HU218610B - Eljárás antigén-specifikus T-sejt toleranciát kiváltó gyógyszerkészítmények előállítására - Google Patents
Eljárás antigén-specifikus T-sejt toleranciát kiváltó gyógyszerkészítmények előállítására Download PDFInfo
- Publication number
- HU218610B HU218610B HU9700522A HU9600522A HU218610B HU 218610 B HU218610 B HU 218610B HU 9700522 A HU9700522 A HU 9700522A HU 9600522 A HU9600522 A HU 9600522A HU 218610 B HU218610 B HU 218610B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- cell
- cells
- antigen
- antibody
- mice
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 61
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 179
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 169
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 claims abstract description 138
- 101000868215 Homo sapiens CD40 ligand Proteins 0.000 claims abstract description 137
- 101000759376 Escherichia phage Mu Tail sheath protein Proteins 0.000 claims abstract description 135
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 107
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 94
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 94
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 92
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims abstract description 58
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims abstract description 48
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 39
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims abstract description 32
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 31
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 claims description 26
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 16
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 15
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 15
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 claims description 3
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 claims description 3
- 239000013566 allergen Substances 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 abstract description 28
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 abstract description 19
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 abstract description 19
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 abstract description 6
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 76
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 56
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 50
- 230000004044 response Effects 0.000 description 50
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 32
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 32
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 28
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 28
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 26
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 24
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 22
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 20
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 17
- 230000006870 function Effects 0.000 description 13
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 11
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 11
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 11
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 10
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 10
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 9
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 description 9
- 230000003172 anti-dna Effects 0.000 description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 9
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 9
- 102000018704 Chitinase-3-Like Protein 1 Human genes 0.000 description 8
- 108010066813 Chitinase-3-Like Protein 1 Proteins 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 8
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 8
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 230000003844 B-cell-activation Effects 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 6
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 6
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 6
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 6
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 6
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 6
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 5
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 5
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 5
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 4
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000007799 mixed lymphocyte reaction assay Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 3
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 description 3
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 208000027585 T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 3
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 3
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 2
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 2
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 2
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000017274 T cell anergy Effects 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N diisopropyl fluorophosphate Chemical compound CC(C)OP(F)(=O)OC(C)C MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Natural products OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 201000006512 mast cell neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000006971 mastocytoma Diseases 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 206010068051 Chimerism Diseases 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical group C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 101710131437 Gene 39 protein Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 235000003332 Ilex aquifolium Nutrition 0.000 description 1
- 235000002296 Ilex sandwicensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002294 Ilex volkensiana Nutrition 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000011366 aggressive therapy Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 208000017760 chronic graft versus host disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003021 clonogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000011254 conventional chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 229960005051 fluostigmine Drugs 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 210000003297 immature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001821 langerhans cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000029052 metamorphosis Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000001400 myeloablative effect Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000021766 negative regulation of B cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
A találmány tárgyát T-sejt-tolerancia kiváltására szolgálógyógyszerkészítmények előállítására irányuló eljárás képezi. A hatás akövetkezőkön alapul: a T-sejt érintkeztetése 1) a T-sejtnek antigéntbemutató sejttel, amely a sejtfelszínen olyan ligandummal rendelkezik,amely kölcsönhatásba lép a T-sejt felületén levő, érintkezésfüggősegítő effektorfunkciót közvetítő receptorral, és 2) a T-sejtfelületén található receptor antagonistájával, amely gátolja aligandum kölcsönhatását a receptorral. Egy előnyben részesítettmegvalósítási módban a T-sejtnek antigént bemutató sejtként B-sejtet,és a T-sejt felületén levő receptorként gp39-et alkalmaznak. Azantagonista előnyösen anti-gp39-antitest vagy oldható gp39-ligandum(például oldható CD40). A találmány szerint előállítottgyógyszerkészítmények felhasználhatók T-sejt-tolerancia kiváltásáraoldható antigénnel vagy alloantigénnel szemben, például csontvelő-átültetésnél, vagy más transzplantációknál a graft versus hostbetegség megelőzésére. ŕ
Description
A találmány olyan gyógyszerkészítmények előállítására vonatkozik, amelyek antigénspecifikus T-sejt-toleranciát váltanak ki. A hatás a következő elemeket foglalja magában: a T-sejt érintkezésbe hozását 1) olyan sejttel, amely a T-sejt számára bemutatja az antigént, és a sejt felszínén rendelkezik olyan ligandummal, amely kölcsönhatásba lép a T-sejt felületén levő, az érintkezésfüggő segítő effektorfunkciókat közvetítő receptorral; és 2) a T-sejt felületén levő, az érintkezésfüggő segítő effektorfunkciókat közvetítő receptor antagonistájával. Az antagonista gátolja a receptornak ligandumával történő kölcsönhatását. A T-sejt érintkezésbe hozható az antigént bemutató sejttel és az antagonistával in vitro, vagy másképpen, a sejt és az antagonista beadható az alanynak T-sejt-tolerancia kiváltása céljából in vivő.
A találmány tárgyát képezi még a B-sejtek szaporodása, a B-sejtek differenciálódása és T-sejt-válaszokat gátolni képes anti-humán gp39 monoklonális antitesteket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítása.
Antigénspecifikus T-sejt-aktiválás kiváltására és klonális expanzióhoz antigént bemutató sejtek (antigenpresenting cells=APCs) által szolgáltatott két szignált kell a pihenő T-limfociták felületére eljuttatni [Jenkins és Schwartz, J. Exp. Med. 165, 302-319 (1987); Mueller et al., J. Immunoi. 144, 3701-3709 (1990); Williams és Unanue, J. Immunoi. 145, 85-93 (1990)]. Az első szignál - amely az immunválasz specificitását adja T-sejt-receptoron (T cell receptor=TCR) keresztül közvetítődik a fő hisztokompatibilitási génkomplexszel (major histocompatibility complex=MHC) összefüggésben bemutatott idegen antigénpeptid felismerését követően. A második - együttstimulálónak nevezett szignál - váltja ki a T-sejtek szaporodását és működőképessé válását [Schwartz R. H„ Science 248, 1349-1356 (1990)]. Az együttstimulálás sem nem antigénspecifikus, sem MHC által nem korlátozott, és úgy gondolják, hogy az APC-k által kifejezett egy vagy több különálló sejtfelszíni molekula szolgáltatja [Jenkins et al., J. Immunoi. 140, 3324-3330 (1988); Linsley et al., J. Exp. Med. 173, 721-730 (1991); Gimmi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 6575-6579 (1991); Young et al., J. Clin. Invest. 90, 229-23Ί (1992); Koulova et al., J. Exp. Med. 173, 759-762 (1991); Reiser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 271-275 (1992); van Seventer et al., J. Immunoi. 144, 4579-4586 (1990); LaSalle et al., J. Immunoi. 147, 774-780 (1991); Dustin et al., J. Exp. Med. 169, 503 (1989); Armitage et al., Natúré 357, 80-82 (1992); Liu et al., J. Exp. Med. 175, 437-445 (1992)]. Egy együttstimulálási útvonalba, amely benne foglaltatik a T-sejt-aktiválásban, beletartozik a T-sejtek felületén található CD28 molekula. Ez a molekula képes venni a B-sejtek vagy más APC-k felületén levő ligandum által szállított együttstimuláló szignált. A ligandumok a CD28 számára magukban foglalják a B-limfocita-aktiváló antigének B7 családjának tagjait, úgymint a B7-l-et és/vagy B7-2-t [Freedman et al., J. Immunoi. 137, 3260-3267 (1987); Freeman et al., J. Immunoi. 143, 2714-2722 (1989); Freeman et al., J. Exp. Med. 174,625 -631 (1991); Freeman et al., Science
262, 909-911 (1993); Azuma et al., Natúré 366, 76- 79 (1993); Freeman et al., J. Exp. Med. 178, 2185 -2192 (1993)]. A B7-1 és B7-2 egy másik molekulának - az aktivált T-sejtek felületén jelen levő CTLA4-nek - is ligandumai, bár a CTLA4-nek az együttstimulálásban játszott szerepe nem tisztázott.
Antigénspecifikus szignálnak együttstimuláló szignállal együttes T-sejthez történő szállítása a T-sejt aktiválódásához vezet, amely magában foglalhatja mind a T-sejt-szaporodást, mind a citokinkiválasztást. Ezzel ellentétben egy antigénspecifikus szignálnak együttstimuláló szignál hiányában történő T-sejthez szállításáról feltételezik, hogy azt válaszképtelenség vagy anergia állapotát váltja ki, ezáltal antigénspecifikus toleranciát hoz létre a T-sejtben.
A T-sejtek és B-sejtek közötti kölcsönhatás központi szerepet játszik az immunválaszokban. A tímuszfüggő antigénekre adott humorális immunitás kiváltása a T-helper (segítő)-sejtek (továbbiakban Th-sejtek) nyújtotta „segítséget” igényli. Mialatt néhány, Blimfociták számára nyújtott segítséget Th-sejtek által kibocsátott oldható molekulák közvetítenek (például limfokinek, úgymint IL-4 és IL-5), a B-sejtek aktivációjához a B-sejtek és Th-sejtek érintkezés függő kölcsönhatására is szükség van [Hirohata et al., J. Immunoi. 140, 3736-3744 (1988); Bartlett et al., J. Immunoi. 143, 1745-1754 (1989)]. Ez azt jelzi, hogy a Bsejt-aktiváció magában foglalja a B-sejtek és Th-sejtek felületi molekulái közötti kötelező kölcsönhatást. A T-sejten található molekula (vagy molekulák) ilyenformán közvetítik) a T-sejtek érintkezésfúggő segítő effektorfunkcióit. A B- és T-sejtek molekulái közötti érintkezésfüggő kölcsönhatást alátámasztja továbbá az a megfigyelés, hogy aktivált T-sejtek izolált plazmamembránjai B-sejt-aktiváláshoz szükséges segítőfunkciót nyújthatnak [Brian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 564-568 (1988); Hodgkin et al., J. Immunoi 145, 2025-2034 (1990); Noelle et al., J. Immunoi. 146, 1118-1124 (1991)].
Egy olyan molekulát - a CD40-et - azonosítottak éretlen és érett B-limfociták felületén, amely ha keresztköt antitestekkel, elindítja a B-sejtek szaporodását [Valié et al., Eur. J. Immunoi. 19, 1463-1467 (1989); Gordon et al., J. Immunoi. 140, 1425-1430 (1988); Gruber et al., J. Immunoi. 142, 4144-4152 (1989)]. A CD40-et molekulárisán klónozták és jellemezték [Stamenkovic et al., EMBO J. 8, 1403-1410 (1989)]. A CD40 ligandumát, a gp39-et (CD40 ligandum vagy CD40L néven is) szintén molekulárisán klónozták és jellemezték [Armitage et al., Natúré 357, 80-82 (1992); Lederman et al., J. Exp. Med. 175, 1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J. 11, 4313-4319 (1992)]. A gp39-fehéijeaktivált CD4+ Th-sejtek felületén fejeződik ki, pihenő Th-sejteken azonban nem [Spriggs et al., J. Exp. Med. 176, 1543-1550 (1992); Lane et al., Eur. J. Immunoi. 22, 2573-2578 (1992); Roy et al., J. Immunoi. 151,1-14 (1993)]. A gp39-génnel transzformált és felületükön a gp39-fehérjét kifejező sejtek képesek kiváltani B-sejtek szaporodását, és más stimulálószignálokkal együtt antitesttermelődést indíthatnak el [Armi2
HU 218 610 Β tagé et al., Natúré 357, 80-82 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J. 11, 4313-4319 (1992)].
A T-sejtek érintkezésfüggő segítő effektorfunkcióit közvetítő sejtfelszíni molekulák fontosak olyan immunválaszok kiváltásában, amelyek T-sejtes segítséget igényelnek. Például a T-sejteken levő gp39-nek a B-sejteken levő CD40-nel történő kölcsönhatása központi szerepet játszik antigénekre adott B-sejt-válaszok aktiválásában. A találmány azon a felismerésen alapul, legalábbis részben, hogy azok a sejtfelszíni molekulák, amelyek érintkezésfuggő segítő effektorfunkciókat közvetítenek, szintén kritikus szerepet játszanak az antigénekre adott T-sejt-válaszban. Különösen fontos az a felismerés, hogy megfelelő körülmények között a T-sejt felületén levő gp39 és egy, az antigént a T-sejtnek bemutató sejt felületén levő ligandum közötti kölcsönhatás megakadályozása antigénspecifikus T-sejt-toleranciát válthat ki. Ennek megfelelően a T-sejt számára antigént bemutató sejtnek szüksége van a felületén található gp39-ligandum (például CD40) és a T-sejt felületén levő gp39 közötti kölcsönhatásra ahhoz, hogy képes legyen a T-sejt aktiválásához nélkülözhetetlen szignál átadására. A gp39-ligandum és gp39 közötti kölcsönhatás gátlása megakadályozza a T-sejt-aktiválást, és meglehetős antigénspecifikus T-sejt-toleranciát vált ki.
Egy előnyben részesített megvalósítási módban a T-sejt felületén levő, az érintkezésfuggő segítő effektorfunkciókat közvetítő receptor a gp39. Ennél a megvalósítási módnál az antagonista olyan molekula, amely gátolja a gp39 és a T-sejt számára antigént bemutató sejt felületén levő ligandumának kölcsönhatását. Különösen előnyben részesített gp39-antagonista egy anti-gp39-antitest. Egy másik lehetőség, hogy a gp39-antagonista a gp39-ligandum oldható formája, például oldható CD40. A T-sejt számára antigént bemutató sejt előnyösen B-sejt. A B-sejt lehet egy kicsi, pihenő B-sejt. Oldható antigénre adott T-sejt-tolerancia kiváltására a B-sejt érintkezésbe kerülhet az antigénnel, mielőtt a T-sejttel érintkezne (például az alanynak történő beadás előtt). Egy másik megvalósítási módban, alloantigénekre adott T-sejt-tolerancia kiváltására, a T-sejt számára antigént bemutató sejtként allogén sejtet használunk. Az allogén sejt lehet például allogén B-sejt, allogén csontvelő, allogén légsejt vagy allogén sejtek a perifériás vérben.
A találmány tárgyát képező eljárással előállított gyógyszerkészítmények felhasználhatók T-sejt-tolerancia létrehozására oldható antigénnel szemben, csontvelő-transzplantátummal vagy más szervtranszplantátummal szemben, vagy az átültetett szövetnek a befogadó szervezettel szembeni reakciója megakadályozására csontvelő-transzplantációnál. Csontvelő-transzplantáció esetén maguk az átvitt csontvelősejtek szolgálnak a T-sejtek számára antigént bemutató sejtként a találmány szerinti eljárásban. Ennek megfelelően a találmány egy megvalósítási módjában a csontvelő-transzplantátum befogadását oly módon segítjük elő, hogy az alanynak allogén csontvelőt gp39-antagonistával (például antigp39-antitesttel) együttesen adunk be.
Az anti-humán gp39-antitesteket előnyösen az immunrendszer általános modulálására, és különösen antigénspecifikus T-sejt-tolerancia kiváltására használjuk. Az előnyben részesített antitestek magukban foglalják a 3E4, 2H5, 2H8, 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 és 89-79 monoklonális antitesteket, amelyeket a
6. példában írunk le. Különösen előnyben részesítjük a 89-76 és 24-31 monoklonális antitesteket. A 89-76 és 24-31 hibridómákat, amelyek a 89-76 és 24-31 antitesteket termelik, a Budapesti Szerződés szerint az American Type Culture Collection, Parklawn Drive, Rockville, Md., szabályzata alapján letétbe helyeztük 1994. szeptember 2-án. A 89-76 hibridómát az ATCC HB 11712 - beszerzési számmal és a 24-31 hibridómát az ATCC HB 11713 - beszerzési számmal jelöltük meg. A 24-31 és 89-76 antitestek az IgGj izotípusai.
Ennek megfelelően a találmány egy megvalósítási módjában anti-humán gp39 monoklonális antitestet (mAb, IgGj izotípus) alkalmazunk. A találmány szerint előállított gyógyszerkészítményben az anti-humán gp39 mAb képes standard in vitro vizsgálatban gátolni például a B-sejtek interleukin-4-gyel és oldható gp39cel történő kezelésével kiváltott B-sejt-szaporodást. Az anti-humán gp39-antitest gátolja a B-sejtek szaporodását előnyösen 0,01-5,0 pg/ml közötti IC50 (azaz a szaporodás 50%-os ingátlásához szükséges koncentráció), előnyösebben 0,1-2,5 pg/ml közötti, és még előnyösebben 0,1-1,25 pg/ml közötti IC50 alkalmazása mellett. Az anti-humán gp39 mAb-k képesek gátolni B-sejtek IgG-, IgM- és/vagy IgA-termelését is standard in vitro vizsgálatban, például a B-sejteknek aktivált T-sejtekkel (például antiCD3 antitesttel kezelt T-sejtekkel) történő tenyésztésével kiváltott Ig-termelést. Az anti-humán gp39-antitest előnyösen körülbelül 0,01-1,0 pg/ml, előnyösebben körülbelül 0,01-0,1 pg/ml IC50 mellett gátolja B-sejtek IgG-, IgM- és/vagy IgA-termelését.
Egy előnyben részesített megvalósítási módban az anti-humán gp39 mAb olyan epitóphoz kötődik, amelyet a következő monoklonális antitesteket tartalmazó csoportból kiválasztott mAb ismer fel: 3E4, 2H5, 2H8, 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 és 89-79. Előnyösebben az anti-humán gp39 mAb olyan epitóphoz kötődik, amelyet a 24-31 vagy a 89-76 monoklonális antitest ismer fel. Egy mAb-nek azt a képességét, hogy kötődni képes a fent említett antitestek bármelyike által felismert epitóphoz, meghatározhatjuk standard keresztkompetíciós vizsgálatokkal. Például egy olyan antitest, amely ugyanazon epitóphoz kötődik, amelyet a 24-31 mAb ismer fel, versengeni fog a kötésért a jelzett 24-31 mAb-vel az aktivált T-sejtekre, míg ellenben egy olyan antitest, amely egy másik epitóphoz kötődik, mint amelyet a 24-31 mAb ismer fel, nem fog versengeni a kötésért a jelzett 24-31 mAb-vel az aktivált T-sejtekre.
A találmány szerint előállított gyógyszerkészítmények egy típusa tehát jellemzően magában foglal egy anti-humán gp39 monoklonális antitestet (például előnyösen 24-31-et vagy 89-76-ot) és gyógyászatilag elfogadható hordozót.
Az anti-humán gp39 mAb-t kódoló nukleinsav (például egy anti-humán gp39 mAb immunglobulin nehéz3
HU 218 610 Β láncát vagy könnyűláncát, vagy ezek részét kódoló DNS) standard technikákkal izolálható anti-humán gp39 mAb-t termelő sejtből (például hibridómából). Például 24-31 vagy 89-76 mAb-t kódoló nukleinsavat izolálhatunk a 24-31 vagy 89-76 hibridómából, cDNS-könyvtár-screeneléssel, PCR-sokszorozással vagy más standard technikával. Anti-humán gp39 mAb láncot kódoló nukleinsavat készíthetünk standard rekombináns DN S-technikákkal rekombináns anti-humán gp39 mAb-k - például kiméra vagy humanizált anti-humán gp39 mAb-k - előállítása céljából.
Ezenfelül anti-humán gp39 mAb-t kódoló nukleinsavat beépíthetünk egy expressziós vektorba és bevihetjük egy gazdasejtbe, hogy lehetővé tegyük az anti-humán gp39-antitestek rekombináns formáinak kifejeződését és előállítását.
Az 1. ábra in vivő anti-gp39-kezeléssel kiváltott, fehérjeantigénre adott T-sejt-tolerancia grafikus bemutatása. T-sejt-válaszokat mértünk in vitro olyan antigénnel történő kihívásra, amelyet előzőleg in vivő adtunk be antigénnel kezelt B-sejteken anti-gp39-antitesttel együtt vagy a nélkül.
A 2. ábra in vivő anti-gp39-kezeléssel kiváltott, allogén B-sejtekre adott T-sejt-tolerancia grafikus bemutatása. T-sejt-válaszokat mértünk in vitro olyan allogén B-sejtekkel történő kihívásra, amelyeket előzőleg in vivő adtunk be anti-gp39-antitesttel együtt vagy a nélkül.
A 3A. ábra grafikus bemutatása az allogén B-sejtekkel kiváltott elsődleges allogén CTL-válaszok gátlásának olyan esetben, ha a befogadó állatokat anti-gp39antitesttel kezeljük. A bemutatott csoportok: kezeletlen egerek (|), anti-gp39-cel kezelt egerek (Δ) és fel nem töltött Balb/c egerek lépsejtjei (Φ ); amelyeket negatívkontroll-effektorsejtekként használtunk fel).
A 3B. és 3C. ábrák grafikus bemutatásai az LPS-sel kezelt B-sejt-blasztok kiváltotta elsődleges allogén CTL-válaszok gátlásának olyan esetben, ha a befogadó állatokat anti-gp39-antitesttel kezeljük. A B és C táblák két egymástól független kísérletet mutatnak be. A bemutatott csoportok: LPS-blasztok in vivő kezelés nélkül (A), LPS-blasztok in vivő anti-gp39-kezeléssel ( φ), pihenő B-sejtek in vivő kezelés nélkül (O) és pihenő B-sejtek in vivő anti-gp39-kezeléssel (| |).
A 4A. ábra grafikus bemutatása az allogén B-sejtekkel kiváltott másodlagos allogén CTL-válaszok gátlásának olyan esetben, ha a befogadó állatokat anti-gp39-antitesttel kezeljük. A bemutatott effektorcsoportok: Hlgvel kezelt befogadók (φ), érintetlen Balb/c-k (▲) és anti-gp39-cel kezelt befogadók (|).
A 4B. ábra az anti-gp39-kezeléssel kiváltott allogén CTL-válaszok gátlásának specificitását bemutató diagram. Bemutatjuk a H-2k célponttal szembeni CTL-válaszokat érintetlen Balb/c sejtekkel (O) vagy H-2b haplotípusú B-sejtek és anti-gp39 beadása révén H-2b-vel szemben toleránssá tett sejtekkel (B )·
Az 5. ábra oszlopdiagram, amely a lépsejtek számát mutatja olyan gazdaszervezetben, amely csontvelőtranszplantátumot kapott a csontvelő átvitelét követő különböző időpontokban történő anti-gp39-antitest-kezeléssel együtt vagy a nélkül.
A 6A. ábra grafikus bemutatása az IgA-koncentrációnak, amelyet olyan egerek lépéből származó B-sejtekkel termeltek eltávolításuk után in vitro, amelyek csontvelő-transzplantátumot kaptak in vivő anti-gp39kezeléssel együtt vagy a nélkül. Eltávolítottuk a lépből származó B-sejteket, és mértük az antitesttermelést 7 vagy 14 nappal a csontvelő-transzplantáció után.
A 6B. ábra grafikus bemutatása az IgG,-koncentrációnak, amelyet olyan egerek lépéből származó B-sejtekkel termeltek eltávolításuk után in vitro, amelyek csontvelő-transzplantátumot kaptak in vivő anti-gp39kezeléssel együtt vagy a nélkül. Eltávolítottuk a lépből származó B-sejteket, és mértük az antitesttermelést 7 vagy 14 nappal a csontvelőtranszplantáció után.
A 7A. ábra olyan egerek szérum-IgE-koncentrációjának grafikus bemutatása, amelyek csontvelő-transzplantátumot kaptak a csontvelő átvitelét követő különböző időpontokban történő anti-gp39-kezeléssel együtt vagy a nélkül.
A 7B. ábra olyan egerek szérum-anti-DNS-antitest koncentrációjának grafikus bemutatása, amelyek csontvelő-transzplantátumot kaptak a csontvelő átvitelét követő különböző időpontokban történő anti-gp39-kezeléssel együtt vagy a nélkül.
A 8A. és 8B. ábra olyan egerekből származó citotoxikus T-sejtek in vitro citolitikus aktivitását mutató diagramok, amelyek csontvelő-transzplantátumot kaptak in vivő anti-gp39-kezeléssel együtt vagy a nélkül, különböző effektor: célsejt arányoknál (effector:target cell=E:T). Az A és B táblák két egymástól független kísérletet szemléltetnek.
A 9A., 9B. és 9C. ábrák áramlásoscitometria-frofilok, amelyek 6 órás aktivált humán perifériás vérlimfociták CD40Ig-vel (A tábla), 4D9-8 mAb-vei (B tábla) vagy 4D9-9 mAb-vei (C tábla) történő megfestődését mutatják.
A 10A., 10B. és 10C. ábrák áramlásoscitometriaffofilok, amelyek a cikloporin A jelenlétében tenyésztett, 6 órás aktivált humán perifériás vérlimfociták 4D9-8 mAb-vel (A tábla), 4D9-9 mAb-vel (B tábla) vagy CD40Ig-vel (C tábla) történő megfestődését mutatják.
A 11 A. és 11B. ábra áramlásoscitometria-ffofilok, amelyek 6 órás aktivált humán perifériás vérlimfociták CD40Ig-vel történő megfestődését mutatják jelöletlen 4D9-8 mAb (A tábla) vagy jelöletlen 4D9-9 mAb (B tábla) jelenlétében.
A 12. ábra az oldható gp39 és IL-4 kiváltotta B-sejt-szaporodás-gátlást mutató diagram, ahol a sejteket anti-humán gp39 mAb-k, 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 vagy 89-79 jelenlétében tenyésztjük.
A 13. ábra grafikus ábrázolása egy allospecifikus kevert limfocitaválasz gátlásának, ahol a sejteket antihumán gp39 mAB-k, 24-31 és 89-76 jelenlétében tenyésztjük.
A találmány újdonsága antigénspecifikus T-sejt-tolerancia kiváltására szolgáló gyógyszerek előállításán alapul. A hatásmechanizmusok magukban foglalják T-sejt érintkezésbe hozását 1) olyan sejttel, amely a T-sejt számára bemutatja az antigént, és a sejt felszínén
HU 218 610 Β rendelkezik olyan ligandummal, amely kölcsönhatásba lép a T-sejt felületén levő, az érintkezésfuggő segítő effektorfunkciókat közvetítő receptorral; és 2) a T-sejt felületén levő receptor antagonistájával, amely gátolja a receptor és a ligandum kölcsönhatását. Ahogyan itt definiáljuk, az a molekula vagy receptor, amelyik az érintkezésfüggő segítő effektorfunkciókat közvetíti, a Th-sejten fejeződik ki, és kölcsönhatásba lép egy effektorsejt (például B-sejt) felületén levő ligandummal, amelyben a receptornak és ligandumának kölcsönhatása nélkülözhetetlen egy effektorsejt-válasz (például B-sejt-aktiválás) létrejöttéhez. Azonkívül, hogy benne foglaltatik az effektorsejt-válaszban, azt találtuk, hogy egy ilyen molekula részt vesz az antigénre adott T-sejt-válaszban.
Előnyben részesített megvalósítási mód szerint az érintkezésfüggő segítő effektorfunkciót közvetítő molekula a T-sejt felületén a gp39. Ennek megfelelően a találmány szerint előállított gyógyszerkészítmények hatása magukban foglalja a T-sejt érintkezésbe hozását olyan sejttel, amely antigént és gp39-antagonistát mutat be. Eszerint az antigénbemutatásra használt sejt kölcsönhatásba lép a T-sejt felületén levő gp39-cel, aktiválva a T-sejtet (azaz a T-sejt-aktiváláshoz nélkülözhetetlen szignált a T-sejthez szállítja). Például a sejt lehet olyan B-sejt, amelyik kifejezi a CD40-et, és antigént mutat be a T-sejtnek. Az antigént bemutató sejt felületén levő gp39-ligandum és a T-sejt felületén levő gp39 közötti kölcsönhatás gátlása folytán a T-sejtet nem aktiválja a bemutatott antigén, hanem toleránssá válik az antigénnel szemben.
A találmány szerint előállított gyógyszerkészítmények felhasználhatók T-sejt-tolerancia kiváltására egy antigénnel szemben in vivő. Például az alanynak beadhatunk T-sejt számára antigént bemutató sejtet, összekapcsolva a T-sejt felületén kifejezett, érintkezésfuggő segítő effektorfunkciót közvetítő receptor antagonistájának (például gp39-antagonista) beadásával. A találmány szerint előállított gyógyszerkészítmények továbbá alkalmasak T-sejtek antigénnel szembeni toleranciájának kialakítására in vitro, a T-sejteknek olyan sejtekkel történő in vitro érintkeztetésével, amelyek a T-sejt számára antigént mutatnak be, együtt a T-sejt felületén kifejezett, érintkezésfüggő segítő effektorfunkciót közvetítő receptor antagonistájával (például gp39-antagonistával). Az in vitro toleránssá tett T-sejtek azután beadhatók az alanynak. A találmány szerint előállított gyógyszerkészítmények alkalmazhatók T-sejteknek az alanyban történő toleránssá tételére specifikus antigénnel vagy transzplantált sejtekkel szemben, úgymint allogén csontvelővel szemben (például csontvelő-átültetésnél). A találmány szerint előállított gyógyszerkészítmények szintén alkalmazhatók az átültetett szövetnek a befogadó szervezettel szembeni reakciója megakadályozására csontvelő-transzplantációnál.
A találmány különböző vonatkozásait tovább részletezve a következő alfejezetekben tárgyaljuk.
1. gp39-antagonisták
A találmány szerint gp39-antagonistát hozunk érintkezésbe T-sejttel (például beadjuk az alanynak), a T-sejt felületén levő gp39 és az antigént bemutató sejt
- úgymint B-sejt - felületén levő gp39-ligandum kölcsönhatásának megakadályozására. A gp39-antagonista definíciója: ez az a molekula, amely megakadályozza ezt a kölcsönhatást. A gp39-antagonista lehet egy gp39 ellen irányuló antitest (például gp39 elleni monoklonális antitest), a gp39 ellen irányuló antitestnek fragmentuma vagy származéka [például Fab vagy F(ab)’2 fragmentumok, kiméra antitestek vagy humanizált antitestek], a gp39-ligandum oldható formái (például oldható CD40), a gp39-ligandum fúziós fehérjéjének oldható formái (például oldható CD40Ig), vagy gyógyszerhatóanyagok, amelyek megszakítják vagy megakadályozzák a gp39-CD40 kölcsönhatást.
A. Antitestek
Emlőst (például egeret, hörcsögöt vagy nyulat) immunizálhatunk a gp39-fehérje vagy -fehérjefragmentum (például peptidfragmentum) immunogén formájával, amely antitestválaszt vált ki az emlősben. A felületén gp39-et kifejező sejtet is használhatjuk immunogénként. Más immunogének magukban foglalják a tisztított gp39-fehérjét vagy -fehérjefragmentumot. A gp39et standard tisztítási technikákkal tisztíthatjuk meg a gp39-et kifejező sejttől; a gp39 cDNS [Armitage et al., Natúré 357, 80-82 (1992); Lederman et al., J. Exp. Med. 175, 1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J. 11, 4313-4319 (1992)] kifejezhető egy gazdasejtben, például baktérium- vagy emlőssejtvonalban, és a gp39-fehérje standard technikákkal tisztítható a sejttenyészetből. gp39-peptideket szintetizálhatunk a gp39 aminosavszekvenciájára (Armitage et al., Natúré 357, 80-82 (1992); Lederman et al., J. Exp. Med. 175, 1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J. 11, 4313-4319 (1992)] alapozva, ismert technikák alkalmazásával (például F-moc vagy T-boc kémiai szintézissel). Azok közé a technikák közé, amelyekkel egy fehérjét immunogenitással ruházhatunk fel, beleértjük a hordozókkal történő konjugációt vagy más, a szakmában jól ismert technikákat. Például a fehérje beadható adjuváns jelenlétében. Az immunizáció előrehaladása nyomon követhető a plazma vagy a szérum antitesttiterének meghatározásával. Standard ELISA- vagy más immunmeghatározást alkalmazhatunk az immunogénnel mint antigénnel az antitestek szintjének becslésére.
Az immunizációt követően antiszérumot kaphatunk, és ha kívánt, poliklonális antitesteket izolálhatunk a szérumból. Monoklonális antitestek előállítására antitestet termelő sejteket (limfocitákat) nyerünk ki immunizált állatból és fuzionáltatjuk mielómasejtekkel standard szomatikus sejtfiiziós eljárással, ily módon halhatatlanná téve ezeket a sejteket, és hibridómasejteket termelve. Ilyen technikák jól ismertek a szakmában. Például a hibridómatechnika, amelyet eredetileg Kohler és Milstein fejlesztett ki [Natúré 256, 495-497 (1975)] ugyanúgy, mint más technikák, úgymint a humán B-sejt-hibridóma-technika [Kozbar et al., Immunoi. Today 4, 72 (1983)], az EBV-hibridóma-technika humán monoklonális antitestek előállítására [Colé et al., Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy, Allén R. Bliss, Inc. 77-96 (1985)], és kombinatorikus antitestkönyvtárak screenelése [Huse et al., Science 246,1275 (1989)].
HU 218 610 Β
A hibridómasejtek immunkémiailag screenelhetők olyan antitestek termelésére, amelyek specifikusan reaktívak a fehérjével vagy a peptiddel, és a monoklonális antitestek izolálhatok.
Az antitest kifejezésbe, ahogyan itt használjuk, beleértjük annak olyan fragmentumait, amelyek specifikusan reaktívak a gp39-fehéijével vagy annak peptidjével, vagy a gp39 fúziós fehérjével. Az antitesteket fragmentálhatjuk hagyományos technikák alkalmazásával, és a fragmentumokat használhatóság szempontjából ugyanolyan módon screenelhetjük, mint ahogyan fent leírtuk a teljes antitestekre. Például F(ab)’2 fragmentumokat hozhatunk létre pepszinnel kezelve az antitestet. Az eredményül kapott F(ab)’2 fragmentumot kezelhetjük a diszulfídhidak redukálásával, hogy Fab’ fragmentumokat állítsunk elő. A találmány szerinti antitest továbbá olyan bispecifikus és kiméra molekulákat tartalmaz, amelyek anti-gp39-résszel rendelkeznek.
Amennyiben nem humán alanyban termelt antitesteket használunk terápiásán embereknél, azokat változó mértékben idegenként ismeri fel a szervezet, és immunválaszjöhet létre a betegben. Egy megközelítés e probléma minimalizálására vagy kiküszöbölésére - amely előnyös az általános immunszuppresszióhoz - kiméraantitest-származékok előállítása, azaz olyan antitestmolekuláké, amelyek egyesítenek egy nem humán, állati variábilis régiót és egy humán konstans régiót. Kiméraantitest-molekulák magukban foglalhatják például egy egér, patkány vagy más faj antitestéből az antigénkötő domént humán konstans régiókkal. Kiméra antitestek előállítására megközelítések több változatát írták már le, és ezek felhasználhatók olyan kiméra antitestek elkészítésére, amelyek a gp39-et felismerő immunglobulin variábilis régiót tartalmazzák [lásd például Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1985); Takeda et al., Natúré 314, 452 (1985); Cabilly et al., US Patent No. 4,816,567; Boss et al., US Patent No. 4,816,397; Tanaguchi et al., European Patent Publication EP 171496; European Patent Publication EP 0173494; United Kingdom Patent GB 2177096B]. Várhatóan az ilyen kiméra antitestek kevésbé lennének immunogének humán alanyban, mint a megfelelő, nem kiméra antitest.
Humán terápiás célokra a gp39-fehérjével vagy -peptiddel specifikusan reaktív monoklonális vagy kiméra antitestek még tovább humanizálhatok humán variábilis régiót tartalmazó kimérák előállításával, amelyekben a variábilis régió részei, különösen az antigénkötő dómén konzervált keretrégiói, humán eredetűek, és csak a hipervariábilis régiók nem humán eredetűek. Ilyen megváltoztatott immunglobulinmolekulák előállíthatók a szakmában ismert számos technika bármelyikével [például Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 7308-7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today 4, 7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol. 92, 3-16 (1982)], és előnyösen a PCT nemzetközi szabadalmi együttműködés keretében közzétett WO92/06193 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés vagy az EP 0239400 európai szabadalmi leírás tanításai szerint állítjuk elő. Humanizált antitestek kereskedelmileg előállíthatok, például a Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Great Britain által.
Egy másik módszer a gp39-fehérjével vagy -peptiddel szemben reaktív specifikus antitestek vagy antitestfragmentumok létrehozására immunglobulint kódoló gének vagy azok részei által kódolt, baktériumokban gp39-fehétjével vagy -peptiddel kifejezett, expressziós könyvtárak screenelése. Például komplett Fab fragmentumokat, VH régiókat és Fv régiókat fejezhetünk ki baktériumokban fág expressziós könyvtárak felhasználásával. Lásd például a következő hivatkozásokat [Ward et al., Natúré 341, 544-546 (1989); Huse et al., Science 246, 1275-1281 (1989) és McCafferty et al., Natúré 348, 552-554 (1990)]. Ilyen könyvtárak screenelése, például gp39-peptiddel, azonosíthatja a gp39-cel reaktív immunglobulin-fragmentumot. Egy másik lehetőségként a SCID-hu egér (Genpharmtól beszerezhető) használható antitestek vagy azok fragmentumainak előállítására.
A gp39 - beleértve a humán gp39-et és egérgp39-et - ellen irányuló monoklonális antitestek és a találmány szerinti eljárásokban alkalmazható megfelelő monoklonális antitestek előállítására szolgáló módszereket további részleteiben a 6. példában írjuk le. A találmány tárgyát képező, különösen előnyben részesített anti-humán gp39-antitestek a 24-31 és 89-76 mAb-k, amelyeket a 24-31 és 89-76 hibridómákkal állítunk elő. A 89-76 és 24-31 hibridómákat, amelyek a 89-76 és 24-31 antitesteket termelik, a Budapesti Szerződés és az American Type Culture Collection, Parklawn Drive, Rockville, Md., rendelkezései alapján letétbe helyeztük 1994. szeptember 2-án. A 89-76 hibridómát az ATCC-beszerzési számmal és a 24-31 hibridómát az ATCC -beszerzési számmal jelöltük meg.
Rekombináns anti-gp39-antitesteket, úgymint kiméra és humanizált antitesteket előállíthatunk anti-gp39 antitestet kódoló nukleinsav (például DNS) manipulációjával, standard rekombináns DNS-technikák szerint. Ennek megfelelően a találmány tárgyát egy másik vonatkozásban olyan izolált nukleinsavmolekulák képezik, amelyek gp39-cel - különösen humán gp39-cel - szemben reaktív immunglobulin-nehéz vagy -könnyűláncokat vagy azok részeit kódolják. Az immunglobulint kódoló nukleinsav kódolhat egy immunglobulin-könnyű- vagy -nehézlánc variábilis régiót hozzákapcsolt nehéz- vagy könnyűlánc konstans régióval (vagy annak részeivel) vagy a nélkül. Ilyen nukleinsavat standard technikákkal izolálhatunk olyan sejtből (például hibridómából), amely anti-humán gp39 mAb-t termel. Például a 24-31 vagy 89-76 mAb-t kódoló nukleinsavat izolálhatjuk a 24-31 vagy 89-76 hibridómából cDNS-könyvtár-screeneléssel, PCR-sokszorozással vagy más standard technikával. Az anti-humán gp39 mAb-t kódoló nukleinsavat - izolálását és esetleges további manipulációját követően - beépíthetjük egy expressziós vektorba és bevihetjük egy gazdasejtbe, hogy elősegítsük az antihumán gp39-antitestek rekombináns formáinak kifejeződését és termelődését.
B) Oldható gp39-ligandumok
T-sejt-tolerancia kiváltására használható egyéb gp39-antagonisták a gp39-ligandum oldható formái.
HU 218 610 Β
A gp39 monovalens oldható liganduma, úgymint az oldható CD40, kötődni tud a gp39-hez, ezáltal gátolva a gp39 és a B-sejteken levő CD40 közötti kölcsönhatást. Az „oldható” kifejezés azt jelenti, hogy a ligandum nincs állandóan a sejtmembránhoz kötve. Oldható gp39-ligandumot készíthetünk kémiai szintézissel vagy előnyösen rekombináns DNS-technikákkal, például a ligandumnak csak az extracelluláris doménjét kifejezve (a transzmembrán és a citoplazmás dómén hiányzik). Előnyben részesített oldható gp39-ligandum az oldható CD40. Egy másik lehetőségként az oldható gp39-ligandum előfordulhat fúziós fehérje formájában. Egy ilyen fúziós fehérje magában foglalja a gp39-ligandumnak legalább egy részét egy második molekulához hozzákötve. Például a CD40 kifejezhető fúziós fehérjeként immunglobulinnal (azaz CD40Ig fúziós fehérjeként). Egy megvalósítási módban fúziós fehérjét állítunk elő, amely a CD40 molekula egy extracellulárisdomén-részének aminosavmaradékait tartalmazza, egy immunglobulin-nehézlánc - például a Cyl - CH2 és CH3 régióinak kapcsolásához megfelelő szekvencia aminosavmaradékaihoz csatlakoztatva, CD40Ig fúziós fehéije létrehozására [lásd például Linsley et al., J. Exp. Med. 1783, 721-730 (1991); Capon et al., Natúré 337, 525-531 (1989) és Capon US 5,116,964], A fúziós fehérje előállítható kémiai szintézissel, vagy előnyösen a CD40 cDNS-én alapuló rekombináns DNS-technikákkal [Stamenkovic et al., EMBO J. 8, 1403-1410 (1989)].
11. antigénspecifikus tolerancia kiváltására szolgáló sejtek
A találmány, legalábbis részben, azon a felfedezésen alapul, hogy az antigén bemutatása a T-sejt számára egy olyan sejt által, amely bemutatja az antigént, ugyanakkor gp39-cel is reagál, antigénspecifikus T-sejt-toleranciát eredményez, ha az antigén bemutatása a T-sejt számára gp39-antagonista jelenlétében történik. Olyan sejtek közé, amelyek ezzel a mechanizmussal képesek T-sejt-tolerancia kiváltására, beleértjük azokat, amelyek bemutatják az antigént a T-sejtnek, és szükségük van a sejt felületén levő gp39-ligandum és a T-sejt felületén levő gp39 közötti kölcsönhatásra ahhoz, hogy a T-sejt-aktiváláshoz nélkülözhetetlen szignálokat T-sejthez szállítsák. Ennek a kölcsönhatásnak a gátlása megakadályozza a T-sejtnek a bemutatott antigénnel történő aktiválását, sőt antigénspecifikus toleranciát vált ki a T-sejtben. A T-sejt gp39-en keresztül történő aktiválásának a megakadályozása meghiúsíthatja együttstimuláló molekulák indukcióját az antigént bemutató sejt felületén (például a B7 családba tartozó molekulákét egy antigént bemutató sejten, úgymint B-sejten) oly módon, hogy az antigént bemutató sejt csak egy antigénhatású szignált továbbít az együttstimuláló szignál hiányában, ilyenformán tehát toleranciát vált ki.
Ennek megfelelően a találmány szerinti eljárásokban antigént bemutató sejtet adunk be a befogadó alanynak. A „sejt, amely antigént mutat be” és az „antigént bemutató sejt” szókapcsolatokat egymással felcserélhetően használjuk, és ezek szándékaink szerint felölelik mindazokat a sejteket, amelyek a befogadó T-sejtjei számára antigént mutathatnak be, és magukban foglalják a B-limfocitákat, „professzionális” antigént bemutató sejteket (például monocitákat, idegsejteket, Langerhans-sejteket), és más olyan sejteket, amelyek antigént mutatnak be immunsejteknek (például keratinociták, endotél sejtek, asztrociták, fibroblasztok, oligodendrociták). Továbbá előnyös, ha az antigént bemutató sejt csökkentett képességgel rendelkezik az együttstimuláló szignál stimulálására a befogadó T-sejtjeiben. Például az antigént bemutató sejtből hiányozhat az együttstimuláló molekulák kifejezése, vagy csak alacsony szinten fejezi ki azokat, úgymint a fehérjék B7 családját (például a B7-l-et és B7—2-t). A találmány eljárásában alkalmazandó, potenciális antigént bemutató sejteken az együttstimuláló molekulák kifejezését megbecsülhetjük standard technikákkal, például áramlásos citometriával az együttstimuláló molekulák ellen irányuló antitestek felhasználásával.
Előnyben részesített antigént bemutató sejtek T-sejt-tolerancia kiváltására a limfoid sejtek, például perifériás vérlimfociták vagy lépsejtek. Előnyben részesített limfoid sejtek T-sejt-tolerancia kiváltására a B-sejtek. B-sejteket tisztíthatunk sejtek kevert populációjából (például a perifériás vér vagy lép egyéb sejttípusaitól) standard sejtelválasztási technikákkal. Például a tapadó sejteket eltávolíthatjuk lépsejteknek műanyag csészékben történő tenyésztésével és a nem tapadó sejtpopuláció visszanyerésével. T-sejteket eltávolithatunk kevert sejtpopulációból anti-T-sejt-antitesttel (például anti-Thy 1.1-gyei és/vagy anti-Thyl.2-vel) és komplementtel történő kezeléssel. Egy megvalósítási módban pihenő limfoid sejteket, előnyösen pihenő B-sejteket használunk antigént bemutató sejtekként. Pihenő limfoid sejtek, úgymint pihenő B-sejtek, izolálhatok a szakmában ismert technikákkal, például kis méretük és sűrűségük alapján. Pihenő limfoid sejteket izolálhatunk például ellenáramú centrifügális elutrációval, ahogyan azt az alábbi szerzők leírták [Tony H-P. és Parker D. C., J. Exp. Med. 161, 223-241 (1985)]. Ellenáramú centrifügális elutráció alkalmazásával a T-sejteket aktiválni képes sejtek közül egy kicsi, pihenő limfoidsejt-populáció kiválását figyelhetjük meg a 14-19 ml/perc, előnyösen 19 ml/perc értéknél lejött frakció(k) összegyűjtésekor (3200 rpm mellett). Egy másik lehetőségként kicsi, pihenő limfocitákat (például B-sejteket) izolálhatunk szakaszos sűrűséggradiens-centrifügálással, például Ficollvagy Percoll-gradienst alkalmazva, és a centrifugálás után kicsi, pihenő limfocitákat tartalmazó réteget figyelhetünk meg. Kicsi, pihenő B-sejtek el is különíthetők aktivált B-sejtektől együttstimuláló molekulák - úgymint B7-1 és/vagy B7-2 - aktivált B-sejtek felületén történő kifejeződésének meghatározásával standard technikákkal (például immunfluoreszcenciával).
Az antigént bemutató sejt, úgymint B-sejt, érintkezésbe hozható egy antigénnel (például oldható fehérjével) a T-sejttel való érintkezést megelőzően (például az alanynak történő beadás előtt), és a T-sejt számára az antigént bemutató sejt gp39-antagonista jelenlétében alkalmazható az antigénre specifikus T-sejt-tolerancia kiváltására (lásd az 1. példát). Egy másik lehetőségként
HU 218 610 Β alloantigénekkel szembeni tolerancia váltható ki antigént bemutató sejtként allogén sejtet alkalmazva (lásd a
2. és 3. példát). Az allogén sejt allogén fehérjék antigénhatású fragmentumait mutatja be T-sejteknek. Egy kiviteli alakban az allogén sejt egy allogén limfoid sejt, úgymint egy allogén B-sejt. Egy másik lehetőségként egy alany toleránssá tehető perifériás vérből származó sejtekkel (például perifériás vérlimfocitákkal), lépsejtekkel vagy csontvelősejtekkel. Csontvelő-átültetés esetén a donor csontvelősejtek szolgálnak antigént bemutató sejtként a T-sejtekkel érintkezve (például beadva az alanynak). Ennek megfelelően allogén csontvelő beadható gp39-antagonistával együttesen, hogy a csontvelővel szemben toleranciát váltsunk ki a befogadóban, és elkerüljük az átültetett szövetnek a befogadó szervezettel szembeni reakciójából adódó betegséget (lásd a 4. és 5. példát).
III. Sejtek és gp39-antagonisták beadása
Antigénspecifikus T-sejt-tolerancia a találmány szerint kiváltható gp39-antagonistának olyan sejttel történő együttes beadásával az alany számára, amely bemutatja az antigént a T-sejtnek és a T-sejt felületén levő gp39-cel kölcsönhatásba lépő ligandumot fejez ki. Egy előnyben részesített megvalósítási módban az antigént bemutató sejtet és a gp39-antagonistát egyidejűleg adjuk be. Egy másik lehetőségként a gp39-antagonista beadható a sejtek beadását megelőzően, például ha az antagonista egy hosszú felezési idejű antitest. Olyan esetben, ha a beadandó sejtek csontvelősejtek, ahol megkövetelt az átültetett szövetnek a befogadó szervezettel szembeni reakciójából adódó betegség megakadályozása, a csontvelőben levő donor T-sejtek toleránssá tehetők a befogadó szervezetbe történő átvitel előtt oly módon, hogy a donor csontvelőt a gazdaszervezetből származó B-sejtekkel és gp39-antagonistával inkubáljuk in vitro. A gp39-kezelés folytatódhat in vivő a csontvelőátvitel alatt és után, ha szükséges. Azokban az alanyokban, amelyek csontvelő vagy más szerv átültetésére várnak, létrehozhatunk a transzplantátummal szemben allogén toleranciát olyan életrendi kezeléssel, amely allogén toleranciát vált ki a szerv vagy csontvelősejtek átvitelét megelőzően. Ez az előzetes életrendi kezelés magában foglalhatja az alany számára a donorból származó sejteknek gp39-antagonistával történő együttes beadását. A donorból származó sejtek lehetnek például B-sejtek, teljes perifériás vér vagy annak néhány frakciója (például perifériás vérlimfociták vagy kis pihenő limfociták, vagy B-sejtek).
Az antigént bemutató sejtek szimpla adagját beadva (az antagonistával együttesen) elegendőnek találtuk a T-sejt-tolerancia kiváltására (lásd a példákat). A beadott antigént bemutató sejtek száma változhat az alkalmazott sejt típusa, az átültetett szövet vagy szerv típusa, a befogadó testtömege, a befogadó általános állapota és egyéb, a szakember számára ismert változók szerint. A találmány szerinti eljárásban felhasználásra kerülő megfelelő sejtszámot meghatározhatjuk a szakmában mindennapos gyakorlatként alkalmazott hagyományos eljárások egyikével (például felhasználva a példákban leírt meghatározásokat). A sejteket olyan formában és úton adjuk be, amely megfelelő a befogadóban történő tolerancia kiváltására. A sejteket beadhatjuk fiziológiásán elfogadható oldatban, úgymint pufferolt sóoldatban vagy hasonló hordozóban. A sejteket előnyösen intravénásán adjuk be.
A találmány szerinti antagonistát gyógyászati beadáshoz megfelelő, biológiailag összeegyeztethető formában adjuk be in vivő az alanynak T-sejt-tolerancia kiváltására. Az „in vivő beadásra megfelelő, biológiailag összeegyeztethető forma” a beadandó antagonistának olyan formáját jelenti, amelyben bármilyen toxikus hatást ellensúlyoz a fehérje terápiás hatása. Az alany kifejezésbe szándékunk szerint olyan élő szervezeteket értünk bele, amelyekben immunválasz kiváltása lehetséges, például emlősöket. Példák alanyokra: magukban foglalnak embereket, kutyákat, macskákat, egereket, patkányokat és ezek transzgén fajait. A gp39-antagonista beadható bármilyen gyógyszerészeti formában, szabadon választhatóan gyógyászatilag elfogadható hordozóban. Az antagonista terápiásán aktív mennyiségének beadását úgy definiáljuk, mint a kívánt eredmény eléréséhez elengedhetetlenül szükséges dózisokban és ideig adott hatásos mennyiséget. Például a gp39-antagonista terápiásán aktív mennyisége változhat olyan faktorok szerint, mint az egyén betegségének stádiuma, életkora, neme és testsúlya és az antagonistának az egyénben a kívánt válasz kiváltására való képessége. A dózis regimát úgy kell beállítanunk, hogy biztosítsuk a terápiás válasz optimumát. Például többfelé elosztott adagot adhatunk be naponta, vagy arányosan csökkenthetjük az adagot, ahogyan azt a terápiás helyzet megkívánja.
Az aktív vegyület (például antagonista) beadható a szokásos módon, úgymint injekcióval (szubkután, intravénásán stb.), szájon át, inhaláció útján, bőrön keresztül vagy végbélbe adva. A beadás útvonalától függően az aktív komponenst bevonhatjuk egy anyaggal, hogy megvédjük a vegyületet enzimek, savak és más természetes körülmények hatásától, amelyek inaktiválhatják a vegyületet. A beadásnak előnyben részesített útja az intravénás injektálás.
Egy gp39-antagonista nem parenterális úton történő beadásakor szükség lehet az antagonista becsomagolására vagy azt az inaktiválástól megvédő anyag egyidejű beadására. Például egy antagonista beadható az egyénnek egy megfelelő hordozóban vagy hígítószerben enziminhibitorokkal egyidejűleg, vagy egy megfelelő hordozóban, úgymint liposzómában. Gyógyászatilag elfogadható hígítószerek só- és vizes pufferoldatokat foglalnak magukban. Az enziminhibitorok felölelik a pankreásztripszin-inhibitort, diizopropil-fluorofoszfátot (DEP) és a trazilolt. A liposzómák közé tartoznak a víz-olaj-víz emulziók ugyanúgy, mint a hagyományos liposzómák ÍStreian et al., J. Neuroimmunol. 7, 27 (1984)].
Az aktív vegyületet beadhatjuk parenterálisan vagy intraperitoneálisan is. Készíthetünk diszperziókat glicerinben, folyékony polietilénglikolban és ezek keverékeiben és olajokban. Közönséges tárolási és felhasználási körülmények között ezek a készítmények tartalmazhat8
HU 218 610 Β nak tartósítószert a mikroorganizmusok növekedésének megakadályozására.
Az injektálásra alkalmas gyógyszerkészítmények magukban foglalnak steril vizes oldatokat (ahol vízoldható) vagy diszperziókat és steril porokat a steril injektálható oldatok vagy diszperziók azonnali elkészítéséhez. A készítménynek minden esetben sterilnek kell lennie, és oly mértékig folyékonynak, hogy könnyen injektálható legyen. Stabilnak kell lennie az előállítás és tárolás körülményei között, és védettnek kell lennie mikroorganizmusok, úgymint baktériumok és gombák okozta fertőzésektől. A hordozó lehet egy oldószer vagy diszperziós tápoldat, amely például vizet, etanolt, poliolt (például glicerint, propilénglikolt és folyékony etilénglikolt, és hasonlókat) és ezek alkalmas keverékeit tartalmazza. A megfelelő folyékonyságot fenntarthatjuk például bevonószerek, úgymint lecitin alkalmazásával, diszperziók esetében a kívánt részecskeméret megtartásával és felületaktív anyagok alkalmazásával. A mikroorganizmusok támadása elleni védelem elérhető különböző antibakteriális és antifungális szerek, például parabének, klorobutanol, fenol, aszkorbinsav, timerozal és hasonlók felhasználásával. Sok esetben előnyben részesítjük izotóniás szerek, például cukrok, polialkoholok, úgymint mannitol, szorbitol és nátrium-klorid jelenlétét a készítményben. Az injektálható készítmények meghoszszabbított abszorpcióját idézhetjük elő olyan szer bevitelével a kompozícióba, amely késlelteti az abszorpciót, például alumínium-monosztearáttal és zselatinnal.
Steril injektálható oldatokat állíthatunk elő az aktív vegyület (például gp39-antagonista) kívánt mennyiségének bevitelével egy megfelelő oldószerbe a fent felsorolt összetevők egyikével vagy kombinációival, szükség szerint, szűréses csírátlanítást követően. A diszperziókat általában az aktív vegyületnek egy olyan steril hordozóba történő beépítésével állítjuk elő, amely tartalmazza az alap-diszperzióstápoldatot és a szükséges egyéb komponenseket a fent felsoroltakból. Steril injektálható oldatok készítésére szolgáló steril porok esetén az előnyben részesített előállítási módszerek a vákuumszárítás és fagyasztva szárítás, amelyek az aktív összetevőt (például antagonistát) és valamilyen hozzáadott kívánt komponenst, annak előzőleg sterilre szűrt oldatából, por alakban szolgáltatja.
Ha az aktív vegyület megfelelően védve van, ahogyan azt fent leírtuk, a fehérjét beadhatjuk szájon át, például egy inért hígítóval, vagy egy asszimilálható, ehető hordozóval. A „gyógyászatilag elfogadható hordozó”, ahogyan itt használjuk, magában foglal mindennemű oldószert, diszperziós tápoldatot, bevonószereket, antibakteriális és antifungális szereket, izotóniás és abszorpciós késleltetőágenseket, és hasonlókat. Ilyen tápoldatok és szerek alkalmazása gyógyászatilag aktív anyagokhoz jól ismert a szakmában. Kivéve, ha bármilyen hagyományos tápoldat vagy szer összeférhetetlen az aktív vegyülettel, azok alkalmazása a terápiás összetételekben megfontolandó. Kiegészítő aktív vegyületek is bevihetők a készítményekbe.
Különösen előnyös a parenterális készítmények egységnyi adagokba történő formulázása a könnyű beadhatóság és a dozírozás egységesítése céljából. Az egységnyi adagolás az itt alkalmazottak szerint fizikailag különálló egységekre vonatkozik, amelyeket egységnyi adagokban használunk fel emlősalanyok kezelésére; minden egység az aktív vegyületnek előre meghatározott mennyiségét tartalmazza, amelyet a kívánt terápiás hatás elérésére - a szükséges gyógyszerészeti hordozóval társítva - számítunk ki. A találmány szerinti adagolási egységekre vonatkozó specifikáció közvetlenül függ a) az aktív vegyület egyedi tulajdonságaitól és az elérendő különleges terápiás hatástól és b) egy ilyen, egyedek érzékenységének figyelembevételére szolgáló, az aktív vegyület összetételében rejlő szakmai korlátoktól.
A T-sejtek in vivő toleránssá tételén felül a találmány felöleli T-sejtek in vitro toleránssá tételét, például érintkezésbe hozva azokat egy antigént bemutató sejttel gp39-antagonista jelenlétében. Például T-sejteket nyerhetünk ki egy alanyból, toleránssá tehetjük azokat in vitro tenyésztve az antigént bemutató sejtekkel és az antagonistával szemben, és azután újra beadhatjuk az alanynak.
IV. A találmány szerint előállított gyógyszerkészítmények alkalmazásai
A találmány szerint előállított gyógyszerkészítményeket alkalmazhatjuk különböző antigénekkel szembeni T-sejt-tolerancia kiváltására. Például T-sejt-toleranciát hozhatunk létre oldható antigénnel (például oldható fehérjével) szemben, ahogyan azt az 1. példában leírjuk. T-sejteket tehetünk toleránssá autoimmunbetegségekben vagy a normálistól eltérő immunválasszal összefüggő rendellenességekben szereplő antigénekkel szemben. Például egy megvalósítási módban az antigén egy autoantigén. Egy másik megvalósítási módban az antigén egy allergén. Egy másik lehetőségként T-sejteket tehetünk toleránssá olyan antigénekkel szemben, amelyek idegen sejtek felületén fejeződnek ki (ahogyan azt a 2-5. példákban leírjuk). Ennek megfelelően, még más megvalósítási módokban az antigén egy alloantigén vagy xenoantigén. T-sejt-tolerancia kiváltása alloantigénekkel és xenoantigénekkel szemben különös felhasználási jelentőséggel bír transzplantációnál, például a donorból átültetett szövetnek vagy szervnek, vagy csontvelőnek a transzplantált befogadó általi kilökődése megakadályozására. Ezenfelül a csontveló-transzplantátumon belül a donor T-sejtek toleránssá tétele hasznos az átültetett szövetnek a befogadó szervezettel szembeni reakciójából adódó megbetegedés megakadályozásában (lásd az 5. példát).
A találmányt a továbbiakban a következő, az oltalmi kör korlátozását nem jelentő példákkal szemléltetjük. A bejelentés egészében idézett minden hivatkozás és közzétett szabadalmi bejelentés tartalmát itt építettük be referenciaként.
1. példa
Antigénspecifikus tolerancia kiváltása
Módszerek
Egereket immunizáltunk KLH-val kezelt lép-B-limfocitákkal 5 napon keresztül. Az elsődleges immunizálás alatt az állatokat vagy nem kezeltük, vagy kezeltük
HU 218 610 Β egy anti-gp39-antitesttel, MRl-gyel. A kezdeti immunizálás után 5 nappal az egereket komplett Freund- adjuvánsban (CFA) levő KLH hatásának tettük ki helyileg (food pad). Az egereket 5 nappal később feláldoztuk, az elfolyó nyirokcsomókat eltávolítottuk és ezt követően in vitro meghatároztuk a KUH-ra adott T-sejt- szaporodási választ.
Eredmények
Olyan állatokban, amelyeket antigénnel kezelt, aktív B-limfocitákkal immunizáltunk és ezt követően ugyanazon antigén hatásának tettünk ki, jelentősen megemelkednek az immunizálóantigénre adott immunválaszok. A választ, amelyet az antigénspecifikus T-limfociták szaporodásával mértünk, az 1. ábrán mutatjuk be. Az állatoknak az elsődleges immunizálás alatt anti-gp39-antitesttel történő kezelése az antigénspecifikus T-limfociták válaszképtelenségét eredményezi in vitro antigénkihívásra. Az anti-gp39-antitesttel kezelt állatok nyirokcsomóiból kinyert T-limfociták lecsökkent szaporodási képességet mutatnak a kezeletlen állatok nyirokcsomóiból kinyert T-limfocitákhoz képest.
2. példa
Allogén sejtekkel szemben kiváltott T-sejt-tolerancia Módszerek
Balb/c (H-2d) egereket immunizáltunk DBA/2 (H-2b) egerekből származó allogén lép-B-sejtekkel. Az állatokat 5 nappal az immunizálás után anti-gp39 antitesttel, MRl-gyel kezeltük vagy nem kezeltük. A 6. napon az állatokat feláldoztuk, és eltávolítottuk a lépüket. Az anti-gp39-antitesttel kezelt vagy kezeletlen állatok lépsejtjeit ezután in vitro tenyésztettük stimulus nélkül vagy besugárzott DBA/2 lépsejtekkel stimulálva. Erre a második allogén stimulációra adott szaporodási választ mértük 3 nappal a tenyésztés indítása után. Eredmények
Az allogén lép-B-sejtekkel immunizált állatokból származó T-limfociták erősen megemelkedett szaporodási választ adtak, amikor ugyanezen sejtek hatásának tettük ki azokat in vitro 5 nappal később (2. ábra). Allogén lép-B-sejtekkel immunizált és anti-gp39-antitesttel kezelt állatokból származó T-limfociták azonban csökkent szaporodási képességgel rendelkeztek, amikor azt követően kihívásnak tettük ki azokat in vitro. Az anti-gp39-antitesttel kezelt egerek körülbelül 50%-os csökkenést mutattak a kihívásra adott válaszkészségben a kontroll-kezeletlenegerekhez képest.
3. példa
Anti-gp39-kezelés megakadályozza az allogén B-sejtekre adott CTL-válaszok létrejöttét
Ebben a példában a gp3 9-nek a citotoxikus T-sejtek (cytotoxic T celis=CTL) keletkezésében játszott szerepét vizsgáltuk. A gp39-nek a CTL-fejlődésben in vivő játszott szerepe becslésére megvizsgáltuk az anti-gp39kezelés hatásait az allospecifikus CTL keletkezésére allogén B-sejtekkel történő immunizáció során. Meghatároztuk az anti-gp39-kezelésnek mind az elsődleges, mind a másodlagos CTL-válaszokra kifejtett hatásait.
Elsődleges CTL-válaszok
Annak vizsgálatára, vajon az anti-gp39 megakadályozhatja-e az allogén B-sejteket CTL-válaszok kiváltásában in vivő, allogén B-sejteket (T-kiürített lépsejtek) adtunk be befogadó egereknek anti-gp39-cel együtt vagy a nélkül. Balb/c egereket (6-8 hetes nőstény, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) immunizáltunk C57BL/6 (6-8 hetes nőstény, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) lépsejtjeivel (30-50xlO6), amelyekből anti-Thyl.2-vel (H013.4 ATCC-klónból való hasűri folyadék) és nyúlkomplementtel történő kezeléssel kiürítettük a T-sejteket. Ezeket a befogadó egereket kezeltük azután 5 napon keresztül anti-gp39-cel (250 mg/recipiens a 0., 2. és 4. napon), vagy nem kezeltük. Az 5. napon eltávolítottuk a lépeket, és mértük a CTL-válaszokat 4 órás krómelengedés-meghatározással. A fel nem töltött Balb/c egerekből származó lépsejteket negatívkontroll-effektorsejtekként használtuk. Az alkalmazott célsejtek E nőstény KI (H-2b, C57BL/6 törzsből származó T-sejt-limfóma) és P815 (H-2d, DBA/2J törzsből származó masztocitóma). A 51Cr-jelölt célsejteket mostuk, és 96 mélyedést tartalmazó lemezekre szélesztettük lxlO4 sejt/mélyedés koncentrációban effektorsejtekkel együtt, 100:1, 20:1 és 4:1 effektor:célsejt (E:T) arányokban. A lemezeket rövid ideig centrifugáltuk, és utána 37 °C-on 5% CO2 mellett 4 órán át inkubáltuk. A lemezeket még egyszer centrifugáltuk, és a sejtmentes felülúszó 100 ml-ét minden mélyedésből összegyűjtöttük gamma-számláláshoz (LKB Clinigamma, Wallace Inc., Gaithersburg, MD). Százalékos lizist definiáltunk az (a-b)/c összefüggéssel, ahol a=az effektorsejtekkel inkubált célsejtek által elengedett cpm, b=csak tápoldattal inkubált célsejtek által elengedett cpm (spontán kiengedés), c=a célsejtekből fagyasztás-felengedés során kiengedett cpm (a teljes beépült cpm-nek körülbelül 80%a). A P815 célsejtek nem lizáltak, bármelyik sejtmintát vizsgáltuk. Az E nőstény KI célsejtekre kapott eredményeket a 3A. ábra szemlélteti, ahol a bemutatott csoportok: kezeletlen egerek (|), anti-gp39-cel kezelt egerek (Δ), és fel nem töltött Balb/c egerek lépsejtjei (®); amelyeket negatívkontroll-effektorsejtekként használtunk fel). Az eredmények azt mutatják, hogy az anti-gp39-et és allogén B-sejteket kapott egerek nem hoztak létre elsődleges CTL-választ in vivő allogén B-sejtekre adott válaszként. Ezzel ellentétben anti-gp39 hiányában az allogén B-sejtek érzékennyé tették a befogadót az alloantigénre, és jelentős CTL-választ váltottak ki.
Annak meghatározására, hogy anti-gp39 csak fel tudta erősíteni a nem aktivált lép-B-sejtek toleranciát kiváltó hatását, LPS-aktivált B-sejteket alkalmaztunk CTL-feltöltésre anti-gp39 jelenlétében vagy hiányában. C57BL/6 törzsből származó B-sejteket készítettünk elő a fent leírtak szerint, és tenyésztettük 2 napig lipopoliszacharid (LPS; 50 mg/ml; Sigma Diagnostics, St. Louis, MO) jelenlétében vagy a nélkül. Azután kinyertük a sejteket, és alaposan mostuk, és Balb/c befogadó egerekbe ip. (intraperitoneálisan) injektáltuk (30-50xlO6). A befogadó egerek vagy kezeletlenek, vagy a 0., 2. és 4. napon anti-gp39-cel kezeltek voltak, ahogyan azt fent leírtuk. Két egymástól független kísér10
HU 218 610 Β let eredményeit mutatjuk be a 3B. ábrán (felső és alsó táblák). A bemutatott csoportok: LPS-blasztok in vivő kezelés nélkül (A), LPS-blasztok in vivő anti-gp39-kezeléssel (φ), pihenő B-sejtek in vivő kezelés nélkül (O) és pihenő B-sejtek in vivő anti-gp39kezeléssel (D). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy bár nem teljesen, de az anti-gp39-kezelés szintén csökkentette az allogén LPS-blasztokra adott elsődleges CTL-választ.
Másodlagos CTL-válaszok
Ahhoz, hogy megvizsgáljuk az anti-gp39 és allogén B-sejtek befolyását a CTL-képződésre, kezelt és kezeletlen egerek lépsejtjeit stimuláltuk in vitro, és vizsgáltuk a CTL-válaszok kiteqedését. Balb/c egereket töltöttünk fel in vivő C57BL/6 törzsből származó B-sejtekkel, ahogyan azt fent leírtuk. Az anti-gp39-cel és a kontrollhörcsög Ig-vel (HIg-vel) kezelt állatok lépsejtjeit eltávolítottuk, és 5 χ 106 sejt/ml-t tenyésztettünk 5 napig („válaszadók”) lép-B-sejtek (anti-Thy 1.2-vei+komplementtel kezelve) különböző, mitomicin C-vel (2,5 mg/ml 37 °Con, Sigma Diagnostics, St. Louis, MO) kezelt törzseinek 5xl06 sejt/ml-ével („stimulátorok”). A stimulátorcsoportokat C57BL/6 (H-2b) és Balb/c (H—2d) alkották, amelyek külön-külön jelezték a másodlagos allogén választ és az elsődleges színgénválaszt. A stimulátorés válaszadó sejteket frissen készített szenzitizáló RPMI-1640 tápoldatban (Bio Whittaker, Walkersville, MD) tenyésztettük, amely 1 χ 105 M 2-merkapto-etanolt, (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), 2 mM L-glutamint (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO), 500 E/ml penicillint és 5000 E/ml sztreptomicint (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO) tartalmazott. 5 nap után kinyertük a válaszadó sejteket, és sűrűséggradiens-centrifugálással eltávolítottuk a holt sejteket. Az eredményül kapott élő sejteket effektorként használtuk fel a CTL-meghatározásnál, ahogyan azt fent leírtuk. A célsejtek E nőstény KI (H-2b, C57BL/6 törzsből származó T-sejt-limfóma) és P815 (H-2d, DBA/2J törzsből származó masztocitóma) volt. Az eredményeket a 4A. ábrán szemléltetjük. A bemutatott, allogén stimulusnak kitett effektorcsoportok: HIg-vel kezelt befogadók (φ), érintetlen Balb/c-k (A) és anti-gp39-cel kezelt befogadók (|). A megfelelő színgénválaszt (Balb/c sejtekkel stimulált Balb/c sejtek) az üres jelek mutatják. Ahogyan az várható volt, az egerek allogén, T-sejtektől kiürített lépsejtekkel (H-2b) történő in vivő immunizálása anti-gp39-kezelés hiányában nagymértékű másodlagos CTL-választ eredményezett in vitro. A megemelkedett másodlagos anti-H-2b CTL-választ nem tapasztaltuk abban az esetben, ha az egereknek in vivő anti-gp39-et adtunk be.
A CTL-válaszok anti-gp39-kezeléssel kiváltott gátlása specificitásának meghatározására lépsejtkultúrákat analizáltunk - ahogyan azt fent leírtuk - anti-H-2k allogén válaszokra, (allogén válaszok harmadik szakasza) B10BR (H-2k) lép-B-sejteket alkalmazva stimulátorként és SL8 (H-2k, AKR törzsből származó spontán T-sejt-limfóma) sejteket célsejtként a CTLmeghatározásnál. Az eredményeket a 4B. ábrán mutatjuk be. A bemutatott csoportok érintetlen Balb/c sejtek (O) és anti-gp39-cel kezelt befogadók (). Az eredmények azt mutatják, hogy az anti-H-2b-specifíkus
CTL-válaszok gátlása anti-gp39-kezeléssel allospecifikus volt, mivel a H-2b lépsejtek és az anti-gp39 beadása nem változtatta meg a mellette levő H-2k alloantigénre adott in vitro CTL-választ.
Összefoglalva, ezek az adatok azt mutatják, hogy anti-gp39 megakadályozza allospecifikus CTL-válaszok létrejöttét (mind az elsődlegest, mind a másodlagost). Anti-gp39 jelenlétében a releváns alloantigénre specifikus CTL-prekurzorok még jelen vannak, mivel az in vitro másodlagos tenyészetben kimutatható egy kevés anti-H-2b CTL-aktivitás. Levonhatjuk azt a következtetést, hogy az anti-gp39-kezelés csökkentette a másodlagos in vitro választ, blokkolva a CTL-feltöltést vagy csökkentve a feltöltött allospecifikus CTL gyakoriságát. Pihenő B-sejtek alkalmazása nem szükségszerű e válaszképtelenség szemléltetésére, mivel az LPSblasztokkal kiváltott allogén CTL-válasz szintén meggyengült az anti-gp39 alkalmazásával.
4. példa
Allogén murénacsontvelő átvitele stabil kimérákat hoz létre a befogadók gp39 elleni antitesttel való reagáltatása esetén
Számos hematológiai rendellenesség - amelyek nem gyógyíthatók hagyományos kemoterápiás módszerekkel - magában foglalja allogén csontvelő átültetését. Ez az agresszív terápia felöleli a magas, mieloablatív dózisú kemoterápiát, összekapcsolva allogén csontvelő perfúziójával klonogén daganatsejtek kiirtására.
Már kimutatták, hogy a tímusz besugárzása, tímusz-T-sejtek megsemmisítése megnöveli stabil kimérák váratlan létrejöttét, amikor T-sejtekkel szembeni monoklonális antitesteket (mAb-ket), beleértve antiCD4 mAb-ket, használtunk. Ez az antitestfolény vezetett a T-sejt-megsemmisítéshez, és ennek következtében donorspecifikus toleranciához, amelyet ki tudtunk mutatni átültetett donor bőrszövetekkel szembeni tolerancia révén. Annak kudarcát, hogy 300 rád WBI, in vivő anti-T-sejt mAb-kezelés és allogén csontvelő beadása után folyamatos allogén beépülést érjünk el, eredményezhették a tímusz belsejében levő nem befolyásolt T-sejtek. Anti-CD4 és anti-CD8 mAb-k alkalmazása a perifériás vér- és lép-T-sejtek hatásos kiürüléshez vezethet, a tímusz-T-sejteket azonban egyszerűen bevonják az mAb-k, de azok nem semmisülnek meg. Ezért tehát az egereken tímuszbesugárzást végeztünk.
Módszerek
FI murénamodellt használtunk szülőbe történő allogén csontvelő-átültetéshez (boné marrow transfer=BMT) oly módon, hogy keletkezésénél fogva elkerüljük az átültetett szövetnek a befogadó szervezettel szembeni reakciójából adódó betegséget. A CB6 jelű FI törzset használtuk, amely (C57BL/6xBalb/c)Fl az átfogó MHC H-2d/b haplotípust eredményezi. A csontvelőt eltávolítottuk, és iv. injektáltuk a besugárzott Balb/c szülőbe anti-gp39-antitesttel, MRl-gyel együtt vagy a nélkül. Az egész testre kiterjedő besugárzás (whole body irradiation=WBI) szintjeit úgy változtattuk, hogy meghatározzuk a kiméraképződés legjobb szintjét, és összehason11
HU 218 610 Β gárzást kezeléssel együtt, mint a 600 rád besugárzást kezelés nélkül kapott csoportot (2. táblázat). Az is látszott, hogy az anti-gp39-antitest-kezelés nem változtatta meg jelentősen a limfoid sejtek egyikének sem a tel5 jes populációs százalékát a periférián belül. Amikor az állatok anti-gp39-antitesttel történő kezelése befejeződött, az állatokat stabilan kimérahordozónak találtuk a transzplantációt követő 8 héten keresztül.
lítsuk az anti-gp39-antitesttel kezelt és kezeletlen állatokat mindegyik besugárzási szinttel. A kiméraképződést a H-2d(Balb/c) egérben jelen levő H-2b MHC haplotípus perifériás vérlimfocitáinak áramlásos citometriás analízisével határoztuk meg. Már korábban megmutattuk, hogy az egereknek ez a kombinációja megfelelő, és kimérák nyerhetők 500 és 600 rád WBI-szinteknél.
Eredmények
Kiméraképződést mutattunk ki C57BL/6-ból származó (H-2b) sejtek áramlásos citometriával történő azonosításával. Fejlődő kimérákat csak abban az esetben találtunk 400, 500 és 600 rád WBI-vel kezelt egerekben 14 napon belül, ha a vizsgálat kezdetétől fogva anti-gp39-antitest-kezelést kaptak. Azok az egerek, amelyek nem kaptak antitestet, kilökték a sejteket a besugárzás minden szintjén, kivéve, ha 600 rád WBI-t kaptak, amelynek következtében ugyanolyan mértékben fogadták be a csontvelőt, mint az antitesttel kezelt csoport 400 rád mellett (1. táblázat). Azt találtuk, hogy a kiméraképződés szintje a 400, 500 és 600 rád és anti-gp39-antitest-terápiát követően 6 héttel egyenként 70,7+5,74; 94,1 és 84,4+8,56 volt, miközben 600 rád besugárzásnál antitestkezelés nélkül 85,7+5,9 kiméraképződési szintet találtunk (2. táblázat). A sejtek fenotipizálása ezen a ponton azt jelezte, hogy T-sejtek, B-sejtek és makrofágok mind kimerizálódtak, és ugyanolyan mértékben, ha összehasonlítjuk a 400 rád besu1. táblázat
| Egész testre kiterjedő besugárzás (rád) | Kimérahordozó állatok száma anti-gp39-kezeléss el | Kimérahordozó állatok száma anti-gp39-kezelés nélkül |
| 0 | 0(5) | 0(5) |
| 200 | 0(5) | 0(5) |
| 400 | 9(9) | 0(9) |
| 450 | 3(5) | 0(5) |
| 500 | 4(5) | 2(5) |
| 600 | 7(9) | 7(9) |
Az egész testre kiterjedő besugárzás szintjei által eredményezett ki25 méraképződés. A zárójelben levő számok minden szintnél a tesztelt állatok teljes számát mutatják.
2. táblázat
| rád | Kezelés | H-2Kb+ | B-sejtek H-2Kb+ | T-scjtck H-2Kb+ | Makrofágok H-2Kbb+ |
| 400 | + | 70,7+5,74 | 89+2,6 | 45,9+13,3 | 82,3+3,3 |
| 500 | + | 94,1 | 100 | 89 | 100 |
| 600 | + | 84,4+8,56 | 99,3+0,94 | 72,3+15,9 | 91,1+8,3 |
| 600 | - | 85,7+5,9 | 97,3+1,77 | 67,1 + 10,3 | 91+9 |
H-2Kb+-re pozitív B-scjtek, T-sejtek és makrofágok százalékos arányai standard hiba.
5. példa
Allogén csontvelő-átültetés a recipiensnek anti-gp39cel történő kezelésével kombinálva, amely gátolja az átültetett szövetnek a befogadó szervezettel szembeni reakciójából adódó akut és krónikus betegséget (GVHD=graft versus hőst disease=az átültetett szövet- 45 nek a befogadó szervezettel szembeni reakciójából adódó betegség)
Ebben a példában a következő módszertant használtuk:
Egerek: DBA/2 (H-2d), C57BL/6 (H-2b) és 50 B6D2F1[(C57BL/6(H-2d)xDBA/2)F, hibrid] egereket szereztünk be az NCI laboratóriumból (Bethesda, Maryland), és vírusmentes környezetben tartottuk fenn a következő intézményben: Animál Facility at Darthmouth Medical School. Az ebben a vizsgálatban felhasznált 55 egerek mindegyike 68 hetes nőstény volt.
Krónikus GVHD kiváltása: Krónikus GVHD-t váltottunk ki szülői (DBA/2) lépsejteknek besugározatlan (C57BL/6xDBA/2)F[ hibrid befogadókba iv. (intravénásán) történő injektálásával [Fást L. D., J. Immu- 60 nol. 144, 4177 (1990)]. A szülői egereket elaltattuk, és nyakficammal megöltük őket a lép eltávolítása céljából. A disszociált lépsejteket mostuk, és RPMI 1640 tápoldatban (Whittaker, Waldersville, Maryland) újraszuszpendáltuk az FI befogadókba történő iv. injekcióhoz.
Akut GVHD kiváltása: Akut GVHD-t váltottunk ki szülői C57BL/6 lépsejteknek besugározatlan (C57BL/6x xDBA/2)Fl hibrid befogadókba iv. (intravénásán) történő injektálásával. A sejteket ugyanúgy készítettük elő az átültetéshez, mint a krónikus GVHD-indukcióhoz. Antitestek: Anti-gp39-et, MRl-et állítottunk elő hasüregi folyadékban, és tisztítottuk ioncserélő HPLC-vel, ahogyan azt korábban leírtuk [Foy et al., J. Exp. Med. 178, 1567-1575 (1993); Noelle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6550 (1992)], Poliklonális antiizotípus antitestek: Minden anti-IgGr és IgA-antitestet és standard kontrollt a Southern Biotechnology Associates, Inc., cégtől (Birmingham AL) szereztünk be. Anti-IgE antitestek: Minden az IgE-specifikus ELISAban használt anti-IgE-antitestet (B1E3 és Biotin AM95)
HU 218 610 Β és standardot (A3B1) Dr. T. Waldschmidt, IA ajándékaként kaptunk. Anti-MHC haplotípus antitestek: H 2Kb FITC konjugált antitestet és H-2Dd biotinnel konjugált antitestet szereztünk be a PharMingen (San Diego, CA) cégtől.
Sejtvonalak: A felhasznált sejtvonalak közé tartoztak a P815 (H-2d) és LB27.4 (H-2bxd) sejtvonalak, amelyeket az American Type Culture Collection törzsgyűjteményből szereztünk be. A cl. 18.5 (H-2b) sejtvonalat Dr. William R. Greentől kaptuk ajándékba.
Poliklonális Ig-termelés in vitro: Eltávolítottuk kontroll- és cGVHD egerek lépeit, és egysejt-szuszpenziókat készítettünk. A sejteket Tris-pufferrel beállított ammónium-kloriddal kezeltük az eritrociták eltávolítása céljából, és meghatároztuk a teljes fehérvérsejtszámot vizuális hemocitométeres számlálással. A sejteket inkubáltuk (5 χ 106) 1 ml komplett (c)RPMI 1640 tápoldatban [10% borjúszérummal (Hyclone, Logan UT) 25 mM HEPES-sel, 2 mM L-glutaminnal, 5000 E/ml penicillinnel és 5000 E/ml sztreptomicinnel kiegészítve] 3 napig 37 °C-on, 5% CO2 mellett. A tenyészet felülúszóját összegyűjtöttük a sejtek pelletálása révén, és meghatároztuk az Ig-t izotípusspecifikus ELISA-val. Izotipusspecifikus és antigénspecifikus ELISA-k ELISA az IgGt és IgA kimutatására: Kecske anti-egér IgG! vagy IgA antitesteket (10 μ g/ml; Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham AL) PBSben abszorbeáltunk egy 96 mélyedést tartalmazó polivinil mikrotitrálólemezre 1 órán keresztül 37 °C-on, majd egy éjszakán át 4 °C-on. A lemezeket mostuk, és blokkoltuk 1% FCS-t tartalmazó PBS-sel 1 óráig 37 °C-on. A lemezeket újból mostuk, és a felülúszók megfelelő hígításait és standard kontrollokat (IgG! és IgA, Southern Biotechnology Associates, In., Birmingham AL) adtunk hozzá 2 órán át 37 °C-on. Ez idő lejárta után a lemezeket 3-szor mostuk, és alkalikus foszfatázzal konjugált kecske anti-egér IgGret vagy IgA-t (1/500 hígításokat) (Southern Biotechnology Associates, In., Birmingham AL) adtunk hozzá 2 órán át 37 °C-on. A lemezeket alaposan mostuk, és foszfatáz szubsztrátot (1 mg/ml; Sigma Diagnostics, St. Louis, MO) adtunk megfelelő színváltozást eredményezve. A leolvasást egy ELISA-leolvasóval végeztük el (Dynatech Laboratories, Inc.) 410 nm-en mért abszorbanciánál. Az Ig-koncentrációkat a megfelelő izotípus standard görbéjével összevetve határoztuk meg, és közép+ standard hiba értékként fejeztük ki (n=3).
ELISA az IgE kimutatására: 96 mélyedést tartalmazó polivinil mikrotitrálólemez mélyedéseit egy anti-egér IgE-antitesttel [B1E3 (2 mg/ml)] vontuk be egy éjszakára 4 °C-on, és utána 1% FCS-t tartalmazó PBS-sel blokkoltuk 1 órán át 37 °C-on. A lemezeket újra mostuk, és a felülúszók megfelelő hígításait és standard kontrollokat [A3Bl(IgE)] adtunk hozzá 2 órán át 37 °C-on. A lemezeket alaposan mostuk, és minden mélyedésbe az EM95-Biotint (5 mg/ml) adtuk, és 2 órán át 37 °C-on inkubáltuk. Ezután alkalikus foszfatázzal konjugált sztreptavidint adtunk hozzá (1/500 hígításban) további 2 óráig, majd utána alaposan mostuk, mielőtt foszfatázszubsztrátot adtunk hozzá (1 mg/ml; Sigma Diagnostics, St. Louis, MO), amely a megfelelő színváltozást eredményezte. A leolvasást egy ELISA-leolvasóval végeztük el (Dynatech Laboratories, Inc.) 410 nmen mért abszorbanciánál. Az Ig-koncentrációkat a megfelelő izotípus standard görbéjével összevetve határoztuk meg, és közép+standard hiba értékként fejeztük ki (n=3).
ELISA anti-DNS-antitest (Ab) kimutatására: Boíjútímusz-DNS-t (Sigma, St. Louis, MO) (5 pg/ml-t) oldottunk 0,1 M nátrium-karbonát/nátrium-bikarbonát tartalmú kapcsolópufferben (pH 9,8). Ezt 10 percig forraltuk, és utána 3 percig jégen tartottuk. Ezután meghatároztuk a DNS OD260-értékét és a koncentrációt, amelyet a kívánt 5 pg/ml elérésére állítottunk be. Ezután 100 μΐ-t adtunk a 96 mélyedést tartalmazó polivinilmikrotitráló mélyedéseibe, és egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk. A lemezt ezután 3-szor mostuk, és blokkoltuk 1 órán át 37 °C-on 1% FCS-t és 0,02% nátriumazidot tartalmazó PBS-sel. A lemezt újból mostuk, majd a szérumminta hígítási sorozatait adtuk hozzá (100 ml-t), és 2 órán át 37 °C-on inkubáltuk. A detektálóantitestet, kecske anti-egér IgGj alkalikus foszfatázt adtuk ezután minden mélyedésbe, és még egyszer inkubáltuk 2 órát 37 °C-on. A lemezeket alaposan mostuk, és foszfatázszubsztrátot adtunk hozzá (1 mg/ml; Sigma Diagnostics, St. Louis, MO), amely a megfelelő színváltozást eredményezte. A leolvasást egy ELISAleolvasóval végeztük el (Dynatech Laboratories, Inc.) 410 nm-en mért abszorbanciánál. Az antitesttitereket a pozitív szérummintákkal vetettük össze, és az eredményeket tetszőleges egységekben fejeztük ki.
Áramló citometriás analízis a donorból származó sejtek kimutatására: Eltávolítottuk a normál BDF1 és anti-gp39-cel kezelt és kezelés nélküli cGVHD egerek lépét, és egysejt-szuszpenziót készítettünk. A sejteket Ficoll-Hypaque (4:l)-re rétegeztük, és ezután 2000 rpm mellett 20 percig, szobahőmérsékleten centrifugáltuk. Az eredményül kapott limfocitaréteget eltávolítottuk, és egyszer mostuk 5% FCS-t tartalmazó BSS-sel. Csövenként 1 χ 106 sejtet használtunk a festéshez 50 μΐ végső térfogatban. 50 μΐ patkányszérumot adtunk minden csőhöz az antitestek nem specifikus kötődésének megelőzésére. A sejteket megfestettük a) kontrollantitestekkel: patkány-Ig FITC (1:100 végső hígítás) és PEsztreptavidin (1:500 végső hígítás) és b) FITC H-2Kb és Biotin H-2Dd (mindkettő 1:100 végső hígítás). A sejteket 20 percig jégen tartottuk, utána kétszer mostuk a nem kötődött antitestek eltávolítása céljából. Végül PEsztreptavidint (1:500 végső hígítás) adtunk a megfelelő csőhöz a biotinnal konjugált antitest kimutatására egy következő, 20 perces jégen tartással. A sejteket újra kétszer mostuk, így készek voltak egy Becton Dickinson FACScannel végzett analízishez. Pozitív előrejutás és oldaba szóródás után 10 000 „versenyzőt” gyűjtöttünk össze mintánként, hogy meghatározzuk a releváns MHC haplotípusra pozitív sejtek százalékos arányát. Krómelengedés vizsgálata CTL-meghatározás becslésére: 51Cr-jelzett célsejteket mostunk, és effektorsejtekkel 100:1, 20:1 és 4:1 E:T arányokban, 1 χ 104/mélyedés mennyiségekben 96 mélyedést tartalmazó lemezek13
HU 218 610 Β re szélesztettük. Az alkalmazott célsejtek P815 (H-2d), LB27.4 (H-2b+xd) és cl.18.5 (H-2b) sejteket foglaltak magukban. A lemezeket rövid ideig centrifugáltuk, és utána 37 °C-on, 5% CO2 mellett 4 órán át inkubáltuk. A lemezeket még egyszer centrifugáltuk, és a sejtmentes felülúszó egy kis részletét minden mélyedésből összegyűjtöttük gamma-számlálóval történő számláláshoz. Százalékos lízist definiáltunk az (a-b)/c összefüggéssel, ahol a=az effektorsejtekkel inkubált célsejtek által elengedett cpm, b=csak tápoldattal inkubált célsejtek által elengedett cpm (spontán kiengedés), c=a célsejtekből fagyasztás-felengedés során kiengedett cpm (a teljes beépült cpm-nek körülbelül 80%-a).
Akut GYHD lépsejtek másodlagos stimulálása in vitro: Akut GVHD lépeket távolítottunk el anti-gp39-cel kezelt, HIg-vel kezelt vagy kezeletlen állatokból. A lépekből kiürítettük a vörösvérsejteket, és utána 1 χ 104 sejt/ mélyedés részleteket mértünk ki. Besugárzott stimulátorsejteket (P815) adtunk a megfelelő mélyedésekbe. 7 nap elteltével CTL-meghatározásokat végeztünk a megfelelő célsejtekkel szemben, ahogyan ezt már korábban említettük.
Eredmények
A GYEID lépmegnagyobbodást eredményez egerekben. A cGVHD egyik következménye az egérben a lép megnagyobbodása. Elsősorban a gazdaszervezet saját sejtjei azok, amelyek beszivárognak és megnövelik a lépet, bár ez a donorsejtekre adott válaszként jelentkezik [Rolink et al., J. Exp. Med. 158, 546 (1983)]. Az 5. ábra mutatja, hogy 7-14 nappal a cGVHD kezdete után a lépek majdnem kétszeres számú leukocitát tartalmaznak, összevetve cGVHD-ben nem szenvedő egerekkel. Az egereknek a cGVHD kezdetén anti-gp39-cel történő kezelése (250 pg/egér a 0., 2. és 4. napon) a leukociták lépenkénti számát a betegségtől mentes egerekével azonos szintre csökkenti.
GYHD kiváltotta poliklonális immunglobulintúltermelés. Már beszámoltak róla, hogy egerekben a cGVHDvel kiváltott Ig-túltermelés donor T-sejtek és B-sejtek közötti rokon kölcsönhatásoknak tulajdonítható [Morris et al., J. Exp. Med. 171, 503 (1990)]. Annak meghatározására, vajon az anti-gp39 gátolja-e az Ig-túltermelést, cGVHD-ben szenvedő egereknek adtunk be anti-gp39-et. A 7. vagy a 14. napon eltávolítottuk a lépeket a kontroll- és cGVHD egerekből, és megvizsgáltuk a B-sejteket spontán IgG,- és IgA-termelésre nézve. A cGVHD-ben szenvedő egerekből származó lépsejtek nagy mennyiségben termeltek IgA-t és IgGr et (6A. és 6B. ábra) in vitro. A cGVHD-ben szenvedő és anti-gp39-cel kezelt (0., 2., 4. és 6. napon) egerekből származó lépsejtek azonban a betegségtől mentes egerekével azonos szintű IgA-t és IgG,-et termeltek. Anti-gp39 hozzáadása cGVHD-ben szenvedő egerekből származó lépsejtekhez nem csökkentette az in vitro Ig-termelés szintjét, azt sugallva, hogy az anti-gp39 in vivő fejtette ki hatását.
Ha hörcsög-Ig-t (HIg-t) használtunk kontrollként ezekhez a kísérletekhez, azt találtuk, hogy nem mutatott gátló szerepet a GVHD kiváltásában, sőt még kihangsúlyozta a betegséget nemcsak poliklonális Ig-termelésben kifejezve, hanem az eredményezett lépmegnagyobbodásban is. 8-szoros növekedést mutattunk ki az 1 hét alatt termelt lg szintjében a HIg-vel kezelt, GVHD-indukált egerekben, összehasonlítva az 1 hetes kezeletlen GVHD-indukált egerekkel. Nyilvánvaló volt, hogy a Híg már önmagában is immunogén hatású volt. Tehát úgy döntöttünk, hogy a kezeletlen FI befogadó egereket jelöljük ki releváns kontrollcsoportként. Anti-gp39 hatása GVEID-indukálta magas szérum-IgEre és anti-DNS-antitestekre. A cGVHD lefolyását nyomon követhetjük a szérum-IgE és a kettős szálú DNSsel szembeni antitestek megemelkedésével [Morris et al., J. Exp. Med. 171, 503 (1990)]. A szérum-IgE szintjét IgE-specifikus ELISA alkalmazásával mértük. Krónikus GVHD-indukált egereket kezeltünk anti-gp39cel a 0., 2., 4. és 6. napon, és utána már nem adtunk be további antitestet. Az egerektől hetenként vért vettünk, és meghatároztuk a szérum-IgE-szinteket (7A. ábra). A cGVHD 10-15-szörös emelkedést idézett elő a szérum-IgE-szintekben. Anti-gp39 beadása gátolta a cGVHD kiváltotta növekedést a szérum-IgE-ben a betegség kezdetétől számított 8 héten keresztül. A szérum-IgE emelkedésének gátlásán felül anti-gp39 beadása blokkolta a szérum-anti-DNS- autoantitestek keletkezését is. Krónikus GVHD által kiváltott 5-10-szeres emelkedést tapasztaltunk az anti-DNS-antitest szintjében, amelyet csökkentett az anti-gp39-kezelés (7B. ábra).
Korábbi tanulmányok azt mutatták, hogy az antigp39 (MR1 klón) felezési ideje 12 nap [Foy et al., J. Exp. Med. 178, 1567-1575 (1993)]. Az anti-gp39 kimutatására specifikus ELISA-analízisek azt jelzik, hogy az anti-gp39 a kezelt egerek szérumában a terápiát követően 8 héttel nem volt kimutatható. Eszerint a cGVHD elnyújtott szuppressziója nem magyarázható az anti-gp39 állandó jelenlétével. Átültetési vizsgálatokat végeztünk annak tanulmányozására, vajon a cGVHD-ben szenvedő egerekből származó lépsejtek és azokból származók, amelyeknek anti-gp39-et adtunk be, át tudják-e vinni a cGVHD-t. Olyan egerek lépsejtjei, amelyek cGVHD-ben szenvedtek, és anti-gp39-et kaptak, képtelenek voltak megemelkedett szérum-IgEés anti-DNS-autoantitest-szintet kiváltani adoptív transzfer útján; miközben cGVHD-ben szenvedő egerek lépsejtjei megnövekedett szérum-IgE- és anti-DNS- antitest szintet váltottak ki. Ezek az adatok azt sugallják, hogy az alloreaktív T-sejtek válaszképtelenné váltak az anti-gp39 kezelés eredményeként.
Alloreaktív donorsejtek kimutatása. Amikor cGVHDindukált egerek lépsejtjeiben donorból származó sejtek jelenlétét kutattuk, azt találtuk, hogy a normál BDF1gyel összevetve, amely kétszeresen pozitívan festódik H-2Kb-re és H-2Dd-re, cGVHD körülbelül 5-7% donorsejttel rendelkezett. Ezek a sejtek DBA/2-ből származnak, és ezért egyszeresen pozitívan festődnek H-2Dd-re. Ezeket a sejteket kimutattuk anti-gp39-kezelésre való tekintet nélkül. Ez szemlélteti azt a pontot, hogy az anti-gp39-kezelés megengedi a donorsejtek beültetését anélkül, hogy a recipiens B-sejtekre gyakorolt bármely segítőfunkciót akadályozná, amely a kezelet14
HU 218 610 Β len cGVHD-csoportban poliklonális Ig-termelődést eredményez.
Az anti-gp39-kezelés hatása akut GVHD indukciójára. Az akut GVHD kapcsolatban van a megnövekedett anti-allogén CTL-válasz kiváltásával. Miközben nyilvánvaló, hogy a gp39-CD40 kölcsönhatások kritikusak a Th-B-sejt kölcsönhatásokra, nem világos, vajon más immuneffektor-mechanizmusok kiváltása is megváltoztatható-e anti-gp39-terápiával. aGVHD-t váltottunk ki C57BL/6 lépek FI befogadóknak történő beadásával. Ahogyan azt a 8. ábrán bemutatjuk, 12 nappal az allogén sejtek átvitele után nagymértékű H-2b antiH-2d CTL-választ mértünk. Egereknek anti-gp39-cel történő kezelése megakadályozta H-2b anti-H-2d CTL létrejöttét, HIg-vel való kezelése viszont nem (8. ábra). A két kísérlet egyikében az anti-gp39-kezelés a CTLválaszokat az érintetlen lépsejtekkel megfigyelteknél alacsonyabb szintre csökkentette. Az eredmény a GDHV egérből származó lépsejtek jelenlétét sejteti az anti-gp39-immunpróba elvégzésekor. Ha ezeket a lépsejteket azután 7 napon keresztül tenyésztjük besugárzott P815 sejtek jelenlétében, és utána CTL-meghatározást végzünk, ezek a sejtek nem emelik meg a P815 sejtekre gyakorolt másodlagos stimulációt, holott a normál BDF1 lép megemeli az elsődleges választ. A kezeletlen aGVHD-indukált egerek, ahogyan azt vártuk, megemelik a másodlagos immunválaszt. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy akut GVHD-ben szenvedő egerek kezelése anti-gp39-cel a CD8+ populációt válaszképtelenné teszi a másodlagos kihívásra.
Értékelés
A lépmegnagyobbodás visszafordítása (5. ábra), az lg túltermelés gátlása (6A. és 6B. ábra), a szérum-IgE szintjének és anti-DNS-autoantitest-termelésének gátlása (7A. és 7B. ábra) GVHD-indukált egerekben antigp39-beadás révén azt sugallja, hogy az anti-gp39 blokkolta a beültetett T-sejteknek a gazdaszervezet B-sejt-aktivációját kiváltó képességét. A lépmegnagyobbodásnak és a poliklonális IgGr és IgA-termelődésnek ez a gátlása alacsony marad az antitest beadásának befejezése után 7 napig. Az IgE és anti-DNS-antitest csökkenése 8 hétig fennáll, még akkor is, ha a kezelés befejeződött. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a T-sejt-funkciót vagy a reaktív T-sejtek klonális megsemmisítése befolyásolta, vagy T-sejt-anergia következett be. Korábban már megmutatták [Van den Eertwegh et al., J. Exp. Med. 178, 1555—1565 (1993)], hogy a citokint termelő sejtek szintje normális marad az antitesttel kezelt egerekben az immunizált egerek in situ tanulmányozásánál. Ez azt jelzi, hogy a T-sejtek nem semmisülnek meg a kezelés következtében. Amikor cGVHD egereket analizáltunk donorból származó sejtek jelenlétére, kimutattuk jelenlétüket akár kezeletlen, akár anti-gp39-cel kezelt volt az állat. Az anti-gp39-kezelés tehát rendelkezik e donor T-sejteken válaszképtelen állapot kiváltásának képességével, megakadályozva az antitestválaszok gátlását. Valójában ha ezekből az állatokból származó lépeket viszünk át érintetlen befogadókba, az antitestszintek emelkednek, amenynyiben a donorlépek kezeletlen cGVHD-k, viszont anti-gp39-cel kezelt cGVHD egerek képtelenek emelni egy másodlagos cGVHD állapotot transzfer útján. Ezek az adatok azt sugallják, hogy az anti-gp39 gátolja a T-sejteknek egy erős GVHD klinikai immunpatológia és lépmegnagyobbodás előidézésére irányuló képességét, hogy az antitest beadása válaszképtelenséget vált ki a CD4+ szubpopuláció felszínén.
Beszámoltak már arról, hogy B-sejtek szükségesek a CTL-indukcióhoz nyújtandó segítséghez, ahogyan ez B-sejt-hiányos egerek védő T-sejt-immunitása kiváltásának tanulmányozásánál látható a Friend murénaleukémia-vírus okozta leukémiával szemben [Schultz et al., Science 249 (1990)]. Elképzelhetőnek tűnik tehát, hogy aGVHD egerekben az anti-gp39 gátolja a B-sejtek aktiválását, és így megelőzi az antigénbemutatást és a CD8+ T-sejtek feltöltését. Az is felmerült, hogy CD8+ CTL keletkezéséhez szükség van I. osztályú korlátozott Th-sejtekkel való kölcsönhatásra [von Boehmer et al., J. Exp. Med. 150, 1134 (1979); Keene et al., J. Exp. Med. 755, 768 (1982)], és ha a TCR-affinitás alacsony, szükség van CD4+ közvetítette T-sejt-segítségre in vivő [Gao et al., J. Immunoi. 147, 3268 (1991)].
Tanulmányokat végeztünk a CD28-B7/BB1 kölcsönhatások szerepének megfigyelésére a CD8+ CTL-válaszok kiváltásában. Azt találtuk, hogy a CD28-B7/BB1 kölcsönhatások nélkülözhetetlenek és elegendőek voltak az MHC I-specifikus CTL létrejöttéhez [Harding és Allison, J. Exp. Med. 777, 1791 (1993)]. Felmerült, hogy a CD40 ligandumja esetleg a B7 fontos kiváltója lehet [Ranheim és Kipps, J. Exp. Med. 777, 925 (1993)], ahogyan megmutatják azokban a tanulmányokban, amelyek felölelik a B7 kifejeződésnek CD40-re irányuló antitestekkel történő gátlását normál és leukémiás B-sejteken. Együttvéve, ezek a tanulmányok azt jelzik, hogy anti-gp39 blokkolhatja a CD4+ T-sejtek B-sejtekkel való kölcsönhatását, ezért nem történik meg a B7 kifejeződésének indukciója, amely lehetővé tenné a B-sejtnek, hogy hatékonyan aktiválja a T-sejtet szaporodásra és citokinek termelésére. Összefoglalva, ezek az adatok azt sugallják, hogy CD4+ T-sejtek szükségesek a CTL-képződés elindításához, először T-B-sejtek rokon kölcsönhatásával a gp39 és liganduma, a CD40 között. A B-sejtek felületén levő CD40 jeladása azután lehetővé teszi a B7/BB1 szabályozott keletkezését. A B7/BB1 fordított kölcsönhatása ligandumával, a T-sejt felületén levő CD28-cal lehetővé teszi a fokozott T-sejt-szaporodást és citokintermelést. Ha azonban csak egy szignál jut el a T-sejtekhez, azaz a gp39 kölcsönhatása CD40-nel, és a második jelet nem kapják meg, akkor válaszképtelenség keletkezik a T-sejtekben, és toleránssá vagy anergizálttá válnak.
Ezek a tanulmányok azt jelzik, hogy ha egerekben aGVHD-t váltunk ki, anti-H-2d-választ kapunk. Ha azonban az állatokat anti-gp39-cel kezeljük, akkor nem figyelhető meg CTL-válasz. Nyilvánvaló lehet, hogy az anti-gp39 a korábban leírt módszer szerint gátolja a CTL-képződést [Schultz et al., Science 249, (1990)]. A B-sejtek nem aktiválódnak CD40-ligációval, és ezért képtelenek elősegíteni a CTL-ek képződését. Továbbá tanulmányaink megmutatják, hogy amikor lépsejteket
HU 218 610 Β in vitro P815 sejteknek teszünk ki, azokat a sejteket, amelyek in vivő anti-gp39-nek voltak kitéve, másodlagos anti-H-2d CTL emelésére képtelennek találtuk. Tehát ez azt jelezheti, hogy az anti-gp39 a T-sejt-kompartmenten toleranciát váltott ki, mivel a gp39 nem képes hozzákötődni a CD40-hez, ezért itt nem következik be a B7/BB1 szabályozott keletkezése, így a T-sejtek nem aktiválódnak tovább, és válaszképtelenek maradnak. Az is ismert, hogy a pihenő B-sejtek általában hatástalan stimulátorai az allogén T-sejteknek a kevert limfocitareakcióban, ha előzetesen nem aktiváljuk azokat anti-IgM-antitestekkel, PMA-val vagy LPS-sel [Inaba és Steinman, J. Exp. Med. 169,1717 (1989); Metley et al., J. Exp. Med. 169, 239 (1989); Frohman és Cowing, J. Immunoi. 134, 2269 (1985)]. Ezenkívül B-sejtes bemutatásra irányuló, oldható monomer antigén in vivő specifikus T-sejt-anergiát eredményezhet [Eynon és Parker, J. Exp. Med. 175,131 (1992)]. Ezért az antigén és antigént bemutató sejtek (APC-k) beadását magában foglaló módszer szerint nyilvánvalónak tűnik, hogy anergia vagy tolerancia keletkezhet. Lép CD8+ T-sejtkompartmentekre történő P815 sejtes kihívás közben az antigénbemutatáshoz nincs szükség B-sejtekre, tehát az alloantigén közvetlenül bemutatható és CTL indukálható. A lépek válaszképtelensége a másodlagos stimulációra azt jelzi, hogy allospecifikus tolerancia keletkezett ebben a rendszerben.
Ez ellentétes a korábbi eredményekkel [Foy et al., J. Exp. Med. 178,1567-1575 (1993)], amelyek azt mutatják, hogy tolerancia nem keletkezik az antitest révén antigénspecifikus rendszerben. A két rendszer különbözik egymástól, mivel az aGVHD modell az alloantigént már az antigént bemutató sejtekhez kötve mutatja be, míg ellenben az antigénspecifikus rendszerekben az antigén beadása és in vivő felvétele történik, amelyet professzionális APC-k végeznek és mutatnak be. Úgy tűnik tehát, hogy az anti-gp39-nek különböző hatásai lehetnek az alkalmazott antigéntől és a bemutatás módjától függően.
6. példa anti-gp39-antitestek előállítása és jellemzése
1. kísérlet - humán gp39 ellen irányuló antitestek
Antigénspecifikus T-sejt-tolerancia kialakítására egy humán alanyban előnyös a humán gp39 ellen irányuló antitest beadása. A következő módszertant használtuk egér anti-humán gp39 monoklonális antitestek előállítására. Balb/c egereket immunizáltunk egy oldható gp39 fúziós fehérjével, gp39-CD8-cal, komplett Freund-adjuvánsban (CFA-ban). Az egereket ezt követően 6 héttel oldható gp39-CD8 hatásának tettük ki inkomplett Freund-adjuvánsban (IFA-ban). Oldható gp39-CD8-at adtunk oldható formában 4 héttel a második immunizálás után. Ezután 2 héttel az egereket felerősítettük aktivált humán perifériás vérlimfocitáktal, amelyet újabb 2 hét elteltével oldható gp39CD8-cal történő végső felerősítés követett. A lépsejteket az NS-1 fúziós partnerrel fuzionáltattuk az utolsó immunizálást követő 4. napon standard előírások szerint.
Az anti-humán gp39-antitesteket termelő kiónokat egy összetett screenelőeljárás alapján választottuk ki. A kiónokat először egy lemezes kötődési meghatározással screeneltük gp39-CD8 felhasználásával. A pozitív kiónokat ezután egy kontroll CDS fúziós fehérjével, CD72-CD8-cal szemben screeneltük. Azokat a kiónokat, amelyek pozitív eredményt adtak a CD8-CD72 lemezes kötődési analízisnél, eltávolítottuk. A maradék kiónokat ezután pihenő és 6 órás aktivált humán perifériás vérlimfocitákon (peripherial blood lymphocytes=PBL) screeneltük áramlásos citometriás analízissel. Azokat a hibridómákat, amelyek az aktivált PBLeket megfestették, a pihenőket viszont nem, pozitívnak tekintettük. Végül a maradék kiónoknak a CD40Ig lemezhez kötött gp39-hez való kötődését blokkoló képességét teszteltük.
Körülbelül 300 kiónt screeneltünk először gp39CD8 és CD72-CD8 ellen a lemezes kötődési analízisekben. Ezekből a kiónokból 30-at találtunk, amelyek a lemezhez kötött gp39-et detektálták, és nem a CD8at. Ezeket a kiónokat ezt követően gp39-nek aktivált humán PBL-en történő kimutatására screeneltük. Körülbelül 15 klón mutatott ki molekulát aktivált PBLen, a pihenő sejteken viszont nem. A specificitást később megerősítettük, meghatározva a kiónoknak azt a képességét, hogy blokkolják a lemezhez kötött gp39 CD40Ig kimutatását. 10 klónból 3-ról mutattuk ki, hogy blokkolja a CD40Ig kötődést ennél a meghatározásnál. Ezek a kiónok a 3E4, 2H5 és 2H8 voltak. Ilyen kiónok használatát előnyben részesítjük az itt leírt módszereknél. Azokat a kiónokat, amelyek pozitív tesztet adtak az aktivált PBL-eken, a pihenőkön viszont nem, egy aktivált patkány-T-sejt-klónnal - POMC8-cal - való reaktivitásra screeneltük. A 2H8 klón keresztreakciót adott ezzel a patkánysejtvonallal.
2. kísérlet - humán gp39 ellen irányuló antitestek
Az 1. kísérletben leírtakhoz hasonló immunizációs eljárást alkalmaztunk további, humán gp39 ellen irányuló antitestek előállítására. Balb/c egeret immunizáltunk oldható gp39-CD8-cal CFA-ban, amelyet 4 héttel később 6 órás aktivált humán perifériás vérlimfocitákkal történő kihívás követett. Az egeret ezután oldható gp39-CD8-cal erősítettük fel 4 nappal a lépsejteknek az NS-1 fúziós partnerrel történő fúzióját megelőzően, standard előírások szerint. A hibridómaklónok screenelését 6 órás aktivált humán PBL-ek áramlásos citometriás festésével végeztük el. Kiválogattuk azokat a kiónokat, amelyek az aktivált humán PBL-eket megfestették, a pihenőket viszont nem. Hat kiónt, 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 és 89-79 jelűeket választottunk ki a további analízisekhez.
A kiválasztott antitestek specificitását többféle meghatározással erősítettük meg. Először áramlásos citometriás analízissel megmutattuk, hogy mind a hat mAb megfesti az aktivált perifériás vér-T-sejteket, a pihenőket azonban nem (lásd a 9B. és 9C. ábrát szemléltető példaként, amelyek az aktivált T-sejtek 4D9-8-cal és 4D9-9-cel való festődését mutatják). A mind a hat antitest által felismert molekula kifejeződése kimutatható
HU 218 610 Β az aktiválás 4 óráján belül, maximálisan 6-8 órával az aktiválás után, és nem mutatható ki 24 órával az aktiválás után. Mind a hat mAb felismeri az aktivált CD3+PBL-ek felületén kifejezett molekulát, elsősorban a CD4+ fenotípust, de a CD8+ T-sejtek egy része is kifejezi a molekulát. A hat mAb által felismert molekula kifejeződését gátolja a tápoldatban levő ciklosporin A, úgymint a gp39 kifejeződését (lásd a 8A. és 8B. ábrát szemléltető példaként, amelyek a ciklosporinnal kezelt T-sejtek 4D9-8-cal és 4D9-9-cel való festődését mutatják). E hat mAb által felismert molekula kifejeződésének kinetikája és megoszlása azonos a gp39-ével, ahogyan azt a humán CD40Ig fúziós fehérjével kimutattuk. Ezenfelül mind a hat mAb blokkolja a gp39 CD40Ig-vel való festődését (lásd a 11 A. és 11B. ábrát szemléltető példaként, amelyek a gp39 CD40Ig-vel való festődésének gátlását mutatja 4D9-8 és 4D9-9 jelenlétében). ELISA-meghatározásnál mind a hat mAb felismeri a gp39-CD8-at, a gp39 molekulának egy oldható fúziós formáját. Továbbá immunreakcióban mind a hat mAb kicsapja a 35Smetioninnal jelölt aktivált humán PBL-ből származó, körülbelül 36 kDa molekulát. Az immunreakcióban kicsapott molekula azonos azzal, amelyet a humán CD40Ig fúziós fehérjével csaptunk ki.
A hat kiválasztott mAb (4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76, 89-79) funkciós aktivitását a következők szerint határoztuk meg. Először az mAb-k IL-4gyel és oldható gp39-cel tenyésztett, tisztított humán B-sejtek szaporodását gátló képességét mértük meg. Tisztított humán B-sejteket tenyésztettünk IL-4-gyel és gp39-cel, tisztított monoklonális antitestek vagy CD40Ig - 0-12,5 pg/ml közötti dózisok - jelenlétében vagy a nélkül. 3 nap elteltével meghatároztuk a B-sejtek szaporodását a tenyészetben timidin beépítésével. Az eredmények azt mutatják (10. ábra), hogy mind a hat mAb képes meggátolni a gp39 és IL-4 kiváltotta B-sejt-szaporodást. A 89-76 és 24-31 mAb volt a leghatékonyabb az indukált B-sejt-szaporodás gátlásában. Az IC50 (a B-sejtek szaporodásának 50%-os gátlásához szükséges antitestkoncentráció) 89-76 esetében körülbelül 1 pg/ml és 24-31 esetében körülbelül 1,25 pg/ml volt.
A következőkben az mAb-k B-sejt-differenciálódást gátló képességét vizsgáltuk, ahogyan azt az anti-CD3mal aktivált T-sejtek és IL-2 kiváltotta Ig-termelódésnél mértük. Tisztított IgD+ humán B-sejteket állítottunk elő FACS-sel történő pozitív szelekcióval, ezután anti-CD3-mal aktivált T-sejtekkel (mitomicin C-vel kezelt) és IL-2-vel tenyésztettük 6 napig, tisztított anti-gp39 monoklonális antitestek - 0-10 pg/ml közötti dózisok - jelenlétében vagy a nélkül. Az IgM-, IgGés IgA-termelődést becsültük meg ELISA-val a 6. napon. Az eredmények (3. táblázat) azt mutatják, hogy mind a hat antitest képes gátolni a T-sejt-függő B-sejtdifferenciálódást az IgM-, IgG- és IgA-termelődés mérése alapján. Az IC50 (az Ig-termelés 50%-os gátlásához szükséges antitestkoncentráció) 1,0 pg/ml és 0,1 pg/ml alatti érték között volt mind a hat mAb esetében, beleértve a 24-31 és 89-76 antitesteket.
3. táblázat
| Immunglobulintermelődés | ||||
| mAb | μg/ml | IgM | IgG | /g4 |
| nincs | - | 17 500 | 6710 | 4471 |
| 4D9-8 | 0,1 | 4813 | 2130 | 2819 |
| 1,0 | 4394 | 2558 | 1519 | |
| 10,0 | 1081 | 389 | 396 | |
| 4D9 9 | 0,1 | 3594 | 919 | 1731 |
| 1,0 | 2659 | 1233 | 1606 | |
| 10,0 | 374 | 448 | 266 | |
| 24-31 | 0,1 | 3863 | 981 | 344 |
| 1,0 | 1287 | 314 | 165 | |
| 10,0 | 1120 | 596 | 23 | |
| 24-43 | 0,1 | 6227 | 4132 | 432 |
| 1,0 | 3193 | 2130 | 192 | |
| 10,0 | 7021 | 1232 | 1081 | |
| 89-76 | 0,1 | 3783 | 1069 | 344 |
| 1,0 | 2180 | 352 | 171 | |
| 10,0 | 818 | 551 | 19 | |
| 89-79 | 0,1 | 9763 | 1924 | 3021 |
| 1,0 | 2314 | 460 | 156 | |
| 10,0 | 183 | 135 | 434 |
Az anti-gp39 mAb-k T-sejt-válaszokra gyakorolt hatásának vizsgálatára az mAb-ket standard kevert limfocitareakciókba (mixed lymphocyte reactions = MLR) vittük be. 300 000 humán perifériás vérlimfocitát (válaszadók=responders=R) tenyésztettünk 100 000 besugárzott, allogén perifériás vérlimfocitával (stimulátorok=stimulators=S) anti-gp39 mAb jelenlétében (10 pg/ml) vagy a nélkül. A tenyészeteket 3H-timidinnel pulzáltattuk a 4., 5. és 6. napon, majd 18 órával később kinyertük a sejteket. Mind a hat antihumán gp39 mAb gátolta az allospecifikus válaszokat az MLR-mérés alapján (lásd a 13. ábrát szemléltető példaként, amely az allospecifikus válaszok gátlását mutatja, ha R- és S-sejteket 24-31 vagy 89-76 jelenlétében inkubáljuk; CTLA4 immunglobulin fúziós fehérjét és anti-CD28 mAb-t használtunk pozitív kontrollként).
Annak meghatározására, vajon a hat mAb felismeri-e a humán gp39-molekula felületén levő különböző epitópokat, keresztblokkoló kísérleteket végeztünk. Először aktivált humán PBL-eket blokkoltunk a hat mAb mindegyikével (25 pg/ml nem konjugált antitesttel). A sejteket mostuk, azután megfestettük 10 pg/ml biotinnal konjugált antitesttel, amelyet fitoeritrinnel (phytoerythrin=PE) konjugált avidinnel (PE-Av) történő reakció követett. A sejtek PE-Av-vel való festődését FACS-sel analizáltuk. Az eredményeket a 4. táblázatban mutatjuk be.
HU 218 610 Β
4. táblázat
| Blokkolás | Szinezőantitest | |||||
| mAb | 4D9-8 | 4D9-9 | 24-31 | 24-43 | 89-76 | 89-79 |
| nincs | + + + | + + + | + + + + | + + + + | + + + + | + + + + |
| 4D9-8 | ND | - | + + + + | Ψ + + + | + + + | + + + |
| 4D9-9 | + + + | ND | + + + | + + + + | + + + | + + + |
| 24-31 | + | 4- | ND | + + + | + + | + + |
| 24-43 | + | + | + + + | ND | + + | + |
| 89-76 | + | + | + + + | + + + | ND | + + + |
| 89-79 | + | + + | + + + | + + + | + + + | ND |
A megfestődés intenzitását és a pozitív sejtek százalékát a + jelzés mutatja (+ + + +=MI>200; + + + =MI>125; + + =MI>50; +=MI>25; -=a háttérhez képest nem festődön meg; ND=nincs meghatározás.
Minden antitest blokkolta a CD40Ig aktivált humán PBL-ekhez történő kötődését. A 2. táblázatban bemutatott adatok azonban egyértelműen megmutatják néhány antitest hibáját más antitesteknek az aktivált humán PBL-ekhez való kötődése blokkolásában, azt sugallva, hogy felismerik a humán gp39-molekula felületén levő különböző epitópokat.
A 89-76 és 24-31 hibridómákat, amelyek a 89-76 és 24-31 antitesteket termelik, a Budapesti Szerződés és az American Type Culture Collection, Parklawn Drive, Rockville, Md., rendelkezései alapján letétbe helyeztük 1994. szeptember 2-án. A 89-76 hibridómát az ATCC-beszerzési számmal és a 24-31 hibridómát az ATCC-beszerzési számmal jelöltük meg.
3. kísérlet - egér-gp39 ellen irányuló antitestek
A találmány egy megvalósítási módjában a gp39antagonista egy anti-egér gp39 monoklonális antitest, az MR1. Az MR1 monoklonális antitest előállítására a következő módszert alkalmaztuk, és ez használható más, a gp39 ellen irányuló antitestek létrehozására.
Hörcsögöket immunizáltunk intraperitoneálisan 5 χ 106 aktivált Thl-sejttel (dl.6) 1 hetes intervallumokban 6 héten keresztül. Amikor a muréna-Thl-gyel szembeni szérumtiter magasabb volt, mint körülbelül 1:10 000, sejtfúziókat végeztünk polietilénglikollal immunhörcsöglépsejteket és NS-l-et alkalmazva. A szaporodó hibridómák felülúszóját screeneltük áramlásos citometriával pihenő és aktivált Thl-sejteken. Egy különleges hibridómát, amely az aktivált Th-t szelektíven felismerő mAb-t termelt, tovább teszteltük és szubklónoztuk, hogy MRl-et kapjunk. MRl-et állítottunk elő a hasüregi folyadékban, és ioncserélő HPLC-vel tisztítottuk. Az American Type Culture Collection gyűjteménynél hibridóma MRl-et helyeztünk letétbe, amelyet a HB11048 beszerzési számmal jelöltünk.
Megfelelések
A szakmában mindennapos gyakorlat felismer vagy képes kideríteni - nem több mint rutinkísérletek alkalmazásával - az itt leírt találmány specifikus megvalósítási módjainak sok megfelelőjét. Ilyen megfelelőket szándékoznak felölelni a következő igénypontok. Minden e bejelentés során hivatkozott referencia és közzétett szabadalmi bejelentés tartalmát ezennel beépítettük referenciaként.
Claims (23)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás antigénspecifikus T-sejt-tolerancia kiváltására szolgáló gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagkénta) a T-sejt számára antigént bemutató sejtet, amely a sejtfelszínen olyan ligandummal rendelkezik, amely kölcsönhatásba lép a T-sejt felületén levő, érintkezésfüggő segítő effektorfünkciót közvetítő receptorral, ésb) a T-sejt felületén található receptor antagonistáját, amely gátolja a ligandum kölcsönhatását a receptorral, alkalmazzuk.
- 2. Eljárás antigénspecifikus T-sejt-tolerancia kiváltására szolgáló gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagkénta) a T-sejt számára antigént bemutató sejtet, amely olyan ligandummal rendelkezik, amely kölcsönhatásba lép a T-sejt felületén levő, érintkezésfüggő segítő effektorfünkciót közvetítő receptorral,b) egy antigént, amely össze van kapcsolva a T-sejt számára antigént bemutató sejttel, ésc) a T-sejt felületén található receptor antagonistáját, amely gátolja a ligandum kölcsönhatását a receptorral, alkalmazzuk.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a T-sejt felületén levő, érintkezésfüggő effektorfünkciót közvetítő receptorként gp39-et alkalmazunk.
- 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antagonista anti-gp39-antitestet alkalmazzuk.
- 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az anti-gp39-antitest anti-humán gp39-antitestet alkalmazzuk.
- 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az anti-gp39-antitest monoklonális antitestet alkalmazzuk.
- 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az anti-gp39-antitest 24-31 monoklonális antitestet (ATCC-beszerzési száma HB 11712) alkalmazzuk.
- 8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az anti-gp39-antitest 89-76 monoklonális antitestet (ATCC-beszerzési száma HB 11713) alkalmazzuk.HU 218 610 Β
- 9. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az anti-gp39-antitest kiméra monoklonális antitestet alkalmazzuk.
- 10. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az anti-gp39-antitest humanizált monoklonális antitestet alkalmazzuk.
- 11. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antagonistaként a CD40 oldható formáját alkalmazzuk.
- 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez- 10 ve, hogy a CD40 oldható formájaként fúziós fehérjét alkalmazunk.
- 13. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy limfoid sejtet alkalmazunk.
- 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez- 15 ve, hogy a limfoid B-sejtet alkalmazzuk.
- 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy B-sejtként pihenő B-sejtet alkalmazunk.
- 16. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy allogén B-sejtet alkalmazunk.
- 17. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a B-sejtet érintkeztetjük az antigénnel, mielőtt5 azt a T-sejttel érintkeztetnénk.
- 18. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a perifériás vérben jelen levő sejtet alkalmazunk.
- 19. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy allogén csontvelőben jelen levő sejtet alkalmazunk.
- 20. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy fehérjeantigént alkalmazunk.
- 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy autoantigén fehérjét alkalmazunk.
- 22. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy alloantigén fehérjét alkalmazunk.
- 23. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy allergén fehérjét alkalmazunk.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11625593A | 1993-09-02 | 1993-09-02 | |
| US08/232,929 US5869049A (en) | 1993-09-02 | 1994-04-25 | Methods of inducing T cell unresponsiveness to bone marrow with gp39 antagonists |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9600522D0 HU9600522D0 (en) | 1996-04-29 |
| HUT74250A HUT74250A (en) | 1996-11-28 |
| HU218610B true HU218610B (hu) | 2000-10-28 |
Family
ID=26814047
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9600521A HU220296B (hu) | 1993-09-02 | 1994-09-02 | Monoklonális antitestek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények |
| HU9700522A HU218610B (hu) | 1993-09-02 | 1994-09-02 | Eljárás antigén-specifikus T-sejt toleranciát kiváltó gyógyszerkészítmények előállítására |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9600521A HU220296B (hu) | 1993-09-02 | 1994-09-02 | Monoklonális antitestek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US5747037A (hu) |
| EP (2) | EP0721469B1 (hu) |
| JP (3) | JP3007977B2 (hu) |
| CN (2) | CN1127351C (hu) |
| AT (2) | ATE188487T1 (hu) |
| AU (2) | AU696235B2 (hu) |
| DE (2) | DE69422523T2 (hu) |
| DK (2) | DK0721469T3 (hu) |
| ES (2) | ES2120067T3 (hu) |
| FI (2) | FI105528B (hu) |
| GR (2) | GR3027658T3 (hu) |
| HU (2) | HU220296B (hu) |
| IL (1) | IL110855A (hu) |
| NO (2) | NO321036B1 (hu) |
| NZ (3) | NZ549136A (hu) |
| PT (1) | PT721469E (hu) |
| WO (2) | WO1995006481A1 (hu) |
Families Citing this family (81)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5962406A (en) * | 1991-10-25 | 1999-10-05 | Immunex Corporation | Recombinant soluble CD40 ligand polypeptide and pharmaceutical composition containing the same |
| US5474771A (en) * | 1991-11-15 | 1995-12-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same |
| US7070777B1 (en) | 1991-11-15 | 2006-07-04 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for inhibiting inflammation with an antibody that binds the 5C8 protein |
| WO1995006481A1 (en) * | 1993-09-02 | 1995-03-09 | Trustees Of Dartmouth College | Methods for inducing antigen-specific t cell tolerance |
| US5683693A (en) * | 1994-04-25 | 1997-11-04 | Trustees Of Dartmouth College | Method for inducing T cell unresponsiveness to a tissue or organ graft with anti-CD40 ligand antibody or soluble CD40 |
| US5876950A (en) * | 1995-01-26 | 1999-03-02 | Bristol-Myers Squibb Company | Monoclonal antibodies specific for different epitopes of human GP39 and methods for their use in diagnosis and therapy |
| JPH08239324A (ja) * | 1995-03-03 | 1996-09-17 | Fusanori Hamashima | 免疫抑制剤 |
| US7175847B1 (en) | 1995-06-07 | 2007-02-13 | Biogen Idec Inc. | Treating intestinal inflammation with anti-CD80 antibodies that do not inhibit CD80 binding to CTLA-4 |
| US6113898A (en) | 1995-06-07 | 2000-09-05 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Human B7.1-specific primatized antibodies and transfectomas expressing said antibodies |
| US5833987A (en) * | 1995-06-07 | 1998-11-10 | Trustees Of Dartmouth College | Treatment of T cell mediated autoimmune disorders |
| US7153508B2 (en) | 1995-06-07 | 2006-12-26 | Biogen Idec Inc. | Treatment of B cell lymphoma using anti-CD80 antibodies that do not inhibit the binding of CD80 to CTLA-4 |
| US6001358A (en) | 1995-11-07 | 1999-12-14 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof |
| US6440418B1 (en) | 1995-11-07 | 2002-08-27 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Methods of treating autoimmune diseases with gp39-specific antibodies |
| US6340459B1 (en) | 1995-12-01 | 2002-01-22 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Therapeutic applications for the anti-T-BAM (CD40-L) monoclonal antibody 5C8 in the treatment of reperfusion injury in non-transplant recipients |
| EP0892643B2 (en) * | 1996-03-20 | 2009-09-02 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for inhibiting an immune response by blocking the gp39/cd40 and ctla4/cd28/b7 pathways and compositions for use therewith |
| DE19634159C1 (de) * | 1996-08-23 | 1997-09-25 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Induktion einer Tumorimmunität durch Injektion von Hybridzellen |
| WO1998008541A1 (en) * | 1996-08-30 | 1998-03-05 | Genzyme Corporation | Inhibition of primary and/or secondary immune response to repeat adenoviral vector administration using cd40l specific antibodies |
| DE69837322T2 (de) * | 1997-01-10 | 2007-11-22 | Biogen Idec Ma Inc., Cambridge | Verfahren zur therapeutischen verabreichung von anti-cd40l-mitteln |
| US6428782B1 (en) * | 1997-05-23 | 2002-08-06 | Hadasit Medical Research Services And Development Ltd. | Non-myeloablative tolerogenic treatment |
| AU780031B2 (en) | 1998-12-14 | 2005-02-24 | Genetics Institute, Llc | Cytokine receptor chain |
| US7553487B2 (en) * | 1998-12-14 | 2009-06-30 | Genetics Institute, Llc | Method and compositions for treating asthma |
| AU2845400A (en) * | 1998-12-24 | 2000-07-31 | Phairson Medical Inc. | Treatment and prevention of immune rejection reactions |
| EP1101495A4 (en) * | 1999-06-01 | 2003-05-07 | Eisai Co Ltd | PREVENTIVE AGENTS AGAINST IDIOPATHIC THROMOBOCYTOPENIC PURPURA |
| AU5641100A (en) * | 1999-06-29 | 2001-01-31 | University Of Massachusetts | Methods for inducing t cell non-responsiveness to a tissue or organ graft |
| US20020028178A1 (en) * | 2000-07-12 | 2002-03-07 | Nabil Hanna | Treatment of B cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications |
| EP1262194A4 (en) * | 2000-03-06 | 2003-05-07 | Eisai Co Ltd | HEALING AND PREVENTIVE AGENTS FOR THE ANTIPHOSPHOLIPID-ANTIBODY SYNDROME |
| WO2001079555A2 (en) | 2000-04-14 | 2001-10-25 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Roles of jak/stat family members in tolerance induction |
| AU5914201A (en) * | 2000-04-25 | 2001-11-07 | Idec Pharma Corp | Intrathecal administration of rituximab for treatment of central nervous system lymphomas |
| BR0110779A (pt) | 2000-05-12 | 2005-01-11 | Beth Israel Hospital | Composições e métodos para adquirir supressão imunológica |
| CA2410188A1 (en) * | 2000-06-06 | 2001-12-13 | Idec Pharmaceutical Corporation | Non-agonistic antibodies to human gp39, compositions containing, and therapeutic use thereof |
| TWI322153B (en) | 2000-07-03 | 2010-03-21 | Bristol Myers Squibb Co | Methods for treating rheumatic diseases using a soluble ctla4 molecule |
| US20040022787A1 (en) | 2000-07-03 | 2004-02-05 | Robert Cohen | Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID |
| AU2002220165A1 (en) * | 2000-11-14 | 2002-05-27 | The University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Non-lethal methods for conditioning a recipient for bone marrow transplantation |
| US7754208B2 (en) | 2001-01-17 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
| US20030133939A1 (en) * | 2001-01-17 | 2003-07-17 | Genecraft, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
| US7829084B2 (en) * | 2001-01-17 | 2010-11-09 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding constructs and methods for use thereof |
| US20070065436A1 (en) * | 2001-01-31 | 2007-03-22 | Biogen Idec Inc. | Anti-cd80 antibody having adcc activity for adcc mediated killing of b cell lymphoma cells alone or in combination with other therapies |
| US20030211107A1 (en) * | 2002-01-31 | 2003-11-13 | Kandasamy Hariharan | Use of CD23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders |
| US20020159996A1 (en) * | 2001-01-31 | 2002-10-31 | Kandasamy Hariharan | Use of CD23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders |
| US20030103971A1 (en) * | 2001-11-09 | 2003-06-05 | Kandasamy Hariharan | Immunoregulatory antibodies and uses thereof |
| US20040058445A1 (en) * | 2001-04-26 | 2004-03-25 | Ledbetter Jeffrey Alan | Activation of tumor-reactive lymphocytes via antibodies or genes recognizing CD3 or 4-1BB |
| PL204899B1 (pl) | 2001-05-23 | 2010-02-26 | Bristol Myers Squibb Co | Zastosowanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4 |
| WO2004003019A2 (en) * | 2002-06-28 | 2004-01-08 | Domantis Limited | Immunoglobin single variant antigen-binding domains and dual-specific constructs |
| EP2075256A2 (en) | 2002-01-14 | 2009-07-01 | William Herman | Multispecific binding molecules |
| US20030180292A1 (en) * | 2002-03-14 | 2003-09-25 | Idec Pharmaceuticals | Treatment of B cell malignancies using anti-CD40L antibodies in combination with anti-CD20 antibodies and/or chemotherapeutics and radiotherapy |
| US20030219436A1 (en) * | 2002-03-15 | 2003-11-27 | Ledbetter Jeffrey A. | Compositions and methods to regulate an immune response using CD83 gene expressed in tumors and using soluble CD83-Ig fusion protein |
| AU2003220820A1 (en) * | 2002-04-03 | 2003-10-27 | Eisai Co., Ltd. | Remedies for pemphigus containing cd40l antagonist as the active ingredient |
| CN1326878C (zh) * | 2003-04-29 | 2007-07-18 | 中国抗体制药有限公司 | 抗人非何杰金淋巴瘤嵌合抗体及其衍生物与应用 |
| AU2011224032B2 (en) * | 2003-06-13 | 2013-01-31 | Biogen Ma Inc. | Aglycosyl Anti-CD154 (CD40 Ligand) Antibodies and Uses Thereof |
| AU2004253868B2 (en) * | 2003-06-13 | 2011-06-16 | Biogen Ma Inc. | Aglycosyl anti-CD154 (CD40 ligand) antibodies and uses thereof |
| US7754209B2 (en) | 2003-07-26 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals | Binding constructs and methods for use thereof |
| SG10201900535UA (en) * | 2003-12-23 | 2019-02-27 | Genentech Inc | Novel anti-il 13 antibodies and uses thereof |
| US20090098142A1 (en) * | 2004-06-09 | 2009-04-16 | Kasaian Marion T | Methods and compositions for treating and monitoring treatment of IL-13-associated disorders |
| AR049390A1 (es) * | 2004-06-09 | 2006-07-26 | Wyeth Corp | Anticuerpos contra la interleuquina-13 humana y usos de los mismos |
| US7501121B2 (en) * | 2004-06-17 | 2009-03-10 | Wyeth | IL-13 binding agents |
| WO2006033702A2 (en) | 2004-07-26 | 2006-03-30 | Biogen Idec Ma Inc. | Anti-cd154 antibodies |
| US7563443B2 (en) * | 2004-09-17 | 2009-07-21 | Domantis Limited | Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof |
| EP1851308B1 (en) * | 2005-02-02 | 2013-08-21 | NewSouth Innovations Pty Limited | Cd4+ cd25+ t-cells activated to a specific antigen |
| CN100423775C (zh) * | 2005-04-15 | 2008-10-08 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 牛衣原体病灭活疫苗及其制备与检验方法 |
| JP5421590B2 (ja) | 2005-05-18 | 2014-02-19 | ノバルティス アーゲー | 自己免疫および／または炎症性成分を有する疾患の診断および治療のための方法 |
| SI1912675T1 (sl) * | 2005-07-25 | 2014-07-31 | Emergent Product Development Seattle, Llc | zmanjšanje števila celic B z uporabo molekul, ki se specifično vežejo na CD37 in CD20 |
| CA2646329C (en) * | 2006-03-20 | 2018-07-03 | The Regents Of The University Of California | Engineered anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting |
| MX363905B (es) * | 2006-06-12 | 2019-04-08 | Aptevo Res & Development Llc | Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora. |
| US8569059B2 (en) | 2006-08-02 | 2013-10-29 | Newsouth Innovations Pty Limited | Method of identifying CD4+ CD25+ T-cells activated to an antigen which express CD8 |
| TW200848429A (en) * | 2007-04-23 | 2008-12-16 | Wyeth Corp | Methods and compositions for treating and monitoring treatment of IL-13-associated disorders |
| EP2197491A4 (en) | 2007-09-04 | 2011-01-12 | Univ California | HIGHAFFINE ANTI-PROSTATE STEM CELL ANTIGEN (PSCA) ANTIBODIES TO CANCER AND TO THE DETECTION OF CANCER |
| EP2052848A1 (de) | 2007-10-27 | 2009-04-29 | Joint Solar Silicon GmbH & Co. KG | Aufbereitung von Formlingen aus Reinstsilizium |
| EP2132228B1 (en) | 2008-04-11 | 2011-06-22 | Emergent Product Development Seattle, LLC | Cd37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof |
| AU2010222928B2 (en) * | 2008-07-16 | 2012-11-29 | Baylor Research Institute | Antigen presenting cell targeted vaccines |
| US20100069616A1 (en) * | 2008-08-06 | 2010-03-18 | The Regents Of The University Of California | Engineered antibody-nanoparticle conjugates |
| WO2010093467A1 (en) | 2009-02-10 | 2010-08-19 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for inducing transplantation tolerance |
| WO2013013708A1 (en) | 2011-07-26 | 2013-01-31 | Fundació Institut D'investigació Biomèdica De Bellvitge | Treatment of acute rejection in renal transplant |
| RU2016107435A (ru) | 2013-09-13 | 2017-10-18 | Дженентек, Инк. | Композиции и способы обнаружения и количественного определения белка клеток-хозяев в клеточных линиях и рекомбинантные полипептидные продукты |
| WO2015038888A1 (en) | 2013-09-13 | 2015-03-19 | Genentech, Inc. | Methods and compositions comprising purified recombinant polypeptides |
| MA41459A (fr) | 2015-02-03 | 2017-12-12 | Als Therapy Development Inst | Anticorps anti-cd40l et méthodes pour traiter des maladies ou des troubles liés aux cd40l |
| MX2018000548A (es) | 2015-07-14 | 2018-09-26 | Immunext Inc | Anticuerpo anti-cd154 con características de unión, funcionalidad y seguridad mejoradas y uso en inmunoterapia humana. |
| MY188405A (en) | 2015-08-05 | 2021-12-08 | Janssen Biotech Inc | Anti-cd154 antibodies and methods of using them |
| WO2017053469A2 (en) | 2015-09-21 | 2017-03-30 | Aptevo Research And Development Llc | Cd3 binding polypeptides |
| CA2946465C (en) | 2015-11-12 | 2022-03-29 | Delta Faucet Company | Ozone generator for a faucet |
| WO2018217918A2 (en) | 2017-05-24 | 2018-11-29 | Als Therapy Development Institute | Therapeutic anti-cd40 ligand antibodies |
| KR102142499B1 (ko) * | 2019-09-11 | 2020-08-10 | 재단법인 오송첨단의료산업진흥재단 | Ykl-40 표적 인간 단일클론항체 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5645820A (en) * | 1987-06-24 | 1997-07-08 | Autoimmune, Inc. | Treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens |
| US5690933A (en) * | 1989-05-31 | 1997-11-25 | Glaxo Wellcome Inc. | Monoclonal antibodies for inducing tolerance |
| JP3308534B2 (ja) * | 1991-10-25 | 2002-07-29 | イミュネックス・コーポレーション | 新規なサイトカイン |
| US5962406A (en) * | 1991-10-25 | 1999-10-05 | Immunex Corporation | Recombinant soluble CD40 ligand polypeptide and pharmaceutical composition containing the same |
| US5474771A (en) * | 1991-11-15 | 1995-12-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same |
| CA2089229C (en) * | 1992-02-14 | 2010-04-13 | Alejandro A. Aruffo | Cd40cr receptor and ligands therefor |
| AU5098493A (en) * | 1992-08-21 | 1994-03-15 | Schering Corporation | Cd40 ligand, anti cd40 antibodies, and soluble cd40 |
| US5540926A (en) * | 1992-09-04 | 1996-07-30 | Bristol-Myers Squibb Company | Soluble and its use in B cell stimulation |
| US5597563A (en) * | 1992-09-04 | 1997-01-28 | Beschorner; William E. | Method induction of antigen-specific immune tolerance |
| WO1995006481A1 (en) * | 1993-09-02 | 1995-03-09 | Trustees Of Dartmouth College | Methods for inducing antigen-specific t cell tolerance |
| ZA946765B (en) * | 1993-09-02 | 1996-02-15 | Dartmouth College | Methods of prolonged suppression of humoral immunity |
| US5683693A (en) * | 1994-04-25 | 1997-11-04 | Trustees Of Dartmouth College | Method for inducing T cell unresponsiveness to a tissue or organ graft with anti-CD40 ligand antibody or soluble CD40 |
-
1994
- 1994-09-02 WO PCT/US1994/009953 patent/WO1995006481A1/en active IP Right Grant
- 1994-09-02 CN CN94194007A patent/CN1127351C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-02 AU AU76429/94A patent/AU696235B2/en not_active Ceased
- 1994-09-02 AT AT94926659T patent/ATE188487T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 DK DK94926659T patent/DK0721469T3/da active
- 1994-09-02 DE DE69422523T patent/DE69422523T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-02 IL IL11085594A patent/IL110855A/xx not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 HU HU9600521A patent/HU220296B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 ES ES94926677T patent/ES2120067T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-02 CN CNB941939189A patent/CN100341896C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-02 HU HU9700522A patent/HU218610B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 NZ NZ549136A patent/NZ549136A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 JP JP7508291A patent/JP3007977B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-02 PT PT94926659T patent/PT721469E/pt unknown
- 1994-09-02 JP JP7508265A patent/JP2991499B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-02 NZ NZ273221A patent/NZ273221A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 EP EP94926659A patent/EP0721469B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-02 ES ES94926659T patent/ES2143553T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-02 EP EP94926677A patent/EP0721346B1/en not_active Revoked
- 1994-09-02 WO PCT/US1994/009871 patent/WO1995006666A1/en active IP Right Grant
- 1994-09-02 NZ NZ273207A patent/NZ273207A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 DK DK94926677T patent/DK0721346T3/da active
- 1994-09-02 AT AT94926677T patent/ATE167062T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 DE DE69411025T patent/DE69411025T2/de not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-06-07 US US08/475,847 patent/US5747037A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-03-01 FI FI960980A patent/FI105528B/fi active
- 1996-03-01 NO NO19960862A patent/NO321036B1/no not_active IP Right Cessation
- 1996-03-01 FI FI960978A patent/FI106306B/fi active
- 1996-03-01 NO NO19960861A patent/NO321098B1/no not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-08-21 AU AU35183/97A patent/AU707110B2/en not_active Ceased
-
1998
- 1998-03-27 US US09/049,043 patent/US5876718A/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-30 US US09/069,871 patent/US6312692B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-14 GR GR980401834T patent/GR3027658T3/el unknown
- 1998-10-01 US US09/164,568 patent/US7722874B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-10-12 JP JP10289353A patent/JP3098739B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-03-29 GR GR20000400784T patent/GR3033095T3/el not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-04-17 US US11/405,876 patent/US20060222649A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6312692B1 (en) | Method of treating graft-versus-host disease with anti-GP39 antibodies and bone marrow cells | |
| KR100337078B1 (ko) | 항-gp39항체및이것의사용방법 | |
| ES2237757T3 (es) | Metodos para inducir la tolerancia de celulas t a un injerto de tejido u organo. | |
| AU678532C (en) | Methods for inducing antigen-specific T cell tolerance | |
| HU220192B (hu) | Gyógyszerkészítmények a humorális immunitás gátlására | |
| MXPA96005051A (en) | Methods to induce tolerance to t cells for a tissue grafting uórg |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |