NO321036B1 - Anti-humant GP39 monoklonalt antistoff, hybridom eller cellelinje, samt farmasoytisk sammensetning. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører anti-humant gp39 monoklonalt antistoff, hybridom eller cellelinje, samt farmasøytisk sammensetning.

Bakgrunn for oppfinnelsen

For å indusere antigenspesifikk aktivering av T-celle lymfocytter og klonal ekspansjon av den aktiverte celle må to signaler, som blir fremskaffet av antigenpresenterende celler (APC), bli levert til overflaten av hvilende T-celler (Jenkins, M. and Schwartz, R. (1987) J. Exp. Med. 165, 302-319; Mueller, D.L et al., (1990) J. Immunol. 144, 3701-3709; Williams I.R. and Unanue E.R. (1990) J. Immunol. 145, 85-93). Det første signalet, som gir spesifisitet til immunresponsen, blir overført via T-celle-reseptoren (TCR) etter at et fremmed antigent peptid blir presentert i sammenheng med "det største vevsforlikelighetskomplekset" ("major histocompatibility complex, MHC). Det andre signalet, som kalles samstimulering, induserer T-cellene til å proliferere og å bli funksjonelt aktive (Schwartz R.H. (1990) Science 248, 1349-1356). Samstimulering er hverken antigenspesifikk eller MHC-begrenset, og antas å stamme fra et eller flere distinkte molekyler på overflaten til antigenpresenterende celler (APCer) (Jenkins, M.K. et al. (1988) J. Immunol. 140, 3324-3330; Linsley, P.S. et al. (1991) J.Exp. Med. 173, 721-730; Gimmi, CD. et al. (1991) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88, 6575-6579; Young, J.W. et al. (1992) J. Clin. Invest. 90, 229-237; Koulova, L. et al. (1991) J. Exp. Med. 173, 759-762; Reiser, H. et al. (1992) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89, 271-275; van-Seventer, G.A. et al. (1990) J. Immunol. 144, 4579-4586; LaSalle, J.M. et al. (1991) J.lmmunol. 147, 774-780; Dustin, M.l. et al. (1989) J. Exp. Med. 169, 503; Armitage, R. J. et al. (1992) Nature 357, 80-82; Liu, Y. et al. (1992) J. Exp. Med. 175, 437-445). En samstimulerende mekanisme som er innblandet i T-celleaktivering omfatter molekylet CD28 på overflaten av T-celler. Dette molekyl kan motta et samstimulerende signal som blir levert av en ligand på B-celler eller andre APCer. Ligander for CD28 inkluderer

medlemmer av B7 familien av B-lymfo-cytt aktiveringsantigener, slik som B7-1 og/eller B7-2 (Freedman, A.S. ét al. (1987) J. Immunol. 137, 3260-3267; Freeman, G.J. et al.

(1989) J.lmmunol. 143, 2714-2722; Freeman, G.J. et al. (1991) J. Exp. Med. 174, 625-631; Freeman, G.FJ. et al. (1993) Science 262, 909-911; Azuma, M. et al. (1993) Nature 366, 76-79; Freeman, G.J. et al. (1993) J. Exp. Med.. 178, 2185-2192). B7-1 and B7-2 er også ligander for et annet molekyl som kalles CTLA4, som er tilstede på overflaten til aktiverte T-celler, selv om rollen CTLA4 spiller i samstimulering er uklar.

Levering av et antigenspesifikt signal sammen med et samstimulerende signal til en T-celle fører til aktivering av T-cellen. Dette kan utgjøre både T-celle proliferasjon og frisetning av cytokiner. I motsetning til dette antas at levering av et antigenspesifikt signal til en T-celle uten noe samstimulerende signal vil indusere en tilstand av manglende respons eller "anergi" i T-cellen, noe som derved induserer antigenspesifikk toleranse i T-cellen.

Interaksjoner mellom T- og B-celler spiller en sentral rolle i immunresponser. Induksjon av humoral immunitet mot thymus- (brissel-)avhengige antigener krever "hjelp" fra T-hjelper (heretter benevnt Th)-celler. Mens en del av hjelpen som gies til B-lymfocytter overføres via løselige molekyler som frigjøres fra Th-celler (for eks. lymfokiner som IL-4 og IL-5), krever aktivering av B-celler også en kontakt-avhengig interaksjon mellom B-celler og Th-celler (Hirata et al., J. Immunol. 140, 3736-3744 (1988); Bartlett et al., J. Immunol. 143:1745-1754 (1989)). Dette antyder at B-celleaktivering involverer en obligatorisk interaksjon mellom celleoverflatemolekyler på B-celler og Th-celler. Molekylet (mole-kylene) på T-cellen medierer derfor T-cellens kontaktavhengige hjelper-effektor funksjon. Videre blir en kontaktavhengig interaksjon mellom molekyler på B-celler og T-celler støttet av observasjonen at isolerte plasmamembraner fra aktiverte T-celler kan gi hjelpefunksjoner som er nødvendige for B-celleaktivering (Brian, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 85, 564-568 (1988); Hodgkin et al. J. Immunol. 145, 2025-2034 (1990); Noelle et

al. J. Immunol. 146, 1118-1124(1991)).

Et molekyl benevnt CD40, som har blitt funnet på overflaten til umodne og modne B-lymfocytter, induserer proliferasjon av

B-celler når det krysskobles med antistoff (Valle et al., Eur.

J. Immunol. 19,1463-1467 (1989); Gordon et al., J. Immunol. 140, 1425-1430 (1988); Gruber et al., J. Immunol. 142, 4144-4152 (1989)). CD40 har blitt molekylært klonet og karakterisert (Stamenkovic et al., EMBO J. 8, 1403-1410 (1989)). En ligand til CP40, gp39 (også kalt CD40-ligand eller CD40L) har også blitt molekylært klonet og karakterisert (Armitage et al., Nature 357, 80-82,1992), Lederman et al., J. Exp. Med. 175,1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J. 11, 4313-4319 (1992)). Gp39 proteinet blir produsert på overflaten av aktiverte, men ikke hvilende CD4+ Th-celler

(Spriggs et al., J. Exp. Med. 176,1543-1540 (1992); Lane et al., Eur. J. Immunol. 22, 2573-2578 (1992); Roy et al., J. Immunol. 151,1-14 (1993)). Celler som har fått genet for gp39 overført (transfektert) og som uttrykker gp39 proteinet på overflaten kan initiere B-celle proliferasjon og kan, sammen med andre stimulerende signaler, indusere produksjon av antistoff (Armitage et al., Nature, 357, 80-82 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J. 11, 4313-4319 (1992)).

Lederman beskriver i J. Exp. Med (1992) på sidene 1091 til 1101 identifikasjonen av et overflateprotein p å aktiverte CD4* T celler som induser er kontakt-avhengig B celle differensiering og et monoklonalt antistoff betegnet 5c8 som hemmer évnen til fikserte, aktiverte CD4<+> celler til å indusere B celle overflate CD23 ekspresjon og leder B celle differensiering drevet av kermesbær mitogen. Lederman beskriver videre rollene til T celle-B celle aktiverende 5c8 antigen og CD40 i kontakt-avhengig hjelp i J. Immunulogy ;(1992), sidene 3817 til 3826. Marshall et al. beskriver i J. Clin. Immunulogy (1993) på sidene 165 til 174 det molekulære grunnlaget for T celle hjelp i humoral immunitet og oversiktsarbeidet av CD40 og dets ligand, gp39. Noelle diskuterer i Immunology Today ;(1992), på sidene 431 til 433 rollen til CD40 og dets ligand som et essensielt ligand-reseptor par for thymus-avhengig B celle aktivering. ;Sammenfatning av oppfinnelsen ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et anti-humant gp39 monoklonalt antistoff eller fragment derav som omfatter det monoklonale antistoffet tilveiebrakt av hybridom 24-31 (ATCC HB 11712) eller innehar den samme epitopiske bindingsspesifisiteten og omtrent den samme bindingsaffiniteten til gp39 som det monoklonale antistoffet gitt av hybridom 24-31 (ATCC HB 11712). ;Celleoverflatemolekyler som medierer T-cellers kontaktavhengige hjelper effektorfunksjon er viktige i å fremme immmunresponser som krever hjelp av T-celler. For eksempel spiller interaksjon mellom gp39 på T-celler og CD40 på B-celler en sentral rolle i å aktivere B-cellers respons på antigener. Denne oppfinnelse er, ihvertfall delvis, basert på oppdagelsen at celleoverflatemolekyler som medierer kontaktavhengige hjelpereffektorfunksjoner også spiller en kritisk rolle i T-cellers respons til antigener. Spesielt har det blitt oppdaget at dersom en interaksjon mellom gp39 på en T-celle og en ligand på en celle som presenterer antigen til T-cellen blir forhindret vil man, under passende betingelser, få antigenspesifikk T-celle toleranse. Cellen som presenterer antigenet for T-cellen trenger altså en interaksjon mellom en gp39 ligand (f.eks. CD40) på cellen og gp39 på T-cellen for å kunne produsere signaler som er nødvendige for at T-cellen skal aktiveres. Inhibisjon av interaksjonen mellom gp39 liganden og gp39 forhindrer T-celleaktivering og induserer snarere antigenspesifikk T-celle toleranse. ;Det er beskrevet induksjon av antigen-spesifikk T-celle toleranse. Det omfatter å kontakte en T-celle med: 1) en celle som presenterer antigen for T-cellen og som har en ligand på celleoverflaten som reagerer med en reseptor på T-cellens overflate som medierer kontaktavhengige hjelpereffektor-funksjoner; 2) en antagonist (motforbindelse) rettet mot reseptoren på T-cellens overflate som medierer kontaktavhengige hjelpereffektorfunksjoner. Antagonisten hemmer interaksjonen mellom reseptoren og dennes ligand. En T-celle kan bli kontaktet av cellen som presenterer antigenet og antagonisten in vitro, eller cellen og antagonisten kan bli tilført til et individ for å indusere T-celle toleranse in vivo. ;Reseptoren på overflaten av T cellen som medierer kontakt-avhengig hjelper effektor funksjoner er gp39. Antagonisten er et anti-gp39 monoklonalt antistoff molekyl som hemmer interaksjonen av gp39 med dets ligand på en celle som presenterer antigen for T cellen. Cellen som presenterer antigen til en T celle er fortrinnsvis en B celle. ;B-cellen kan være en liten, hvilende B-celle. For å indusere T-celle toleranse mot et løselig antigen kan B-cellen få kontakt med antigenet før den får kontakt med T-cellen (f.eks. før tilførsel til et individ). I en annen versjon hvor T-celle toleranse induseres mot alloantigener benyttes en allogen celle for å presentere antigenet for T-cellen. Den allogene celle kan for eksempel være en allogen B-celle, allogen benmarg, allogene miltceller eller allogene celler i perifert blod. ;Det er mulig for eksempel å indusere T-celle toleranse mot et løselig antigen, for å indusere T-celle toleranse mot et benmargstransplantat eller annet organtransplantat, eller for å hindre transplantat-mot-vert sykdom (graft-versus-host disease) i benmargstransplantasjon. I tilfellet benmargstransplantasjon vil benmargscellene selv tjenestegjøre som celler som presenterer antigenet for T-cellen. Således vil i en versjon av oppfinnelsen et benmargstransplantat bli bedre akseptert dersom det tilføres en gp39 antagonist (f.eks. et anti-gp39 antistoff) sammen med allogen benmarg til et individ. ;Anti-humant gp39 monoklonale antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse har evne til å hemme B celle proliferasjon, B celle differensiering og T celle responser. Videre vedrører foreliggende oppfinnelse farmasøytiske sammensetninger som omfatter slike antistoffer. Anti-humane gp39 monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen er foretrukket for anvendelse ved modulering av immunresponser generelt, og spesielt for anvendelse ved indusering av antigen-spesifikk T celle toleranse. Spesielt foretrukne antistoffer er monoklonalt antistoff 24-31. 24-31 hybridom som produserer 24-31 _ant.istp.ff ble deponert undej reglementet til.Budapest.Avtalen til American Type Culture Collection, Parklawn Drive, Rockville, Md., 2. september 1994. 24-31 hybridomet ble tildelt ATCC Accession Number BH 11712. 24-31 antistoffet er av lgG1 isotype. ;Det er beskrevet anti-humant gp39 monoklonalt antistoff eller fragment derav, kjennetegnet ved at det omfatter det monoklonale antistoffet oppnådd fra hybridom 24-31 (ATCC HB 11712) eller innehar den samme epitopiske bindingsspesifisitet og omtrent den samme bindingsaffiniteten til gp39 som det monoklonale antistoffet oppnådd fra hybridom 24-31 (ATCC HB 11712). ;Det er videre beskrevet kimært eller humanisert anti-humant gp39 antistoff, kjennetegnet ved at det er ifølge krav 1. ;I overenstemmelse med dette gir følgelig oppfinnelsen i en versjon et anti-humant gp39 monoklonalt antistoff (mAb) av lgG1 isotype. Det anti-humane gp39 monoklonale antistoff fra oppfinnelsen kan hemme B-celleproliferasjon i standard in vitro studier, for eksempel B-celleproliferasjon indusert ved behandling av B celler med interleukin-4 og løselig gp39. Fortrinnsvis hemmer det anti-humane gp39 antistoff B-celleproliferasjon med en IC50 (dvs. konsentra-sjon som hemmer 50% av proliferasjonen) mellom ca. 0.01 og 5.0 ug/ml, bedre mellom ca. 0.1 og 2.5 ug/ml og enda bedre mellom ca. 0.1 og 1.25 ug/ml. De anti-humane gp39 monoklonale antistoff fra oppfinnelsen kan også hemme B-cellers produksjon av IgG, IgM og/eller IgA i et standard in vitro forsøk, for eksempel IgG produksjon indusert ved å dyrke B-celler med aktiverte T-celler (f.eks. T-celler aktivert med behandling med et anti-CD3 antistoff). Fortrinnsvis hemmer det antihumane gp39 antistoff B-cellers produksjon av IgG, IgM og/eller IgA med en IC<50> mellom ca. 0.01 og 1.0 ug/ml, eller bedre, mellom ca. 0.01 og 0.1 ug/ml. ;Anti-human gp39 mAb kan binde en epitope gjenkjent av monoklonalt antistoff 24-31 eller monoklonalt antistoff 89-76. Evnen som et mAb har til å binde en epitope gjenkjent av hvilken som helst av ovennevnte antistoffer kan bli bestemt ved standard kryss-konkurrerende analyser. For eksempel vil et antistoff som binder den samme epitopen gjenkjent av mAb 24-31 konkurrere for binding av merket 24-31 for å aktivere T celler, mens et antistoff som binder en annen epitope enn den som blir gjenkjent av mAb 24-31 vil ikke konkurrere for binding av merket 24-31 for å aktivere T cellene. ;Oppfinnelse n tilveiebringer yjdereiarmasøytiske sammensetnin<g>er av anti-humane gp39 antistoffer ifølge oppfinnelsen. Disse sammensetningene omfatter typisk et anti-humant gp39 mAb (for eksempel fortrinnsvis 24-31) og en farmasøytisk akseptabel bærer. Nukleinsyre kodende for et anti-humant gp39 mAb (for eksempel DNA kodende for en immunoglobulin tung kjede eller lett kjede, eller deler derav, av et anti-humant gp39 mAb) kan bli isolert fra en celle (for eksempel hybridom) produserer et antistoff-humant gp39 mAb ifølge standard teknikker. For eksempel kan nukleinsyren som koder for 24-31 mAb bli isolert fra 24-31 hybridomet ved cDNA bibliotek screening, PCR amplifikasjon eller annen standard teknikk. Nukleinsyre som koder for en anti-human gp39, mAb kjede kan bli manipulert ved standard rekombinante DNA teknikker for å produsere rekombinant anti-human gp39 mAb, for eksempel, kimerisk eller humanisert anti-humant gp39 mAb. - ;I en foretrukket versjon binder det anti-humane gp39 monoklonale antistoff en epitop som gjenkjennes av de monoklonale antistoffene 24-31. Evnen et monoklonalt antistoff har til å binde til en epitop som gjenkjennes av enhver av de nevnte antistoff kan bestemmes ved standard kryss-konkurranse studier. For eksempel vil et antistoff som binder den samme epitop som gjenkjennes av monoklonalt antistoff 24-31 konkurrere med binding av merket 24-31 til aktiverte T-celler, mens et antistoff som binder en annen epitop enn den som gjenkjennes av monoklonalt antistoff 24-31 ikke vil konkurrere med binding av merket 24-31 til aktiverte T-celler. ;Oppfinnelsen gir også farmasøytisk sammensetning, kjennetegnet ved at det inneholder et anti-humant gp39 monoklonalt antistoff eller fragment ifølge et hvilket som helst av kravene 1-10 og en farmasøytisk akseptabel bærer. Disse blandinger vil vanligvis omfatte et anti-humant gp39 monoklonalt antistoff (f.eks. fortrinnsvis 24-31) og en farmasøytisk akseptabel bærersubstans. ;Nukleinsyrer som koder for et anti-humant gp-39 monoklonalt antstoff kan bli isolert fra en celle (f.eks. et hybridom) som produserer et anti-humant gp39 monoklonalt antistoff med standard teknikker. For eksempel kan nukleinsyre som koder for 24-31 monoklonalt antistoff bli isolert fra 4-31 hybridom ved analyser av komplementært DNA (cDNA) biblioteker, forsterket polymerase kjedereakson (PCR), eller andre standard metoder. Nukleinsyre som koder for en anti-human gp39 monoklonalt antistoffkjede kan manipuleres med standard rekombinante DNA teknikker slik at rekombinante gp39 monoklonalt antistoff blir pro dusert, for ekse mpel kimærer el ler humaniserte anti-humane gp39 monoklonalt antistoff. ;Videre kan nukleinsyre som koder for et anti-humant gp39 monoklonalt antistoff bli inkorporert i en ekspresjonsvektor og bli introdusert i en vertscelle for å lette ekspresjon og produksjon av rekombinante former av anti-humane gp39 antistoff. ;Foreliggende oppfinnelse vedrører videre hybridom eller cellelinje, ;kjennetegnet ved at det produserer et anti-humant gp39 monoklonalt antistoff ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene. ;Det er også beskrevet hybridom 24-31 (ATCC HB11712). ;Kort beskrivelse av fi<g>urene. ;Figur 1 er en grafisk fremstilling av T-celle toleranse overfor et protein antigen, indusert ved in vivo anti-gp39 behandling. T-celleresponser ble mått in vitro etter stimulering med et antigen som tidligere hadde blitt tilsatt in vivo til antigen-eksponerte B-celler enten med eller uten et anti-gp39 antistoff. Figur 2 er en grafisk fremstilling av T-celletoleranse til allogene B-celler indusert ved in vivo anti-gp39 behandling. ;T-celleresponser ble målt in vitro etter stimulering med allogene B-celler som tidligere hadde blitt tilsatt in vivo enten med eller uten et anti-gp39 antistoff. Figur 3A er en grafisk fremstilling av hemning av primære allogene CTL (cytolytiske, celleoppløsende) responser indusert av allogene B-celler når mottagerdyr blir behandlet med anti-gp39 antistoff. Grupper som vises er ubehandlete mus (■), anti-gp39-behandlete mus (A) og miltceller fra ubehandlete Balb/c mus (•, brukt som negative kontroll effektorceller), ved ulike effektor: målcelle forhold (E:T ratio). Figurene 3B og 3C er grafiske fremstillinger av hemning av primære allogene CTL responser indusert med LPS (lipopolysakkarid)-behandlete B-celle blåster (umodne B-celler) når mottagerdyr blir behandlet med anti-gp39 antistoff. Panelene B og C viser to uavhengige eksperimenter. Gruppene som vises er LPS blåster in vivo uten behandling LPS blåster in vivo med anti-gp39 behandling (•), hvilende B-celler in vivo uten ;behandling (O) og hvilende B-celler in vivo med anti-gp39 behandling (□). ;Figur 4A er en grafisk fremstilling av hemningen av sekundære allogene CTL res ponser indusert av allog ene B-c eller når mottagerdyr blir behandlet med anti-gp39 antistoff. Effektor gruppene som vises er: Hlg(hamsterimmunglobulin)-behandlete mottagere (•), naturlige Balb/c mus (>) og anti-gp39-behandlete mottagere (■). Tilsvarende syngene responser (Balb/c celler stimulert med Balb/c celler) er vist med åpne symboler. Figur 4B er en grafisk fremstilling som viser spesifisiteten av hemningen av allogene CTL responser som forårsakes av anti-gp39 behandling. Det vises CTL responser overfor H-2k mål ved naturlige Balb/c celler (O) eller ved celler gjort tolerante mot H-2D ved tilsetning av H-2<15> haplotype B-celler og anti-gp39 (■). Figur 5 er et søylediagram som viser antall miltceller i en vertsorganisme som har mottatt en benmargstransplantasjon, ved ulike tidsintervaller etter benmargsoverføringen til verten enten med eller uten behandling med et anti-gp39 antistoff. Figur 6A er en grafisk fremstilling av konsentrasjonen av IgA produsert av B-celler fra milt ih vitro etter fjernelse fra mus som hadde mottatt benmargstransplantat enten med eller uten in vivo anti-gp39 behandling. B-celler fra milt ble fjernet og antistoffproduskjon ble målt enten 7 eller 14 dager etter benmargstransplantasjonen. Figur 6B er en grafisk fremstilling av konsentrasjonen av lgG1 produsert av B-celler fra milt in vitro etter fjernelse fra mus som hadde mottatt benmargstransplantat enten med eller uten in vivo anti-gp39 behandling. B-celler fra milt ble fjernet og anti-stoffproduksjon ble målt enten 7 eller 14 dager etter benmargs-transplantasjonen. Figur 7A er en grafisk fremstilling av serum IgE konsentrasjonen hos mus som hadde mottatt benmargstransplantat enten med eller uten in vivo anti-gp39 behandling, ved ulike tidspunkt etter benmargsoverføringen. Figur 7B er en grafisk fremstilling av konsentrasjon av anti-DNA antistoff i serum hos mus som hadde mottatt benmargstransplantat enten med eller uten in vivo anti-gp39 behandling, ved ulike tider etter benmargsoverføringen. Figurene 8A og 8B er grafiske fremstillinger som viser den cytolytiske (celleoppløsende) in vitro aktivitet funnet i cytotoksiske T-celler frå mus som hadde mottatt benmargstransplantat enten med eller uten in vivo anti-gp39 behandling, ved ulike effektor-til-målcelle forhold (E:T ratio). Panelene A og B viser to uavhengige eksperimenter. Figurene 9A, 9B og 9C er flowcytometri-profiler som viser fargingen av humane lymfocytter fra perifert blod, aktivert i 6 timer, med enten CD40lg (panel A), monoklonalt antistoff 4D9-8 (panel B) eller monoklonalt antistoff 4D9-9 (panel C). Figurene 10A, B og C er flowcytometri-profiler som viser fargingen av humane lymfocytter fra perifert blod, aktivert i 6 timer, og dyrket i nærvær av cyclosporin A, med enten monoklonalt antistoff 4D9-8 (panel A), monoklonalt antistoff 4D9-9 (panel B) eller CD40lg (panel C). Figurene 11A og 11B er flowcytometri-profiler som viser fargingen av humane lymfocytter fra perifert blod, aktivert i 6 timer, med CD40lg i nærvær av umerket monoklonalt antistoff 4D9-8 (panel A) eller umerket monoklonalt antistoff 4D9-9 (panel ;B). ;Figur 12 er en grafisk fremstilling av hemningen av human B-celleproliferasjon som induseres av løselig gp39 og IL-4 når celler dyrkes under nærvær av anti-humane gp39 monoklonalt antistoff 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 89-76 eller 89-79. Figur 13 er en grafisk fremstilling av hemningen av en allo-spesifikk blandet lymfocyttrespons når celler dyrkes i nærvær av anti-humane gp39 monoklonalt antistoff 24-31 eller 89-79. ;Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen ;Det er beskrevet metoder som induserer antigenspesifikk T-celle toleranse. ;Metodene omfatter å kontakte en T-celle med 1) en celle som presenterer antigen til T-cellen og har en ligand på celleoverflaten som reagerer med en reseptor på T-cellens overflate som medierer kontaktavhengig hjelper-effektor funksjoner, og 2) en reseptorantagonist på T-cellen som hemmer interaksjon mellom reseptoren og liganden. Som definert her er et molekyl eller en reseptor som medierer kontaktavhengig hjelper-effektor funksjon en som uttrykkes på en Th celle og reagerer med en ligand på en effektorcelle (f.eks. en B-celle), hvor interaksjonen mellom liganden og reseptoren er nødvendig for dannelsen av en effektorcelle respons (f.eks. aktivering av B-celle). I tillegg til å være innvolvert i effektorcelleresponser har det nå blitt funnet at et slikt molekyl er innblandet i T-cellens respons på antigen. ;Et foretrukket molekyl på en T-celle som medierer kontakt-avhengig hjelper-effektor funksjon er gp39. Dette inn befatter kontakt mellom en T-celle og en celle som presenterer antigen og en gp39 antagonist. Således er cellen som brukes for å presentere antigen en som reagerer med gp39 på overflaten av en T-celle for å aktivere T-cellen (dvs. overfører de signaler til T-cellen som er nødvendige for T-celleaktivering). For eksempel kan cellen være en B-celle som uttrykker CD40 og presenterer antigen for T-cellen. Ved å hemme en interaksjon mellom en gp39-ligand på cellen som presenterer antigen og gp39 på T-cellen hindres at T-cellen blir aktivert av det presenterte antigen, og heller blir tolerant overfor dette antigen. ;Det er mulig å indusere T-celle toleranse overfor et antigen in vivo. For eksempel kan en celle som presenterer antigen til en T-celle tilføres til et individ sammen med en antagonist mot en reseptor på T-cellens overflate som medierer kontktavhengig hjelper-effektor funksjon (f.eks. en gp39 antagonist). Videre er det mulig å indusere toleranse hos en T-celle mot et antigen in vitro, dette kan gjøres ved å kontakte T-cellen in vitro med en celle som presenterer antigen til T-cellen sammen med en antagonist til en reseptor på T-cellen som medierer kontaktavhengig hjelper-effektor funksjon (f.eks. en gp39 antagonist). T-celler gjort tolerante in vitro kan så tilføres til et individ. Oppfinnelsens metoder kan bli brukt for å skape toleranse hos T-celler i et individ overfor et spesifikt antigen, eller overfor transplanterte celler slik som allogen benmarg (f.eks. ved benmargstransplantasjon) og for å hemme transplantat-mot-vert sykdom ved benmargstransplantasjon. ;Ulike aspekter ved oppfinnelsen blir beskrevet mere detaljert i de følgende avsnitt. ;1. gp39 Antagonister ;En gp39 antagonist blir dermed brakt i kontakt med en T-celle (f.eks. tilført et individ) for å interferere med interaksjonen mellom gp39 på T-cellen og en gp39 ligand på en antigenpresenterende celle, slik som en B-celle. En gp39 antagonist defineres som et molekyl som interferer i denne interaksjon. gp39 antagonisten kan være et antistoff rettet mot gp39 (f.eks. et monoklonalt antistoff mot gp39), et fragment eller derivat av et antistoff rettet mot gp39 (f.eks. Fab eller F(ab)'2 fragmenter, kimære antistoff eller humaniserte antistoff), løselige former av en gp39-ligand (f.eks. løselig CD40), løselige former av et fusjonsprotein bestående av en gp39 ligand (f.eks. løselig CO40lg), eller farmasøytiske agens som avbryter eller interferer i reaksjonen mellom gp39 og CD40. ;A. Antistoff ;Et pattedyr (f.eks. en mus, hamster eller kanin) kan bli immunisert med en immunogen form av gp39 protein eller et proteinfragment (f.eks. et peptidfragment) som fremkaller en antistoff respons i dyret. En celle som uttrykker gp39 på sin overflate kan også bli brukt som immunogen. Alternative immunogener kan være renset gp39 protein eller proteinfragmenter. gp39 kan renses fra en celle som uttrykker gp39 med standard rensingsteknikker; gp39 cDNA (Armitage et al., Nature, 357, 80-82,1992; Lederman et al., J. Exp. Med. 175, 1091-1101, 1992; Hollenbaugh et al., EMBO J. 11, 4313-4319, 1992) kan bli uttrykt i en vertscelle, f.eks. bakterier eller pattedyrscellelinje, og gp39 protein kan så renses fra cellekulturen med standard teknikker. Basert på aminosyresekvensen av gp39 (se Armitage et al., Nature 357, 80-82,1992; Lederman et al., J. Exp. Med. 175,1091-1101,1992; Hollenbaugh et al., EMBOJ. 11,4313-4319, 1992) kan gp39 peptider bli syntetisert med kjente teknikker (f.eks. F-moc eller T-boc kjemisk syntese). Metoder som kan gi et protein immunogen effekt består i å konjugere det til en bærer, eller andre metoder velkjent i faget. For eksempel kan proteinet bli tilført sammen med en adjuvans. Utvikling av immunrespons kan følges ved å måle titer av antistoff i plasma eller serum. Standard ELISA (enzymbundet immunoadsorbent analyse) eller andre immunkjemiske metoder kan bli brukt med immunogenet som antigen for å måle nivå av antistoff. ;Etter immunisering kan antisera samles og dersom det ønskes kan polyklonale antistoff bli isolert. For å produsere monoklonale antistoff kan antistoffproduserende celler (lymfocytter) bli høstet fra et immunisert dyr og fusjonert med myelomceller med standard prosedyrer for fusjon av somatiske celler, slik at disse celler udødeliggjøres og blir hybridomceller. Slike metoder er velkjent i faget, for eksempel hybridomteknikken først utviklet av Kohler og Milstein (Nature (1975) 256, 495-497) likesåvel som andre teknikker slik som den humane B-celle hybridomteknikken (Kozbar et al., Immunol. Today (1983) 4, 72), EBV-hybridomteknikken for å produsere humane monoklonale antistoff (Cole et al., Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy (1985) (Allen R. Liss, Inc., pp. 77-96), og utvelging fra kombinatoriske antistoff-biblioteker (Huse et al., Science ;(1989) 246,1275). Hybridomcellene kan undersøkes immunkjemisk med henblikk på produksjon av antistoff som er spesielt reaktive med proteinet eller peptidet, og monoklonale antistoff kan bli isolert. ;Begrepet antistoff som brukt her skal også inkludere antistoff ragmenter som er spesielt reaktive med et gp39 protein eller peptid fra dette, eller et gp39 fusjonsprotein. Antistoff kan fragmenteres med konvensjonelle teknikker, og fragmentene kan bli undersøkt med henblikk på deres brukbarhet på samme måte som beskrevet over for komplette antistoff. For eksempel kan F(ab')2 fragmenter produseres ved å behandle antistoff med pepsin. De resulterende F(ab')2 fragmenter kan så behandles for å redusere disulfidbroer for å lage Fab' f ragmenter. Antistoffet i denne oppfinnelse er videre planlagt å innbefatte bispesifikke og kimære molekyler som har en anti-gp39 del. ;Når antistoff som er laget i ikke-humane individer blir benyttet i terapeutisk hensikt hos mennesker blir de i ulik grad gjenkjent som fremmede, og immunresponser kan oppstå hos pasienten. En måte som kan minimalisere eller eliminere problemet som er å foretrekke fremfor generell immunsuppresjon er å produsere kimære antistoffderivater, dvs. antistoffmolekyler som kombinerer en ikke-human, dyrespesifikk variabel del og en human, konstant region. Kimære antistoffmolekyler kan foreksempel innbefatte det antigenbindende domene fra et antistoff fra mus, rotte eller andre arter, med humane konstante regioner. En rekke tilnærmingsmåter har blitt beskrevet for å produsere kimære antistoff, og kan benyttes for å lage kimære antistoff som inneholder den variable immunglobulinregion som gjenkjenner gp39. Se for eksempel Morrison et al., Proe. Nati. Acad. Sei USA 81, 6851 (1985); Takeda et al., Nature 314, 452 (1985); Cabilly et al., U.S. Patent No. 4,816,567; Boss et al., U.S. Patent No. 4,816,397; Tanaguchi etal., European Patent Publication EP171496; European Patent Publication 0173494, United Kingdom Patent GB 2177096B. Det forventes at slike kimære antistoff vil være mindre immunogene for mennesker enn det tilsvarende ikke-kimære antistoff. ;Med henblikk på terapeutiske forhold hos mennesker kan de monoklonale eller kimære antistoff som er spesifikt reaktive med et gp39 protein eller peptid videre humaniseres ved at det produseres humant variable region-kimærer, der deler av den variable region, særlig de konserverte rammeregioner i det antigenbindende domene, er av human opprinnelse og bare de hypervariable regioner er fra nonhumane arter. Slike forandrete immunglobulinmolekyler kan lages med mange ulike teknikkér kjent i faget (f.eks. Teng et al., Proe. Nati. Acad. Sei USA 80,7308-7312 (1983); Kozbar et al., Immunol. Today 4,72-79 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol. 92,3-16 (1982)) og er helst produsert etter beskrivelsene i PCT Publication WO92/06193 eller EP 0239400. Humaniserte antistoff ;kan skaffes fra kommersielle kilder, f.eks. fra Scotgen Limited, ;2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, GB. ;En annen metode for å fremskaffe spesifikke antistoff eller fragmenter av antistoff som reagerer med et gp39 protein eller peptid er å undersøke ekspresjonsbiblioteker som koder for immunglobulingener eller deler av disse og som er uttrykt i bakterier med et gp39 protein eller peptid. For eksempel kan komplette Fab fragmenter, VH regioner og FV regioner bli uttrykt i bakterier v.h.a. fag ekspresjonsbiblioteker. See for eksempel Ward et al., Nature, 341, 544-546 (1989); Huse et al., Science 246,1275-1281 (1989); og McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990). Ved undersøkelse av slike biblioteker med for eksempel et gp39 peptid kan identifiseres immunglobulinfragmenter som reagerer med gp39. Som alternativ kan musestammen benevnt SCDIC-hu (tilgjengelig fra Genpharm) benyttes for å produsere antistoff eller fragmenter av antistoff. ;Metoder for å produsere monoklonale antistoffer rettet mot gp39, inkludert humant gp39 og mus gp39, og egnede monoklonale antistoffer for anvendelse i foreliggende oppfinnelse er beskrevet i større detalj i Eksempel 6. Spesielt foretrukne anti-humane gp39 antistoffer ifølge oppfinnelsen er mAb 24-31, produsert henholdsvis av hybridom 24-31. ;Rekombinant anti-gp39 antistoffer, så som kimerære og humanisert antistoffer kan bli produsert ved manipulering av nukleinsyre (for eksempel DNA) kodende for anti-gp39 antistoff ifølge standard rekombinante DNA teknikker. Immunoglobulin-kodende nukleinsyre kan kode for en immunoglobulin lett eller tung kjede variabel region, med eller uten en koblet tung eller lett kjede konstant region (eller del derav). En slik nukleinsyre kan bli isolert fra en celle (for eksempel hybridom) som produserer et anti-humant gp39 mAb ved standard teknikker. For eksempel kan nukleinsyren som koder for 24-31 mAb bli isolert fra 24-31 hybridom, ved cDNA bibliotek screening, PCR amplifikasjon eller annen standard teknikk. Etter isolering av og mulig videre manipulering kan nukleinsyre kodende for et anti-humant gp39 mAb bli inkorporert i en ekspresjonsvektor og introdusert inn i en vertcelle for å lette ekspresjon og produksjon av rekombinante former av anti-humane gp39 antistoffer. ;B. Løseli<g>e <qp>39 Ligander ;Andre gp39 antagonister som kan benyttes for å indusere T-celle toleranse er løselige former av gp39 ligander. En monovalent løselig gp39 ligand, som f.eks. løselig CD40, kan binde gp39 og derved hemme interaksjonen mellom gp39 og CD40 på B-celler. Termen "løselig" antyder at liganden ikke er permanent bundet til en cellemembran. En løselig gp39 ligand kan produseres ved kjemisk syntese eller, bedre, ved rekombinante DNA teknikker, for eksempel ved å uttrykke kun ligandens ekstracellulære domene (dvs. uten de transmembrane og intracellulære domener). Løselig CD40 er en foretrukket løselig gp39 ligand. Som alternativ kan en løselig gp39 ligand foreligge som et fusjonsprotein. Et slikt protein omfatter i det minste en del av gp39 liganden bundet til et annet molekyl. For eksempel kan CD40 bli uttrykt som fusjonsprotein sammen med immunglobulin (dvs. et CD40lg fusjonsprotein). I en versjon blir et fusjonsprotein produsert som omfatter aminosyrerester fra et ekstracellulært domene av CD40 molekylet bundet til aminosyrerester fra en sekvens som korresponderer med leddregioner-, CH2 og CH3-regionene fra en immunglobulins tunge kjede, f.eks. Cy1, for å produsere et CD40lg fusjonsprotein (se f.eks. Linsley et al. ;(1990) J. Exp. Med 1783, 721-730; Capon et al., (1989) Nature 337, 525-531; og Capon U.S. 5,116,964). Fusjonsproteinet can produseres med kjemisk syntese eller bedre med rekombinant DNAteknikker som baseres på cDNA fra CD40 (Stamenkovic et al., EMBO J. 8, 1403-1410(1989)). ;II. Celler for å indusere Antigenspesifikk Toleranse ;Denne oppfinnelse er, ihvertfail delvis, basert på følgende oppdagelse: Presentasjon av et antigen til en T-celle fra en celle som både presenterer antigenet og reagerer med gp39 resulterer i en antigenspesifikk T-celle toleranse dersom antigenet presenteres for T-cellen i nærvær av en gp39 antagonist. Celler som har evne til å indusere T-celle toleranse via denne mekanisme innbefatter de som presenterer antigen til en T-celle og krever en interaksjon mellom en gp39 ligand på cellen og gp39 på T-cellen for å overføre til T-cellen de signaler som er nødvendige for T-celle aktivering. Hemning av denne interaksjon forhindrer T-celle aktivering fra det presenterte antigen og gir istedet antigenspesifikk T-celle toleranse. Interferens med denne aktivering av T-. cellen via gp39 kan forhindre induksjon av samstimulerende molekyler på den antigenpresenterende celle (f.eks. B7 familie molekyler på en antigenpresenterende celle slik som en B-celle) slik at den antigenpresenterende celle kun gir et antigent signal i fravær av et samstimulerende signal, og således induserer toleranse. ;En celle som presenterer antigen blir følgelig tilført en mottager. Frasene "celle som presenterer antigen" og "antigenpresenterende celle" blir her brukt om hverandre, og skal omfatte celler kan presentere antigener til mottagerens T-celler og innbefatter B lymfocytter, "profesjonelle" antigenpresenterende celler (f.eks. monocytter, dendrittiske celler, Langerhans celler) og andre celler som presenterer antigen til immunceller (f.eks. keratinocytter, endotelceller, astrocytter, fibroblaster, oligodendrocytter). Videre er det ;fordelaktig om den antigenpresenterende celle har redusert evne til å stimulere et samstimulerende signal i mottagende T-celler. For eksempel kan den ~;antigenpresenterende celle mangle ekspresjon av, eller uttrykke bare lave nivåer av, samstimulerende molekyler slik som B7 proteinfamilien (f.eks. B7-1 og B7-2). Ekspresjon av samstimulerende molekyler på potensielle antigenpresenterende celler som skal brukes i oppfinnelsens metode kan estimeres med standard metoder, for eksempel "flow cytometri" hvor det brukes antistoff rettet mot samstimulerende molekyler. ;Foretrukne antigenpresenterende celler for å indusere T-celle toleranse er lymfoide celler, for eksempel lymfocytter fra perifert blod og miltceller. Foretrukne lymfoide celler for å indusere T-celle toleranse er B-celler. B-celler kan renses fra en blandet cellepopulasjon (f.eks. andre celletyper i perifert blod eller i milt) ved standard celleseparerings metoder. For eksempel kan adhererende celler fjernes ved at miltceller blir dyrket på plastskåler og åt man samler de ikke-adhererende celler. T-celler kan fjernes fra en blandet cellepopulasjon ved behandling med et anti-T-celle antistoff (f.eks. anti-Thy-1.1 og/eller anti-Thy-1.2) og komplement. I en versjon blir hvilende lymfoide celler, fortrinnsvis hvilende B-celler, brukt som de antigenpresenterende celler. Hvilende lymfoide celler slik som hvilende B-celler kan isoleres med teknikker som er kjent i faget, for eksempel basert på deres størrelse og tetthet. Hvilende lymfoide celler kan for eksempel isoleres med 'motstrøms sentrifugal elutriering<1>, som beskrevet i Tony, H.P. and Parker, D.C. (1985) J. Exp. Med. 161, 223-241. Ved bruk av motstrøms sentrifugal elutriering kan man fremskaffe en liten populasjon av hvilende lymfoide celler som mangler celler som kan aktivere T-celle responser ved å samle fraksjon(er) ved 14-19 ml/min, helst ved 19 ml/min (ved 3200 omdreininger pr min). Som alternativ kan små, hvilende lymfocytter (f.eks. B-celler) bli isolert ved diskontinuerlig tetthetsgradient sentrifugering, for eksempel ved bruk av Ficoll eller Percoll gradienter og et lag som inneholder små hvilende lymfocytter kan fremskaffes etter sentrifugering. Små hvilende B-celler kan også skilles fra aktiverte B-celler ved å undersøke ekspresjon av samstimulerende molekyler, slik som B7-1 og/eller B7-2, på overflaten av aktiverte B-celler ved standard metoder (f.eks. immunfluorescens). ;- Den antigenpresenterende celle, f.eks. en B-celle, kan kontaktes av et antigen (f.eks. et løselig protein) før kontakten med T-cellen (f.eks. før tilførsel til et individ), og cellen kan benyttes for å presentere antigenet til T-cellen i nærvær av en gp39 antagonist for å indusere spesifikk T-celle toleranse overfor antigenet (se Eksempel 1). Som alternativkan toleranse mot allo-antigener bli indusert ved at det benyttes en allogen celle som den antigenpresenterende celle (se Eksempler 2 og 3). Den allogene celle presenterer antigene fragmenter av allogene proteiner til ;T-celler. I en versjon er den allogene celle en allogen lymfoid celle, som f.eks. en allogen B-celle. Som alternativ kan et individ bli gjort tolerant med celler fra perifert blod (f.eks. perifere blodlymfocytter), miltceller eller benmargcelier. Hva angår transplantasjon av benmarg fungerer donors benmargcelier selv som antigenpresenterende celler i kontakt med T-celler (f.eks. tilført et individ). Allogen benmarg kan således, sammen med en gp39 antagonist, tilføres for å indusere toleranse til benmargen i mottager og for å forhindre transplantat-mot-vert sykdom (se Eksempler 4 og 5). ;III. Tilførsel av Celler oa qp39 Antagonister ;Antigenspesifikk T-celle toleranse kan bli indusert ved å tilføre en gp39 antagonist til et individ sammen med en celle som presenterer antigen til en T-celle og uttrykker en ligand som reagerer med gp39 på T-cellen. I en foretrukket versjon blir den antigenpresenterende celle og gp39 antagonisten tilført sammen eller ved samme tidspunkt. Som alternativ kan gp39 antagonisten bli tilført før cellene, for eksempel dersom gp399 antagonisten er et antistoff med lang halveringstid. I et tilfelle der cellene som skal tilføres er benmargcelier, og hvor hemning av transplantat-mot-vert sykdom ønskes, kan donor T-celler i benmargen bli gjort tolerante før overføring til den mottagende vert ved å inkubere donors benmarg med B-celler fra verten og en gp39 antagonist in vitro. gp39 behandling kan kontinueres in vivo under og etter benmargsoverføring dersom nødvendig. Hos individer som skal motta en benmarg eller annet organtransplantat kan allogen toleranse overfor transplantatet bli indusert ved behandling som induserer allogen toleranse, før overføring av organet eller benmarg-cellene. Denne 'behandling før transplantasjon<1> kan dreie seg om tilførsel av celler fra donor sammen med en gp39 antagonist til individet. Cellene fra donor kan for eksempel være B-celler, helblod eller en blodfraksjon (f.eks. perifere blod lymfocytter eller små hvilende lymfocytter eller B-celler). ;Tilførsel av en enkeltdose med antigenpresenterende celler (sammen med antagonisten) har blitt funnet å være tilstrekkelig for induksjon av T-celle toleranse. (Se Eksemplene). Antall antigenpresenterende celler som tilføres kan variere, avhengig av type celle som brukes, type vev eller organtransplantat, mottagers vekt, mottagers generelle tilstand og andre variable som er kjent for fagmannen. Et passende antall celler til bruk kan bli bestemt av enhver med vanlig kompetanse i faget via konvensjonelle metoder (for eksempel ved å bruke analyser beskrevet i Eksemplene). Celler blir tilført i en form og via en vei som er passende for å indusere toleranse i mottageren. Celler kan tilføres i en fysiologisk akseptabel løsning, slik som bufret saltløsning eller tilsvarende. Celler blir fortrinnsvis tilført intravenøst. ;Følgelig blir en heri beskrevet antagonist tilført til individer i en biologisk tålbar form, passende for farmasøytisk tilførsel in vivo for å indusere T-celle toleranse. Med "biologisk tålbar form, passende for farmasøytisk tilførsel in vivo" menes en form av antagonisten som skal tilføres hvor enhver toksisk effekt blir uvesentlig i forhold til de terapeutiske effekter av proteinet. Begrepet "individ" ønskes å inkludere levende organismer hvor en immunrespons kan fremkalles, f.eks. pattedyr. Eksempler på individer er mennesker, hunder, katter, rotter, og transgene arter av disse. En gp39 antagonist kan bli tilført i enhver farmakologisk form, eventuelt i en farmasøytisk akseptabel bærer. Tilførsel av en terapeutisk aktiv dose av antagonisten blir definert som en effektiv mengde, ved doser og i perioder som er nødvendige for å oppnå det ønskete resultat. For eksempel kan en terapeutisk aktiv mengde av en gp39 antagonist variere alt etter faktorer som sykdomstilstand, alder, kjønn og vekt hos individet, og evnen en antagonist har til å fremkalle en ønsket respons hos individet. Doseringsregime kan bli tilpasset for å gi den optimale terapeutiske respons. For eksempel kan flere delte doser bli tilført hver dag, eller dosen kan bli redusert dersom den terapeutiske situasjon måtte kreve det. ;Den aktive substans (f.eks. antagonist) kan tilføres på en enkel måte som ved injeksjon (subkutan, intravenøs etc), per os, ved inhalasjon, ved transdeimal eller rektal tilførsel. Avhengig av tilførselsvei kan den aktive substans være dekket i et materiale som beskytter mot inaktivering fra enzymer, syrer og andre naturlige forhold. En foretrukken tilførselsvei er ved intravenøs injeksjon. ;For å tilføre en gp39 antagonist på annen måte enn ved parenteral tilførsel kan det være nødvendig å dekke antagonisten eller tilføre den sammen med et materiale som hindrer dens inaktivering. For eksempel kan en antagonist bli tilført et individ i en passende bærer eller fortynningsvæske sammen med enzymhemmere, eller i passende bærere slik sonrrliposomer. Farmasøytisk akseptable fortynntngsvæsker er saltvann og vandige bufferløsninger. Enzymhemmere er pankreatisk trypsin inhibitor, diisopropyl fluorofosfat (DEP) og Trasylol. Liposomer kan være vann-i-olje-i-vann emulsjoner, eller konvensjonelle liposomer (Strejan et al., (1984) J. Neuroimmunol. 7,27). ;Den aktive substans kan også tilføres parenteralt eller intraperitonealt (i bukhulen). Dispersjoner kan også prepareres i glycerol, flytende polyetylenglykoler og blandinger av disse, og i oljer. Under vanlige lagrings- og bruksforhold kan disse preparater inneholde et konserveirngsmiddel for å hindre vekst av mikroorganismer. ;Farmasøytiske blandinger som passer til injeksjon omfatter sterile vandige løsninger (der vannløselighet er ønsket) eller dispersjoner og sterile pulvere for improvisert, rask forberedelse av sterile injeksjonsløsninger. I alle tilfeller må blandingen være steril og såpass flytende at den lett kan injiseres. Den må være stabil under produksjon og lagring og må beskyttes mot forurensing med mikroorganismer som bakterier og sopp. Bæreren kan være et løsningsmiddel eller dispersjonsmedium som inneholder for eksempel vann, etanol, polyol (for eksempel glycerol, propylenglykol, og flytende polyetylenglykol og lignende), og passende blandinger av disse. Den passende grad av fluiditet kan for eksempel vedlikeholdes ved å benytte et dekkende lag som lecitin, ved dispersjoner ved å bevare den nødvendige partikkelstørrelse, og ved bruk av overflateaktive forbindelser. For å hindre mikroorganismers effekter kan ulike antibakterielle og antifungale midler brukes, for eksempel parabener, klorobutanol, fenol, askorbinsyre, timerosal og lignende. I mange tilfelle vil det ;være fordelaktig å ha med isotone forbindelser, f.eks. sukkere, polyalkoholer som mannitol, sorbitol, eller natriumklorid i blandingen. Forlenget absorpsjon av de injiserbare blandinger kan oppnåes ved å tilsette agens som forsinker absorpsjonen, for eksempel aluminium monostearat og gelatin, til blandingen. ;Sterile injiserbare løsninger kan prepareres ved å tilsette den nødvendige mengde aktiv substans (f.eks. en gp39 antagonist) i et passende løsningsmiddel til en kombinasjon av komponentene beskrevet over, etter behov, og rense denne blanding med sterilfiltrering. Vanligvis blir dispersjoner preparert ved at aktiv ingrediens blir innkorporert i et sterilt bærermedium som inneholder et dispersjonsmedium og de nødvendige andre ingredienser fra de som er beskrevet over. Hva angår sterilt pulver beregnet på preparering av sterile injiserbare løsninger er de foretrukne metoder vakuumtørking og frysetørking, som gir et pulver inneholdende den aktive substans (f.eks. antagonisten) samt enhver ytterligere ønsket ingrediens fra en tidligere sterilfiltrert løsning av denne. ;Når den aktive forbindelse er beskyttet på passende måte, som beskrevet over, kan proteinet bli gitt peroralt, for eksempel med en inaktiv løsningsvæske eller en spiselig bærersubstans. Som benyttet her innbefatter "farmasøytisk akseptabel bærer" enhver og alle løsningsmidler, dispersjonsmedier, dekkende materialer, antibakterielle og antifungale midler, isotone og absorpsjonsforsinkende agens, og lignende. Bruk av slike media og agens for farmasøytisk aktive substanser er godt kjent i faget. Slik bruk i den terapeutiske blanding blir planlagt, unntatt ved tilfeller der konvensjonelle medier eller agens er uforlikelige med den aktive substans. Ytterligere aktive substanser kan også bli tilsatt blandingen. ;Det er spesielt fordelaktig å formulere parenterale blandinger i dose-enhetsformer som forenkler tilførsel og enhetlig dosering. 'Dose-enhetsform' som brukt her henviser til fysikalsk separate enheter, passende for en enkelt dose for pattedyrindividene som skal bli behandlet, hvor hver enhet inneholder en på forhånd bestemt mengde av aktiv substans som er beregnet å gi den ønskete terapeutiske effekt, sammen med den nødvendige farmasøytiske bærer. Spesifikasjonen av dose-enhetsformen i oppfinnelsen dikteres av og er direkte avhengig av (a) de unike egenskaper av den aktive substans og den spesielle terapeutiske effekt man tilstreber, og (b) begrensningene som ligger i metodene for å lage blandinger med en slik aktiv substans som kan brukes for behandling av følsomhet i individer. ;Det er mulig å fremskaffe toleranse i T-celler in vivo og in vitro, f.eks. ved kontakt med en antigenpresenterende celle i nærvær av en gp39 antagonist. For eksempel kan T-celler skaffes fra et individ, toleranse i disse T-celler kan fremskaffes in vitro ved dyrking sammen med den antigenpresenterende celle og antagonisten, og T-cellene kan så føres tilbake til individet. ;IV. Bruk ;Det er mulig å indusere T-celle toleranse overfor en rekke ulike antigener. For eksempel kan T-celle toleranse bli indusert mot løselige antigener (f.eks. et løselig protein) som beskrevet i Eksempel 1. T-celle toleranse kan fremskaffes overfor antigener som-erinnblandet i autoimmunsykdommereller tilstander knyttet til unormale-immunresponser. For eksempel kan antigenet i en versjon være et autoantigen. I en annen versjon kan antigenet være et allergen. Som alternativ kan T-celler bli gjort tolerante overfor antigener som uttrykkes på fremmede celler (som beskrevet i eksemplene 2-5). Likeså kan, i andre versjoner, antigenet være et alloantigen eller et xenoantigen. Induksjon av T-celle toleranse overtor alloantigener og xenoantigener er av spesiell betydning i transplantasjon, for eksempel ved å hemme at en mottager forkaster et transplantat, f.eks. et vevs-, organs- eller benmargstransplantat. I tillegg er induksjon av toleranse hos donor T-celler innen et benmargstransplantat nyttig for å hindre ;transplantat-mot-vert sykdom (se Eksempel 5). ;Oppfinnelsen er videre illustrert ved hjelp av de følgende eksempler. ;EKSEMPEL 1: Induksjon av Antigenspesifikk Toleranse ;Metoder ;Mus ble immunisert med miltlymfocytter "pulset" med KLH (keyhole limpet hemocyanin) i fem dager. Under den primære immunisering ble en gruppe dyr behandlet med et anti-gp39 antistoff MR1Fem dager etter den første immunisering ble musene gitt en lokal (i fotputen) injeksjon av KLH i komplett Freunds adjuvans (CFA). Dyrene ble avlivet fem dager senere, drenerende lymfeknutene ble tatt ut og T-cellenes proliferative respons til KLH ble så undersøkt in vitro. ;Resultater ;Dyr som var immunisert med aktiverte B lymfocytter "pulset" med antigen og deretter stimulert med det samme antigen responderer med betydelige immunresponses mot det immuniserende antigen. Figur 1 viser responsen, målt som proliferasjon av antigen-spesifikke T lymfocytter. Behandling av dyr med et anti-gp39 antistoff under den —primære immunisering-resulterer i manglende'respons av de antigenspesifikke T lymfocytter når de testes in vitro. T lymfocytter fra lymfeknuter fra dyr som var behandlet med et anti-gp39 antistoff viser senket proliferasjonskapasitet når de sammmenlignes med T lymfocytter fra lymfeknuter fra ubehandlete dyr. ;EKSEMPEL 2: Induksjon av T-celle Toleranse overfor Allogene Celler ;Metoder ;Balb/c (H-2<d>) mus ble immunisert med allogene B-celler fra milt fra DBA/2 (H-2<b>) mus. En gruppe dyr ble behandlet i fem dager med et antt-gp39 antistoff, MR1, en annen gruppe ble ikke behandlet. På sjette dag etter immunisering ble dyrene avlivet og milten tatt ut. Miltceller fra anti-gp39 antistoff- eller ubehandlete dyr ble deretter dyrket in vitro med enten ingen stimulus eller med bestrålte DBA/2 miltceller. Den proliferative respons ;som fulgte denne sekundære allogene stimulering ble målt dag 3 etter at dyrking ble påbegynt. ;Resultater ;T lymfocytter fra dyr som var immunisert med allogene milt B-celler gir sterk proliferativ respons dersom de utsettes fem dager senere for de samme cellene in vitro (Fig. 2). Imidlertid har T lymfocytter fra mus som har blitt immunisert med allogene milt B-celler og behandlet med et anti-gp39 antistoff en senket proliferativ kapasitet når de sener stimuleres in vitro. Mus som har vært behandlet méd anti-gp39 antistoff har ca. 50% nedgang i respons til stimulering, sammenlignet med kontroll, ubehandlete mus. ;EKSEMPEL 3: Anti-gp39 Behandling interferer med dannelsen av CTL ;Responser overfor Allogene B-celler ;I dette eksempel ble rollen som gp39 spilte i dannelsen av cytotoksiske T-celler (CTL) studert. For å estimere funksjonen av gp39 i utviklingen av CTL in vivo ble effekten av behandling med anti-gp39 på dannelsen av allospesifikke CTL, fremkalt med immunisering med allogene B-celler, bestemt. ;Primære CTL responser ;For å teste om anti-gp39 kan hindre allogene B-celler i å fremkalle allospesifikk CTL respons in vivo ble allogene B-celler (celler fra milt renset for T-celler) tilført mottagermus med eller uten anti-gp39. Balb/c mus (hundyr, 6-8 uker gamle, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) ble immunisert med miltceller (30-50 x 10<6>) fra C57BL/6 mus (hundyr, 6-8 uker gamle, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME), der miltcellene var renset for T-celler med behandling med anti-Thyl .2 (bukhulevæske fra ATCC klone H013.4) og kanin komplement. Disse mottagermus bie så enten ikke behandlet eller behandlet med anti-gp39 i fem dager (250 mg/mot-tager på dag 0,2 og 4). På dag fem ble miltene fjernet og CTL responsene ble målt med en krom-frisetting analyse. Miltceller fra Balb/c mus som ikke var stimulert ble brukt som kontroll. Målceller som ble brukt var E hunkjønn K1 (H-2b, T-celle lymfom fra C57BL/6 stamme) og P815 (H-2d, mastocytom fra DBA/2J stamme). Celler merket med Krom-51 (<51>Cr) ble vasket og tilsatt 96-brønns plater med 1x10<4> celler pr. brønn med effektor celler i effektor: målceller (E:T) ratio på 100:1, 20:1 og 4:1. Platene ble kortvarig sentrifugert og inkubert ved 37°C i 5% C02 i fire timer. Platene ble sentrifugert om igjen, og 0.1 ml av cellefri supernatant ble samlet for analyse ved gammatelling (LKB Clinigamma, Wallac Inc., Gaithersburg, MD). Prosent spesifikk lysis (celleoppløsning) er definert som (a-b)/c, der a=cpm frisatt av målceller inkubert med effektor celler (cpm, radioaktive 'counts per minute), b=cpm frisatt fra ;målceller inkubert bare med medium (dvs. spontan frisetning) og c=frosset-og-tint ;. _J.rJset_tbar cprn fra mål celler (ca. 80% av de tota[ cpm inn korporert). P815 målceller ble ikke oppløst av noen av celleprøvene som ble testet. Resultater frå E hunkjønn K1 målceller vises i Figur 3A. der gruppene som vises er ubehandlete mus (■), mus. behandlet med anti-gp39 (A) og miltceller fra ikkestimulerte Balb/c mus {•, brukes som negative kontroll effektor celler). Resultatene viser at mus som fikk anti-gp39 og allogene celler ikke genererte en primær CTL respons in vivo som svar på allogene B-celler. I motsetning til dette førte de allogene B-celler i fravær av anti-gp39 til sensitisering av mottager og til en betydelig CTL respons, ;LPS (lipopolysakkaird)-aktiverté B-celler ble brukt for å stimulere til CTL respons i nærvær eller fravær av anti-gp39 for å avgjøre om anti-gp39 bare kunne forsterke den "tolerogene" effekt av ikke-aktiverte milt B-celler. B-celler fra C57BL/6 mus ble preparert som beskrevet over og dyrket i to dager i nærvær eller fravær av LPS (50 mg/ml, Sigma diagnostics, St. Louis, MO). Celler ble så høstet og vaket grundig og injisert intraperitonealt (30-50 x 10<6>) i Balb/c mottagermus. Mottagerne ble enten ubehandlete eller fikk anti-gp39 på dag 0,2, og 4 som beskrevet over. På dag 5 ble miltene tatt ut og CTL responser ble målt som beskrevet over. Resultatene fra to uavhengige eksperimenter vises i Fig. 3B (topp og bunnpaneler). Gruppene som vises er LPS blåster in vivo uten behandling (>), LPS blåster in vivo med anti-gp39 behandling (•), hvilende B-celler in vivo uten behandling (O) og hvilende B-celler in vivo med anti-gp39 behandling {□). Resultatene indi-kerer, selv om de ikke er komplette, at anti-gp39 behandling også reduserte den primære CTL respons overfor allogene LPS blåster. ;Sekundære CTL responser ;For å studere påvirkningen av anti-gp39 og allogene B-celle tilførsel på CTL dannelse ble miltceller fra behandlete og ubehandlete mus stimulert in vitro og nivået av ;CTL responser ble studert. Balb/c mus ble stimulert in vivo med B-celler fra C57BL/6 som beskrevet over. Miltceller fra de anti-gp39- og fra kontroll hamster lg (Hig)-behandlete dyr ble tatt ut og 5x 10<6> celler/ml ble dyrket i 5 dager ("respondere") med ulike, mitomycin C-behandlete (2,5 mg/ml ved 37°C, Sigma Diagnostics, St. Louis, MO) stammer av milt B-celler (preparert med behandling med anti-Thy 1.2 + komplement) i mengder på 5 x 10<6 >stimulatorer/ml. Stimulatorgrupper var C57BL/6(H-2<b>) og Balb/c(H-2<d>) som viser henholdsvis den sekundære allogen respons og den primære syngene respons. Stimula]Pr:_°9 responsceller bl e videre dyrket i ferskt preparejt_RPMM640 medium (Bio Whittaker, Walkersville, MD), 0.01 mM merkaptoetanol (BioRad Laboratories, Hercules, CA), 2 mM L-glutamin (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO), 500 U/ml penicillin og 5000 U/ml streptomycin (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO). Etter 5 dager ble responscellene høstet, og døde celler ble fjernet ved sentrifugering på en tetthetsgradient. De resulterende levende celler ble brukt som effektorceller i en CTL analyse som beskrevet over. Målceller var E hunkjønn K1 (H-2d, mastocytom, fra DBA/2J stamme); Resultatene er vist i Fig. 4A. Allogent stimulerte effektorgrupper som vises er: Hlg-behandlet mottagere (•), natur-lige Balb/c (>) og anti-gp39-behandlete mottagere (■). Tilsvarende syngene responser (Balb/c celler stimulert med Balb/c celler) er vist med åpne symboler. In vivo immunisering av mus med allogene miltceller (H-2<b>), hvor T-celler var fjernet, uten anti-gp39 behandling, resulterte som forventet i en robust sekundær CTL respons in vitro. Den økte sekundære anti-H-2b CTL respons ble ikke observert dersom musene fikk anti-gp39 in vivo. ;For å bestemme spesifisiteten av inhibisjonen av CTL responsene fremkalt av anti-gp39 behandling ble miltcelle kulturer som beskrevet over analsyert m.h.p. anti-H-2k allogene responser (tredje-parti allogene responser) ved å benytte B10BR (H-2<k>) milt B-celler as som stimulatorer og SL8 (H-2k, spontant T-celle lymfom fra AKR stamme) som målceller i CTL analysen. Resultater vises i Figur 4B. Grupper som vises er naturlige Balb/c (O) og anti-gp39 behandlete mottagere (■). Resultatene viser at hemmingen av anti-H2b-spesifikke CTL responser fremkalt av anti-gp39 behandling var allospesifikk siden tilførsel av H-2b miltceller og anti-gp39 ikke endret in vivo CTL responsen overfor et 'tilskuer<1> alloantigen ;(H-2<k>). ;Tilsammen viser disse data at anti-gp39 interferer med dannelsen av (både primære og sekundære) allospesifikke CTL responser. I nærvær av anti-gp39 er CTL forløpere spesifikke for det relevante alloantigen fremdeles tilstede, siden man, i in vitro kultur, kan vise noe anti-H-2b CTL aktivitet. Man kan konkludere med at anti-gp39 behandling reduserte den sekundære in vitro respons ved å blokke CTL stimulering eller ved å redusere hyppigheten av stimulert spesifikk CTL. Bruk av hvilende B-celler er ikke absolutt nødvendig for å vise denne manglende respons siden den allogene CTL res pons fremkalt_av LPS blåster også var senket a<y> antj-gp39._ ;EKSEMPEL 4: Overføring av Allogen Murin Benmarg induserer stabile kimæerer når mottagere er behandlet med at antistoff mot gp39. ;Behandling av mange blodsykdommer som ikke kan kureres.med konvensjonelle kjemoterapeutiske metoder ibefatter overføring av allogen benmarg. Denne aggressive terapi består av tilførsel av høye, margdrepende doser av kjemoterapeutika, koblet med perffusjon av allogen benmarg, noe som tillater å utrydde klonedannende tumorceller. ;Det har allerede blitt vist at bestråling av thymus, og derved fjerne thymusceller, øker hyppigheten av stabile kimærer når monoklonale antistoff (mAb) mot T-celler, inkludert anti-CD4 monoklonalt antistoff, ble brukt. Dette antistoffregime førte til fjernelse av T-celler og således til donor-spesifikk toleranse, noe som ble vist ved toleranse til hudtransplantater fra donor. Manglende evne til å oppnå permanent allogen transplantasjon etter 300 rad WBI (helkroppsbestråling), in vivo anti-T-celle monoklonalt antistoff behandling og tilførsel allogen benmarg kan ha resultert fra de uaffiserte T-celler i thymus. Bruk av anti-CD4 og anti-CD8 monoklonalt antistoff kan føre til effektiv fjernelse av T-celler i perifert blod og milt, men T-celler i thymus er simpelthen dekket med monoklonalt antistoff, uten å bli fjernet. Derfor blir bestråling av thymus benyttet på mus. ;Metoder ;En musemodell for allogen benmargstransplantasjon (BMT) fra F1 til forelder ble benyttet for å unngå induksjon av transplantat-mot-vert sykdom. Vi brukte F1 stammen CB6 som er (C57BL/6 x Balb/c)F1 og som resulter i en generell MHC (største histokompatibilitets gen) haplotype. Benmarg ble fjernet og injisert intravenøst i den bestrålte Balb/c forelder med eller uten et anti-gp39 antistoff, MR1. Mengder av helkroppsbestråling (WBI) ble variert for å bestemme det beste nivå av kimæredannelse og for å sammenligne anti-gp39 antistoffbehandlete og -ubehandlete dyr ved hvert bestrålingsnivå. Kimære-dannelse ble bestemt med flow cytometri-analyse av H-2b MHC-haplotype lymfocytter fra perifert blod fra H-2<d>(Balb/c) musen. Det har tidligere blitt vist at denne musekombinasjon er passende og at kimærer kan oppnåes ved 500 og 600 rad ;WBI. ;Resultater ;Kimærdannelse ble oppdaget ved å identifisere celler fra C57BL/6 (H-2<b>) med flow cytometri. Kimærdannelse ble funnet utviklet i mus som var bestrålet med 400,500 og 600 helkroppsbestråling innen 14 dager bare dersom de var behandlet med anti-gp39 antistoff fra starten av studien. Mus som ikke fikk antistoffbehandling forkastet cellene ved alle bestrålingsnivåer unntatt når de fikk 600 rad WBI, hvorved de aksepterte benmarg i den samme utstrekning som den antistoffbehandlete gruppe gjorde ved 400 rad WBI (Tabell 1). Det ble funnet at kimæredanneisen etter 6 ukers behandling med anti-gp39 ved 400, 500 og 600 rad var henholdsvis 70,7+5,74, 94,1 og 84,4+8,56, mens den ved 600 rad uten antistoffbehandling var funnet å være 85,7+5,9 kimære (Tabell 2). Bestemmelse av cellenes fenotype indikerte at T-celler, B-celler og makrofager alle var kimærisert i samme grad etter anti-gp39 behandling og 400 rad bestråling som etter 600 rad bestråling uten behandling (Tabell 2). Det synes også som om anti-gp39 behandling ikke signifikant endret totale prosent lymfocyttpopulasjoner i periferien. Etter avsluttet behandling av dyrene med anti-gp39 antistoff var dyrene stabile kimærer i inntil 8 uker etter transplantasjonen. ;EKSEMPEL 5: Allogen benmargstransplantasjon kombinert med behandling av mottager med anti-gp39 hemmer akutt og kronisk transplantat-mot-vert sykdom (GVHD). ;I dette eksempel ble den følgende metodologi brukt: ;Mus: DBA/2 (H-2<d>), C57BL/6 (H-2<*>) og B6D2F1 ((C57BL/6(H-2d)xDBA/2)F1 hybrid) mus ble anskaffet fra NCI laboratoriene (Behtesda, Maryland) og vedlikeholdt i en virusfri sone i dyreavdelingen ved Dartmouth Medical School. Alle mus brukt i studien var hunkjønn og av 6-8 ukers alder.

Induksjon av kronisk GVHD: Kronisk GVHD ble fremkalt ved intravenøs injeksjon av foreldre (DBA/2) miltceller til ikkebestrålte (C57BL/6xDBA/2)F1 hybrid mottagere (Fast, LD. (1990)

J. Immunol. 144,4177). Som forberedelse til miltfjernelse ble foreldremusene bedøvet og avlivet med halsbrudd. Dissosierte miltceller ble vasket og resuspendert i RPM11640 medium (Whittaker, Waldersville, Maryland) før intravenøs injeksjon i F1 mottagerne.

Induksjon av akutt GVHD: Akutt GVHD ble fremkalt ved intravenøs injeksjon av foreldre C57BL/6 miltceller til ikkebestrålte (C57BL/6xDBA/2)F1 hybrid mottagere. Celler ble preparert før overføring som ved induksjon av kronisk GVHD.

Antistoff: Anti-gp39:MR1 ble produsert i bukhulevæske og renset med ionebytter høytrykks væskekromatografi som tidligere beskrevet (Foy, T.M. et al. (1993) J. Exp. Med. 178, 1567-1575; Noelle R.J. et al. (1992) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89, 6550). Polyklonale anti-isotype antistoff: Alle anti-lgG1 og anti-lgA antsitoff og standard kontroller var fra Southern Biotechnology Associates, Inc. (Birmingham, AL). Anti-lgE antistoff: Alle anti-lgE antistoff (BIE3 og Biotin AM95) og standarder (A3B1) brukt i det IgE-spesifikke ELISA var gave fra Dr. T. Waldschmidt, IA. Anti-MHC haplotype antistoff: H-2Kb FITC-konjugerte antistoff og H-2Dd Biotin-konjugerte antistoff ble skaffet fra PharMingen (San Diego, CA).

Cellelinjer: Cellelinjer som ble brukt omfattet P815 (H-2d) og LB27.4(H-2<bxd>), som var fra Amercian Type Culture Collection. Cellelinjen c1.18.5 (H-2<b>) var en gave fra Dr. William R. Green.

Polyklonal IgG produksjon in vitro: Milt fra kontrol og cGVHD mus ble tatt ut og suspensjoner av enkeltceller ble preparert. Celler ble behandlet med Tris-bufret ammoniumklorid for å fjerne røde blodlegemer og totalantall hvite blodlegemer ble telt med visuelt cytometer. Celler ble inkubert (5 x 106) i 1 ml komplett (c)RPMI-1640 medium (forsterket med 10% føtalt kalveserum (FCS) (Hyclone, Logan UT), 25 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 5000 U/ml penicillin og 5000 mg/ml streptomycin) i 3 dager ved 37°C og 5% C02. Kultursupernatanter ble samlet ved sentrifugering og lg ble målt med et isotype-spesifikt ELISA.

Isotypespesifikt og antigenspesifikt ELISA: ELISA for oppdagelse av lgG1 og IgA: Geit anti-mus lgG1 eller IgA (10 mikrogram/ml; Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham AL)

i fosfatbufret saltvann (PBS) ble adsorbert til brønner i en 96-brønns polyvinyl mikrotiterplate, først i 1 time ved 37°C, så over natten ved 4°C. Platene ble vasket og blokkert med PBS-1 % FCS i 1 time ved 37°C. Platene ble vasket igjen og de passende fortynninger av supematanter og standard kontroller (IgGJ.og IgA, Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham AL) ble tilsatt i 2 timer ved 37°C. Etter dette ble platene vasket 3 ganger og alkalisk fosfatase-konjugert anti-mus lgG1 eller IgA (1/500 fortynninger) (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham AL) ble tilsatt i 2 timer ved 37°C. Platene ble så grundig vasket og fosfatase substrat (1 mg/ml, Sigma Diagnostics, St. Louis MO) tilsatt til passende farveendring ble oppnådd. Avlesninger ble gjort i en ELISA avleser (Dynatech Laboratories Inc.) som absorbans ved 410 nanometer bølgelengde. Konsentrasjoner av lg ble bestemt ved sammenligning med den passende isotype standardkurve, og uttrykt som gjennomsnitt + standard feil (n=3).

ELISA for oppdagelse av IgE: Brønner i 96-brønns polyvinyl mikrotiterplater ble dekket med et anti-mus IgE bindingsantistoff (B1E3 (2 mg/ml)) over natten ved 4°G og så blokkert med PBS inneholdende 1%FCS i 1 time ved 37°C. Platene ble igjen vasket og de passende fortynninger av supematanter og standard kontroller (A3B1 (IgE)) ble tilsatt i 2 timer ved 37°C. Platene ble vasket grundig og EM95-Biotin (5 mg/ml) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 2 timer ved 37°C. Etter dette ble alkalisk fosfatase bundet til streptavidin tilsatt (1/500 fortynning) i en videre 2 timers inkubering, fulgt av grundig vask før fosfatase substrat (1 mg/ml, Sigma Diagnostics, St. Louis MO) ble tilsatt til passende endring av farve ble oppnådd. Avlesninger ble gjort i en ELISA avleser (Dynatech Laboratories Inc.) som absorbans ved 410 nanometer bølgelengde. Konsentrasjoner av lg ble bestemt ved sammenligning med standardkurve, og uttrykt som gjennomsnitt standard feil (n=3).

ELISA for oppdagelse av anti-DNA antistoff: Kalvethymus (Sigma, St. Louis, MO)

(5 ug/ml) ble løst i koblingsbuffer med 0.1 M natriumkarbonat/natrium bikarbonat (pH 9.8). Dette ble kokt i 10 minutter og så inkubert på is i tre minutter. Optisk tetthet (OD) aav DNA ble så bestemt og konsentrasjonen justert til ønsket 5 ug/ml. 100 pi ble tilsatt

brønnene i en 96 brønns polyvinyl mikrotiterplate og inkubert over natten ved 4°C. Platen ble vasket 3 ganger og blokkert i 1 time med PBS-1%FCS og 0,02% natriumazid. Platen ble igjen vasket og serifortynninger av serumprøver ble tilsatt (100 pl) og inkubert i 2 timer ved 37°C. Deteksjons-antistoffet, geit anti-mus lgG1 - alkalisk fosfatase ble tilsatt hver brønn og inkubert en gang til i 2 timer ved 37°C. Platene ble grunding vasket og fosfatase substrat (1 mg/ ml, Sigma Diagnostics, St. Louis MO) ble tilsatt til passende endring av farve ble oppnådd. Avlesninger ble gjort i en ELISA avleser (Dynatech Laboratories. Inc) somjabsorbans ved 410 nanometer bølgelengde. Titer av antistoff ble sammenlignet med positive serumprøver og resultater uttrykt i arbitrære enheter.

Flow cytometrisk analyse for oppdagelse av donor-deriverte celler: Milt ble tatt ut fra normale BDF1, cGVHD mus behandlet med og uten anti-gp39, og en enkeltcelle-suspensjon ble laget. Cellene ble lagt på Ficoll-Hypaque (4:1) og sentrifugert (2000 rpm i 20 minutter) ved romtemperatur. Det resulterende lymfocyttlag ble samlet og vasket en gang med BSS med 5% FCS. 1 x 10<6> celler per rør ble brukt for farging i et sluttvolum på 50 pl. 50 pl rotteserum ble tilsatt hvert rør for å forhindre nonspesifikk binding av antistoff. Celler ble farget med (a) kontroll antistoff: rotte lg FITC (1:100 sluttfortynning) og PE-Streptavidin (1:500 sluttfortynning) og (b) FITC H-2Kb og Biotin H-2Dd (begge i 1:100 sluttfortynning). Celler ble inkubert i 20 minutter på is, og så vasket to ganger for å fjerne ubundne antistoff. Tilslutt ble PE-Streptavidin (1:500 sluttfortynning) tilsatt til passende rør og holdt på is i 20 minutter, for å oppdage biotin-konjugérte antistoff. Celler ble igjen vasket to ganger, klare for analyse på en Becton Dickinson FACScan. Etter positiv sortering via fremover- og sidespredning ble 10000 hendelser pr. prøve samlet for bestemmelse av prosent celler positive for den relevante MHC haplotype.

Analyse av frisetting av krom for bedømmelse av CTL: Målceller merket med krom-51 ble vasket og utplatet (1 x 10<4> celler pr. brønn) i 96-brønns plater med effektor celler i E:T ratio på 100:1, 20:1 og 4:1. Målceller omfattet P815 (H-2<d>), LB27.4(H-2<bx>d) og d 1.5(H-2b). Platene ble kort sentrifugert og inkubert ved 37°C i 5% C02 i 4 timer. Etter ny sentrifugering ble en prøve fra cellefri supernatant ble samlet for analyse av radioaktivitet med gammatelling. Prosent spesifikk lysis er definert som (a-b)/c, der a=cpm frisatt av målceller inkubert med effektor celler (cpm, radioaktive 'counts per minute), b=cpm frisatt fra målceller inkubert bare med medium (dvs. spontan frisetning) og c=frosset-og-tint frisettbar cpm fra målceller (ca. 80% av de total cpm innkorporert).

Sekundær stimulering av akutt GVDH-miltceller in vitro:

Akutt GVHD milt ble tatt ut fra anti-gp39 behandlete Hlg-behandlete eller ubehandlete dyr. Miltene ble gjort fri for røde blodlegemer og så fordelt med 1 x 10<4> celler/brønn. Bestrålte stimulator celler (P815) ble tilsatt de relevante brønner. Etter

7 dager ble CTL analyse gjort mot de passende målceller som beskrevet.

Resultater:

GVHD i mus gir splenomegali (forstørret milt). I mus er en av konsekvensene av cGVHD at milten forstørres. Det er hovedsaklig vertens egne celler som infiltrerer og forstørrer milten, selv om dette er en respons på tilstedeværelsen av donorceller (Rolink A.G et al. (1983) J. Exp. Med. 158, 546). Figur 5 indikerer at 7-14 dager etter påbegynt cGVHD inneholder milten nesten dobbelt så mange hvite blodlegemer som mus uten cGVHD. Behandling av mus ved påbegynnelsen av cGVHD med anti-gp39 (250 ug/mus) på dag 0, 2,4 og 6 reduserte tall hvite blodlegemer pr. milt i cGVHD musene til nivåer identiske med de funnet hos mus uten sykdom.

GVHD-indusert overproduksjon av polyklonalt Immunglobulin. Det har blitt rapportert at overproduksjon av lg forekommer hos mus med cGVHD, fremkalt av spesifikk interaksjon mellom donor T-celler og B-celler (Morris S.E. et al. (1990) J. Exp. Med. 171, 503). For å bestemme om anti-gp39 hemmer lg overproduksjon fikk mus med cGVHD tilført anti-gp39. På dag 7 eller 14 ble milt fjernet fra kontroll og cGVHD mus og B-cellene ble analysert for deres spontanproduksjon av lgG1 og IgA in vitro. Miltceller fra mus med cGVHD produserte høye nivåer av IgA og lgG1 (Figur 6A og 6B) in vitro.

Imidlertid produserte miltceller fra mus med cGVHD som var behandlet med anti-gp39

(dag 0, 2, 4 og 6) nivåer av IgA og lgG1 som var identiske med de fra mus uten sykdom. Tilsetning av anti-gp39 til miltcellekulturer fra mus med cGVHD førte ikke til reduksjon av in vitro lg produksjon, antydende at anti-gp39 utøvet sin effekt in vivo.

Dersom hamster lg (Hig) ble brukt som kontroll i disse eksperimenter ble det funnet at dette ikke hadde noen inhibitorisk effekt mot induksjon av GVHD, og snarere forsterket sykdommen, ikke bare i form av polyklonal lg produksjon men også i den resulterende splenomegali. En 8-gangers økning ble funnet i nivået av lg produsert av en ukes Hlg-behandlete GVHD-induserte mus, sammenlignet med ubehandlete en ukes GVHD-induserte mus. Det syntes klart at Hig selv virket som et immunogen. Det ble derfor avgjort at den ubehandlete F1 mottagermus skulle betegnes som den relevante kontrollgruppe.

Effekt av anti-gp39 på GVHD-indusert serum Hyper-lgE og anti-DNA autoantistoff.

Utvikling av cGVHD kan følges ved å følge økning i serum IgE og antistoff mot DNA

(Morris S.E. et al. (1990) J. Exp. Med. 171, 503). Kronisk GVHD-induserte mus ble derfor behandlet med anti-g p39 på dag 0. 2, 4 og 6. hvoret ter antistoff ikke ble gitt. Mus ble så

tappet for blod med en ukes intervaller og IgE nivåer ble målt (Fig. 7A). cGVHD induserer en 10-15 gangers økning i serum IgE nivåer. Tilførsel av anti-gp39 hemmet cGVHD-induserte økninger i serum IgE i opptil åtte uker etter påbegynt sykdom. I tillegg til denne hemning av øket IgE blokkerte tilførsel av anti-gp39 også dannelsen av serum anti-DNA autoantistoff. Kronisk GVHD induserer en 5-10 gangers økning av ant-DNA antistoff, som ble redusert av behandling med anti-gp39 (Fig. 7B).

Tidligere studier har vist at anti-gp39 (MR1 klone) har en halveringstid på 12 dager (Foy T.M. et al., (1993) J. Exp. Med. 178, 1567-1575). ELISA assay spesifikke for anti-gp39 indikerte at det tilførte anti-gp39 antistoff ikke kunne påvises i serum hos de

behandlete mus 8 uker etter behandling. Derfor kan ikke vedvarende mengder av anti-gp39 forklare den langvarige hemmende effekt av cGVHD. Overføringsstudier ble utført for å studere om miltceller fra mus med cGVHD og de som hadde fått anti-gp39 kunne overføre cGVHD. Miltceller fra mus med cGVHD og behandlet med anti-gp39 var ikke istand til å fremkalle forhøyete serumnivåer av IgE og anti-DNA autoantistoff etter overføring; mens miltceller fra mus med cGVHD fremkalte økte slgE og anti-DNA antistoff. Disse resultater antyder at de alloreaktive T-cellene hadde blitt indusert til å bli nonresponsive som et resultat av behandling med anti-gp39.

Deteksjon av alloreaktive donorceller. Analyse av cGVHD-induserte mus m.h.p. tilstedeværelse av donor-deriverte celler i milten viste, ved sammenligning med normal BDF1 som farves dobbelpositive for H-2Kb og H-2Dd, at cGVHD milt hadde ca. 5-7% donor celler. Disse celler kommer fra DBA/2 og farver derfor enkeltpositive for H-2Dd. Disse cellene ble funnet uansett behandling med anti-gp39 eller ikke. Dette illusterer poenget at anti-gp39 behandling tillater transplantasjon av donorceller uten at noen av de hjelperfunksjonene for mottager B-cellene fremkalles som i den ubehandlete cGVHD gruppen fører til polyklonal lg produksjon.

Effekt av anti-gp39 behandling på induksjon av akutt GVHD. Akutt GVHD er assosiert med induksjon av øket anti-allogen CTL respons. Mens det er klart at gp39-CD40 interaksjoner er viktige for Th-B-celleinteraksjoner, er det ikke klart om induksjon av andre immun effektormekanismer også kan være endret i anti-gp39 behandlete dyr. aGVHD ble indusert ved tilførsel av C57BL/6 miltceller til F1 mottagerne. Som vist i Figur 8 kan det 12 dager etter overføringen av allogene celler påvises.en robust H-2b antiH-2d CTL respons. Behandling av musene med anti-gp39, men ikke med Hig, forhindret dannelsen av H-2b anti-H-2d CTL (Figur 8). I ett av to eksperimenter reduserte behandling med anti-gp39 CTL responsen til under den som ble observert med naturlige miltceller. Dette antyder at miltceller fra en GVHD mus, når den utsettes for. Dersom disse miltceller så dyrkes i 7 dager i tilstedeværelse av bestrålte P815 celler og deretter testes i en CTL analyse viser det seg at disse celler ikke gir en sekundær stimulering overfor P815 cellene, mens de normale BDF1 miltceller gir en normal primær respons. De ubehandlete aGVHD musene gir som forventet en sekundær immunrespons. Disse resultater indikerer at behandling av akutt GVHD mus med anti-gp39 gjør GD8+ populasjonen nonresponsive overfor en sekundær stimulering.

Diskusjon

Reversering av miltforstørrelse (Figur 5), inhibering av overproduksjon av lg (Figurene 6A og 6B), inhibering av serumnivåene for IgE og anti-DNA autoantistoff produksjon (Figurene 7A og 7B) i GVH-induserte mus ved tilførsel av anti-gp39 antyder at anti-gp39 blokkerte evnen de overførte T-celler har til å aktivere vertens B-celler. Denne inhibering av miltforstørrelsen og polyklonal lgG1 og IgA produksjon forble lav 7 dager etter avslutning av antistofftilførsel. Reduksjon av IgE og anti-DNA antistoff vedvarer 8 uker selv omm behandlingen blir avsluttet. Disse resultater indikerer at T-celle funksjon har blitt affisert, enten ved klonal delesjon av de reaktive T-celler eller at T-celle anergi har oppstått. Det har tidligere blitt vist i in situ studier på immuniserte mus (Van den Eertweg et al. (1993) J. Exp. Med. 178,1555-1565) at nivåer på cytokinproduserende celler forblir normalt i antistoff-behandlete mus. Dette indikerer at T-celler ikke blir fjernet som en konsekvens av behandlingen. Når cGVHD mus ble analysert m.h.p tilstedeværelse av donor-deriverte celler blir disse funnet å være tilstede, enten dyret er behandlet med anti-gp39 eller ikke. Anti-gp39 har således evnen til å indusere en ikkeresponiv tilstand i disse donor T-celler, og fremkalle en inhibisjon av antistoffresponser. Dersom milt fra disse dyr blir overført til naturlige mottagere er antistoffnivåer faktisk forøket når donormiltene er ubehandlet cGVHD, men anti-gp39-behandlete cGVHD mus er ute av stand til å reagere med en sekundær cGVHD tilstand etter overføring. Disse data tyder på at anti-gp39 interferer med T-cellers evne til å __fremkalle en sterk GVHDJdinisk immunpatologi og miltforstørrelse at antistoff-tilførsel fremkaller manglende respons i CD4+ subpopulasjonen.

Det har blitt rapportert at hjelp fra B-celler er nødvendig for induksjon av CTL, som vist ved å studere induksjon av beskyttende T-celle immunitet overfor en Friend museleukemivirus-indusert leukemi hos mus som mangler B-celler (Schultz K.R. et al.

(1990) Science 249). Det synes således mulig at anti-gp39 i en aGVHD-indusert mus

hemmer aktivering av B-celler og således forhindrer antigen presentasjon, og derved forbereder CD8+ T-cellene. Det har også blitt antydet at dannelse av CD8+ CTL krevet interaksjom med klasse ll-begrensete Th celler (von Boehmer H. et al. (1979) J. Exp. Med. 150,1134; Keene J, et al. (1982) J. Exp. Med. 155, 768) og at nårTCR affiniteten er lav er CD4+-mediert T-cellehjelp nødvendig in vivo (Gao X. et al. (1991) J. Immunol.

147,3268):"-- "

Studier har blitt utført som har sett på rollen som interaksjon mellom CD28-B7/BB1 har i induksjon av CD8+ CTL responser. Det ble funnet at CD28-B7/BB1 interaksjoner var nødvendige og tilstrekkelige for dannelse av klasse I MHC-spesifikk CTL (Harding F.A. and Allison J.P. (1993) J. Exp. Med. 177,1791). Det har blitt antydet at liganden for CD40 kan være en viktig stimulator for B7 (Ranheim E.A. arid Kipps, T.J.

(1993) J. Exp. Med. 177, 925) som vist med studier som dreier seg om evnen antistoff

mot CD40 har i å fremkalle inhibisjon av B7 ekspresjon på normale og leukemiske B-celler. Sammenfattet indikerer disse studier at anti-gp39 kan blokkere interaksjonen mellom CD4+ T-celler og B-celler, som således ikke er istand til å indusere ekspresjon av B7 som tillater en B-celle å effektivt aktivere en T-celle til proliferasjon og cytokinproduksjon. Sammenfattet indikerer disse resultater at CD4+ T-celler er nødvendige for induksjon av CTL først ved T-B celle interaksjon mellom gp39 og dets ligand CD40. Signaloverføring fra CD40 til B-cellene tillater deretter oppregulering av

B7/BB1. Resiprok interaksjon mellom B7/BB1 og dets ligand CD28 på T-cellene tillater deretter en øket T-celle proliferasjon og produksjon av cytokiner. Dersom imidlertid bare et signal kommer til T-cellene, dvs. gp39 interaksjon med CD40, mens det sekundære signal uteblir, da inntrer en manglende evne til respons i T-cellen og den utvikler toleranse og anergi.

Disse studier indikerer at når aGVHD blir indusert i mus får man en anti-H-2d respons. Dersom imidlertid dyrene blir behandlet med anti-gp39 vil ingen CTL respons _oppstå. Det S7.nes_klart_at^nti-gp_39 binding hemmer CTL dannelsen ved en metode som tidligere er beskrevet (Schultz K.R. et al. (1990) Science 249). B-cellen blir ikke aktivert via bindingen til CD40 og er derfor ikke istand til å fremme induksjon av CTL. Videre viser våre studier at når miltceller blir stimulert med P815 celler in vitro ble cellene som hadde blitt utsatt for anti-gp39 in vivo funnet ikke å være istand til å produsere en sekundær anti-H-2d CTL. Dette kan indikere at anti-gp39 har indusert en tolerant situasjon for T-cellene siden gp39 ikke er istand til å binde CD40, og det er derfor ingen B7/BB1 oppregulering og T-cellene får således ingen videre stimulering og forblir ikke-responsive. Det er også kjent at hvilende B-celler generelt er ikke er effektive i å stimulere allogene T-celler i den blandete lymfocyttreaksjon dersom de ikke er preaktiverte med anti-lgM : antistoff, PMA eller LPS (Inaba K. and Steinman R.M (1989) J. Exp. Med. 160,1717; Metley J.P. et al. (1989) J. Exp. Med. 169, 239; Frohman M. and Cowing C. (1985) J. Immunol. 134, 2269). I tillegg kan løselige monomere antigener rettet mot B-celler for presentasjon in vivo resultere i spesifikk T-celle anergi (Eynon E.E. and Parker D. (1992) J. Exp. Med. 175,131). Det synes derfor klart at anergi eller toleranse kan induseres, avhengig av måten antigen blir tilført og hvilke typer APC som er innblandet. Etter stimulering av CD8+ T-celler i milt med P815 celler er B-celler ikke nødvendige for antigenpresentasjon, og alloantigen kan således bli presentert direkte og CTL kan induseres. Den manglende respons hos milten til sekundær stimulering indikerer at allospesifikk toleranse har blitt indusert i dette systemet.

Dette er i motsetning til tidligere resultater (Foy T.M. et I. (1993) J. Exp. Med. 178, 1567-1575), som indikerte at toleranse ikke induseres av antistoffet via en antigenspesifikk reaksjon. De to systemene er ulike, siden aGVHD modellen presenterer alloantigener som allerede er bundet til antigenpresenterende celler, mens antigenet i de antigenspesifikke systemene blir tilført og tatt opp in vivo, bearbeidet og presentert av profesjonelle APC. Det synes således som om anti-gp39 kan ha ulike effekter avhengig av antigen som blir brukt og presentasjonsmetoden.

Det kan konkluderes med at anti-gp39 kan indusere allospesifikk toleranse i både CD4+ og CD8+ deler av immunsystemet, og dette kan være en klårt effektiv terapeutisk intervensjon når man vurderer transplantasjonsimmunologi og immunterapi. I tilfelle av behandling av pasienter som skal gjennomgå benmargstransplantasjon er det mulig at anti-gp39 terapi vil kunne være tilstrekkelig for å indusere toleranse mot transplantatet og for å hindre induksjon av slike transplantasjonskonsekvenser som GVHD.

EKSEMPEL 6: Produksjon og Karakterisering av Ånti-gp39

Antistoff

Eksperiment 1 - Antistoff rettet mot humant gp39

For å indusere antigenspesifikk T-celle toleranse i et menneske er det fordelaktig å tilføre et antistoff rettet mot humant gp39. Den følgende metode ble brukt for å produsere mus anti-humant gp39 monoklonale antistoff. Balb/c mus ble immunisert med et løselig gp39 fusjonsprotein, gp39-CD8, i komplett Freunds adjuvans (CFA). Musene ble deretter stimulert 6 uker senere med løselig gp39-CD8 i inkomplett Freunds adjuvans (IFA); løselig gp39-CD8 ble så gitt i løselig form 4 uker etter den sekundære immunisering. Musene ble deretter stimulert med aktiverte humane blod lymfocytter 2 uker senere, og dette ble fulgt av en avsluttende stimulering med løselig gp39-CD8 etter ytterliger 2 uker. Miltceller ble fusjonert med NS-1 fusjonspartner på dag 4 etter den siste immunisering, etter standard protokoller.

Kloner som produserte anti-humant gp39 antistoff ble selektert basert på en multippel utvalgsprosess. Klonene ble først analysert med en plate-bindingsmetode, med bruk av gp39-CD8. Positive kloner ble så testet mot et kontrol CD8 fusjonsprotein, CD72-CD8. Kloner som var positive på denne siste test ble eliminert. De gjenværende kloner ble deretter analysert v.h.a. flow cytometri på hvilende og 6-timers aktiverte humant perifert blodlymfocytter (PBL). Hybridomer som farget aktive, men ikke hvilende, PBL ble definert som positive. Tilslutt ble de gjenværende kloner testet m.h.p. deres evne til å blokkere binding av CD40lg til platebundet gp39.

Omtrent 300 kloner ble først testet mot gp39-CD8 og CD72-CD8 i platebindingsprøven. Av disse ble 30 kloner funnet å gjenkjenne platebundet gp39, men ikke CD8. Disse kloner ble deretter testet for deres evne til å gjenkjenne gp39 på aktiverte humane PBL. Omtrent 15 kloner gjenkjente et molekyl på aktiverte, men ikke på hvilende PBL. Spesifisitet ble videre bekreftet ved å bestemme evnen klonene hadde til å blokke CD40lg binding til platebundet gp39. 3 av 10 kloner som ble tested hadde evnen til å blokke CD40lg binding i denne test. Disse kloner var 3E4, 2H5 og 2H8. Slike kloner er å foretrekke til bruk i metodene bekrevet her. Kloner som testet positivt på aktiverte men ikke hvilende PBL ble også undersøkt m.h.p. deres reaktivitet med en aktivert rotte T-celle klone, POMC8. Klone 2H8 viste kryssreaktivitet med denne cellelinje fra rotte.

Eksperiment 2 - Antistoff rettet mot humant gp39

En lignende immuniseringsprosedyre som den beskrevet i Eksperiment 1 ble brukt for å fremskaffe ytterligere antistoff rettet mot humant gp39. En Balb/c mus ble immunisert med løselig gp39-CD8 i CFA, fulgt etter 4 uker av stimulering med 6 timer-stimulerte humane lymfocytter fra perifert blod. Musen fikk deretter forsterkingsstimulering med løselig gp39-CD8 4 dager før fusjon av miltceller med NS-1 fusjonspartner etter standard protokoller. Utvelging av hybridom kloner ble gjort med flow cytometri-farging av 6 timers aktiverte humane PBL. Kloner som farget aktiverte, men ikke hvilende, humane PBL ble valgt. Seks kloner benevnt 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 89-76 og 89-79 ble valgt for videre studier.

Spesifisiteten av de utvalgte antistoff ble bekreftet med flere tester. Først viste flow cytometri at alle seks monoklonale antistoff farget aktiverte, men ikke hvilende T-celler fra perifert blod (se Figur 9B og 9C for et representativt eksempel som viser farging av aktiverte T-celler med henholdsvis 4D9-8 og 4D9-9). Ekspresjon av molekylet som ble gjenkjent av hvert av de seks antistoff kan påvises innen 4 timer etter aktivering, er maksimal mellom 6-8 timer etter aktivering og kan ikke poåvises

24 timer etter aktivering. Alle seks monoklonale antistoff gjenkjenner et molekyl som uttrykkes på aktiverte CD3+ PBL, fortrinnsvis CD4+ fenotypen, men en del av CD8+ T-celler uttrykker også molekylet. Ekspresjon av molekylet om gjenkjennes av de seks monoklonale antistoff hemmes av tilstedeværelsen av cyclosporin A i dyrkingsmediet, som også ekspresjon av gp39 er det (se Figur 10A og 10B for et representativt eksempel, som viser farging av cyclosporin-behandlete T-celler med henholdsvis 4D9-8 og 4D9-9). I en ELISA analyse gjenkjente alle seks monoklonale antistoff gp39-CD8, en løselig fusjonsproteinsform av gp39 molekylet. Videre immunpresipiterte alle seks mmonoklonale antistoff fra 35S-methionin-merket aktiverte humane PBL et molekyl med tilnærmet 36 kilodalton molekylmasse. Det immunpresipiterte molekyl er identisk med det som ble presipitert av det humane CD40lg fusjonsproteinet.

Den funksjonelle aktivitet til de seks utvalgte monoklonale antistoff (4D9-8,4D9-9, 24-31, 89-76 og 89-79) ble tested som følger. Først ble antistoffenes evne til å hemme proliferasjon av rensete humane B-celler dyrket med IL-4 og løselig gp39 målt. Rensete humane B-celler ble dyrket med gp39 og IL-4 i nærvær eller fravær av rensete monoklonale antistoff elleer CD40lg i doser mellom 0 og 12,5 ug/ml. B-celle proliferasjon ble bestemt etter 3 dager i kultur ved thymidin-inkorporering. Reultåtene (vist i Figur 12) viser at alle seks monoklonale antistoff kan hemme B-celle proliferasjon som er indusert av gp39 og IL-4. Monoklonale antistoff 89-76 og 24-31 var de mest effektive i å hemme den induserte proliferasjonen av B-celler. IC5o (konsentrasjonen av antistoff nødvendig for å hemme B-celle proliferasjon med 50%) var ca. 1 ug/ml for 89-76 og 1,25 ug/ml for 24-31.

Videre ble antistoffenes evne i å hemme B-celle differensiering, målt som lg produksjon indusert av anti-CD3 aktiverte T-celler og IL-2, studert. Rensete lgD+ humane B-celler ble preparert med positiv seleksjon med FACS og deretter dyrket med anti-CD3 aktiverte humane T-celler (behandlet med mitomycin C) og IL-2 i 6 dager i nærvær og fravær av rensete anti-gp39 monoklonale antistoff i doser mellom 0 og 10 ug/ml. IgM, IgG og IgA produksjon ble tested med ELISA på dag 6. Resultatene (vist i Tabell 3) viser at alle seks antistoff kan hemme T-celle-avhengig B-celle diffe-rensiering, målt som IgM, IgG og IgA produksjon. IC5o (konsentrasjonen av antistoff nødvendig for å hemme B-celle proliferasjon med 50%) var i området mellom 1 ug/ml og 0,1 ug/ml for de seks monoklonale antistoff, inkluderende 89-76 og 24-31 antistoffene.

For å studere antistoffenes effekter på T-celle responser ble monoklonale antistoff inkludert i standard "blandet-lymfocytt reaksjoner" (MLR). 300000 humane perifere blodlymfocytter (respondere = R) ble dyrket sammen med 100000 bestrålte allogene perifere blod lymfocytter (stimulatorer = S) i nærvær og fravær av anti-gp39 monoklonale antistoff (10 ug/ml). Kulturer ble 'pulset' med 3H-thymidin på dag 4,5 eller 6 og høstet 18 timer senere. Alle seks monoklonale anti-human gp39 antistoff hemmet allospesifikke responser, målt som MLR (se Figur 13 for et representativt eksempel, som viser inhibisjon av allospesifikke responser der R og S er inkubert i nærvær av 24-31 eller 89-76; et CTLA4-immun-globulin fusjonsprotein og et anti-Cd28 monoklonalt antistoff ble brukt som positive kontroller).

For å bestemme om de seks monoklonale antistoff gjenkjente ulike epitoper på det humane gp39 molekyl ble eksperimenter med kryssblokking utført. Aktiverte humane PBL ble først blokkert med hvert av de seks monoklonale anttistoff (25 ug/ml av ukonjugert antistoff). Cellene ble så vasket og farget med 10 ug/ml av biotin-konjugert antistoff, fulgt av reaksjon med phytoerythrin-konjugert avidin (PE-Av). Farging av cellene med PE-Av ble analysert med FACS. Resultatene vises i Tabell 4.

Alle antistoff blokkerte binding av CD40lg til aktiverte humane PBL. Imidlertid viser data i Tabell 4 klart at noen av antistoffene ikke blokker bindingen av andre antistoff til aktiverte humane PBL, noe som antyder at de gjenkjenner ulike epitoper på de humane gp39 molekyler.

89-76 og 24-31 hybridorhene som produserer henholdsvis 89-76 og 24-31 antistoffene ble plassert under betingelsene i Budapestavtalen hos American Type Ciilture Collection, Parklawn Drive, Rockville, MD, den 2. september 1994. 89-76 hybridomet ble gitt ATCC tilgangsnummer HB 11713 og 24-31 hybridomet ble gitt ATCC tilgangsnummer HB 11712. Både 24-31 og 89-76 antistoffene er av lgG1 isotype.

Eksperimént 3 - Antistoff rettet mot mus gp39

I en versjon av oppfinnelsen er gp39 antagonisten et anti-mus gp39 monoklonalt antistoff, MR1. Den følgende metode ble brukt for å produsere MR1.

Hamstere ble immunisert i bukhulen med 5x10<6> aktiverte Th1 celler (d1.6) i ukentlige intervaller, totalt i seks uker. Da serumtiter mot mus Th1 var større enn ca.

1 ;10000 ble cellefusjon utført med polyethylenglykol, med bruk av immune hamster miltceller og NS-1. Supernatant fra brønner som inneholdt voksende hybridomer ble undersøkt med flow cytometri på hvilende og aktiverte Th1. Et spesielt hybridom som produserte et monoklonalt antistoff som selektivt gjenkjente aktiverte Th ble testet videre og subklonet for å produsere MR1. MR1 ble produsert i bukhukevæske og renset med jonebytter HPLC. Et hybridom MR1 har blitt plassert hos American Type Culture Collection og gitt ATCC tilgangsnummer HB11048.

EKVIVALENTER

De som er kyndige i faget vil forstå, eller vil være istand til å overbevise seg ved hjelp av rutineeksperimenter, at mange likeverdige versjoner av de spesifikke versjoner som er beskrevet her eksisterer.

Claims (13)

1. Anti-humant gp39 monoklonalt antistoff eller fragment derav, karakterisert ved at det omfatter det monoklonale antistoffet oppnådd fra hybridom 24-31 (ATCC HB 11712) eller innehar den samme epitopiske bindingsspesifisitet og omtrent den samme bindingsaffiniteten til gp39 som det monoklonale antistoffet oppnådd fra hybridom 24-31 (ATCC HB 11712).

2. Kimært eller humanisert anti-humant gp39 antistoff, karakterisert ved at det er ifølge krav 1.

3. Anti-humant gp39 monoklonalt antistoff ifølge krav 1 eller krav 2, karakterisert ved at det hemmer B celle proliferasjonen i en standard in vitro analyse med en ICso på mellom 0,01 og 5,0 ug/ml.

4. Anti-humant gp39 monoklonalt antistoff ifølge krav 3, karakterisert ved at det hemmer B celle proliferasjonen i en standard in vitro analyse med en IC50 på mellom 0,1 og 2,5 ug/ml.

5. Anti-humant gp39 monoklonalt antistoff ifølge krav 4, karakterisert ved at det hemmer B celle proliferasjonen i en standard in vitro analyse med en IC50 på mellom 0,1 og 1,25 Mg/ml.

6. Anti-humant gp39 monoklonalt antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 3 til 5, karakterisert ved at B celle proliferasjonen blir indusert in vitro av behandlende B celler med interleukin-4 og oppløselig gp39.

7. Anti-humant gp39 monoklonalt antistoff ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, karakterisert ved at det hemmer B celle produksjonen av IgM, IgG eller IgA i en standard in vitro analyse med IC50 på mellom 0,01 og 1,0 ug/ml.

8. Anti-humant gp39 monoklonalt antistoff ifølge krav 7, karakterisert ved at det hemmer B celle produksjonen til IgM, IgG eller IgA i en standard in vitro analyse med en IC50 på mellom 0,01 og 0,1 ug/ml.

9. Anti-humant gp39 monoklonalt antistoff ifølge krav 7 eller krav 8, karakterisert ved at B celle produksjonen til IgM, IgG eller IgA blir indusert av dyrkende B celler med anti-CD3 aktiverte T-celler.

10. Anti-humant gp39 monoklonalt antistoff, karakterisert ved at det blir produsert av hybridom 24-31 (ATCC HB 11712).

11. Hybridom eller cellelinje, karakterisert ved at det produserer et anti-humant gp39 monoklonalt antistoff ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene.

12. Hybridom 24-31 (ATCC HB11712).

13. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at ved at det inneholder et anti-humant gp39 monoklonalt antistoff eller fragment ifølge et hvilket som helst av kravene 1-10 og en farmasøytisk akseptabel bærer.