中，公知的是次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶缺陷(以下简称为HGPRT缺陷)、或胸苷激酶缺陷(以下简称为TK缺陷)等。具有HGPRT或TK缺陷的细胞具有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷敏感性(以下简称为HAT敏感性)。HAT敏感性的细胞不能在HAT选择培养基中进行DNA合成而会死亡，但若与正常细胞发生融合，则可利用正常细胞的补救途径继续DNA的合成，因此在HAT选择培养基中也会增殖。

HGPRT缺陷或TK缺陷的细胞各自可通过含有6-硫代鸟嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤(以下简称为8AG)、或5’-溴脱氧尿苷的培养基来选择。DNA中整合有这些嘧啶类似物的正常细胞会死亡。而无法整合这些嘧啶类似物的缺乏上述酶的细胞则可以在选择培养基中存活。此外，被称为G418抗性的选择标志物可通过新霉素抗性基因赋予针对2-脱氧链霉胺系抗生素(庆大霉素类似物)的抗性。细胞融合中优选的各种骨髓瘤细胞是公知的。

作为这类骨髓瘤细胞，例如可优选使用：P3(P3×63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123(4),1548-1550)、P3×63Ag8U.1(Current Topics inMicrobiology and Immunology(1978)81,1-7)、NS-1(C.Eur.J.Immunol.(1976)6(7),511-519)、MPC-11(Cell(1976)8(3),405-415)、SP2/0(Nature(1978)276(5685),269-270)、FO(J.Immunol.Methods(1980)35(1-2),1-21)、S194/5.XX0.BU.1(J.Exp.Med.(1978)148(1),313-323)、R210(Nature(1979)277(5692),131-133)等。

基本上，根据公知的方法，例如Kohler和Milstein等人的方法(Methods Enzymol.(1981)73,3-46)等，进行上述免疫细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合。

更具体而言，例如，可以在细胞融合促进剂的存在下、在通常的营养培养液中实施上述细胞融合。作为融合促进剂，使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，为了进一步提高融合效率，根据期望添加二甲基亚砜等助剂后使用。

免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例可以任意设定。例如，相对于骨髓瘤细胞，优选使免疫细胞达到1至10倍。作为用于上述细胞融合的培养液，使用例如适于上述骨髓瘤细胞株的增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液以及用于此种细胞培养的通常的培养液，进而可优选添加胎牛血清(FCS)等血清补液。

关于细胞融合，将上述免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养液中以规定量充分混合，将预先加热至37℃左右的PEG溶液(例如平均分子量为1000至6000左右)通常以30至60％(w/v)的浓度添加。通过缓缓地混合混合液，形成所期望的融合细胞(杂交瘤)。接着，依次添加上述列举的适当的培养液，通过重复进行离心除去上清的操作，可以除去对杂交瘤的生长不利的细胞融合剂等。

如此操作得到的杂交瘤可通过用通常的选择培养液、例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)进行培养来选择。使用上述HAT培养液的培养可持续足够除所期望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的时间(通常，所述足够的时间为数天至数周)。接着，通过通常的有限稀释方法，实施产生所期望抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。

如此操作得到的杂交瘤可通过使用对应于用于细胞融合的骨髓瘤所具有的选择标志物的选择培养液来进行选择。例如，具有HGPRT或TK缺陷的细胞可以通过用HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)培养来进行选择。即，在细胞融合中使用HAT敏感性的骨髓瘤细胞时，在HAT培养液中，与正常细胞的细胞融合成功了的细胞可选择性地增殖。使用上述HAT培养液的培养可以持续足够除所期望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的时间。具体而言，通常通过数天至数周的培养，可以选择所期望的杂交瘤。接着，可通过通常的有限稀释法实施产生所期望抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。

所期望抗体的筛选和单克隆优选可通过公知的基于抗原抗体反应的筛选方法来实施。例如，可以根据ELISA的原理来评价抗体对固定化的IgA的结合活性。例如，将IgA固定于ELISA板的孔中。使杂交瘤的培养上清与孔内的IgA接触，检测与IgA结合的抗体。单克隆抗体来源于小鼠时，与细胞结合的抗体可通过抗小鼠免疫球蛋白抗体检测。通过这些筛选选择出的、产生对抗原具有结合能力的所期望的抗体的杂交瘤可以通过有限稀释法等进行克隆。

如此操作而制作的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在通常的培养液中传代培养。另外，该杂交瘤可以在液氮中长期保存。

按照通常的方法培养该杂交瘤，可从其培养上清中获得所期望的单克隆抗体。或者，可以将杂交瘤给予和其具有相容性的哺乳动物并使其增殖，从其腹水中获得单克隆抗体。前一种方法适于获得高纯度的抗体。

也可以优选使用由从该杂交瘤等抗体产生细胞克隆的抗体基因编码的抗体。将克隆的抗体基因插入适当的载体中，再导入宿主中，由此表达由该基因编码的抗体。用于抗体基因的分离、向载体中的导入、以及宿主细胞的转化的方法已经由例如Vandamme等人确立(Eur.J.Biochem.(1990)192(3),767-775)。另外，如下所述重组抗体的制造方法也是公知的。

例如，由产生抗IgA抗体的杂交瘤细胞获得编码抗IgA抗体的可变区(V区)的cDNA。为此，通常首先从杂交瘤中提取总RNA。作为用于从细胞中提取mRNA的方法，例如可使用如下所述的方法。

-胍超离心法(Biochemistry(1979)18(24),5294-5299)；

-AGPC法(Anal.Biochem.(1987)162(1),156-159)。

所提取的mRNA可使用mRNA纯化试剂盒(GE HealthcareBioscience制)等进行纯化。或者，还市售有象QuickPrep mRNA纯化试剂盒(GE Healthcare Bioscience制)等用于从细胞中直接提取总mRNA的试剂盒。使用这种试剂盒，可由杂交瘤获得mRNA。使用逆转录酶，可由所得mRNA合成编码抗体V区的cDNA。cDNA可通过AMV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒(生化学工业)等合成。另外，为了cDNA的合成和扩增，可以适当采用使用了SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech制)和PCR的5’-RACE法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85(23),8998-9002、Nucleic Acids Res.(1989)17(8),2919-2932)。进而，可以在这种cDNA的合成过程中向cDNA的两末端导入后述适合的限制酶位点。

由所得PCR产物纯化出目标cDNA片段，接着与载体DNA连接。如此制作重组载体，并导入大肠杆菌等中，选择集落后，可以由形成该集落的大肠杆菌制备所期望的重组载体。而且，关于该重组载体是否具有目标cDNA的核苷酸序列，这可以通过公知的方法、例如双脱氧核苷酸链终止法等来确认。

为了获得编码可变区的基因，简便的是利用5’-RACE法，其中使用了可变区基因扩增用的引物。首先，以从杂交瘤细胞中提取的RNA为模板合成cDNA，获得5’-RACE cDNA文库。在5’-RACE cDNA文库的合成中可适当地使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒等市售的试剂盒。

以所得的5’-RACE cDNA文库为模板，通过PCR法扩增抗体基因。根据公知的抗体基因序列，可设计小鼠抗体基因扩增用的引物。这些引物根据免疫球蛋白的亚类而具有不同的核苷酸序列。因此，理想的是使用Iso Strip小鼠单克隆抗体同种型分型试剂盒(RocheDiagnostics)等市售试剂盒来预先确定亚类。

具体而言，例如为了获得编码小鼠IgG的基因时，可以使用下述引物，其能够扩增编码作为重链的γ1、γ2a、γ2b、γ3、作为轻链的κ链和λ链的基因。为了扩增IgG的可变区基因，通常3’侧的引物使用会退火到相当于接近可变区的恒定区的部分上的引物。而5’侧的引物则使用5’RACEcDNA文库制作试剂盒所附带的引物。

使用如此扩增而得到的PCR产物，可以重构由重链和轻链的组合构成的免疫球蛋白。将经重构的免疫球蛋白针对IgA的结合活性作为指标，可筛选所期望的抗体。例如，为了获得抗IgA的抗体时，进一步优选抗体对IgA的结合是特异性的。与IgA结合的抗体例如可如下进行筛选：

步骤(1)，使包含由杂交瘤获得的cDNA所编码的V区的抗体与IgA接触；

步骤(2)，检测IgA与抗体的结合；以及

步骤(3)，选择与IgA表达细胞结合的抗体。

检测抗体与IgA的结合的方法是公知的。具体而言，通过之前所述的ELISA等方法，可检测出抗体与IL-6R表达细胞的结合。

作为以结合活性为指标的抗体的筛选方法，还优选采用淘选法，其利用了噬菌体载体。由多克隆抗体表达细胞群以重链和轻链的亚类的文库形式获得抗体基因时，有利的是利用噬菌体载体的筛选方法。编码重链和轻链的可变区的基因通过用适当的接头序列连接，可形成单链Fv(scFv)。通过将编码scFv的基因插入噬菌体载体中，可以获得在表面表达scFv的噬菌体。该噬菌体与所期望的抗原接触后，回收与抗原结合的噬菌体，从而可以回收编码具有目标结合活性的scFv的DNA。根据需要重复该操作，从而可以浓缩具有所期望的结合活性的scFv。

得到目标的编码抗IgA抗体V区的cDNA后，该cDNA被识别插入该cDNA的两末端的限制酶位点的限制酶消化。优选的限制酶会识别并消化在构成抗体基因的核苷酸序列中出现的频率低的核苷酸序列。进而，为了将1拷贝的消化片段以正确方向插入载体中，优选插入能提供粘性末端的限制酶。将如上消化的编码抗IgA抗体V区的cDNA插入适当的表达载体中，由此可获得抗体表达载体。此时，只要将编码抗体恒定区(C区)的基因和编码上述V区的基因框内融合，则可获得嵌合抗体。这里，嵌合抗体是指恒定区和可变区的来源不同。因此，除了小鼠-人等异种嵌合抗体之外，人-人同种嵌合抗体也包含在本发明的嵌合抗体中。通过在预先具有恒定区的表达载体中插入上述V区基因，可以构建嵌合抗体表达载体。具体而言，例如，可在保持有编码所期望的抗体恒定区(C区)的DNA的表达载体的5’侧适当地配置消化上述V区基因的限制酶的限制酶识别序列。对经相同组合的限制酶消化的两者进行框内融合，由此构建嵌合抗体表达载体。

为了制造抗IgA单克隆抗体，以在表达调控区的调控下进行表达的方式，将抗体基因插入表达载体中。用于表达抗体的表达调控区包含例如增强子或启动子。另外，可以在氨基末端添加合适的信号序列，以使表达的抗体分泌到细胞外。在后述实施例中，作为信号序列使用了具有氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO:5)的肽，除此之外也可以添加合适的信号序列。表达的多肽在上述序列的羧基末端部分被切断，被切断的多肽能够以成熟多肽的形式分泌到细胞外。接着，用该表达载体转化适当的宿主细胞，由此可以获得表达编码抗IgA抗体的DNA的重组细胞。

为了表达抗体基因，编码抗体重链(H链)和轻链(L链)的DNA被分别整合于其他的表达载体中。通过用整合有H链和L链的载体共转化(co-transfect)成相同的宿主细胞，可以表达具备H链和L链的抗体分子。或者，将编码H链和L链的DNA插入单一表达载体中，从而可以转化宿主细胞(参照国际公开第WO 1994/011523号)。

用于将分离的抗体基因导入适当的宿主中来制作抗体的宿主细胞和表达载体的多个组合是公知的。这些表达系统均可用于分离本发明的抗原结合分子。将真核细胞用作宿主细胞时，可适当使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞。具体而言，动物细胞可例示下述细胞。

(1)哺乳动物细胞：CHO(中国仓鼠卵巢细胞株)、COS(猴肾细胞株)、骨髓瘤(Sp2/O、NS0等)、BHK(幼仓鼠肾细胞株)、HEK293(携带已剪切腺病毒(Ad)5DNA的人胚肾细胞株)、PER.C6细胞(用5型腺病毒(Ad5)E1A和E1B基因转化的人胚视网膜细胞株)、Hela、Vero、HEK293(携带已剪切腺病毒(Ad)5DNA的人胚肾细胞株)等(CurrentProtocols in Protein Science(May,2001,Unit5.9,Table5.9.1))；

(2)两栖动物细胞：非洲爪蟾卵母细胞等；

(3)昆虫细胞：sf9、sf21、Tn5等。

或者，作为植物细胞，公知有基于来源于烟草(Nicotiana tabacum)等烟草(Nicotiana)属的细胞的抗体基因表达系统。在植物细胞的转化中，可以适当使用进行了愈伤组织培养的细胞。

进而，作为真菌细胞，可以使用如下细胞：

-酵母：酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)等酵母(Saccharomyces)属、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)等毕赤酵母属；

-丝状真菌：黑曲霉菌(Aspergillus niger)等曲霉(Aspergillus)属。

另外，利用原核细胞的抗体基因表达系统也是公知的。例如，使用细菌细胞时，可适当利用大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌等细菌细胞。通过转化向这些细胞中导入含有目标抗体基因的表达载体。通过在体外培养经转化的细胞，可以从该转化细胞的培养物中获得所期望的抗体。

除了上述宿主细胞之外，重组抗体的产生也可以利用转基因动物。即，可以由导入有编码所期望抗体的基因的动物获得该抗体。例如，抗体基因可以通过框内插入编码乳汁中固有产生的蛋白的基因的内部，而构建为融合基因。作为分泌至乳汁中的蛋白，可利用例如山羊β酪蛋白等。将含有插入了抗体基因的融合基因的DNA片段注入山羊的胚胎中，再将该注入了的胚胎导入母山羊体内。由接受了胚胎的山羊生出的转基因山羊(或其后代)产生的乳汁中，能够以与乳汁蛋白形成的融合蛋白的形式获得所期望的抗体。另外，为了使由转基因山羊产生的含有所期望抗体的乳汁量增加，可以对转基因山羊给予激素(Bio/Technology(1994),12(7),699-702)。

对人给予本说明书中记载的抗原结合分子时，作为该抗原结合分子中的抗原结合结构域，可以适当采用来源于基因重组型抗体的抗原结合结构域，所述基因重组型抗体为了降低针对人的异源抗原性等目的已进行了人工修饰。基因重组型抗体包含例如人源化(humanized)抗体等。这些修饰抗体可使用公知方法适当制造。

为了制作本说明书中记载的抗原结合分子的抗原结合结构域而使用的抗体的可变区通常由被4个构架区(FR)夹持的3个互补性决定区(complementarity-determining region；CDR)构成。CDR实质上是决定抗体结合特异性的区域。CDR的氨基酸序列富有多样性。另一方面，构成FR的氨基酸序列即便在具有不同结合特异性的抗体之间也往往显示出高度的同源性。因此，通常认为可以通过CDR的移植来将某抗体的结合特异性移植到其它抗体中。

人源化抗体也被称为重构(reshaped)人抗体。具体而言，将人以外的动物例如小鼠抗体的CDR移植到人抗体中的应用了CDR移植技术(CDR grafting technology)的人源化抗体等是公知的。用于获得人源化抗体的通常的基因重组方法也是已知的。具体而言，作为用于将小鼠抗体的CDR移植到人的FR中的方法，公知的是例如重叠延伸PCR。重叠延伸PCR中，用于合成人抗体FR的引物中添加有编码待移植小鼠抗体CDR的核苷酸序列。针对4个FR分别准备引物。通常，将小鼠CDR移植至人FR时，选择与小鼠FR同源性高的人FR，但在维持CDR功能方面认为有利。即，通常优选使用下述人FR，其包含与待移植小鼠CDR的相邻FR氨基酸序列的同源性高的氨基酸序列。

另外，连接的核苷酸序列被设计成相互框内连接。通过各引物单独地合成人FR。其结果，得到各FR上添加有编码小鼠CDR的DNA的产物。各产物的编码小鼠CDR的核苷酸序列被设计成相互重叠。接着，使以人抗体基因为模板合成的产物的重叠CDR部分相互退火，进行互补链合成反应。通过该反应，人FR经由小鼠CDR序列来连接。

最终3个CDR和4个FR连接得到的V区基因，通过会与其5’末端和3’末端发生退火并添加有适当的限制酶识别序列的引物而扩增出其全长。将如上得到的DNA和编码人抗体C区的DNA以进行框内融合的方式插入表达载体中，由此可以制作人型抗体表达用载体。将该整合载体导入宿主中建立重组细胞后，培养该重组细胞，通过表达编码该人源化抗体的DNA，在该培养细胞的培养物中产生该人源化抗体(参照欧州专利公开EP239400、国际公开第WO1996/002576号)。

通过定性或者定量地测定并评价如上制作的人源化抗体对抗原的结合活性，可以优选选择人抗体FR，以便经由CDR连接时该CDR形成良好的抗原结合位点。根据需要，也可以按照重构人抗体CDR形成合适的抗原结合位点的方式取代FR的氨基酸残基。例如，可以应用将小鼠CDR移植到人FR中使用的PCR法，向FR中导入氨基酸序列的突变。具体而言，可以向会与FR发生退火的引物中导入部分核苷酸序列的突变。通过这类引物合成的FR中导入了核苷酸序列的突变。通过用上述方法测定并评价进行了氨基酸取代的突变型抗体对抗原的结合活性，可以选择具有所期望的性质的突变FR序列(CancerRes.,(1993)53,851-856)。

此外，将具有人抗体基因的全部组成成分的转基因动物(参照国际公开WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735)作为免疫动物，通过DNA免疫可以获得所期望的人抗体。

进而，使用人抗体文库通过淘选法获得人抗体的技术也是已知的。例如，人抗体的V区以单链抗体(scFv)的形式通过噬菌体展示法表达在噬菌体的表面。可以选择表达与抗原结合的scFv的噬菌体。通过对选择的噬菌体的基因进行分析，可以确定编码与抗原结合的人抗体V区的DNA序列。确定与抗原结合的scFv的DNA序列后，将该V区序列与所期望的人抗体C区序列框内融合后，插入适当的表达载体中，由此可以制作表达载体。将该表达载体导入上述列举的适当的表达细胞中，使编码该人抗体的基因表达，从而可以获得该人抗体。这些方法已经公知(参照国际公开WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388)。

另外，作为获得抗体基因的方法，除了上述方法外，还可适当地使用如Bernasconi等人(Science(2002)298,2199-2202)或国际公开WO2008/081008中记载的B细胞克隆(各抗体的编码序列的鉴定和克隆、其分离、以及用于制备各抗体(特别是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的表达载体构建用的用途等)的方法。

EU编号和Kabat编号

根据本发明中使用的方法，分配给抗体的CDR和FR的氨基酸位置依照Kabat规定(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health,Bethesda,Md.,1987年和1991年)。本说明书中，抗原结合分子为抗体或抗原结合片段时，可变区的氨基酸按照Kabat编号来表示，恒定区的氨基酸按照基于Kabat氨基酸位置的EU编号来表示。

离子浓度条件

金属离子浓度条件

在本发明的一个方案中，离子浓度是指金属离子浓度。“金属离子”是指属于除了氢以外的碱金属和铜族等第I族、碱土金属和锌族等第II族、除了硼之外的第III族、除了碳和硅之外的第IV族、铁族和铂族等第VIII族、V、VI和VII族的各A亚族的元素、以及锑、铋、钋等金属元素的离子。金属原子具有释放出原子价电子而形成阳离子的性质，称之为离子化倾向。认为离子化倾向大的金属富有化学活性。

作为本发明中优选的金属离子的实例，可以列举钙离子。钙离子参与多种生命现象的调节，钙离子参与骨骼肌、平滑肌和心肌等肌肉的收缩、白细胞的运动和吞噬等的活化、血小板的变形和分泌等的活化、淋巴细胞的活化、组胺的分泌等肥大细胞的活化、儿茶酚胺α受体或乙酰胆碱受体介导的细胞应答、胞吐作用、递质从神经元末端的释放、神经元的轴浆流等。作为细胞内的钙离子受体，已知具有多个钙离子结合位点、且认为在分子进化上来源于共同起源的肌钙蛋白C、钙调蛋白、小白蛋白、肌球蛋白轻链等，其结合模体也大多已知。例如，还熟知钙黏蛋白结构域、钙调蛋白所含的EF手、蛋白激酶C所含的C2结构域、凝血蛋白因子IX所含的Gla结构域、脱唾液酸糖蛋白受体或甘露糖结合受体所含的C型凝集素、LDL受体所含的A结构域、膜联蛋白、血小板反应蛋白3型结构域和EGF样结构域。

本发明中，在金属离子为钙离子时，作为钙离子浓度条件，可以列举低钙离子浓度条件和高钙离子浓度条件。结合活性随钙离子浓度条件而变化是指，低钙离子浓度和高钙离子浓度条件的不同导致抗原结合分子对抗原的结合活性发生变化。例如可以列举：高钙离子浓度条件下抗原结合分子对抗原的结合活性高于低钙离子浓度条件下抗原结合分子对抗原的结合活性的情形。此外还可以列举：低钙离子浓度条件下抗原结合分子对抗原的结合活性高于高钙离子浓度条件下抗原结合分子对抗原的结合活性的情形。

本说明书中，高钙离子浓度并不特别限于统一的数值，可以是优选选自100μM至10mM之间的浓度。此外，在其他方案中，可以是选自200μM至5mM之间的浓度。此外，在不同的方案中，可以是选自400μM至3mM之间的浓度，在其他的方案中也可以是选自200μM至2mM之间的浓度。进而，还可以是选自400μM至1mM之间的浓度。特别优选列举选自与生物体内血浆中(血中)的钙离子浓度接近的500μM至2.5mM之间的浓度。

本说明书中，低钙离子浓度并不特别限于统一的数值，可以是优选选自0.1μM至30μM之间的浓度。此外，在其他方案中，可以是选自0.2μM至20μM之间的浓度。此外，在不同的方案中，可以是选自0.5μM至10μM之间的浓度，在其他的方案中也可以是选自1μM至5μM之间的浓度。进而，还可以是选自2μM至4μM之间的浓度。特别优选列举选自与生物体内的早期核内体内的离子化钙浓度接近的1μM至5μM之间的浓度。

本发明中，低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性意指，抗原结合分子在选自0.1μM至30μM之间的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于选自100μM至10mM之间的钙离子浓度下的抗原结合活性。优选意指抗原结合分子在选自0.5μM至10μM之间的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于在选自200μM至5mM之间的钙离子浓度下的抗原结合活性，特别优选意指生物体内的早期核内体内的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于生物体内的血浆中的钙离子浓度下的抗原结合活性，具体意指抗原结合分子在选自1μM至5μM之间的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于在选自500μM至2.5mM之间的钙离子浓度下的抗原结合活性。

抗原结合分子对抗原的结合活性是否随金属离子浓度条件而变化，这可以通过使用例如上述结合活性项目中记载的公知测定方法来确定。例如，为了确认与低钙离子浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性相比高钙离子浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性变得更高，对低钙离子浓度和高钙离子浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性进行比较。

进而，本发明中，“低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性”的表述也可以表述为抗原结合分子在高钙离子浓度条件下的抗原结合活性高于在低钙离子浓度条件下的抗原结合活性。需要说明的是，本发明中有时也将“低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性”记载为“低钙离子浓度条件下的抗原结合能力弱于高钙离子浓度条件下的抗原结合能力”，此外，有时也将“使低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性”记载为“使低钙离子浓度条件下的抗原结合能力弱于高钙离子浓度条件下的抗原结合能力”。

本领域技术人员可以适当选择测定抗原结合活性时的钙离子浓度以外的条件，没有特别限定。例如，可以在HEPES缓冲液、37℃的条件下进行测定。例如，可以使用Biacore(GE Healthcare)等进行测定。关于抗原结合分子与抗原的结合活性的测定，在抗原为可溶型抗原时，通过对固定有抗原结合分子的芯片流过作为分析物的抗原，可以评价对可溶型抗原的结合活性；在抗原为膜型抗原时，通过对固定有抗原的芯片流过作为分析物的抗原结合分子，可以评价对膜型抗原的结合活性。

本发明的抗原结合分子中，只要低钙离子浓度条件下的抗原结合活性弱于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性，则低钙离子浓度条件下的抗原结合活性和高钙离子浓度条件下的抗原结合活性之比没有特别限定，优选相对于抗原的低钙离子浓度条件下的KD(Dissociationconstant：解离常数)与高钙离子浓度条件下的KD之比即KD(Ca3μM)/KD(Ca 2mM)的值为2以上，进一步优选KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2mM)的值为10以上，进一步优选KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2mM)的值为40以上。KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2mM)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制作，则可以是400、1000、10000等任意的值。

作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型抗原时可以使用KD(解离常数)，而在抗原为膜型抗原时可以使用表观KD(Apparentdissociation constant：表观解离常数)。KD(解离常数)和表观KD(表观解离常数)可通过本领域技术人员公知的方法进行测定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、斯卡查德图(Scatchard plot)、流式细胞仪等。

此外，作为显示本发明的抗原结合分子的低钙浓度条件下的抗原结合活性与高钙浓度条件下的抗原结合活性之比的其它指标，还可优选使用例如解离速率常数kd(Dissociation rate constant：解离速率常数)。代替KD(解离常数)而使用kd(解离速率常数)来作为显示结合活性之比的指标时，相对于抗原的低钙浓度条件下的kd(解离速率常数)与高钙浓度条件下的kd(解离速率常数)之比kd(低钙浓度条件)/kd(高钙浓度条件)的值优选为2以上，进一步优选为5以上，进一步优选为10以上，更优选为30以上。对Kd(低钙浓度条件)/kd(高钙浓度条件)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术常识可以制作，则可以是50、100、200等任意的值。

作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型抗原时可以使用kd(解离速率常数)，而在抗原为膜型抗原时可以使用表观kd(Apparentdissociation rate constant：表观解离速率常数)。kd(解离速率常数)和表观kd(表观解离速率常数)可通过本领域技术人员公知的方法测定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、流式细胞仪等。需要说明的是，本发明中，在测定不同钙离子浓度下的抗原结合分子的抗原结合活性时，钙浓度以外的条件优选为相同。

例如，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子可通过包含以下步骤(a)～(c)的抗原结合结构域或抗体的筛选来获得：

步骤(a)，获得低钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性；

步骤(b)，获得高钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性；

步骤(c)，选择低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子。

进而，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子可通过包含以下步骤(a)～(c)的抗原结合结构域或抗原结合分子或其文库的筛选来获得：

步骤(a)，在高钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗原结合分子或其文库与抗原接触；

步骤(b)，将在上述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗原结合分子置于低钙浓度条件下；

步骤(c)，对在上述步骤(b)中发生解离的抗原结合结构域或抗原结合分子进行分离。

此外，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子可通过包含以下步骤(a)～(d)的抗原结合结构域或抗原结合分子或其文库的筛选来获得：

步骤(a)，在低钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗原结合分子的文库与抗原接触；

步骤(b)，选择在上述步骤(a)中未与抗原结合的抗原结合结构域或抗原结合分子；

步骤(c)，使在上述步骤(b)中选择的抗原结合结构域或抗原结合分子在高钙浓度条件下与抗原结合；

步骤(d)，对在上述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗原结合分子进行分离。

进而，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子可通过包含以下步骤(a)～(c)的筛选方法来获得：

步骤(a)，在高钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗原结合分子的文库与固定有抗原的柱接触；

步骤(b)，将在上述步骤(a)中与柱结合的抗原结合结构域或抗原结合分子在低钙浓度条件下从柱上洗脱；

步骤(c)，对在上述步骤(b)中被洗脱的抗原结合结构域或抗原结合分子进行分离。

进而，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子可通过包含以下步骤(a)～(d)的筛选方法来获得：

步骤(a)，在低钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗原结合分子的文库通过固定有抗原的柱；

步骤(b)，对在上述步骤(a)中未与柱结合而洗脱的抗原结合结构域或抗原结合分子进行回收；

步骤(c)，使在上述步骤(b)中回收的抗原结合结构域或抗原结合分子在高钙浓度条件下与抗原结合；

步骤(a)，在高钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗原结合分子的文库与抗原接触；

步骤(b)，获得在上述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗原结合分子；

步骤(c)，将在上述步骤(b)中获得的抗原结合结构域或抗原结合分子置于低钙浓度条件下；

步骤(d)，对上述步骤(c)中抗原结合活性弱于上述步骤(b)中选择的标准的抗原结合结构域或抗原结合分子进行分离。

需要说明的是，上述步骤可以重复两次以上。因此，根据本发明可提供通过上述筛选方法中进一步包括将步骤(a)～(c)或步骤(a)～(d)重复两次以上的步骤的筛选方法而获得的低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子。步骤(a)～(c)或步骤(a)～(d)的重复次数没有特别限定，通常为10次以内。

本发明的筛选方法中，低钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性只要是离子化钙浓度为0.1μM～30μM之间的抗原结合活性则没有特别限定，作为优选的离子化钙浓度，可以列举0.5μM～10μM之间的抗原结合活性。作为更优选的离子化钙浓度，可以列举生物体内的早期核内体内的离子化钙浓度，具体可以列举1μM～5μM下的抗原结合活性。另外，高钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性只要是离子化钙浓度为100μM～10mM之间的抗原结合活性则没有特别限定，作为优选的离子化钙浓度，可以列举200μM～5mM之间的抗原结合活性。作为更优选的离子化钙浓度，可以列举生物体内的血浆中的离子化钙浓度，具体可以列举0.5mM～2.5mM时的抗原结合活性。

抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性可通过本领域技术人员公知的方法测定，关于离子化钙浓度以外的条件，本领域技术人员可以适当决定。抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性可以作为KD(Dissociation constant：解离常数)、表观KD(Apparentdissociation constant：表观解离常数)、解离速率kd(Dissociation rate：解离速率常数)、或表观kd(Apparent dissociation：表观解离速率常数)等来进行评价。它们可以通过本领域技术人员公知的方法来测定，例如可以使用Biacore(GE healthcare)、斯卡查德图、FACS等。

本发明中，选择高钙浓度条件下的抗原结合活性高于低钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子的步骤，与选择低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子的步骤含义相同。

只要高钙浓度条件下的抗原结合活性高于低钙浓度条件下的抗原结合活性，则对高钙浓度条件下的抗原结合活性与低钙浓度条件下的抗原结合活性之差没有特别限定，优选高钙浓度条件下的抗原结合活性是低钙浓度条件下的抗原结合活性的2倍以上，进一步优选为10倍以上，更优选为40倍以上。

通过上述筛选方法筛选的本发明的抗原结合结构域或抗原结合分子可以是任意的抗原结合结构域或抗原结合分子，例如，可以筛选上述的抗原结合结构域或抗原结合分子。例如，可以筛选具有天然序列的抗原结合结构域或抗原结合分子，也可以筛选氨基酸序列被取代的抗原结合结构域或抗原结合分子。

文库

根据一个方案，本发明的抗原结合结构域或抗原结合分子可以由文库获得，所述文库主要由多个抗原结合分子形成，所述多个抗原结合分子的序列彼此不同，并且其抗原结合结构域中含有至少一个使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的氨基酸残基。作为离子浓度的实例，优选列举金属离子浓度或氢离子浓度。

本说明书中，“文库”是指多个抗原结合分子或含有抗原结合分子的多个融合多肽、或编码它们的序列的核酸、多核苷酸。文库中所含的多个抗原结合分子或含有抗原结合分子的多个融合多肽的序列并非单一的序列，而是序列彼此不同的抗原结合分子或含有抗原结合分子的融合多肽。

本说明书中，序列彼此不同的多个抗原结合分子的记载中的“序列彼此不同”这一术语意指文库中的各抗原结合分子的序列彼此不同。即，文库中的彼此不同的序列的数量反映文库中的序列不同的独立克隆的数量，有时也被视为“文库大小”。通常的噬菌体展示文库为10⁶至10¹²，通过使用核糖体展示法等公知的技术，可将文库大小放大至10¹⁴。然而，噬菌体文库的淘选选择时使用的噬菌体颗粒的实际数目通常比文库大小大10至10,000倍。该过量倍数也称为“文库当量数”，表示具有相同氨基酸序列的各克隆能够存在10至10,000个。所以，本发明中的“序列彼此不同”这一术语意指文库当量数除外的文库中的各抗原结合分子的序列彼此不同，更具体意指序列彼此不同的抗原结合分子存在10⁶至10¹⁴个分子、优选10⁷至10¹²个分子、进一步优选10⁸至10¹¹个分子、特别优选10⁸至10¹⁰个分子。

此外，本发明中的主要由多个抗原结合分子形成的文库这一记载中的术语“多个”，对于例如本发明的抗原结合分子、融合多肽、多核苷酸分子、载体或病毒而言，通常是指这些物质的两种以上的集合。例如，只要某2个以上的物质在特定形态方面彼此不同，则表示该物质存在两种以上。作为实例，可以列举在氨基酸序列中的特定氨基酸位置观察到的突变体氨基酸。例如，当除了柔性残基以外或除了露出于表面的超变氨基酸位置的特定突变体氨基酸以外序列实质上相同、且优选存在序列相同的本发明的2个以上的抗原结合分子时，则存在多个本发明的抗原结合分子。在其他例子中，当除了编码柔性残基的碱基以外或除了编码露出于表面的超变氨基酸位置的特定突变体氨基酸的碱基以外实质上相同、且优选存在序列相同的本发明的2个以上的多核苷酸分子时，则存在多个本发明中的多核苷酸分子。

进而，本发明中的主要由多个抗原结合分子形成的文库的记载中的“主要由...形成”的表述反映出文库中的序列不同的独立克隆的数量中，抗原结合分子对抗原的结合活性随离子浓度条件而不同的抗原结合分子的数量。具体而言，优选显示出这种结合活性的抗原结合分子在文库中至少存在10⁴个分子。此外，更优选本发明的抗原结合结构域可由显示出这种结合活性的抗原结合分子至少存在10⁵个分子的文库中获得。进一步优选本发明的抗原结合结构域可由显示出这种结合活性的抗原结合分子至少存在10⁶个分子的文库中获得。特别优选本发明的抗原结合结构域可由显示出这种结合活性的抗原结合分子至少存在10⁷个分子的文库中获得。还优选本发明的抗原结合结构域可由显示出这种结合活性的抗原结合分子至少存在10⁸个分子的文库中获得。在其它表述中，也可适当表述为在文库中的序列不同的独立克隆的数量中抗原结合分子对抗原的结合活性随离子浓度条件而不同的抗原结合分子的比例。具体而言，本发明的抗原结合结构域可以由显示出这种结合活性的抗原结合分子占文库中序列不同的独立克隆的数量的0.1％至80％、优选0.5％至60％、更优选1％至40％、进一步优选2％至20％、特别优选4％至10％的文库中获得。融合多肽、多核苷酸分子或载体的情形也和上述相同，可以用分子的数量或全部分子中的比例来表述。此外，病毒的情形也和上述相同，可以用病毒个体的数量或全部个体中的比例来表述。

使抗原结合结构域的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸

通过上述筛选方法筛选的本发明的抗原结合结构域或抗原结合分子可以任意制备，例如，在金属离子为钙离子浓度的情况下，可以使用预先存在的抗原结合分子、预先存在的文库(噬菌体文库等)、由对动物进行免疫得到的杂交瘤或来自免疫动物的B细胞制得的抗体或文库、向这些抗体或文库中导入能螯合钙的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突变而得到的抗体或文库(能螯合钙的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的含有率提高的文库、或者在特定位置导入能够螯合钙的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突变而得到的文库等)等。

如上所述，作为使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的氨基酸的实例，例如，在金属离子为钙离子时，只要是形成钙结合模体的氨基酸即可，不论其种类如何。钙结合模体为本领域技术人员所周知，并且有详细记载(例如Springer等人(Cell(2000)102,275-277)；Kawasaki和Kretsinger(Protein Prof.(1995)2,305-490)；Moncrief等人(J.Mol.Evol.(1990)30,522-562)；Chauvaux等人(Biochem.J.(1990)265,261-265)；Bairoch和Cox(FEBS Lett.(1990)269,454-456)；Davis(New Biol.(1990)2,410-419)；Schaefer等人(Genomics(1995)25,638～643)；Economou等人(EMBOJ.(1990)9,349-354)；Wurzburg等人(Structure.(2006)14,6,1049-1058))。即，本发明的抗原结合分子中可以含有ASGPR、CD23、MBR、DC-SIGN等C型凝集素等任意的公知钙结合模体。作为这种钙结合模体的优选实例，除了上述钙结合模体之外，还可以列举SEQ ID NO:6所记载的抗原结合结构域中所含的钙结合模体。

此外，作为使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸的实例，也可优选使用具有金属螯合作用的氨基酸。作为具有金属螯合作用的氨基酸的实例，优选列举例如丝氨酸(Ser(S))、苏氨酸(Thr(T))、天冬酰胺(Asn(N))、谷氨酰胺(Gln(Q))、天冬氨酸(Asp(D))和谷氨酸(Glu(E))等。

含有上述氨基酸的抗原结合结构域的位置并不限于特定的位置，只要使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化，则可以是形成抗原结合结构域的重链可变区或轻链可变区中的任意位置。即，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，所述文库主要由重链的抗原结合结构域中含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。此外，在其他方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，所述文库主要由重链的CDR3中含有该氨基酸、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。在其它方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，所述文库主要由重链的CDR3的以Kabat编号表示的95位、96位、100a位和/或101位含有该氨基酸、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。

此外，在本发明的一个方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，所述文库主要由轻链的抗原结合结构域中含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。此外，在其他方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，所述文库主要由轻链的CDR1中含有该氨基酸、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。在其它方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，所述文库主要由轻链的CDR1的以Kabat编号表示的30位、31位和/或32位含有该氨基酸、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。

此外，在其他方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，所述文库主要由轻链的CDR2中含有该氨基酸残基、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。在其它方案中提供下述文库，所述文库主要由轻链的CDR2的以Kabat编号表示的50位含有该氨基酸残基、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。

进而，在其他方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，所述文库主要由轻链的CDR3中含有该氨基酸残基、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。在其它方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，所述文库主要由轻链的CDR3的以Kabat编号表示的92位含有该氨基酸残基、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。

此外，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库作为本发明的不同方案来获得，所述文库主要由选自上述记载的轻链的CDR1、CDR2和CDR3中的2个或3个CDR含有该氨基酸残基、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。进而，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，所述文库主要由轻链的以Kabat编号表示的30位、31位、32位、50位和/或92位中的任一者以上含有该氨基酸残基、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。

在特别优选的实施方案中，理想的是抗原结合分子的轻链和/或重链可变区的构架序列具有人的种系构架序列。因此，在本发明的一个方案中，若构架序列完全为人的序列，则认为在给予人(例如疾病的治疗)时，本发明的抗原结合分子基本或完全不会引起免疫原性反应。根据上述含义，本发明中的“含有种系序列”意指本发明的构架序列的一部分与任意的人的种系构架序列的一部分相同。例如，在本发明的抗原结合分子的重链FR2序列为多个不同的人的种系构架序列的重链FR2序列组合得到的序列时，该抗原结合分子也是本发明的“含有种系序列”的抗原结合分子。

作为构架的实例，例如优选列举现在已知的完全人型构架区的序列，其包含在V-Base(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)等网站中。这些构架区的序列能够适当用作本发明的抗原结合分子中所含的种系序列。种系序列可根据其相似性来分类(Tomlinson等人(J.Mol.Biol.(1992)227,776-798)Williams和Winter(Eur.J.Immunol.(1993)23,1456-1461)和Cox等人(Nat.Genetics(1994)7,162-168))。可以从分类为7个亚类的Vκ、分类为10个亚类的Vλ、分类为7个亚类的VH中适当选择合适的种系序列。

完全人型VH序列并不仅限于下述序列，优选列举例如VH1亚类(例如，VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69)、VH2亚类(例如，VH2-5、VH2-26、VH2-70)、VH3亚类(VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74)、VH4亚类(VH4-4、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61)、VH5亚类(VH5-51)、VH6亚类(VH6-1)、VH7亚类(VH7-4、VH7-81)的VH序列等。它们也记载于公知文献(Matsuda等人(J.Exp.Med.(1998)188,1973-1975))等中，本领域技术人员可以根据它们的序列信息适当设计本发明的抗原结合分子。也可优选使用它们以外的完全人型构架或构架的亚区域(sub-region)。

完全人型Vκ序列并不仅限于下述序列，例如优选列举：分类为Vk1亚类的A20、A30、L1、L4、L5、L8、L9、L11、L12、L14、L15、L18、L19、L22、L23、L24、O2、O4、O8、O12、O14、O18；分类为Vk2亚类的A1、A2、A3、A5、A7、A17、A18、A19、A23、O1、O11；分类为Vk3亚类的A11、A27、L2、L6、L10、L16、L20、L25；分类为Vk4亚类的B3；分类为Vk5亚类的B2(本说明书中也称为Vk5-2)；分类为Vk6亚类的A10、A14、A26等(Kawasaki等人(Eur.J.Immunol.(2001)31,1017-1028)；Schable和Zachau(Biol.Chem.HoppeSeyler(1993)374,1001-1022)和Brensing-Kuppers等人(Gene(1997)191,173-181))。

完全人型的Vλ序列并不仅限于下述序列，例如优选列举：分类为VL1亚类的V1-2、V1-3、V1-4、V1-5、V1-7、V1-9、V1-11、V1-13、V1-16、V1-17、V1-18、V1-19、V1-20、V1-22；分类为VL1亚类的V2-1、V2-6、V2-7、V2-8、V2-11、V2-13、V2-14、V2-15、V2-17、V2-19；分类为VL3亚类的V3-2、V3-3、V3-4；分类为VL4亚类的V4-1、V4-2、V4-3、V4-4、V4-6；分类为VL5亚类的V5-1、V5-2、V5-4、V5-6等(Kawasaki等人(Genome Res.(1997)7,250-261))。

通常，这些构架序列根据一个或更多的氨基酸残基的区别而彼此不同。这些构架序列可以与本发明中的“使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基”一起使用。作为与本发明中的“使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基”一起使用的完全人型构架的实例，并不仅限于此，另外还可以列举KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY、POM等(例如，上述的Kabat等人(1991)和Wu等人(J.Exp.Med.(1970)132,211-250))。

本发明并不受特定理论的束缚，认为种系序列的使用有望排除大多数个体中的有害免疫应答的一个理由如下。通常的免疫应答中产生的亲和性成熟步骤的结果造成免疫球蛋白的可变区频繁地产生体细胞的突变。这些突变主要产生在其序列为超变的CDR的附近，对构架区的残基也造成影响。这些构架的突变在种系基因中不存在，而成为患者的免疫原性的可能性也小。另一方面，通常的人群暴露于种系基因所表达的构架序列的大多数，作为免疫耐受性的结果，预测这些种系构架在患者中的免疫原性低或为非免疫原性。为了使免疫耐受性的可能性达到最大，编码可变区的基因可以从通常存在的功能性种系基因的集合中选择。

为了制作本发明的、上述可变区序列的序列、重链可变区或轻链可变区的序列、或CDR序列或构架序列中含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸的抗原结合分子，可以适当地采用位点特异性诱变法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或重叠延伸PCR等公知方法。

例如，通过将被选择作为预先含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基的构架序列的轻链可变区与被制作为随机可变区序列文库的重链可变区组合，可以制作含有本发明的多个序列彼此不同的抗原结合分子的文库。作为这样的非限定性实例，在离子浓度为钙离子浓度时，例如优选列举：将SEQID NO:6(Vk5-2)所记载的轻链可变区序列和作为随机可变区序列文库而制作的重链可变区组合而成的文库。

此外，也可以设计成上述被选择作为预先含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基的构架序列的轻链可变区的序列中含有作为该氨基酸残基以外的残基的各种氨基酸。在本发明中这样的残基也被称为柔性残基。本发明的抗原结合分子的抗原结合活性只要随离子浓度条件而变化，则该柔性残基的数目和位置并不限于特定的方案。即，重链和/或轻链的CDR序列和/或FR序列中可以含有一个或更多的柔性残基。例如，在离子浓度为钙离子浓度时，作为导入SEQ ID NO:6(Vk5-2)所记载的轻链可变区序列中的柔性残基的非限定性实例，可以列举表1或表2所记载的氨基酸残基。

[表1]

(位置表示Kabat编号)

[表2]

(位置表示Kabat编号)

本说明书中，柔性残基是指在与公知和/或天然抗体或抗原结合结构域的氨基酸序列进行比较时，具有在该位置上出现的数个不同氨基酸的轻链和重链可变区上的氨基酸为超变的位置上存在的氨基酸残基的改变。超变的位置一般存在于CDR区。一个方案中，在确定公知和/或天然抗体的超变位置时，Kabat,Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institute of Health Bethesda Md.)(1987年和1991年)所提供的数据是有效的。此外，因特网上的多个数据库(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/、http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html)中提供有收集的大量人轻链和重链的序列以及其配置，这些序列及其配置的信息对确定本发明中的超变位置有用。根据本发明，当氨基酸在某位置具有优选约2至约20、优选约3至约19、优选约4至约18、优选5至17、优选6至16、优选7至15、优选8至14、优选9至13、优选10至12个可能的不同的氨基酸残基的多样性时，可以说该位置是超变的。在数个实施方案中，某氨基酸位置可以具有优选至少约2、优选至少约4、优选至少约6、优选至少约8、优选约10、优选约12个可能的不同氨基酸残基的多样性。

此外，通过将上述导入有使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基的轻链可变区和作为随机可变区序列文库而制作的重链可变区组合，也可以制作含有本发明的多个序列彼此不同的抗原结合分子的文库。作为这样的非限定性实例，在离子浓度为钙离子浓度时，例如优选列举：将SEQ ID NO:7(Vk1)、SEQ ID NO:8(Vk2)、SEQ ID NO:9(Vk3)、SEQ ID NO:10(Vk4)等种系的特定残基取代成使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基的轻链可变区序列和作为随机可变区序列文库而制作的重链可变区组合而得的文库。作为该氨基酸残基的非限定性实例，例示轻链的CDR1中所含的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基的非限定性实例，例示轻链的CDR2中所含的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基的非限定性的其它实例，还例示轻链的CDR3中所含的氨基酸残基。

如上所述，作为该氨基酸残基为轻链CDR1中所含的氨基酸残基的非限定性实例，可以列举轻链可变区的CDR1中的以EU编号表示的30位、31位和/或32位的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基为轻链CDR2中所含的氨基酸残基的非限定性实例，可以列举轻链可变区的CDR2中的以Kabat编号表示的50位的氨基酸残基。进而，作为该氨基酸残基为轻链CDR3中所含的氨基酸残基的非限定性实例，可以列举轻链可变区的CDR3中的以Kabat编号表示的92位的氨基酸残基。此外，这些氨基酸残基只要可形成钙结合模体、和/或使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化，则这些氨基酸残基可单独含有，也可将这些氨基酸的两个以上组合含有。此外，已知具有多个钙离子结合位点、且认为在分子进化上来源于共同起源的肌钙蛋白C、钙调蛋白、小白蛋白、肌球蛋白轻链等，也可以以含有其结合模体的方式来设计轻链CDR1、CDR2和/或CDR3。例如，为了上述目的，可以适当使用钙黏蛋白结构域、钙调蛋白所含的EF手、蛋白激酶C所含的C2结构域、凝血蛋白因子IX所含的Gla结构域、脱唾液酸糖蛋白受体或甘露糖结合受体所含的C型凝集素、LDL受体所含的A结构域、膜联蛋白、血小板反应蛋白3型结构域和EGF样结构域。

在将上述导入有使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基的轻链可变区和作为随机可变区序列文库而制作的重链可变区组合时，与上述同样，也可以设计成该轻链可变区的序列中含有柔性残基。本发明的抗原结合分子的抗原结合活性只要随离子浓度条件而变化，则该柔性残基的数目和位置并不限于特定的方案。即，重链和/或轻链的CDR序列和/或FR序列中可以含有一个或更多的柔性残基。例如，在离子浓度为钙离子浓度时，作为导入轻链可变区序列中的柔性残基的非限定性实例，可以列举表1或表2所记载的氨基酸残基。

作为进行组合的重链可变区的实例，优选列举随机可变区文库。随机可变区文库的制作方法适当组合公知的方法。在本发明的一个非限定性方案中，根据用特定抗原免疫的动物、感染疾病患者或接种疫苗而使血中抗体效价上升的人、癌症患者、自身免疫疾病的淋巴细胞来源的抗体基因而构建的免疫文库可优选用作随机可变区文库。

此外，在本发明的一个非限定性方案中，将基因组DNA中的V基因或重构功能性V基因的CDR序列，用包含适当长度的编码密码子组的序列的合成寡核苷酸组取代而成的合成文库也可优选用作随机可变区文库。此时，由于观察到重链的CDR3的基因序列的多样性，因而也可仅取代CDR3的序列。抗原结合分子的可变区中产生氨基酸的多样性的基准是，抗原结合分子的露出于表面的位置的氨基酸残基具有多样性。露出于表面的位置是指，根据抗原结合分子的结构、结构总体和/或模型化结构，判断为可以露出于表面和/或可与抗原接触的位置，通常为其CDR。露出于表面的位置优选使用InsightII程序(Accelrys)之类的计算机程序，使用来自抗原结合分子的三维模型的坐标来确定。露出于表面的位置可使用本技术领域公知的算法(例如，Lee和Richards(J.Mol.Biol.(1971)55,379-400)、Connolly(J.Appl.Cryst.(1983)16,548-558))来确定。露出于表面的位置的确定可使用由适于蛋白建模的软件和抗体得到的三维结构信息来进行。作为可用于上述目的的软件，优选列举SYBYL生物体高分子模量软件(TriposAssociates)。通常或优选地，在算法需要使用者输入大小参数时，计算中使用的探针的“大小”设定为半径约1.4埃以下。进而，使用个人电脑用软件的露出于表面的区域和面积的确定方法记载于Pacios(Comput.Chem.(1994)18(4),377-386和J.Mol.Model.(1995)1,46-53)中。

进而，在本发明的一个非限定性方案中，由来源于正常人淋巴细胞的抗体基因构建、且由其组成成分不含偏差的抗体序列即天然(naive)序列构成的天然文库也可特别优选用作随机可变区文库(Gejima等人(Human Antibodies(2002)11,121-129)和Cardoso等人(Scand.J.Immunol.(2000)51,337-344))。本发明中记载的包含天然序列的氨基酸序列是指由上述天然文库获得的氨基酸序列。

本发明的一个方案中，通过将被选择作为预先含有“使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基”的构架序列的重链可变区和作为随机可变区序列文库而制作的轻链可变区组合，可以由含有本发明的多个序列彼此不同的抗原结合分子的文库获得本发明的抗原结合结构域。作为这样的非限定性实例，在离子浓度为钙离子浓度时，例如可优选列举：将SEQ ID NO:11(6RL#9-IgG1)或SEQ ID NO:12(6KC4-1#85-IgG1)所记载的重链可变区序列和作为随机可变区序列文库而制作的轻链可变区组合而得的文库。此外，也可以通过代替作为随机可变区序列文库而制作的轻链可变区，而从具有种系序列的轻链可变区中适当选择来制作。例如可优选列举：将SEQ ID NO:11(6RL#9-IgG1)或SEQ ID NO:12(6KC4-1#85-IgG1)所记载的重链可变区序列和具有种系序列的轻链可变区组合而得的文库。

此外，也可以设计成上述被选择作为预先含有“使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基”的构架序列的重链可变区的序列中含有柔性残基。本发明的抗原结合分子的抗原结合活性只要随离子浓度条件而变化，则该柔性残基的数目和位置并不限于特定的方案。即，重链和/或轻链的CDR序列和/或FR序列中可以含有一个或更多的柔性残基。例如，在离子浓度为钙离子浓度时，作为导入SEQ ID NO:11(6RL#9-IgG1)所记载的重链可变区序列中的柔性残基的非限定性实例，除了重链CDR1和CDR2的全部氨基酸残基之外，可以列举重链CDR3的95位、96位和/或100a位以外的CDR3的氨基酸残基。或者作为导入SEQ ID NO:12(6KC4-1#85-IgG1)所记载的重链可变区序列中的柔性残基的非限定性实例，除了重链CDR1和CDR2的全部氨基酸残基之外，还可以列举重链CDR3的95位和/或101位以外的CDR3的氨基酸残基。

此外，通过将上述导入有“使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基”的重链可变区和作为随机可变区序列文库而制作的轻链可变区或具有种系序列的轻链可变区组合，也可以制作包含多个序列彼此不同的抗原结合分子的文库。作为这样的非限定性实例，在离子浓度为钙离子浓度时，例如优选列举：将重链可变区的特定残基取代成使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基的重链可变区序列和作为随机可变区序列文库而制作的轻链可变区或具有种系序列的轻链可变区组合而得的文库。作为该氨基酸残基的非限定性实例，例示重链的CDR1中所含的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基的非限定性实例，还例示重链的CDR2中所含的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基的其它非限定性实例，还例示重链的CDR3中所含的氨基酸残基。作为该氨基酸残基为重链的CDR3中所含的氨基酸残基的非限定性实例，可以列举重链可变区的CDR3中的以Kabat编号表示的95位、96位、100a位和/或101位氨基酸。此外，这些氨基酸残基只要可形成钙结合模体、和/或使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化，则这些氨基酸残基可单独含有，也可将这些氨基酸的两个以上组合含有。

在将上述导入有使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基的重链可变区和作为随机可变区序列文库而制作的轻链可变区或具有种系序列的轻链可变区组合时，与上述同样，也可以设计成该重链可变区的序列中含有柔性残基。本发明的抗原结合分子的抗原结合活性只要随离子浓度条件而变化，则该柔性残基的数目和位置并不限于特定的方案。即，重链的CDR序列和/或FR序列中可以含有一个或更多的柔性残基。此外，作为使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的氨基酸残基以外的重链可变区的CDR1、CDR2和/或CDR3的氨基酸序列，也可优选使用随机可变区文库。在使用种系序列作为轻链可变区时，例如可以列举SEQ ID NO:7(Vk1)、SEQ ID NO:8(Vk2)、SEQ ID NO:9(Vk3)、SEQ ID NO:10(Vk4)等种系序列作为非限定性实例。

作为上述使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸，只要形成钙结合模体，则所有的氨基酸均可适当使用，作为这种氨基酸，具体可以列举具有供电子性的氨基酸。作为这种具有供电子性的氨基酸，优选例示丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸。

氢离子浓度条件

此外，在本发明的一个方案中，离子浓度条件是指氢离子浓度条件或pH条件。本发明中，将质子即氢原子的原子核的浓度条件与氢指数(pH)的条件视为相同含义。水溶液中的氢离子的活性量用aH+来表示时，则pH定义为-log10aH+。水溶液中的离子强度若(例如与10^-3相比)低，则aH+与氢离子强度几乎相等。例如25℃、1个大气压下的水的离子积为Kw＝aH+aOH＝10^-14，因而对纯水而言aH+＝aOH＝10^-7。此时的pH＝7为中性，pH小于7的水溶液为酸性，而pH大于7的水溶液为碱性。

本发明中，使用pH条件来作为离子浓度条件时，作为pH条件，可以列举高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件和低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件。结合活性随pH条件而变化是指，高氢离子浓度或低pH(pH酸性范围)和低氢离子浓度或高pH(pH中性范围)的条件的不同导致抗原结合分子的抗原结合活性发生变化。例如可以列举：pH中性范围条件下的抗原结合分子的抗原结合活性高于pH酸性范围条件下的抗原结合分子的抗原结合活性的情形。此外，还可以列举：pH酸性范围条件下的抗原结合分子的抗原结合活性高于pH中性范围条件下的抗原结合分子的抗原结合活性的情形。

本说明书中，pH中性范围并不特别限于统一的数值，优选可从pH6.7至pH10.0之间选择。此外，在其它方案中，可以从pH6.7至pH9.5之间选择。此外，在不同的方案中，可以从pH7.0至pH9.0之间选择，在其它方案中，可以从pH7.0至pH8.0之间选择。特别优选列举与生物体内血浆中(血中)的pH接近的pH7.4。

本说明书中，pH酸性范围并不特别限于统一的数值，优选可从pH4.0至pH6.5之间选择。此外，在其它方案中，可以从pH4.5至pH6.5之间选择。此外，在不同的方案中，可以从pH5.0至pH6.5之间选择，在其它方案中，可以从pH5.5至pH6.5之间选择。特别优选列举与生物体内的早期核内体内的离子化钙浓度接近的pH5.8。

本发明中，抗原结合分子在高氢离子浓度或低pH(pH酸性范围)条件下的抗原结合活性比在低氢离子浓度或高pH(pH中性范围)条件下的抗原结合活性低时，意指抗原结合分子在选自pH4.0至pH6.5之间的pH下的抗原结合活性比在选自pH6.7至pH10.0之间的pH下的抗原结合活性弱。优选意指抗原结合分子在选自pH4.5至pH6.5之间的pH下的抗原结合活性比在选自pH6.7至pH9.5之间的pH下的抗原结合活性弱，更优选意指抗原结合分子在选自pH5.0至pH6.5之间的pH下的抗原结合活性比在选自pH7.0至pH9.0之间的pH下的抗原结合活性弱。此外，优选意指抗原结合分子在选自pH5.5至pH6.5之间的pH下的抗原结合活性比在选自pH7.0至pH8.0之间的pH下的抗原结合活性弱。特别优选意指在生物体内的早期核内体内的pH下的抗原结合活性比在生物体内的血浆中的pH下的抗原结合活性弱，具体意指抗原结合分子在pH5.8下的抗原结合活性比在pH7.4下的抗原结合活性弱。

抗原结合分子的抗原结合活性是否随pH条件而变化，这可以利用例如上述结合活性项目中记载的公知测定方法来确定。即，利用该测定方法测定不同pH条件下的结合活性。例如，为了确认与pH酸性范围条件下的抗原结合分子的抗原结合活性相比，pH中性范围条件下的抗原结合分子的抗原结合活性变高，将pH酸性范围和pH中性范围条件下的抗原结合分子的抗原结合活性进行比较。

进而，在本发明中，“高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低”的表述也可以表述为抗原结合分子在低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性比其在高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性高。需要说明的是，本发明中有时也将“高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低”记载为“高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合能力弱”，此外，有时也将“使高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低”记载为“使高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合能力弱”。

本领域技术人员可以适当选择测定抗原结合活性时的氢离子浓度或pH以外的条件，没有特别限定。例如，可以在HEPES缓冲液、37℃的条件下进行测定。例如，可以使用Biacore(GE Healthcare)等进行测定。关于抗原结合分子与抗原的结合活性的测定，在抗原为可溶型抗原时，通过对固定有抗原结合分子的芯片流过作为分析物的抗原，可以评价对可溶型抗原的结合活性；在抗原为膜型抗原时，通过对固定有抗原的芯片流过作为分析物的抗原结合分子，可以评价对膜型抗原的结合活性。

本发明的抗原结合分子中，只要高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性弱，则对高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性与低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性之比没有特别限定，优选相对于抗原的高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的KD(Dissociation constant：解离常数)与低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的KD之比KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值为2以上，进一步优选KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值为10以上，进一步优选KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值为40以上。对KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制作，则可以是400、1000、10000等任意的值。

作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型抗原时可以使用KD(解离常数)，而在抗原为膜型抗原时可以使用表观KD(Apparentdissociation constant：表观解离常数)。KD(解离常数)和表观KD(表观解离常数)可通过本领域技术人员公知的方法进行测定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、斯卡查德图、流式细胞仪等。

此外，作为显示本发明的抗原结合分子在高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性与低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性之比的其它指标，例如还可优选使用解离速率常数kd(Dissociation rate constant：解离速率常数)。代替KD(解离常数)而使用kd(解离速率常数)来作为显示结合活性之比的指标时，相对于抗原的高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的kd(解离速率常数)与低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的kd(解离速率常数)之比kd(pH酸性范围条件下)/kd(pH中性范围条件下)的值优选为2以上、进一步优选为5以上、进一步优选为10以上、更优选为30以上。对Kd(pH酸性范围条件下)/kd(pH中性范围条件下)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术常识可以制作，则可以是50、100、200等任意的值。

作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型抗原时可以使用kd(解离速率常数)，在抗原为膜型抗原时可以使用表观kd(Apparentdissociation rate constant：表观解离速率常数)。kd(解离速率常数)和表观kd(表观解离速率常数)可通过本领域技术人员公知的方法来测定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、流式细胞仪等。需要说明的是，本发明中，在测定不同氢离子浓度即pH下的抗原结合分子的抗原结合活性时，氢离子浓度即pH以外的条件优选为相同。

例如，作为本发明提供的一个方案的高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗原结合分子可以通过包括以下步骤(a)～(c)的抗原结合结构域或抗原结合分子的筛选来获得：

步骤(a)，获得pH酸性范围条件下的抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性；

步骤(b)，获得pH中性范围条件下的抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性；

步骤(c)，选择pH酸性范围条件下的抗原结合活性比pH中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗原结合分子。

进而，作为本发明提供的一个方案的高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗原结合分子可以通过包括以下步骤(a)～(c)的抗原结合结构域或抗原结合分子或其文库的筛选来获得：

步骤(a)，使pH中性范围条件下的抗原结合结构域或抗原结合分子或其文库与抗原接触；

步骤(b)，将在上述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗原结合分子置于pH酸性范围条件下；

步骤(c)，对在上述步骤(b)中解离的抗原结合结构域或抗原结合分子进行分离。

此外，作为本发明提供的一个方案的高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗原结合分子可以通过包括以下步骤(a)～(d)的抗原结合结构域或抗原结合分子或其文库的筛选来获得：

步骤(a)，在pH酸性范围条件下使抗原结合结构域或抗原结合分子的文库与抗原接触；

步骤(c)，使在上述步骤(b)中选择的抗原结合结构域或抗原结合分子在pH中性范围条件下与抗原结合；

进而，作为本发明提供的一个方案的高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗原结合分子可以通过包括以下步骤(a)～(c)的筛选方法来获得：

步骤(a)，在pH中性范围条件下使抗原结合结构域或抗原结合分子的文库与固定有抗原的柱接触；

步骤(b)，将在上述步骤(a)中与柱结合的抗原结合结构域或抗原结合分子在pH酸性范围条件下从柱上洗脱；

步骤(c)，对在上述步骤(b)中洗脱的抗原结合结构域或抗原结合分子进行分离。

进而，作为本发明提供的一个方案的高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗原结合分子可以通过包括以下步骤(a)～(d)的筛选方法来获得：

步骤(a)，在pH酸性范围条件下使抗原结合结构域或抗原结合分子的文库通过固定有抗原的柱；

步骤(c)，使在上述步骤(b)中回收的抗原结合结构域或抗原结合分子在pH中性范围条件与抗原结合；

步骤(a)，在pH中性范围条件下使抗原结合结构域或抗原结合分子的文库与抗原接触；

步骤(c)，将在上述步骤(b)中获得的抗原结合结构域或抗原结合分子置于pH酸性范围条件下；

步骤(d)，对在上述步骤(c)中抗原结合活性弱于上述步骤(b)中选择的标准的抗原结合结构域或抗原结合分子进行分离。

需要说明的是，上述步骤可以重复两次以上。因此，根据本发明可提供通过上述筛选方法中进一步包括将步骤(a)～(c)或步骤(a)～(d)重复两次以上的步骤的筛选方法而获得的pH酸性范围条件下的抗原结合活性低于pH中性范围条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子。对步骤(a)～(c)或步骤(a)～(d)的重复次数没有特别限定，通常为10次以内。

本发明的筛选方法中，高氢离子浓度条件或低pH即pH酸性范围下的抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性只要是pH为4.0～6.5之间的抗原结合活性则没有特别限定，作为优选的pH，可以列举pH为4.5～6.6之间的抗原结合活性。作为其它的优选pH，可以列举pH为5.0～6.5之间的抗原结合活性，进而可以列举pH为5.5～6.5之间的抗原结合活性。作为更优选的pH，可以列举生物体内的早期核内体内的pH，具体可以列举pH5.8下的抗原结合活性。此外，低氢离子浓度条件或高pH即pH中性范围下的抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性只要是pH为6.7～10之间的抗原结合活性则没有特别限定，作为优选的pH，可以列举pH为6.7～9.5之间的抗原结合活性。作为其它的优选pH，可以列举pH为7.0～9.5之间的抗原结合活性，进而可以列举pH为7.0～8.0之间的抗原结合活性。作为更优选的pH，可以列举生物体内的血浆中的pH，具体可以列举pH为7.4下的抗原结合活性。

抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性可通过本领域技术人员公知的方法来测定，关于离子化钙浓度以外的条件，本领域技术人员可以适当决定。抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性可以作为KD(Dissociation constant：解离常数)、表观KD(Apparentdissociation constant：表观解离常数)、解离速率kd(Dissociation rate：解离速率常数)或表观kd(Apparent dissociation：表观解离速率常数)等来进行评价。它们可以通过本领域技术人员公知的方法来测定，例如可以使用Biacore(GE healthcare)、斯卡查德图、FACS等。

在本发明中，选择低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性比高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性高的抗原结合结构域或抗原结合分子的步骤，与选择高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗原结合分子的步骤含义相同。

只要低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性比高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性高，则对低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性与高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性之差没有特别限定，优选低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性为高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性的2倍以上，进一步优选为10倍以上，更优选为40倍以上。

通过上述筛选方法筛选的本发明的抗原结合结构域或抗原结合分子可以是任意的抗原结合结构域或抗原结合分子，例如可以筛选上述抗原结合结构域或抗原结合分子。例如，既可以筛选具有天然序列的抗原结合结构域或抗原结合分子，也可以筛选氨基酸序列被取代的抗原结合结构域或抗原结合分子。

通过上述筛选方法筛选的本发明的抗原结合结构域或抗原结合分子可以任意制备，例如可以使用：预先存在的抗原结合分子、预先存在的文库(噬菌体文库等)、由对动物进行免疫得到的杂交瘤或来自免疫动物的B细胞制作的抗体或文库、向这些抗体或文库中导入侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突变而得的抗体或文库(侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的含有率提高的文库、或在特定位置导入侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突变而成的文库等)等。

作为从由对动物进行免疫得到的杂交瘤或来自免疫动物的B细胞制作的抗原结合结构域或抗体中获得低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性比高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性高的抗原结合结构域或抗原结合分子的方法，例如优选列举：将如国际公开WO2009/125825中记载的抗原结合结构域或抗原结合分子中的氨基酸的至少一个取代成侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突变的抗原结合结构域或抗原结合分子、或者在抗原结合结构域或抗原结合分子中插入侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的抗原结合结构域或抗原结合分子。

对导入侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突变的位置没有特别限定，只要与取代或插入前相比，pH酸性范围下的抗原结合活性变得比pH中性范围下的抗原结合活性弱(KD(pH酸性范围)/KD(pH中性范围)的值变大、或者kd(pH酸性范围)/kd(pH中性范围)的值变大)，则可以是任意位点。例如，在抗原结合分子为抗体时，优选列举抗体的可变区或CDR等。本领域技术人员可以适当确定取代成侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的氨基酸的数目或插入的氨基酸的数目，可以被侧链的pKa为4.0-8.0的1个氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸取代，可以插入侧链的pKa为4.0-8.0的1个氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸，可以被侧链的pKa为4.0-8.0的2个以上的多个氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸取代，可以插入侧链的pKa为4.0-8.0的2个以上的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸。另外，除了取代成侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸、或者插入侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸以外，也可以同时进行其它的氨基酸的缺失、添加、插入和/或取代等。取代成侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸、或者插入侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸，这可以通过本领域技术人员公知的丙氨酸扫描的丙氨酸取代成组氨酸等而成的组氨酸等扫描等方法随机进行，从随机地导入了侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的取代或插入的突变的抗原结合结构域或抗体中，可以选择与突变前相比KD(pH酸性范围)/KD(pH中性范围)或kd(pH酸性范围)/kd(pH中性范围)的值变大的抗原结合分子。

如上所述，作为进行了突变为其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸、并且pH酸性范围下的抗原结合活性比pH中性范围下的抗原结合活性低的抗原结合分子的优选实例，例如优选列举：突变为其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸后的pH中性范围下的抗原结合活性与突变为其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸前的pH中性范围下的抗原结合活性同等的抗原结合分子。本发明中，突变为其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸后的抗原结合分子具有与突变为其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸前的抗原结合分子同等的抗原结合活性是指，以突变为其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸前的抗原结合分子的抗原结合活性作为100％时，突变为其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸后的抗原结合分子的抗原结合活性为至少10％以上、优选50％以上、进一步优选80％以上、更优选90％以上。突变为其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸后的pH7.4下的抗原结合活性可以比突变为其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸前的pH7.4下的抗原结合活性变高。通过取代成或插入其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸而使抗原结合分子的抗原结合活性变低时，可以通过抗原结合分子中的1个或多个氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等来使抗原结合活性与其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的取代或插入前的抗原结合活性同等。本发明中也包括这样的侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的取代或插入后进行1个或多个氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入而使结合活性变得同等的抗原结合分子。

使抗原结合结构域的抗原结合活性随氢离子浓度条件而变化的氨基酸

通过上述筛选方法筛选的本发明的抗原结合结构域或抗原结合分子可以任意制备，例如，在离子浓度条件为氢离子浓度条件或pH条件时，可以使用预先存在的抗原结合分子、预先存在的文库(噬菌体文库等)、由对动物进行免疫得到的杂交瘤或来自免疫动物的B细胞制得的抗体或文库、向这些抗体或文库中导入侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的突变而得的抗体或文库(侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的含有率提高的文库或在特定位置导入了侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的突变而得到的文库等)等。

作为本发明的一个方案，通过将导入有“使抗原结合分子的抗原结合活性随氢离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基”的轻链可变区和作为随机可变区序列文库而制作的重链可变区组合，也可以制作含有本发明的多个序列彼此不同的抗原结合分子的文库。

作为该氨基酸残基的非限定性实例，例示轻链的CDR1中所含的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基的非限定性实例，例示轻链的CDR2中所含的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基的非限定性的其它实例，还例示轻链的CDR3中所含的氨基酸残基。

如上所述，作为该氨基酸残基为轻链CDR1中所含的氨基酸残基的非限定性实例，可以列举轻链可变区的CDR1中的以Kabat编号表示的24位、27位、28位、31位、32位和/或34位氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基为轻链CDR2中所含的氨基酸残基的非限定性实例，可以列举轻链可变区的CDR2中的以Kabat编号表示的50位、51位、52位、53位、54位、55位和/或56位氨基酸残基。进而，作为该氨基酸残基为轻链CDR3中所含的氨基酸残基的非限定性实例，可以列举轻链可变区的CDR3中的以Kabat编号表示的89位、90位、91位、92位、93位、94位和/或95A位氨基酸残基。此外，这些氨基酸残基只要可使抗原结合分子的抗原结合活性随氢离子浓度条件而变化，则这些氨基酸残基可单独含有，也可以将这些氨基酸的两个以上组合含有。

在将上述导入有“使抗原结合分子的抗原结合活性随氢离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基”的轻链可变区和作为随机可变区序列文库而制作的重链可变区组合时，也上述同样，也可以设计成该轻链可变区的序列中含有柔性残基。本发明的抗原结合分子的抗原结合活性只要随氢离子浓度条件而变化，则该柔性残基的数目和位置并不限于特定的方案。即，重链和/或轻链的CDR序列和/或FR序列中可以含有一个或更多的柔性残基。例如，作为导入轻链可变区序列中的柔性残基的非限定性实例，可以列举表3或表4所记载的氨基酸残基。此外，作为使抗原结合分子的抗原结合活性随氢离子浓度条件而变化的氨基酸残基和柔性残基以外的轻链可变区的氨基酸序列，作为非限定性实例，可以优选使用Vk1(SEQ ID NO:7)、Vk2(SEQ ID NO:8)、Vk3(SEQ ID NO:9)、Vk4(SEQ ID NO:10)等种系序列。

[表3]

(位置表示Kabat编号)

[表4]

(位置表示Kabat编号)

作为上述的使抗原结合分子的抗原结合活性随氢离子浓度条件而变化的氨基酸残基，还可适当使用任意的氨基酸残基，作为这种氨基酸残基，具体可以列举侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸。作为这种具有供电子性的氨基酸，除了组氨酸或谷氨酸等天然氨基酸之外，优选例示组氨酸类似物(US2009/0035836)或m-NO2-Tyr(pKa 7.45)、3,5-Br2-Tyr(pKa7.21)或3,5-I2-Tyr(pKa7.38)等非天然氨基酸(Bioorg.Med.Chem.(2003)11(17),3761-3768)。此外，作为该氨基酸残基的特别优选的实例，可以列举侧链的pKa为6.0-7.0的氨基酸。作为这种具有供电子性的氨基酸，优选例示组氨酸。

为了改变抗原结合结构域的氨基酸，可适当采用位点特异性诱变法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或重叠延伸PCR等公知的方法。此外，作为取代成天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸改变方法，还可采用多种公知的方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。例如，还优选使用包含作为终止密码子之一的UAG密码子(琥珀密码子)的互补琥珀抑制基因tRNA上连接有非天然氨基酸而得到的tRNA的无细胞翻译系统(Clover Direct(ProteinExpress))等。

作为进行组合的重链可变区的实例，优选列举随机可变区文库。随机可变区文库的制作方法适当组合公知的方法。在本发明的一个非限定性方案中，根据用特定抗原免疫的动物、感染疾病患者或接种疫苗而使血中抗体效价上升的人、癌症患者、自身免疫疾病的淋巴细胞来源的抗体基因构建的免疫文库可优选用作随机可变区文库。

此外，在本发明的一个非限定性方案中，与上述同样，将基因组DNA中的V基因或重构功能性V基因的CDR序列用包含适当长度的编码密码子组的序列的合成寡核苷酸组取代而成的合成文库也可优选用作随机可变区文库。此时，由于观察到重链的CDR3的基因序列的多样性，因而也可仅取代CDR3的序列。抗原结合分子的可变区中产生氨基酸的多样性的基准是，抗原结合分子的露出于表面的位置的氨基酸残基具有多样性。露出于表面的位置是指，根据抗原结合分子的结构、结构总体和/或模型化结构，判断为可以露出于表面和/或可与抗原接触的位置，通常为其CDR。露出于表面的位置优选使用InsightII程序(Accelrys)之类的计算机程序，使用来自抗原结合分子的三维模型的坐标来确定。露出于表面的位置可使用本技术领域公知的算法(例如，Lee和Richards(J.Mol.Biol.(1971)55,379-400)、Connolly(J.Appl.Cryst.(1983)16,548-558))来确定。露出于表面的位置的确定可使用由适于蛋白建模的软件和抗体得到的三维结构信息来进行。作为可用于上述目的的软件，优选列举SYBYL生物体高分子模量软件(Tripos Associates)。通常或优选地，在算法需要使用者输入大小参数时，计算中使用的探针的“大小”设定为半径约1.4埃以下。进而，使用个人电脑用软件的露出于表面的区域和面积的确定方法记载于Pacios(Comput.Chem.(1994)18(4),377-386和J.Mol.Model.(1995)1,46-53)中。

进而，在本发明的一个非限定性方案中，由来源于正常人淋巴细胞的抗体基因构建、且由其组成成分不含偏差的抗体序列即天然序列构成的天然文库也可特别优选用作随机可变区文库(Gejima等人(Human Antibodies(2002)11,121-129)和Cardoso等人(Scand.J.Immunol.(2000)51,337-344))。

Fc区

Fc区包含来自抗体重链恒定区的氨基酸序列。Fc区是从以EU编号表示的大约216位氨基酸的木瓜蛋白酶切割位点的铰链区N末端开始，包含该铰链、CH2和CH3结构域的抗体重链恒定区的一部分。Fc区可由人IgG1获得，并不限于IgG的特定的亚类。作为该Fc区的优选例子，可以列举如下所述在pH酸性范围具有对FcRn的结合活性的Fc区。另外，该Fc区的优选例子还可以列举：如下所述对Fcγ受体具有结合活性的Fc区。作为这样的Fc区的一个非限定性方案，例示人IgG1(SEQ ID NO:13)、IgG2(SEQ ID NO:14)、IgG3(SEQ ID NO:15)或IgG4(SEQ ID NO:16)所表示的Fc区。

FcRn

与属于免疫球蛋白超家族的Fcγ受体不同，人FcRn在结构上与主要组织不相容性复合体(MHC)I类的多肽结构类似，与I类的MHC分子具有22至29％的序列同源性(Ghetie等人,Immunol.Today(1997)18(12),592-598)。FcRn表达为异源二聚体，其由与可溶性β或轻链(β2微球蛋白)复合而成的跨膜α或重链构成。如MHC那样，FcRn的α链包含3个胞外结构域(α1、α2、α3)，短的胞质结构域将蛋白锚定于细胞表面。α1和α2结构域与抗体的Fc区中的FcRn结合结构域相互作用(Raghavan等人(Immunity(1994)1,303-315)。

FcRn在哺乳动物的母体胎盘或卵黄囊中表达，其参与IgG从母体向胎儿的转移。此外，表达有FcRn的啮齿类新生儿的小肠中，FcRn参与母体IgG从所摄取的初乳或乳中穿过刷状边缘上皮的移动。FcRn在大量种类的大量的其它组织以及各种内皮细胞系中表达。其也在人成年血管内皮、肌肉血管系和肝窦毛细血管中有表达。FcRn被认为与IgG结合，将其再循环至血清中，由此起到维持血浆中的IgG浓度的作用。通常，FcRn对IgG分子的结合严格地为pH依赖性，最佳结合在小于7.0的pH酸性范围内可观察到。

以含有SEQ ID NO:17所示信号序列的多肽作为前体的人FcRn在生物体内(SEQ ID NO:18中记载了含有信号序列的该多肽)与人β2-微球蛋白形成复合体。与β2-微球蛋白形成复合体的可溶型人FcRn是通过利用通常的重组表达方法来制造的。可以评价本发明的Fc区对这种与β2-微球蛋白形成复合体的可溶型人FcRn的结合活性。本发明中，若无特别记载，则人FcRn是指能够与本发明的Fc区结合的形态，作为实例，可以列举人FcRn与人β2-微球蛋白的复合体。在一个非限定性方案中，还可以列举小鼠FcRn(SEQ ID NO:73)与小鼠β2-微球蛋白(SEQ ID NO:74)的复合体。

Fc区与FcRn、特别是与人FcRn的结合活性

关于由本发明提供的Fc区与FcRn、特别是与人FcRn的结合活性，如上述结合活性项目中所述，可通过本领域技术人员公知的方法进行测定，pH以外的条件可由本领域技术人员适当确定。抗原结合分子的抗原结合活性和人FcRn结合活性可作为KD(Dissociationconstant：解离常数)、表观KD(Apparent dissociation constant：表观解离常数)、解离速率kd(Dissociation rate：解离速率)或表观kd(Apparentdissociation：表观解离速率)等进行评价。它们可通过本领域技术人员公知的方法进行测定。例如可使用Biacore(GE healthcare)、斯卡查德图、流式细胞仪等。

测定本发明的Fc区对人FcRn的结合活性时pH以外的条件可由本领域技术人员适当选择，无特别限定。例如，可如国际公开WO2009/125825中所记载，在MES缓冲液、37℃的条件下测定。此外，本发明的Fc区对人FcRn结合活性测定可通过本领域技术人员公知的方法进行，例如可使用Biacore(GE Healthcare)等进行测定。关于本发明的Fc区与人FcRn的结合活性的测定，可通过向固定有Fc区或包含Fc区的本发明的抗原结合分子或人FcRn的芯片分别流过人FcRn或者Fc区或包含Fc区的本发明抗原结合分子作为分析物进行评价。

作为本发明的抗原结合分子所含的Fc区与FcRn具有结合活性的条件的pH中性范围，通常指pH6.7～pH10.0。pH中性范围优选为由pH7.0～pH8.0的任意pH值表示的范围，优选从pH7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9和8.0中选择，特别优选为与生物体内的血浆中(血中)pH接近的pH7.4。在pH7.4下人FcRn结合结构域与人FcRn的结合亲和性低而致使难以评价该结合亲和性的情况下，可使用pH7.0代替pH7.4。本发明中，作为本发明的抗原结合分子所含的Fc区与FcRn具有结合活性的条件的pH酸性范围，通常指pH4.0～pH6.5。优选指pH5.5～pH6.5，特别优选指与生物体内的早期核内体内的pH接近的pH5.8～pH6.0。作为测定条件中使用的温度，人FcRn结合结构域与人FcRn的结合亲和性可在10℃～50℃的任意温度下进行评价。为了确定人FcRn结合结构域与人FcRn的结合亲和性，优选使用15℃～40℃的温度。更优选地，诸如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34和35℃中任一者的20℃～35℃的任意温度也同样用于确定人FcRn结合结构域与人FcRn的结合亲和性。25℃的温度是本发明方案的一个非限定性实例。

根据The Journal of Immunology(2009)182:7663-7671，天然型人IgG1的人FcRn结合活性在pH酸性范围(pH6.0)为KD 1.7μM，但在pH中性范围基本无法检测到活性。因此，在优选方案中，可选择包括pH酸性范围的人FcRn结合活性为KD20μM或更强的Fc区的抗原结合分子。在更优选的方案中，可选择包括pH酸性范围的人FcRn结合活性为KD2.0μM或更强的Fc区的抗原结合分子。在进一步更优选的方案中，可选择包括pH酸性范围的人FcRn结合活性为KD 0.5μM或更强的Fc区的抗原结合分子。上述KD值可通过The Journal ofImmunology(2009)182:7663-7671中记载的方法(将抗原结合分子固定在芯片上，作为分析物流过人FcRn)来确定。

在本发明中，优选在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性的Fc区。该结构域若为预先在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性的Fc区，则可直接使用。该结构域在pH酸性范围条件下的FcRn结合活性不存在或弱的情况下，可通过改变抗原结合分子中的氨基酸来获得具有所期望的FcRn结合活性的Fc区，通过改变Fc区中的氨基酸，也可优选获得在pH酸性范围条件下具有所期望的FcRn结合活性或该活性增强的Fc区。这样的带来所期望的结合活性的Fc区氨基酸改变可通过比较氨基酸改变前与改变后在pH酸性范围条件下的FcRn结合活性来发现。利用与上述用于改变Fcγ受体结合活性的方法相同的公知方法，本领域技术人员可实施适当的氨基酸改变。

本发明的抗原结合分子中所含的在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性的Fc区可通过任意方法获得，具体而言，可通过改变用作起始Fc区的人IgG型免疫球蛋白的氨基酸来获得在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性或该活性增强的FcRn结合结构域。作为用于改变的优选的IgG型免疫球蛋白Fc区，例如可列举人IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4以及它们的改变体)的Fc区。对于向其它氨基酸的改变，只要在pH酸性范围条件下具有FcRn结合活性、或者在酸性范围条件下提高人FcRn结合活性，就可以改变任意位置的氨基酸。在抗原结合分子包含人IgG1的Fc区作为Fc区的情况下，优选包含带来pH酸性范围条件下的FcRn结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变。作为可实现这样的改变的氨基酸，例如，可列举国际公开WO1997/034631中记载的以EU编号表示的252位、254位、256位、309位、311位、315位、433位和/或434位以及与这些氨基酸组合的253位、310位、435位和/或426位的氨基酸。优选列举如国际公开WO2000/042072中记载的以EU编号表示的238位、252位、253位、254位、255位、256位、265位、272位、286位、288位、303位、305位、307位、309位、311位、312位、317位、340位、356位、360位、362位、376位、378位、380位、382位、386位、388位、400位、413位、415位、424位、433位、434位、435位、436位、439位和/或447位氨基酸。同样地，作为可实现这样的改变的氨基酸，例如还优选列举如国际公开WO2002/060919中记载的以EU编号表示的251位、252位、254位、255位、256位、308位、309位、311位、312位、385位、386位、387位、389位、428位、433位、434位和/或436位氨基酸。而且，作为可实现这样的改变的氨基酸，还可列举如国际公开WO2004/092219中记载的以EU编号表示的250位、314位和428位氨基酸。此外，作为可实现这样的改变的氨基酸，例如还优选列举如国际公开WO2006/020114中记载的238位、244位、245位、249位、252位、256位、257位、258位、260位、262位、270位、272位、279位、283位、285位、286位、288位、293位、307位、311位、312位、316位、317位、318位、332位、339位、341位、343位、375位、376位、377位、378位、380位、382位、423位、427位、430位、431位、434位、436位、438位、440位和/或442位的氨基酸。另外，作为可实现这样的改变的氨基酸，例如还优选列举如国际公开WO2010/045193中记载的以EU编号表示的251位、252位、307位、308位、378位、428位、430位、434位和/或436位氨基酸。通过改变这些氨基酸，增强IgG型免疫球蛋白Fc区在pH酸性范围条件下对FcRn的结合。

在包含人IgG1的Fc区作为Fc区的情况下，在带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变的一个非限定性方案中，可以列举以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸的改变：

251位氨基酸为Arg或Leu中的任一个；

252位氨基酸为Phe、Ser、Thr或Tyr中的任一个；

254位氨基酸为Ser或Thr中的任一个；

255位氨基酸为Arg、Gly、Ile或Leu中的任一个；

256位氨基酸为Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu或Thr中的任一个；

308位氨基酸为Ile或Thr中的任一个；

309位氨基酸为Pro；

311位氨基酸为Glu、Leu或Ser中的任一个；

312位氨基酸为Ala或Asp中的任一个；

314位氨基酸为Ala或Leu中的任一个；

387位氨基酸为Ala、Arg、His、Pro、Ser或Thr中的任一个；

389位氨基酸为Asn、Pro或Ser中的任一个；

428位氨基酸为Leu、Met、Phe、Ser或Thr中的任一个；

433位氨基酸为Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro或Ser中的任一个；

434位氨基酸为His、Phe或Tyr中的任一个；或者

436位氨基酸为Arg、Asn、His、Lys、Met或Thr中的任一个。另外，对将被改变的氨基酸的数量没有特别限定，可以只改变一处的氨基酸，也可以改变两处以上的氨基酸。

在包含人IgG1的Fc区作为Fc区的情况下，带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变的一个非限定性方案可以是包含以EU编号表示的以下的氨基酸的改变：308位氨基酸为Ile、309位氨基酸为Pro、和/或311位氨基酸为Glu。另外，该改变的其他的一个非限定性方案可以是包含以下的氨基酸的改变：308位氨基酸为Thr、309位氨基酸为Pro、311位氨基酸为Leu、312位氨基酸为Ala、和/或314位氨基酸为Ala。另外，该改变的其他的一个非限定性方案可以是包含以下的氨基酸的改变：308位氨基酸为Ile或Thr、309位氨基酸为Pro、311位氨基酸为Glu、Leu或Ser、312位氨基酸为Ala、和/或314位氨基酸为Ala或Leu。该改变的不同的一个非限定性方案可以是包含以下的氨基酸的改变：308位氨基酸为Thr、309位氨基酸为Pro、311位氨基酸为Ser、312位氨基酸为Asp、和/或314位氨基酸为Leu。

在包含人IgG1的Fc区作为Fc区的情况下，带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变的一个非限定性方案可以是包含以EU编号表示的以下的氨基酸的改变：251位氨基酸为Leu、252位氨基酸为Tyr、254位氨基酸为Ser或Thr、255位氨基酸为Arg、和/或256位氨基酸为Glu。

在包含人IgG1的Fc区作为Fc区的情况下，带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变的一个非限定性方案可以是包含以EU编号表示的以下的氨基酸的改变：428位氨基酸为Leu、Met、Phe、Ser或Thr中的任一个；433位氨基酸为Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro或Ser中的任一个；434位氨基酸为His、Phe或Tyr中的任一个；和/或436位氨基酸为Arg、Asn、His、Lys、Met或Thr中的任一个。另外，该改变的其他的一个非限定性方案可以是包含以下的氨基酸的改变：428位氨基酸为His或Met、和/或434位氨基酸为His或Met。

在包含人IgG1的Fc区作为Fc区的情况下，带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变的一个非限定性方案可以是包含以EU编号表示的以下的氨基酸的改变：385位氨基酸为Arg、386位氨基酸为Thr、387位氨基酸为Arg、和/或389位氨基酸为Pro。此外，该改变的其他的一个非限定性方案可以是包含以下的氨基酸的改变：385位氨基酸为Asp、386位氨基酸为Pro和/或389位氨基酸为Ser。

进而，在包含人IgG1的Fc区作为Fc区的情况下，在带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变的一个非限定性方案中，可以列举以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸的改变：

250位氨基酸为Gln或Glu中的任一个；或者

428位氨基酸为Leu或Phe中的任一个；

另外，对将被改变的氨基酸数没有特别限定，可以只改变一处氨基酸，也可以改变两处氨基酸。

在含有人IgG1的Fc区作为Fc区的情况下，带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变的一个非限定性方案可以是包含以EU编号表示的以下的任一个氨基酸的改变：250位氨基酸为Gln、和/或428位氨基酸为Leu或Phe。另外，该改变的其他的一个非限定性方案可以是包含以下的任一个氨基酸的改变：250位氨基酸为Glu、和/或428位氨基酸为Leu或Phe。

在包含人IgG1的Fc区作为Fc区的情况下，在带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变的一个非限定性方案中，可以列举以EU编号表示的选自以下的至少两个以上的氨基酸的改变：

251位氨基酸为Asp或Glu中的任一个；

252位氨基酸为Tyr；

307位氨基酸为Gln；

308位氨基酸为Pro；

378位氨基酸为Val；

380位氨基酸为Ala；

428位氨基酸为Leu；

430位氨基酸为Ala或Lys中的任一个；

434位氨基酸为Ala、His、Ser或Tyr中的任一个；或者

436位氨基酸为Ile；另外，对将被改变的氨基酸的数量没有特别限定，可以只改变两处氨基酸，也可以改变三处以上的氨基酸。

在包含人IgG1的Fc区作为Fc区的情况下，带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变的一个非限定性方案可以是包含以EU编号表示的以下的任一个氨基酸的改变：307位氨基酸为Gln、和434位氨基酸为Ala或Ser。另外，该改变的其他的一个非限定性方案可以是包含以下的氨基酸的改变：308位氨基酸为Pro、和434位氨基酸为Ala。另外，该改变的其他的一个非限定性方案可以是包含以下的氨基酸的改变：252位氨基酸为Tyr、和434位氨基酸为Ala。该改变的不同的一个非限定性方案可以是包含以下的氨基酸的改变：378位氨基酸为Val、和434位氨基酸为Ala。该改变的其他不同的一个非限定性方案可以是包含以下的氨基酸的改变：428位氨基酸为Leu、和434位氨基酸为Ala。另外，该改变的其他不同的一个非限定性方案可以是包含以下的氨基酸的改变：434位氨基酸为Ala、和436位氨基酸为Ile。进而，该改变的又一个非限定性方案可以是包含以下的氨基酸的改变：308位氨基酸为Pro、和434位氨基酸为Tyr。进而，该改变的其他的又一个非限定性方案可以是包含以下的氨基酸的改变：307位氨基酸为Gln、和436位氨基酸为Ile。

在包含人IgG1的Fc区作为Fc区的情况下，带来在pH酸性范围条件下对FcRn的结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变的一个非限定性方案可以是包含以EU编号表示的以下的任一个氨基酸的改变：307位氨基酸为Gln、380位氨基酸为Ala、和434位氨基酸为Ser。另外，该改变的其他的一个非限定性方案可以是包含以下的氨基酸的改变：307位氨基酸为Gln、380位氨基酸为Ala、和434位氨基酸为Ala。另外，该改变的其他的一个非限定性方案可以是包含以下的氨基酸的改变：252位氨基酸为Tyr、308位氨基酸为Pro、和434位氨基酸为Tyr。该改变的不同的一个非限定性方案可以是包含以下的氨基酸的改变：251位氨基酸为Asp、307位氨基酸为Gln、和434位氨基酸为His。

238位氨基酸为Leu；

244位氨基酸为Leu；

245位氨基酸为Arg；

249位氨基酸为Pro；

252位氨基酸为Tyr；

256位氨基酸为Pro；

257位氨基酸为Ala、Ile、Met、Asn、Ser或Val中的任一个；

258位氨基酸为Asp；

260位氨基酸为Ser；

262位氨基酸为Leu；

270位氨基酸为Lys；

272位氨基酸为Leu或Arg中的任一个；

285位氨基酸为Asn；

286位氨基酸为Phe；

288位氨基酸为Asn或Pro中的任一个；

293位氨基酸为Val；

307位氨基酸为Ala、Glu或Met中的任一个；

311位氨基酸为Ala、Ile、Lys、Leu、Met、Val或Trp中的任一个；

312位氨基酸为Pro；

316位氨基酸为Lys；

317位氨基酸为Pro；

318位氨基酸为Asn或Thr中的任一个；

339位氨基酸为Asn、Thr或Trp中的任一个；

341位氨基酸为Pro；

343位氨基酸为Glu、His、Lys、Gln、Arg、Thr或Tyr中的任一个；

375位氨基酸为Arg；

376位氨基酸为Gly、Ile、Met、Pro、Thr或Val中的任一个；

377位氨基酸为Lys；

378位氨基酸为Asp或Asn中的任一个；

380位氨基酸为Asn、Ser或Thr中的任一个；

423位氨基酸为Asn；

427位氨基酸为Asn；

431位氨基酸为His或Asn中的任一个；

434位氨基酸为Phe、Gly、His、Trp或Tyr中的任一个；

436位氨基酸为Ile、Leu或Thr中的任一个；

438位氨基酸为Lys、Leu、Thr或Trp中的任一个；

440位氨基酸为Lys；或者

442位氨基酸为Lys；

另外，对将被改变的氨基酸的数量没有特别限定，可以只改变两处氨基酸，也可以改变三处以上的氨基酸。

在包含人IgG1的Fc区作为Fc区的情况下，带来在pH酸性范围条件下对FcR的结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变的一个非限定性方案可以是包含以EU编号表示的以下的氨基酸的改变：257位氨基酸为Ile、和311位氨基酸为Ile。另外，该改变的其他的一个非限定性方案可以是包含以下的氨基酸的改变：257位氨基酸为Ile、和434位氨基酸为His。另外，该改变的其他的一个非限定性方案可以是包含以下的氨基酸的改变：376位氨基酸为Val、和434位氨基酸为His。

另外，在其他的一个非限定性方案中，还可以筛选包含Fc区的抗原结合分子，所述Fc区具有pH中性范围的人FcRn结合活性的特征，以代替上述记载的pH酸性范围的人FcRn结合活性的特征。在更优选的方案中，可以筛选包含pH中性范围的人FcRn结合活性为KD40μM或更强的Fc区的抗原结合分子。在更进一步优选的方案中，可以筛选包含pH中性范围的人FcRn结合活性为KD 15μM或更强的Fc区的抗原结合分子。

另外，在其他的一个非限定性方案中，还可以筛选包含Fc区的抗原结合分子，所述Fc区除了具有上述记载的pH酸性范围的人FcRn结合活性的特征之外，还具有pH中性范围的人FcRn结合活性的特征。在更优选的方案中，可以筛选包含pH中性范围的人FcRn结合活性为KD 40μM或更强的Fc区的抗原结合分子。在更进一步优选的方案中，可以筛选包含pH中性范围的人FcRn结合活性为KD15μM或更强的Fc区的抗原结合分子。

在本发明中，优选在pH酸性范围和/或pH中性范围具有人FcRn结合活性的Fc区。该Fc区如果是预先在pH酸性范围和/或pH中性范围具有FcRn结合活性的Fc区，则可直接使用。当该Fc区在pH酸性范围和/或pH中性范围不存在FcRn结合活性或该活性弱时，通过改变抗原结合分子所含的Fc区中的氨基酸，可以获得包含具有所期望的人FcRn结合活性的Fc区的抗原结合分子，但通过改变人Fc区中的氨基酸，也可优选获得在pH酸性范围和/或pH中性范围具有所期望的人FcRn结合活性的Fc区。此外，通过改变预先在pH酸性范围和/或pH中性范围具有人FcRn结合活性的Fc区中的氨基酸，也可以获得包含具有所期望的人FcRn结合活性的Fc区的抗原结合分子。关于带来这种所期望的结合活性的人Fc区的氨基酸改变，通过比较氨基酸改变前与改变后在pH酸性范围和/或pH中性范围的人FcRn结合活性来发现。本领域技术人员可以利用公知的方法适当实施氨基酸的改变。

本发明中，Fc区的“氨基酸的改变”或“氨基酸改变”包括改变成与起始Fc区氨基酸序列不同的氨基酸序列。只要起始Fc区的修饰改变体在pH酸性范围可以与人FcRn结合(所以，起始Fc区未必需要具有pH中性范围条件下的人FcRn结合活性)，则所有的Fc区均可用作起始结构域。作为起始Fc区的实例，优选列举IgG抗体的Fc区、即天然型Fc区。此外，将已进行了改变的Fc区作为起始Fc区并进一步进行了改变而得的改变Fc区也可优选用作本发明的改变Fc区。起始Fc区可指多肽自身、含有起始Fc区的组合物或编码起始Fc区的氨基酸序列。起始Fc区可包括抗体项目中概述的通过重组产生的公知的IgG抗体的Fc区。对起始Fc区的来源没有限定，可由非人动物的任意生物或人获得。优选地，作为任意生物，优选列举选自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猫、兔、狗、山羊、绵羊、牛、马、骆驼和非人灵长类的生物。在其他方案中，起始Fc区还可由食蟹猴、狨猴、恒河猴、黑猩猩或人获得。优选地，起始Fc区可由人IgG1获得，但不限于IgG的特定亚类。这是指可适当使用以人IgG1(SEQ ID NO:13)、IgG2(SEQ ID NO:14)、IgG3(SEQ ID NO:15)或IgG4(SEQ ID NO:16)表示的Fc区作为起始Fc区。同样，在本说明书中，是指可将来自上述任意生物的IgG的任意类或亚类的Fc区优选用作起始Fc区。天然存在的IgG变体或被操作的类型的实例记载于公知文献(Curr.Opin.Biotechnol.(2009)20(6),685-91；Curr.Opin.Immunol.(2008)20(4),460-470；Protein Eng.Des.Sel.(2010)23(4),195-202；国际公开WO2009/086320、WO2008/092117、WO2007/041635和WO2006/105338)中，但不限于这些。

作为改变的实例，包括一个以上的变异，例如取代成与起始Fc区的氨基酸不同的氨基酸残基的变异、或者向起始Fc区的氨基酸中插入一个以上的氨基酸残基或者从起始Fc区的氨基酸中缺失一个以上的氨基酸等。优选地，改变后的Fc区氨基酸序列包含含有非天然存在的Fc区的至少一部分的氨基酸序列。这种变体与起始Fc区必然具有不足100％的序列同源性或相似性。在优选实施方案中，变体具有与起始Fc区的氨基酸序列约75％～不足100％的氨基酸序列同源性或相似性，更优选约80％～不足100％、更优选约85％～不足100％、更优选约90％～不足100％、最优选约95％～不足100％的同源性或相似性的氨基酸序列。本发明的一个非限定性方案中，起始Fc区与本发明的改变Fc区之间存在至少一个氨基酸的差异。起始Fc区与改变Fc区的氨基酸的不同还可通过特别是上述的以EU编号表示的氨基酸残基位置的特定氨基酸的不同来优选规定。

为了改变Fc区的氨基酸，可适当采用位点特异性诱变法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或重叠延伸PCR等公知方法。此外，作为取代成天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸改变方法，也可采用多种公知方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。例如，还优选使用包含非天然氨基酸与终止密码子之一的UAG密码子(琥珀密码子)的互补性琥珀抑制基因tRNA连接而得到的tRNA的无细胞翻译系统(Clover Direct(Protein Express))等。

本发明的抗原结合分子所含的具有pH酸性范围的人FcRn结合活性的Fc区可通过任意方法获得，具体而言，通过改变用作起始Fc区的人IgG型免疫球蛋白的氨基酸，可以筛选包含pH酸性范围的人FcRn结合活性为KD 20μM或更强的Fc区的抗原结合分子，在更优选的方案中，可以筛选包含pH酸性范围的人FcRn结合活性为KD2.0μM或更强的Fc区的抗原结合分子，在更进一步优选的方案中，可以筛选包含pH酸性范围的人FcRn结合活性为KD 0.5μM或更强的Fc区的抗原结合分子。作为用于改变的优选的IgG型免疫球蛋白的Fc区，例如可以列举：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16各自所表示的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4等人IgG、和它们的改变体的Fc区。

在抗原结合分子包含人IgG1的Fc区作为Fc区的情况下，作为可以进行在pH酸性范围条件下对FcRn的结合通过用作起始Fc区的人IgG型免疫球蛋白的氨基酸的改变而带来上述所期望的效果的改变的氨基酸，例如优选列举如国际公开WO2000/042072中记载的以EU编号表示的238位、252位、253位、254位、255位、256位、265位、272位、286位、288位、303位、305位、307位、309位、311位、312位、317位、340位、356位、360位、362位、376位、378位、380位、382位、386位、388位、400位、413位、415位、424位、433位、434位、435位、436位、439位和/或447位氨基酸。同样，作为可以进行这种改变的氨基酸，还优选列举例如国际公开WO2002/060919中记载的以EU编号表示的251位、252位、254位、255位、256位、308位、309位、311位、312位、385位、386位、387位、389位、428位、433位、434位和/或436位氨基酸。而且，作为可以进行这种改变的氨基酸，还可以列举如国际公开WO2004/092219中记载的以EU编号表示的250位、314位和428位氨基酸。另外，作为可进行这种改变的氨基酸，还优选列举例如如国际公开WO2010/045193所记载的以EU编号表示的251位、252位、307位、308位、378位、428位、430位、434位和/或436位氨基酸。通过这些氨基酸的改变，IgG型免疫球蛋白的Fc区在pH酸性范围条件下对FcRn的结合有所增强。

通过改变用作起始Fc区的人IgG型免疫球蛋白的氨基酸，还可获得在pH中性范围具有人FcRn结合活性的Fc区。作为用于改变的优选的IgG型免疫球蛋白的Fc区，例如可以列举SEQ ID NO:13、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16各自表示的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4等人IgG、和它们的改变体的Fc区。向其他氨基酸的改变只要具有pH中性范围的人FcRn结合活性、或者提高中性范围的人FcRn结合活性，就可以改变任何位置的氨基酸。在抗原结合分子包含人IgG1的Fc区作为人Fc区的情况下，优选包含带来pH中性范围的人FcRn结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变。作为可以进行这种改变的氨基酸，例如可以列举选自EU编号221位～225位、227位、228位、230位、232位、233位～241位、243位～252位、254位～260位、262位～272位、274位、276位、278位～289位、291位～312位、315位～320位、324位、325位、327位～339位、341位、343位、345位、360位、362位、370位、375位～378位、380位、382位、385位～387位、389位、396位、414位、416位、423位、424位、426位～438位、440位和442位的至少一个以上的氨基酸。通过这些氨基酸的改变，IgG型免疫球蛋白的Fc区在pH中性范围对人FcRn的结合有所增强。

为了用于本发明，在这些改变中，适当选择在pH中性范围也增强对人FcRn的结合的改变。作为特别优选的Fc区改变体的氨基酸，例如可以列举以EU编号表示的237位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265位、286位、289位、297位、298位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、315位、317位、332位、334位、360位、376位、380位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、424位、428位、433位、434位和436位氨基酸。通过将选自这些氨基酸的至少一个氨基酸取代成其他的氨基酸，可以增强抗原结合分子所含的Fc区在pH中性范围的人FcRn结合活性。

作为特别优选的改变，例如可以列举Fc区的以EU编号表示的下述氨基酸：

237位氨基酸为Met；

248位氨基酸为Ile；

252位氨基酸为Phe、Trp或Tyr中的任一个；

254位氨基酸为Thr；

255位氨基酸为Glu；

256位氨基酸为Asp、Asn、Glu或Gln中的任一个；

258位氨基酸为His；

265位氨基酸为Ala；

286位氨基酸为Ala或Glu中的任一个；

289位氨基酸为His；

297位氨基酸为Ala；

303位氨基酸为Ala；

305位氨基酸为Ala；

309位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro或Arg中的任一个；

311位氨基酸为Ala、His或Ile中的任一个；

312位氨基酸为Ala或His中的任一个；

314位氨基酸为Lys或Arg中的任一个；

315位氨基酸为Ala、Asp或His中的任一个；

317位氨基酸为Ala；

332位氨基酸为Val；

334位氨基酸为Leu；

360位氨基酸为His；

376位氨基酸为Ala；

380位氨基酸为Ala；

382位氨基酸为Ala；

384位氨基酸为Ala；

385位氨基酸为Asp或His中的任一个；

386位氨基酸为Pro；

387位氨基酸为Glu；

389位氨基酸为Ala或Ser中的任一个；；

424位氨基酸为Ala；

433位氨基酸为Lys；

434位氨基酸为Ala、Phe、His、Ser、Trp或Tyr中的任一个；或者

436位氨基酸为His、Ile、Leu、Phe、Thr或Val。此外，对将被改变的氨基酸的数量没有特别限定，可以仅改变一处氨基酸，也可以改变两处以上的氨基酸。作为这些氨基酸的改变的组合，例如可以列举表5-1～5-33中所示的氨基酸的改变。

[表5-1]

改变体	KD(M)	氨基酸改变位点
			F1	8.10E-07	N434W
F2	3.20E-06	M252Y/S254T/T256E
			F3	2.50E-06	N434Y
F4	5.80E-06	N434S
			F5	6.80E-06	N434A
F7	5.60E-06	M252Y
			F8	4.20E-06	M252W
F9	1.40E-07	M252Y/S254T/T256E/N434Y
			F10	6.90E-08	M252Y/S254T/T256E/N434W
F11	3.10E-07	M252Y/N434Y
			F12	1.70E-07	M252Y/N434W
F13	3.20E-07	M252W/N434Y
			F14	1.80E-07	M252W/N434W
F19	4.60E-07	P257L/434Y
			F20	4.60E-07	V308F/N434Y
F21	3.00E-08	M252Y/V308P/N434Y
			F22	2.00E-06	M428L/N434S
F25	9.20E-09	M252Y/S254T/T256E/V308p/N434W
			F26	1.00E-06I	332V
F27	7.40E-06	G237M
			F29	1.40E-06	1332V/N434Y
F31	2.80E-06	G237M/V308F
			F32	8.00E-07	S254T/N434W
F33	2.30E-06	S254T/N434Y
			F34	2.80E-07	T256E/N434W
F35	8.40E-07	T256E/N434Y
			F36	3.60E-07	S254T/T256E/N434W
F37	1.10E-06	S254T/T256E/N434Y
			F38	1.00E-07	M252Y/S254T/N434W
F39	3.00E-07	M252Y/S254T/N434Y
			F40	8.20E-08	M252Y/T256E/N434W
F41	1.50E-07	M252Y/T256E/N434Y

表5-2是表5-1的续表。

[表5-2]

F42	1.00E-06	M252Y/S254T/T256E/N434A
			F43	1.70E-06	M252Y/N434A
F44	1.10E-06	M252W/N434A
			F47	2.40E-07	M252Y/T256Q/N434W
F48	3.20E-07	M252Y/T256Q/N434Y
			F49	5.10E-07	M252F/T256D/N434W
F50	1.20E-06	M252F/T256D/N434Y
			F51	8.10E-06	N434F/Y436H
F52	3.10E-06	H433K/N434F/Y436H
			F53	1.00E-06	I332V/N434W
F54	8.40E-08	V308P/N434W
			F56	9.40E-07	I332V/M428L/N434Y
F57	1.10E-05	G385D/Q386P/N389S
			F58	7.70E-07	G385D/Q386P/N389S/N434W
F59	2.40E-06	G385D/Q386P/N389S/N434Y
			F60	1.10E.05	G385H
F61	9.70E-07	G385H/N434W
			F62	1.90E-06	G385H/N434Y
F63	2.50E-06	N434F
			F64	5.30E-06	N434H
F65	2.90E-07	M252Y/S254T/T256E/N434F
			F66	4.30E-07	M252Y/S254T/T256E/N434H
F67	6.30E-07	M252Y/N434F
			F68	9.30E-07	M252Y/N434H
F69	5.10E-07	M428L/N434W
			F70	1.50E-06	M428L/N434Y
F71	8.30E-08	M252Y/S254T/T256E/M428L/N434W
			F72	2.00E-07	M252Y/S254T/T256E/M428L/N434Y
F73	1.70E-07	M252Y/M428L/N434W
			F74	4.60E-07	M252Y/M428L/N434Y
F75	1.40E-06	M252Y/M428L/N434A
			F76	1.00E-06	M252Y/S254T/T256E/M428L/N434A
F77	9.90E-07	T256E/M428L/N434Y
			F78	7.80E-07	S254T/M428L/N434W

表5-3是表5-2的续表。

[表5-3]

F79	5.90E-06	S254T/T256E/N434A
			F80	2.70E-06	M252Y/T256Q/N434A
F81	1.60E-06	M252Y/T256E/N434A
			F82	1.10E-06	T256Q/N434W
F83	2.60E-06	T256Q/N434Y
			F84	2.80E-07	M252W/T256Q/N434W
F85	5.50E-07	M252W/T256Q/N434Y
			F86	1.50E-06	S254T/T256Q/N434W
F87	4.30E-06	S254T/T256Q/N434Y
			F88	1.90E-07	M252Y/S254T/T256Q/N434W
F89	8.60E-07	M252Y/S254T/T256Q/N434Y
			F90	1.90E-08	M252Y/T256E/V308P/N434W
F91	4.80E-08	M252Y/V308P/M428L/N434Y
			F92	1.10E-08	M252Y/S254T/T256E/V308P/M428L/N434W
F93	7.40E-07	M252W/M428L/N434W
			F94	3.70E-07	P257L/M428L/N434Y
F95	2.60E-07	M252Y/S254T/T256E/M428L/N434F
			F99	6.20E-07	M252Y/T256E/N434H
F101	1.10E-07	M252W/T256Q/P257L/N434Y
			F103	4.40E-08	P238/M252Y/V308P/N434Y
F104	3.70E-08	M252Y/D265A/V308P/N434Y
			F105	7.50E-08	M252Y/T307A/V308P/N434Y
F106	3.70E-08	M252Y/V303A/V308P/N434Y
			F107	3.40E-08	M252Y/V308P/D375A/N434Y
F108	4.10E-08	M252Y/V305A/V308P/N434Y
			F109	3.20E-08	M252Y/V308P/Q311A/N434Y
F111	3.20E-08	M252Y/V308P/K317A/N434Y
			F112	6.40E-08	M252Y/V308P/E380A/N434Y
F113	3.20E-08	M252Y/V308P/E382A/N434Y
			F114	3.80E-08	M252Y/V308P/S424A/N434Y
F115	6.60E-06	T307A/N434A
			F116	8.70E-06	E380A/N434A
F118	1.40E-05	M428L
			F119	5.40E-06	T250Q/M428L

表5-4是表5-3的续表。

[表5-4]

F120	6.30E-08	P257L/V308P/M428L/N434Y
			F121	1.50E-08	M252Y/T256E/V308P/M428L/N434W
F122	1.20E-07	M252Y/T256E/M428L/N434W
			F123	3.00E-08	M252Y/T256E/V308P/N434Y
F124	2.90E-07	M252Y/T256E/M428L/N434Y
			F125	2.40E-08	M252Y/S254T/T256E/V308P/M428L/N434Y
F128	1.70E-07	P257L/M428L/N434W
			F129	2.20E-07	P257A/M428L/N434Y
F131	3.00E-06	P257G/M428L/N434Y
			F132	2.10E-07	P257I/M426L/N434Y
F133	4.10E-07	P257M/M428L/N434Y
			F134	2.70E-07	P257N/M428L/N434Y
F135	7.50E-07	P25S/M428L/N434Y
			F136	3.80E-07	P257T/M428L/N434Y
F137	4.60E-07	P257V/M428L/N434Y
			F139	1.50E-08	M252W/V308P/N434W
F140	3.60E-08	S239K/M252Y/V308P/N434Y
			F141	3.50E-08	M252Y/S298G/V308P/N434Y
F142	3.70E-08	M252Y/D270F/V308P/N434Y
			F143	2.00E-07	M252Y/V308A/N434Y
F145	5.30E-08	M252Y/V308F/N434Y
			F147	2.40E-07	M252Y/V3081/N434Y
F149	1.90E-07	M252Y/V308L/N434Y
			F150	2.00E-07	M252Y/V308M/N434Y
F152	2.70E-07	M252Y/V308Q/N434Y
			F154	1.80E-07	M252Y/V308T/N434Y
F157	1.50E-07	P257A/V308P/M428L/N434Y
			F158	5.90E-08	P257T/V308P/M428L/N434Y
F159	4.40E-08	P257V/V308P/M428L/N434Y
			F160	8.50E-07	M252W/M428I/N434Y
F162	1.60E.07	M252W/M428Y/N434Y
			F163	4.20E-07	M252W/M428F/N434Y
F164	3.70E-07	P238A/M252W/N434Y
			F165	2.90E-07	M252W/D265A/N434Y

表5-5是表5-4的续表。

[表5-5]

F166	1.50E-07	M252W/T307Q/N434Y
			F167	2.90E-07	M252W/V303A/N434Y
F168	3.20E-07	M252W/D376A/N434Y
			F169	2.90E-07	M252W/V305A/N434Y
F170	1.70E-07	M252W/Q311A/N434Y
			F171	1.90E-07	M252W/D312A/N434Y
F172	2.20E-07	M252W/K317A/N434Y
			F173	7.70E-07	M252W/E380A/N434Y
F174	3.40E-07	M252W/E382A/N434Y
			F175	2.70E-07	M252W/S424A/N434Y
F176	2.90E-07	S239K/M252W/N434Y
			F177	2.80E-07	M252W/S298G/N434Y
F178	2.70E-07	M252W/D270F/N434Y
			F179	3.10E-07	M252W/N325G/N434Y
F182	6.60E-08	P257A/M428L/N434W
			F183	2.20E-07	P257T/M428L/N434W
F184	2.70E-07	P257V/M428L/N434W
			F185	2.60E-07	M252W/I332V/N434Y
F188	3.00E-06	P257I/Q311I
			F189	1.90E-07	M252Y/T307A/N434Y
F190	1.10E-07	M252Y/T307Q/N434Y
			F191	1.60E-07	P257L/T307A/M428L/N434Y
F192	1.10E-07	P257A/T307A/M428L/N434Y
			F193	8.50E-08	P257T/T307A/M428L/N434Y
F194	1.20E-07	P257V/T307A/M428L/N434Y
			F195	5.60E-08	P257L/T307Q/M428L/N434Y
F196	3.50E-08	P257A/T307Q/M428L/N434Y
			F197	3.30E-08	P257T/T307Q/M428L/N434Y
F198	4.80E-08	P257V/T307Q/M478L/N434Y
			F201	2.10E-07	M252Y/T307D/N434Y
F203	2.40E-07	M252Y/T307F/N434Y
			F204	2.10E-07	M252Y/T307G/N434Y
F205	2.00E-07	M252Y/T307H/N434Y
			F206	2.30E-07	M252Y/T307I/N434Y

表5-6是表5-5的续表。

[表5-6]

F207	9.40E-07	M252Y/T307K/N434Y
			F208	3.90E-07	M252Y/T307L/N434Y
F209	1.30E-07	M252Y/T307M/N434Y
			F210	2.90E-07	M252Y/T307N/N434Y
F211	2.40E-07	M252Y/T307P/N434Y
			F212	6.80E-07	M252Y/T307R/N434Y
F213	2.30E-07	M252Y/T307S/N434Y
			F214	1.70E-07	M252Y/T307V/N434Y
F215	9.60E-08	M252Y/T307W/N434Y
			F216	2.30E-07	M252Y/T307Y/N434Y
F217	2.30E-07	M252Y/K334L/N434Y
			F218	2.60E-07	M252Y/G385H/N434Y
F219	2.50E-07	M252Y/T289H/N434Y
			F220	2.50E-07	M252Y/Q311H/N434Y
F221	3.10E-07	M252Y/D312H/N434Y
			F222	3.40E-07	M252Y/N315H/N434Y
F223	2.70E-07	M252Y/K360H/N434Y
			F225	1.50E-06	M252Y/L314R/N434Y
F226	5.40E-07	M252Y/L314K/N434Y
			F227	1.20E-07	M252Y/N286E/N434Y
F228	2.30E-07	M252Y/L309E/N434Y
			F229	5.10E-07	M252Y/R255E/N434Y
F230	2.50E-07	M252Y/P387E/N434Y
			F236	8.90E-07	K248I/M428L/N434Y
F237	2.30E-07	M252Y/M428A/N434Y
			F238	7.40E-07	M252Y/M428D/N434Y
F240	7.20E-07	M252Y/M428F/N434Y
			F241	1.50E-06	M252Y/M428G/N434Y
F242	8.50E-07	M252Y/M428H/N434Y
			F243	1.80E-07	M252Y/M428I/N434Y
F244	1.30E-06	M252Y/M428K/N434Y
			F245	4.70E-07	M252Y/M428N/N434Y
F246	1.10E-06	M252Y/M428P/N434Y
			F247	4.40E-07	M252Y/M428Q/N434Y

表5-7是表5-6的续表。

[表5-7]

F249	6.40E-07	M252Y/M428S/N434Y
			F250	2.90E-07	M252Y/M428T/N434Y
F251	1.90E-07	M252Y/M428V/N434Y
			F252	1.00E-06	M252Y/M428W/N434Y
F253	7.10E-07	M252Y/M428Y/N434Y
			F254	7.50E-08	M252W/T307Q/M428Y/N434Y
F255	1.10E-07	M252W/Q311Q/M428Y/N434Y
			F256	5.40E-08	M252W/T307Q/Q311A/M428Y/N434Y
F257	5.00E-07	M252Y/T307A/M428Y/N434Y
			F258	3.20E-07	M252Y/T307Q/M428Y/N434Y
F259	2.80E-07	M252Y/D270F/N434Y
			F260	1.30E-07	M252Y/T307A/Q311A/N434Y
F261	8.40E-08	M252Y/T307Q/Q311A/N434Y
			F262	1.90E-07	M252Y/T307A/Q311H/N434Y
F263	1.10E-07	M252Y/T307Q/Q311H/N434Y
			F264	2.80E-07	M252Y/E382A/N434Y
F265	6.80E-07	M252Y/E382A/M428Y/N434Y
			F266	4.70E-07	M252Y/T307A/E382A/M428Y/N434Y
F267	3.20E-07	M252Y/T307Q/E382A/M428Y/N434Y
			F268	6.30E-07	P238A/M252Y/M428F/N434Y
F269	5.20E-07	M252Y/V305A/M428F/N434Y
			F270	6.60E-07	M252Y/N325G/M428F/N434Y
F271	6.90E-07	M252Y/D376A/M428F/N434Y
			F272	6.80E-07	M252Y/E380A/M428F/N434Y
F273	6.50E-07	M252Y/E382A/M428F/N434Y
			F274	7.60E-07	M252Y/E380A/E382A/M428F/N434Y
F275	4.20E-08	S239K/M252Y/V308P/E382A/N434Y
			F276	4.10E-08	M252Y/D270F/V308P/E382A/N434Y
F277	1.30E-07	S239K/M252Y/V308P/M428Y/N434Y
			F278	3.00E-08	M252Y/T307Q/V308P/E382A/N434Y
F279	6.10E-08	M252Y/V308P/Q311H/E382A/N434Y
			F280	4.10E-08	S239K/M252Y/D270F/V308P/N434Y
F281	9.20E-08	M252Y/V308P/E382A/M428F/N434Y
			F282	2.90E-08	M252Y/V308P/E382A/M428L/N434Y

表5-8是表5-7的续表。

[表5-8]

F283	1.00E-07	M252Y/V308P/E382A/M428Y/N434Y
			F284	1.00E-07	M252Y/V308P/M428Y/N434Y
F285	9.90E-08	M252Y/V308P/M428F/N434Y
			F286	l.20E-07	S239K/M252Y/V308P/E382A/M428Y/N434Y
F287	1.00E-07	M252Y/V308P/E380A/E382A/M428F/N434Y
			F288	1.90E-07	M252Y/T256E/E382A/N434Y
F289	4.80E-07	M252Y/T256E/M428Y/N434Y
			F290	4.60E-07	M252Y/T256E/E382A/M428Y/N434Y
F292	2.30E-08	S239K/M252Y/V308P/E382A/M428I/N434Y
			F293	5.30E-08	M252Y/V308P/E380A/E382A/M428I/N434Y
F294	1.10E-07	S239K/M252Y/V308P/M428F/N434Y
			F295	6.80E-07	S239K/M242Y/E380A/E382A/M428F/N434Y
F296	4.90E-07	M252Y/Q311A/M428Y/N434Y
			F297	5.10E-07	M252Y/D312A/M428Y/N434Y
F298	4.80E-07	M252Y/Q311A/D312A/M428Y/N434Y
			F299	9.40E-08	S239K/M252Y/V308P/Q311A/M428Y/N434Y
F300	8.30E-08	S239K/M252Y/V308P/D312A/M428Y/N434Y
			F301	7.20E-08	S239K/M252Y/V308P/Q311A/D312A/M428Y/N434Y
F302	1.90E-07	M252Y/T255E/T307P/N434Y
			F303	6.70E-07	M252Y/T307P/M428Y/N434Y
F304	1.60E-08	M252W/V308P/M428Y/N434Y
			F305	2.70E-08	M252Y/T256E/V308P/E382A/N434Y
F306	3.60E-08	M252W/V308P/E382A/N434Y
			F307	3.60E-08	S239K/M252W/V308P/E382A/N434Y
F308	1.90E-08	S239K/M252W/V308P/E382A/M428Y/N434Y
			F310	9.40E-08	S239K/M252W/V308P/E382A/M428I/N434Y
F311	2.80E-08	S239K/M252W/V308P/M428P/N434Y
			F312	4.50E-07	S239K/M252W/E380A/E382A/M428F/N434Y
F313	6.50E-07	S239K/M252Y/T307P/M428Y/N434Y
			F314	3.20E-07	M252Y/T256E/Q311A/D312A/M428Y/N434Y
F315	6.80E-07	S239K/M252Y/M428Y/N434Y
			F316	7.00E-07	S239K/M252Y/D270F/M428Y/N434Y
F317	1.10E-07	S239K/M252Y/D270F/V308P/M428Y/N434Y
			F318	1.80E-08	S239K/M252Y/V308P/M428I/N434Y

表5-9是表5-8的续表。

[表5-9]

F320	2.00E-08	S239K/M252Y/V308P/N325G/E382A/M428I/N434Y
			F321	3.20E-08	S239K/M252Y/D270F/V308P/N325G/N434Y
F322	9.20E-08	S239K/M252Y/D270F/T307P/V308P/N434Y
			F323	2.70E-08	S239K/M252Y/T256E/D270F/V308P/N434Y
F324	2.80E-08	S239K/M252Y/D270F/T307Q/V308P/N434Y
			F325	2.10E-08	S239K/M252Y/D270F/T307Q/V308P/Q311A/N434Y
F326	7.50E-08	S239K/M252Y/D270F/T307Q/Q311A/N434Y
			F327	6.50E-08	S239K/M252Y/T256E/D270F/T307Q/Q311A/N434Y
F328	1.90E-08	S239K/M252Y/D270F/V308P/M428I/N434Y
			F329	1.20E-08	S239K/M252Y/D270F/N286E/V308P/N434Y
F330	3.60E-08	S239K/M252Y/D270F/V308P/L309E/N434Y
			F331	3.00E-08	S239K/M252Y/D270F/V308P/P387E/N434Y
F333	7.40E-08	S239K/M252Y/D270F/T307Q/L309E/Q311A/N4334Y
			F334	1.90E-08	S239K/M252Y/D270F/V308P/N325G/M428I/N434Y
F335	1.50E-08	S239K/M252Y/T256E/D270F/V308P/M428I/N434Y
			F336	1.40E-08	S239K/M252Y/D270F/T307Q/V308P/Q311A/M428I/N434Y
F337	5.60E-08	S239K/M252Y/D270F/T307Q/Q311A/M428I/N434Y
			F338	7.70E-09	S239K/M252Y/D270F/N286E/V308P/M428I/N434Y
F339	1.90E-08	S239K/M252Y/D270F/V308P/L309E/M428I/N434Y
			F343	3.20E-08	S239K/M252Y/D270F/V308P/M428L/N434Y
F344	3.00E-08	S239K/M252Y/V308P/M428L/N434Y
			F349	1.50E-07	S239K/M252Y/V308P/L309P/M428L/N434Y
F350	1.70E-07	S239K/M252Y/V308P/L309R/M428L/N434Y
			F352	6.00E-07	S239K/M252Y/L309P/M428L/N434Y
F353	1.10E-06	S238K/M252Y/L309/M428L/N434Y
			F354	2.80E-08	S239K/M252Y/T307Q/V308P/M428L/N434Y
F356	3.40E-08	S239K/M252Y/D270F/V308P/L309E/P387E/N434Y
			F357	1.60E-08	S239K/M252Y/T256E/D270F/V308P/N325G/M428I/N434Y
F358	1.00E-07	S239K/M252Y/T307Q/N434Y
			F359	4.20E-07	P257V/T307Q/M428I/N434Y
F360	1.30E-06	P257V/T307Q/M428V/N434Y
			F362	5.40E-08	9257V/T307Q/N325G/M428L/N434Y
F363	4.10E-08	P257V/T307Q/Q311A/M428L/N434Y
			F364	3.50E-08	P257V/T307Q/Q311A/N325G/M428L/N434Y

表5-10是表5-9的续表。

[表5-10]

F365	5.10E-08	P257V/V305A/T307Q/M428L/N434Y
			F367	1.50E-08	S239K/M252Y/E258H/D270F/T307Q/V308P/Q311A/N434Y
F368	2.00E-08	S239K/M252Y/D270F/V308P/N325G/E382A/M428I/N434Y
			F369	7.50E-08	M252Y/P257V/T307Q/M428I/N434Y
F372	1.30E-08	S239K/M252W/V308P/M428Y/N434Y
			F373	1.10E-08	S239K/M252W/V308P/Q311A/M428Y/N434Y
F374	1.20E-08	S239K/M252W/T256E/V308P/M428Y/N434Y
			F375	5.50E-09	S239K/M252W/N286E/V308P/M428Y/N434Y
F376	9.60E-09	S239K/M252Y/T256E/D270F/N286E/V308P/N434Y
			F377	1.30E-07	S239K/M252W/T307P/M428Y/N434Y
F379	9.00E-09	S239K/M252W/T256E/V308P/Q311A/M428Y/N434Y
			F380	5.60E-09	S239K/M252W/T256E/N286E/V308P/M428Y/N434Y
F381	1.10E-07	P257V/T307A/Q311A/M428L/N434Y
			F382	8.70E-08	P257V/V305A/T307A/M428L/N434Y
F386	3.20E-08	M252Y/V308P/L309E/N434Y
			F387	1.50E-07	M252Y/V308P/L309D/N434Y
F388	7.00E-08	M252Y/V308P/L309A/N434Y
			F389	1.70E-08	M252W/V308P/L309E/M428Y/N434Y
F390	6.80E-08	M252W/V308P/L309D/M428Y/N434Y
			F391	3.60E-08	M252W/V308P/L309A/M428Y/N434Y
F392	6.90E-09	S239K/M252Y/N286E/V308P/M428I/N434Y
			F393	1.20E-08	S239K/M252Y/N286E/V308P/N434Y
F394	5.30E-08	S239K/M252Y/T307Q/Q311A/M428I/N434Y
			F395	2.40E-08	S239K/M252Y/T256E/V308P/N434Y
F396	2.00E-08	S239K/M252Y/D270F/N286E/T307Q/Q311A/M428I/N434Y
			F397	4.50E-08	S239K/M252Y/D270F/T307Q/Q311A/P387E/M428I/N434Y
F398	4.40E-09	S239K/M252Y/D270F/N286E/T307Q/V308P/Q311A/M428I/N434Y
			F399	6.50E-09	S239K/M252Y/D270F/N286E/T307Q/V308P/M428I/N434Y
F400	6.10E-09	S239K/M252Y/D270F/N286E/V308P/Q311A/M428I/N434Y
			F401	6.90E-09	S239K/M252Y/D270F/N286E/V308P/P387E/M428I/N434Y
F402	2.20E-08	P257V/T307Q/M428L/N434W
			F403	5.10E-08	P257V/T307A/M428L/N434W
F404	9.40E-08	P257A/T307Q/L309P/M428L/N434Y
			F405	1.70E-07	P257V/T307Q/L309P/M428L/N434Y

表5-11是表5-10的续表。

[表5-11]

F406	1.50E-07	P257A/T307Q/L309R/M428L/N434Y
			F407	1.60E-07	P257V/T307Q/L309R/M428L/N434Y
F408	2.50E-07	P257V/N286E/M428L/N434Y
			F409	2.00E-07	P257V/P387E/M428L/N434Y
F410	2.20E-07	P257V/T307H/M428L/N434Y
			F411	1.30E-07	P257V/T307N/M428L/N434Y
F412	8.80E-08	P257V/T307G/M428L/N434Y
			F413	1.20E-07	P257V/T307P/M428L/N434Y
F414	1.10E-07	P257V/T307S/M428L/N434Y
			F415	5.60E-08	P257V/N286E/T307A/M428L/N434Y
F416	9.40E-08	P257V/T307A/P387E/M428L/N434Y
			F418	6.20E-07	S239K/M252Y/T307P/N325G/M428Y/N434Y
F419	1.60E-07	M252Y/T307A/Q311H/K360H/N434Y
			F420	1.50E-07	M252Y/T307A/Q311H/P387E/N434Y
F421	1.30E-07	M252Y/T307A/Q311H/M428A/N434Y
			F422	1.80E-07	M252Y/T307A/Q311H/E382A/N434Y
F423	8.40E-08	M252Y/T307W/Q311H/N434Y
			F424	9.40E-08	S239K/P257A/V308P/M428L/N434Y
F425	8.00E-08	P257A/V308P/L309E/M428L/N434Y
			F426	8.40E-08	P257V/T307Q/N434Y
F427	1.10E-07	M252Y/P257V/T307Q/M428V/N434Y
			F428	8.00E-08	M252Y/P257V/T307Q/M428L/N434Y
F429	3.70E-08	M252Y/P257V/T307Q/N434Y
			F430	8.10E-08	M252Y/P257V/T307Q/M428Y/N434Y
F431	6.50E-08	M252Y/P257V/T307Q/M428F/N434Y
			F432	9.20E-07	P257V/T307Q/Q311A/N325G/M428V/N434Y
F433	6.00E-08	P257V/T307Q/Q311A/N325G/N434Y
			F434	2.00E-08	P257V/T307Q/Q311A/N325G/M428Y/N434Y
F435	2.50E-08	P257V/T307Q/Q311A/N325G/M428F/N434Y
			F436	2.50E-07	P257A/T307Q/M428V/N434Y
F437	5.70E-08	P257A/T307Q/N434Y
			F438	3.60E-08	P257A/T307Q/M428Y/N434Y
F439	4.00E-08	P257A/T307Q/M428F/N434Y
			F440	1.50E-08	P257V/N286E/T307Q/Q311A/N325G/M428L/N434Y

表5-12是表5-11的续表。

[表5-12]

F441	1.80E-07	P257A/Q311A/M428L/N434Y
			F442	2.00E-07	P257A/Q311H/M428L/N434Y
F443	5.50E-08	P257A/T307Q/Q311A/M428L/N434Y
			F444	1.40E-07	P257A/T307A/Q311A/M428L/N434Y
F445	6.20E-08	P257A/T307Q/Q311H/M428L/N434Y
			F446	1.10E-07	P257A/T307A/Q311H/M428L/N434Y
F447	1.40E-08	P257A/N286E/T307Q/M428L/N434Y
			F448	5.30E-08	P257A/N286E/T307A/M428L/N434Y
F449	5.70E-07	S239K/M252Y/D270F/T307P/N325G/M428Y/N434Y
			F450	5.20E-07	S239K/M252Y/T307P/L309E/N325G/M428Y/N434Y
F451	1.00E-07P	257S/T307A/M428L/N434Y
			F452	1.40E-07	P257M/T307A/M428L/N434Y
F453	7.80E-08	P257N/T307A/M428L/N434Y
			F454	9.60E-08	P257I/T307A/M428L/N434Y
F455	2.70E-08	P257V/T307Q/M428Y/N434Y
			F456	3.40E-08	P257V/T307Q/M428F/N434Y
F457	4.00E-08	S239K/P257V/V308P/M428L/N434Y
			F458	1.50E-08	P257V/T307Q/V308P/N325G/M428L/N434Y
F459	1.30E-08	P257V/T307Q/V308P/Q311A/N325G/M428L/N434Y
			F460	4.70E-08	P257V/T307A/V308P/N325G/M428L/N434Y
F462	8.50E-08	P257A/V308P/N325G/M428L/N434Y
			F463	1.30E-07	P257A/T307A/V308P/M428L/N434Y
F464	5.50E-08	P257A/T307Q/V308P/M428L/N434Y
			F465	2.10E-08	P257V/N286E/T307Q/N325G/M428L/N434Y
F466	3.50E-07	T256E/P257V/N434Y
			F467	5.70E-07	T256E/P257T/N434Y
F468	5.70E-08	S239K/P257T/V308P/M428L/N434Y
			F469	5.60E-08	P257T/V308P/N325G/M428L/N434Y
F470	5.40E-08	T256E/P257T/V308P/N325G/M428L/N434Y
			F471	6.60E-08	P257T/V308P/N325G/E382A/M428L/N434Y
F472	5.40E-08	P257T/V308P/N325G/P387E/M428L/N434Y
			F473	4.50E-07	P257T/V308P/L309P/N325G/M428L/N434Y
F474	3.50E-07	P257T/V308P/L309R/N325G/M428L/N434Y
			F475	4.30E-08	T256E/P257V/T307Q/M428L/N434Y

表5-13是表5-12的续表。

[表5-13]

F476	5.50E-08	P257V/T307Q/E382A/M428L/N434Y
			F477	4.30E-08	P257V/T307Q/P387E/M428L/N434Y
F480	3.90E-08	P257L/V308P/N434Y
			F481	5.60E-08	P257T/T307Q/N434Y
F482	7.00E-08	P257V/T307Q/N325G/N434Y
			F483	5.70E-08	P257V/T307Q/Q311A/N434Y
F484	6.20E-08	P257V/V305A/T307Q/N434Y
			F485	9.70E-08	P257V/N286E/T307A/N434Y
F486	3.40E-07	P257V/T307Q/L309R/Q311H/M428L/N434Y
			F488	3.50E-08	P257V/V308P/N325G/M428L/N434Y
F490	7.50E-08	S239K/P257V/V308P/Q311H/M428L/N434Y
			F492	9.80E-08	P257V/V305A/T307A/N325G/M428L/N434Y
F493	4.90E-07	S239K/D270F/T307P/N325G/M428Y/N434Y
			F497	3.10E-06	P257T/T307A/M428V/N434Y
F498	1.30E-06	P257A/M428V/N434Y
			F499	5.20E-07	P257A/T307A/M428V/N434Y
F500	4.30E-08	P257S/T307Q/M428L/N434Y
			F506	1.90E-07	P257V/N297A/T307Q/M428L/N434Y
F507	5.10E-08	P257V/N286A/T307Q/M428L/N434Y
			F508	1.10E-07	P257V/T307Q/N315A/M428L/N434Y
F509	5.80E-08	P257V/T307Q/N384A/M428L/N434Y
			F510	5.30E-08	P257V/T307Q/N389A/M428L/N434Y
F511	4.20E-07	P257V/N434Y
			E512	5.80E-07	P257T/N434Y
F517	3.10E-07	P257V/N286E/N434Y
			F518	4.20E-07	P257T/N286E/N434Y
F519	2.60E-08	P257V/N286E/T307Q/N434Y
			F521	1.10E-08	P257V/N286E/T307Q/M428Y/N434Y
F523	2.60E-08	P257V/V305A/T307Q/M428Y/N434Y
			F526	1.90E-08	P257T/T307Q/M428Y/N434Y
F527	9.40E-09	P257V/T307Q/V308P/N325G/M428Y/N434Y
			F529	2.50E-08	P257T/T307Q/M428F/N434Y
F533	1.20E-08	P257A/N286E/T307Q/M428F/N434Y
			F534	1.20E-08	P257A/N286E/T307Q/M428Y/N434Y

表5-14是表5-13的续表。

[表5-14]

F535	3.90E-08	T250A/P257V/T307Q/M428L/N434Y
			F538	9.90E-08	T250F/P257V/T307Q/M428L/N434Y
F541	6.00E-08	T250I/P257V/T307Q/M428L/N434Y
			F544	3.10E-08	T250M/P257V/T307Q/M428L/N434Y
F549	5.40E-08	T250S/P257V/T307Q/M428L/N434Y
			F550	5.90E-08	T250V/P257V/T307Q/M428L/N434Y
F551	1.20E-07	T250W/P257V/T307Q/M428L/N434Y
			F552	1.10E-07	T250Y/P257V/T307Q/M428L/N434Y
F553	1.70E-07	M252Y/Q311A/N434Y
			F554	2.80E-08	S239K/M252Y/S254T/V308P/N434Y
F556	1.50E-06	M252Y/T307Q/Q311A
			F559	8.00E-08	M252Y/S254T/N286E/N434Y
F560	2.80E-08	M252Y/S254T/V308P/N434Y
			F561	1.40E-07	M252Y/S254T/T307A/N434Y
F562	8.30E-08	M252Y/S254T/T307Q/N434Y
			F563	1.30E-07	M252Y/S254T/Q311A/N434Y
F564	1.90E-07	M252Y/S254T/Q311H/N434Y
			F565	9.20E-08	M252Y/S254T/T307A/Q311A/N434Y
F566	6.10E-08	M252Y/S254T/T307Q/Q311A/N434Y
			F567	2.20E-07	M252Y/S254T/M428I/N434Y
F568	1.10E-07	M252Y/T256E/T307A/Q311H/N434Y
			F569	2.00E-07	M252Y/T256Q/T307A/Q311H/N434Y
F570	1.30E-07	M252Y/S254T/T307A/Q311H/N434Y
			F571	8.10E-08	M252Y/N286E/T307A/Q311H/N434Y
F572	1.00E-07	M252Y/T307A/Q311H/M428I/N434Y
			F576	1.60E-06	M252Y/T256E/T307Q/Q311H
F577	1.30E-06	M252Y/N286E/T307A/Q311A
			F578	5.70E-07	M252Y/N286E/T307Q/Q311A
F580	8.60E-07	M252Y/N286E/T307Q/Q311H
			F581	7.20E-08	M252Y/T256E/N286E/N434Y
F582	7.50E-07	S239K/M252Y/V308P
			F583	7.80E-07	S239K/M252Y/V308P/E382A
F584	6.30E-07	S239K/M252Y/T256E/V308P
			F585	2.90E-07	S239K/M252Y/N286E/V308P

表5-15是表5-14的续表。

[表5-15]

F586	1.40E-07	S239K/M252Y/N286E/V308P/M428I
			F587	1.90E-07	M252Y/N286E/M428L/N434Y
F592	2.00E-07	M252Y/S254T/E382A/N434Y
			F593	3.10E-08	S239K/M252Y/S254T/V308P/M428I/N434Y
F594	1.60E-08	S239K/M252Y/T256E/V308P/M428I/N434Y
			F595	1.80E-07	S239K/M252Y/M428I/N434Y
F596	4.00E-07	M252Y/D314A/E382A/M4428Y/N434Y
			F597	2.20E-07	M252Y/E382A/P387E/N434Y
F598	1.40E-07	M252Y/D312A/P387E/N434Y
			F599	5.20E-07	M252Y/P387E/M428Y/N434Y
F600	2.80E-07	M252Y/T256Q/E382A/N434Y
			F601	9.60E-09	M252Y/N286E/V308P/N434Y
F608		G236A/S239D/I332E
			F611	2.80E-07	M252Y/V305T/T307P/V308I/L309A/N434Y
F612	3.60E-07	M252Y/T307P/V308I/L309A/N434Y
			F613		S239D/A330L/I332E
F616		S239D/K326D/L328Y
			F617	7.40E-07	S239K/N434W
F618	6.40E-07	S239K/V308F/N434Y
			F619	3.10E-07	S239K/M252Y/N434Y
F650	2.10E-07	S239K/M252Y/S254T/N434Y
			F621	1.50E-07	S239K/M252Y/T307A/Q311H/N434Y
F622	3.20E-07	S239K/M252Y/T256Q/N434Y
			F623	1.80E-07	S239K/M252W/N434W
F624	1.40E-08	S239K/P257A/N286E/T307Q/M428L/N434Y
			F625	7.60E-08	S239K/P257A/T307Q/M428L/N4344Y
F626	1.30E-06	V308P
			F629	3.90E-08	M252Y/V279L/V308P/N434Y
F630	3.70E-08	S239K/M252Y/V279L/V308P/N434Y
			F633	2.40E-08	M252Y/V282D/V308P/N434Y
F634	3.20E-08	S239K/M252Y/V282D/V308P/N434Y
			F635	4.50E-08	M252Y/V284K/V308P/N434Y
F636	4.80E-08	S239K/M252Y/V284K/V308P/N434Y
			F637	1.50E-07	M252Y/K288S/V308P/N434Y

表5-16是表5-15的续表。

[表5-16]

F638	1.40E-07	S239K/M252Y/K288S/V308P/N434Y
			F639	2.70E-08	M252Y/V308P/G385R/N434Y
F640	3.60E-08	S239K/M252Y/V308P/G385R/N434Y
			F641	3.00E-08	M252Y/V308P/Q386K/N434Y
F642	3.00E-08	S239K/M252Y/V308P/Q386K/N434Y
			F643	3.20E-08	L235G/G236R/S239K/M252Y/V308P/N434Y
F644	3.00E-08	G236R/S239K/M252Y/V308P/N434Y
			F645	3.30E-08	S239K/M252Y/V308P/L328R/N434Y
F646	3.80E-08	S239K/M252Y/N297A/V308P/N434Y
			F647	2.90E-08	P238D/M252Y/V308P/N434Y
F648		P238D
			F649	1.20E-07	S239K/M252Y/N286E/N434Y
F650	1.70E-07	S239K/M252Y/T256E/N434Y
			F651	1.80E-07	S239K/M252Y/Q311A/N434Y
F652	2.40E-07	P238D/M252Y/N434Y
			F654	3.20E-08	L235K/S239K/M252Y/V308P/N434Y
F655	3.40E-08	L235R/S239K/M252Y/V308P/N434Y
			F656	3.30E-08	G237K/S239K/M252Y/V308P/N434Y
F657	3.20E-08	G237R/S239K/M252Y/V308P/N434Y
			F658	3.20E-08	P238K/S239K/M252Y/V308P/N434Y
F659	3.00E-08	P238R/S239K/M252Y/V308P/N434Y
			F660	3.10E-08	S239K/M252Y/V308P/P329K/N434Y
F661	3.40E-08	S239K/M252Y/V308P/P329R/N434Y
			F663	6.40E-09	S239K/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/N434Y
F664	3.90E-08	M252Y/N286A/V308P/N434Y
			F665	2.00E-08	M252Y/N286D/V308P/N434Y
F666	2.10E-08	M252Y/N286F/V308P/N434Y
			F667	3.00E-08	M252Y/N286G/V308P/N434Y
F668	4.00E-08	M252Y/N286H/V308P/N434Y
			F669	3.50E-08	M252Y/N286I/V308P/N434Y
F670	2.10E-07	M252Y/N286K/V308P/N434Y
			F671	2.20E-08	M252Y/N286L/V308P/N434Y
F672	2.40E-08	M252Y/N286M/V308P/N434Y
			F673	2.30E-08	M252Y/N286P/V308P/N434Y

表5-17是表5-16的续表。

[表5-17]

F674	3.20E-08	M252Y/N286Q/V308P/N434Y
			F675	5.10E-08	M252Y/N286R/V308P/N434Y
F676	3.20E-08	M252Y/N286S/V308P/N434Y
			F677	4.70E-08	M252Y/N286T/V308P/N434Y
F678	3.30E-08	M252Y/N286V/V308P/N434Y
			F679	1.70E-08	M252Y/N286W/V308P/N434Y
F680	1.50E-08	M252Y/N286Y/V308P/N434Y
			F681	4.90E-08	M252Y/K288A/V308P/N434Y
F682	8.20E-08	M252Y/K288D/V308P/N434Y
			F683	5.00E-08	M252Y/K288E/V308P/N434Y
F684	5.10E-08	M252Y/K288F/V308P/N434Y
			F685	5.30E-08	M252Y/K288G/V308P/N434Y
F686	4.60E-08	M252Y/K288H/V308P/N434Y
			F687	4.90E-08	M252Y/K288I/V308P/N434Y
F688	2.80E-08	M252Y/K288L/V308P/N434Y
			F689	4.10E-08	M252Y/K288M/V308P/N434Y
F690	1.00E-07	M252Y/K288N/V308P/N434Y
			F691	3.20E-07	M252Y/K288P/V308P/N434Y
F692	3.90E-08	M252Y/K288Q/V308P/N434Y
			F693	3.60E-08	M252Y/K288R/V308P/N434Y
F694	4.70E-08	M252Y/K288V/V308P/N434Y
			F695	4.00E-08	M252Y/K288W/V308P/N434Y
F696	4.40E-08	M252Y/K288Y/V308P/N434Y
			F697	3.10E-08	S239K/M252Y/V308P/N325G/N434Y
F698	2.20E-08	M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y
			F699	2.30E-08	S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y
F700	5.20E-08	M252Y/V308P/L328E/N434Y
			F705	7.10E-09	M252Y/N286E/V308P/M428I/N434Y
F706	1.80E-08	M252Y/N286E/T307Q/Q311A/M428I/N434Y
			F707	5.90E-09	M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/N434Y
F708	4.10E-09	M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/M428I/N434Y
			F709	2.00E-08	S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/M428I/N434Y
F710	1.50E-08	F238D/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/M428I/N434Y
			F711	6.50E-08	S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y

表5-18是表5-17的续表。

[表5-18]

F712	6.00E-08	P238D/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y
			F713	2.00E-08	P238D/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y
F714	2.30E-07	P238D/M252Y/N325S/N434Y
			F715	2.30E-07	P238D/M252Y/N325M/N434Y
F716	2.70E-07	P238D/M252Y/N325L/N434Y
			F717	2.60E-07	P238D/M252Y/N325I/N434Y
F718	2.80E-07	P238D/M252Y/Q295M/N434Y
			F719	7.40E-08	P238D/M252Y/N325G/N434Y
F720	2.40E-08	M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y
			F721	1.50E-08	M252Y/T307Q/V308P/Q311A/M428I/N434Y
F722	2.70E-07	P238D/M252Y/A327G/N434Y
			F723	2.80E-07	P238D/M252Y/L328D/N434Y
F724	2.50E-07	P238D/M252Y/L328E/N434Y
			F725	4.20E-08	L235K/G237R/S239K/M252Y/V308P/N434Y
F726	3.70E-08	L235K/P238K/S239K/M252Y/V308P/N434Y
			F729	9.20E-07	T307A/Q311A/N434Y
F730	6.00E-07	T307Q/Q311A/N434Y
			F731	8.50E-07	T307A/Q311H/N434Y
F732	6.80E-07	T307Q/Q311H/N434Y
			F733	3.20E-07	M252Y/L328E/N434Y
F734	3.10E-07	G236D/M252Y/L328E/N434Y
			F736	3.10E-07	M252Y/S267M/L328E/N434Y
F737	3.10E-07	M252Y/S267L/L328E/N434Y
			F738	3.50E-07	P238D/M252Y/T307P/N434Y
F739	2.20E-07	M252Y/T307P/Q311A/N434Y
			F740	2.90F-07	M252Y/T307P/Q311H/N434Y
F741	3.10E-07	P238D/T250A/M252Y/N434Y
			F744	9.90E-07	P238D/T250F/M252Y/N434Y
F745	6.60E-07	P238D/T250G/M252Y/N434Y
			F746	6.00E-07	P238D/T250H/M252Y/N434Y
F747	2.80E-07	P238D/T250I/M252Y/N434Y
			F749	5.10E-07	P238D/T250L/M252Y/N434Y
F750	3.00E-07	P238D/T250M/M252Y/N434Y
			F751	5.30E-07	P238D/T250N/M252Y/N434Y

表5-19是表5-18的续表。

[表5-19]

F753	1.80E-07	P238D/T250Q/M252Y/N434Y
			F755	3.50E-07	P238D/T250S/M252Y/N434Y
F756	3.70E-07	P238D/T250V/M252Y/N434Y
			F757	1.20E-06	P238D/T250W/M252Y/N434Y
F758	1.40E-06	P238D/T250Y/M252Y/N434Y
			F759		L235K/S239K
F760		L235R/S239K
			F761	1.10E-06	P238D/N434Y
F762	3.60E-08	L235K/S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y
			F763	3.50E-08	L235R/S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y
F764	6.30E-07	P238D/T307Q/Q311A/N434Y
			F765	8.50E-08	P238D/M252Y/T307Q/L309E/Q311A/N434Y
F766	6.00E-07	T307A/L309E/Q311A/N434Y
			F767	4.30E-07	T307Q/L309E/Q311A/N434Y
F768	6.40E-07	T307A/L309E/Q311H/N434Y
			F769	4.60E-07	T307Q/L309E/Q311H/N434Y
F770	3.00E-07	M252Y/T256A/N434Y
			F771	4.00E-07	M252Y/E272A/N434Y
F772	3.80E-07	M252Y/K274A/N434Y
			F773	3.90E-07	M252Y/V282A/N434Y
F774	4.00E-07	M252Y/N286A/N434Y
			F775	6.20E-07	M252Y/K338A/N434Y
F776	3.90E-07	M252Y/K340A/N434Y
			F777	3.90E-07	M252Y/E345A/N434Y
F779	3.90E-07	M252Y/N361A/N434Y
			F780	3.90E-07	M252Y/Q362A/N434Y
F781	3.70E-07	M252Y/S375A/N434Y
			F782	3.50E-07	M252Y/Y391A/N434Y
F783	4.00E-07	M252Y/D413A/N434Y
			F784	5.00E-07	M252Y/L309A/N434Y
F785	7.40E-07	M252Y/L309H/N434Y
			F786	2.80E-08	M252Y/S254T/N286E/T307Q/Q311A/N434Y
F787	8.80E-08	M252Y/S254T/T307Q/L309E/Q311A/N434Y
			F788	4.10E-07	M252Y/N315A/N434Y

表5-20是表5-19的续表。

[表5-20]

F789	1.50E-07	M252Y/N315D/N434Y
			F790	2.70E-07	M252Y/N315E/N434Y
F791	4.40E-07	M252Y/N315F/N434Y
			F792	4.40E-07	M252Y/N315G/N434Y
F793	3.30E-07	M252Y/N315I/N434Y
			F794	4.10E-07	M252Y/N315K/N434Y
F795	3.10E-07	M252Y/N315L/N434Y
			F796	3.40E-07	M252Y/N315M/N434Y
F798	3.50E-07	M252Y/N315Q/N434Y
			F799	4.10E-07	M252Y/N315R/N434Y
F800	3.80E-07	M252Y/N315S/N434Y
			F801	4.40E-07	M252Y/N315T/N434Y
F802	3.30E-07	M252Y/N315V/N434Y
			F803	3.60E-07	M252Y/N315W/N434Y
F804	4.00E-07	M252Y/N315Y/N434Y
			F805	3.00E-07	M252Y/N325A/N434Y
F806	3.10E-07	M252Y/N384A/N434Y
			F807	3.20E-07	M252Y/N389A/N434Y
F808	3.20E-07	M252Y/N389A/N390A/N434Y
			F809	2.20E-07	M252Y/S254T/T256S/N434Y
F810	2.20E-07	M252Y/A378V/N434Y
			F811	4.90E-07	M252Y/E380S/N434Y
F812	2.70E-07	M252Y/E382V/N434Y
			F813	2.80E-07	M252Y/S424E/N434Y
F814	1.20E-07	M252Y/N434Y/Y436I
			F815	5.50E-07	M252Y/N434Y/T437R
F816	3.60E-07	P238D/T250V/M252Y/T307P/N434Y
			F817	9.80E-08	P238D/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y
F819	1.40E-07	P238D/M252Y/N286E/N434Y
			F820	3.40E-07	L235K/S239K/M252Y/N434Y
F821	3.10E-07	L235R/S239K/M252Y/N434Y
			F822	1.10E-06	P238D/T250Y/M252Y/W313Y/N434Y
F823	1.10E-06	P238D/T250Y/M252Y/W313F/N434Y
			F828	2.50E-06	P238D/T250V/M252Y/I253V/N434Y

表5-21是表5-20的续表。

[表5-21]

F831	1.60E-06	P238D/T250V/M252Y/R255A/N434Y
			F832	2.60E-06	P238D/T250V/M252Y/R255D/N434Y
F833	8.00E-07	P238D/T250V/M252Y/R255E/N434Y
			F834	5.10E-07	P238D/T250V/M252Y/R225F/N434Y
F836	5.00E-07	P238D/T250V/M252Y/R255H/N434Y
			F837	5.60E-07	P238D/T250V/M252Y/R255I/N434Y
F838	4.30E-07	P238D/T250V/M252Y/R255K/N434Y
			F839	3.40E-07	P238D/T250V/M252Y/R255L/N434Y
F840	4.20E-07	P238D/T250V/M252Y/R255M/N434Y
			F841	1.10E-06	P238D/T250V/M252Y/R255N/N434Y
F843	6.60E-07	P238D/T250V/M252Y/R255Q/N434Y
			F844	1.30E-06	P238D/T250V/M252Y/R255S/N434Y
F847	3.40E-07	P238D/T250V/M252Y/R255W/N434Y
			F848	8.30E-07	P238D/T250V/M252Y/R255Y/N434Y
F849	3.30E-07	M252Y/D280A/N434Y
			F850	2.90E-07	M252Y/D280E/N434Y
F852	3.30E-07	M252Y/D280G/N434Y
			F853	3.20E-07	M252Y/D280H/N434Y
F855	3.20E-07	M252Y/D280K/N434Y
			F858	3.20E-07	M252Y/D280N/N434Y
F860	3.30E-07	M252Y/D280Q/N434Y
			F861	3.20E-07	M252Y/D280R/N434Y
F862	3.00E-07	M252Y/D280S/N434Y
			F863	2.70E-07	M252Y/D280T/N434Y
F867	2.80E-07	M252Y/N384A/N389A/N434Y
			F868	2.00E-08	G236A/S239D/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y
F869		G236A/S239D
			F870	7.30E-08	L235K/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y
F871	7.10E-08	L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y
			F872	1.30E-07	L235K/S239K/M252Y/N286E/N434Y
F873	1.20E-07	L235R/S239K/M252Y/N286E/N434Y
			F875	4.80E-07	M252Y/N434Y/Y436A
F877	8.30E-07	M252Y/N434Y/Y436E
			F878	1.90E-07	M252Y/N434Y/Y436F

表5-22是表5-21的续表。

[表5-22]

F879	9.20E-07	M252Y/N434Y/Y436G
			F880	3.90E-07	M252Y/N434Y/Y436H
F881	3.10E-07	M252Y/N434Y/Y436K
			F882	1.30E-07	M252Y/N434Y/Y436L
F883	2.10E-07	M252Y/N434Y/Y436M
			F884	4.00E-07	M252Y/N434Y/Y436N
F888	4.80E-07	M252Y/N434Y/Y436S
			F889	2.20E-07	M252Y/N434Y/Y436T
F890	1.10E-07	M252Y/N434Y/Y436V
			F891	1.70E-07	M252Y/N434Y/Y436W
F892	7.10E-08	M252Y/S254T/N434Y/Y436I
			F893	9.80E-08	L235K/S239K/M252Y/N434Y/Y436I
F894	9.20E-08	L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436I
			F895	2.10E-08	L235K/S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N315E/N434Y
F896	2.00E-08	L235R/S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N315E/N434Y
			F897	9.70E-08	M252Y/N315D/N384A/N389A/N434Y
F898	1.70E-07	M252Y/N315E/N384A/N389A/N434Y
			F899	1.10E-07	M252Y/N315D/G316A/N434Y
F900	1.70E-07	M252Y/N315D/G316D/N434Y
			F901	1.30E-07	M252Y/N315D/G316E/N434Y
F902	2.20E-07	M252Y/N315D/G316F/N434Y
			F903	2.30E-07	M252Y/N315D/G316H/N434Y
F904	1.00E-07	M252Y/N315D/G316I/N434Y
			F905	1.30E-07	M252Y/N315D/G316K/N434Y
F906	1.50E-07	M252Y/N315D/G316L/N434Y
			F907	1.30E-07	M252Y/N315D/G316M/N434Y
F908	1.50E-07	M252Y/N315D/G316N/N434Y
			F909	1.30E-07	M252Y/N315D/G316P/N434Y
F910	1.40E-07	M252Y/N315D/G316Q/N434Y
			F911	1.30E-07	M252Y/N315D/G316R/N434Y
F912	1.20E-07	M252Y/N315D/G316S/N434Y
			F913	1.10E-07	M252Y/N315D/G316T/N434Y
F914	1.50E-07	M252Y/N315D/G316V/N434Y
			F915	2.30E-07	M252Y/N315D/G316W/N434Y

表5-23是表5-22的续表。

[表5-23]

F917	2.50E-07	M252Y/N286S/N434Y
			F918	2.80E-07	M252Y/D280E/N384A/N389A/N434Y
F919	3.30E-07	M252Y/D280G/N384A/N389A/N434Y
			F920	2.50E-07	M252Y/N286S/N384A/N389A/N434Y
F921	1.20E-07	M252Y/N286E/N384A/N389A/N434Y
			F922	5.90E-08	L235K/S239K/M252Y/N286E/N434Y/Y436I
F923	6.00E-08	L235R/S239K/M252Y/N286E/N434Y/Y436I
			F924	3.40E-08	L235K/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436I
F925	3.20E-08	L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436I
			F926	1.10E-07	L235K/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y435I
F927	1.00E-07	L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436I
			F928	2.90E-08	M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436I
F929	2.90E-08	M252Y/S254T/T307Q/Q311A/N434Y/Y436I
			F930	1.40E-07	P238D/T250V/M252Y/N286E/N434Y
F931	1.20E-07	P238D/T250V/M252Y/N434Y/Y436I
			F932	3.20E-07	T250V/M252Y/N434Y
F933	3.00E-07	L234R/P238D/T250V/M252Y/N434Y
			F934	3.10E-07	G236K/P238D/T250V/M252Y/N434Y
F935	3.20E-07	G237K/P238D/T250V/M252Y/N434Y
			F936	3.20E-07	G237R/P238D/T250V/M252Y/N424Y
F937	3.10E-07	P238D/S239K/T250V/M252Y/N434Y
			F938	1.60E-07	L235K/S239K/M252Y/N434Y/Y436V
F939	1.50E-07	L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V
			F940	1.50E-07	P238D/T250V/M252Y/N434Y/Y436V
F941	1.20E-08	M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V
			F942	4.20E-08	L235K/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V
F943	4.00E-08	L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V
			F944	1.70E-07	T250V/M252Y/N434Y/Y436V
F945	1.70E-08	T250V/M252Y/V308P/N434Y/Y436V
			F946	4.30E-08	T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V
F947	1.10E-08	T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V
			F954	5.30E-07	M252Y/N434Y/H435K/Y436V
F957	7.70E-07	M252Y/N434Y/H435N/Y436V
			F960	8.00E-07	M252Y/N434Y/H435R/Y736V

表5-24是表5-23的续表。

[表5-24]

表5-25是表5-24的续表。

[表5-25]

表5-26是表5-25的续表。

[表5-26]

F1053	4.23E-08	L235R/S239K/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V
			F1058	1.31E-07	M252Y/Q386E/N434Y/Y436V
F1059	1.39E-07	M252Y/Q386R/N434Y/Y436V
			F1060	1.43E-07	M252Y/Q386S/N434Y/Y436V
F1061	1.19E-07	M252Y/P387E/N434Y/Y436V
			F1062	1.2E-07	M252Y/P387R/N434Y/Y436V
F1063	1.43E-07	M252Y/P387S/N434Y/Y436V
			F1064	1.32E-07	M252Y/V422E/N434Y/Y436V
F1065	1.38E-07	M252Y/V422R/N434Y/Y436V
			F1066	1.45E-07	M252Y/V422S/N434Y/Y436V
F1067	1.26E-07	M252Y/S424E/N434Y/Y436V
			F1068	1.69E-07	M252Y/S424R/N434Y/Y436V
F1069	1.39E-07	M252Y/N434Y/Y436V/Q438E
			F1070	1.73E-07	M252Y/N434Y/Y436V/Q438R
F1071	1.24E-07	M252Y/N434Y/Y436V/Q438S
			F1072	1.35E-07	M252Y/N434Y/Y436V/S440E
F1073	1.34E-07	M252Y/N434Y/Y436V/S440R
			F1074	1.32E-07	S239D/M252Y/N434Y/Y436V
F1075	1.4E-07	M252Y/K326D/L328Y/N434Y/Y436V
			F1076	1.27E-07	S239D/M252Y/K326D/L328Y/N434Y/Y436V
F1077	2.03E-06	K248N/M252Y/N434Y
			F1078	4.7E-07	M252Y/E380N/E382S/N434Y
F1079	3.44E-07	M252Y/E382N/N384S/N434Y
			F1080	3.19E-07	M252Y/S424N/N434Y
F1081	6.2E-07	M252Y/N434Y/Y436N/Q438T
			F1082	2.76E-07	M252Y/N434Y/Q438N
F1083	3.45E-07	M252Y/N434Y/S440N
			F1094	2.6E-07	M252Y/N434Y/S442N
F1095	2.86E-07	M252Y/S383N/G385S/N434Y
			F1096	2.72E-07	M252Y/Q386T/N434Y
F1097	2.82E-07	M252Y/G385N/P387S/N434Y
			F1098	2.58E-07	S239D/M252Y/N434Y
F1099	2.57E-07	M252Y/K326D/L328Y/N434Y
			F1100	2.41E-07	S239D/M252Y/K326D/L328Y/N434Y
F1101	6.59E-08	S239D/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y
			F1102	6.46E-08	M252Y/T307Q/Q311A/K326D/L328Y/N434Y
F1103	6.11E-08	S239D/M252Y/T307Q/Q311A/K326D/L328Y/N434Y
			F1104	1.77E-07	M252Y/V422E/S424R/N434Y/Y436V
F1105	1.54E-07	M252Y/V422S/S424R/N434Y/Y436V
			F1106	1.42E-07	M252Y/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
F1107	1.23E-07	M252Y/V422D/N434Y/Y436V

表5-27是表5-26的续表。

[表5-27]

表5-28是表5-27的续表。

[表5-28]

F1148	7.63E-08	L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Q438R/S440E
			F1151	2.51E-07	L235R/S239K/M252Y/S424N/N434Y
F1152	7.38E-08	L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/S424N/N434Y
			F1153	4.85E-08	L235R/S239K/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/S424N/N434Y/Y436V
F1154	1.34E-08	L235R/S239K/T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/S424N/N434Y/Y436V
			F1157	2.09E-07	M252Y/N434Y/Q438R/S440E
F1158	2.44E-07	L235R/S239K/M252Y/N434Y/Q438R/S440E
			F1159	4.79E-07	S424N/N434W
F1160	2.88E-07	V308F/S424N/N437Y
			F1161	1.07E-06	I332V/S424N/N434Y
F1162	3.43E-07	P238D/T250Y/M252Y/N434Y/Y436V
			F1163	1.54E-07	P238D/T250Y/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y
F1164	6.96E-08	P238D/T250Y/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V
			F1165	1.63E-08	P238D/T250Y/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V
F1174	4.9E-07	P257I/N434H
			F1176	1.98E-06	V308F
F1178	8.72E-07	V259I/V308F/M428L
			F1183	1.28E-06	E380A/M428L/N434S
F1184	1E-06	T307A/M428L/N434S
			F1185	9.17E-07	T307A/E380A/M428L/N434S
F1188	1.72E-06	T307A/E380A/N434H
			F1189	1.57E-07	M252Y/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
F1190	2.4E-07	M252Y/H433E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
			F1191	2.11E-07	M252Y/N434Y/Y436V/T437A/Q438R/S440E
F1192	1.27E-07	M252Y/N434Y/Y436V/T437G/Q438R/S440E
			F1194	1.55E-07	M252Y/N434Y/Y436V/Q438R/K439D/S440E
F1195	1.76E-07	M252Y/N434Y/Y436V/Q438R/S440E/L441A
			F1196	1.51E-07	M252Y/N434Y/Y436V/Q438R/S440E/L441E
F1197	9.46E-08	M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
			F1198	7.83E-08	M252Y/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
F1199	6.25E-08	M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
			F1200	1.26E-07	T250V/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
F1201	1.07E-07	T250V/M252Y/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
			F1202	8.81E-08	T250V/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
F1203	1.52E-07	M252Y/T256Q/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
			F1204	1.18E-07	M252Y/S254T/T256Q/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
F1205	1.98E-07	T250V/M252Y/T256Q/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
			F1206	1.69E-07	T250V/M252Y/S254T/T256Q/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
F1207	1.11E-06	I332E/M428L/N434S
			F1208	5.71E-07	L251A/M252Y/N434Y/Y436V
F1211	1.23E-06	L251H/M252Y/N434Y/Y436V

表5-29是表5-28的续表。

[表5-29]

F1213	6.33E-07	L251N/M252Y/N434Y/Y436V
			F1216	1.16E-06	L251S/M252Y/N434Y/Y436V
F1217	1.14E-06	l251T/M252Y/N434Y/Y436V
			F1218	2.51E-07	L251V/M252Y/N434Y/Y436V
F1229	2.81E-06	M252Y/I253V/N434Y/Y436V
			F1230	1.12E-07	M252Y/N434Y/Y436V/Q438R/S440D
F1231	9.73E-08	M252Y/N434Y/Y436V/Q438K/S440E
			F1232	9.79E-08	M252Y/N434Y/Y436V/Q438K/S440D
F1243	1.25E-07	L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
			F1244	1.02E-07	L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
F1245	8.2E-08	L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
			F1246	1.73E-07	L235R/S239K/T250V/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
F1247	1.45E-07	L235R/S239K/T250V/M252Y/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
			F1248	1.2E-07	L235R/S239K/T250V/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
F1249	2.06E-07	L235R/S239K/M252Y/T256Q/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
			F1250	1.66E-07	L235R/S239K/M252Y/S254T/T256Q/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
F1251	2.77E-07	L235R/S239K/T250V/M252Y/T256Q/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
			F1252	2.33E-07	L235R/S239K/T250V/M252Y/S254T/T256Q/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
F1253	1.12E-07	L235R/S239K/M252Y/T307A/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
			F1254	6.42E-08	L235R/S239K/M252Y/T307Q/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
F1255	1.11E-07	L235R/S239K/M252Y/Q311A/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
			F1256	1.56E-07	L235R/S239K/M252Y/Q311H/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
F1257	7.81E-08	L235R/S239K/M252Y/T307A/Q311A/N434Y/T436V/Q438R/S440E
			F1258	1.05E-07	L235R/S239K/M252Y/T307A/Q311H/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
F1259	4.46E-08	L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
			F1260	6.53E-08	L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311H/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
F1261	1.35E-07	L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438R/S440D
			F1262	1.26E-07	L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438K/S440E
F1263	1.24E-07	L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438K/S440D
			F1264	1.27E-07	L235R/S239K/M252Y/T256A/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
F1265	1.57E-07	L235R/S239K/M252Y/T256G/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
			F1266	9.99E-08	L235R/S239K/M252Y/T256N/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
F1267	1.5E-07	L235R/S239K/M252Y/S254A/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
			F1268	2E-07	L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
F1269	1.69E-07	L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440D
			F1270	1.18E-07	L235R/S239K/M252Y/S254A/N434Y/Y436V/Q438K/S440D
F1271	2.05E-07	L235R/S239K/M252Y/S254A/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
			F1272	1.71E-07	L235R/S239K/M252Y/S254A/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440D
F1273	1.53E-07	L235R/S239K/M252Y/T256Q/N434Y/Y436V/Q438K/S440D
			F1274	2.48E-07	L235R/S239K/M252Y/T256Q/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
F1275	2.09E-07	L235R/S239K/M252Y/T256Q/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440D

表5-30是表5-29的续表。

[表5-30]

F1276	1.02E-07	L235R/S239K/M252Y/T256A/N434Y/Y436V/Q438K/S440D
			F1277	1.69E-07	L235R/S239K/M252Y/T256A/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
F1278	1.4E-07	L235R/S239K/M252Y/T256A/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440D
			F1279	1.23E-07	L235R/S239K/M252Y/T256G/N434Y/Y436V/Q438K/S440D
F1280	2.09E-07	L235R/S239K/M252Y/T256G/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
			F1281	1.74E-07	L235R/S239K/M252Y/T256G/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440D
F1282	7.69E-08	L235R/S239K/M252Y/T256N/N434Y/Y436V/Q438K/S440D
			F1283	1.34E-07	L235R/S239K/M252Y/T256N/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
F1284	1.12E-07	L235R/S239K/M252Y/T256N/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440D
			F1285	9.36E-08	L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438K/S440D
F1286	1.57E-07	L235R/S239K/M252Y/S254T/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
			F1287	1.5E-07	L235R/S239K/M252Y/S254T/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440D
F1288	7.95E-08	L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436V/Q438K/S440D
			F1289	1.33E-07	L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
F1290	1.11E-07	L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440D
			F1291	1.51E-07	L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436V
F1292	4.24E-07	L235R/S239K/H433D/N434W/Y436V/Q438R/S440E
			F1293	1.61E-07	L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Q438R/S440E
F1294	2E-07	L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436T/Q438R/S440E
			D1295	9.84E-08	L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436F/Q438R/S440E
F1296	2.27E-07	L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Q438R/S440E
			F1297	2.5E-07	L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Y436T/Q438R/S440E
F1298	1.47E-07	L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Y436F/Q438R/S440E
			F1299	1.5E-07	L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Q438K/S440D
F1300	1.63E-07	L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436T/Q438K/S440D
			F1301	8.3E-08	L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436F/Q438K/S440D
F1302	2.15E-07	L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Q438K/S440D
			F1303	2.1E-07	L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Y436T/Q438K/S440D
F1304	1.24E-07	L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Y436F/Q438K/S440D
			F1305	2.05E-07	L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440D
F1306	1.92E-07	L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440E
			F1307	1.44E-07	L235R/S239K/M252Y/V422A/S424A/N434Y/Y436V
F1308	2.06E-07	L235R/S239K/M252Y/V422L/S424L/N434Y/V436V
			F1309	1.26E-07	L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438A/S440A
F1310	2.28E-07	L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438L/S440L
			F1311	1.69E-07	L235R/S239K/M252Y/V422A/S424A/H433D/N434Y/Y436V
F1312	1.79E-07	L235R/S239K/M252Y/V422L/S424L/H433D/N434Y/Y436V
			F1313	1.77E-07	L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436V/Q438A/S440A
F1314	2.27E-07	L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436V/Q438L/S440L
			F1315	1.52E-07	G237K/S239K/M252Y/N434Y/Y436V
F1316	1.49E-07	G237R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V

表5-31是表5-30的续表。

[表5-31]

F1317	1.38E-07	S239K/M252Y/P329K/N434Y/Y436V
			F1318	1.43E-07	S239K/M252Y/P329R/N434Y/Y436V
F1319	2.67E-07	M252Y/L328Y/N434Y
			F1320	1.22E-07	L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438R/S440D
F1321	1.03E-07	L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438K/S440E
			F1322	1.6E-07	L235R/S239K/M252Y/S254T/H433D/N434Y/Y436V/Q438R/S440D
F1323	1.49E-07	L235R/S239K/M252Y/S254T/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440E
			F1324	1.32E-07	L234A/L235A/M252Y/N434Y/Y436V
F1325	2.13E-07	L234A/L235A/M252Y/N297A/N434Y/Y436V
			F1326	1.09E-08	L234A/L235A/T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V
F1327	1.41E-08	L234A/L235A/T250V/M252Y/N297A/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V
			F1328	1.52E-07	L235R/G236R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
F1329	1.29E-07	L235R/G236R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
			F1330	1.03E-07	L235R/G236R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
F1331	7.75E-08	L235R/G236R/S239K/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436V/Q438R/S440E
			F1333	1.23E-07	L235R/G236R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V
F1334	1.04E-07	L235R/G236R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438K/S440D
			F1335	8.78E-08	L235R/G236R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438K/S440D
F1336	7.18E-08	L235R/G236R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436V/Q438K/S440D
			F1337	7.41E-08	L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436V/Q438K/S440E
F1338	1.04E-07	L235R/S239K/M252Y/T256E/H433D/N434Y/Y436V/Q438K/S440E
			F1339	2.51E-07	L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/H433D/N434Y/Y436T/Q438K/S440E
F1340	5.58E-08	L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436V/Q438K/S440E
			F1341	3.22E-07	L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436T/Q438K/S440E
F1342	2.51E-07	L235R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436T/Q438K/S440E
			F1343	2.01E-07	L235R/S239K/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436T/Q438K/S440E
F1344	3.96E-07	L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436T/Q438K/S440E
			F1345	1.05E-07	L235R/G236R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V/Q438K/S440E
F1346	8.59E-08	L235R/G236R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436V/Q438K/S440E
			F1347	7.14E-08	L235R/G236R/S239K/M252Y/T256E/N434Y/Y436V/Q438K/S440E
F1348	5.52E-08	L235R/G236R/S239K/M252Y/S254T/T256E/N434Y/Y436V/Q438K/S440E
			F1349	3.36E-07	L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436T/Q438R/S440E
F1350	1.18E-07	L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436F/Q438K/S440E
			F1351	1.62E-07	L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y435F/Q438R/S440E
F1352	3.93E-07	L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436T/Q438K/S440E
			F1353	4.33E-07	L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436T/Q438R/S440E
F1354	2.29E-07	L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436F/Q438K/S440E
			F1355	2.47E-07	L235R/S239K/M252Y/H433D/N434Y/Y436F/Q438R/S440E
F1356	1.58E-07	G236R/M252Y/L328R/N434Y/Y436V
			F1357	2.81E-07	L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436T/Q438R/S440E
F1358	9.07E-08	L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436F/Q438K/S440E

表5-32是表5-31的续表。

[表5-32]

表5-33是表5-32的续表。

[表5-33]

Fcγ受体

Fcγ受体(也记作FcγR)是指可与IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体Fc区结合的受体，实质上指Fcγ受体基因编码的蛋白家族的任意成员。对于人，该家族包括：包括同工型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)；包括同工型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131。即FcγRIIa(H)和FcγRIIa(R))、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc的FcγRII(CD32)；以及包括同工型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158。即FcγRIIIa(V)和FcγRIIIa(F))和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)，以及任何未发现的人FcγR类或FcγR同工型或同种异型，但并不限于这些。FcγR包括人、小鼠、大鼠、兔和猴来源的FcγR，但并不限于这些，可以是任何生物来源。小鼠FcγR类包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(FcγRIV、CD16-2)以及任何未发现的小鼠FcγR类或FcγR同工型或同种异型，但不限于这些。作为这样的Fcγ受体的优选实例，可以列举人FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、FcγRIIb(CD32)、FcγRIIIa(CD16)和/或FcγRIIIb(CD16)。人FcγRI的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQIDNO:19(NM_000566.3)和20(NP_000557.1)，人FcγRIIa(同种异型H131)的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO:21(BC020823.1)和22(AAH20823.1)(同种异型R131是SEQ ID NO:22的第166位氨基酸被取代成Arg而得的序列)，FcγRIIb的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO:23(BC146678.1)和24(AAI46679.1)，FcγRIIIa的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO:25(BC033678.1)和26(AAH33678.1)，以及FcγRIIIb的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO:27(BC128562.1)和28(AAI28563.1)(括号内是RefSeq登录号)。例如，象使用同种异型V158时记作FcγRIIIaV那样，只要没有特别表记，则使用同种异型F158，但本申请中记载的同工型FcγRIIIa的同种异型可以解释为没有特别限定。

对于包括FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)以及包括同工型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)，与IgG的Fc部分结合的α链和具有向细胞内传递活化信号的ITAM的共有γ链缔合。另一方面，包括同工型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)和FcγRIIc的FcγRII(CD32)自身的胞质结构域中不包含ITAM。这些受体在巨噬细胞或肥大细胞、抗原提呈细胞等众多免疫细胞上表达。这些受体通过与IgG的Fc部分结合而传递的活化信号促进巨噬细胞的吞噬能力或炎症性细胞因子的产生、肥大细胞的脱粒、抗原提呈细胞的功能亢进。上述具有传递活化信号的能力的Fcγ受体在本发明中也称为活化型Fcγ受体。

另一方面，FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)自身的胞质结构域包含传递抑制型信号的ITIM。B细胞中，通过FcγRIIb与B细胞受体(BCR)的交联抑制来自BCR的活化信号，结果抑制了BCR的抗体产生。巨噬细胞中，通过FcγRIII与FcγRIIb的交联抑制吞噬能力或炎症性细胞因子的产生能力。如上所述具有传递抑制信号的能力的Fcγ受体在本发明中也称为抑制型Fcγ受体。

Fc区对FcγR的结合活性

如上所述，作为本发明的抗原结合分子所含的Fc区，可以列举具有Fcγ受体结合活性的Fc区。作为这种Fc区的一个非限定性方案，例示以人IgG1(SEQ ID NO:13)、IgG2(SEQ ID NO:14)、IgG3(SEQ IDNO:15)或IgG4(SEQ ID NO:16)表示的Fc区。Fcγ受体对IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体的Fc区是否具有结合活性，除了上述记载的FACS或ELISA形式之外，还可通过ALPHA筛选(增强的发光接近均质测定，Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)或利用表面等离子体共振(SPR)现象的BIACORE法等来确认(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010)。

ALPHA筛选是通过使用供体和受体两种珠的ALPHA技术基于下述原理实施。仅在与供体珠结合的分子和与受体珠结合的分子发生生物学相互作用，两种珠接近的状态时，检测到发光信号。由激光激发的供体珠内的光敏剂将周围的氧转变成激发态的单重态氧。单重态氧扩散到供体珠周围，一旦到达接近的受体珠，则引起珠内的化学发光反应，最终发光。在与供体珠结合的分子和与受体珠结合的分子不发生相互作用时，供体珠产生的单重态氧不到达受体珠，因此不发生化学发光反应。

例如，包含生物素标记的Fc区的抗原结合分子与供体珠结合，带谷胱甘肽S转移酶(GST)标签的Fcγ受体与受体珠结合。在竞争的包含Fc区改变体的抗原结合分子的不存在下，具有野生型Fc区的多肽缔合体与Fcγ受体发生相互作用，产生520-620nm的信号。包含不带标签的Fc区改变体的抗原结合分子与具有天然型Fc区的抗原结合分子竞争与Fcγ受体间的相互作用。通过定量竞争的结果所表现出的荧光减少可确定相对结合亲和性。使用Sulfo-NHS-生物素等将抗体等抗原结合分子生物素化是公知的。作为使Fcγ受体带有GST标签的方法，可适当采用将编码Fcγ受体的多核苷酸与编码GST的多核苷酸在保持于有效连接有框内融合而成的融合基因的载体的细胞等中表达，并利用谷胱甘肽柱纯化的方法等。所得信号通过例如使用GRAPHPAD PRISM(GraphPad公司、San Diego)等软件拟合于利用非线性回归分析的单位点竞争(one-site competition)模型来适当地分析。

将观察相互作用的物质的一方(配体)固定在传感器芯片的金薄膜上，从传感器芯片的背面照射光使得在金薄膜与玻璃的界面发生全反射时，在一部分反射光中形成反射强度降低的部分(SPR信号)。将观察相互作用的物质的另一方(分析物)流过传感器芯片表面使配体与分析物结合，则固定的配体分子的质量增加，传感器芯片表面的溶剂折射率发生变化。根据该折射率的变化，SPR信号的位置发生移位(反之，若结合解离，则信号的位置恢复)。Biacore系统将上述移位的量即传感器芯片表面的质量变化作为纵轴，将质量的时间变化以测定数据的形式表示(传感图)。由传感图的曲线求出动力学：结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)，由该常数之比求出亲和性(KD)。在BIACORE法中也优选使用抑制测定法。抑制测定法的实例记载于Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010。

作为本发明所含的Fc区，除了以人IgG1(SEQ ID NO:13)、IgG2(SEQ ID NO:14)、IgG3(SEQ ID NO:15)或IgG4(SEQ ID NO:16)表示的Fc区之外，还可以适当使用Fcγ受体结合活性比天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性高的FcγR结合改变Fc区。在本说明书中，“天然型人IgG的Fc区”是指，与SEQ ID NO:13、14、15、或16中例示的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区的EU编号297位结合的糖链为含岩藻糖的糖链的Fc区。这种FcγR结合改变Fc区可通过改变天然型人IgG的Fc区的氨基酸来制作。FcγR结合改变Fc区的FcγR结合活性是否比天然型人IgG的Fc区的FcγR结合活性高，这可以采用上述结合活性项中记载的方法来适当实施。

本发明中，Fc区的“氨基酸的改变”或“氨基酸改变”包括改变成与起始Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。只要起始Fc区的修饰改变体可以在pH中性范围与人Fcγ受体结合，则可使用任何Fc区作为起始Fc区。此外，将已进行了改变的Fc区作为起始Fc区并进一步进行了改变而得到的Fc区也可优选用作本发明的Fc区。起始Fc区可指多肽自身、含有起始Fc区的组合物或编码起始Fc区的氨基酸序列。起始Fc区可包括抗体项目中概述的通过重组产生的公知的Fc区。对起始Fc区的来源没有限定，可由非人动物的任意生物或人获得。优选地，作为任意生物，可优选列举选自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猫、兔、狗、山羊、绵羊、牛、马、骆驼和非人灵长类的生物。在其他方案中，起始Fc区还可由食蟹猴、狨猴、恒河猴、黑猩猩或人获得。优选起始Fc区可由人IgG1获得，但不限于IgG的特定类别。这是指可适当使用人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区作为起始Fc区。同样，在本说明书中，是指可以将来自上述任意生物的IgG的任意类或亚类的Fc区优选用作起始Fc区。天然存在的IgG变体或被操作的类型的实例记载于公知文献(Curr.Opin.Biotechnol.(2009)20(6),685-91；Curr.Opin.Immunol.(2008)20(4),460-470；Protein Eng.Des.Sel.(2010)23(4),195-202；国际公开WO2009/086320、WO2008/092117、WO2007/041635和WO2006/105338)，但不限于此。

作为改变的实例，包括一个以上的变异，例如取代成与起始Fc区的氨基酸不同的氨基酸残基的变异、或者向起始Fc区的氨基酸中插入一个以上的氨基酸残基或从起始Fc区的氨基酸中缺失一个以上的氨基酸等。优选改变后的Fc区氨基酸序列包含含有非天然存在的Fc区的至少一部分的氨基酸序列。这种变体与起始Fc区必然具有不足100％的序列同源性或相似性。在优选实施方案中，变体具有与起始Fc区的氨基酸序列约75％～不足100％的氨基酸序列同源性或相似性，更优选约80％～不足100％、更优选约85％～不足100％、更优选约90％～不足100％、最优选约95％～不足100％的同源性或相似性的氨基酸序列。本发明的一个非限定性方案中，起始Fc区与本发明的FcγR结合改变Fc区之间存在至少一个氨基酸的差异。起始Fc区与本发明的FcγR结合改变Fc区的氨基酸的不同可优选通过特别是上述的以EU编号特定的氨基酸残基位置的特定氨基酸的不同来规定。

为了改变Fc区的氨基酸，可适当采用位点特异性诱变法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或重叠延伸PCR等公知方法。此外，作为取代成天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸改变方法，也可采用多种公知方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。例如，还优选使用包含非天然氨基酸与终止密码子之一的UAG密码子(琥珀密码子)的互补性琥珀抑制基因tRNA连接的tRNA的无细胞翻译系统(Clover Direct(Protein Express))等。

本发明的抗原结合分子所含的、Fcγ受体结合活性高于天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性的FcγR结合改变Fc区(FcγR结合改变Fc区)可通过任意方法获得，具体而言，通过改变被用作起始Fc区的人IgG型免疫球蛋白的氨基酸来获得该FcγR结合改变Fc区。作为用于改变的优选IgG型免疫球蛋白的Fc区，例如可以列举SEQ IDNO:13、14、15或16中例示的人IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4以及它们的改变体)的Fc区。

关于向其他氨基酸的改变，只要Fcγ受体结合活性高于天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性，则任何位置的氨基酸均可改变。在抗原结合分子包含人IgG1的Fc区作为人Fc区的情况下，优选包含带来Fcγ受体结合活性高于与EU编号297位结合的糖链为含岩藻糖的糖链的天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性的效果的改变。作为这种氨基酸的改变，例如在国际公开WO2007/024249、WO2007/021841、WO2006/031370、WO2000/042072、WO2004/029207、WO2004/099249、WO2006/105338、WO2007/041635、WO2008/092117、WO2005/070963、WO2006/020114、WO2006/116260和WO2006/023403等中有报道。

作为可进行这种改变的氨基酸，例如可以列举选自以EU编号表示的221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位和440位的至少一个以上的氨基酸。通过这些氨基酸的改变，可以获得Fcγ受体结合活性高于天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性的Fc区(FcγR结合改变Fc区)。

为了在本发明中使用，作为特别优选的改变，例如可以列举Fc区的以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸的改变：

221位氨基酸为Lys或Tyr中的任一个；

222位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

223位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个；

224位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

225位氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个；

227位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

228位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

230位氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个；

231位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

232位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

240位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

241位氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

243位氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

244位氨基酸为His；

245位氨基酸为Ala；

246位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

249位氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个；

250位氨基酸为Glu或Gln中的任一个；

251位氨基酸为Phe；

254位氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个；

255位氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个；

256位氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个；

258位氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个；

260位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

262位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个；

263位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

266位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

273位氨基酸为Phe或Ile中的任一个；

275位氨基酸为Leu或Trp中的任一个；

279位氨基酸为Ala；

281位氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

282位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

284位氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一个；

285位氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中的任一个；

286位氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一个；

288位氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一个；

291位氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中的任一个；

292位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一个；

301位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

302位氨基酸为Ile；

303位氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一个；

304位氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一个；

305位氨基酸为Glu、Ile、Thr或Tyr中的任一个；

311位氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一个；

313位氨基酸为Phe；

315位氨基酸为Leu；

317位氨基酸为Glu或Gln；

323位氨基酸为Ile；

334位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中的任一个；

336位氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一个；

337位氨基酸为Glu、His或Asn中的任一个；

376位氨基酸为Ala或Val中的任一个；

377位氨基酸为Gly或Lys中的任一个；

378位氨基酸为Asp；

379位氨基酸为Asn；

380位氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一个；

382位氨基酸为Ala或Ile中的任一个；

385位氨基酸为Glu；

392位氨基酸为Thr；

396位氨基酸为Leu；

421位氨基酸为Lys；

427位氨基酸为Asn；

428位氨基酸为Phe或Leu中的任一个；

429位氨基酸为Met；

434位氨基酸为Trp；

436位氨基酸为Ile；或者

440位氨基酸为Gly、His、Ile、Leu或Tyr中的任一个。另外，对改变的氨基酸的数量没有特别限定，可以只改变一处的氨基酸，也可以改变两处以上的氨基酸。作为两处以上的氨基酸改变的组合，例如可以列举如表6(表6-1～表6-3)中记载的组合。

[表6-1]

氨基酸的组合	氨基酸的组合
		K370E/P396L/D270E	S239Q/I332Q
Q419H/P396L/D270E	S267D/I332E
		V240A/P396L/D270E	S267E/I332E
R255L/P396L/D270E	S267L/A327S
		R255L/P396L/D270E	S267Q/A327S
R255L/P396L/D270E/R292G	S298A/I332E
		R255L/P396L/D270E	S304T/I332E
R255L/P396L/D270E/Y300L	S324G/I332D
		F243L/D270E/K392N/P396L	S324G/I332E
F243L/R255L/D270E/P396L	S324I/I332D
		F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L	S324I/I332E
F243L/R292P/Y300L/P396L	T260H/I332E
		F243L/R292P/Y300L	T335D/I332E
F243L/R292P/P396L	V240I/V266I
		F243L/R292P/V305I	V264I/I332E
F243L/R292P	D265F/N297E/I332E
		S298A/E333A/K334A	D265Y/N297D/I332E
E380A/T307A	F243L/V262I/V264W
		K326M/E333S	N297D/A330Y/I332E
K326A/E333A	N297D/T299E/I332E
		S317A/K353A	N297D/T299F/I332E
A327D/I332E	N297D/T299H/I332E
		A330L/I332E	N297D/T299I/I332E
A330Y/I332E	N297D/T299L/I332E
		E258H/I332E	N297D/T299V/I332E
E272H/I332E	P230A/E233D/I332E
		E272I/N276D	P244H/P245A/P247V
E272R/I332E	S239D/A330L/I332E
		E283H/I332E	S239D/A330Y/I332E
E293R/I332E	S239D/H268E/A330Y
		F241L/V262I	S239D/I332E/A327A
F241W/F243W	S239D/I332E/A330I

表6-2是表6-1的续表。

[表6—2]

F243L/V264I	S239D/N297D/I332E
		H268D/A330Y	S239D/S298A/I332E
H268E/A330Y	S239D/V264I/I332E
		K246H/I332E	S239E/N297D/I332E
L234D/I332E	S239E/V264I/I332E
		L234E/I332E	S239N/A330L/I332E
L234G/I332E	S239N/A330Y/I332E
		L234I/I332E	S239N/S298A/I332E
L234I/L235D	S239Q/V264I/I332E
		L234Y/I332E	V264E/N297D/I332E
L235D/I332E	V264I/A330L/I332E
		L235E/I332E	V264I/A330Y/I332E
L235I/I332E	V264I/S298A/I332E
		L235S/I332E	Y296D/N297D/I332E
L328A/I332D	Y296E/N297D/I332E
		L328D/I332D	Y296H/N297D/I332E
L328D/I332E	Y296N/N297D/I332E
		L328E/I332D	Y296Q/N297D/I332E
L328E/I332E	Y296T/N297D/I332E
		L328F/I332D	D265Y/N297D/T299L/I332E
L328F/I332E	F241E/F243Q/V262T/V264E
		L328H/I332E	F241E/F243R/V262E/V264R
L328I/I332D	F241E/F243Y/V262T/V264R
		L328I/I332E	F241L/F243L/V262I/V264I
L328M/I332D	F241R/F243Q/V262T/V264R
		L328M/I332E	F241S/F243H/V262T/V264T
L328N/I332D	F241W/F243W/V262A/V264A
		L328N/I332E	F241Y/F243Y/V262T/V264T
L328Q/I332D	I332E/A330Y/H268E/A327A
		L328Q/I332E	N297D/I332E/S239D/A330L
L328T/I332D	N297D/S298A/A330Y/I332E
		L328T/I332E	S239D/A330Y/I332E/K326E
L328V/I332D	S239D/A330Y/I332E/K326T
		L328V/I332E	S239D/A330Y/I332E/L234I
L328Y/I332D	S239D/A330Y/I332E/L235D

表6-3是表6-2的续表。

[表6-3]

L328Y/I332E	S239D/A330Y/I332E/V240I
		N297D/I332E	S239D/A330Y/I332E/V264T
N297E/I332E	S239D/A330Y/I332E/V266I
		N297S/I332E	S239D/D265F/N297D/I332E
P227G/I332E	S239D/D265H/N297D/I332E
		P230A/E233D	S239D/D265I/N297D/I332E
Q295E/I332E	S239D/D265L/N297D/I332E
		R255Y/I332E	S239D/D265T/N297D//I332E
S239D/I332D	S239D/D265V/N297D/I332E
		S239D/I332E	S239D/D265Y/N297D/I332E
S239D/I332N	S239D/I332E/A330Y/A327A
		S239D/I332Q	S239D/I332E/H268E/A327A
S239E/D265G	S239D/I332E/H268E/A330Y
		S239E/D265N	S239D/N297D/I332E/A330Y
S239E/D265Q	S239D/N297D/I332E/K326E
		S239E/I332D	S239D/N297D/I332E/L235D
S239E/I332E	S239D/V264I/A330L/I332E
		S239E/I332N	S239D/V264I/S298A/I332E
S239E/I332Q	S239E/V264I/A330Y/I332E
		S239N/I332D	F241E/F243Q/V262T/V264E/I332E
S239N/I332E	F241E/F243R/V262E/V264R/I332E
		S239N/I332N	F241E/F243Y/V262T/V264R/I332E
S239N/I332Q	F241R/F243Q/V262T/V264R/I332E
		S239Q/I332D	S239D/I332E/H268E/A330Y/A327A
S239Q/I332E	S239E/V264I/S298A/A330Y/I332E
		S239Q/I332N	F241Y/F243Y/V262T/V264T/N297D/I332E
S267E/L328F	G236D/S267E
		S239D/S267E

测定本发明的抗原结合分子所含的Fc区与Fcγ受体的结合活性的pH条件可以适当采用pH酸性范围或pH中性范围的条件。作为测定本发明的抗原结合分子所含的Fc区与Fcγ受体的结合活性的条件的pH中性范围，通常指pH6.7～pH10.0。优选为由pH7.0～pH8.0的任意pH值表示的范围，优选从pH7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9和8.0中选择，特别优选为与生物体内的血浆中(血中)pH接近的pH7.4。本发明中，作为具有本发明的抗原结合分子所含的Fc区与Fcγ受体的结合活性的条件的pH酸性范围，通常指pH4.0～pH6.5。优选意指pH5.5～pH6.5，特别优选意指与生物体内的早期核内体内的pH接近的pH5.8～pH6.0。作为在测定条件中使用的温度，Fc区与Fcγ受体的结合亲和性可在10℃～50℃的任意温度下进行评价。为了确定Fc区与Fcγ受体的结合亲和性，优选使用15℃～40℃的温度。更优选诸如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34和35℃中任一者的20℃～35℃的任意温度也同样用于确定Fc区与Fcγ受体的结合亲和力。25℃的温度是本发明方案的一个非限定性实例。

本说明书中，FcγR结合改变Fc区的Fcγ受体结合活性高于天然型Fc区的Fcγ受体结合活性是指，FcγR结合改变Fc区对FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb的任一种人Fcγ受体的结合活性高于天然型Fc区对这些人Fcγ受体的结合活性。例如，根据上述的分析方法，与作为对照的包含人IgG的天然型Fc区的抗原结合分子的结合活性相比，包含FcγR结合改变Fc区的抗原结合分子的结合活性显示出105％以上、优选110％以上、115％以上、120％以上、125％以上、特别优选130％以上、135％以上、140％以上、145％以上、150％以上、155％以上、160％以上、165％以上、170％以上、175％以上、180％以上、185％以上、190％以上、195％以上、2倍以上、2.5倍以上、3倍以上、3.5倍以上、4倍以上、4.5倍以上、5倍以上、7.5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、100倍以上的结合活性。作为天然型Fc区，既可以使用起始Fc区，也可以使用相同亚类的抗体的天然型Fc区。

本发明中，作为对照的人IgG的天然型Fc区，优选使用与以EU编号表示的297位氨基酸结合的糖链为含岩藻糖的糖链的天然型人IgG的Fc区。与以EU编号表示的297位氨基酸结合的糖链是否是含岩藻糖的糖链，这可以采用非专利文献6中记载的方法。例如，通过如下所述的方法，可以判定与天然型人IgG的Fc区结合的糖链是否是含岩藻糖的糖链。通过使N-糖苷酶F(Roche diagnostics)与被测天然型人IgG反应，糖链从被测天然型人IgG中游离出来(Weitzhandler等人(J.Pharma.Sciences(1994)83,12,1670-1675)。接下来，将与乙醇反应而除去了蛋白的反应液(Schenk等人(J.Clin.Investigation(2001)108(11)1687-1695)的浓缩干固物用2-氨基吡啶或2-氨基苯甲酰胺进行荧光标记(Bigge等人(Anal.Biochem.(1995)230(2)229-238)。将经过使用纤维素过滤筒的固相提取进行了脱试剂的、荧光标记的2-AP或2-AB化糖链通过正相层析进行分析。通过观察所检测的色谱图的峰，可以判定与人IgG的天然型Fc区结合的糖链是否是含岩藻糖的糖链。

作为对照的包含相同亚类的天然型抗体Fc区的抗原结合分子，可以适当使用具有IgG单克隆抗体Fc区的抗原结合分子。该Fc区的结构记载在SEQ ID NO:13(RefSeq注册号AAC82527.1的N末端添加有A)、14(RefSeq注册号AAB59393.1的N末端添加有A)、15(RefSeq注册号CAA27268.1)和16(RefSeq注册号AAB59394.1的N末端添加有A)中。另外，使用包含某特定同种型的抗体Fc区的抗原结合分子作为被测物质时，通过使用具有该特定同种型的IgG单克隆抗体Fc区的抗原结合分子作为对照，来验证包含被测Fc区的抗原结合分子的Fcγ受体结合活性的效果。如上操作，适当选择包含已被证实Fcγ受体结合活性高的Fc区的抗原结合分子。

具有选择性的Fcγ受体结合活性的Fc区

作为本发明中优选使用的Fc区的例子，还优选列举：具有对特定Fcγ受体的结合活性高于对其他Fcγ受体的结合活性的性质的Fc区(具有选择性的Fcγ受体结合活性的Fc区)。使用抗体作为抗原结合分子时，一分子的抗体只能与一分子的Fcγ受体结合，所以一分子的抗原结合分子在与抑制型Fcγ受体结合的状态下无法与其他活性型FcγR结合，在与活性型Fcγ受体结合的状态下也无法与其他的活性型Fcγ受体或抑制型Fcγ受体结合。

如上所述，作为活性型Fcγ受体，优选列举包含FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)以及包含同工型FcγRIIIa(包含同种异型V158或F158)和FcγRIIIb(包含同种异型FcγRIIIb-NA1或FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)、以及FcγRIIa(包含同种异型H131或R131)。另外，作为抑制型Fcγ受体的优选例，可以列举FcγRIIb(包含FcγRIIb-1或FcγRIIb-2)。

本发明的抗原结合分子所含的含有选择性FcγR结合结构域的Fc区和包含该Fc区的抗原结合分子还可以是：与以人IgG1(SEQ ID NO:13)、IgG2(SEQ ID NO:14)、IgG3(SEQ ID NO:15)或IgG4(SEQ ID NO:16)表示的Fc区(以下，统称为野生型Fc区)和包含该野生型Fc区的抗原结合分子相比，对活性型FcγR(包含FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、同种异型V158的FcγRIIIa、包含同种异型F158的FcγRIIIa、包含同种异型FcγRIIIb-NA1的FcγRIIIb、包含同种异型FcγRIIIb-NA2的FcγRIIIb、包含同种异型H131的FcγRIIa、包含同种异型R131的FcγRIIa、和/或FcγRIIc)的结合活性也得以维持或减少的Fc区和包含该Fc区的抗原结合分子。

与野生型Fc区和包含野生型Fc区的抗原结合分子相比，本发明的抗原结合分子所含的含有选择性FcγR结合结构域的Fc区和包含该Fc区的抗原结合分子对上述活性型FcγR的结合活性减少的程度例如可以列举：99％以下、98％以下、97％以下、96％以下、95％以下、94％以下、93％以下、92％以下、91％以下、90％以下、88％以下、86％以下、84％以下、82％以下、80％以下、78％以下、76％以下、74％以下、72％以下、70％以下、68％以下、66％以下、64％以下、62％以下、60％以下、58％以下、56％以下、54％以下、52％以下、50％以下、45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下、0.5％以下、0.4％以下、0.3％以下、0.2％以下、0.1％以下、0.05％以下、0.01％以下、0.005％以下。

本发明的抗原结合分子所含的含有选择性FcγR结合结构域的Fc区和包含该Fc区的抗原结合分子还可以是：与以人IgG1(SEQ ID NO:13)、IgG2(SEQ ID NO:14)、IgG3(SEQ ID NO:15)或IgG4(SEQ ID NO:16)表示的Fc区(以下，统称为野生型Fc区)和包含该野生型Fc区的抗原结合分子相比，对抑制型FcγR(FcγRIIb-1和/或FcγRIIb-2)的结合活性也得到增强的Fc区和包含该Fc区的抗原结合分子。

与野生型Fc区和包含野生型Fc区的抗原结合分子相比，本发明的抗原结合分子所含的含有选择性FcγR结合结构域的Fc区和包含该Fc区的抗原结合分子对上述抑制型FcγR的结合活性增强的程度例如可以列举：101％以上、102％以上、103％以上、104％以上、105％以上、106％以上、107％以上、108％以上、109％以上、110％以上、112％以上、114％以上、116％以上、118％以上、120％以上、122％以上、124％以上、126％以上、128％以上、130％以上、132％以上、134％以上、136％以上、138％以上、140％以上、142％以上、144％以上、146％以上、148％以上、150％以上、155％以上、160％以上、165％以上、170％以上、175％以上、180％以上、185％以上、190％以上、195％以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、100倍以上、200倍以上、300倍以上、400倍以上、500倍以上、600倍以上、700倍以上、800倍以上、900倍以上、1000倍以上、10000倍以上、100000倍。

另外，本发明的抗原结合分子所含的含有选择性FcγR结合结构域的Fc区和包含该Fc区的抗原结合分子还可以是：与以人IgG1(SEQID NO:13)、IgG2(SEQ ID NO:14)、IgG3(SEQ ID NO:15)或IgG4(SEQID NO:16)表示的Fc区(以下，统称为野生型Fc区)和包含该野生型Fc区的抗原结合分子相比对活性型FcγR(包含FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、同种异型V158的FcγRIIIa、包含同种异型F158的FcγRIIIa、包含同种异型FcγRIIIb-NA1的FcγRIIIb、包含同种异型FcγRIIIb-NA2的FcγRIIIb、包含同种异型H131的FcγRIIa、包含同种异型R131的FcγRIIa和/或FcγRIIc)的结合活性也得以维持或减少、且与以人IgG1(SEQ ID NO:13)、IgG2(SEQ ID NO:14)、IgG3(SEQ ID NO:15)或IgG4(SEQ ID NO:16)表示的Fc区(以下，统称为野生型Fc区)和包含该野生型Fc区的抗原结合分子相比对抑制型FcγR(FcγRIIb-1和/或FcγRIIb-2)的结合活性增强的Fc区和包含该Fc区的抗原结合分子。

另外，本发明的抗原结合分子所含的含有选择性FcγR结合结构域的Fc区和包含该Fc区的抗原结合分子还可以是：与以人IgG1(SEQID NO:13)、IgG2(SEQ ID NO:14)、IgG3(SEQ ID NO:15)或IgG4(SEQID NO:16)表示的Fc区(以下，统称为野生型Fc区)和包含该野生型Fc区的抗原结合分子相比，对抑制型Fcγ受体(FcγRIIb-1和/或FcγRIIb-2)的结合活性的增强程度高于对活性型Fcγ受体(包含FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、同种异型V158的FcγRIIIa、包含同种异型F158的FcγRIIIa、包含同种异型FcγRIIIb-NA1的FcγRIIIb、包含同种异型FcγRIIIb-NA2的FcγRIIIb、包含同种异型H131的FcγRIIa、包含同种异型R131的FcγRIIa)的结合活性的增强程度的Fc区和包含该Fc区的抗原结合分子。

本发明根据上述氨基酸的改变项中说明的方案等，对于以EU编号表示的238位氨基酸为Asp的Fc区或以EU编号表示的328位氨基酸为Glu的Fc区，可以进一步进行针对其他的至少一个Fc区的改变。另外，除了这些改变之外，还可以包含附加的改变。附加的改变例如可以是氨基酸的取代、缺失或修饰中的任一种、或者从它们的组合中选择。例如，可以进行增强对FcγRIIb的结合活性、且维持或降低对FcγRIIa(H型)和FcγRIIa(R型)的结合活性的改变。通过进行这样的改变，与FcγRIIa相比对FcγRIIb的结合选择性提高。

另外，本发明的多肽对各种FcγR的结合活性是否维持、增强或减少，这还可以根据按照上述例子求出的各种FcγR与本发明多肽的结合量的增减来判断。这里，各种FcγR与多肽的结合量是指，用使作为分析物的各种FcγR与各多肽进行相互作用前后发生变化的传感图中的RU值之差除以将多肽捕捉到传感器芯片上前后发生变化的传感图中的RU值之差而得到的值。

本发明的多肽是否是对FcγRIIa(R型、H型)的结合活性得以维持或减少、并且对FcγRIIb的结合活性增强的多肽，这可以通过使用按照上述例子求出的该多肽与FcγRIIa的结合量和该多肽与FcγRIIb的结合量来进行判断。

例如是以下情形：本发明的多肽与FcγRIIb的结合量与亲本多肽与FcγRIIb的结合量相比增加、且本发明的多肽与FcγRIIa(R型、H型)的结合量与亲本多肽与FcγRIIa(R型、H型)的结合量同等(维持)、或者优选减少。另外，还可以将按照上述例子求出的该多肽与FcγRIa的结合量、该多肽与FcγRIIIa的结合量适当组合来进行判断。

在本发明的一个非限定性方案中，作为对抑制型Fcγ受体的结合活性高于对活性型Fcγ受体的结合活性(具有对抑制型Fcγ受体的选择性结合活性)的Fc区的例子，除了US2009/0136485或WO2012/115241中列举的Fc区之外，还优选列举上述Fc区的氨基酸中以EU编号表示的238位或328位氨基酸被改变成不同于天然型Fc区的氨基酸的Fc区。

另外，在本发明的一个非限定性方案中，作为对抑制型Fcγ受体的结合活性高于对活性型Fcγ受体的结合活性(具有对抑制型Fcγ受体的选择性结合活性)的Fc区的例子，优选列举上述Fc区的以EU编号表示的氨基酸被改变成以下的任意一个以上的Fc区：238位氨基酸为Asp、或328位氨基酸为Glu。另外，作为具有对抑制型Fcγ受体的选择性结合活性的Fc区，还可以适当选择US2009/0136485或WO2012/115241中记载的Fc区或改变。

另外，在本发明的一个非限定性方案中，优选列举上述Fc区的以EU编号表示的氨基酸被改变成以下的任意一个以上的Fc区：238位氨基酸为Asp、或328位氨基酸为Glu。

进而，在本发明的一个非限定性方案中，优选列举被改变成以下的任意一个以上的Fc区：以EU编号表示的238位的Pro取代成Asp、和以EU编号表示的237位氨基酸为Trp、以EU编号表示的237位氨基酸为Phe、以EU编号表示的267位氨基酸为Val、以EU编号表示的267位氨基酸为Gln、以EU编号表示的268位氨基酸为Asn、以EU编号表示的271位氨基酸为Gly、以EU编号表示的326位氨基酸为Leu、以EU编号表示的326位氨基酸为Gln、以EU编号表示的326位氨基酸为Glu、以EU编号表示的326位氨基酸为Met、以EU编号表示的239位氨基酸为Asp、以EU编号表示的267位氨基酸为Ala、以EU编号表示的234位氨基酸为Trp、以EU编号表示的234位氨基酸为Tyr、以EU编号表示的237位氨基酸为Ala、以EU编号表示的237位氨基酸为Asp、以EU编号表示的237位氨基酸为Glu、以EU编号表示的237位氨基酸为Leu、以EU编号表示的237位氨基酸为Met、以EU编号表示的237位氨基酸为Tyr、以EU编号表示的330位氨基酸为Lys、以EU编号表示的330位氨基酸为Arg、以EU编号表示的233位氨基酸为Asp、以EU编号表示的268位氨基酸为Asp、以EU编号表示的268位氨基酸为Glu、以EU编号表示的326位氨基酸为Asp、以EU编号表示的326位氨基酸为Ser、以EU编号表示的326位氨基酸为Thr、以EU编号表示的323位氨基酸为Ile、以EU编号表示的323位氨基酸为Leu、以EU编号表示的323位氨基酸为Met、以EU编号表示的296位氨基酸为Asp、以EU编号表示的326位氨基酸为Ala、以EU编号表示的326位氨基酸为Asn、以EU编号表示的330位氨基酸为Met。

抗原结合分子

本发明中，抗原结合分子以表示包含抗原结合结构域和Fc区的分子的最广泛的含义使用，具体而言，只要它们显示出抗原结合活性，则包括各种分子类型。例如，作为抗原结合结构域与Fc区结合的分子的实例，可列举抗体。抗体可包括单一的单克隆抗体(包括激动抗体和拮抗抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体等。另外作为抗体片段使用的情况，可以优选列举抗原结合结构域和抗原结合片段(例如，Fab、F(ab’)2、scFv和Fv)。现有的稳定的α/β桶蛋白结构等立体结构作为支架(scaffold，基础)使用、仅其一部分结构为了构建抗原结合结构域而文库化的支架分子也包括在本发明的抗原结合分子中。

本发明的抗原结合分子可包含介导FcRn结合和Fcγ受体结合的Fc区的至少一部分。例如，在一个非限定性方案中，抗原结合分子可以是抗体或Fc融合蛋白。融合蛋白是指包含含有第一氨基酸序列的多肽的嵌合多肽，该含有第一氨基酸序列的多肽与在天然情况下不会自然连接的具有第二氨基酸序列的多肽连接。例如，融合蛋白可以包括非免疫球蛋白多肽，所述非免疫球蛋白多肽包含：由Fc区的至少一部分(例如，赋予FcRn结合的Fc区部分或赋予Fcγ受体结合的Fc区部分)构成的氨基酸序列、以及例如由受体的配体结合结构域或配体的受体结合结构域构成的氨基酸序列。氨基酸序列可存在于一起转移到融合蛋白中的各蛋白中、或者它们通常可存在于同一蛋白中，但会进入融合多肽中的新的重组中。融合蛋白例如可通过化学合成来制作，或者按照制作以所期望的关系编码肽区的多核苷酸、并将其表达的基因重组方法来制作。

本发明的抗原结合结构域、Fc区等各结构域可通过多肽键直接连接，也可经由接头连接。作为接头，可以使用通过基因工程可导入的任意肽接头或合成化合物接头(例如，Protein Engineering(1996)9(3),299-305)中公开的接头等，本发明中优选肽接头。对肽接头长度无特别限定，本领域技术人员可根据目的适当选择，优选长度为5个氨基酸以上(上限没有特别限定，通常为30个氨基酸以下，优选20个氨基酸以下)，特别优选为15个氨基酸。

例如，在肽接头的情况下，可优选列举：

Ser

Gly·Ser

Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO:29)

Ser·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO:30)

Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO:31)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO:32)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO:33)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO:34)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO:35)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO:36)

(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO:31))n

(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO:32))n

[n为1以上的整数]等。但是，本领域技术人员根据目的可以适当选择肽接头的长度或序列。

合成化学物接头(化学交联剂)是通常用于肽的交联的交联剂，例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺基)酯(BS3)、二硫代双(丙酸琥珀酰亚胺酯)(DSP)、二硫代双(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酸琥珀酰亚胺酯)(EGS)、乙二醇双(琥珀酸磺基琥珀酰亚胺酯)(磺基-EGS)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-DST)、双[2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)、双[2-(磺基琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基-BSOCOES)等，这些交联剂有市售。

使用多个连接各结构域的接头时，可全部使用同种的接头，也可使用不同种的接头。

此外，除了上述记载中例示的接头之外，也可适当使用例如具有His标签、HA标签、myc标签、FLAG标签等肽标签的接头。此外，也可优选利用通过氢键、二硫键、共价键、离子性相互作用或这些键的组合相互连接的性质。例如，利用抗体的CH1与CL间的亲和性，或者利用异源Fc区缔合时以上述双特异性抗体为来源的Fc区。此外，也可优选利用结构域间形成的二硫键。

为了通过肽键连接各结构域，将编码该结构域的多核苷酸进行框内连接。作为将多核苷酸进行框内连接的方法，限制性片段的连接或融合PCR、重叠PCR等方法是公知的，在本发明的抗原结合分子的制作中也可适当单独或组合使用这些方法。本发明中，用语“被连接”、“被融合”、“连接”或“融合”可互换使用。这些用语是指通过包括上述化学结合方法或重组方法在内的所有方法连接两个以上的多肽等组分或成分以形成一个结构。框内连接是指，在两个以上的结构域、组分(element)或成分为多肽时，将以维持该多肽的正确阅读框的方式连接的、用于形成更长的阅读框的两个以上的阅读框单位连接。将两分子的Fab用作抗原结合结构域的情况下，该抗原结合结构域和Fc区不经由接头而是通过肽键进行框内连接的作为本发明的抗原结合分子的抗体可用作本申请的适当的抗原结合分子。

包含两个以上的抗原结合分子和两个以上的抗原结合单元的复合体

如实施例1所记载(如国际公开WO2011/122011所示)，与H54/L28-IgG1相比使sIL-6R结合活性随pH条件而变化的Fv4-IgG1会加速sIL-6R的消失，但与单独的sIL-6R相比并没有加速消失。为了与单独的sIL-6R相比加速消失，需要使用(例如实施例1中记载的Fv4-IgG1-v2等的)包含增强了pH中性范围的FcRn结合的Fc区的抗原结合分子。

另一方面，令人惊奇的是，尽管人IgA结合活性随Ca离子浓度条件而变化的GA2-IgG1包含pH中性范围的FcRn结合没有增强的来自天然型IgG1的Fc区，但发现与单独的人IgA相比其会加速人IgA的消失。同样，尽管人IgE结合活性随pH条件而变化的克隆278包含pH中性范围的FcRn结合没有增强的来源于天然型IgG1的Fc区，但发现与单独的人IgE相比其也会加速人IgE的消失。并不受特定理论的束缚，但作为在GA2-IgG1或克隆278中发生这样的事情的理由，例示以下的机理。

象sIL-6R等抗原结合单元为一单元(即同源单体)时，两分子(即两单元的抗原结合单元)的抗原与包含二价的抗体结合结构域的一分子的抗体结合，一分子的抗sIL-6R抗体和包含两单元的抗原结合单元的两分子的抗原分子形成复合体。因此，如图1所示，这种抗原与抗体的复合体仅具有一个Fc区(天然型IgG1的Fc区)。该复合体经由一个Fc区与一分子的FcγR或两分子的FcRn结合，所以认为其对这些受体的亲和性和普通的IgG抗体一样，向细胞内的摄入主要是非特异性地发生的。

另一方面，象作为重链和轻链的异源复合体的二聚体的人IgA等抗原结合单元为两单元时，该抗原结合单元中还存在两单元的抗原结合结构域所结合的表位。但是，当二价的(即一分子的抗IgA抗体所含的抗原结合结构域与同一表位结合)抗IgA抗体与作为其抗原的IgA结合时，从表位的配置等方面考虑，认为一分子的抗IgA抗体所含的二价的各抗原结合结构域难以与一分子的IgA分子中存在的两单元的表位分别结合。其结果，在与存在于一分子的抗IgA抗体中的二价抗原结合结构域结合的两分子的IgA中所存在的两单元的抗原结合单元上，通过结合其他的抗IgA抗体分子，认为形成至少包含四分子(即作为抗原分子的IgA的两个分子和作为抗原结合分子的抗IgA抗体的两个分子)的抗原抗体复合体(免疫复合体)。

与包含两个以上抗原结合单元的抗原分子结合的抗体等抗原结合分子形成至少为四聚体的大免疫复合体时，该免疫复合体可以经由至少两个以上的多价Fc区通过亲合力与FcγR、FcRn、补体受体等强固结合。因此，如图7所示，该复合体以高于天然型IgG1的效率摄入到表达这些受体的细胞中。另一方面，如上所述，与包含一单元的抗原结合单元(单体的)的抗原分子结合等的抗原结合分子与抗原分子的免疫复合体，其由Fc区介导的对这些受体的亲和性不充分，所以如图1所示，该免疫复合体主要是非特异性地(与经由亲合力的结合介导的摄入相比没有效率)摄入到表达这些受体的细胞内。即，与经由亲合力的结合介导的摄入相比没有效率。

作为与包含两个以上抗原结合单元的抗原分子结合的抗体等抗原结合分子，包含象pH或Ca依赖性结合等与抗原的结合随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域的抗体在血浆中形成至少包含四个分子(两分子抗原和两分子抗体)以上的抗原抗体复合体(免疫复合体)的情况下，当该免疫复合体摄入到细胞内时，在离子浓度条件不同于血浆中的条件的核内体内抗原从该抗体上解离。因此，在摄入了该免疫复合体的细胞的核内体内，该免疫复合体的形成抵消。已解离的抗原在核内体内无法与FcRn结合，所以转移到溶酶体中后被分解。另一方面，认为抗原解离后的抗体在核内体内与FcRn结合后再循环到血浆中(图7)。

如上所述，认为含有天然IgG1型恒定区的pH或Ca依赖性结合抗体与包含两个以上的抗原结合单元的多聚体抗原形成大的免疫复合体，只要其可以通过亲合力与FcγR、FcRn、补体受体等结合，则可以选择性地只大幅加速抗原的消失。给予与人IgA结合的GA2-IgG1时，认为也形成了这种大的免疫复合体。实际上，如实施例3所示，向GA2-IgG1中导入破坏了与小鼠FcγR的结合的改变而得到的GA2-IgG1-FcγR(-)，无法象GA2-IgG1那样与单独的人IgA相比大幅加速人IgA的消失，而是显示出与单独的人IgA同等的消失。由此认为：GA2-IgG1可以大幅加速人IgA消失的原因在于，含有作为包含两个以上的抗原结合单元的多聚体抗原的人IgA和GA2-IgG1的免疫复合体通过亲合力与FcγR结合，并迅速摄入到表达FcγR的细胞中。在摄入了该免疫复合体的细胞的核内体内，从该免疫复合体中解离的IgA被溶酶体分解。与此同时，在该核内体内与FcRn结合后再循环到血浆中的解离了IgA的抗体可以再次与血浆中的IgA结合。如此操作，认为大幅加速了血浆中的人IgA的消失。作为加速抗原从血浆中消失的方法，使用在pH中性范围与FcRn结合的Fc区的氨基酸改变体的方法记载在国际公开WO2011/122011中。本发明作为不使用上述改变体而加速包含两个以上的抗原结合单元的多聚体抗原从血浆中消失的方法是有效的，同时如GA2-N434W中所示，通过与上述的改变体组合，可以进一步加速包含两个以上的抗原结合单元的多聚体抗原从血浆中消失。

包含两个以上的抗原结合分子和两个以上的抗原结合单元的免疫复合体的形成评价方法

为了发挥上述的进一步加速包含两个以上的抗原结合单元的多聚体抗原从血浆中消失的作用，认为优选抗原结合分子与抗原形成大的免疫复合体，抗原结合分子所含的Fc区通过亲合力与FcγR和/或FcRn强力结合。当抗原为包含两个以上的抗原结合单元的抗原时，可以形成包含两个以上的抗原结合分子和两个以上的抗原结合单元的大的免疫复合体，所以对包含两个以上的抗原结合单元的多聚体抗原的结合活性随离子浓度条件而变化，通过筛选通过亲合力与上述受体结合的抗原结合分子，可以获得进一步加速包含两个以上的抗原结合单元的多聚体抗原从血浆中消失的抗原结合分子。

复合体形成评价方法

作为评价包含抗原结合分子和抗原的免疫复合体的形成的方法，可以列举包括下述方法等在内的分析化学方法：利用了与抗原结合分子单体或抗原分子单体相比免疫复合体的分子大的性质的尺寸排阻(凝胶过滤)层析法、超离心分析法、光散射法、电子显微镜、质谱法(Molecular Immunology(2002),39,77-84,Molecular Immunology(2009),47,357-364)。例如，如图9所示采用尺寸排阻(凝胶过滤)层析时，是否形成了免疫复合体，这要通过与分析单独的抗原分子或者单独的抗原结合分子时进行比较，根据是否观测到更大的分子种类来进行评价。

进而，当抗原结合分子或者抗原具有免疫球蛋白恒定区时，还可列举包括下述方法在内的免疫化学方法：利用了与抗原结合分子单体或者抗原单体相比免疫复合体与Fc受体或补体成分强力结合的性质的ELISA或FACS、SPR法(例如使用Biacore的方法)(The Journal ofBiological Chemistry(2001)276(9),6591-6604；Journal ofImmunological Methods(1982)50,109-114,Journal of Immunology(2010)184(4),1968-1976；mAbs(2009)1(5)491-504)。例如，在进行Fc受体已固相化的ELISA时，是否形成了免疫复合体，这要通过与评价抗原单体或者抗原结合分子单体的情形进行比较，根据检测到的信号是否增加来进行评价。

使用抗原结合分子混合物来促进单体抗原从血浆中消失的方法

如上所述，抗原为多聚体抗原(例如，作为一个非限定性的例子，IgA、IgE等免疫球蛋白、或者TNF或CD154等TNF超家族)时，认为有时会形成包含两个以上的抗原结合分子和两个以上的抗原结合单元的大的免疫复合体。而即使在抗原为单体抗原的情况下，认为作为与该单体抗原中存在的不同表位分别结合的适当的两个以上的抗原结合分子的、与该表位的结合随(pH或Ca等)离子浓度条件而变化的抗原结合分子的混合物也可以形成包含两个以上的抗原结合分子和两个以上的抗原结合单元(单体抗原)的大的免疫复合体。在本说明书中，将作为与单体抗原中存在的不同表位分别结合的适当的两个以上的抗原结合分子的、与该表位的结合随(pH或Ca等)离子浓度条件而变化的抗原结合分子的混合物称作抗原结合分子混合物。其中，在抗原结合分子中，形成免疫复合体的至少一个抗原结合分子(所含的抗原结合结构域)只要是对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域即可。

使用多特异性或多互补位的抗原结合分子来促进单体抗原从血浆中消失的方法

另外，即使在抗原为单体抗原的情况下，认为具有抗原结合分子所含的各抗原结合结构域与该单体抗原中存在的不同表位分别结合的特征、且包含各抗原结合结构域与表位的结合随(pH或Ca等)离子浓度条件而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子也可以形成包含两个以上的抗原结合分子和两个以上的抗原结合单元(单体抗原)的大的免疫复合体。作为如上所述的抗原结合分子的一个非限定性方案，例示包含与存在于单体抗原中的彼此不同的表位结合的适当的可变区的多特异性(multispecific)抗体、或多互补位的(multiparatopic)抗体。作为这种多特异性(multispecific)抗体、或多互补位的(multiparatopic)抗体的一个非限定性方案，认为其可变区为pH或Ca依赖性的结合抗体(图8所示的包含识别表位A的右臂可变区和识别表位B的左臂可变区的双特异性(bispecific)抗体或双互补位的(biparatopic)抗体)也可以形成包含两个以上的抗体和两个以上的抗原结合单元(单体抗原)的大的免疫复合体。

通过筛选针对单体抗原的不同表位的、对该各表位的结合活性随离子浓度条件而变化、且可以通过亲合力与上述受体结合的抗原结合结构域的组合，可以获得进一步加速单体抗原从血浆中消失的抗原结合分子。使多特异性或多互补位的抗原结合结构域对各表位的结合活性发生变化的离子浓度条件可以是相同的离子浓度条件，也可以是不同的离子浓度条件。例如，作为本发明的抗原结合分子的一个非限定性方案，例示包含双特异性或双互补位的抗原结合结构域的抗原结合分子，其双特异性或双互补位的抗原结合结构域的一方的抗原结合结构域对表位的结合活性随pH条件或Ca离子浓度等金属离子浓度条件而变化。进而，作为本发明的抗原结合分子的一个非限定性方案，例如例示包含双特异性或双互补位的抗原结合结构域的抗原结合分子，其双特异性或双互补位的抗原结合结构域的一方的抗原结合结构域对表位的结合活性随pH条件而变化、而另一方的抗原结合结构域对表位的结合活性随Ca离子浓度等金属离子浓度条件而变化。另外，作为本发明的抗原结合分子的一个非限定性方案，还例示包含双特异性或双互补位的抗原结合结构域的抗原结合分子，其双特异性或双互补位的抗原结合结构域的一方的抗原结合结构域对表位的结合活性随pH条件而变化、而另一方的抗原结合结构域对表位的结合活性也随pH条件而变化。进而，作为本发明的抗原结合分子的一个非限定性方案，还例示包含双特异性或双互补位的抗原结合结构域的抗原结合分子，其双特异性或双互补位的抗原结合结构域的一方的抗原结合结构域对表位的结合活性随Ca离子浓度等金属离子浓度条件而变化、而另一方的抗原结合结构域对表位的结合活性随Ca离子浓度等金属离子浓度条件而变化。

多特异性抗原结合分子或多互补位的抗原结合分子

从反应特异性的观点考虑，将具有如下特征且包含至少两个抗原结合结构域的抗原结合分子称作多特异性抗原结合分子：其至少一个抗原结合结构域与抗原分子中的第一表位结合，其至少一个其他的抗原结合结构域与抗原分子中的第二表位结合。抗原结合分子通过其一分子的抗原结合分子所含的两种抗原结合结构域与两个不同的表位结合时，该抗原结合分子被称作双特异性抗原结合分子。另外，抗原结合分子通过其一分子的抗原结合分子所含的三种抗原结合结构域与三个不同表位结合时，该抗原结合分子被称作三特异性抗原结合分子。

与抗原分子中的第一表位结合的抗原结合结构域中的互补位和与结构不同于第一表位的第二表位结合的抗原结合结构域中的互补位的结构彼此不同。所以，从结构特异性的观点考虑，具有如下特征且包含至少两个抗原结合结构域的抗原结合分子被称作多互补位的抗原结合分子：其至少一个抗原结合结构域与抗原分子中的第一表位结合，其至少一个其他的抗原结合结构域与抗原分子中的第二表位结合。抗原结合分子通过其一分子的抗原结合分子所含的两种抗原结合结构域与两个不同表位结合时，该抗原结合分子被称作双互补位的抗原结合分子。另外，抗原结合分子通过其一分子的抗原结合分子所含的三种抗原结合结构域与三个不同表位结合时，该抗原结合分子被称作三互补位的抗原结合分子。

包含一个或多个抗原结合结构域的多价多特异性或多互补位的抗原结合分子及其制备方法还记载在Conrath等人(J.Biol.Chem.(2001)276(10)7346-7350)、Muyldermans(Rev.Mol.Biotech.(2001)74,277-302)和KontermannR.E.(2011)Bispecific Antibodies(Springer-Verlag)等非专利文献、以及国际公开WO1996/034103或WO1999/023221等专利文献等中。通过利用其中记载的多特异性或多互补位的抗原结合分子及其制备方法，可以制作本发明的抗原结合分子。

双特异性抗体及其制作方法

作为如上所述的多特异性或多互补位的抗原结合分子及其制备方法的一个方案，以下例示双特异性抗体及其制作方法。双特异性抗体是指包含与不同表位进行特异性结合的两种可变区的抗体。IgG型双特异性抗体可由通过融合两种产生IgG抗体的杂交瘤而产生的杂交的杂交瘤(quadroma)来分泌(Milstein等人(Nature(1983)305,537-540)。

利用上述抗体项中记载的重组方法制造双特异性抗体时，可以采用将编码包含两种目标可变区的重链的基因导入细胞中使其共表达的方法。但是，仅考虑这种共表达方法中的重链的组合，也会形成下述的(i)、(ii)、(iii)的组合以2：1：1的分子数的比例存在的混合物：(i)包含与第一表位结合的可变区的重链和包含与第二表位结合的可变区的重链形成一对的重链组合、(ii)只是包含与第一表位结合的可变区的重链形成一对的重链组合、(iii)只是包含与第二表位结合的可变区的重链形成一对的重链组合。难以从这三种重链组合的混合物中纯化包含目标重链组合的抗原结合分子。

利用这种重组方法制造双特异性抗体时，通过对构成重链的CH3结构域进行适当的氨基酸取代的改变，可以优先分泌包含不同的组合的重链的双特异性抗体。具体而言，有下述方法：将存在于一条重链的CH3结构域的氨基酸侧链取代成更大的侧链(knob(意为“突起”))、将存在于另一条重链的CH3结构域的氨基酸侧链取代成更小的侧链(hole(意为“空隙”))，从而使突起能够配置在间隙内，以促进形成不同种的重链和抑制形成同种的重链(国际公开WO1996/027011；Ridgway等人(Protein Engineering(1996)9,617-621)；Merchant等人(Nat.Biotech.(1998)16,677-681))。

此外，还已知通过将控制多肽的缔合或由多肽构成的不同多聚体的缔合的方法用于重链的缔合来制作双特异性抗体的技术。即，在双特异性抗体的制作中可以采用下述方法：通过改变重链内的形成界面的氨基酸残基，而控制成抑制具有相同序列的重链的缔合且形成序列不同的两个重链(国际公开WO2006/106905)。在制造双特异性抗体时也可以采用这样的方法。

作为本发明的一个非限定性方案中的抗原结合分子所含的Fc区，可适当使用形成以上述的双特异性抗体为来源的Fc区的两个多肽。更具体而言，优选使用形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的349位氨基酸为Cys、366位氨基酸为Trp，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的356位氨基酸为Cys、366位氨基酸为Ser、368氨基酸为Ala、407位氨基酸为Val。

作为除此以外的本发明的一个非限定性方案中的Fc区，优选使用形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的409位氨基酸为Asp，在另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的399位氨基酸为Lys。在上述方案中，409位氨基酸可以是Glu以代替Asp，399位氨基酸可以是Arg以代替Lys。另外，除399位氨基酸Lys以外，还可以适当追加作为360位氨基酸的Asp或作为392位氨基酸的Asp。

作为本发明的其他的一个非限定性方案中的Fc区，优选使用形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的370位氨基酸为Glu，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的357位氨基酸为Lys。

作为本发明其他的一个非限定性方案中的Fc区，优选使用形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的439位氨基酸为Glu、另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的356位氨基酸为Lys。

作为本发明的其他的一个非限定性方案中的Fc区，优选使用这些Fc区组合得到的以下的任一个方案：

(i)形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的409位氨基酸为Asp、370位氨基酸为Glu，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的399位氨基酸为Lys、357位氨基酸为Lys(本方案中，以EU编号表示的370位氨基酸可以是Asp以代替Glu，可以是以EU编号表示的392位氨基酸的Asp以代替370位氨基酸的Glu)；

(ii)形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的409位氨基酸为Asp、439位氨基酸为Glu，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的399位氨基酸为Lys、356位氨基酸为Lys(在本方案中，可以是以EU编号表示的360位氨基酸的Asp以代替439位氨基酸的Glu、可以是以EU编号表示的392位氨基酸的Asp或439位氨基酸的Asp)；

(iii)形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的370位氨基酸为Glu、439位氨基酸为Glu，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的357位氨基酸为Lys、356位氨基酸为Lys；或者

形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的409位氨基酸为Asp、370位氨基酸为Glu、439位氨基酸为Glu，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的399位氨基酸为Lys、357位氨基酸为Lys、356位氨基酸为Lys(本方案中，以EU编号表示的370位氨基酸可以取代成Glu，而且370位氨基酸不取代成Glu，并且439位氨基酸Glu可以取代成Asp、或者392位氨基酸Asp可以取代成439位氨基酸Glu)。

进而，在本发明的其他的一个非限定性方案中，还优选使用形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的356位氨基酸为Lys，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的435位氨基酸为Arg、439位氨基酸为Glu。

进而，在本发明的其他的一个非限定性方案中，还优选使用形成Fc区且具有以下特征的两个多肽：其中一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的356位氨基酸为Lys、357位氨基酸为Lys，另一个多肽的氨基酸序列中以EU编号表示的370位氨基酸为Glu、435位氨基酸为Arg、439位氨基酸为Glu。

除上述的异种重链的缔合技术外，为了制作本发明提供的多特异性或多互补位的抗原结合分子，还可以使用以下的作为異种轻链的缔合技术而已知的CrossMab技术：使形成与第一表位结合的可变区的轻链和形成与第二表位结合的可变区的轻链分别与形成与第一表位结合的可变区的重链和形成与第二表位结合的可变区的重链缔合(Scaefer等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2011)108,11187-11192))。

抗原结合分子在使包含两个以上的抗原结合单元的抗原从血浆中消失中的应用

根据本发明，提供可形成免疫复合体的抗原结合分子在使抗原从血浆中消失中的应用，是指包含(i)Fc区和(ii)对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子的应用；

本发明中，关于抗原结合分子的使用，只要其可以使该抗原从血浆中消失即可，对其使用方案没有特别限定。作为这种使用的一个非限定性方案，例示包含本发明所提供的抗原结合分子的药物组合物、或者包含向对象给予本发明所提供的抗原结合分子的方法等。另外，作为其他的一个非限定性方案，还例示该抗原结合分子在用于使该抗原从血浆中消失的先体外后体内(ex vivo)方法中的应用，所述的先体外后体内方法包括：使免疫复合体与表达FcRn或Fcγ受体的细胞接触，所述免疫复合体是使从对象中分离的血浆与本发明的抗原结合分子接触而形成的，其包含两分子以上的该抗原结合分子和两分子以上的抗原(其中，该抗原包含两个以上的抗原结合单元)。

药物动力学的改善

在本发明中，“血浆中抗原消失能力”是指，向生物体内给予抗原结合分子、或者向生物体内分泌抗原结合分子时，使存在于血浆中的抗原从血浆中消失的能力。因此，在本发明中，“抗原结合分子的血浆中抗原消失能力增加”是指给予抗原结合分子时，与给予本发明中公开的无法形成免疫复合体的抗原结合分子、包含抗原结合活性为离子浓度非依赖性的抗原结合结构域的抗原结合分子、或者包含损害了对FcγR或FcRn的结合活性的Fc区的抗原结合分子时相比，只要抗原从血浆中消失的速度变快即可。抗原结合分子的血浆中抗原消失能力是否增加，这例如可以通过向生物体内给予可溶型抗原和抗原结合分子，测定给药后血浆中的可溶型抗原浓度来判断。通过使可以形成包含两个以上的抗原结合分子和两个以上的抗原结合单元的抗原的免疫复合体的抗原结合分子在pH酸性范围的抗原结合活性与在pH中性范围的抗原结合活性相比降低(或者，使低钙离子浓度下的抗原结合活性与高钙离子浓度下的抗原结合活性相比降低)等，当给予抗原结合活性随离子浓度而变化的抗原结合分子和可溶型抗原后的血浆中可溶型抗原的浓度降低时，可以判断为抗原结合分子的血浆中抗原消失能力增加。可溶型抗原可以是在血浆中与抗原结合分子结合的抗原，或者可以是未结合抗原结合分子的抗原，其浓度可以分别作为“血浆中抗原结合分子结合抗原浓度”和“血浆中抗原结合分子非结合抗原浓度”来确定(后者与“血浆中游离抗原浓度”同义)。由于“血浆中总抗原浓度”是指抗原结合分子结合抗原和抗原结合分子非结合抗原的总浓度、或者作为抗原结合分子非结合抗原浓度的“血浆中游离抗原浓度”，所以可溶型抗原浓度可以作为“血浆中总抗原浓度”来确定。在本说明书中，如下所述，测定“血浆中总抗原浓度”或“血浆中游离抗原浓度”的各种方法在本技术领域众所周知。

本发明中，“药物动力学的提高”、“药物动力学的改善”和“优异的药物动力学”可以改说成“血浆中(血中)滞留性的提高”、“血浆中(血中)滞留性的改善”、“优异的血浆中(血中)滞留性”、“延长血浆中(血中)滞留性”，这些术语以相同的意义使用。

本发明中，“药物动力学改善”不仅包括对人或小鼠、大鼠、猴、兔、狗等非人动物给予抗原结合分子后直至其从血浆中消失(例如直至形成抗原结合分子由于在细胞内被分解等而无法返回到血浆中的状态)的时间变长，还包括在给予抗原结合分子后被分解直至消失期间以可与抗原结合的状态(例如，抗原结合分子未与抗原结合的状态)在血浆中滞留的时间变长。具有天然型Fc区的人IgG可与非人动物来源的FcRn结合。例如，具有天然型Fc区的人IgG与小鼠FcRn的结合强于其与人FcRn的结合(Int.Immunol.(2001)13(12),1551-1559)，所以为了确认本发明的抗原结合分子的特性，优选可以使用小鼠进行给药。其他例子有：为了确认以下记载的本发明的抗原结合分子的特性，还可以使用原来的FcRn基因被破坏、而携带与人FcRn基因有关的转基因进行表达的小鼠(Methods Mol.Biol.(2010)602,93-104)进行给药。具体而言，“药物动力学改善”还包括未与抗原结合的抗原结合分子(抗原非结合型抗原结合分子)被分解后直至消失的时间变长。即使抗原结合分子存在于血浆中，但在该抗原结合分子已经与抗原结合时，该抗原结合分子无法与新的抗原结合。因此，如果抗原结合分子未与抗原结合的时间变长，则其可与新的抗原结合的时间变长(可与新的抗原结合的机会增多)，可以减少在生物体内抗原未与抗原结合分子结合的时间，可以延长抗原与抗原结合分子结合的时间。如果通过给予抗原结合分子可以加速抗原从血浆中消失，则抗原非结合型抗原结合分子的血浆中浓度增加，另外，抗原与抗原结合分子结合的时间也变长。即，本发明中的“抗原结合分子的药物动力学的改善”包括：抗原非结合型抗原结合分子的任意一个药物动力学参数的改善(血浆中半衰期增加、平均血浆中滞留时间增加、血浆中清除率降低的任一种)、或者给予抗原结合分子后抗原与抗原结合分子结合的时间延长、或者利用抗原结合分子加速抗原从血浆中消失。可以通过测定抗原结合分子或抗原非结合型抗原结合分子的血浆中半衰期、平均血浆中滞留时间、血浆中清除率等任意一个参数(ファーマコキネティクス演習による理解(药物动力学演习的理解)(南山堂))来进行判断。例如，对小鼠、大鼠、猴、兔、狗、人等给予抗原结合分子时，测定血浆中的抗原结合分子或抗原非结合型抗原结合分子的浓度，算出各参数，当血浆中半衰期延长或平均血浆中滞留时间变长时等，可以说抗原结合分子的药物动力学得到了改善。这些参数可以通过本领域技术人员所公知的方法进行测定，例如，使用药物动力学分析软件WinNonlin(Pharsight)，按照附带的说明书进行非房室模型(Noncompartmental)分析，从而可以适当地进行评价。血浆中未与抗原结合的抗原结合分子的浓度测定可以按照本领域技术人员公知的方法实施，例如可以采用Clin.Pharmacol.(2008)48(4),406-417中测定的方法。

在本发明中，“药物动力学改善”还包括给予抗原结合分子后抗原与抗原结合分子结合的时间延长。给予抗原结合分子后抗原与抗原结合分子结合的时间是否延长，这可以通过测定血浆中游离抗原的浓度，根据直至血浆中游离抗原的浓度或者游离抗原浓度与总抗原浓度的比例上升的时间来判断。

血浆中未与抗原结合分子结合的游离抗原的浓度、或游离抗原浓度与总抗原浓度的比例可以通过本领域技术人员所公知的方法来确定。例如，可以利用Pharm.Res.(2006)23(1),95-103中使用的方法来确定。另外，当抗原在生物体内显示出某些功能时，抗原是否与中和抗原功能的抗原结合分子(拮抗分子)结合，这还可以根据该抗原功能是否被中和来进行评价。抗原的功能是否被中和，这可以通过测定反映抗原功能的某些生物体内标志物来进行评价。抗原是否与激活抗原功能的抗原结合分子(激动分子)结合，这可以通过测定反映抗原功能的某些生物体内标志物来进行评价。

对血浆中游离抗原浓度的测定、血浆中的游离抗原量与血浆中的总抗原量的比例的测定、生物体内标志物的测定等测定没有特别限定，但优选给予抗原结合分子起经过一定时间后进行测定。本发明中，对给予抗原结合分子起经过一定时间后没有特别限定，本领域技术人员可以根据所给予的抗原结合分子的性质等进行适时确定，例如可以列举：给予抗原结合分子起经过1天后、给予抗原结合分子起经过3天后、给予抗原结合分子起经过7天后、给予抗原结合分子起经过14天后、给予抗原结合分子起经过28天后等。本发明中，“血浆中抗原浓度”是指抗原结合分子结合抗原与抗原结合分子非结合抗原的总浓度即“血浆中总抗原浓度”或者抗原结合分子非结合抗原浓度即“血浆中游离抗原浓度”均包括在内的概念。

关于血浆中总抗原浓度，作为抗原结合分子，与给予包含抗原结合活性为离子浓度非依赖性的抗原结合结构域的抗原结合分子、或包含损害了FcγR结合活性的Fc区的抗原结合分子时相比、或者与没有给予本发明的抗原结合分子时相比，通过给予本发明的抗原结合分子，血浆中总抗原浓度可以降低2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍或其以上。

抗原/抗原结合分子摩尔比可如下计算：

A值＝各时刻的抗原的摩尔浓度；

B值＝各时刻的的抗原结合分子的摩尔浓度；

C值＝各时刻的抗原结合分子的单位摩尔浓度的抗原摩尔浓度(抗原/抗原结合分子摩尔比)；

C＝A/B。

C值越小，表明每个抗原结合分子的抗原消失效率越高，C值越大，表明每个抗原结合分子的抗原消失效率越低。

抗原/抗原结合分子摩尔比可如上计算。

关于抗原/抗原结合分子摩尔比，作为抗原结合分子，与给予本发明中公开的无法形成免疫复合体的抗原结合分子、包含抗原结合活性为离子浓度非依赖性的抗原结合结构域的抗原结合分子、或包含损害了对FcγR或FcRn的结合活性的Fc区的抗原结合分子时相比，通过给予本发明的抗原结合分子，抗原/抗原结合分子摩尔比可以降低2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍或其以上。

在本发明中，作为与本发明的抗原结合分子进行比较的参照抗原结合分子，使用本发明中公开的无法形成免疫复合体的抗原结合分子、包含抗原结合活性为离子浓度非依赖性的抗原结合结构域的抗原结合分子、或者包含对FcγR或FcRn的结合活性受损的Fc区的抗原结合分子。

关于在从血浆中向细胞内摄入本发明的抗原结合分子时利用存在FcRn的路径的情况下血浆中总抗原浓度或抗原/抗体摩尔比的减少，在抗原结合分子不与小鼠配对抗原发生交叉反应的情况下，还可以使用人FcRn转基因小鼠系统32或系统276(Jackson Laboratories,Methods Mol.Biol.(2010)602,93-104)，通过抗原抗体同时注射模型或稳态抗原注入模型的任一种来进行评价。抗原结合分子与小鼠配对发生交叉反应时，还可以通过向人FcRn转基因小鼠系统32或系统276(Jackson Laboratories)中只注入抗原结合分子来进行评价。在同时注射模型中，对小鼠给予抗原结合分子和抗原的混合物。在稳态抗原注入模型中，为了达到一定的血浆中抗原浓度，在小鼠体内埋入填充有抗原溶液的注入泵，接下来对小鼠注射抗原结合分子。以相同的用量给予试验抗原结合分子。利用本领域技术人员所公知的方法，在适当的时候测定血浆中总抗原浓度、血浆中游离抗原浓度和血浆中抗原结合分子浓度。

关于在从血浆中向细胞内摄入本发明的抗原结合分子时利用存在FcγR的路径的情况下血浆中总抗原浓度或抗原/抗体摩尔比的减少，在抗原结合分子不与小鼠配对抗原发生交叉反应的情况下，还可以使用通常使用的C57BL/6J小鼠(Charles River Japan)，通过抗原抗体同时注射模型或稳态抗原注入模型的任一种来进行评价。在抗原结合分子与小鼠配对抗原发生交叉反应的情况下，还可以通过向通常使用的C57BL/6J小鼠(Charles River Japan)中只注射抗原结合分子来进行评价。

在同时注射模型中，对小鼠给予抗原结合分子和抗原的混合物。在稳态抗原注入模型中，为了达到一定的血浆中抗原浓度，在小鼠体内埋入填充有抗原溶液的注入泵，接下来对小鼠注射抗原结合分子。以相同的用量给予试验抗原结合分子。利用本领域技术人员所公知的方法，在适当的时刻测定血浆中总抗原浓度、血浆中游离抗原浓度和血浆中抗原结合分子浓度。

可以在给药2天后、4天后、7天后、14天后、28天后、56天后或84天后，测定血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度和抗原/抗原结合分子摩尔比，由此评价本发明的长期效果。换言之，为了评价本发明的抗原结合分子的特性，长期的血浆中抗原浓度要通过在抗原结合分子给药2天后、4天后、7天后、14天后、28天后、56天后或84天后测定血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度和抗原/抗原结合分子摩尔比来确定。通过本发明所记载的抗原结合分子是否可以实现血浆中抗原浓度或抗原/抗原结合分子摩尔比的减少，这可以通过在之前记载的任意一个或几个时刻评价其减少来确定。

可以在给药15分钟后、1小时后、2小时后、4小时后、8小时后、12小时后或24小时后，测定血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度和抗原/抗原结合分子摩尔比，由此评价本发明的短期效果。换言之，为了评价本发明的抗原结合分子的特性，短期的血浆中抗原浓度要通过在抗原结合分子给药15分钟后、1小时后、2小时后、4小时后、8小时后、12小时后或24小时后测定血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度和抗原/抗原结合分子摩尔比来确定。

本发明的抗原结合分子的给药途径可以从皮内注射、静脉内注射、玻璃体内注射、皮下注射、腹腔内注射、胃肠外注射和肌肉内注射中选择。

本发明中，优选抗原结合分子在人体内的药物动力学得到改善。在难以测定人体内的血浆中滞留性的情况下，可以根据小鼠(例如正常小鼠、人抗原表达转基因小鼠、人FcRn表达转基因小鼠等)或猴(例如食蟹猴等)体内的血浆中滞留性来预测人体内的血浆中滞留性。

本发明中的“抗原结合分子的药物动力学的改善、血浆中滞留性的提高”是指，对生物体给予抗原结合分子时的任意一个药物动力学参数得到改善(血浆中半衰期增加、平均血浆中滞留时间增加、血浆中清除率下降、生物利用度中的任一种)、或者给药后的适当时间抗原结合分子的血浆中浓度提高。可以通过测定抗原结合分子的血浆中半衰期、平均血浆中滞留时间、血浆中清除率、生物利用率等任意一个参数(ファーマコキネティクス演習による理解(药物动力学演习的理解)(南山堂))来进行判断。例如，对小鼠(正常小鼠和人FcRn转基因小鼠)、大鼠、猴、兔、狗、人等给予抗原结合分子时，测定血浆中抗原结合分子的浓度，算出各参数，当血浆中半衰期变长或平均血浆中滞留时间变长时等，可以说抗原结合分子的药物动力学得到了改善。这些参数可以通过本领域技术人员所公知的方法进行测定，例如，使用药物动力学分析软件WinNonlin(Pharsight)，按照附带的说明书进行非房室模型(Noncompartmental)分析，从而可以适当地进行评价。

虽然不受特定理论的束缚，但作为本发明的包含(i)Fc区以及(ii)抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域、且可以形成包含两个以上的该抗原结合分子和两个以上的抗原结合单元的抗原的免疫复合体的抗原结合分子有可能使该抗原结合单元从血浆中消失的一个机理，例示如下所述的机理。象sIL-6R等抗原结合单元为一单元(即单体)时，两分子(即两单元的抗原结合单元)的抗原与包含二价的抗体结合结构域的一分子的抗体结合，一分子的抗sIL-6R抗体和包含两单元的抗原结合单元的两分子的抗原分子形成复合体。因此，如图1所示，这种抗原与抗体的复合体只具有一个Fc区(天然型IgG1的Fc区)。该复合体经由一个Fc区与一分子的FcγR或两分子的FcRn结合，所以可以认为其对这些受体的亲和性和普通的IgG抗体一样，主要是非特异性地摄入到细胞内。

另一方面，象作为重链和轻链的异源复合体的二聚体的人IgA等抗原结合单元为两单元时，该抗原结合单元中还存在两单元的抗原结合结构域所结合的表位。但是，当二价的(即一分子抗IgA抗体所含的抗原结合结构域与同一表位结合)抗IgA抗体与作为其抗原的IgA结合时，从表位的配置等方面考虑，认为一分子抗IgA抗体所含的二价的各抗原结合结构域难以与存在于一分子IgA分子中的两单元的表位分别结合。其结果，由于在与存在于一分子抗IgA抗体中的二价抗原结合结构域结合的两分子IgA中所存在的两单元的抗原结合单元上结合其他的抗IgA抗体分子，从而认为形成至少包含四分子(即作为抗原分子的IgA的两个分子和作为抗原结合分子的抗IgA抗体的两个分子)的抗原抗体复合体(免疫复合体)。

与包含两个以上抗原结合单元的抗原分子结合的抗体等抗原结合分子形成至少四聚体这样的大的免疫复合体时，该免疫复合体可以经由至少两个以上的多价Fc区通过亲合力与FcγR、FcRn、补体受体等强固结合。因此，如图7所示，该复合体被有效摄入到表达这些受体的细胞中。另一方面，如上所述，与包含一单元的抗原结合单元的(单体的)抗原分子结合等的抗原结合分子与抗原分子的免疫复合体针对这些受体的由Fc区介导的亲和性不充分，所以如图1所示该免疫复合体主要是非特异性地(与经由亲合力的结合进行的摄入相比没有效率)摄入到表达这些受体的细胞内。即，与经由亲合力的结合进行的摄入相比没有效率。

作为与包含两个以上抗原结合单元的抗原分子结合的抗体等抗原结合分子，包含如pH或Ca依赖性结合等与抗原的结合随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域的抗体在血浆中形成至少包含四个分子(两分子抗原和两分子抗体)以上的抗原抗体复合体(免疫复合体)时，当该免疫复合体摄入到细胞内时，在离子浓度条件不同于血浆中的条件的核内体内抗原从该抗体上解离。因此，在摄入了该免疫复合体的细胞的核内体内，该免疫复合体的形成被解除。解离后的抗原在核内体内无法与FcRn结合，所以转移到溶酶体中之后被分解。另一方面，认为抗原解离后的抗体在核内体内与FcRn结合后再循环到血浆中(图7)。

如上所述，认为针对包含两个以上抗原结合单元的多聚体抗原且含有天然IgG1型恒定区的pH或Ca依赖性结合抗体形成大的免疫复合体，当其通过亲合力可与FcγR、FcRn、补体受体等结合时，可以选择性地只大幅加速抗原的消失。给予与人IgA结合的GA2-IgG1时，认为也形成了这种大的免疫复合体。实际上，如实施例3所示，向GA2-IgG1中导入了与小鼠FcγR的结合受损的改变而得到的GA2-IgG1-FcγR(-)，无法象GA2-IgG1那样与单独的人IgA相比大幅加速人IgA的消失，而是显示出与单独的人IgA同等的消失。由此认为：GA2-IgG1可以大幅加速人IgA的消失的原因在于，含有作为包含两个以上抗原结合单元的多聚体抗原的人IgA和GA2-IgG1的免疫复合体通过亲合力与FcγR结合，并迅速摄入到表达FcγR的细胞中。在摄入了该免疫复合体的细胞的核内体内从该免疫复合体上解离的IgA被溶酶体分解。同时，在该核内体内与FcRn结合后再循环到血浆中的解离IgA后的抗体可以再次与血浆中的IgA结合。如此操作，认为大幅加速了血浆中的人IgA的消失。作为加速抗原从血浆中消失的方法，使用在pH中性范围与FcRn结合的Fc区的氨基酸改变体的方法记载在国际公开WO2011/122011中。本发明作为不使用上述改变体而加速包含两个以上抗原结合单元的多聚体抗原从血浆中消失的方法是有效的，同时通过与上述改变体组合，可以进一步加速包含两个以上抗原结合单元的多聚体抗原从血浆中消失。

用于使该抗原从血浆中消失的先体外后体内方法

作为由本发明提供的、抗原结合分子在用于使该抗原从血浆中消失的方法中的应用的一个非限定性方案，还例示该抗原结合分子在用于使该抗原从血浆中消失的所谓先体外后体内方法中的应用，所述应用包括：使从对象中分离的血浆与本发明的抗原结合分子接触而形成的免疫复合体与表达FcRn和/或Fcγ受体的细胞接触，所述免疫复合体包含两分子以上的该抗原结合分子和两分子以上的抗原(其中，该抗原包含两个以上的抗原结合单元)。用所谓的先体外后体内方法代替向生物体内给予抗原结合分子的方法或者与其组合，也可以促进血浆中的抗原消失速度，所述先体外后体内方法是指，将包含抗原结合分子和与抗原结合分子结合的抗原的血浆暂且采集到生物体外后，使其与表达FcRn和/或Fcγ受体的细胞接触，经过一定期间将再循环(还称作再分泌或再循环)到细胞外的包含没有结合抗原的抗原结合分子的血浆送回生物体内。

另外，作为由本发明提供的、抗原结合分子在用于使该抗原从血浆中消失的方法中的应用的一个非限定性方案，还例示该抗原结合分子在用于使该抗原从血浆中消失的所谓先体外后体内方法中的应用，所述应用包括：使从给予了本发明的抗原结合分子的对象中分离的血浆中存在的免疫复合体与表达FcRn和/或Fcγ受体的细胞接触，所述免疫复合体包含两分子以上的该抗原结合分子和两分子以上的抗原(其中，该抗原包含两个以上的抗原结合单元)。

该抗原是否从血浆中消失，这可以通过以本发明中公开的无法形成免疫复合体的抗原结合分子、包含抗原结合活性为离子浓度非依赖性的抗原结合结构域的抗原结合分子、或者包含与FcγR或FcRn的结合活性受损的Fc区的抗原结合分子为对照以代替本发明的抗原结合分子来进行比较时，评价上述的血浆中抗原的消失速度是否得到促进等来进行确认。

包含Fc区和抗原结合活性为离子浓度依赖性的抗原结合结构域的抗原结合分子的筛选方法

本发明提供具有使该抗原从血浆中消失的功能的抗原结合分子的筛选方法，该方法包括以下的步骤(a)～(g)：

步骤(a)，得到抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；

步骤(d)，培养宿主细胞，所述宿主细胞携带在上述步骤(c)中进行了有效连接的基因；

步骤(f)，使上述步骤(e)中得到的抗原结合分子与抗原接触的步骤；

在本发明的一个非限定性方案中，在分离编码结合活性随如上选择的条件而变化的抗原结合结构域的多核苷酸后，将该多核苷酸插入适当的表达载体中。例如，当抗原结合结构域为抗体可变区时，得到编码该可变区的cDNA后，通过插入在该cDNA的两末端且识别限制酶切位点的限制酶来消化该cDNA。优选的限制酶识别在构成抗原结合分子的基因的核苷酸序列中出现的频率低的核苷酸序列并进行消化。为了再将1拷贝的消化片段以正确方向插入载体中，优选插入提供附着末端的限制酶。通过将以上述方式消化的编码抗原结合分子的可变区的cDNA插入适当的表达载体中，可以获得本发明的抗原结合分子的表达载体。此时，编码抗体恒定区(C区)的基因和上述编码可变区的基因可以进行框内融合。

为了制造所期望的抗原结合分子，将编码抗原结合分子的多核苷酸以与调控序列进行了有效连接的形式插入表达载体中。调控序列例如包含增强子或启动子。另外，可以在氨基末端连接适当的信号序列，使表达的抗原结合分子分泌到细胞外。例如作为信号序列，使用具有氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO:5)的肽，除此之外也可以连接合适的信号序列。所表达的多肽在上述序列的羧基末端部分被切断，被切断的多肽能够以成熟多肽的形式分泌到细胞外。接着，通过该表达载体转化适当的宿主细胞，由此可以获得表达编码所期望的的抗原结合分子的多核苷酸的重组细胞。关于由该重组细胞制造本发明的抗原结合分子的方法，可以按照上述的抗体项中记载的方法来制造。

关于核酸，“有效连接”是指该核酸存在与其它核酸序列的功能关系。例如，前序列(presequence)或分泌前导肽的DNA在作为与某多肽的分泌相关的前体蛋白表达的情况下，与该多肽的DNA有效连接。启动子或增强子在其影响某编码序列的转录的情况下与该序列有效连接。或者，核糖体结合位点在其位于使翻译变得容易的位置的情况下与编码序列有效连接。通常，“有效连接”是指连接的DNA序列连续，在分泌前导肽的情况下指连续位于阅读框内。然而，增强子没有连续的必要。连接是在合适的限制性位点通过连接作用来实现。不存在这样的位点时，合成寡核苷酸衔接头或接头根据历来的惯例使用。还可通过上述重叠延伸PCR方法制作连接的核酸。

在本发明的一个非限定性方案中，分离编码结合活性随如上选择的条件而变化的抗原结合分子的多核苷酸后，将该多核苷酸的改变体插入适当的表达载体中。作为这样的改变体之一，优选列举通过使用合成文库或以非人动物为来源而制作的免疫文库作为随机化可变区文库而筛选的编码本发明的抗原结合分子的多核苷酸序列被人源化的改变体。被人源化的抗原结合分子的改变体的制作方法可以采用与上述的人源化抗体的制作方法相同的方法。

另外，作为改变体的其他方案，优选列举对所分离的多核苷酸序列进行了下述改变而得到的改变体：通过使用合成文库或天然文库作为随机化可变区文库，使所筛选的本发明的抗原结合分子的抗原结合亲和性增强(亲和成熟化)的改变。这种改变体可以通过包含CDR的诱变(Yang等人(J.Mol.Biol.(1995)254,392-403))、链改组(Marks等人(Bio/Technology(1992)10,779-783))、E.coli的诱变株的使用(Low等人(J.Mol.Biol.(1996)250,359-368))、DNA改组(Patten等人(Curr.Opin.Biotechnol.(1997)8,724-733))、噬菌体展示(Thompson等人(J.Mol.Biol.(1996)256,77-88))和有性PCR(sexualPCR)(Clameri等人(Nature(1998)391,288-291))在内的各种亲和性成熟化的公知顺序来获得。

如上所述，作为通过本发明的制备方法制作的抗原结合分子，可以列举包含Fc区的抗原结合分子，但可以使用各种改变体作为Fc区。作为本发明的改变体的一个方案，还优选列举：编码这样的Fc区的改变体的多核苷酸和编码结合活性随如上选择的条件而变化的抗原结合结构域的多核苷酸进行框内连接得到的、编码具有重链的抗原结合分子的多核苷酸。

在本发明的一个非限定性方案中，作为Fc区，例如优选列举：SEQ ID NO:13所表示的IgG1(N末端添加了Ala的AAC82527.1)、SEQID NO:14所表示的IgG2(N末端添加了Ala的AAB59393.1)、SEQ IDNO:15所表示的IgG3(CAA27268.1)、SEQ ID NO:16所表示的IgG4(N末端添加了Ala的AAB59394.1)等抗体的Fc恒定区。IgG分子的血浆中滞留性比较长(从血浆中消失慢)的原因在于：作为IgG分子的补救受体而已知的FcRn特别是人FcRn在发挥作用。通过胞饮作用进入核内体内的IgG分子在核内体内的酸性条件下与在核内体内表达的FcRn特别是人FcRn结合。无法与FcRn特别是人FcRn结合的IgG分子进入溶酶体内，在这里被分解，但与FcRn特别是人FcRn结合的IgG分子转移到细胞表面，在血浆中的中性条件下从FcRn特别是人FcRn上解离，从而再次返回到血浆中。

普通的包含Fc区的抗体在血浆中的pH中性范围条件下对FcRn特别是人FcRn没有结合活性，所以普通的抗体和抗体-抗原复合体通过非特异性的胞吞被摄入细胞内，在核内体内的pH酸性范围条件下与FcRn特别是人FcRn结合，从而输送到细胞表面。由于FcRn特别是人FcRn将抗体从核内体内输送到细胞表面，所以认为FcRn特别是人FcRn的一部分还存在于细胞表面，但在细胞表面的pH中性范围条件下，抗体从FcRn特别是人FcRn上解离，所以抗体再循环到血浆中。

本发明的抗原结合分子所能包含的、具有pH中性范围的人FcRn结合活性的Fc区可通过任意方法获得，具体而言，通过改变用作起始Fc区的人IgG型免疫球蛋白的氨基酸可以获得具有pH中性范围的人FcRn结合活性的Fc区。作为用于改变的优选IgG型免疫球蛋白Fc区，例如可列举人IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4、以及它们的改变体)的Fc区。对于向其它氨基酸的改变，只要具有pH中性范围的人FcRn结合活性、或者提高中性范围的人FcRn结合活性，就可以改变任意位置的氨基酸。在抗原结合分子包含人IgG1的Fc区作为人Fc区的情况下，优选包含带来在pH中性范围对人FcRn的结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变。作为可进行这种改变的氨基酸，例如可以列举选自EU编号221位～225位、227位、228位、230位、232位、233位～241位、243位～252位、254位～260位、262位～272位、274位、276位、278位～289位、291位～312位、315位～320位、324位、325位、327位～339位、341位、343位、345位、360位、362位、370位、375位～378位、380位、382位、385位～387位、389位、396位、414位、416位、423位、424位、426位～438位、440位和442位的至少一个以上的氨基酸。更具体而言，例如可以列举表5中记载的氨基酸的改变。通过这些氨基酸的改变，IgG型免疫球蛋白的Fc区在pH中性范围对人FcRn的结合有所增强。

为了在本发明中使用，在这些改变中，适当选择在pH中性范围也增强对人FcRn的结合的改变。作为特别优选的Fc区改变体的氨基酸，例如可以列举以EU编号表示的237位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265位、286位、289位、297位、298位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、315位、317位、332位、334位、360位、376位、380位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、424位、428位、433位、434位和436位的氨基酸。通过将选自这些氨基酸的至少一个氨基酸取代成其他的氨基酸，可以增强抗原结合分子所含的Fc区在pH中性范围对人FcRn的结合活性。

作为特别优选的改变，例如可以列举Fc区的以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸的改变：

237位氨基酸为Met；

248位氨基酸为Ile；

252位氨基酸为Phe、Trp或Tyr中的任一个；

254位氨基酸为Thr；

255位氨基酸为Glu；

256位氨基酸为Asp、Asn、Glu或Gln中的任一个；

258位氨基酸为His；

265位氨基酸为Ala；

286位氨基酸为Ala或Glu中的任一个；

289位氨基酸为His；

297位氨基酸为Ala；

303位氨基酸为Ala；

305位氨基酸为Ala；

309位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro或Arg中的任一个；

311位氨基酸为Ala、His或Ile中的任一个；

312位氨基酸为Ala或His中的任一个；

314位氨基酸为Lys或Arg中的任一个；

315位氨基酸为Ala、Asp或His中的任一个；

317位氨基酸为Ala；

332位氨基酸为Val

334位氨基酸为Leu；

360位氨基酸为His；

376位氨基酸为Ala；

380位氨基酸为Ala；

382位氨基酸为Ala；

384位氨基酸为Ala；

385位氨基酸为Asp或His中的任一个；

386位氨基酸为Pro；

387位氨基酸为Glu；

389位氨基酸为Ala或Ser中的任一个；

424位氨基酸为Ala；

433位氨基酸为Lys；

434位氨基酸为Ala、Phe、His、Ser、Trp或Tyr中的任一个；或者

436位氨基酸为His、Ile、Leu、Phe、Thr或Val。另外，对改变的氨基酸的数量没有特别限定，可以只改变一处氨基酸，也可以改变两处以上的氨基酸。作为两处所以上的氨基酸的改变的组合，例如可以列举表5-1～5-32中记载的组合。

另外，作为本发明所含的Fc区，除了以人IgG1(SEQ ID NO:13)、IgG2(SEQ ID NO:14)、IgG3(SEQ ID NO:15)或IgG4(SEQ ID NO:16)表示的Fc区之外，还可以适当使用对Fcγ受体的结合活性高于与EU编号297位结合的糖链为含岩藻糖的糖链的天然型人IgG的Fc区对Fcγ受体的结合活性的FcγR结合改变Fc区。这种FcγR结合改变Fc区可以通过改变天然型人IgG的Fc区的氨基酸来制作。Fc区对FcγR的结合活性是否高于与EU编号297位结合的糖链为含岩藻糖的糖链的天然型人IgG的Fc区对FcγR的结合活性，这可以利用如上所述的方法来适当评价。

本发明中，Fc区的“氨基酸的改变”或“氨基酸改变”包括改变成与起始Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。起始Fc区的修饰改变体只要可以在pH中性范围与人Fcγ受体结合，就可使用任一种Fc区作为起始Fc区。此外，将已进行改变的Fc区作为起始Fc区并进行进一步的改变而成的Fc区也可优选用作本发明的Fc区。起始Fc区可指多肽自身、含有起始Fc区的组合物、或编码起始Fc区的氨基酸序列。起始Fc区可包括抗体项目中概述的通过重组产生的公知的Fc区。对起始Fc区的来源没有限定，可由非人动物的任意生物或人获得。优选地，作为任意生物，优选列举选自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猫、兔、狗、山羊、绵羊、牛、马、骆驼和非人灵长类的生物。在其他方案中，起始Fc区还可由食蟹猴、狨猴、恒河猴、黑猩猩或人获得。优选地，起始Fc区可由人IgG1获得，但不限于IgG的特定类别。这是指可适当使用人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区作为起始Fc区。同样，在本说明书中，是指可将来自上述任意生物的IgG的任意类或亚类的Fc区优选用作起始Fc区。天然存在的IgG变体或被操作的类型的实例记载于公知文献(Curr.Opin.Biotechnol.(2009)20(6),685-91；Curr.Opin.Immunol.(2008)20(4),460-470；Protein Eng.Des.Sel.(2010)23(4),195-202；国际公开WO2009/086320、WO2008/092117、WO2007/041635和WO2006/105338)，但不限于此。

作为改变的实例，包括一个以上的变异，例如取代成与起始Fc区的氨基酸不同的氨基酸残基的变异、或者向起始Fc区的氨基酸中插入一个以上的氨基酸残基或从起始Fc区的氨基酸中缺失一个以上的氨基酸等。优选改变后的Fc区的氨基酸序列中包含含有非天然存在的Fc区的至少一部分的氨基酸序列。这种变体与起始Fc区必然具有不足100％的序列同源性或相似性。在优选实施方案中，变体与起始Fc区的氨基酸序列具有约75％～不足100％的氨基酸序列同源性或相似性，更优选约80％～不足100％、更优选约85％～不足100％、更优选约90％～不足100％、最优选约95％～不足100％的同源性或相似性的氨基酸序列。在本发明的一个非限定性方案中，起始Fc区和本发明的FcγR结合改变Fc区之间存在至少一个氨基酸的差异。起始Fc区与本发明的FcγR结合改变Fc区的氨基酸的不同可优选通过特别是上述的以EU编号特定的氨基酸残基位置的特定氨基酸的不同来规定。

本发明的抗原结合分子所含的、对Fcγ受体的结合活性高于与EU编号297位结合的糖链为含岩藻糖的糖链的天然型人IgG的Fc区对Fcγ受体的结合活性的(FcγR结合改变Fc区)可通过任意方法获得，具体而言，通过改变用作起始Fc区的人IgG型免疫球蛋白氨基酸可以获得该FcγR结合改变Fc区。作为用于改变的优选的IgG型免疫球蛋白的Fc区，例如可列举人IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4、以及它们的改变体)的Fc区。

关于向其它氨基酸的改变，只要对Fcγ受体的结合活性高于与EU编号297位结合的糖链为含岩藻糖的糖链的天然型人IgG的Fc区对Fcγ受体的结合活性，就可改变任意位置的氨基酸。在抗原结合分子包含人IgG1的Fc区作为人Fc区的情况下，优选包含带来对Fcγ受体的结合活性高于与EU编号297位结合的糖链为含岩藻糖的糖链的天然型人IgG的Fc区对Fcγ受体的结合活性的效果的改变。作为这种氨基酸的改变，例如在国际公开WO2007/024249、WO2007/021841、WO2006/031370、WO2000/042072、WO2004/029207、WO2004/099249、WO2006/105338、WO2007/041635、WO2008/092117、WO2005/070963、WO2006/020114、WO2006/116260和WO2006/023403等中有报道。

作为可以进行这种改变的氨基酸，例如可以例举选自以EU编号表示的221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位和440位的至少一个以上的氨基酸。通过这些氨基酸的改变，可以获得对Fcγ受体的结合活性高于与EU编号297位结合的糖链为含岩藻糖的糖链的天然型人IgG的Fc区对Fcγ受体的结合活性的Fc区(FcγR结合改变Fc区)。

221位氨基酸为Lys或Tyr中的任一个；

222位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

223位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个；

224位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

225位氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个；

227位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

228位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

230位氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个；

231位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

232位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

240位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

241位氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

243位氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

244位氨基酸为His；

245位氨基酸为Ala；

246位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

249位氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个；

250位氨基酸为Glu或Gln中的任一个；

251位氨基酸为Phe；

254位氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个；

255位氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个；

256位氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个；

258位氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个；

260位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

262位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个；

263位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

266位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

273位氨基酸为Phe或Ile中的任一个；

275位氨基酸为Leu或Trp中的任一个；

279位氨基酸为Ala；

281位氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

282位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

284位氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一个；

285位氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中的任一个；

286位氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一个；

288位氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一个；

291位氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中的任一个；

292位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一个；

301位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

302位氨基酸为Ile；

303位氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一个；

304位氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一个；

305位氨基酸为Glu、Ile、Thr或Tyr中的任一个；

311位氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一个；

313位氨基酸为Phe；

315位氨基酸为Leu；

317位氨基酸为Glu或Gln；

323位氨基酸为Ile；

334位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中的任一个；

336位氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一个；

337位氨基酸为Glu、His或Asn中的任一个；

376位氨基酸为Ala或Val中的任一个；

377位氨基酸为Gly或Lys中的任一个；

378位氨基酸为Asp；

379位氨基酸为Asn；

380位氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一个；

382位氨基酸为Ala或Ile中的任一个；

385位氨基酸为Glu；

392位氨基酸为Thr；

396位氨基酸为Leu；

421位氨基酸为Lys；

427位氨基酸为Asn；

428位氨基酸为Phe或Leu中的任一个；

429位氨基酸为Met；

434位氨基酸为Trp；

436位氨基酸为Ile；或者

440位氨基酸为Gly、His、Ile、Leu或Tyr中的任一个。另外，对改变的氨基酸的数量没有特别限定，可以只改变一处氨基酸，也可以改变两处以上的氨基酸。作为两处所以上的氨基酸的改变的组合，例如可以列举表6(表6-1～表6-3)中记载的组合。

另外，本发明中优选使用的Fc区中，用作具有对特定Fcγ受体的结合活性高于对其他Fcγ受体的结合活性的性质的Fc区(具有选择性的Fcγ受体结合活性的Fc区)的一个非限定性方案的、对抑制型Fcγ受体的结合活性高于对活性型Fcγ受体的结合活性(具有对抑制型Fcγ受体的选择性的结合活性)的Fc区的例子，优选列举改变成以下的任意一个以上的氨基酸的Fc区：上述Fc区的以EU编号表示的238位氨基酸为Asp、或328位氨基酸为Glu。另外，作为具有对抑制型Fcγ受体的选择性的结合活性的Fc区，还可以适当选择US2009/0136485中记载的Fc区或改变。

另外，在本发明的一个非限定性方案中，优选列举改变成以下的任意一个以上的氨基酸的Fc区：上述Fc区的以EU编号表示的238位氨基酸为Asp、或328位氨基酸为Glu。

进而，在本发明的一个非限定性方案中，优选列举改变成以下的任意一个以上的氨基酸的Fc区：以EU编号表示的238位的Pro取代成Asp、和以EU编号表示的237位氨基酸为Trp、以EU编号表示的237位氨基酸为Phe、以EU编号表示的267位氨基酸为Val、以EU编号表示的267位氨基酸为Gln、以EU编号表示的268位氨基酸为Asn、以EU编号表示的271位氨基酸为Gly、以EU编号表示的326位氨基酸为Leu、以EU编号表示的326位氨基酸为Gln、以EU编号表示的326位氨基酸为Glu、以EU编号表示的326位氨基酸为Met、以EU编号表示的239位氨基酸为Asp、以EU编号表示的267位氨基酸为Ala、以EU编号表示的234位氨基酸为Trp、以EU编号表示的234位氨基酸为Tyr、以EU编号表示的237位氨基酸为Ala、以EU编号表示的237位氨基酸为Asp、以EU编号表示的237位氨基酸为Glu、以EU编号表示的237位氨基酸为Leu、以EU编号表示的237位氨基酸为Met、以EU编号表示的237位氨基酸为Tyr、以EU编号表示的330位氨基酸为Lys、以EU编号表示的330位氨基酸为Arg、以EU编号表示的233位氨基酸为Asp、以EU编号表示的268位氨基酸为Asp、以EU编号表示的268位氨基酸为Glu、以EU编号表示的326位氨基酸为Asp、以EU编号表示的326位氨基酸为Ser、以EU编号表示的326位氨基酸为Thr、以EU编号表示的323位氨基酸为Ile、以EU编号表示的323位氨基酸为Leu、以EU编号表示的323位氨基酸为Met、以EU编号表示的296位氨基酸为Asp、以EU编号表示的326位氨基酸为Ala、以EU编号表示的326位氨基酸为Asn、以EU编号表示的330位氨基酸为Met。

为了改变Fc区的氨基酸，可适当采用位点特异性诱变法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或重叠延伸PCR等公知的方法。此外，作为取代成天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸的改变方法，还可采用多种公知的方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。例如，还优选使用包含作为终止密码子之一的UAG密码子(琥珀密码子)的互补性琥珀抑制基因tRNA上连接有非天然氨基酸而成的tRNA的无细胞翻译系统(Clover Direct(Protein Express))等。

如上所述，在本发明的筛选方法中，使从宿主细胞的培养液中分离的抗原结合分子与抗原接触，所述宿主细胞携带编码进行了有效连接的抗原结合分子的基因。作为接触时的一个非限定性方案，适当采用在上述的针对抗原的结合抗原项中记载的条件等。

接着，评价是否形成了包含该被测抗原结合分子和该被测抗原的免疫复合体。作为评价包含抗原结合分子和抗原的免疫复合体的形成的方法，可以列举：利用了免疫复合体分子比抗原结合分子单体或抗原分子单体大的性质的尺寸排阻(凝胶过滤)层析法、超离心分析法、光散射法、电子显微镜、质谱法(Molecular Immunology(2002),39,77-84；Molecular Immunology(2009),47,357-364)。例如，如图9所示使用尺寸排阻(凝胶过滤)层析时，是否形成免疫复合体，这要通过与分析单独的抗原分子或者单独的抗原结合分子时进行比较，根据是否观测到更大的分子种类来进行评价。

进而，当抗原结合分子或者抗原具有免疫球蛋白恒定区时，还可以列举利用了免疫复合体与Fc受体或补体成分的结合强于其与抗原结合分子单体或者抗原单体的结合的性质的ELISA或FACS(TheJournal of Biological Chemistry(2001)276(9),6591-6604；Journal ofImmunological Methods(1982)50,109-114)。例如，在进行Fc受体已固相化的ELISA时，是否形成免疫复合体，这要通过与评价抗原单体或者抗原结合分子单体时进行比较，根据所检测到的信号是否增加来进行评价。

包含Fc区和抗原结合活性为离子浓度依赖性的抗原结合结构域的抗原结合分子的制备方法

本发明提供具有使该抗原从血浆中消失的功能的抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下的步骤(a)～(d)：

步骤(a)，使抗原结合分子与抗原接触，所述抗原结合分子包含Fc区和两个以上的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域中的至少一个抗原结合结构域的抗原结合活性随离子浓度条件而变化；

步骤(c)，培养包含载体的宿主细胞，所述载体携带编码在上述步骤(b)中确认到免疫复合体的形成的抗原结合结构域的基因；

本发明还提供具有使抗原从血浆中消失的功能的抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下的步骤(a)～(i)：

步骤(c)，将上述步骤(b)中得到的基因与编码Fc区的基因有效连接；

步骤(f)，使上述步骤(e)中得到的抗原结合分子与抗原接触；

步骤(h)，培养包含载体的宿主细胞，所述载体携带编码在上述步骤(g)中确认到免疫复合体的形成的抗原结合结构域的基因；

本发明还提供具有使该抗原从血浆中消失的功能的抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下的步骤(a)～(e)，还包括使通过该制备方法得到的抗原结合分子与抗原接触，来评价包含该抗原结合分子和该抗原的免疫复合体的形成的步骤；

在本发明的一个非限定性方案中，在分离编码结合活性随如上选择的条件而变化的抗原结合结构域的多核苷酸后，将该多核苷酸插入适当的表达载体中。例如，当抗原结合结构域为抗体可变区时，得到编码该可变区的cDNA后，通过插入在该cDNA的两末端且识别限制酶切位点的限制酶来消化该cDNA。优选的限制酶识别在构成抗原结合分子的基因的核苷酸序列中出现的频率低的核苷酸序列并进行消化。为了再将1拷贝的消化片段以正确方向插入载体中，优选插入提供附着末端的限制酶。通过将以上述方式消化的编码抗原结合分子可变区的cDNA插入适当的表达载体中，可以获得本发明的抗原结合分子的表达载体。此时，编码抗体恒定区(C区)的基因和编码上述可变区的基因可以进行框内融合。

为了制造所期望的抗原结合分子，将编码抗原结合分子的多核苷酸以与调控序列进行了有效连接的形式插入表达载体中。调控序列例如包含增强子或启动子。另外，还可以在氨基末端连接适当的信号序列，使已表达的抗原结合分子分泌到细胞外。例如，作为信号序列，使用具有氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO:5)的肽，但除此之外也可以连接合适的信号序列。表达了的多肽在上述序列的羧基末端部分被切断，被切断的多肽能够以成熟多肽的形式分泌到细胞外。接着，用该表达载体转化适当的宿主细胞，由此可以获得表达编码所期望的抗原结合分子的多核苷酸的重组细胞。关于由该重组细胞制造本发明的抗原结合分子的方法，可以按照上述的抗体项中记载的方法来制造。

在本发明的一个非限定性方案中，在分离编码结合活性随如上选择的条件而变化的抗原结合分子的多核苷酸后，将该多核苷酸的改变体插入适当的表达载体中。作为这样的改变体之一，优选列举通过使用合成文库或以非人动物为来源而制作的免疫文库作为随机化可变区文库，使所筛选的编码本发明的抗原结合分子的多核苷酸序列被人源化的改变体。被人源化的抗原结合分子的改变体的制作方法可以采用与上述的人源化抗体的制作方法相同的方法。

另外，作为改变体的其他方案，优选列举对分离的多核苷酸序列进行下述改变而得到的改变体：通过使用合成文库或天然(naive)文库作为随机化可变区文库，使所筛选的本发明的抗原结合分子的抗原结合亲和性增强(亲和成熟化)的改变。这种改变体可以通过包括CDR的诱变(Yang等人(J.Mol.Biol.(1995)254,392-403))、链改组(Marks等人(Bio/Technology(1992)10,779-783))、E.coli的诱变株的使用(Low等人(J.Mol.Biol.(1996)250,359-368))、DNA改组(Patten等人(Curr.Opin.Biotechnol.(1997)8,724-733))、噬菌体展示(Thompson等人(J.Mol.Biol.(1996)256,77-88))和有性PCR(sexualPCR)(Clameri等人(Nature(1998)391,288-291))在内的各种亲和性成熟化的公知顺序来获得。

如上所述，作为通过本发明的制备方法制作的抗原结合分子，可以列举包含Fc区的抗原结合分子，但可以使用各种改变体作为Fc区。作为本发明的改变体的一个方案，还优选列举编码抗原结合分子的多核苷酸，所述抗原结合分子具有编码这样的Fc区的改变体的多核苷酸和编码结合活性随如上选择的条件而变化的抗原结合分子的多核苷酸进行框内连接的重链。

在本发明的一个非限定性方案中，作为Fc区，例如优选列举：SEQ ID NO:13所表示的IgG1(N末端添加了Ala的AAC82527.1)、SEQID NO:14所表示的IgG2(N末端添加了Ala的AAB59393.1)、SEQ IDNO:15所表示的IgG3(CAA27268.1)、SEQ ID NO:16所表示的IgG4(N末端添加了Ala的AAB59394.1)等抗体的Fc恒定区。IgG分子的血浆中滞留性比较长(从血浆中消失慢)的原因在于：作为IgG分子的补救受体而已知的FcRn特别是人FcRn在发挥作用。通过胞饮作用进入核内体内的IgG分子在核内体内的酸性条件下与在核内体内表达的FcRn特别是人FcRn结合。无法与FcRn特别是人FcRn结合的IgG分子进入溶酶体内，在这里被分解，但与FcRn特别是人FcRn结合的IgG分子向细胞表面转移，在血浆中的中性条件下从FcRn特别是人FcRn上解离，从而再次返回到血浆中。

普通的包含Fc区的抗体在血浆中的pH中性范围条件下不具有对FcRn特别是人FcRn的结合活性，所以普通的抗体和抗体-抗原复合体通过非特异性的胞吞被摄入细胞内，在核内体内的pH酸性范围条件下与FcRn特别是人FcRn结合，从而输送到细胞表面。由于FcRn特别是人FcRn将抗体从核内体内输送到细胞表面，所以认为在细胞表面也存在一部分FcRn特别是人FcRn，但在细胞表面的pH中性范围条件下抗体从FcRn特别是人FcRn上解离，所以抗体又循环到血浆中。

本发明的抗原结合分子所能包含的、在pH中性范围具有人FcRn结合活性的Fc区可通过任意方法获得，具体而言，通过改变用作起始Fc区的人IgG型免疫球蛋白的氨基酸，可以获得在pH中性范围具有人FcRn结合活性的Fc区。作为用于改变的优选IgG型免疫球蛋白Fc区，例如可列举人IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4、以及它们的改变体)的Fc区。对于向其它氨基酸的改变，只要具有pH中性范围的人FcRn结合活性、或者提高中性范围的人FcRn结合活性，就可改变任意位置的氨基酸。在抗原结合分子包含人IgG1的Fc区作为人Fc区的情况下，优选包含带来在pH中性范围对人FcRn的结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变。作为可进行这种改变的氨基酸，例如可以列举选自EU编号221位～225位、227位、228位、230位、232位、233位～241位、243位～252位、254位～260位、262位～272位、274位、276位、278位～289位、291位～312位、315位～320位、324位、325位、327位～339位、341位、343位、345位、360位、362位、370位、375位～378位、380位、382位、385位～387位、389位、396位、414位、416位、423位、424位、426位～438位、440位和442位的至少一个氨基酸。更具体而言，例如可以列举表5中记载的氨基酸的改变。通过这些氨基酸的改变，IgG型免疫球蛋白的Fc区在pH中性范围对人FcRn的结合有所增强。

为了在本发明中使用，这些改变中，适当选择在pH中性范围也增强对人FcRn的结合的改变。作为特别优选的Fc区改变体的氨基酸，例如可以列举以EU编号表示的237位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265位、286位、289位、297位、298位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、315位、317位、332位、334位、360位、376位、380位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、424位、428位、433位、434位和436位氨基酸。通过将选自这些氨基酸的至少一个氨基酸取代成其他氨基酸，可以增强抗原结合分子所含的Fc区在pH中性范围对人FcRn的结合活性。

237位氨基酸为Met；

248位氨基酸为Ile；

252位氨基酸为Phe、Trp或Tyr中的任一个；

254位氨基酸为Thr；

255位氨基酸为Glu；

256位氨基酸为Asp、Asn、Glu或Gln中的任一个；

258位氨基酸为His；

265位氨基酸为Ala；

286位氨基酸为Ala或Glu中的任一个；

289位氨基酸为His；

297位氨基酸为Ala；

303位氨基酸为Ala；

305位氨基酸为Ala；

307位氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、或Tyr中的任一个；

309位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro或Arg中的任一个；

311位氨基酸为Ala、His或Ile中的任一个；

312位氨基酸为Ala或His中的任一个；

314位氨基酸为Lys或Arg中的任一个；

315位氨基酸为Ala、Asp或His中的任一个；

317位氨基酸为Ala；

332位氨基酸为Val；

334位氨基酸为Leu；

360位氨基酸为His；

376位氨基酸为Ala；

380位氨基酸为Ala；

382位氨基酸为Ala；

384位氨基酸为Ala；

385位氨基酸为Asp或His中的任一个；

386位氨基酸为Pro；

387位氨基酸为Glu；

389位氨基酸为Ala或Ser中的任一个；

424位氨基酸为Ala；

433位氨基酸为Lys；

434位氨基酸为Ala、Phe、His、Ser、Trp、或Tyr中的任一个；或者

436位氨基酸为His、Ile、Leu、Phe、Thr或Val。另外，对改变的氨基酸的数量没有特别限定，可以只改变一处氨基酸，也可以改变两处以上的氨基酸。作为两处以上的氨基酸的改变的组合，例如可以列举表5-1～5-33中记载的组合。

另外，作为本发明所含的Fc区，除了人IgG1(SEQ ID NO:13)、IgG2(SEQ ID NO:14)、IgG3(SEQ ID NO:15)或IgG4(SEQ ID NO:16)所表示的Fc区之外，还可以适当使用对Fcγ受体的结合活性高于与EU编号297位结合的糖链为含岩藻糖的糖链的天然型人IgG的Fc区对Fcγ受体的结合活性的FcγR结合改变Fc区。这种FcγR结合改变Fc区可以通过改变天然型人IgG的Fc区的氨基酸来制作。Fc区对FcγR的结合活性是否高于与EU编号297位结合的糖链为含岩藻糖的糖链的天然型人IgG的Fc区对FcγR的结合活性，这可以利用如上所述的方法来适当评价。

本发明中，Fc区的“氨基酸的改变”或“氨基酸改变”包括改变成与起始Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。起始Fc区的修饰改变体只要可以在pH中性范围与人Fcγ受体结合，就可使用任一种Fc区作为起始Fc区。此外，将已进行了改变的Fc区作为起始Fc区并进行进一步的改变而成的Fc区也可优选用作本发明的Fc区。起始Fc区可指多肽自身、含有起始Fc区的组合物、或编码起始Fc区的氨基酸序列。起始Fc区可包括抗体项中概述的通过重组产生的公知的Fc区。对起始Fc区的来源没有限定，可由非人动物的任意生物或人获得。优选地，作为任意生物，优选列举选自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猫、兔、狗、山羊、绵羊、牛、马、骆驼和非人灵长类的生物。在其他方案中，起始Fc区还可由食蟹猴、狨猴、恒河猴、黑猩猩或人获得。优选地，起始Fc区可由人IgG1获得，但不限于IgG的特定类别。这是指可适当使用人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区作为起始Fc区。同样，在本说明书中，是指可将来自上述任意生物的IgG的任意类或亚类的Fc区优选用作起始Fc区。天然存在的IgG变体或被操作的类型的实例记载于公知文献(Curr.Opin.Biotechnol.(2009)20(6),685-91；Curr.Opin.Immunol.(2008)20(4),460-470；Protein Eng.Des.Sel.(2010)23(4),195-202；国际公开WO2009/086320、WO2008/092117、WO2007/041635和WO2006/105338)，但不限于此。

作为改变的实例，包括一个以上的变异、例如取代成与起始Fc区的氨基酸不同的氨基酸残基的变异、或者向起始Fc区的氨基酸中插入一个以上的氨基酸残基或从起始Fc区的氨基酸中缺失一个以上的氨基酸等。优选地，改变后的Fc区氨基酸序列包含含有非天然存在的Fc区的至少一部分的氨基酸序列。这种变体与起始Fc区必然具有不足100％的序列同源性或相似性。在优选实施方案中，变体具有与起始Fc区的氨基酸序列约75％～不足100％的氨基酸序列同源性或相似性，更优选约80％～不足100％、更优选约85％～不足100％、更优选约90％～不足100％、最优选约95％～不足100％的同源性或相似性的氨基酸序列。本发明的一个非限定性方案中，起始Fc区和本发明的FcγR结合改变Fc区之间存在至少一个氨基酸的差异。起始Fc区与本发明的FcγR结合改变Fc区的氨基酸的不同还可优选通过特别是上述的以EU编号特定的氨基酸残基位置的特定氨基酸的不同来规定。

本发明的抗原结合分子所含的、对Fcγ受体的结合活性高于与EU编号297位结合的糖链为含岩藻糖的糖链的天然型人IgG的Fc区对Fcγ受体的结合活性的(FcγR结合改变Fc区)还可通过任意方法获得，具体而言，通过改变用作起始Fc区的人IgG型免疫球蛋白氨基酸可以获得该FcγR结合改变Fc区。作为用于改变的优选IgG型免疫球蛋白Fc区，例如可列举人IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4、以及它们的改变体)的Fc区。

作为可以进行这样的改变的氨基酸，例如可以例举选自以下的至少一个以上的氨基酸：以EU编号表示的221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位和440位。通过这些氨基酸的改变，可以获得对Fcγ受体的结合活性高于与EU编号297位结合的糖链为含岩藻糖的糖链的天然型人IgG的Fc区对Fcγ受体的结合活性的Fc区(FcγR结合改变Fc区)。

为了在本发明中使用，作为特别优选的改变，例如可以例举Fc区的以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸的改变：

221位氨基酸为Lys或Tyr中的任一个；

222位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

223位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个；

224位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

225位氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个；

227位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

228位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

230位氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个；

231位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

232位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

240位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

241位氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

243位氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

244位氨基酸为His；

245位氨基酸为Ala；

246位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

249位氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个；

250位氨基酸为Glu或Gln中的任一个；

251位氨基酸为Phe；

254位氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个；

255位氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个；

256位氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个；

258位氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个；

260位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

262位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个；

263位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

266位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

273位氨基酸为Phe或Ile中的任一个；

275位氨基酸为Leu或Trp中的任一个；

279位氨基酸为Ala；

281位氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

282位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

284位氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一个；

285位氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中的任一个；

286位氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一个；

288位氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一个；

291位氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中的任一个；

292位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一个；

301位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

302位氨基酸为Ile；

303位氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一个；

304位氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一个；

305位氨基酸为Glu、Ile、Thr或Tyr中的任一个；

311位氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一个；

313位氨基酸为Phe；

315位氨基酸为Leu；

317位氨基酸为Glu或Gln；

323位氨基酸为Ile；

334位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中的任一个；

336位氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一个；

337位氨基酸为Glu、His或Asn中的任一个；

376位氨基酸为Ala或Val中的任一个；

377位氨基酸为Gly或Lys中的任一个；

378位氨基酸为Asp；

379位氨基酸为Asn；

380位氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一个；

382位氨基酸为Ala或Ile中的任一个；

385位氨基酸为Glu；

392位氨基酸为Thr；

396位氨基酸为Leu；

421位氨基酸为Lys；

427位氨基酸为Asn；

428位氨基酸为Phe或Leu中的任一个；

429位氨基酸为Met；

434位氨基酸为Trp；

436位氨基酸为Ile；或者

440位氨基酸为Gly、His、Ile、Leu或Tyr中的任一个。另外，对改变的氨基酸的数量没有特别限定，可以只改变一处氨基酸，也可以改变两处以上的氨基酸。作为两处以上氨基酸的改变的组合，例如可以列举表6(表6-1～表6-3)中记载的组合。

另外，本发明中优选使用Fc区中，用作具有对特定的Fcγ受体的结合活性高于对其他Fcγ受体的结合活性的性质的Fc区(具有选择性的对Fcγ受体的结合活性的Fc区)的一个非限定性方案的、对抑制型Fcγ受体的结合活性高于对活性型Fcγ受体的结合活性(具有对抑制型Fcγ受体的选择性结合活性)的Fc区的例子，优选列举改变成以下的任意一个以上的氨基酸的Fc区：上述Fc区的以EU编号表示的238位氨基酸为Asp、或328位氨基酸为Glu。另外，作为具有对抑制型Fcγ受体的选择性结合活性的Fc区，还可以适当选择US2009/0136485或WO2012/115241中记载的Fc区或改变。

为了改变Fc区的氨基酸，可适当采用位点特异性诱变法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或重叠延伸PCR等公知的方法。此外，作为取代成天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸改变方法，还可采用多种公知的方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。例如还优选使用：包含作为终止密码子之一的UAG密码子(琥珀密码子)的互补性琥珀抑制基因tRNA上连接有非天然氨基酸而成的tRNA的无细胞翻译系统(Clover Direct(Protein Express))等。

作为本发明的改变体的一个方案，还制作编码抗原结合分子的多核苷酸，所述抗原结合分子具有编码进行了上述的氨基酸突变的Fc区的改变体的多核苷酸和编码结合活性所如上选择的条件而变化的抗原结合结构域的多核苷酸进行框内连接的重链。

根据本发明，提供抗原结合分子的制备方法，该方法包括：从导入了载体的细胞的培养液中回收抗原结合分子，所述载体有效连接有与编码Fc区的多核苷酸进行框内连接且编码结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域的多核苷酸。另外，本发明还提供抗原结合分子的制备方法，该方法包括：从导入了载体的细胞的培养液中回收抗原结合分子，所述载体有效连接有：编码在载体中预先进行了有效连接的Fc区的多核苷酸和编码结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域的多核苷酸。

在本发明的制备方法中，获得“已确认形成了免疫复合体的抗原结合结构域”后，只要可以形成该免疫复合体，就可以对该结构域进行适当的改变。另外，本发明还提供抗原结合分子的制备方法，该方法包括：从包含载体的细胞的培养液中回收抗原结合分子，所述载体包含编码具有重链的抗原结合分子的多核苷酸，所述重链是编码可形成免疫复合体且如此地进行了改变的抗原结合结构域的多核苷酸和编码进行了上述氨基酸突变的Fc区的改变体的多核苷酸在框内连接而得到的重链。

药物组合物

预料在给予针对可溶型抗原的现有的中和抗体时，抗原与抗体结合，从而使得抗原在血浆中的持续性提高。抗体通常具有长的半衰期(1周～3周)，而抗原通常具有短的半衰期(1天以下)。因此，与抗原单独存在时相比，在血浆中与抗体结合的抗原具有显著长的半衰期。其结果，通过给予现有的中和抗体，导致血浆中的抗原浓度升高。这种事例在以各种可溶型抗原为靶的中和抗体中有报道，可列举的例子有IL-6(J.Immunotoxicol.(2005)3,131-139)、淀粉样β蛋白(mAbs(2010)2(5),1-13)、MCP-1(ARTHRITIS & RHEUMATISM(2006)54,2387-2392)、铁调素(AAPS J.(2010)4,646-657)、sIL-6受体(Blood(2008)112(10),3959-64)等。有报道称，通过给予现有的中和抗体，血浆中总抗原浓度从基线起上升大约10倍～1000倍左右(上升的程度根据抗原而不同)。这里，血浆中总抗原浓度是指，作为血浆中存在的抗原总量的浓度，即以抗体结合型和抗体非结合型的抗原浓度之和来表示。不优选通过这种以可溶型抗原为靶的抗体药物来引起血浆中总抗原浓度的上升。这是由于：为了中和可溶型抗原，至少需要升高血浆中总抗原浓度的血浆中抗体浓度。即，血浆中总抗原浓度上升10倍～1000倍是指，即使是用于中和可溶型抗原的血浆中抗体浓度(即抗体给药量)，与不会引起血浆中总抗原浓度上升的情形相比也需要达到10倍～1000倍。另一方面，与现有的中和抗体相比，如果可以使血浆中总抗原浓度降低10倍～1000倍，则可以只减少相同的抗体给药量。如此说来，与现有的中和抗体相比，可以使可溶型抗原从血浆中消失以降低血浆中总抗原浓度的抗体的实用性明显高。

虽然不受特定理论的束缚，但作为本发明的包含(i)Fc区以及(ii)抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域、且可以形成包含两个以上的该抗原结合分子和两个以上的抗原结合单元的抗原的免疫复合体的抗原结合分子有可能使该抗原结合单元从血浆中消失的一个机理，例示如下所述的机理。当象sIL-6R等抗原结合单元为一单元(即同源单体)时，两分子(即两单元的抗原结合单元)的抗原与包含二价抗体结合结构域的一分子的抗体结合，一分子的抗sIL-6R抗体和包含两单元的抗原结合单元的两分子的抗原分子形成复合体。因此，如图1所示，这种抗原与抗体的复合体仅有一个Fc区(天然型IgG1的Fc区)。该复合体经由一个Fc区与一分子的FcγR或两分子的FcRn结合，所以可以认为其对这些受体的亲和性和普通的IgG抗体一样，主要是非特异性地发生向细胞内的摄入。

另一方面，象作为重链和轻链的异源复合体的二聚体的人IgA等抗原结合单元为两单元时，在该抗原结合单元中还存在两单元的抗原结合结构域所结合的表位。但是，当二价的(即一分子抗IgA抗体所含的抗原结合结构域与同一表位结合)抗IgA抗体与作为其抗原的IgA结合时，从表位的配置等方面考虑，认为一分子抗IgA抗体所含的二价的各抗原结合结构域难以与一分子的IgA分子中存在的两单元的表位分别结合。其结果，通过在与存在于一分子抗IgA抗体中的二价抗原结合结构域结合的两分子IgA中所存在的两单元的抗原结合单元上结合其他的抗IgA抗体分子，认为形成至少包含四分子(即作为抗原分子的IgA的两个分子和作为抗原结合分子的抗IgA抗体的两个分子)的抗原抗体复合体(免疫复合体)。

与包含两个以上抗原结合单元的抗原分子结合的抗体等抗原结合分子形成至少四聚体的大的免疫复合体时，该免疫复合体可以经由至少两个以上的多价Fc区通过亲合力与FcγR、FcRn、补体受体等强固结合。因此，如图7所示，该复合体被有效摄入到表达这些受体的细胞中。另一方面，如上所述，与包含一单元的抗原结合单元的(单体的)抗原分子结合等的抗原结合分子与抗原分子的免疫复合体针对这些受体的由Fc区介导的亲和性不充分，所以如图1所示该免疫复合体主要是非特异性地(与经由亲合力的结合介导的摄入相比没有效率)摄入到表达这些受体的细胞内。即，与由亲合力的结合介导的摄入相比没有效率。

作为与包含两个以上抗原结合单元的抗原分子结合的抗体等抗原结合分子，包含如pH或Ca依赖性结合等与抗原的结合随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域的抗体在血浆中形成至少包含四分子(两分子抗原和两分子抗体)以上的抗原抗体复合体(免疫复合体)的情况下，当该免疫复合体摄入到细胞内时，在离子浓度条件不同于血浆中的条件的核内体内抗原从该抗体上解离。因此，在摄入了该免疫复合体的细胞的核内体内，该免疫复合体的形成被解除。解离后的抗原在核内体内无法与FcRn结合，所以移动到溶酶体中后被分解。另一方面，认为抗原解离后的抗体在核内体内与FcRn结合后又循环到血浆中(图7)。

如上所述，认为含有针对包含两个以上抗原结合单元的多聚体抗原的天然IgG1型恒定区的pH或Ca依赖性结合抗体形成大的免疫复合体，通过亲合力可以与FcγR、FcRn、补体受体等结合时，可以选择性地只大幅加速抗原的消失。给予与人IgA结合的GA2-IgG1时，认为也形成了这种大的免疫复合体。实际上，如实施例3所示，向GA2-IgG1中导入了与小鼠FcγR的结合受损的改变的GA2-IgG1-FcγR(-)，无法象GA2-IgG1那样与单独的人IgA相比大幅加速人IgA的消失，而是显示出与单独的人IgA同等的消失。由此认为：GA2-IgG1可以大幅加速人IgA的消失的原因在于，含有作为包含两个以上抗原结合单元的多聚体抗原的人IgA和GA2-IgG1的免疫复合体通过亲合力与FcγR结合，并迅速摄入到表达FcγR的细胞中。在摄入了该免疫复合体的细胞的核内体内从该免疫复合体上解离的IgA被溶酶体分解。与此同时，在该核内体内与FcRn结合后再循环到血浆中的解离了IgA的抗体可以再次与血浆中的IgA结合。如此操作，认为大幅加速了血浆中的人IgA的消失。作为加速抗原从血浆中消失的方法，使用在pH中性范围与FcRn结合的Fc区的氨基酸改变体的方法记载在国际公开WO2011/122011中。本发明作为不使用上述改变体而加速包含两个以上抗原结合单元的多聚体抗原从血浆中消失的方法是有效的，同时如GA2-N434W中所示，通过与上述的改变体组合，可以进一步加速包含两个以上抗原结合单元的多聚体抗原从血浆中消失。另外，关于使包含两个以上抗原结合单元的多聚体抗原消失，即使在上述的血浆中以外，只要与间质液、关节液、腹水、胸水、心包液接触的细胞表达FcγR或FcRn，也可以使所述多聚体抗原从这些间质液、关节液、腹水、胸水、心包液中消失。作为这种细胞的一个非限定性方案，例示存在于间质液、关节液、腹水、胸水、心包液中的免疫细胞等。

即，本发明还涉及本发明的抗原结合分子、利用本发明的改变方法制作的抗原结合分子、或含有利用本发明的制备方法制备的抗原结合分子的药物组合物。通过给予本发明的抗原结合分子或利用本发明的制备方法制备的抗原结合分子，与普通的抗原结合分子相比，降低血浆中的抗原浓度的作用强，而且会改变被给药的生物体的免疫应答或该生物体内的药物动力学等，所以作为药物组合物有效。本发明的药物组合物可以含有药学上可接受的载体。

在本发明中，药物组合物是指通常用于疾病的治疗或预防、或者检查、诊断的药物。

本发明的药物组合物，可以利用本领域技术人员所公知的方法制成制剂。例如，可以制成和水或水以外的药学上可接受的液体的无菌溶液或悬浮液，以注射剂的形式进行胃肠外给药。例如，可以和药理学上可接受的载体或介质，具体而言，和灭菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、媒介物(vehicle)、防腐剂、粘合剂等适当组合，以通常认可的制药实施所要求的单位用量形态进行混合以制成制剂。上述制剂中的有效成分量设定为得到所指示的范围的适当容量。

用于注射的无菌组合物，可以使用注射用蒸馏水等媒介物，按照通常的制剂流程进行配制。作为注射用水溶液，例如可以列举生理盐水和等渗溶液，所述等渗溶液中含有葡萄糖或其他辅药(例如，D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠)。可以结合使用适当的助溶剂，例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非离子表面活性剂(吐温80(TM)、HCO-50等)。

作为油性液体，可以列举芝麻油、大豆油，还可以结合使用苯甲酸苄酯和/或苄醇作为助溶剂。还可以和缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液)、缓和剂(例如，盐酸普鲁卡因)、稳定剂(例如，苄醇和苯酚)、抗氧化剂混合。所制备的注射液通常填充在适当的安瓿中。

本发明的药物组合物，优选通过胃肠外进行给药。例如，给予注射剂型、经鼻给药剂型、经肺给药剂型、经皮给药型的组合物。例如，可以通过静脉注射、肌肉注射、腹腔内注射、皮下注射等进行全身或局部给药。

给药方法可以根据患者的年龄、症状而适当选择。含有抗原结合分子的药物组合物的给药量例如可以设定为：每次每1kg体重0.0001mg～1000mg的范围。或者，给药量可以是例如每位患者0.001～100000mg，但本发明未必限于上述数值。给药量和给药方法根据患者的体重、年龄、症状等而变化，本领域技术人员可以考虑上述条件，设定适当的给药量和给药方法。

本发明还提供用于本发明的方法的试剂盒，该试剂盒至少包含本发明的抗原结合分子。此外，该试剂盒还可以事先包装药学上可接受的载体、媒介物、记载了使用方法的说明书等。

本发明还涉及：用于使血浆中的包含两个以上抗原结合单元和两个以上抗原结合分子的复合体从血浆中消失的药物，该药物含有本发明的抗原结合分子或利用本发明的制备方法制备的抗原结合分子作为有效成分。

本发明还涉及疾病的治疗方法，该方法包括：向对象(患者、被测者等)给予本发明的抗原结合分子或利用本发明的制备方法制备的抗原结合分子的步骤。作为疾病的一个非限定性实例，可以列举癌症或炎症性疾病。

本发明还涉及：本发明的抗原结合分子或通过本发明的制备方法制备的抗原结合分子在制备用于使血浆中的包含两个以上抗原结合单元和两个以上抗原结合分子的复合体从血浆中消失的药物中的应用。

本发明还涉及：本发明的抗原结合分子或利用本发明的制备方法制备的抗原结合分子的用于使血浆中的包含两个以上抗原结合单元和两个以上抗原结合分子的复合体从血浆中消失的应用。

本发明还涉及：在本发明的方法中使用的本发明的抗原结合分子或利用本发明的制备方法制备的抗原结合分子。

需说明的是，本发明记载的氨基酸序列中所含的氨基酸还存在进行翻译后修饰的情况(例如，N末端的谷氨酰胺的焦谷氨酰化所致的向焦谷氨酸的修饰是本领域技术人员熟知的修饰)，勿庸赘言，这样氨基酸进行了翻译后修饰的情况也包括在本发明记载的氨基酸序列中。

需要说明的是，本说明书中引用的全部现有技术文献均作为参照而纳入本说明书中。

实施例

以下，通过实施例来具体说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限制。

[实施例1]钙依赖性地与人IgA结合的抗体的制备

(1-1)人IgA(hIgA)的制备

利用以下所述的重组技术制备作为抗原的人IgA(以下，还称作hIgA)。按照本领域技术人员所公知的方法，利用离子交换层析和凝胶过滤层析纯化hIgA，所述hIgA是通过培养含有包含H(WT)-IgA1(SEQID NO:49)和L(WT)(SEQ ID NO:50)的重组载体的宿主细胞来表达的。

(1-2)关于钙依赖性结合抗体

国际公开WO2009/125825中记载的H54/L28-IgG1是人源化抗IL-6受体抗体，Fv4-IgG1是相对于H54/L28-IgG1具有pH依赖性地与可溶型人IL-6受体结合(在中性条件下结合、在酸性条件下解离)的特性的人源化抗IL-6受体抗体。在国际公开WO2009/125825中记载的小鼠体内试验中，与给予了H54/L28-IgG1和作为抗原的可溶型人IL-6受体的混合物的组相比，在给予了Fv4-IgG1和作为抗原的可溶型人IL-6受体的混合物的组中，显示可溶型人IL-6受体的消失大幅加速。

与普通的可溶型人IL-6受体结合的抗体所结合的可溶型人IL-6受体和抗体一起通过FcRn再循环到血浆中。相对于此，pH依赖性地与可溶型人IL-6受体结合的抗体在核内体内的酸性条件下解离与抗体结合的可溶型人IL-6受体。解离了的可溶型人IL-6受体被溶酶体分解，所以可以大幅加速可溶型人IL-6受体从血浆中消失，而且pH依赖性地与可溶型人IL-6受体结合的抗体在解离可溶型人IL-6受体后通过FcRn再循环到血浆中，再循环的抗体可以再次与可溶型人IL-6受体结合。通过反复进行上述的循环(结合了抗原的抗体摄入细胞内＞抗原从抗体上解离＞抗原的分解和抗体向血浆中再循环)，一个抗体分子可以反复多次与可溶型人IL-6受体结合(图1)。

而且，如国际公开WO2011/122011所记载，H54/L28-IgG1是人源化抗IL-6受体抗体，Fv4-IgG1是相对于H54/L28-IgG1具有pH依赖性地与可溶型人IL-6受体结合(在中性条件下结合、在酸性条件下解离)的特性的人源化抗IL-6受体抗体，Fv4-IgG1-v2是相对于Fv4-IgG1在pH中性条件下与FcRn的结合增强的人源化抗IL-6受体抗体。在国际公开WO2011/122011记载的小鼠体内试验中，与给予了Fv4-IgG1和作为抗原的可溶型人IL-6受体的混合物的组相比，在给予了Fv4-IgG1-v2和作为抗原的可溶型人IL-6受体的混合物的组中，显示可溶型人IL-6受体的消失大幅加速。即，有报道称：通过增强pH依赖性地与抗原结合的抗体在pH中性条件下(pH7.4)与FcRn的结合，增强了的改变抗体可以与抗原反复结合的效果和促进抗原从血浆中消失的效果进一步提高，通过给予该抗体，可以使抗原从血浆中消失(图2)。

在图1和图2所示的pH依赖性地与抗原结合的抗体所产生的作用中，充分利用抗体的下述性质：利用血浆中与核内体内的环境的不同、即pH的不同(血浆中：pH7.4、核内体内：pH6.0)，在血浆中与抗原强力结合，而在核内体内解离抗原。为了在血浆中和核内体内pH依赖性地结合的抗体的抗原结合能力上充分利用这种差异，血浆中和核内体内的环境因素的性质及其差异的大小较为重要。pH的不同即为氢离子浓度的不同。即，由于pH7.4的血浆中的氢离子浓度为约40nM，而pH6.0的核内体内的氢离子浓度为约1000nM，所以被认为是血浆中和核内体内的环境因素之一的氢离子浓度的差异为约25倍的大小。

而且，为了以不同的形式或者合并这些形式来实现图1和图2所示的作用，认为除了利用血浆中和核内体内的氢离子浓度的差异以外，还可以使用依赖于该差异大的环境因素而与抗原结合的抗体。研究了在血浆中和核内体内浓度差异大的环境因素，结果发现了钙。血浆中的离子化钙浓度为1.1-1.3mM左右，而核内体内的离子化钙浓度为3μM左右，由此发现：被认为是血浆中和核内体内的环境因素之一的钙离子浓度的差异为约400倍大小，其大小比氢离子浓度差(25倍)大。即，认为通过使用在高钙浓度条件下(1.1-1.3mM)与抗原结合、而在低钙浓度条件下(3μM)解离抗原的离子化钙浓度依赖性地与抗原结合的抗体，可以和pH依赖性地与抗原结合的抗体同等或其以上地在核内体内从抗体上解离抗原。

(1-3)与hIgA结合的抗体的表达和纯化

GA1-IgG1(重链SEQ ID NO:37、轻链SEQ ID NO:38)、GA2-IgG1(重链SEQ ID NO:39、轻链SEQ ID NO:40)是与hIgA结合的抗体。按照本领域技术人员所公知的方法，将编码GA1-IgG1(重链SEQ ID NO:37、轻链SEQ ID NO:38)和GA2-IgG1(重链SEQ ID NO:39、轻链SEQ ID NO:40)的DNA序列插入动物细胞表达用质粒中。抗体的表达采用以下方法来进行。将来自人胚肾细胞的FreeStyle293-F株(Invitrogen)悬浮于FreeStyle 293 Expression Medium培养基(Invitrogen)中，将所得的细胞悬浮液以1.33×10⁶个/mL的细胞密度在6孔板的各孔中分别接种3mL。接下来，将利用脂质转染法制备的质粒导入细胞中。该细胞在CO₂培养箱(37℃、8％CO₂、90rpm)中培养4天，按照本领域技术人员公知的方法，使用rProtein A Sepharose^TMFastFlow(Amersham Biosciences)，从分离的培养上清中纯化抗体。使用分光光度计测定已纯化的抗体溶液的吸光度(波长：280nm)。通过PACE法由所得的测定值算出吸光系数，使用该吸光系数算出抗体浓度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。

(1-4)所获得的抗体对hIgA的钙依赖性结合能力的评价

使用Biacore T200(GE Healthcare)，评价(1-3)中分离的抗体的hIgA结合活性(解离常数K_D(M))。使用含有3μM或1.2mM的CaCl₂的0.05％tween20、20mmol/L的ACES、150mmol/L的NaCl(pH7.4或pH5.8)、或者含有0.1μM或10mM的CaCl₂的0.05％tween20、20mmol/L的ACES、150mmol/L的NaCl(pH8.0)作为运行缓冲液进行测定。

使抗体与通过胺偶联法固定有适当量的重组型蛋白A/G(ThermoScientific)的传感器芯片CM5(GEHealthcare)结合。接下来，通过注射作为分析物的适当浓度的hIgA(记载在(1-1)中)，使hIgA与传感器芯片上的抗体发生相互作用。在37℃下进行测定。测定后，通过注射10mmol/L的甘氨酸-HCl(pH1.5)，使传感器芯片再生。使用BiacoreT200评估软件(GE Healthcare)，通过曲线拟合分析和平衡值分析，由测定结果算出解离常数K_D(M)。其结果见表7。另外，得到的传感图见图3。结果显示：GA2-IgG1在1.2mM的Ca²⁺浓度下与hIgA强力结合，而在3μM的Ca²⁺浓度下与hIgA微弱结合。还显示：GA2-IgG1在1.2mM的Ca²⁺浓度条件下，在pH7.4下与人IgA强力结合、但在pH5.8下与人IgA微弱结合。即，可知GA2-IgG1与人IgA进行pH依赖性和钙依赖性结合。

[表7]

[实施例2]钙依赖性地与hIgA结合的抗体的改变体的制备

进而，为了进一步加速抗原(hIgA)从血浆中消失，制作了向钙依赖性地与hIgA结合的GA2-IgG1中导入N434W的氨基酸取代以增强在pH7.4下与小鼠FcRn的结合的GA2-N434W(重链SEQ ID NO:41、轻链SEQ ID NO:40)。另外，制作了向GA2-IgG1中导入L235R、S239K的氨基酸取代以缺乏对FcγR的结合的GA2-FcγR(-)(重链SEQ ID NO:42、轻链SEQ ID NO:40)。使用按照本领域技术人员所公知的方法插入有编码GA2-N434W(重链SEQ ID NO:41、轻链SEQ ID NO:40)和GA2-FcγR(-)(重链SEQ ID NO:42、轻链SEQ ID NO:40)的DNA序列的动物表达用质粒，纯化后测定按照上述方法进行表达的这些抗体改变体的浓度。评价GA2-FcγR(-)对各种小鼠FcγR(mFcγRI、mFcγRII、mFcγRIII、mFcγRIV)的结合，结果确认了与所有受体均未结合。

[实施例3]使用正常小鼠评价Ca依赖性hIgA结合抗体对抗原的血浆中滞留性的影响

(3-1)使用正常小鼠的体内试验

对正常小鼠(C57BL/6J小鼠、Charles River Japan)单独给予hIgA(人IgA：实施例1中制作)、或同时给予hIgA和hIgA抗体后，评价hIgA和抗hIgA抗体的体内动力学。以10mL/kg的用量向尾静脉单次给予hIgA溶液(80μg/mL)、或hIgA和抗hIgA抗体的混合溶液。抗hIgA抗体使用上述的GA1-IgG1、GA2-IgG1、GA2-N434W和GA2-FcγR(-)。

混合溶液中的hIgA浓度均为80μg/mL，但每种抗体的抗hIgA抗体浓度根据各抗体与hIgA的亲和性而不同，GA1-IgG1制备成10mg/mL、GA2-IgG1制备成2.69mg/mL、GA2-N434W制备成1mg/mL、GA2-FcγR(-)制备成2.69mg/mL。此时，由于相对于hIgA过剩存在足够量的抗hIgA抗体，所以认为大部分的hIgA与抗体结合。给药后5分钟、7小时、1天、2天、3天、7天从小鼠体内进行采血。采集的血液立即在4℃、12,000rpm下离心分离15分钟，从而得到血浆。分离的血浆在实施测定前保存在设定为-20℃以下的冷库中。

(3-2)利用ELISA法测定正常小鼠血浆中的抗hIgA抗体浓度

利用ELISA法测定小鼠血浆中的抗hIgA抗体浓度。首先，将各孔中分别注入有抗体的抗人IgG(γ-链特异性)F(ab’)2片段(SIGMA)的Nunc-Immuno板,MaxiSoup(Nalge nunc International)在4℃下静置一夜，由此制作抗人IgG固相化板。将作为血浆中浓度标准液的制备成0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.01563、0.07813μg/mL的抗hIgA抗体的标准曲线样品和稀释了100倍以上的小鼠血浆测定样品分别注入上述的抗人IgG固相化板中，之后将该板在25℃下培养1小时。之后，在上述板的各孔中分别注入山羊抗人IgG(γ链特异性)生物素(BIOT)缀合物(Southern Biotechnology Associats Inc.)后，使该板在25℃下反应1小时。进而，在上述板的各孔中分别注入链霉亲和素-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)后，使该板在25℃下反应1小时。使用1N的硫酸(Showa Chemical)来停止以TMB单组份HRP微孔底物(BioFX Laboratories)作为底物的显色反应，之后使用酶标仪测定各孔的反应液在450nm的吸光度。使用分析软件SOFTmaxPRO(Molecular Devices)由标准曲线的吸光度算出小鼠血浆中的抗hIgA抗体浓度。通过该方法测定的静脉内给药后的正常小鼠血浆中的GA1-IgG1、GA2-IgG1、GA2-N434W和GA2-FcγR(-)的抗体浓度变化见图4。

(3-3)利用ELISA法测定血浆中hIgA浓度

利用ELISA法测定小鼠血浆中的hIgA浓度。首先，将各孔中分别注入有山羊抗人IgA抗体(BETHYL)的Nunc-Immuno板,MaxiSoup(Nalge nunc International)在4℃下静置一夜，由此制作抗人IgA固相化板。在上述的抗人IgA固相化板中分别注入各100μL的作为血浆中浓度标准液的制备成0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μg/mL的hIgA的标准曲线样品和稀释了100倍以上的小鼠血浆测定样品，之后再分别注入200μL500ng/mL的hsIL-6R，之后将该板在室温下静置1小时。接下来，在上述板的各孔中分别注入生物素化的抗人IL-6R抗体(R&D)，之后使该板在室温下反应1小时。再向上述板的各孔中分别注入链霉亲和素-PolyHRP80(Stereospecific DetectionTechnologies)，之后使该板在室温下反应1小时。使用1N的硫酸(Showa Chemical)来停止以TMB单组份HRP微孔底物(BioFXLaboratories)为底物的显色反应，之后使用酶标仪测定各孔的反应液在450nm的吸光度。使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)由标准曲线的吸光度算出小鼠血浆中浓度。通过该方法测定的静脉内给药后正常小鼠血浆中的hIgA浓度变化见图5。

其结果，相对于hIgA单独消失，同时给予hIgA和作为Ca依赖性结合弱(依赖性程度小)的抗体的GA1-IgG1时hIgA的消失变慢。相对于此，同时给予hIgA和具有100倍以上的Ca依赖性结合活性的GA2-IgG1时，与单独的hIgA相比，hIgA的消失大幅加速。由图4所示的血浆中抗体浓度、图5所示的血浆中hIgA浓度和表7所示的各抗体的KD值求出存在于血浆中的非结合型hIgA浓度。其结果见图6。如图6所示，与GA1-IgG1给药组的非结合型抗原(hIgA)浓度相比，钙依赖性地与hIgA结合的GA2-IgG1给药组的非结合型抗原(hIgA)的浓度低，由此显示：通过使用钙依赖性结合抗体来加速抗原的消失，可以降低未与抗体结合的(抗体非结合型)抗原(hIgA)。而且，在pH7.4下FcRn结合增强的GA2-N434W与GA2-IgG1相比更快地使抗原消失，血浆中的hIgA浓度在给药7小时后达到检测限以下。

[实施例4]pH依赖性的抗IgE抗体的获得

(4-1)抗人IgE抗体的获得

为了获得pH依赖性的抗人IgE抗体，使用FreeStyle293(LifeTechnologies)来表达作为抗原的人IgE(重链SEQ ID NO:43、轻链SEQID NO:44)(可变区包含抗人磷脂酰肌醇聚糖3抗体)。表达后的人IgE通过本领域技术人员公知的普通的柱层析法进行纯化、制备。

从获得的多个抗体中，选择pH依赖性地与人IgE结合、且形成包含两分子的抗IgE抗体和两分子的IgE以上的大的免疫复合体的抗体。使用人IgG1重链恒定区和人轻链恒定区来表达、纯化所选择的抗人IgE抗体。所制作的抗体命名为克隆278(重链SEQ ID NO:45、轻链SEQ ID NO:46)。

(4-2)抗人IgE抗体的结合活性和pH依赖性结合活性的评价

在核内体内可以解离抗原的抗体不仅可以通过pH依赖性地与抗原结合来研制，还可以通过Ca依赖性地与抗原结合来研制。因此，评价克隆278和作为对照的不具有pH/Ca依赖性IgE结合能力的Xolair(奥马珠单抗,Novartis)对人IgE(hIgE)的pH依赖性结合能力和pH/Ca依赖性结合能力。

即，使用Biacore T200(GEHealthcare)评价克隆278和Xolair对hIgE的结合活性(解离常数K_D(M))。使用以下3种作为运行缓冲液来进行测定。

·1.2mmol/l的CaCl₂/0.05％的tween20、20mmol/l的ACES、150mmol/l的NaCl，pH7.4；

·1.2mmol/l的CaCl₂/0.05％的tween20、20mmol/l的ACES、150mmol/l的NaCl，pH5.8；

·3μmol/l的CaCl₂/0.05％的tween20、20mmol/l的ACES、150mmol/l的NaCl，pH5.8。

利用链霉亲和素与生物素的亲和性，将适量添加的来自化学合成人磷脂酰肌醇聚糖3蛋白的序列(SEQ ID NO:47)的C末端存在的Lys上添加了生物素的肽(以下记作“生物素化GPC3肽”)固定在传感器芯片SA(GE Healthcare)上。注射适当浓度的人IgE，将其捕捉到生物素化GPC3肽上，由此将人IgE固定在芯片上。注射作为分析物的适当浓度的克隆278，使其与传感器芯片上的人IgE发生相互作用。之后，注射10mmol/L的甘氨酸-HCl(pH1.5)，使传感器芯片再生。相互作用均在37℃下进行测定。使用Biacore T200评估软件(GE Healthcare)，通过曲线拟合分析测定结果，算出结合速度常数ka(1/Ms)和解离速度常数kd(1/s)。根据这些常数算出解离常数K_D(M)。算出pH5.8、1.2mMCa条件和pH7.4、1.2mMCa条件下的各抗体的KD比，评价pH依赖性结合，再算出pH5.8、3μM Ca条件和pH7.4、1.2mM Ca条件下的各抗体的KD比，评价pH/Ca依赖性结合。其结果见表8。

[表8]

(4-3)克隆278的免疫复合体的形成评价

通过凝胶过滤层析评价：克隆278和人IgE在中性条件下(pH7.4)以2：2以上形成大的免疫复合体、以及该免疫复合体在酸性条件下(pH5.8)解离。对于用100mM的NaCl进行了透析处理的克隆278，用20mM Tris-HCl、150mM NaCl、1.2mM CaCl₂(pH7.4)的缓冲液稀释，作为中性条件下的样品；用20mM Bis-tris-HCl、150mM NaCl、3μMCaCl₂(pH5.8)的缓冲液稀释，作为酸性条件下的样品。将100μg/mL(0.60μM)的(实施例5中制作的)作为人IgE的hIgE(Asp6)和克隆278以1:1、1:6的摩尔比混合，将所得混合液在室温或25℃自动进样器中放置2小时以上，之后通过凝胶过滤层析进行分析。在中性条件下使用20mM Tris-HCl、300mM NaCl、1.2mM CaCl₂(pH7.4)的流动相，在酸性条件下使用20mM Bis-tris-HCl、300mM NaCl、3uM CaCl₂(pH5.8)的流动相。柱使用G4000SWxl(TOSOH)，在流速为0.5mL/分钟、25℃的条件下进行分析。其结果见图9。如图9所示，确认到克隆278和人IgE在中性条件下形成了由包含表观分子量为670kDa左右(假定一分子抗体为单体的情况下)的四聚体及其以上的多聚体构成的大的免疫复合体。而且，在酸性条件下没有确认到这样的免疫复合体，由此确认：与上述的使用Biacore的结合评价一样，这些免疫复合体pH依赖性地解离。

由上述结果认为：克隆278和上述的作为抗IgA抗体的GA2-IgG1一样可以加速人IgE的消失。

[实施例5]克隆278和Xolair的体内评价

(5-1)体内评价用的人IgE(hIgE(Asp6))的制备

按照与实施例1相同的方法制备由重链(SEQ ID NO:48)和轻链(SEQ ID NO:44)构成的体内评价用的人IgE即hIgE(Asp6)(可变区为抗人磷脂酰肌醇聚糖3抗体)。hIgE(Asp6)是将人IgE的6处N型糖链结合位点的天冬酰胺改变成天冬氨酸而得到的分子，以使人IgE的N型糖链的异质性不受作为抗原的人IgE的血浆中浓度变化的影响。

(5-2)使用正常小鼠验证克隆278和Xolair加速人IgE消失的效果

评价对C57BL/6J小鼠(Charles river Japan)单独给予hIgE(Asp6)、或者同时给予hIgE(Asp6)和抗hIgE抗体(克隆278和Xolair)后的hIgE(Asp6)和抗人IgE抗体的体内动力学。按10mL/kg从尾静脉单次给予hIgE(Asp6)(20μg/mL)或者hIgE(Asp6)和抗人IgE抗体的混合溶液(浓度记载在表9中)。此时，由于相对于hIgE(Asp6)过剩存在足够量的各抗体，所以认为hIgE(Asp6)几乎全部与抗体结合。给药后5分钟、2小时、7小时、1天、2天、4天或5天、7天、14天、21天、28天从该小鼠体内采血。采集的血液立即在4℃、15,000rpm下离心分离5分钟，得到血浆。分离的血浆在实施测定前保存在设定为-20℃以下的冷库中。

[表9]

(5-3)正常小鼠的血浆中hIgE(Asp6)浓度的测定

利用ELISA法测定小鼠血浆中hIgE(Asp6)浓度。制备以血浆中浓度计为192、96、48、24、12、6、3ng/mL的标准曲线样品。为了使hIgE(Asp6)和抗hIgE抗体的免疫复合体变得均匀，在标准曲线和小鼠血浆测定样品中添加Xolair(Novartis)使达到10μg/mL，在室温下静置30分钟。将静置后的标准曲线和小鼠血浆测定样品分别注入固定有抗人IgE的免疫板(MABTECH)或者固定有抗人IgE(克隆107、MABTECH)的免疫板(Nunc F96微孔板(Nalge nunc International))中，在室温下静置2小时或者在4℃下静置一夜。之后，使人GPC3核心蛋白(SEQ ID NO:51)、用NHS-PEG4-生物素(Thermo Fisher Scientific)进行了生物素化的抗GPC3抗体(公司内制备)、链霉亲和素-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)分别依次反应1小时。利用下述方法测定小鼠血浆中浓度：使用1N的硫酸(ShowaChemical)来停止以TMB单组份HRP微孔底物(BioFX Laboratories)作为底物的显色反应，之后使用酶标仪测定该显色在450nm的吸光度的方法；或者以SuperSignal(r)ELISA Pico化学发光底物(Thermo FisherScientific)作为底物进行发光反应，再使用酶标仪测定发光强度的方法。使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)，由标准曲线的吸光度或发光强度算出小鼠血浆中浓度。通过该方法测定的静脉内给药后的血浆中hIgE(Asp6)浓度变化见图11。

(5-4)正常小鼠的血浆中抗人IgE抗体浓度的测定

利用ELISA法测定小鼠血浆中的抗hIgE抗体浓度。制备以血浆中浓度计为0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μg/mL的标准曲线样品。为了使hIgE(Asp6)和抗hIgE抗体的免疫复合体变得均匀，在标准曲线和小鼠血浆测定样品中添加hIgE(Asp6)使其达到1μg/mL，在室温下静置30分钟。将静置后的标准曲线和小鼠血浆测定样品分别注入固定有抗人Kappa轻链抗体(Bethyl Laboratories)的免疫板(Nunc-Immuno Plate,MaxiSorp(Nalge nunc International))中，在室温下静置2小时或者在4℃下静置一夜。之后，使兔抗人IgG(Fc)二次抗体、生物素缀合物(Pierce Biotechnology)和链霉亲和素-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)分别依次反应1小时。使用1N的硫酸(Showa Chemical)来停止以TMB单组份HRP微孔底物(BioFX Laboratories)作为底物的显色反应，之后通过使用酶标仪测定该显色在450nm的吸光度的方法测定小鼠血浆中浓度。使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)，由标准曲线的吸光度算出小鼠血浆中浓度。通过该方法测定的静脉内给药后的血浆中抗体浓度变化见图10。

其结果，相对于人IgE单独消失，同时给予人IgE和作为对照抗IgE抗体的Xolair时，人IgE的消失变慢。相对于此，同时给予人IgE和具有强pH依赖性结合活性的克隆278时，确认到人IgE的消失与单独的人IgE相比大幅加速。即，不仅在是IgA中，在IgE中通过给予形成大的免疫复合体的抗体，与抗原单独相比也显示出加速抗原的消失。

[实施例6]钙依赖性地与hIgA结合的抗体的改变体的制备

接下来，为了进一步加速抗原(hIgA)从血浆中消失，相对于钙依赖性地与hIgA结合的GA2-IgG1，制作了将GA2-IgG1的以EU编号表示的328位Leu取代成Tyr以增强对小鼠FcγR的结合的GA2-F1087(重链SEQ ID NO:52)。使用按照本领域技术人员所公知的方法插入了编码GA2-F1087(重链SEQ ID NO:52、轻链SEQ ID NO:40)的DNA序列的动物表达用质粒，纯化后测定通过上述方法表达的这些抗体改变体的浓度。如参考实施例5所示，包含该改变的抗体对小鼠FcγR的结合大幅增强。

[实施例7]评价在给予了Ca依赖性hIgA结合抗体的正常小鼠中对抗原的血浆中滞留性的影响

(7-1)使用正常小鼠的体内试验

对正常小鼠(C57BL/6J小鼠、Charles River Japan)单独给予hIgA(人IgA：实施例(1-1)中制作)、或者同时给予hIgA和抗hIgA抗体后，评价hIgA和抗hIgA抗体的体内动力学。按10mL/kg的用量对尾静脉单次给予hIgA溶液(80μg/mL)、或hIgA和抗hIgA抗体的混合溶液。抗hIgA抗体使用上述的GA2-IgG1和GA2-F1087。

混合溶液中的hIgA浓度均为80μg/mL，抗hIgA抗体浓度为2.69mg/mL。此时，由于相对于hIgA过剩存在足够量的抗hIgA抗体，所以认为大部分的hIgA与抗体结合。在给予了GA-IgG1的组中，给药后5分钟、7小时、1天、2天、3天、7天从小鼠体内进行采血。另外，在给予了GA-F1087的组中，给药后5分钟、30分钟、1小时、2小时、1天、3天、7天从小鼠体内进行采血。采集的血液立即在4℃、12,000rpm下离心分离15分钟，从而得到血浆。分离的血浆在实施测定前保存在设定为-20℃以下的冷库中。

(7-2)利用ELISA法测定正常小鼠血浆中的抗hIgA抗体浓度

利用ELISA法测定小鼠血浆中的抗hIgA抗体浓度。首先，将各孔中分别注入了抗体的抗人IgG(γ链特异性)F(ab’)2片段(SIGMA)的Nunc-Immuno板,MaxiSorp(Nalge nunc International)在4℃下静置一夜，从而制作抗人IgG固相化板。向上述的抗人IgG固相化板中分别注入作为血浆中浓度标准液的制备成0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.01563、0.007813μg/mL的抗hIgA抗体的标准曲线样品和稀释了100倍以上的小鼠血浆测定样品，之后将该板在25℃下培养1小时。之后，在上述板的各孔中分别注入山羊抗人IgG(γ链特异性)生物素(BIOT)缀合物(Southern Biotechnology Associats Inc.)，之后使该板在25℃下反应1小时。再向上述板的各孔中分别注入链霉亲和素-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)，之后使该板在25℃下反应1小时。使用1N的硫酸(Showa Chemical)来停止以TMB单组份HRP微孔底物(BioFX Laboratories)作为底物的显色反应，之后使用酶标仪测定各孔的反应液在450nm的吸光度。使用分析软件SOFTmaxPRO(Molecular Devices)，由标准曲线的吸光度算出小鼠血浆中的抗hIgA抗体浓度。通过该方法测定的静脉内给药后的正常小鼠血浆中的GA2-IgG1和GA2-F1087的抗体浓度变化见图12。其结果，确认到：即使与hIgA具有强的pH和Ca依赖性结合活性的克隆GA2-IgG1增强了与FcγR的结合，但其血浆中抗体浓度也没有大幅下降。

(7-3)利用ELISA法测定血浆中hIgA浓度

利用ELISA法测定小鼠血浆中的hIgA浓度。首先，将各孔中分别注入有山羊抗人IgA抗体(BETHYL)的Nunc-Immuno板MaxiSoup(Nalge nunc International)在4℃下静置一夜，从而制作抗人IgA固相化板。使用制备成0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μg/mL的hIgA的标准曲线样品作为血浆中浓度的标准液。向各100μL的标准曲线样品和稀释了100倍以上的小鼠血浆测定样品中加入200μL500ng/mL的hsIL6R进行混合，在室温下静置1小时。之后，将分别注入了100μL混合溶液的上述抗人IgA固相化板板在室温下静置1小时。接下来，在上述板的各孔中分别注入生物素化的抗人IL-6R抗体(R&D)，之后使该板在室温下反应1小时。再向上述板的各孔中分别注入链霉亲和素-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)后，使该板在室温下反应1小时。使用1N的硫酸(Showa Chemical)来停止以TMB单组份HRP微孔底物(BioFX Laboratories)作为底物的显色反应，之后使用酶标仪测定各孔的反应液在450nm的吸光度。使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)，由标准曲线的吸光度算出小鼠血浆中浓度。通过该方法测定的静脉内给药后的正常小鼠血浆中的hIgA浓度变化见图13。

其结果，相对于hIgA单独消失，在同时给予了hIgA和具有100倍以上的Ca依赖性结合活性的GA2-IgG1的小鼠中，与hIgA单独相比hIgA的消失加速。而且，在给予了hIgA和对FcγR的结合增强的GA2-F1087的小鼠的血浆中，给药一天后hIgA浓度低于测定范围(0.006μg/mL以上)，与给予了GA-IgG1的小鼠的血浆中相比，hIgA的消失大幅加速。以上结果显示：在给予了形成免疫复合体的hIgA和抗hIgA抗体的小鼠中，对FcγR的结合增强的抗体所产生的从血浆中除去抗原(hIgA)的效果与作为对FcγR的结合增强的抗体基础的抗体所产生的抗原(hIgA)除去效果相比增强。

[实施例8]pH依赖性地与人IgE结合的抗体的改变体的制备

接下来，为了进一步加速抗原(人IgE)从血浆中消失，按照本领域技术人员所公知的方法将编码278-F1087(重链SEQ ID NO:53、轻链SEQ ID NO:46)的DNA序列插入动物表达用质粒中，所述278-F1087是将278-IgG1的以EU编号表示的328位Leu取代成Tyr，以相对于pH依赖性地与人IgE结合的278-IgG1增强与小鼠FcγR的结合。使用导入了该质粒的动物细胞，在其纯化后测定通过上述方法表达的这些抗体改变体的浓度。

[实施例9]278-IgG1的体内评价

(9-1)体内评价用的人IgE(hIgE(Asp6))的制备

利用与实施例(5-1)中记载的方法相同的方法，制备了作为体内评价用人IgE的hIgE(Asp6)(可变区为抗人磷脂酰肌醇聚糖3抗体)。hIgE(Asp6)是将人IgE的6处N型糖链结合位点的天冬酰胺改变成天冬氨酸而得到的分子，使人IgE的N型糖链的异质性不受作为抗原的人IgE的血浆中浓度变化的影响。

(9-2)给予了克隆278的正常小鼠血浆中人IgE的消失加速效果的验证

实施例7中显示：给予了pH依赖性地与作为抗原的人IgA结合并增强了对小鼠FcγR的结合的分子的小鼠血浆中抗原浓度大幅降低。增强了对小鼠FcγR的结合时，为了对是否同样观察到给予了pH依赖性地与人IgA以外的抗原结合并增强对小鼠FcγR的结合的抗体的生物体血浆中的可溶型抗原的消失效果进行进一步的验证，重新进行使用以人IgE作为抗原的抗体的试验。

对C57BL/6J小鼠(Charles river Japan)单独给予hIgE(Asp6)、或者同时给予hIgE(Asp6)和抗hIgE抗体(278-IgG1和278-F1087)后，评价hIgE(Asp6)和抗人IgE抗体的体内动力学。按10mL/kg从尾静脉单次给予hIgE(Asp6)(20μg/mL)或者hIgE(Asp6)和抗人IgE抗体的混合溶液(浓度如表10所记载，所有抗体均制备成相同浓度)。此时，由于相对于hIgE(Asp6)过剩存在足够量的各抗体，所以认为hIgE(Asp6)几乎全部与抗体结合。在给予了克隆278(278-IgG1)的组中，给药后5分钟、2小时、7小时、1天、2天、4天、5天、7天、14天、21天从该小鼠体内采血。在给予了278-F1087的组中，给药后5分钟、30分钟、1小时、2小时、1天、3天、7天、14天、21天从该小鼠体内采血。另外，采集的血液立即在4℃、15,000rpm下离心分离5分钟，以得到血浆。分离的血浆在实施测定前保存在设定为-20℃以下的冷库中。

[表10]

(9-3)正常小鼠血浆中的抗人IgE抗体浓度的测定

利用ELISA法测定小鼠血浆中的抗hIgE抗体浓度。制备以血浆中浓度计为0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μg/mL的标准曲线样品。为了使hIgE(Asp6)和抗hIgE抗体的免疫复合体变得均匀，向标准曲线和小鼠血浆测定样品中添加hIgE(Asp6)使其达到1μg/mL，将278-hIgG1给药组和对应的标准曲线样品在室温下静置30分钟。另外，将278-F1087给药组和对应的标准曲线样品在37℃下搅拌一夜。将静置或者搅拌后的标准曲线和小鼠血浆测定样品分别注入固定有抗人Kappa轻链抗体(Bethyl Laboratories)的免疫板(Nunc-Immuno板,MaxiSorp(Nalge nunc International))中，在室温下静置搅拌2小时(278-F1087给药组的样品和278-F1087的标准曲线样品)或者在4℃下静置一夜(278-hIgG1给药组的样品和278-hIgG1的标准曲线样品)。之后，使兔抗人IgG(Fc)二次抗体、生物素缀合物(PierceBiotechnology)和链霉亲和素-Poly HRP80(Stereospecific DetectionTechnologies)分别依次反应1小时。使用1N的硫酸(Showa Chemical)来停止以TMB单组份HRP微孔底物(BioFX Laboratories)作为底物的显色反应。之后通过使用酶标仪测定该显色在450nm的吸光度的方法测定小鼠血浆中浓度。使用分析软件SOFTmax PRO(MolecularDevices)，由标准曲线的吸光度算出小鼠血浆中浓度。通过该方法测定的静脉内给药后的血浆中抗体浓度变化见图14。其结果，确认到：在给予了对人IgE具有强的pH依赖性结合活性的278-IgG1与FcγR的结合增强了的改变体的小鼠中，该小鼠血浆中的抗体浓度与278-IgG1的浓度相比也大幅下降。

(9-4)正常小鼠血浆中的hIgE(Asp6)浓度的测定

利用ELISA法测定小鼠血浆中hIgE(Asp6)浓度。制备以血浆中浓度计为192、96、48、24、12、6、3ng/mL的标准曲线样品。为了使hIgE(Asp6)与抗hIgE抗体的免疫复合体变得均匀，在给予了278-hIgG1的组的标准曲线和小鼠血浆测定样品中，添加Xolair(Novartis)使其达到10μg/mL，在室温下静置30分钟。在给予了278-F1087的组的标准曲线和小鼠血浆测定样品中，添加278-F1022(重链SEQ ID NO:54、轻链SEQ ID NO:46，与实施例8同样制备)或者278-F760(重链SEQ IDNO:55、轻链SEQ ID NO:46，与实施例8同样制备)使其达到20μg/mL，在37℃下搅拌60小时。将小鼠血浆测定样品分别注入固定有抗人IgE的免疫板(MABTECH)或者固定有抗人IgE(克隆107、MABTECH)的免疫板(Nunc F96微孔板(Nalge nunc International))中，在室温下静置或者搅拌2小时或者在4℃下静置一夜。之后，使人GPC3核心蛋白(SEQ ID NO:51)、用NHS-PEG4-生物素(Thermo Fisher Scientific)进行了生物素化的GPC3抗体(公司内制备)、链霉亲和素-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)分别依次反应1小时。通过下述方法测定小鼠血浆中浓度：使用1N的硫酸(Showa Chemical)来停止以TMB单组份HRP微孔底物(BioFX Laboratories)作为底物的显色反应，之后使用酶标仪测定该显色在450nm的吸光度的方法；或者，以SuperSignal(r)ELISA Pico化学发光底物(Thermo Fisher Scientific)为底物进行发光反应，使用酶标仪测定发光强度的方法。使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)，由标准曲线的吸光度或发光强度算出小鼠血浆中浓度。通过该方法测定的静脉内给药后的血浆中hIgE(Asp6)浓度变化见图15。

其结果，相对于人IgE单独消失，在同时给予了具有强pH依赖性结合活性的278-IgG1和人IgE的小鼠中，人IgE的消失与人IgE单独相比加速。而且，在给予了相对于278-IgG1而言与FcγR的结合增强的278-F1087和人IgE的小鼠中，人IgE的消失与单独给予人IgE和给予278-IgG1和人IgE的小鼠相比大幅加速。即，在不仅给予了以上所述的与FcγR的结合增强的抗IgA抗体、还给予了与FcγR的结合增强的抗IgE抗体的小鼠中，也显示出抗原的消失加速。以上结果显示：在形成免疫复合体的hIgA与抗hIgA抗体的组合以及hIgE与抗hIgE抗体的组合中，通过增强与FcγR的结合，可以进一步加速抗原的消失。

[实施例10]钙依赖性地与hIgA结合的抗体的改变体的制备

接下来，为了加速抗原(hIgA)从血浆中消失，制作相对于钙依赖性地与hIgA结合的GA2-IgG1而言对小鼠FcRn的结合增强的改变体。首先，为了降低Fc区与FcγR的结合，制作了GA2-IgG1的以EU编号表示的235位Leu被取代成Arg、239位Ser被取代成Lys的GA2-F760(重链SEQ ID NO:57)。而且，将GA2-F760的以EU编号表示的236位Gly取代成Arg、252位Met取代成Tyr、254位Ser取代成Thr、256位Thr取代成Glu、434位Asn取代成Tyr、436位Tyr取代成Val、438位Gln取代成Arg、440位Ser取代成Glu，制作了与GA2-F760相比在pH7.4下与FcRn更强地结合的改变体即GA2-F1331。使用按照本领域技术人员所公知的方法插入了编码GA2-F760(重链SEQ ID NO:57、轻链SEQ ID NO:40)和GA2-F1331(重链SEQ ID NO:56、轻链SEQ ID NO:40)的DNA序列的动物表达用质粒，纯化后测定通过上述方法表达的这些抗体改变体的浓度。测定了GA2-F760对小鼠FcγR(mFcγRI、mFcγRII、mFcγRIII和mFcγRIV)的结合活性。其结果，GA2-F760没有显示出与小鼠FcγR显著结合。

[实施例11]评价在给予了Ca依赖性hIgA结合抗体的人FcRn转基因小鼠中对抗原的血浆中滞留性的影响

(11-1)使用人FcRn转基因小鼠的体内试验

对人FcRn转基因小鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg种系32+/+小鼠、Jackson Laboratories、Methods Mol Biol.(2010)602,93-104)单独给予hIgA(人IgA：实施例(1-1)中制作)、或者同时给予hIgA和抗hIgA抗体后，评价hIgA和抗hIgA抗体的体内动力学。按10mL/kg的用量对尾静脉单次给予hIgA溶液(80μg/mL)、或hIgA和抗hIgA抗体的混合溶液。作为所给予的抗hIgA抗体，使用上述的GA2-IgG1、GA2-F760和GA2-F1331中的任一种。

混合溶液中的hIgA浓度均为80μg/mL，抗hIgA抗体浓度为2.69mg/mL。此时，由于相对于hIgA过剩存在足够量的抗hIgA抗体，所以认为大部分的hIgA与抗体结合。给予抗体后15分钟、1小时、2小时、7小时、1天、3天、7天、14天从小鼠体内采血。采集的血液立即在4℃、12,000rpm下离心分离15分钟，由此得到血浆。分离的血浆在实施测定前保存在设定为-20℃以下的冷库中。

(11-2)利用ELISA法测定人FcRn转基因小鼠血浆中的抗hIgA抗体浓度

利用ELISA法测定小鼠血浆中的抗hIgA抗体浓度。首先，将各孔中分别注入了抗体的抗人IgG(γ-链特异性)F(ab’)2片段(SIGMA)的Nunc-Immuno板,MaxiSorp(Nalge nunc International)在4℃下静置一夜，从而制作抗人IgG固相化板。在上述的抗人IgG固相化板中分别注入作为血浆中浓度标准液的制备成0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.01563、0.007813μg/mL的抗hIgA抗体的标准曲线样品和稀释了100倍以上的小鼠血浆测定样品，之后将该板在25℃下培养1小时。之后，在上述板的各孔中分别注入山羊抗人IgG(γ链特异性)生物素(BIOT)缀合物(Southern Biotechnology Associats Inc.)后，使该板在25℃下反应1小时。再向上述板的各孔中分别注入链霉亲和素-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)，之后使该板在25℃下反应1小时。使用1N的硫酸(Showa Chemical)来停止以TMB单组份HRP微孔底物(BioFX Laboratories)为底物的显色反应，之后使用酶标仪测定各孔的反应液在450nm的吸光度。使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)，由标准曲线的吸光度算出小鼠血浆中的抗hIgA抗体浓度。通过该方法测定的静脉内给药后的人FcRn转基因小鼠血浆中的GA2-F1331和GA2-F760的抗体浓度变化见图16。

(11-3)利用ELISA法测定血浆中hIgA浓度

利用ELISA法测定小鼠血浆中的hIgA浓度。首先，将各孔中分别注入了山羊抗人IgA抗体(BETHYL)的Nunc-Immuno板,MaxiSoup(Nalge nunc International)在4℃下静置一夜，由此制作抗人IgA固相化板。作为血浆中浓度的标准液，使用制备成0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μg/mL的hIgA的标准曲线样品。向各100μL的标准曲线样品和稀释了100倍以上的小鼠血浆测定样品中加入200μL500ng/mL的hsIL6R进行混合，在室温下静置1小时。之后，将分别注入了100μL混合溶液的上述抗人IgA固相化板在室温下静置1小时。接下来，在上述板的各孔中分别注入生物素化的抗人IL-6R抗体(R&D)后，使该板在室温下反应1小时。再向上述板的各孔中分别注入链霉亲和素-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)后，使该板在室温下反应1小时。使用1N的硫酸(Showa Chemical)来停止以TMB单组份HRP微孔底物(BioFX Laboratories)为底物的显色反应后，使用酶标仪测定各孔的反应液在450nm的吸光度。使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)，由标准曲线的吸光度算出小鼠血浆中浓度。通过该方法测定的静脉内给药后的人FcRn转基因小鼠血浆中的hIgA浓度变化见图17。

其结果显示：与一并给予了hIgA和对人FcRn的结合活性低的GA2-F760的小鼠血浆中hIgA的消失相比，一并给予了hIgA和对人FcRn的结合增强的GA2-F1331的小鼠血浆中hIgA的消失明显加速。

[实施例12]pH依赖性地与人IgE结合的抗体的改变体的制备

接下来，为了加速抗原(人IgE)从血浆中消失，制作了相对于pH依赖性地与人IgE结合的278-IgG1而言对小鼠FcRn的结合增强的改变体。首先，为了降低与小鼠FcγR的结合，制作了278-IgG1的以EU编号表示的235位Leu取代成Arg、239位Ser取代成Lys的278-F760(SEQ ID NO:55)。再将278-F760的以EU编号表示的236位Gly取代成Arg、252位Met取代成Tyr、254位Ser取代成Thr、256位Thr取代成Glu、434位Asn取代成Tyr、436位Tyr取代成Val、438位Gln取代成Arg、440位Ser取代成Glu，制作与278-F760相比在pH7.4下与FcRn更强地结合的改变体即278-F1331。按照本领域技术人员所公知的方法将编码278-F1331(重链SEQ ID NO:58、轻链SEQID NO:46)或278-F760(重链SEQ ID NO:55、轻链SEQ ID NO:46)的DNA序列插入动物表达用质粒中。使用导入了该质粒的动物细胞，在其纯化后测定按照上述方法表达的这些抗体改变体的浓度。

[实施例13]评价在给予了pH依赖性hIgE结合抗体的人FcRn转基因小鼠中对抗原的血浆中滞留性的影响

(13-1)使用人FcRn转基因小鼠的体内试验

对人FcRn转基因小鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg种系32+/+小鼠,Jackson Laboratories、Methods Mol Biol.(2010)602,93-104)同时给予hIgE(Asp6)(人IgE(Asp6)：实施例(5-1)中制作)和抗hIgE抗体(278-F760或278-F1331)和Sanglopor(人正常免疫球蛋白、CSL Behring)后，评价hIgE(Asp6)和抗hIgE抗体的体内动力学。按10mL/kg的用量对尾静脉单次给予hIgE(Asp6)和抗hIgE抗体和Sanglopor的混合溶液(浓度记载在表11中。)。作为所给予的抗hIgE抗体，使用上述的278-F760和278-F1331中的任一种。

此时，由于相对于hIgE(Asp6)过剩存在足够量的抗hIgE抗体，所以认为大部分的hIgE(Asp6)与抗体结合。抗体给药后5分钟、2小时、7小时、1天、2天、4天或5天、7天、14天、21天和28天从小鼠体内采血。采集的血液立即在4℃、12,000rpm下离心分离15分钟，从而得到血浆。分离的血浆在实施测定前保存在设定为-20℃以下的冷库中。

[表11]

(13-2)利用ELISA法测定人FcRn转基因小鼠血浆中抗hIgE抗体浓度

通过电化学发光(ECL)分析测定小鼠血浆中的抗hIgE抗体浓度。作为血浆中浓度的标准液，制备了制备成32、16、8、4、2、1、0.5和0.25μg/mL的抗hIgE抗体的标准曲线样品。在固定有hIgE(Asp6)的CL板的各孔中分别注入标准曲线样品和小鼠血浆样品后，使该板在4℃下反应1小时。之后，在上述板的各孔中分别注入山羊抗人IgG(γ链特异性)生物素(BIOT)缀合物(Southern Biotechnology AssociatsInc.)，之后使该板在25℃下反应1小时。再向上述板的各孔中分别注入链霉亲和素-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)，之后使该板在25℃下反应1小时。接下来，使SULFO标签标记的山羊抗兔抗体(Meso Scale Discovery)与该板中的各反应液在室温下反应1小时。最后，向各反应液中分别注入读数(read)缓冲液T(x4)(Meso ScaleDiscovery)后，立即使用Sector Imager 2400 Reader(Meso ScaleDiscovery)测定反应液的发光。使用分析软件SOFTmax PRO(MolecularDevices)，由标准曲线的反应性(响应值)算出小鼠血浆中的抗hIgE抗体浓度。通过该方法测定的静脉内给药后的人FcRn转基因小鼠血浆中的278-F1331和278-F760的抗体浓度变化见图18。

(13-3)人FcRn转基因小鼠血浆中的hIgE(Asp6)浓度确定

利用ELISA法测定小鼠血浆中hIgE(Asp6)浓度。制备以血浆中浓度计为192、96、48、24、12、6、3ng/mL的标准曲线样品。为了使hIgE(Asp6)和抗hIgE抗体的免疫复合体变得均匀，在给予了278-hIgG1的组的标准曲线和小鼠血浆测定样品中，添加Xolair(Novartis)使其达到10μg/mL，在室温下静置30分钟。在固定有抗人IgE的免疫板(MABTECH)或者固定有抗人IgE(克隆107、MABTECH)的免疫板(Nunc F96微孔板(Nalge nunc International))中分别注入小鼠血浆测定样品，在室温下静置2小时或者在4℃下静置一夜。之后，使人GPC3核心蛋白(SEQ ID NO:51)、用NHS-PEG4-生物素(Thermo FisherScientific)进行了生物素化的抗GPC3抗体(公司内部制备)、链霉亲和素-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)分别依次反应1小时。通过下述方法测定小鼠血浆中浓度：使用1N的硫酸(ShowaChemical)来停止以TMB单组份HRP微孔底物(BioFX Laboratories)作为底物的显色反应后，使用酶标仪测定该显色在450nm的吸光度的方法；或者，以SuperSignal(r)ELISA Pico化学发光底物(Thermo FisherScientific)为底物进行发光反应，使用酶标仪测定发光强度的方法。使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)，由标准曲线的吸光度或发光强度算出小鼠血浆中浓度。通过该方法测定的静脉内给药后的血浆中hIgE(Asp6)浓度变化见图19。

其结果显示：与一并给予了hIgE和对人FcRn的结合活性低的278-F760的小鼠血浆中hIgE的消失相比，一并给予了hIgE和对人FcRn的结合增强的278-F1331的小鼠血浆中hIgE的消失明显加速。即，在不仅给予了以上所述的与FcRn的结合增强的抗IgE抗体、还给予了与FcRn的结合增强的抗IgE抗体的小鼠中，也显示抗原的消失加速。以上结果表明：在形成免疫复合体的hIgA和抗hIgA抗体的组合以及hIgE和抗hIgE抗体的组合中，通过增强与FcRn的结合，可以进一步加速抗原的消失。

[实施例14]使用正常小鼠评价同时给予两种抗人IL6受体抗体对抗原的血浆中滞留性的影响

(14-1)两种抗IL6R抗体的制备

Fv4-IgG1(重链SEQ ID NO:59、轻链SEQ ID NO:60)是国际公开WO2011/122011中记载的具有pH依赖性地与人IL6R结合(在中性条件下结合、在酸性条件下解离)的特性的抗人IL6受体抗体。另外，PHX-IgG1(重链SEQ ID NO:61、轻链SEQ ID NO:62)是与人IL6R结合的抗体。使用按照本领域技术人员所公知的方法插入了编码Fv4-IgG1(重链SEQ ID NO:59、轻链SEQ ID NO:60)、PHX-IgG1(重链SEQ ID NO:61、轻链SEQ ID NO:62)或PHX-IgG1的重链恒定区的氨基酸已改变的PHX-F29(重链SEQ ID NO:63、轻链SEQ ID NO:62)的DNA序列的动物表达用质粒，纯化后测定按照上述方法(记载在实施例1中)表达的这些抗体改变体的浓度。

(14-2)PHX-IgG1的人IL6受体结合评价

通过使用Biacore T200(GE Healthcare)分析(14-1)中制备的PHX-IgG1与IL-6R的相互作用，算出解离常数(KD)。运行缓冲液使用10mM ACES、150mM NaCl、0.05％Tween20(pH7.4)，在37℃下分析相互作用。将目标抗体捕捉到通过胺偶联法固定有蛋白A/G(ThermoScientific)的S系列传感器芯片CM4(GE Healthcare)上。使经运行缓冲液稀释至800、400、200、100、50、25、12.5nM的IL-6R和运行缓冲液以2μL/分钟的流速与补充了抗体的该芯片相互作用15分钟。通过与10mM的甘氨酸-HCl(pH1.5)进行反应，清洗捕捉到芯片上的抗体，使清洗后的芯片再生，反复用于相互作用分析。

通过使用Biacore评估软件对作为Biacore的测定结果而得到的传感图进行稳态亲和分析，算出PHX-IgG1与IL-6R的解离常数KD(mol/L)。通过该方法算出的pH7.4下的PHX-IgG1与IL-6R的解离常数(KD)为1.4E-7(M)。

接下来，使用Biacore T100评价PHX-IgG1与hIL-6R的结合的pH依赖性。使用10mM的ACES、150mM的NaCl、0.05％的Tween20(pH7.4)和10mM的ACES、150mM的NaCl、0.05％的Tween20(pH6.0)各缓冲液作为运行缓冲液，在37℃的温度下、在pH7.4和pH6.0的条件下测定PHX-IgG1与hIL-6R的结合。将目标抗体捕捉到通过胺偶联法固定有蛋白A/G(Thermo Scientific)的S系列传感器芯片CM4(GEHealthcare)上。使经运行缓冲液稀释至1000、250、62.5nM的hIL-6R和运行缓冲液与捕捉了抗体的该芯片进行相互作用。

通过该方法测定得到的pH7.4和pH6.0下的传感图分别见图20。图20显示将抗体的捕获量标准化成100RU时PHX-IgG1与hIL-6R的结合相和解离相。比较图20的结果可知：与pH7.4的情形相比，在pH6.0下PHX-IgG1与hIl-6R的结合减少。

(14-3)利用电化学发光法评价两种抗体的同一抗原同时结合性

利用电化学发光法评价两种抗体是否可以同时与1个抗原结合。首先，将100μL用EZ-Link Sulfo-NHS-生物素(Thermo SIENTIFIC)进行了生物素化的1μg/mL的Fv4-IgG1添加到MULTI-ARRAY(r)96孔链霉亲和素金板中，在室温下反应1小时。清洗后添加100μL制备成0、0.2、1、5、25μg/mL的hsIL-6R，在室温下反应1小时，清洗后再添加用SULFO-TAG NHS酯(Meso Scale Discovery)进行了钌化的PHX-F29(0、0.2、1、5、25、125μg/mL、100μL)或按照相同方法进行了钌化的Fv4-IgG1(5μg/mL、100μL)，在室温下反应1小时。清洗后，向各孔中分别注入150μL读取缓冲液T(×4)(Meso Scale Discovery)，立即使用SECTOR IMAGER 2400reader(Meso Scale Discovery)测定化学发光。

结果见图21。使钌化后的Fv4-IgG1反应时，无论抗原浓度如何，均无法观测到反应。另一方面，使钌化后的PHX-F29反应时，抗原(IL6R)浓度依赖性地观察到反应。该结果表明：PHX-F29和Fv4-IgG1同时与IL6R结合。因此，表明PHX-F29所识别的IL6R的表位与Fv4-IgG1所识别的表位不同，显示出：通过使用分别具有PHX-F29的可变区和Fv4-IgG1的可变区的抗体，两分子的抗原结合分子可以与1分子的IL6R结合。

(14-4)使用正常小鼠的体内试验

对正常小鼠(C57BL/6J小鼠、Charles River Japan)一并给予hsIL-6R(可溶型人IL-6受体：参考实施例1中制作)或hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体后，评价hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体的体内动力学。按10mL/kg对尾静脉单次给予hsIL-6R溶液(5μg/mL)、或者hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体的混合溶液。抗人IL-6受体抗体使用Fv4-IgG1和PHX-IgG1。

混合溶液中的hsIL-6R浓度均为5μg/mL，但每个给药组的不同的抗人IL-6受体抗体浓度见表12。此时，由于相对于hsIL-6R过剩存在足够量的抗人IL-6受体抗体，所以认为大部分的hsIL-6R与抗体结合。给药后5分钟、7小时、1天、2天、3天、7天、14天、21天从给药的小鼠体内采血。Fv4-IgG1(1mg/kg)给药组(#1)在给药后5分钟、7小时、1天、2天、3天、7天、15天、22天采血。采集的血液立即在4℃、12,000rpm下离心分离15分钟，得到血浆。分离的血浆在实施测定前保存在设定为-20℃以下的冷库中。

[表12]

给药组

Fv4-IgG1的给药量

PHX-IgG1的给药量

	(mg/kg)	(mg/kg)
			#1	1	0
#2	1	1
			#3	1	5
#4	1	25

(14-5)利用电化学发光法测定正常小鼠血浆中的抗人IL-6受体抗体浓度

小鼠血浆中的抗人IL-6受体抗体浓度通过电化学发光法来测定。首先，向Multi-ARRAY96孔板(Meso Scale Discovery)中分别注入抗人kappa捕获抗体(抗体溶液)，在室温下搅拌1小时后，用含有5％BSA(w/v)的PBS-Tween溶液在室温下封闭2小时，制作抗人IgG固相化板。将各孔中分别注入了制备成以血浆中浓度计为40.0、13.3、4.44、1.48、0.494、0.165、0.0549μg/mL的浓度的标准曲线样品和稀释了500倍以上而制得的小鼠血浆测定样品的抗人IgG固相化板在室温下搅拌1小时。之后，向该板的各孔中分别注入抗人kappa捕获抗体生物素缀合物(抗体溶液)，之后将该板在室温下搅拌1小时使其反应。再向该板的各孔中分别注入SULFO-TAG标记的链霉亲和素(Meso Scale Discovery)，之后将该板在室温下搅拌1小时使其反应。清洗各孔后，立即使用SECTOR Imager 2400(Meso Scale Discovery)测定同孔中分别注入了读取缓冲液T(×1)(Meso Scale Discovery)的反应液的化学发光。使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)，由标准曲线的响应值算出小鼠血浆中浓度。抗人IL6R抗体的浓度变化见图22。

(14-6)利用电化学发光法测定血浆中hsIL-6R浓度

利用电化学发光法测定小鼠血浆中的hsIL-6R浓度。使制备成以血浆中浓度计为12.5、6.25、3.13、1.56、0.781、0.391、0.195ng/mL的hsIL-6R标准曲线样品或稀释了50倍以上而制得的小鼠血浆测定样品与用SULFO-TAG NHS酯(Meso Scale Discovery)进行了钌化的单克隆抗人IL-6R抗体(R&D)和生物素化的抗人IL-6R抗体(R&D)和托珠单抗(重链SEQ ID NO:64、轻链SEQ ID NO:65)溶液的混合液在37℃下反应一夜。之后，向用含有0.5％BSA(w/v)的PBS-Tween溶液在5℃下封闭了一夜的链霉亲和素Gold Multi-ARRAY板(Meso ScaleDiscovery)的各孔中分别注入该混合液。再使该板在室温下反应2小时，清洗该板的各孔后，立即使用SECTOR Imager 2400(Meso ScaleDiscovery)测定分别注入了读取缓冲液T(×2)(Meso Scale Discovery)的各孔的反应液中的化学发光。使用分析软件SOFTmax PRO(MolecularDevices)，由标准曲线的响应值算出hsIL-6R浓度。

算出的人IL6R(虽然还记作hsIL6R或hsIL-6R，但意指相同的蛋白)的浓度变化见图23。在同时给予了Fv4-IgG1和PHX-IgG1的小鼠中，与单独给予Fv4-IgG1的小鼠相比，hs血浆中的IL6R的消失加速。

虽然不受特有理论的束缚，但认为上述血浆中抗原消失的加速还可以如下进行说明。即使在单独给予Fv4-IgG1的情况下，相对于hsIL6R也存在足够量的Fv4-IgG1，认为几乎所有的hsIL6R在血浆中都与Fv4-IgG1结合。若给予表位与Fv4-IgG1的表位不同且可以同时与hsIL6R结合的PHX-IgG1，则与一分子的hsIL6R形成包含Fv4-IgG1、PHX-IgG1的免疫复合体。其结果，通过增强的与Fcγ受体和/或FcRn的结合，促进向细胞内摄取，结果，认为hsIL6R从血浆中消失加速。即，作为包含与单体抗原中存在的彼此不同的表位结合的适当可变区的多特异性(multispecific)抗体、或多互补位的(multiparatopic)抗体的一个非限定性方案的、其可变区为pH或Ca依赖性的结合抗体(图8所示的包含识别表位A的右腕可变区和识别表位B的左腕可变区的双特异性(bispecific)抗体或双互补位的(biparatopic)抗体)也形成包含两个以上抗体和两个以上抗原结合单元(单体抗原)的大的免疫复合体，显示可以加速抗原的消失。

[实施例15]使用Biacore来评价免疫复合体与FcgR的结合

(15-1)关于免疫复合体与FcγR的结合

作为评价包含抗原结合分子和抗原的免疫复合体的形成的方法，实施例4中采用凝胶过滤(尺寸排阻)层析，而实施例14中采用电化学发光法(ECL法)。在免疫复合体所含的抗原结合分子或者抗原中包含免疫球蛋白恒定区等FcγR结合结构域的情况下，免疫复合体通过亲合力与FcγR结合。因此，认为通过利用了与抗原结合分子单体或抗原单体相比与FcγR更强地结合的性质(特别是解离变慢的性质)的方法，可以确认含有FcγR结合结构域的免疫复合体的形成(The Journalof Biological Chemistry(2001)276(9),6591-6604；mAbs(2009)1(5),491-504)。

(15-2)评价抗体·抗原和添加了组氨酸标签的人FcγR IIIaV的制备

用于评价免疫复合体的形成的Xolair(Novartis)、克隆278-IgG1(实施例4中制备)、GA2-IgG1(实施例1中制备)、Fv4-IgG1(实施例14中制备)、PHX-IgG1(实施例14中制备)按照上述方法来制备。

评价中使用的hIgE(hIgE(Asp6)、实施例5中制备)和IL6R(参考实施例1)分别按照上述方法来制备。作为人IgA的重组体的hIgA-v2(GC-hIgA)通过下述方法来制备。将编码GC-hIgA-MYC(重链SEQ IDNO:66、轻链SEQ ID NO:67)的基因片段插入动物细胞表达用载体中。使用293Fectin(Invitrogen)将所构建的质粒载体和表达EBNA1的基因一同导入FreeStyle293(Invitrogen)中。之后，将进行了基因导入的细胞在37℃、8％的CO₂中培养6天，使GC-hIgA蛋白分泌到培养上清中。用0.22μm瓶顶过滤器过滤包含GC-hIgA-MYC的细胞培养液，得到培养上清。按照本领域技术人员所公知的方法，利用离子交换层析和凝胶过滤层析进行纯化，得到GC-hIgA-MYC。

添加了组氨酸标签的人FcγR IIIaV按照参考实施例2中记载的方法来制备。

(15-3)免疫复合体与FcγR的结合评价

使用Biacore T200(GE Healthcare)评价抗原抗体免疫复合体与FcgR的结合。

在通过胺偶联法固定有适当量的Penta-His抗体(QIAGEN)的传感器芯片CM5(GE Healthcare)上，注射添加了适当浓度的组氨酸标签的人FcγR IIIaV。通过将人FcγR IIIaV捕捉到固定在该芯片上的penta-His抗体上，将人FcγR IIIaV固定在该芯片上。注射作为分析物的包含200nM抗体的溶液或200nM抗体和200nM抗原的混合液，与固定在传感器芯片上的人FcγR IIIaV发生相互作用。之后，注射10mmol/L的甘氨酸-HCl(pH2.5)，使传感器芯片再生。使用1.2mmol/l的CaCl₂/0.05％的tween20、20mmol/l的ACES、150mmol/l的NaCl(pH7.4)作为运行缓冲液，在25℃下测定抗原抗体免疫复合体与FcgR的结合。

使包含抗体的溶液或抗体和抗原的混合液与人FcγRIIIaV作用时的结合分析结果见图24。图24是为了着眼于解离而将结合量标准化成100的传感图。虽然Fv4-IgG1与IL6R结合，但没有形成免疫复合体，所以在使包含抗体的溶液与FcγR作用时的解离和使抗体与抗原的混合液作用时的解离之间没有确认到差异。另一方面，观测到使据报道形成了免疫复合体的Xolair(J.Pharmacol.Exp.Ther.(1996)279(2)1000-1008)和hIgE的混合液与FcγR结合时从FcγR上的解离比仅使Xolair与FcγR结合时从FcγR上的解离慢。而且，使实施例4中利用尺寸排阻(凝胶过滤)层析确认形成了免疫复合体的克隆278-IgG1和抗原(hIgE)的混合液与FcγR结合时从FcγR上的解离也比仅使克隆278-IgG1与FcγR结合时从FcγR上的解离慢。而且，使GA2-IgG1和hIgA的混合液与FcγR结合时从FcγR上的解离也比仅使GA2-IgG1与FcγR结合时从FcγR上的解离慢。而且，使Fv4-IgG1以及PHX-IgG1和抗原(IL6R)的混合液与FcγR结合时从FcγR上的解离也比使Fv4-IgG1或PHX-IgG1与FcγR结合时从FcγR上的解离慢。

由以上结果可知：在免疫复合体所含的抗原结合分子或抗原中含有免疫球蛋白恒定区等FcγR结合结构域情况下，由于免疫复合体通过亲合力与FcγR结合，所以作为评价包含抗原结合分子和抗原的免疫复合体的形成的方法，评价下述现象的方法是有效的：与使包含免疫球蛋白恒定区等FcγR结合结构域等的分子单独与FcγR结合时从FcγR上的解离相比，使包含FcγR结合结构域等的抗原结合分子和其抗原的混合液与FcγR结合时从FcγR上的解离、或者使包含FcγR结合结构域等的抗原和与该抗原结合的抗原结合分子的混合液与FcγR结合时从FcγR上的解离变慢。表明以上述的从FcγR上的解离作为判断基准的免疫复合体的评价在由针对结合有多个单体的抗原的抗体形成的免疫复合体、由单体抗原中表位不同的多个抗体形成的免疫复合体的情况下均有效。

[实施例16]使用Biacore评价免疫复合体与FcRn的结合

(16-1)关于免疫复合体与FcRn的结合

作为评价包含抗原结合分子和抗原的免疫复合体的形成的方法，在免疫复合体所含的抗原结合分子或抗原含有免疫球蛋白恒定区等FcRn结合结构域的情况下，免疫复合体通过亲合力与FcRn结合。因此，认为通过利用与抗原结合分子单体或抗原单体相比与FcRn更强地结合的性质(特别是解离变慢的性质)的方法，可以确认包含FcRn结合结构域的免疫复合体的形成(Journal of Immunology(2010)184(4)1968-1976)。但是，迄今为止所报道的方法是在pH6.0的条件下评价FcRn与FcRn结合结构域的结合，该条件不仅与生物体内的条件不同，而且也不适合评价若pH变化则结合力变化的样本。认为其原因在于：由于人FcRn与人IgG1的结合力非常低，所以无法评价pH7.4下的结合。因此，研究在接近生物体内的条件的pH7.4的条件下能否对免疫复合体进行评价。

(16-2)评价抗体·抗原和FcRn的制备

用于评价的Fv4-F22是Fv4-IgG1(记载在实施例14中)的重链恒定区改变体。Xolair-F22是Xolair(Novartis)的重链恒定区改变体。利用本领域技术人员所公知的方法，将编码Fv4-F22(重链SEQ ID NO:68、轻链SEQ ID NO:60)和Xolair-F22(重链SEQ ID NO:69、轻链SEQ IDNO:70)的DNA序列插入动物表达用质粒中。使用导入了该质粒的动物细胞，在其纯化后测定按照上述方法(记载在实施例1中)表达的这些抗体改变体的浓度。另外，克隆278-IgG1(在实施例4中制备)、Fv4-IgG1(实施例14中制备)、PHX-IgG1(实施例14中制备)通过上述方法来制备。

用于评价的hIgE(hIgE(Asp6)、实施例5中制备)和IL6R(参考实施例1中制备)分别通过上述方法来制备。

人FcRn和小鼠FcRn分别通过参考实施例3和4中记载的方法来制备。

(16-3)免疫复合体与人FcRn的结合评价

使用BiacoreT100(GE Healthcare)评价抗原抗体免疫复合体与人FcRn的结合。

在通过胺偶联法固定有适当量的人FcRn(hFcRn)的传感器芯片CM4(GE Healthcare)上，使作为分析物来注射的仅包含表13所示抗体的溶液或抗体和抗原的混合液与传感器芯片上的hFcRn发生相互作用。之后，注射20mM的Tris-HCl、150mM的NaCl(pH9.0或pH9.5)，使传感器芯片再生。使用50mmol/l的磷酸钠(磷酸)、150mmol/l的NaCl、0.05％的Tween20(pH7.4)作为运行缓冲液，在25℃下测定抗原抗体免疫复合体与FcRn的结合。

[表13]

样品名称	抗体	抗原
			Fv4-F22	Fv4-F22(10μg/mL)	-
Fv4-F22+IL6R	Fv4-F22(10μg/mL)	hsIL6R(2.5μg/mL)
			Xolair-F22	Xolair-F22(10μg/mL)	-
Xolair-F22+IgE	Xolair-F22(10μg/mL)	hIgE(Asp6)(10μg/mL)

使含有抗体的溶液或抗体和抗原的混合液与hFcRn作用时的结合分析结果见图25。图25是为了着眼于解离而将结合量标准化成100的传感图。虽然Fv4-F22与IL6R结合，但没有形成包含多个具有免疫球蛋白恒定区的分子的免疫复合体，所以在使含有抗体的溶液与FcRn作用时的解离和使抗体和抗原的混合液与其作用时的解离之间没有确认到差别。另一方面，还观测到：使具有据报道与hIgE形成免疫复合体的Xolair(J.Pharmacol.Exp.Ther.(1996)279(2)1000-1008)的可变区的Xolair-F22和hIgE的混合液与FcRn结合时从FcRn上的解离与仅使Xolair-F22与FcRn结合时从FcRn上的解离相比变慢。由以上结果可知：即使在pH7.4的条件下，通过使用与hFcRn的结合增强的抗体，也可以检测出与hFcRn的结合。另外，在免疫复合体所含的抗原结合分子或者抗原中包含免疫球蛋白恒定区等FcRn结合结构域的情况下，免疫复合体与FcRn更强固地结合，所以作为评价包含抗原结合分子和抗原的免疫复合体的形成的方法，评价下述现象的方法是有效的：与使包含免疫球蛋白恒定区等FcRn结合结构域等的分子单独与FcRn结合时从FcRn上的解离相比，使包含FcRn结合结构域等的抗原结合分子和其抗原的混合液与FcRn结合时从FcRn上的解离、或者使包含FcRn结合结构域等的抗原和与该抗原结合的抗原结合分子的混合液与FcRn结合时从FcRn上的解离变慢。

(16-4)使用Biacore评价免疫复合体与小鼠FcRn的结合

在(16-3)中评价了包含与hFcRn的结合增强的免疫球蛋白恒定区的改变体的免疫复合体与FcRn的结合。与人FcRn相比，天然型人IgG可以与小鼠FcRn强力结合(Int.Immunol.(2001)13(12),1551-1559)，因此通过评价包含天然型人IgG恒定区的抗体对小鼠FcRn的结合，来研究能否不改变免疫球蛋白恒定区而评价免疫复合体的形成。

使用Biacore T100(GE Healthcare)评价抗原抗体免疫复合体与FcRn的结合。在通过胺偶联法固定有适当量的小鼠FcRn(mFcRn)的传感器芯片CM4(GE Healthcare)上，使作为分析物注射的仅包含表14所示抗体的溶液或抗体和抗原的混合液与传感器芯片上的mFcRn发生相互作用。之后，注射20mM的Tris-HCl、150mM的NaCl(pH9.0或pH9.5)，使传感器芯片再生。使用50mmol/l的磷酸钠(磷酸)、150mmol/l的NaCl、0.05％的Tween20(pH7.4)作为运行缓冲液，在25℃下测定抗原抗体免疫复合体与FcRn的结合。

[表14]

使仅含有抗体的溶液或抗体和抗原的混合液与mFcRn作用时的结合分析结果见图26和图27。图26和图27是为了着眼于解离而将结合量标准化成100的传感图。使实施例4中利用尺寸排阻(凝胶过滤)层析确认到免疫复合体的形成的克隆278-IgG1和抗原(hIgE)的混合液与mFcRn结合时从mFcRn上的解离也比仅使克隆278-IgG1与mFcRn结合时从mFcRn上的解离慢。还观测到：使据报道形成了免疫复合体的Xolair(J.Pharmacol.Exp.Ther.(1996)279(2)1000-1008)和hIgE的混合液与mFcRn结合时从mFcRn上的解离与仅使Xolair与mFcRn结合时从mFcRn上的解离相比变慢(图26)。另一方面，在使含有Fv4-IgG1的溶液与mFcRn结合时从mFcRn上的解离和使Fv4-IgG1和IL6R的混合液与mFcRn结合时从mFcRn上的解离之间没有确认到差别。而且，在使含有PHX-IgG1的溶液与mFcRn结合时从mFcRn上的解离和使PHX-IgG1和IL6R的混合液与mFcRn结合时从mFcRn上的解离之间没有确认到差别(图27)。认为其原因在于：由于Fv4-IgG1所含的可变区所结合的IL6R中的抗原结合单元为1单元，所以在仅使用Fv4-IgG1作为针对IL6R的抗原结合分子时，其与一分子的IL6R没有形成包含两分子以上的Fv4-IgG1的免疫复合体。由于PHX-IgG1所含的可变区所结合的IL6R中的抗原结合单元也是1单元，所以在IL6R中只存在一个表位，因此在仅使用PHX-IgG1作为针对IL6R的抗原结合分子时，其与一分子的IL6R没有形成包含两分子以上的PHX-IgG1的免疫复合体。这里，使在实施例14中已经明确了表位是彼此不同的PHX-IgG1和Fv4-IgG1和IL6R的混合液与mFcRn结合时从mFcRn上的解离与使含有Fv4-IgG1抗体和PHX-IgG1抗体(只有抗体的)的溶液与mFcRn结合时从mFcRn上的解离相比变慢。这种解离变慢的现象和在克隆278中观测到的现象相同。这表明：在使用单一的抗原结合分子作为与目标抗原结合的抗原结合分子时，即使是抗原结合单元为1单元的抗原，通过使用表位彼此不同的抗原结合分子的组合作为针对该抗原的抗原结合分子，也可以使该抗原的抗原结合单元达到两个以上，其结果，可以形成包含两分子以上的抗原结合分子的免疫复合体。

以上结果显示：通过使用小鼠FcRn，即使是没有进行影响与FcRn的相互作用的改变的天然人IgG1分子，也可以评价在与生物体内的条件相同的pH7.4的条件下与FcRn的结合。而且，在抗原结合分子或者抗原中包含免疫球蛋白恒定区等FcRn结合结构域的情况下，由于免疫复合体与FcRn强固结合，所以通过评价下述现象可以确认免疫复合体的形成：与包含免疫球蛋白恒定区等FcRn结合结构域的分子从FcRn上的解离相比，包含多个含有免疫球蛋白恒定区等FcRn结合结构域的分子的免疫复合体从FcRn上的解离变慢。可以确认：上述的使用了FcRn的免疫复合体的形成评价在确认由结合有多个单体的抗原和与该抗原结合的抗体形成的免疫复合体、以及由单体抗原和与该抗原结合且彼此结合的表位不同的多个抗体形成的免疫复合体的形成的情况下均可使用。

[参考实施例1]可溶型人IL-6受体(hsIL-6R)的制备

作为抗原的人IL-6受体的重组人IL-6受体如下制备。按照本领域技术人员公知的方法，构建J.Immunol.(1994)152,4958-4968中报道的稳定表达由N末端侧第1～357位的氨基酸序列构成的可溶型人IL-6受体(以下，记作hsIL-6R)的CHO株。通过培养该CHO株，使hsIL-6R表达。通过Blue Sepharose 6 FF柱层析、凝胶过滤柱层析这两个步骤，由得到的该CHO株的培养上清中纯化hsIL-6R。在最终步骤中作为主峰洗脱的组分被用作最终纯品。

[参考实施例2]添加了组氨酸标签的人FcγR IIIaV的制备

添加了组氨酸标签的人FcγRIIIaV通过以下方法来制备。首先，按照本领域技术人员所公知的方法实施FcgR的细胞外结构域的基因合成。此时，根据注册在NCBI中的信息制作各FcgR的序列。具体而言，根据NCBI的注册号#NM_001127593.1的序列制作FcgRIIIa的序列，在C末端添加His标签。另外，虽然已知关于FcgRIIIa的多态性，但对于FcgRIIIa以J.Clin.Invest.,1997,100(5):1059-1070为参考来制作。

将所得的基因片段插入动物细胞表达载体中，制作表达载体。将所制作的表达载体一过性地导入来自人胚肾癌细胞的FreeStyle293细胞(Invitrogen公司)中，使目标蛋白表达。培养细胞，回收所得的培养上清，之后通过0.22μm的滤器得到培养上清。得到的培养上清原则上通过以下4个步骤进行纯化。步骤1是进行阳离子交换柱层析(SPSepharoseFF)，步骤2是进行针对His标签的亲和柱层析(HisTrap HP)，步骤3是进行凝胶过滤柱层析(Superdex200)，步骤4是进行无菌过滤。对于纯化后的蛋白，使用分光光度计测定其在280nm的吸光度，利用PACE等方法由所得的值算出吸光系数，使用该吸光系数算出纯化蛋白的浓度(Protein Science 1995；4:2411-2423)。

[参考实施例3]可溶型人FcRn(hFcRn)的制备

人FcRn和β2-微球蛋白形成复合体。根据已报道的人FcRn基因序列(JExp Med.1994 Dec 1；180(6):2377-81)设计了寡-DNA引物。使用所设计的引物，通过PCR法由人cDNA(人胎盘Marathon-ReadycDNA,Clontech)扩增cDNA。扩增后的cDNA是包含信号序列的细胞外结构域(Met1-Leu290)，将其插入动物细胞表达用载体中。同样，对于β2-微球蛋白，也是根据已报道的人β2-微球蛋白序列来设计引物，再通过PCR法扩增cDNA。扩增包含信号序列的Met1-Met119的cDNA片段，将其插入动物细胞表达用载体中。

可溶型人FcRn(称作hFcRn)按照以下程序进行制备。通过利用了PEI(Polyscience)的脂质转染法向HEK293H细胞(Invitrogen)中导入上述的表达人FcRn(SEQ ID NO:71)的载体和表达β2-微球蛋白(SEQ IDNO:72)的载体的基因。培养导入了基因的细胞，回收培养液。通过IgGSepharose 6 Fast Flow(Amersham Biosciences)和Hi Trap QHP(GEHealthcare)的各层析，从已回收的培养液中纯化hFcRn。(J Immunol.2002 Nov 1；169(9):5171-80)。

[参考实施例4]可溶型小鼠FcRn(mFcRn)的制备

与可溶型人FcRn同样地制备可溶型小鼠FcRn。首先，按照本领域技术人员所公知的方法合成小鼠FcRn的细胞外结构域的基因和小鼠β2-微球蛋白的基因。此时，根据注册在NCBI中的信息制作小鼠FcRn和小鼠β2-微球蛋白的序列。具体而言，对于小鼠FcRn，根据NCBI的注册号#NP_034319.2的序列，制作编码包含信号序列作为细胞外结构域的第1-290位氨基酸的基因片段(SEQ ID NO:73)。而且，对于β2-微球蛋白，根据NCBI的注册号#NP_033865的序列制作基因片段(SEQ ID NO:74)。将得到的基因片段插入动物细胞表达载体中，制作表达载体。将所制作的表达载体一过性地导入来自人胚肾癌细胞的FreeStyle293细胞(Invitrogen公司)中，使目标蛋白表达。培养导入了基因的细胞，回收培养液。通过IgG Sepharose 6 Fast Flow(AmershamBiosciences)和Superdex200(GE Healthcare)的各层析，从所回收的培养液中纯化mFcRn。

[参考实施例5]FcγR结合活性比天然型人IgG的Fc区的结合活性高、且在pH酸性范围条件下人FcRn结合活性增强的抗原结合分子的制作

(5-1)与小鼠FcγR的结合增强的抗人IL-6受体抗体的制作

作为与小鼠FcγR的结合增强的抗原结合分子，制作VH3-IgG1的以EU编号表示的326位Lys被取代成Asp的VH3-IgG1-F1087(SEQID NO:75)和VH3-IgG1的以EU编号表示的239位Ser被取代成Asp、且332位Ile被取代成Glu的VH3-IgG1-F1182(SEQ ID NO:76)。利用参考实施例2的方法，制作包含VH3-IgG1-F1087作为重链、包含VL3-CK(SEQ ID NO:77)作为轻链的Fv4-IgG1-F1087和包含VH3-IgG1-F1182作为重链、包含VL3-CK作为轻链的Fv4-IgG1-F1182。

(5-2)与小鼠FcγR的结合活性的确认

制作含有VH3-IgG1-F1087和VH3-IgG1-F1182作为重链、含有L(WT)-CK(SEQ ID NO:78)作为轻链的VH3/L(WT)-IgG1-F1087和VH3/L(WT)-IgG1-F1182。评价这些抗体和VH3/L(WT)-IgG1-F1022与小鼠FcγR的结合活性。其结果见表15。关于各改变体与小鼠FcγR的结合活性和进行改变前的IgG1相比增强了几倍，其结果见表16。

[表15]

[表16]

产业实用性

本发明所涉及的抗原结合分子具备以下特征：形成包含含有两个以上抗原结合单元(表位)的抗原和两分子以上的抗原结合分子(例如抗体)的大的免疫复合体，从而可以加速含有两个以上抗原结合单元的抗原从血浆中消失。本发明的抗原结合分子除了具备上述特征外，还具备离子依赖性抗原结合活性，由此可以进一步加速该抗原的消失。由于本发明的抗原结合分子具备上述技术特征，所以该抗原结合分子作为用于治疗疾病或症状(例如癌症、炎症性疾病)的药物非常有效。

Claims

1.可形成免疫复合体的抗原结合分子的用于使该抗原从血浆中消失的应用，是指包含(i) Fc区和(ii)两个以上的抗原结合结构域的抗原结合分子的应用，所述抗原结合结构域中的至少一个是对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；

所述免疫复合体包含(a)两分子以上的该抗原结合分子和(b)两分子以上的抗原，其中，所述抗原包含两个以上的抗原结合单元。

2.权利要求1所述的应用，其中，离子浓度条件为钙离子浓度条件。

3.权利要求2所述的应用，其中，所述抗原结合结构域是在低钙离子浓度条件下对抗原的结合活性低于在高钙离子浓度条件下对抗原的结合活性的抗原结合结构域。

4.权利要求1～3中任一项所述的应用，其中，离子浓度条件为pH条件。

5.权利要求4所述的应用，其中，所述抗原结合结构域是在pH酸性范围对抗原的结合活性低于在pH中性范围条件下对抗原的结合活性的抗原结合结构域。

6.权利要求1～5中任一项所述的应用，其中，包含两个以上抗原结合单元的所述抗原为多聚体。

7.权利要求6所述的应用，其中，所述抗原为GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(肌肉生成抑制素)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFSF10(TRAIL Apo-2配体、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配体 ODF、OPG配体)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配体、DR3配体)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配体、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配体 AITR配体、TL6)、TNFSF1A(TNF-a 肌联蛋白(Connectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40配体 gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配体 CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配体 Apo-1配体、APT1配体)、TNFSF7(CD27配体 CD70)、TNFSF8(CD30配体 CD153)、TNFSF9(4-1BB配体 CD137配体)、VEGF、IgE、IgA、IgG、IgM、RANKL、TGF-α、TGF-β、泛特异性的TGF-β或IL-8中的任一种。

8.权利要求1～5中任一项所述的应用，其中，包含两个以上抗原结合单元的所述抗原为单体。

9.权利要求1～8中任一项所述的应用，其中，抗原结合分子为多特异性或多互补位的抗原结合分子、或者抗原结合分子混合物。

10.权利要求1～9中任一项所述的应用，其中，所述Fc区分别为SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一个所表示的Fc区。

11.权利要求1～9中任一项所述的应用，其中，所述Fc区为在pH酸性范围条件下对FcRn的结合活性与SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一个所表示的Fc区的结合活性相比增强的Fc区。

12.权利要求11所述的应用，其中，所述Fc区为下述Fc区：在SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一个所表示的Fc区的氨基酸序列中，选自以下的至少一个以上的氨基酸被取代的Fc区：以EU编号表示的238位、244位、245位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257位、258位、260位、262位、265位、270位、272位、279位、283位、285位、286位、288位、293位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、316位、317位、318位、332位、339位、340位、341位、343位、356位、360位、362位、375位、376位、377位、378位、380位、382位、385位、386位、387位、388位、389位、400位、413位、415位、423位、424位、427位、428位、430位、431位、433位、434位、435位、436位、438位、439位、440位、442位或447位的氨基酸。

13.权利要求12所述的应用，其中，所述Fc区为SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一个所表示的Fc区的氨基酸序列中以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸：

238位氨基酸为Leu；

244位氨基酸为Leu；

245位氨基酸为Arg；

249位氨基酸为Pro；

250位氨基酸为Gln或Glu中的任一个；或者

251位氨基酸为Arg、Asp、Glu或Leu中的任一个；

252位氨基酸为Phe、Ser、Thr或Tyr中的任一个；

254位氨基酸为Ser或Thr中的任一个；

255位氨基酸为Arg、Gly、Ile或Leu中的任一个；

257位氨基酸为Ala、Ile、Met、Asn、Ser或Val中的任一个；

258位氨基酸为Asp；

260位氨基酸为Ser；

262位氨基酸为Leu；

270位氨基酸为Lys；

272位氨基酸为Leu或Arg中的任一个；

285位氨基酸为Asn；

286位氨基酸为Phe；

288位氨基酸为Asn或Pro中的任一个；

293位氨基酸为Val；

307位氨基酸为Ala、Glu、Gln或Met中的任一个；

311位氨基酸为Ala、Glu、Ile、Lys、Leu、Met、Ser 、Val或Trp中的任一个；

309位氨基酸为Pro；

312位氨基酸为Ala、Asp或Pro中的任一个；

314位氨基酸为Ala或Leu中的任一个；

316位氨基酸为Lys；

317位氨基酸为Pro；

318位氨基酸为Asn或Thr中的任一个；

339位氨基酸为Asn、Thr或Trp中的任一个；

341位氨基酸为Pro；

343位氨基酸为Glu、His、Lys、Gln、Arg、Thr或Tyr中的任一个；

375位氨基酸为Arg；

376位氨基酸为Gly、Ile、Met、Pro、Thr或Val中的任一个；

377位氨基酸为Lys；

378位氨基酸为Asp、Asn或Val中的任一个；

380位氨基酸为Ala、Asn、Ser或Thr中的任一个；

387位氨基酸为Ala、Arg、His、Pro、Ser或Thr中的任一个；

389位氨基酸为Asn、Pro或Ser中的任一个；

423位氨基酸为Asn；

427位氨基酸为Asn；

428位氨基酸为Leu、Met、Phe、Ser或Thr中的任一个；

431位氨基酸为His或Asn中的任一个；

433位氨基酸为Arg、Gln、His、Ile、Lys、Pro或Ser中的任一个；

434位氨基酸为Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp或Tyr中的任一个；

438位氨基酸为Lys、Leu、Thr或Trp中的任一个；

440位氨基酸为Lys；或者

442位氨基酸为Lys、308位氨基酸为Ile、Pro或Thr中的任一个。

14.权利要求1～9中任一项所述的应用，其中，所述Fc区为在pH中性范围条件下对FcRn的结合活性与SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一个所表示的Fc区的结合活性相比增强的Fc区。

15.权利要求14所述的应用，其中，所述Fc区为下述Fc区：在SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一个所表示的Fc区的氨基酸序列中，选自以下的至少一个以上的氨基酸被取代的Fc区：以EU编号表示的237位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265位、286位、289位、297位、298位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、315位、317位、332位、334位、360位、376位、380位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、424位、428位、433位、434位或436位。

16.权利要求15所述的应用，其中，所述Fc区为在SEQ ID NO: 13、14、15、或16中任一个所表示的Fc区的氨基酸序列中，以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸：

237位氨基酸为Met；

248位氨基酸为Ile；

252位氨基酸为Phe、Trp或Tyr中的任一个；

254位氨基酸为Thr；

255位氨基酸为Glu；

256位氨基酸为Asp、Asn、Glu或Gln中的任一个；

258位氨基酸为His；

265位氨基酸为Ala；

286位氨基酸为Ala或Glu中的任一个；

289位氨基酸为His；

297位氨基酸为Ala；

303位氨基酸为Ala；

305位氨基酸为Ala；

309位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro或Arg中的任一个；

311位氨基酸为Ala、His或Ile中的任一个；

312位氨基酸为Ala或His中的任一个；

314位氨基酸为Lys或Arg中的任一个；

315位氨基酸为Ala、Asp或His中的任一个；

317位氨基酸为Ala；

332位氨基酸为Val；

334位氨基酸为Leu；

360位氨基酸为His；

376位氨基酸为Ala；

380位氨基酸为Ala；

382位氨基酸为Ala；

384位氨基酸为Ala；

385位氨基酸为Asp或His中的任一个；

386位氨基酸为Pro；

387位氨基酸为Glu；

389位氨基酸为Ala或Ser中的任一个；

424位氨基酸为Ala；

433位氨基酸为Lys；

434位氨基酸为Ala、Phe、His、Ser、Trp或Tyr中的任一个；或者

436位氨基酸为His 、Ile、Leu、Phe、Thr或Val。

17.权利要求1～13中任一项所述的应用，其中，所述Fc区包含对Fcγ受体的结合活性比天然型人IgG的Fc区对Fcγ受体的结合活性高的Fc区。

18.权利要求17所述的应用，其中，所述Fc区的氨基酸序列中，选自以下的至少一个以上的氨基酸包含与天然型人IgG的Fc区的氨基酸不同的氨基酸：以EU编号表示的221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位或440位。

19.权利要求18所述的应用，其中，所述Fc区的氨基酸序列中，包含以EU编号表示的选自以下的至少一个的氨基酸：

221位氨基酸为Lys或Tyr中的任一个；

222位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

223位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个；

224位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；

225位氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个；

227位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

228位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

230位氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个；

231位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

232位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；

240位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

241位氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

243位氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中的任一个；

244位氨基酸为His；

245位氨基酸为Ala；

246位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

249位氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个；

250位氨基酸为Glu或Gln中的任一个；

251位氨基酸为Phe；

254位氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个；

255位氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个；

256位氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个；

258位氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个；

260位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

262位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个；

263位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

266位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；

273位氨基酸为Phe或Ile中的任一个；

275位氨基酸为Leu或Trp中的任一个；

279位氨基酸为Ala；

281位氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

282位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；

284位氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一个；

285位氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中的任一个；

286位氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一个；

288位氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一个；

291位氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中的任一个；

292位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一个；

301位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；

302位氨基酸为Ile；

303位氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一个；

304位氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一个；

305位氨基酸为Glu、Ile、Thr或Tyr中的任一个；

311位氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一个；

313位氨基酸为Phe；

315位氨基酸为Leu；

317位氨基酸为Glu或Gln；

323位氨基酸为Ile；

334位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中的任一个；

336位氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一个；

337位氨基酸为Glu、His或Asn中的任一个；

376位氨基酸为Ala或Val中的任一个；

377位氨基酸为Gly或Lys中的任一个；

378位氨基酸为Asp；

379位氨基酸为Asn；

380位氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一个；

382位氨基酸为Ala或Ile中的任一个；

385位氨基酸为Glu；

392位氨基酸为Thr；

396位氨基酸为Leu；

421位氨基酸为Lys；

427位氨基酸为Asn；

428位氨基酸为Phe或Leu中的任一个；

429位氨基酸为Met；

434位氨基酸为Trp；

436位氨基酸为Ile；或者

440位氨基酸为Gly、His、Ile、Leu或Tyr中的任一个。

20.权利要求1～16中任一项所述的应用，其中，所述Fc区为对抑制型Fcγ受体的结合活性高于对活性型Fcγ受体的结合活性的Fc区。

21.权利要求20所述的应用，其中，所述抑制型Fcγ受体为人FcγRIIb。

22.权利要求20或21中任一项所述的应用，其中，所述活性型Fcγ受体为人FcγRIa、人FcγRIIa(R)、人FcγRIIa(H)、人FcγRIIIa(V)或人FcγRIIIa(F)。

23.权利要求20～22中任一项所述的应用，其中，所述Fc区的以EU编号表示的238位或328位的氨基酸包含与天然型人IgG的Fc区的氨基酸不同的氨基酸。

24.权利要求23所述的应用，其中，所述Fc区的以EU编号表示的238位氨基酸为Asp、或者328位氨基酸为Glu。

25.权利要求23或24所述的应用，其中，所述Fc区的氨基酸序列中，为以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸：

233位氨基酸为Asp；

234位氨基酸为Trp或Tyr中的任一个；

239位氨基酸为Asp；

267位氨基酸为Ala、Gln或Val中的任一个；

268位氨基酸为Asn、Asp或Glu中的任一个；

271位氨基酸为Gly；

330位氨基酸为Arg、Lys或Met中的任一个；

323位氨基酸为Ile、Leu或Met中的任一个；或者

296位氨基酸为Asp。

26.具有使抗原从血浆中消失的功能的抗原结合分子的筛选方法，该方法包括以下的步骤(a)～(i)：

步骤(f)，使上述步骤(e)中得到的抗原结合分子与抗原接触；

27.具有使抗原从血浆中消失的功能的抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下的步骤(a)～(d)：

步骤(c)，培养包含载体的宿主细胞，所述载体携带编码在上述步骤(b)中确认到免疫复合体的形成的抗原结合分子的基因；

28.具有使抗原从血浆中消失的功能的抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下的步骤(a)～(i)：

步骤(f)，使上述步骤(e)中得到的抗原结合分子与抗原接触；

步骤(h)，培养包含载体的宿主细胞，所述载体携带编码在上述步骤(g)中确认到免疫复合体的形成的抗原结合分子的基因；

29.具有使抗原从血浆中消失的功能的抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下的步骤(a)～(e)，还包括如下步骤：使通过该制备方法得到的抗原结合分子与抗原接触，以评价包含该抗原结合分子和该抗原的免疫复合体的形成；