JP2018522562A - 抗cd154抗体及びこれを使用する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国特許仮出願第62/367,660号(2016年7月28日出願)及び米国特許仮出願第62/201,150号(2015年8月5日出願)の利益を主張し、前述の各特許出願の全内容を参照により本明細書に組み込む。
本発明は、CD154に特異的に結合する抗体、かかる抗体又は断片をコードしているポリヌクレオチド、並びに前述のものを作製及び使用する方法に関する。
HCDR1残基S1が、A、C、D、E、G、I、K、L、M、N、Q、R、T、又はVに変異しており、
HCDR1残基I4が、M、L、又はVに変異しており、
HCDR1残基S5が、Aに変異しており、
HCDR2残基S3が、A、T、又はVに変異しており、
HCDR2残基P4が、V、T、L Q、又はEに変異しており、
HCDR2残基N8が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、W、又はYに変異しており、
HCDR2残基T9が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、W、又はYに変異しており、
HCDR2残基N10が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、W、又はYに変異しており、
HCDR3残基S1が、A又はMに変異しており、
HCDR3残基R2が、A、S、Q、又はKに変異しており、かつ
HCDR3残基L7が、Mに変異している、
アンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分を提供する。
それぞれ配列番号17、23、30、37、44、及び52のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3;
配列番号59のVH及び配列番号66のVL;又は
配列番号80の重鎖及び配列番号81の軽鎖
を含み、かつ配列番号1のCD154に特異的に結合する、単離されたアンタゴニスト抗体も提供する。
本発明は、高親和性でCD154に特異的に結合して、CD154の生物活性を効果的に中和する、アンタゴニスト抗体を提供する。本発明は、CD154に特異的に結合する抗体が血小板上のFcγRIIaに対し結合すると血小板の活性化及び凝集、並びにそれに続く血栓塞栓症が生じるという現在の理解とは異なり、血小板活性化は、かかる抗体の結合するCD154エピトープにも依存することが本明細書において発見されたことに少なくとも一部基づく。本明細書では、FcγRIIaに働きかけることが可能なCD154上の特定のエピトープに結合する本発明の抗体は、血小板の活性化を介在させないように機能し得ることが発見されている。さらに、本発明の抗体は、所望により、望ましくない免疫賦活機能がさらに発動するのを防止するよう設計されたFcである。そのため、本発明の抗体は、臨床環境下において、CD154に特異的に結合する既存の抗体と比較してより望ましい安全性プロファイルを有し得る。
HCDR1残基S1が、A、C、D、E、G、I、K、L、M、N、Q、R、T、又はVに変異しており、
HCDR1残基I4が、M、L、又はVに変異しており、
HCDR1残基S5が、Aに変異しており、
HCDR2残基S3が、A、T、又はVに変異しており、
HCDR2残基P4が、V、T、L Q、又はEに変異しており、
HCDR2残基N8が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、W、又はYに変異しており、
HCDR2残基T9が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、W、又はYに変異しており、
HCDR2残基N10が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、W、又はYに変異しており、
HCDR3残基S1が、A又はMに変異しており、
HCDR3残基R2が、A、S、Q、又はKに変異しており、かつ
HCDR3残基L7が、Mに変異している、アンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分を提供する。
LCDR1残基Q4が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、R、S、T、V、W、又はYに変異しており、
LCDR1残基S5が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、又はYに変異しており、
LCDR1残基S7が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、又はYに変異しており、
LCDR1残基S8が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、又はYに変異しており、
LCDR2残基A2が、Sに変異しており、
LCDR2残基N3が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、W、又はYに変異しており、
LCDR2残基S4が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、又はYに変異しており、
LCDR2残基L5が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、Q、R、S、T、V、W、又はYに変異しており、
LCDR2残基Q6が、E、D、又はNに変異しており、
LCDR2残基S7が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、又はYに変異しており、
LCDR3残基S3が、Aに変異しており、
LCDR3残基D4が、Nに変異しており、
LCDR3残基S5が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、又はYに変異しており、かつ
LCDR3残基I6が、A、C、D、E、G、K、L、M、N、Q、R、S、T、又はVに変異している。
それぞれ、配列番号36、43、及び51、
それぞれ、配列番号37、44、及び52、
それぞれ、配列番号38、45、及び53、
それぞれ、配列番号39、46、及び54、
それぞれ、配列番号40、47、及び55、
それぞれ、配列番号41、47、及び56、
それぞれ、配列番号42、48、及び57、
それぞれ、配列番号37、49、及び52、又は
それぞれ、配列番号37、50、及び52、の、軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、LCDR2、及びLCDR3を含む。
0.03%のポリソルベートP20及び100μg/mLのウシ血清アルブミンを含有しているダルベッコリン酸緩衝生理食塩水にて、25℃下でProteOn XPR36システムを用いKDを測定したときに、約5×10−9M以下の解離定数(KD)でCD154に結合する。
CD154介在性のヒトB細胞の増殖を、約2.7×10−9M以下のIC50値で阻害する。又は
分泌型胎盤性アルカリホスファターゼ(SEAP)及びヒトCD40を安定的に発現するHEK293細胞において、NF−κB−誘導性インターフェロン−β(IFN−β)ミニマルプロモーター下、約2.1×10−8M以下のIC50値で、SEAPのCD154介在性の発現を阻害する。
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISPIFGNTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRYYGDLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYANSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSDSIPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISPIFGNTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRYYGDLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGASSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSAEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISPIFGNTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRYYGDLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPAAASSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSAEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
それぞれ、配列番号16、22、及び29、
それぞれ、配列番号17、23、及び30、
それぞれ、配列番号16、24、及び31、
それぞれ、配列番号18、25、及び32、
それぞれ、配列番号19、26、及び33、
それぞれ、配列番号20、27、及び34、又は
それぞれ、配列番号21、28、及び35
の、HCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含む、配列番号1のCD154に特異的に結合するアンタゴニスト抗体も提供する。
それぞれ、配列番号16、22、及び29、
それぞれ、配列番号17、23、及び30、
それぞれ、配列番号16、24、及び31、
それぞれ、配列番号18、25、及び32、
それぞれ、配列番号19、26、及び33、
それぞれ、配列番号20、27、及び34、又は
それぞれ、配列番号21、28、及び35、
それぞれ、配列番号36、43、及び51、
それぞれ、配列番号37、44、及び52、
それぞれ、配列番号38、45、及び53、
それぞれ、配列番号39、46、及び54、
それぞれ、配列番号40、47、及び55、
それぞれ、配列番号41、47、及び56、
それぞれ、配列番号42、48、及び57、
それぞれ、配列番号37、49、及び52、又は
それぞれ、配列番号37、50、及び52、の、軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、LCDR2、及びLCDR3を含む。
抗体と、shCD154との免疫複合体が血小板を活性化せず、ここで、血小板活性化は、血小板上のP−セレクチン表面発現により測定される;
実施例1の親和性測定に記載の実験デザインを用い、ProteOn XPR36システムを用いKDを測定したときに、約5×10−9M以下の解離定数(KD)でCD154に結合する;
CD154介在性のヒトB細胞の増殖を、約2.7×10−9M以下のIC50値で阻害する。又は
分泌型胎盤性アルカリホスファターゼ(SEAP)及びヒトCD40を安定的に発現するHEK293細胞において、NF−κB−誘導性インターフェロン−β(IFN−β)ミニマルプロモーター下、約2.1×10−8M以下のIC50値で、SEAPのCD154介在性の発現を阻害する。
抗体と、shCD154との免疫複合体が血小板を活性化せず、ここで、血小板活性化は、血小板上のP−セレクチン表面発現により測定される;
実施例1の親和性測定に記載の実験デザインを用い、ProteOn XPR36システムを用いKDを測定したときに、約5×10−9M以下の解離定数(KD)でCD154に結合する;
CD154介在性のヒトB細胞の増殖を、約2.7×10−9M以下のIC50値で阻害する。又は
分泌型胎盤性アルカリホスファターゼ(SEAP)及びヒトCD40を安定的に発現するHEK293細胞において、NF−κB−誘導性インターフェロン−β(IFN−β)ミニマルプロモーター下、約2.1×10−8M以下のIC50値で、SEAPのCD154介在性の発現を阻害する。
抗体と、shCD154との免疫複合体が血小板を活性化せず、ここで、血小板活性化は、血小板上のP−セレクチン表面発現により測定される;
実施例1の親和性測定に記載の試験デザインを用い、ProteOn XPR36システムを用いKDを測定したときに、約5×10−9M以下の解離定数(KD)でCD154に結合する;
CD154介在性のヒトB細胞の増殖を、約2.7×10−9M以下のIC50値で阻害する。又は
分泌型胎盤性アルカリホスファターゼ(SEAP)及びヒトCD40を安定的に発現するHEK293細胞において、NF−κB−誘導性インターフェロン−β(IFN−β)ミニマルプロモーター下、約2.1×10−8M以下のIC50値で、SEAPのCD154介在性の発現を阻害する。
次の特性のうちの1つ以上を示す:
抗体と、shCD154との免疫複合体が血小板を活性化せず、ここで、血小板活性化は、血小板上のP−セレクチン表面発現により測定される;
実施例1の親和性測定に記載の試験デザインを用い、ProteOn XPR36システムを用いKDを測定したときに、約5×10−9M以下の解離定数(KD)でCD154に結合する;
CD154介在性のヒトB細胞の増殖を約2.7×10−9M以下のIC50値で阻害する;又は
分泌型胎盤性アルカリホスファターゼ(SEAP)及びヒトCD40を安定的に発現するHEK293細胞において、NF−κB−誘導性インターフェロン−β(IFN−β)ミニマルプロモーター下、約2.1×10−8M以下のIC50値で、SEAPのCD154介在性の発現を阻害する。
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCCAGAGCATCAGCAGCTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACGCCAACAGCCTGCAGAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGCGACAGCATCCCCTGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG
CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCGGCACCTTCAGCAGCTACGGCATCAGCTGGGTCCGACAGGCCCCAGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCTGGATCAGCCCCATCTTCGGCAACACCAACTACGCCCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCATCACCGCCGACGAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAAGCCGGTACTACGGCGACCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCCTCT
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCTCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCAGCATGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATCCACTGGGTGCGCCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAATGGGTGGGACGGTTCAACCCCAACAGCGGCGACACCAACGGCGCCCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCATGACCCGGGACACCAGCATCAGCACCGCCTACATGGAACTGACCCGGCTGCGGAGCGACGACACCGCCGTGTACCACTGTGCCAGAGAGGGCGAGCTGGCCGGCATCTTCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCAGC
AGCTACGAGCTGACCCAGCCCCCCAGCGTGTCCGTGTCTCCTGGCCAGACCGCCAGCATCACCTGTAGCGGCGACAAGCTGGGCGACAAATACGTGTCCTGGAACCACCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCGTGCTGGTGATCTACCAGGACCGGAAGAGGCCCAGCGGCATCCCCGAGAGATTCAGCGGCAGCAACAGCGGCAACACCGCCACCCTGACCATCAGCGGCACCCAGGCCATGGACGAGGCCGACTACTACTGCCAGGCCTGGGACAGCAGCACCGTGGTGTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACCGTGCTG
抗体のVHをコードしている第1のポリヌクレオチドと、抗体のVLをコードしている第2のポリヌクレオチドと、を発現ベクターに組み込むことと、
宿主細胞を発現ベクターで形質転換させることと、
VL及びVHが発現し、抗体を形成する条件下で、培養培地中で宿主細胞を培養することと、
宿主細胞又は培養培地からかかる抗体を回収することと、を含む、配列番号1のCD154に特異的に結合する拮抗性抗体を産生する方法も提供する。
本発明のCD154に特異的に結合するアンタゴニスト抗体、例えば、抗体C4LB5、C4LB89、C4LB94、C4LB150、C4LB189、C4LB191、C4LB199、C4LB231、C4LB232、C4LB35、及びC4LB236を、任意の状態又は疾患の治療及び/又は予防に使用することもでき、ここで、CD154の作用を拮抗することは、治療上有効であり得るものであり、かつ疾患の症状を低減し得るものである。これらの例としては、アレルギー、自己免疫、癌、移植、GVHD、炎症及びその他の状態、特に、耐性の誘導及び/又は液性免疫の抑制が治療として望ましい治療が挙げられる。本発明の抗体により治療され得る疾患は、関節炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、炎症性腸疾患、移植、腎移植、皮膚移植、骨髄移植、移植片対宿主病(GVHD)、免疫性血小板減少症(ITP)、多発性硬化症、甲状腺炎、I型糖尿病、又はアテローム性動脈硬化症などの免疫介在性炎症性疾患又は自己免疫疾患である。
本発明は、本発明のCD154に特異的に結合するアンタゴニスト抗体及び医薬的に許容される担体の医薬組成物を提供する。治療用途では、抗体本発明(the antibodies the invention)は、医薬的に許容され得る担体中の活性成分として有効量の抗体を含有する医薬組成物として調製することができる。用語「担体」は、活性化合物と共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。そのようなビヒクルは、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などの、石油、動物、植物、又は合成物起源のものを含む、水及び油などの液体であってよい。例えば、0.4%生理食塩水及び0.3%グリシンを用いることができる。これらの溶液は滅菌され、一般には粒子状物質を含まない。これらは、通常の周知の滅菌法(例えば、濾過)によって滅菌することができる。この組成物には、生理学的条件に近づけるために必要とされる医薬的に許容される補助物質、例えばpH調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などを含有させることができる。そのような医薬製剤中の本発明の分子又は抗体の濃度は幅広く異なってもよく、即ち約0.5重量%未満から、通常は少なくとも約1重量%まで、最大で5重量%、10重量%、15重量%、20重量%、25重量%、30重量%、35重量%、40重量%、45重量%、又は50重量%までであってよく、また、選択される具体的な投与方法に従って、必要とされる用量、流体体積、粘度などに主に基づいて選択される。好適なビヒクル及び製剤(他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む)は、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,Troy,D.B.ed.,Lipincott Williams and Wilkins,Philadelphia,PA 2006,Part 5,Pharmaceutical Manufacturing pp691〜1092に記載され、特にpp.958〜989を参照されたい。
本発明は、本発明の抗体に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
「免疫複合体」は、1つ以上の異種分子(複数可)と融合させた本発明の抗体を指す。
以下に、本明細書の他の箇所の開示に従う、本発明の更なる実施形態を列挙する。本明細書に開示される本発明に関連するものとして上述された本発明の実施形態の特徴は、これらの番号付けされた更なる実施形態のうちの1つ1つにもまた関係する。
1)配列番号1のヒトCD154に特異的に結合するアンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分であって、配列番号17の重鎖相補性決定領域(HCDR)1(SYGIS)と、配列番号23のHCDR2(WISPIFGNTNYAQKFQG)と、配列番号30のHCDR3(SRYYGDLDY)とを含み、場合により、
a)HCDR1残基S1が、A、C、D、E、G、I、K、L、M、N、Q、R、T、又はVに変異しており、
b)HCDR1残基I4が、M、L、又はVに変異しており、
c)HCDR1残基S5が、Aに変異しており、
d)HCDR2残基S3が、A、T、又はVに変異しており、
e)HCDR2残基P4が、V、T、L Q、又はEに変異しており、
f)HCDR2残基N8が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、W、又はYに変異しており、
g)HCDR2残基T9が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、W、又はYに変異しており、
h)HCDR2残基N10が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、W、又はYに変異しており、
i)HCDR3残基S1が、A、又はMに変異しており、
j)HCDR3残基R2が、A、S、Q、又はKに変異しており、
k)HCDR3残基L7が、Mに変異している、アンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分。
2)配列番号37の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1(RASQSISSYLN)と、配列番号44のLCDR2(YANSLQS)と、配列番号52のLCDR3(QQSDSIPWT)と、を含む請求項1に記載の抗体であって、所望により、
a)LCDR1残基Q4が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、R、S、T、V、W、又はYに変異しており、
b)LCDR1残基S5が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、又はYに変異しており、
c)LCDR1残基S7が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、又はYに変異しており、
d)LCDR1残基S8が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、又はYに変異しており、
e)LCDR2残基A2が、Sに変異しており、
f)LCDR2残基N3が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、W、又はYに変異しており、
g)LCDR2残基S4が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、又はYに変異しており、
h)LCDR2残基L5が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、Q、R、S、T、V、W、又はYに変異しており、
i)LCDR2残基Q6が、E、D、又はNに変異しており、
j)LCDR2残基S7が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、又はYに変異しており、
k)LCDR3残基S3が、Aに変異しており、
l)LCDR3残基D4が、Nに変異しており、
m)LCDR3残基S5が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、又はYに変異しており、
n)LCDR3残基I6が、A、C、D、E、G、K、L、M、N、Q、R、S、T、Vに変異している、抗体。
3)配列番号17のHCDR1(SYGIS)と、配列番号23のHCDR2(WISPIFGNTNYAQKFQG)と、配列番号30のHCDR3(SRYYGDLDY)と、配列番号37のLCDR1(RASQSISSYLN)と、配列番号44のLCDR2(YANSLQS)と、配列番号52のLCDR3(QQSDSIPWT)とを含む、実施形態1又は2に記載の抗体。
4)
a)配列番号59のVH及び配列番号66のVL、又は
b)配列番号80の重鎖及び配列番号81の軽鎖を含む、実施形態1〜3のいずれか1つに記載の抗体。
5)配列番号4の可溶性ヒトCD154(shCD154)に特異的に結合する単離されたアンタゴニスト抗体。
6)Fc領域に少なくとも1つの置換を含む、実施形態1〜5のいずれか1つに記載の抗体。
7)抗体がヒト血小板を活性化させない、実施形態1〜6のいずれか1つに記載の抗体。
8)実施例1の親和性測定に記載の試験デザインを用い、ProteOn XPR36システムを用いKDを測定したときに、約5×10−9M以下、約1×10−9M以下、約5×10−10M以下、約1×10−10M以下、約5×10−11M以下、又は約1×10−11M以下の解離定数KDでshCD154に結合する、実施形態1〜7のいずれか1つに記載の抗体。
9)かかる抗体が、約7.0×10−11M〜約6×10−10MのIC50値でshCD154介在性のヒトB細胞の増殖を阻害する、実施形態1〜8のいずれか1つに記載の抗体。
10)かかる抗体が、分泌型胎盤性アルカリホスファターゼ(SEAP)及びヒトCD40を安定的に発現するHEK293細胞において、NF−κB−誘導性インターフェロン−β(IFN−β)ミニマルプロモーター下、約2.1×10−8M以下のIC50値で、SEAPのshCD154介在性の発現を阻害する、実施形態1〜9のいずれか1つに記載の抗体。
11)かかる抗体が、shCD154に対する結合に関し、重鎖可変領域(VH)と軽鎖可変領域(VL)とを含む抗体と競合し、ここで、かかるVHが配列番号59の配列を含み、かかるVLが配列番号66の配列を含む、実施形態1〜10のいずれか1つに記載の抗体。
12)かかる抗体が、重鎖相補性決定領域1(HCDR1)、2(HCDR2)、及び/又は3(HCDR3)における保存的アミノ酸置換を場合により1つ、2つ、又は3つ有する、配列番号58、59、60、61、62、63、又は64のVHのHCDR1、HCDR2、及びHCDR3のアミノ酸配列を含み、ここで、HCDRが、Kabat、Chothia、又はIMGTにより定義されるものである、実施形態1〜11のいずれか1つに記載の抗体。
13)かかる抗体が、軽鎖相補性決定領域1(LCDR1)、2(LCDR2)、及び/又は3(LCDR3)における保存的アミノ酸置換を場合により1つ、2つ、又は3つ有する、配列番号65、66、67、68、69、70、71、72、又は73のVHのLCDR1、LCDR2、及びLCDR3のアミノ酸配列を含み、ここで、LCDRが、Kabat、Chothia、又はIMGTにより定義されるものである、実施形態1〜12のいずれか1つに記載の抗体。
14)
a)それぞれ配列番号16、22、及び29のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3アミノ酸配列と、それらの保存的改変、
b)それぞれ配列番号17、23、及び30のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3アミノ酸配列と、それらの保存的改変、
c)それぞれ配列番号16、24、及び31のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3アミノ酸配列と、それらの保存的改変、
d)それぞれ配列番号18、25、及び32のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3アミノ酸配列と、それらの保存的改変、
e)それぞれ配列番号19、26、及び33のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3アミノ酸配列と、それらの保存的改変、
f)それぞれ配列番号20、27、及び34のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3アミノ酸配列と、それらの保存的改変、又は
g)それぞれ配列番号21、28、及び35のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3アミノ酸配列と、それらの保存的改変
を含む、実施形態1〜13のいずれか1つに記載の抗体。
15)
a)それぞれ配列番号36、43、及び51のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3アミノ酸配列と、それらの保存的改変、
b)それぞれ配列番号37、44、及び52のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3アミノ酸配列と、それらの保存的改変、
c)それぞれ配列番号38、45、及び53のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3アミノ酸配列と、それらの保存的改変、
d)それぞれ配列番号39、46、及び54のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3アミノ酸配列と、それらの保存的改変、
e)それぞれ配列番号40、47、及び55のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3アミノ酸配列と、それらの保存的改変、
f)それぞれ配列番号41、47、及び56のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3アミノ酸配列と、それらの保存的改変、
g)それぞれ配列番号42、48、及び57のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3アミノ酸配列と、それらの保存的改変、
h)それぞれ配列番号37、49、及び52のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3アミノ酸配列と、それらの保存的改変、又は
i)それぞれ配列番号37、50、及び52のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3アミノ酸配列と、それらの保存的改変
を含む、実施形態1〜10のいずれか1つに記載の抗体。
16)
a)それぞれ、配列番号16、22、及び29、
b)それぞれ、配列番号17、23、及び30、
c)それぞれ、配列番号16、24、及び31、
d)それぞれ、配列番号18、25、及び32、
e)それぞれ、配列番号19、26、及び33、
f)それぞれ、配列番号20、27、及び34、又は
それぞれ、配列番号21、28、及び35
の、HCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含む、実施形態1〜15のいずれか1つに記載の抗体。
17)
a)それぞれ、配列番号36、43、及び51、
b)それぞれ、配列番号37、44、及び52、
c)それぞれ、配列番号38、45、及び53、
d)それぞれ、配列番号39、46、及び54、
e)それぞれ、配列番号40、47、及び55、
f)それぞれ、配列番号41、47、及び56、
g)それぞれ、配列番号42、48、及び57、
h)それぞれ、配列番号37、49、及び52、又は
i)それぞれ、配列番号37、50、及び52
の、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、実施形態1〜16のいずれか1つに記載の抗体。
18)それぞれ配列番号16、22、及び29のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3と、それぞれ配列番号36、43、及び51のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3とを含む実施形態1〜17のいずれか1つに記載の抗体。
19)それぞれ配列番号17、23、及び30のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3と、それぞれ配列番号37、44、及び52のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3とを含む実施形態1〜17のいずれか1つに記載の抗体。
20)それぞれ配列番号16、24、及び31のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3と、それぞれ配列番号38、45、及び53のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3とを含む実施形態1〜17のいずれか1つに記載の抗体。
21)それぞれ配列番号18、25、及び32のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3と、それぞれ配列番号39、46、及び54のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3とを含む実施形態1〜17のいずれか1つに記載の抗体。
22)それぞれ配列番号19、26、及び33のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3と、それぞれ配列番号40、47、及び55のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3とを含む実施形態1〜17のいずれか1つに記載の抗体。
23)それぞれ配列番号20、27、及び34のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3と、それぞれ配列番号41、47、及び56のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3とを含む実施形態1〜17のいずれか1つに記載の抗体。
24)それぞれ配列番号21、28、及び35のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3と、それぞれ配列番号42、48、及び57のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3とを含む実施形態1〜17のいずれか1つに記載の抗体。
25)それぞれ配列番号17、23、及び30のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3と、それぞれ配列番号37、49、及び52のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3とを含む実施形態1〜17のいずれか1つに記載の抗体。
26)それぞれ配列番号17、23、及び30のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3と、それぞれ配列番号37、50、及び52のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3とを含む実施形態1〜17のいずれか1つに記載の抗体。
27)配列番号58、59、60、61、62、63、又は64のVHと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%相同であるVHを含む、実施形態1〜26のいずれか1つに記載の抗体。
28)配列番号65、66、67、68、69、70、71、72、又は73のVLと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%相同であるVLを含む、実施形態1〜27のいずれか1つに記載の抗体。
29)配列番号58のVHと配列番号65のVLとを含み、ここで、場合により、VH、VL、又はVH及びVLの両方が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15個のアミノ酸置換を含む、実施形態1〜28のいずれか1つに記載の抗体。
30)配列番号59のVHと配列番号66のVLとを含み、ここで、場合により、VH、VL、又はVH及びVLの両方が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15個のアミノ酸置換を含む、実施形態1〜28のいずれか1つに記載の抗体。
31)配列番号60のVHと配列番号67のVLとを含み、ここで、場合により、VH、VL、又はVH及びVLの両方が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15個のアミノ酸置換を含む、実施形態1〜28のいずれか1つに記載の抗体。
32)配列番号61のVHと配列番号68のVLとを含み、ここで、場合により、VH、VL、又はVH及びVLの両方が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15個のアミノ酸置換を含む、実施形態1〜28のいずれか1つに記載の抗体。
33)配列番号62のVHと配列番号69のVLとを含み、ここで、場合により、VH、VL、又はVH及びVLの両方が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15個のアミノ酸置換を含む、実施形態1〜28のいずれか1つに記載の抗体。
34)配列番号63のVHと配列番号70のVLとを含み、ここで、場合により、VH、VL、又はVH及びVLの両方が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15個のアミノ酸置換を含む、実施形態1〜28のいずれか1つに記載の抗体。
35)配列番号64のVHと配列番号71のVLとを含み、ここで、場合により、VH、VL、又はVH及びVLの両方が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15個のアミノ酸置換を含む、実施形態1〜28のいずれか1つに記載の抗体。
36)配列番号59のVHと配列番号72のVLとを含み、ここで、場合により、VH、VL、又はVH及びVLの両方が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15個のアミノ酸置換を含む、実施形態1〜28のいずれか1つに記載の抗体。
37)配列番号59のVHと配列番号73のVLとを含み、ここで、場合により、VH、VL、又はVH及びVLの両方が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15個のアミノ酸置換を含む、実施形態1〜28のいずれか1つに記載の抗体。
38)Fc領域に少なくとも1つの置換を含む、実施形態1〜37のいずれか1つに記載の抗体。
39)Fc領域における少なくとも1つの置換が、置換L234A、L235A、G237A、P238S、H268A、A330S、及びP331Sであり、ここで、残基付番はEUインデックスに準拠する、実施形態1〜38のいずれか1つに記載の抗体。
40)Fc領域における少なくとも1つの置換が、置換V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S、及びP331Sであり、ここで、残基付番はEUインデックスに準拠する、実施形態1〜38のいずれか1つに記載の抗体。
41)かかる抗体が、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4のアイソタイプである、実施形態1〜40のいずれか1つに記載の抗体。
42)抗体パラトープ残基の全てがVHに存在する、実施形態1〜41のいずれか1つに記載の抗体。
43)かかる抗体が、可溶性ヒトCD154三量体内の、第1のCD154モノマー及び第2のCD154モノマーに同時に結合する、実施形態1〜42のいずれか1つに記載の抗体。
44)かかる抗体が、配列番号1のCD154のアミノ酸残基182〜207内の、第1のCD154モノマー中の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、又は8個のCD154残基に結合し、ここで、残基付番は配列番号1に準拠する、実施形態43に記載の抗体。
45)かかる抗体が、配列番号1のCD154のアミノ酸残基176〜253内の、第2のCD154モノマー中の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、又は8個のCD154残基に結合し、ここで、残基付番は配列番号1に準拠する、実施形態43又は44に記載の抗体。
46)かかる抗体が、第1のCD154モノマー中の残基E182、S185、Q186、A187、P188、S214、A215、及びR207に結合し、ここで、残基付番は配列番号1に準拠する、実施形態43〜45のいずれか1つに記載の抗体。
47)かかる抗体が、第2のCD154モノマー中の残基T176、F177、C178、Q220、S248、H249、G250、及びF353に結合し、ここで、残基付番は配列番号1に準拠する、実施形態43〜46のいずれか1つに記載の抗体。
48)異なる結合特異性を有する第2の抗原結合分子に結合している実施形態1〜47のいずれか1つに記載の抗体又はその抗原結合部分を含む二重特異性分子。
49)
a)shCD154との免疫複合体においてヒト血小板を活性化しない、
b)解離定数KD約5×10−9M以下でshCD154に結合する、
c)shCD154介在性のヒトB細胞の増殖を阻害する、又は
d)NF−κB−SEAPレポーター遺伝子アッセイにおいてCD154生物活性を阻害する、実施形態1〜47のいずれか一項に記載の抗体又は請求項48に記載の二重特異性分子。
50)治療薬又は造影剤に結合させた実施形態1〜47のいずれか1つに記載の抗体又はその抗原結合部分を含む免疫複合体。
51)実施形態1〜47のいずれか1つに記載の抗体と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
52)実施形態1〜47のいずれか1つに記載の抗体VH、抗体VL、又は抗体VHと抗体VLとをコードしているポリヌクレオチド。
53)実施形態52に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
54)実施形態53に記載のベクターを含む宿主細胞。
55)抗体が発現される条件下で実施形態54に記載の宿主細胞を培養することと、宿主細胞より産生された抗体を回収することと、を含む、抗体の産生方法。
56)自己免疫疾患又は免疫介在性炎症性疾患の治療に使用するための、実施形態1〜47のいずれかに記載の抗体、又は実施形態51に記載の医薬組成物。
57)関節炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、炎症性腸疾患、移植、腎移植、皮膚移植、骨髄移植、移植片対宿主病(GVHD)、免疫性血小板減少症(ITP)、多発性硬化症、甲状腺炎、1型糖尿病、又はアテローム性動脈硬化症に使用するための、実施形態1〜47のいずれか1つに記載の抗体。
58)関節リウマチの治療に使用するための実施形態1〜47のいずれか1つに記載の抗体。
59)狼瘡の治療に使用するための実施形態1〜47のいずれか1つに記載の抗体。
60)移植の処置(treatment of transplantation)に使用するための実施形態1〜47のいずれか1つに記載の抗体。
61)炎症性腸疾患の治療に使用するための実施形態1〜47のいずれか1つに記載の抗体。
62)実施形態56〜61のいずれの記載に従って第2の治療薬と組み合わせて使用するための実施形態1〜47のいずれかに記載の抗体。
63)第2の治療薬が、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)、サリチラート、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、コルチコステロイド、細胞毒性剤、免疫抑制剤、及び/又は抗体である、実施形態62に記載の抗体。
使用するタンパク質の生成
内因性CD154シグナルは三量体であることから、組換CD154を様々な方法で発現させて機能性の組換三量体を得た。可溶性ヒトCD154(shCD154;配列番号4)、コモンマーモセット(Callithrix jacchus)(本明細書においてマーモセットとして呼称)の可溶性CD154(smCD154;配列番号5)又はカニクイザル(Macaca fascicularis)(本明細書においてカニクイザルとして呼称)の可溶性CD154(scCD154;配列番号6)をクローニングし、His6(配列番号10)融合体(shCD154−his,配列番号7;smCD154−his,配列番号8;scCD154−his,配列番号9)として、又はロイシンジッパー(ILZ)(配列番号11)との融合体(shCD154−ILZ,配列番号12;smCD154−ILZ,配列番号13;scCD154−ILZ,配列番号14)として発現させた。標準法を用いクローニング、発現、及びタンパク質精製を行った。His融合体及びILZ融合体のいずれもほとんどが三量体であった。EZ−Link(商標)スルホ−NHS−LC−ビオチンと、標識キット(Thermo,カタログ番号21327)を用いsmCD154及びsmCD154−ILZをビオチニル化した。ビオチニル化の成功をHABA−アビジンアッセイ(Thermo,カタログ番号46610)及びOctetにより分析した。ヒトCD40(配列番号15)を発現している細胞をいくつかのアッセイに使用した。ヒトCD154を内因的に発現しているD1.1 Jurkat細胞(ATCC(登録商標)CRL−10915(商標)をいくつかのアッセイに使用した。
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ProteOn XPR36システム(BioRad)使用して表面プラズモン共鳴(SPR)を用い、親和性測定を実施した。アミンカップリング化学反応についての製造元の使用説明書を用い、抗ヒトIgG Fc(Jacksonカタログ番号109〜005〜098)を、GLCチップ(BioRad,カタログ番号176〜5011)の加工アルギン酸ポリマー層にカップリングさせて、バイオセンサー表面を調製した。約4700 RU(レスポンスユニット)の被検抗体を固定した。速度論的実験を、ランニングバッファー(DPBS+0.03%ポリソルベートP20+100μg/mL BSA)で25℃にて実施した。速度論的実験を実施するにあたり、0.391nM〜100nM(4倍段階希釈)の範囲の濃度の分析種(shCD154−his及びsmCD154−his)の注入後100 RUの抗体を捕捉した。50μL/分で3分間会合段階をモニターした後、15分間緩衝液を流した(解離段階)。100μL/分で100mM H3PO4(Sigma、カタログ番号7961)を18秒間ずつ2回流してチップ表面を再生した。
細胞活性化のマーカーとしてCD54を用い、抗CD154抗体がRamos細胞の活性化を阻害する能力を評価した。供給元のプロトコルに準拠して維持したRamos細胞(バーキットリンパ腫細胞,ATCC(登録商標)CRL−1596(商標))を、100μL/ウェルの完全増殖培地を入れた96ウェルV底プレートに2.0×105個/ウェルで播種した。0.2、2、又は20μg/mLの被検抗体を、40ng/mL smCD154−hisと室温で1時間プレインキュベートした後、細胞に加えた。プレートをカバーし終夜インキュベートした(37℃,5% CO2)。翌日、アッセイプレートをスピンダウンし、使用済みの処理培地を除去した。得られた細胞ペレットを冷PBS/2% FBSで洗浄した後、かかる細胞を、PE標識した抗CD54(ICAM−1)抗体又は適切な対照アイソタイプにより4℃で1時間染色した。細胞を冷PBS/2% FBSで洗浄し、100μL/ウェルにて冷PBS/2% FBSに再懸濁し、フローサイトメーターで蛍光シグナル(黄色チャネル)を測定した。次の基準、「5C8抗体と比較したときの%力価が5C8の力価の5%を超過している」を満たしたとき、抗体はアンタゴニストであるものと判定された。ここで、%力価とは、試験した中で最も高濃度の5C8と比較して正規化した阻害率(%)を指す。
抗CD154抗体が、CD154により誘導されるCD40下流のシグナル伝達経路を阻害する能力を、ヒトCD40を発現するよう改変したHEK−Blue(商標)CD40L細胞(Invivogen)を用い評価して、NF−κB−誘導性プロモーター(IFN−κミニマルプロモーター)の制御下、分泌型胎盤性アルカリホスファターゼ(SEAP)レポーター遺伝子を導入した。細胞を、ヒト若しくはカニクイザルCD154のいずれか、又はJurkat細胞により刺激した。HEK−Blue(商標)CD40L細胞を供給元のプロトコルに準拠して維持し、全ての活性アッセイを、10%ウシ胎仔血清(熱失活)と1倍濃度のGlutamaxとを添加したDMEMで行った。細胞を、1ウェル当たり2.5又は5×104個の細胞密度、100μL用量で96ウェル組織培養プレートに播種し、終夜インキュベートした(37℃,5% CO2)。翌日、shCD154−His若しくはshCD154−ILZ、又はD1.1Jurkat細胞の4倍濃度の溶液を、抗CD154抗体の4倍濃度の溶液(適した濃度にて)と1:1の割合でプレインキュベートして、2倍濃度のCD154:抗体のプレ複合体混合物溶液を得た。CD154:抗体混合物は室温で1時間インキュベートし、一方D1.1Jurkat:mAb混合物は37℃かつ5% CO2で1時間インキュベートした。プレ複合体インキュベート時間の終了時に、HEK−Blue(商標)CD40L細胞を入れた96ウェルアッセイプレートに2倍濃度のプレ複合体溶液100μL/ウェルを添加した。最終アッセイ用量は、最終濃度80ng/mLのshCD154−His、若しくは40ng/mLのshCD154−ILZのCD154、若しくは2.5〜6.0×104個のD1.1Jurkat細胞で200μL/ウェルとした。16〜24時間の処理時間後(37℃,5% CO2)、40μL/ウェルの上清を160μL/ウェルのQUANTI−Blue(商標)(Invivogen)と37℃で30〜60インキュベートし、吸光度(650nm)を測定することにより、上清のホスファターゼ活性を分析した(SEAP)。
抗CD154抗体によるJurkat細胞介在性のDC活性化阻害能を、DCによる各種サイトカインの産生低下を測定することにより評価した。ヒト単球(Biologic Specialties)を50ng/mLのIL−4及びGM−CSFと共に6日間培養した。細胞には3日目に新しい培地(IL−4及びGM−CSF添加)を補充した。6日目の細胞アッセイには未成熟なDCs(iDCs)(CD1a+CD14low CD83−)を使用した。2.5×105個のD1.1 Jurkat細胞(1000radで放射線照射)を0.000064〜25μg/mL μg/mLの抗CD154抗体と共に15〜20分間インキュベートした後、96ウェル丸底プレートで、200μL/ウェルの最終用量にて2.5×104個のiDCと共培養した。48時間のインキュベート後、サイトカイン分析のため上清を回収した。
抗CD154抗体によるJurkat細胞介在性B細胞活性化阻害能を、B細胞の増殖に対する抗体の作用を評価することにより評価した。1×105個のD1.1 Jurkat細胞(5000radで放射線照射)を、IL−21(100ng/mL)及び0.0077ng/mL−15μg/mLの抗CD154抗体の存在下、96ウェル丸底プレートで200μL/ウェルの最終用量にて、1×105個のヒト扁桃体B細胞と共培養した。2日間のインキュベート後、メチル(−3H)−チミジン(0.5μCi/ウェル)を培養物に添加し、終夜インキュベートした後、ヒトB細胞の増殖を測定した。
抗CD154抗体による組換CD154介在性B細胞活性化阻害能を、ヒト又はカニクイザルのB細胞において評価した。1×105個のヒト扁桃体B細胞又はカニクイザル脾臓細胞を、96ウェル丸底プレートで200μL/ウェルの最終用量にて100ng/mLのrhIL−21、0.5μg/mLのshCD154−ILZ、及び0.0077ng/mL〜15μg/mLの抗CD154抗体を用い培養した。2日間のインキュベート後、メチル(−3H)−チミジン(0.5μCi/ウェル)を培養物に添加し、終夜インキュベートした後、ヒトB細胞の増殖を測定した。
CD154結合性のFabを、Shi et al.,J Mol Biol 397:385〜96,2010、国際公開第2009/085462号、米国特許出願公開第2010/0021477号)に記載のものなどの新規のpIXファージディスプレイからスクリーニングした。簡潔に言えば、ライブラリは、ヒトスキャフォールドを多様化することによって作製されたものであり、生殖細胞系列VH遺伝子であるIGHV1−69*01、IGHV3−23*01及びIGHV5−51*01をH3ループを介してヒトIGHJ−4ミニ遺伝子で組み替え、そしてヒト生殖細胞系列VLκ遺伝子であるO12(IGKV1−39*01)、L6(IGKV3−11*01)、A27(IGKV3−20*01)及びB3(IGKV4−1*01)をIGKJ−1ミニ遺伝子で組み替えることで、完全なVH及びVLドメインを構築した。多様化に際し、重鎖及び軽鎖可変領域内の、タンパク質抗原及びペプチド抗原と高頻度に接していると確認された位置に相当するH1、H2、L1、L2及びL3ループ周辺の位置を選択した。選択した位置での配列多様性は、それぞれのIGHV又はIGLV遺伝子のIGHV又はIGLV生殖系列遺伝子ファミリーのそれぞれの位置で見られる残基に制限した。長さがアミノ酸7〜14個分の単鎖〜中鎖型の合成ループを用いることで、H3ループにおいて多様性が発生した。H3でのアミノ酸分布は、ヒト抗体において観察されるアミノ酸の変動を模倣するよう設計された。ライブラリ設計の詳細は、Shi et al.,J Mol Biol 397:385〜96,2010に記載されている。ライブラリを生成するために利用した足場は、これらの由来するヒトVH及びVL生殖系列遺伝子に準じて命名した。smCD154又は完全長のカニクイザルCD154を発現している細胞に対するパニング実験にあたって、3つの重鎖ライブラリを、4個の生殖系列軽鎖又は生殖系列軽鎖ライブラリと組み合わせることで12とおりの固有の組み合わせのVH:VLを作製した。
ヒト免疫グロブリンの遺伝子座を発現しているトランスジェニックラット、OmniRat(登録商標);OMT,Incを使用して、抗CD154抗体を作製した。OmniRat(登録商標)の内在性イムノグロブリン遺伝子座は、ラットCH遺伝子座に連結させたヒトIgκ及びIgλ遺伝子座と、ヒト由来のVセグメント、Dセグメント、及びJセグメントを有するヒト/ラットキメラIgH遺伝子座とにより置き換えられている。かかるIgH遺伝子座は、22個のヒトVHセグメントと、全てのヒトDセグメント及びJHセグメントとを天然の構成でラットCH遺伝子座に連結して含有する。OmniRat(登録商標)の作製及び特性評価は、Osborn,et al.J Immunol 190:1481〜1490,2013、及び国際公開第2014/093908号に記載されている。
ファージディスプレイ又はヒトイムノグロブリン遺伝子座を発現する遺伝子導入マウスにより得られ、実施例2及び3に記載のとおりのアンタゴニスト活性を示したいくつかの抗CD154抗体を配列決定し、さらにヒト及びカニクイザル樹状細胞に対する結合、ヒト及びカニクイザル樹状細胞及びB細胞に対する機能阻害能、並びに抗体エフェクター機能について特性評価した。標準的な方法を用い、抗体のVH領域及びVL領域を配列決定した。
抗体C4LB89のVLは、LCDR2に推定脱アミノ化部位を含んでいた(軽鎖C4LL49中N52〜S53,配列番号66)。VL中各位置(N52S及びS53T)に対する置換は別個に行った。変異した軽鎖を親重鎖C4LH165(配列番号59)と同時発現させて、抗体C4LB235及びC4LB236をIgG2σ/κとして作製した。LCDR2、並びにC4LB235及びC4LB236のVLのアミノ酸配列をそれぞれ表13及び表14に示す。C4LB235は、配列番号17、23、及び30のHCDR、配列番号37、49、及び52のLCDR、配列番号59のVH、並びに配列番号72のVLを含む。C4LB236は、配列番号17、23、及び30のHCDR、配列番号37、50、及び52のLCDR、配列番号59のVH、並びに配列番号73のVLを含む。
抗CD154抗体は、臨床における自己免疫疾患患者においてポジティブな結果伴い開発されてきたものの、血栓塞栓症(TE)が随伴することより、かかる抗体の更なる臨床開発は中断された。ヒト化5c8抗体(IgG1/κ)は、臨床的に誘導されたTEにおける抗CD154抗体である(Yazdany et al.,Lupus 13:377〜380,2004)。ヒト化5c8により介在される血栓塞栓症(TE)は、Fcを血小板FcγRIIa受容体に結合させることにより血小板を架橋するハイオーダーでの抗CD154/CD154免疫複合体(IC)の形成による血小板活性化及び凝集の結果として生じることが仮定される。インビトロでは、FcγRIIa受容体結合能を欠いている機能欠失Fc(IgG1中D265A置換)を有するよう設計した5c8抗体は血小板を活性化させなかった(Xie et al.,J Immunol 192:4083〜4092,2014)。
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抗体C4LB89の可変領域を、IgG1σ/及びIgG1σYTEアイソタイプとしてクローン化して、機能性及び開発有効性(developability)における潜在的な差異を評価した。新しい抗体をC4LB231(IgG1σ)及びC4LB232(IgG1σYTE)と命名した。
ProteOnを用い、実施例1に記載のとおり親和性測定を行った。会合速度(on-rate)、解離速度(off-rate)及び親和性を表16に示す。この表中に報告したパラメーターは、2相結合モデルを適用したC4LB94及びC4LB150を除き全てのサンプルについてラングミュア型の1:1結合モデルにより得られた。
X線結晶構造解析を用い、抗体C4LB89のエピトープを同定した。Hisタグを付与したC4LB89のFab断片と、Hisタグを付与した可溶型のマーモセットCD40L(smCD154−his)とをHEK293 GnTI細胞で発現させて、親和性及びサイズ排除クロマトグラフィーを用い精製した。smCD154:C4LB89複合体を4℃で終夜インキュベートし、濃縮し、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて複合体を形成していない分析種から分離した。16% PEG 3350、0.2M クエン酸アンモニウム、0.1M MES(pH6.5)を含む溶液から蒸気拡散法によりこの複合体を結晶化した。この結晶は162.1Åの単位格子乗数で立方晶系空間群P213に属する。複合体の構造は、検索モデルとしてC4LB89 Fab及びCD40L(PDB entry 1ALY)の結晶構造を用いる分子置換モデルにより決定した。
C4LB89可変領域(配列番号59のVH及び配列番号66のVL)をIgG1/κとしてクローン化し、C4LB237抗体を得た。実施例1に記載のとおりにProteOnを用いて測定したとき、C4LB237はヒトCD154(表17)結合能を保持していることが確認された。C4LB237のヒトCD154に対する親和性は23.6±5.4pMであった。IgG2σ由来のC4LB89から誘導されるVH/VLのアイソタイプのIgG1へのスイッチは、得られた抗体の結合親和性を変えるようである。
CD154と複合体を形成しているC4LB89の結晶構造解析により、C4LB89のCDRにおける、複合体の全体構造に影響を及ぼさずに変異を導入可能であり、ひいてはC4LB89抗体の特性に影響しないことが予想される部分が明らかとなった。軽鎖CDRにおけるこれらの中立変異を表19に掲載し、重鎖CDRについては表20に掲載する。変異を導入可能な残基付番を、各CDR及びVL又はVHの両方に対し示す。例えば、配列番号37のLCDR1上の残基Q4(RASQSISSYLN)は、抗体の特性を実質的に変化させずにA、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、R、S、T、V、W、又はYへと変異誘導可能である。配列番号66のVLにおける対応する残基はQ27である。
Fab領域と、C4LB231及び5C8IgG1のshCD154との結晶構造データの評価、SC−HPLC及びDLSによる上記の実験、並びに血小板活性化データのレビューに関する評価をもとに、抗CD154抗体とshCD154三量体との結合におけるわずかな差が、ハイオーダーの免疫複合体形成を促進し得るとの仮説を立てた。1)C4LB231 Fabは、sCD154三量体の2つのサブユニット間に結合する一方で、5C8 Fabは、sCD154の1つのサブユニットに結合する。2)C4LB231 Fabは、5c8 Fabと比較して、立体構造がより安定であり、かつ3)抗CD154抗体とのsCD154結合角度がより安定なようである。
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SE−HPLC
表21に示す抗体と、Alexafluo−448標識shCD154との免疫複合体を、110μLの1xPBSで、抗体:shCD154のモル比を1:1及び10:1で調製し、37℃で30分間インキュベートした。各測定にあたり、5μgのAF488標識shCD154と、15μg(1:1比)又は150μg(10:1比)の抗CD154mAbとを含有する100μLの各サンプルをカラムに注入した(Agilent,1100/1200システム)。標準の保持時間をもとに分子量を計算した(Bio−Rad)。タンパク質の分子量と保持時間との関係は次式を満たす。
log(M)=b−cT,
式中、Mは分子量であり、Tは保持時間であり、かつb及びcは定数である。log(M)及びTの線形曲線(linear curve)は、R2=0.9928とした最小二乗法により標準SE−HPLCクロマトグラムから得た。
DLS測定は、光散乱の原理と、分子運動又はブラウン運動とに基づくものである。ブラウン運動、典型的には、溶液中の分子挙動は、相の内外の両方で光散乱を招き、建設的干渉及び破壊的干渉を生じる。その結果が、時間に伴う散乱光の強度の変動である。DLS又はQELS(順弾性光散乱)解析中、散乱光強度におけるこの時間依存性の変動は高速光子カウンターにより捕捉される。この変動は、分散速度に正比例する。ストークス・アインシュタインの式を用いた相関データの分析により、流体力学的半径を得た。サンプルの分析により単量体及び二量体を識別可能なSEC−MALS又はSECとは異なり、DLSは約4のサイズファクター(size factor)により分類される分析種の分析のみが可能であり、したがって、単量体及び四量体が分析されはじめる。しかしながら、単量体と二量体とは識別されず、混合物の重量平均が報告されることになる。
D=拡散係数、
k=ボルツマン定数
T=温度
η=粘度
血小板活性化
shCD154と、Fcを欠失させたIgG2σ若しくはIgG1σとして、又は野生型IgG1として発現させた抗体との免疫複合体による血小板活性化能を評価した。様々なIgG足場に対しクローン化した5c8抗体を対照として使用した。図3は、抗FcγRIIa抗体が5c8IgG1介在性の血小板活性化を阻害したことから、5c8IgG1:shCD154免疫複合体がFcγRIIaに依存した方法で血小板を活性化したことを示す。エフェクターを欠失させたFc、IgG1σ、又はIgG2σでクローン化した5c8 VH/VL領域は、それらの血小板活性化能を失っていた(図1)。これらの結果は、これまでに記載した内容と一致している。しかしながら、予想外にも、実施例10で実施した実験により、野生型IgG1抗体との免疫複合体(C4LBB237:shCD154)は血小板(図7)を活性化しないことが示され、可能性のある、エピトープに依存性の血小板活性化に研究をさらに進めた。
SE−HPLC及びDLSを使用して、ハイオーダーの免疫複合体の形成の存在、並びにこれらの、表21に示す抗CD154抗体とshCD154との免疫複合体の適切な大きさと、をさらに評価した。shCD154は溶液中で三量体であることから、溶液中の抗体:shCD154三量体に見込まれる化学量論は3:1である。カラムから溶出不能であり、低収率(%)が確認されている非常に大きい免疫複合体とを例外として、SE−HPLCに関しては、免疫複合体が重くなるほど、ひいては大きくなるほど保持時間が短くなる一方で、免疫複合体が軽くなるほど、ひいては小さくなるほど保持時間が長くなる。DLSの場合、半径(Rh)値が大きくなるほど免疫複合体が大きくなる。プレートDLS法では、IgG単量体、二量体、三量体、及び四量体を識別できない。したがって、得られるRh値は単量体−三量体の重量平均となり、Rh値が6.5に近くなるほど、mAb溶液がハイオーダーの分析種を、典型的には二量体を含有していることを表し得る。mAbのshCD154に対する結合が化学量論的なものである場合、2種類の分析種は、3:1複合体(約500kDa)と、未結合の抗体(約150kDa)とで表されることになり、この場合、約8.8nm及び5〜6.5nmのRh値がそれぞれ3:1複合体及び未結合のmAbに相当する。いずれの技法でも、免疫複合体の分子量を正確に分類できないものの、相対的な大きさでの分類も可能である。表23は、保持時間及び流体力学的半径とおよその分子量との関係を示す。
CD154を含まないmAb、及び抗体:shCD154免疫複合体の大きさを、抗体(10:1モル比)過剰、及び等濃度(1:1モル比)で抗体:shCD154複合体が形成される条件下で評価した。抗体が過剰な条件下では、抗体は、典型的には、CD154部位飽和させて免疫複合体を形成し、未結合の過剰な抗体が存在する。等濃度下では、未結合の抗体又は未結合のshCD154は存在しない。shCD154の非存在下、及びモル濃度比10:1及び10:10でのshCD154の存在下で、各mAbについて得られたRh値を表24に示す。
表25は、SE−HPLC分析により得られた、抗CD154抗体単独、及びshCD154との免疫複合体の保持時間、回収率、及び推定分子量(MW)を示す。典型的な抗体は、約150kDのMWを有し、shCD154三量体は約50kDaのMWを有する。したがって、化学量論比が3:1であるmAb:shCD154三量体複合体の有する推定分子量は約500kDaである。
Claims (81)
- 配列番号1のヒトCD154に特異的に結合する単離されたアンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分であって、配列番号17の重鎖相補性決定領域(HCDR)1(SYGIS)と、配列番号23のHCDR2(WISPIFGNTNYAQKFQG)と、配列番号30のHCDR3(SRYYGDLDY)とを含み、場合により、
a)前記HCDR1残基S1が、A、C、D、E、G、I、K、L、M、N、Q、R、T、又はVに変異しており、
b)前記HCDR1残基I4が、M、L、又はVに変異しており、
c)前記HCDR1残基S5が、Aに変異しており、
d)前記HCDR2残基S3が、A、T、又はVに変異しており、
e)前記HCDR2残基P4が、V、T、L Q、又はEに変異しており、
f)前記HCDR2残基N8が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、W、又はYに変異しており、
g)前記HCDR2残基T9が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、W、又はYに変異しており、
h)前記HCDR2残基N10が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、W、又はYに変異しており、
i)前記HCDR3残基S1が、A、又はMに変異しており、
j)前記HCDR3残基R2が、A、S、Q、又はKに変異しており、および、
k)前記HCDR3残基L7が、Mに変異している、単離されたアンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分。 - 配列番号37の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1(RASQSISSYLN)と、配列番号44のLCDR2(YANSLQS)と、配列番号52のLCDR3(QQSDSIPWT)と、を含み、場合により、
a)前記LCDR1残基Q4が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、R、S、T、V、W、又はYに変異しており、
b)前記LCDR1残基S5が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、又はYに変異しており、
c)前記LCDR1残基S7が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、又はYに変異しており、
d)前記LCDR1残基S8が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、又はYに変異しており、
e)前記LCDR2残基A2が、Sに変異しており、
f)前記LCDR2残基N3が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、W、又はYに変異しており、
g)前記LCDR2残基S4が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、又はYに変異しており、
h)前記LCDR2残基L5が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、Q、R、S、T、V、W、又はYに変異しており、
i)前記LCDR2残基Q6が、E、D、又はNに変異しており、
j)前記LCDR2残基S7が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、又はYに変異しており、
k)前記LCDR3残基S3が、Aに変異しており、
l)前記LCDR3残基D4が、Nに変異しており、
m)前記LCDR3残基S5が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、又はYに変異しており、および、
n)前記LCDR3残基I6が、A、C、D、E、G、K、L、M、N、Q、R、S、T、Vに変異している、請求項1に記載の抗体。 - a)それぞれ、配列番号36、43、及び51、
b)それぞれ、配列番号37、44、及び52、
c)それぞれ、配列番号38、45、及び53、
d)それぞれ、配列番号39、46、及び54、
e)それぞれ、配列番号40、47、及び55、
f)それぞれ、配列番号41、47、及び56、
g)それぞれ、配列番号42、48、及び57、
h)それぞれ、配列番号37、49、及び52、又は
i)それぞれ、配列番号37、50、及び52
の、軽鎖相補性決定領域(LCDR1)、LCDR2、及びLCDR3を含む、請求項1に記載の抗体。 - 前記配列番号17のHCDR1(SYGIS)と、前記配列番号23のHCDR2(WISPIFGNTNYAQKFQG)と、前記配列番号30のHCDR3(SRYYGDLDY)と、前記配列番号37のLCDR1(RASQSISSYLN)と、前記配列番号44のLCDR2(YANSLQS)と、前記配列番号52のLCDR3(QQSDSIPWT)とを含む、請求項2に記載の抗体。
- 前記抗体が、以下の特性:
a)前記抗体と、可溶性ヒトCD154(shCD154)との免疫複合体が、血小板を活性化せず、ここで、血小板活性化は、血小板上のP−セレクチン表面発現により測定される;
b)0.03%のポリソルベートP20及び100μg/mLのウシ血清アルブミンを含有しているダルベッコリン酸緩衝生理食塩水にて、25℃下でProteOn XPR36システムを用いKDを測定したときに、約5×10−9M以下の解離定数(KD)でCD154に結合する;
c)CD154介在性のヒトB細胞の増殖を約2.7×10−9M以下のIC50値で阻害する;又は
d)分泌型胎盤性アルカリホスファターゼ(SEAP)及びヒトCD40を安定的に発現するHEK293細胞において、NF−κB−誘導性インターフェロン−β(IFN−β)ミニマルプロモーター下、約2.1×10−8M以下のIC50値で、SEAPのCD154介在性の発現を阻害する;
のうちの少なくとも1つを有する、請求項2に記載の抗体。 - CD154がホモ三量体であり、前記抗体が、前記ホモ三量体中の第1のCD154モノマーにCD154のアミノ酸残基182〜207内で結合し、前記ホモ三量体中の第2のCD154モノマーにCD154のアミノ酸残基176〜253内で結合し、ここで、残基付番は配列番号1に準拠する、請求項2に記載の抗体。
- 前記抗体が、前記第1のCD154モノマー中の残基E182、S185、Q186、A187、P188、S214、A215、及びR207に結合し、ここで残基付番は配列番号1に準拠する、請求項6に記載の抗体。
- 前記抗体が、前記第2のCD154モノマー中の残基T176、F177、C178、Q220、S248、H249、G250、及びF353に結合し、ここで残基付番は配列番号1に準拠する、請求項6に記載の抗体。
- 配列番号59の重鎖可変領域(VH)を含み、場合により、前記VHは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15個のアミノ酸置換を含む、請求項2に記載の抗体。
- 配列番号65、66、67、68、69、70、71、72、又は73の軽鎖可変領域(VL)を含み、場合により、前記VLは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15個のアミノ酸置換を含む、請求項9に記載の抗体。
- 配列番号66、72、又は73の前記VLを含む、請求項10に記載の抗体。
- 配列番号59の前記VH、及び配列番号66の前記VLを含む、請求項11に記載の抗体。
- 配列番号59の前記VH、及び配列番号72の前記VLを含む、請求項11に記載の抗体。
- 配列番号59の前記VH、及び配列番号73の前記VLを含む、請求項11に記載の抗体。
- 前記抗体が、IgG1型、IgG2型、IgG3型、又はIgG4型アイソタイプである、請求項2に記載の抗体。
- Fc領域に少なくとも1つの置換を含む、請求項15に記載の抗体。
- 前記Fc領域における少なくとも1つの置換が、置換L234A、L235A、G237A、P238S、M252Y、S254T、T256E、H268A、A330S、又はP331Sであり、残基付番がEUインデックスに準拠する、請求項16に記載の抗体。
- 前記Fc領域に置換L234A、L235A、G237A、P238S、H268A、A330S、又はP331Sを含み、残基付番がEUインデックスに準拠する、請求項17に記載の抗体。
- 前記Fc領域における少なくとも1つの置換が、置換V234A、G237A、P238S、M252Y、S254T、T256E、H268A、V309L、A330S、又はP331Sであり、残基付番がEUインデックスに準拠する、請求項16に記載の抗体。
- 前記Fc領域に置換V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S、及びP331Sを含み、残基付番がEUインデックスに準拠する、請求項19に記載の抗体。
- a)それぞれ、配列番号80及び81、
b)それぞれ、配列番号82及び81、又は
c)それぞれ、配列番号83及び81
の、重鎖(HC)及び軽鎖(LC)を含む、請求項16に記載の抗体。 - 前記抗体が多重特異性である、請求項2に記載の抗体。
- 配列番号1のCD154に特異的に結合する単離されたアンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分であって、
a)それぞれ配列番号17、23、30、37、44、及び52の前記HCDR1、前記HCDR2、前記HCDR3、前記LCDR1、前記LCDR2、及び前記LCDR3、
b)配列番号59の前記VH及び配列番号66の前記VL、又は
c)配列番号80の前記重鎖及び配列番号81の前記軽鎖
を含む、単離されたアンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分。 - 配列番号1のCD154に特異的に結合する単離されたアンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分であって、CD154がホモ三量体であり、前記抗体が、前記ホモ三量体中の第1のCD154モノマーにCD154のアミノ酸残基182〜207内で結合し、前記ホモ三量体中の第2のCD154モノマーにCD154のアミノ酸残基176〜253内で結合し、ここで、残基付番は配列番号1に準拠する、単離されたアンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分。
- 治療薬又は造影剤に結合させた請求項2に記載の抗体を含む免疫複合体。
- 請求項2に記載の抗体と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
- 前記配列番号59の抗体VHをコードしているポリヌクレオチド。
- 前記配列番号65、66、67、68、69、70、71、72、又は73の抗体VLをコードしているポリヌクレオチド。
- 配列番号76、77、78、又は79のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
- 前記配列番号59の抗体VHと、前記配列番号66の抗体VLとをコードしているポリヌクレオチド。
- 請求項27、28、29、又は30に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項31に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 配列番号1のCD154に特異的に結合する単離されたアンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分の製造方法であって、
前記抗体が発現される条件下で請求項32に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞より産生された前記抗体を回収することと、を含む、方法。 - 自己免疫疾患又は免疫介在性炎症性疾患の治療方法であって、
治療有効量の請求項2に記載の単離された抗体又は請求項26に記載の医薬組成物を、前記自己免疫疾患又は前記免疫介在性炎症性疾患を治療するのに十分な時間にわたって、前記自己免疫疾患又は前記免疫介在性炎症性疾患の治療を必要としている患者に投与することを含む、方法。 - 前記免疫介在性炎症性疾患又は前記自己免疫疾患が、関節炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、炎症性腸疾患、移植、腎移植、皮膚移植、骨髄移植、移植片対宿主病(GVHD)、免疫性血小板減少症(ITP)、多発性硬化症、甲状腺炎、1型糖尿病、又はアテローム性動脈硬化症である、請求項34に記載の方法。
- 関節炎が、関節リウマチ、若年性関節炎、乾癬性関節炎、ライター症候群、強直性脊椎炎、又は痛風性関節炎である、請求項35に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患又は前記免疫介在性炎症性疾患が、狼瘡である、請求項34に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患又は前記免疫介在性炎症性疾患が、移植である、請求項34に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患又は前記免疫介在性炎症性疾患が、炎症性腸疾患(IBD)である、請求項34に記載の方法。
- IBDがクローン病又は潰瘍性大腸炎である、請求項39に記載の方法。
- 第2の治療剤をさらに投与する、請求項34に記載の方法。
- 前記第2の治療薬が、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)、サリチラート、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、コルチコステロイド、細胞毒性剤、免疫抑制剤、及び/又は抗体である、請求項41に記載の抗体。
- 治療に使用するための、請求項2に記載の抗体又は請求項25に記載の医薬組成物。
- 配列番号1のCD154に特異的に結合する単離されたアンタゴニスト抗体であって、
a)それぞれ、配列番号16、22、及び29、
b)それぞれ、配列番号17、23、及び30、
c)それぞれ、配列番号16、24、及び31、
d)それぞれ、配列番号18、25、及び32、
e)それぞれ、配列番号19、26、及び33、
f)それぞれ、配列番号20、27、及び34、又は
g)それぞれ、配列番号21、28、及び35
の、HCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含み、場合により、前記HCDR1、前記HCDR2及び/又は前記HCDR3における保存的アミノ酸置換を1つ、2つ、又は3つ有し、
ここで、前記HCDR1、前記HCDR2、及び前記HCDR3が、Kabat、Chothia、又はIMGTにより定義されるものである、単離されたアンタゴニスト抗体。 - a)それぞれ、配列番号36、43、及び51、
b)それぞれ、配列番号37、44、及び52、
c)それぞれ、配列番号38、45、及び53、
d)それぞれ、配列番号39、46、及び54、
e)それぞれ、配列番号40、47、及び55、
f)それぞれ、配列番号41、47、及び56、
g)それぞれ、配列番号42、48、及び57、
h)それぞれ、配列番号37、49、及び52、又は
i)それぞれ、配列番号37、50、及び52
の、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、場合により、前記LCDR1、前記LCDR2及び/又は前記LCDR3における保存的アミノ酸置換を1つ、2つ、又は3つ有し、
ここで、前記LCDR1、前記LCDR2、及び前記LCDR3が、Kabat、Chothia、又はIMGTにより定義されるものである、請求項44に記載の抗体。 - a)それぞれ配列番号16、22、及び29の前記HCDR1、前記HCDR2、及び前記HCDR3と、それぞれ配列番号36、43、及び51の前記LCDR1、前記LCDR2、及び前記LCDR3とを含む、又は
b)配列番号58の前記VHと配列番号65の前記VLとを含む、請求項45に記載の抗体。 - a)それぞれ配列番号17、23、及び30の前記HCDR1、前記HCDR2、及び前記HCDR3と、それぞれ配列番号37、44、及び52の前記LCDR1、前記LCDR2、及び前記LCDR3と、を含む、又は
b)配列番号59の前記VHと配列番号66の前記VLとを含む、請求項45に記載の抗体。 - a)それぞれ配列番号16、24、及び31の前記HCDR1、前記HCDR2、及び前記HCDR3と、それぞれ配列番号38、45、及び53の前記LCDR1、前記LCDR2、及び前記LCDR3と、を含む、又は
b)配列番号60の前記VHと配列番号67の前記VLとを含む、請求項45に記載の抗体。 - a)それぞれ配列番号18、25、及び32の前記HCDR1、前記HCDR2、及び前記HCDR3と、それぞれ配列番号39、46、及び54の前記LCDR1、前記LCDR2、及び前記LCDR3と、を含む、又は
b)配列番号61の前記VHと配列番号68の前記VLとを含む、請求項45に記載の抗体。 - a)それぞれ配列番号19、26、及び33の前記HCDR1、前記HCDR2、及び前記HCDR3と、それぞれ配列番号40、47、及び55の前記LCDR1、前記LCDR2、及び前記LCDR3と、を含む、又は
b)配列番号62の前記VHと配列番号69の前記VLとを含む、請求項45に記載の抗体。 - a)それぞれ配列番号20、27、及び34の前記HCDR1、前記HCDR2、及び前記HCDR3と、それぞれ配列番号41、47、及び56の前記LCDR1、前記LCDR2、及び前記LCDR3と、を含む、又は
b)配列番号63の前記VHと配列番号70の前記VLとを含む、請求項45に記載の抗体。 - a)それぞれ配列番号21、28、及び35の前記HCDR1、前記HCDR2、及び前記HCDR3と、それぞれ配列番号42、48、及び57の前記LCDR1、前記LCDR2、及び前記LCDR3と、を含む、又は
b)配列番号64の前記VHと配列番号71の前記VLとを含む、請求項45に記載の抗体。 - a)それぞれ配列番号17、23、及び30の前記HCDR1、前記HCDR2、及び前記HCDR3と、それぞれ配列番号37、49、及び52の前記LCDR1、前記LCDR2、及び前記LCDR3と、を含む、又は
b)配列番号59の前記VHと配列番号72の前記VLとを含む、請求項45に記載の抗体。 - a)それぞれ配列番号17、23、及び30の前記HCDR1、前記HCDR2、及び前記HCDR3と、それぞれ配列番号37、50、及び52の前記LCDR1、前記LCDR2、及び前記LCDR3と、を含む、又は
b)配列番号59の前記VHと配列番号73の前記VLとを含む、請求項45に記載の抗体。 - 前記抗体が、IgG1型、IgG2型、IgG3型、又はIgG4型アイソタイプである、請求項45に記載の抗体。
- Fc領域に少なくとも1つの置換を含む、請求項55に記載の抗体。
- 前記Fc領域における少なくとも1つの置換が、置換L234A、L235A、G237A、P238S、M252Y、S254T、T256E、H268A、A330S、又はP331Sであり、残基付番がEUインデックスに準拠する、請求項56に記載の抗体。
- 前記Fc領域に置換L234A、L235A、G237A、P238S、H268A、A330S、及びP331Sを含み、残基付番がEUインデックスに準拠する、請求項57に記載の抗体。
- 前記Fc領域における少なくとも1つの置換が、置換V234A、G237A、P238S、M252Y、S254T、T256E、H268A、V309L、A330S、又はP331Sであり、残基付番がEUインデックスに準拠する、請求項56に記載の抗体。
- 前記Fc領域に置換V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S、及びP331Sを含み、残基付番がEUインデックスに準拠する、請求項59に記載の抗体。
- 前記抗体が多重特異性である、請求項45に記載の抗体。
- 前記抗体が、以下の特性:
a)前記抗体と、可溶性ヒトCD154(shCD154)との免疫複合体は、血小板を活性化せず、ここで、血小板活性化は、血小板上のP−セレクチン表面発現により測定される;
b)0.03%のポリソルベートP20及び100μg/mLのウシ血清アルブミンを含有しているダルベッコリン酸緩衝生理食塩水にて、25℃下でProteOn XPR36システムを用いKDを測定したときに、約5×10−9M以下の解離定数(KD)でCD154に結合する;
c)CD154介在性のヒトB細胞の増殖を約2.7×10−9M以下のIC50値で阻害する;又は
d)分泌型胎盤性アルカリホスファターゼ(SEAP)及びヒトCD40を安定的に発現するHEK293細胞において、NF−κB−誘導性インターフェロン−β(IFN−β)ミニマルプロモーター下、約2.1×10−8M以下のIC50値で、SEAPのCD154介在性の発現を阻害する;
のうちの少なくとも1つを有する、請求項45に記載の抗体。 - 治療薬又は造影剤に結合させた請求項45に記載の抗体を含む免疫複合体。
- 請求項45に記載の抗体と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
- 請求項45に記載の抗体VH、抗体VL、又は抗体VHと抗体VLとをコードしているポリヌクレオチド。
- 請求項65に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項66に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 配列番号1のCD154に特異的に結合する単離されたアンタゴニスト抗体又はその抗原結合部分の製造方法であって、
前記抗体が発現される条件下で請求項67に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞より産生された前記抗体を回収することと、を含む、方法。 - 自己免疫疾患又は免疫介在性炎症性疾患の治療方法であって、
治療有効量の請求項45に記載の単離された抗体又は請求項64に記載の医薬組成物を、前記自己免疫疾患又は前記免疫介在性炎症性疾患を治療するのに十分な時間にわたって、前記自己免疫疾患又は前記免疫介在性炎症性疾患の治療を必要としている患者に投与することを含む、方法。 - 前記免疫介在性炎症性疾患又は前記自己免疫疾患が、関節炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、炎症性腸疾患、移植、腎移植、皮膚移植、骨髄移植、移植片対宿主病(GVHD)、免疫性血小板減少症(ITP)、多発性硬化症、甲状腺炎、1型糖尿病、又はアテローム性動脈硬化症である、請求項69に記載の方法。
- 関節炎が、関節リウマチである、請求項70に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患又は前記免疫介在性炎症性疾患が、狼瘡である、請求項69に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患又は前記免疫介在性炎症性疾患が、移植である、請求項69に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患又は前記免疫介在性炎症性疾患が、炎症性腸疾患である、請求項69に記載の方法。
- IBDがクローン病又は潰瘍性大腸炎である、請求項74に記載の方法。
- 第2の治療剤をさらに投与する、請求項69に記載の方法。
- 前記第2の治療薬が、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)、サリチラート、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、コルチコステロイド、細胞毒性剤、免疫抑制剤、及び/又は抗体である、請求項76に記載の抗体。
- 治療に使用するための、請求項45に記載の抗体又は請求項64に記載の医薬組成物。
- 請求項2に記載の抗体に結合する抗イディオタイプ抗体。
- 請求項2に記載の抗体を含むキット。
- 前記抗体を検出するための試薬及び使用説明書を更に含む、請求項80に記載のキット。
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