ES2277460T3 - Cadena del receptor de la citoquina. - Google Patents
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Abstract
El uso de un antagonista de IL-13 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una condición asociada con la IL-13 en un sujeto mamífero, en donde dicho antagonista es un anticuerpo contra la IL-13 o un fragmento de estos se une a la IL-13 y en donde dicha condición asociada con la IL- 13 es la atopia, una condición alérgica, el asma, una enfermedad del complejo antígeno-anticuerpo, una condición inflamatoria de los pulmones, inmunodeficiencia, o el cáncer.
Description
Cadena del receptor de la citoquina.
La presente invención se relaciona con el uso de
un antagonista de IL-13 en la fabricación de un
medicamento para tratar una condición asociada con la
IL-13 en un sujeto mamífero, en donde dicho
antagonista es un anticuerpo contra IL-13 o uno de
sus fragmentos de enlace de la IL-13 y en donde
dicha condición relacionada con IL-13 es la atopia,
una condición alérgica, el asma, una enfermedad del complejo
antígeno-anticuerpo, una condición inflamatoria de
los pulmones, inmunodeficiencia, o el cáncer.
Una variedad de moléculas reguladoras, conocidas
como citoquinas, han sido identificadas incluyendo la
interleucina-13 (IL-13). Varias
formas de proteínas de IL-13 y el ADN que codifica
varias formas de actividad de la IL-13 se describen
en McKenzie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3735
(1993); Minty et al., Nature 362:248 (1993); y Aversa et
al., WO94/04680. De tal manera, el término
"TL-13" incluye las proteínas que tienen la
secuencia y/o actividad biológica descritas en estos documentos,
tanto si se producen por técnicas de ingeniería genética
recombinante; se purifican de fuentes de células que producen el
factor naturalmente o bajo la inducción con otros factores; como
sintetizadas por técnicas químicas; o una combinación de lo
precedente.
La IL-13 es una citoquina que
ha sido implicada en la producción de varias actividades biológicas
incluyendo: inducción de IgG4 e intercambio de IgE, incluyendo en
células B inmaduras humanas (Punnonen et al., J. Immunol.
152:1094 (1994)); inducción de la transcripción de la cadena pesada
de la línea germinal IgE (\varepsilon) y la expresión de CD23 en
células B humanas normales (Punnonen et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90:3730 (1993)); e inducción de la proliferación de
la célula B en la presencia de CD40L o y-CD40 mAb
(Cocks et al., Int. Immunol. 5:657 (1993)). A pesar de que
varias actividades de la IL-13 son similares a
aquellas de la IL-4, en contraste con IL- 4, la
IL-13 no tiene crecimiento que promueva los efectos
sobre las células T activadas o los clones de la célula T (Zurawski
et al, EMBO J. 12:2663 (1993)).
Como la mayoría de las citoquinas, la
IL-13 muestra ciertas actividades biológicas
interactuando con un receptor IL-13
("IL-13R") sobre la superficie de las células
blanco. La IL-13R y el receptor
IL-4 ("IL-4R") comparten un
componente común, el cual se requiere para la activación del
receptor; sin embargo, la IL-13 no se une a las
células transfectadas con la IL-4R 130 kD (Zurawski
et al., supra). De esta manera, la IL-13R
debe contener al menos otra cadena de enlace al ligando. Los
receptores de la citoquina comúnmente se componen o de dos o tres
cadenas. La clonación de una cadena de enlace al ligando para
IL-13 se ha reportado recientemente (Hilton et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:497-501).
Sería deseable identificar y clonar la secuencia
para cualquier otra cadena de enlace para la IL-13
de IL-13R a fin de que las proteínas
IL-13R puedan ser producidas por varias razones,
incluyendo la producción de terapéuticos y de selección para los
inhibidores del enlace de la IL-13 con el receptor y
la señalización del receptor.
La presente invención proporciona el uso de un
antagonista de la IL-13 en la fabricación de un
medicamento para tratar una condición asociada con la
IL-13 en un sujeto mamífero, en donde dicho
antagonista es un anticuerpo contra IL-13 o uno de
sus fragmentos de enlace de la IL-13 y en donde
dicha condición relacionada con la IL-13 es la
atopia, una condición alérgica, el asma, una enfermedad del complejo
antígeno-anticuerpo, una condición inflamatoria de
los pulmones, inmunodeficiencia, o el cáncer.
Otro aspecto de la invención es el uso de un
antagonista de la IL-13 en la fabricación de un
medicamento para inhibir la interacción de la IL-13
con una proteína IL-13bc en una condición
seleccionada de la atopia, una condición alérgica, el asma, una
enfermedad del complejo antígeno-anticuerpo, una
condición inflamatoria de los pulmones, inmunodeficiencia, o el
cáncer, en donde dicho antagonista es un anticuerpo contra
IL-13 o uno de sus fragmentos de enlace de la
IL-13.
También se describen los polinucleótidos que
codifican las cadenas de enlace de la IL-13 del
receptor de la interleucina-13 se revelan,
incluyendo sin limitación aquellos de los receptores murina y
humano. En ciertas modalidades, la invención proporciona un
polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos
seleccionada del grupo que consiste de:
- (a)
- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 del nucleótido 256 al nucleótido 1404;
- (b)
- la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleótido 103 al nucleótido 1242;
- (c)
- una secuencia de nucleótidos que varía de la secuencia de la secuencia de nucleótidos especificada en (a) o (b) como un resultado de degeneración del código genético;
- (d)
- una secuencia de nucleótidos capaz de hibridizar bajo condiciones rigurosas al nucleótido especificado en (a) o (b);
- (e)
- una secuencia de nucleótidos que codifica una especie homóloga de la secuencia especificada en (a) o (b): y
- (f)
- una variante alélica de la secuencia de nucleótidos especificada en (a) o (b).
Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos
codifica una proteína que tiene una actividad biológica del receptor
IL-13 humano. La secuencia de nucleótidos puede
estar unida operablemente a una secuencia control de expresión. En
las modalidades preferidas, el poli nucleótido contiene la secuencia
de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 del nucleótido 256 al nucleótido
1404; la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 del nucleótido
319 al nucleótido 1257; la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID
NO:1 del nucleótido 1324 al nucleótido 1404; la secuencia de
nucleótidos de la SEQ ID N0:3 del nucleótido 103 al nucleótido 1242;
la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:3 del nucleótido 178 al
nucleótido 1125; o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:3 del
nucleótido 1189 al nucleótido 1242.
Adicionalmente se describen los polinucleótidos
aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un
péptido o proteína que comprende una secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo que consiste de:
- (a)
- la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2;
- (b)
- la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 de los aminoácidos 22 a 334;
- (c)
- la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 de los aminoácidos 357 a 383;
- (d)
- la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4;
- (e)
- la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N0:4 de los aminoácidos 26 a 341;
- (f)
- la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 de los aminoácidos 363 a 380; y
- (g)
- los fragmentos de (a)-(f) que tienen una actividad biológica de la cadena de enlace del receptor IL-13. Otras modalidades preferidas codifican la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 de los aminoácidos 1 a 331 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 de los aminoácidos 26 a 331.
Las células huésped, preferiblemente las células
de mamífero, transformadas con los polinucleótidos también se
describen.
También se describe en esta un procedimiento
para producir una proteína IL-13bc. El procedimiento
comprende:
- (a)
- el crecimiento de un cultivo de la célula huésped de la presente invención en un medio de cultivo apropiado; y
- (b)
- la purificación de la proteína humana IL-13bc a partir del cultivo.
Las proteínas producidas de acuerdo con estos
métodos también se proporcionan.
La presente invención también proporciona una
proteína IL-13bc aislada que comprende una secuencia
de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de:
- (a)
- la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2;
- (b)
- la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 de los aminoácidos 22 a 334;
- (c)
- la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 de los aminoácidos 357 a 383;
- (d)
- la secuencia de aminoácidos de la SEQ IID NO: 4;
- (e)
- la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 de los aminoácidos 26 a 341;
- (f)
- la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N0:4 de los aminoácidos 363 a 380; y
- (g)
- los fragmentos de (a)-(f) que tienen actividad biológica de la cadena de enlace de receptor IL-13.
Preferiblemente la proteína comprende la
secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; la secuencia del
aminoácido 22 a 334 de la SEQ ID NO: 2; la secuencia de la SEQ ID
NO: 4; o la secuencia del aminoácido 26 a 341 de la SEQ ID NO: 4. En
otras modalidades preferidas, la secuencia de aminoácidos
especificada adicional es parte de una proteína de fusión (con una
secuencia de aminoácidos no derivada de la IL-13bc).
Las proteínas de fusión preferidas comprenden un fragmento del
anticuerpo, tal como un fragmento de Fe. Particularmente las
modalidades preferidas comprenden la secuencia de aminoácidos de la
SEQ ID NO: 2 de los aminoácidos 1 a 331 y la secuencia de
aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 de los aminoácidos 26 a 331.
También se describen, las composiciones
farmacéuticas que comprenden una proteína de la presente invención y
un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Adicionalmente se describen las composiciones
que comprenden un anticuerpo que reacciona específicamente con una
proteína según lo descrito en esta.
Los métodos de identificación de un inhibidor
del enlace de la IL-13 con la
IL-13bc o el receptor IL-13 también
se describen. Estos métodos comprenden:
- (a)
- la combinación de una proteína IL-13bc o de uno de sus fragmentos con la IL-13 o un fragmento de esta, dicha combinación forma una primera mezcla de enlace;
- (b)
- la medición de la cantidad de enlace entre la proteína y la IL-13 o el fragmento en la primera mezcla de enlace;
- (c)
- la combinación de un compuesto con la proteína y la IL-13 o un fragmento para formar una segunda mezcla de enlace;
- (d)
- la medición de la cantidad de enlace en la segunda mezcla de enlace; y
- (e)
- la comparación de la cantidad de enlace en la primera mezcla de enlace con la cantidad de enlace en la segunda mezcla de enlace;
en donde el compuesto es capaz de
inhibir el enlace de la IL-13 con la proteína
IL-13bc o con el receptor IL-13
cuando una disminución en la cantidad de enlace de la segunda mezcla
de enlace ocurre. También se describen, los inhibidores de
IL-13R identificados por estos métodos y las
composiciones farmacéuticas que los
contienen.
Los métodos de inhibición del enlace de la
IL-13 con las proteínas IL-13bc o
con el receptor IL-13 en un sujeto mamífero también
son revelados, los cuales comprenden la administración de una
cantidad efectiva terapéuticamente de una composición que contiene
una proteína IL-13bc, una IL-13bc o
un inhibidor IL-13R o un anticuerpo contra la
proteína IL-13bc.
Los métodos también descritos para el aumento de
la potencia de la actividad de la IL-13, que
comprende la combinación de una proteína que tiene actividad de la
IL-13 con una proteína de la reivindicación 11 y que
contiene tal combinación con una célula que expresa al menos una
cadena de IL-13R fuera de IL-13bc.
Preferiblemente, la etapa de contacto se realiza mediante la
administración de una cantidad efectiva terapéuticamente de dicha
combinación a un sujeto mamífero.
Los métodos adicionales se revelan para tratar
una condición asociada con la
IL-13-probada en un sujeto mamífero,
dicho método comprende la administración de una cantidad efectiva
terapéuticamente de una composición que comprende un antagonista de
IL-13 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Otros métodos descritos se relacionan con un método de inhibición de
la interacción de IL-13 con una proteína
IL-13bc en un sujeto mamífero que comprende la
administración de una cantidad efectiva terapéuticamente de una
composición que comprende un antagonista de IL-13 y
un excipiente farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, el
antagonista se selecciona del grupo que consiste de una proteína
IL-13bc, una forma soluble de
IL-13R\alpha1, un anticuerpo contra
IL-13 o uno de sus fragmentos de enlace de la
IL-13, un anticuerpo contra IL-13bc
o uno de sus fragmentos de enlace de la IL-13bc, un
anticuerpo contra IL-13R\alpha1 o uno de sus
fragmentos de enlace de la IL-13R\alpha1, mutantes
del enlace de la IL-13R de la IL-4,
una pequeña molécula capaz de inhibir la interacción de la
IL-13 con IL-13bc y una pequeña
molécula capaz de inhibir la interacción de la
IL-13 con IL-13R\alpha1.
Fig. 1: La figura presenta fotografías de la
IL-13, IL-4, IL-11 y
células COS transfectadas simuladas después de la exposición a IL-
13bc-Fc según lo descrito en el Ejemplo 4 abajo.
Fig. 2: Inversión de la hiper sensibilidad de
las vías aéreas inducida por un alergeno, mediante el bloqueo in
vivo de interleucina-13. 10 días después del
desafío intratraqueal inicial, los ratones inmunizados OVA- y
PBS-se desafiaron otra vez intratraquealmente con
OVA o PBS. Los ratones se dispensaron con
sIL-13bc-Fc (400 ug) o una cantidad
equivalente de hu-IgG control mediante inyección
intraperitoneal en el Día -1, O, +1 y +3 del desafío secundario con
el antígeno. El fenotipo alérgico se evaluó 4 días después del
desafío PBS u OVA. (A) Hiper sensibilidad de las vías respiratorias
(AHR) para un desafío de la acetilcolina, definido por subida de la
presión máxima de las vías aéreas integradas al tiempo (índice del
tiempo de la presión de las vías aéreas [APTI] en cm. de H_{2}O x
seg.). (B) Composición de la célula inflamatoria de fluidos del
lavado broncoalveolar. Los porcentajes diferenciales de células se
determinaron por evaluación microscópica de luz de las preparaciones
de citocentrífuga. Los datos se expresan como números absolutos de
células. (C) concentraciones de OVA-específica del
suero IgE. Los resultados son promedios +/- SEM de
8-10 animales por grupo. *P < 0.05 comparado con
los grupos control PBS respectivos; **P < 0.05 comparado con el
grupo OVA/Hu-Ig (ANOVA de una vía seguido por la
prueba de la diferencia menos significante de Fisher para
comparaciones multiples).
Fig. 3: Los efectos del bloqueo de
IL-13 sobre el incremento manejado del alergeno en
células que contienen moco en el epitelio de las vías aéreas.
Secciones del pulmón (N = 4 por grupo experimental, cuatro secciones
por animal) se fijaron en formalina, se cortaron en secciones de
10um y se tiñeron con hematoxilina y eosina, y ácido Schiff
intermitente. Las secciones representativas se muestran. Bars =100
um. PBS/Hu-Ig: PBS-inmunizado y los
controles desafiados, probaron que pocas células contienen moco.
OVA/Hu-Ig: alergeno-inducido
incremento en las células inflamatorias intersticiales e incremento
en el número de células caliciformes que contienen moco.
OVA/sIL-13bc-Fc: efecto inhibitorio
dramático del bloqueo de IL-13 sobre la producción
alergeno-inducida de moco en las células
caliciformes.
Fig. 4: IL-13 inducción de
hipersensibilidad de las vías aéreas. Los ratones Naive se
dispensaron con IL-13 recombinante (5 ug/ratón, 50
ul volumen) o PBS diariamente por instalación intratraqueal. 24
horas después del último tratamiento, se determinaron, (A) Hiper
sensibilidad de las vías aéreas, (B) niveles de eosinófilo BAL, (C)
niveles de IgE total en suero, y (D) grado de moco. Los resultados
son promedios +/- SEM (barras verticales) de 7-10
animales por grupo. *P < 0.05 comparado con el grupo PBS (test de
Student).
Los inventores de la presente aplicación, por
primera vez han identificado y proporcionado los polinucleótidos que
codifican la cadena de enlace a IL-13 de la
IL-13R (a partir de este momento
"IL-13bc"), incluyendo sin limitación los
polinucleótidos que codifican la IL-13bc humana y
murina.
La SEQ ID NO: 1 proporciona la secuencia de
nucleótidos de un ADNc que codifica la IL-13bc
murina. La SEQ ID NO: 2 proporciona la secuencia predicha de
aminoácidos de la cadena del receptor, incluyendo una secuencia
señal putativa de los aminoácidos 1-21. La
IL-13bc murina madura se considera que tiene la
secuencia de aminoácidos 22-383 de la SEQ ID NO: 2.
La cadena del receptor de murina madura tiene al menos tres dominios
distintos: un dominio extracelular (que comprende aproximadamente
los aminoácidos 22-334 de la SEQ ID NO: 2), un
dominio transmembrana (que comprende aproximadamente los
aminoácidos 335-356 de la SEQ ID NO:2) y un dominio
intracelular (que comprende aproximadamente los aminoácidos
357-383 de la SEQ ID NO:2).
La SEQ ID NO: 3 proporciona la secuencia de
nucleótidos de un ADNc que codifica la IL-13bc
humana. La SEQ ID NO: 4 proporciona la secuencia predicha de
aminoácidos de la cadena del receptor, incluyendo una secuencia
señal putativa de los aminoácidos 1-25. La
IL-13bc humana madura se considera que tiene la
secuencia de aminoácidos 26-380 de la SEQ ID NO: 4.
La cadena del receptor humana madura tiene al menos tres dominios
distintos: un dominio extracelular (que comprende aproximadamente
los aminoácidos 26-341 de la SEQ ID NO: 4), un
dominio transmembrana (que comprende aproximadamente los
aminoácidos 342-362 de la SEQ ID NO: 4) y un
dominio intracelular (que comprende aproximadamente los aminoácidos
363-380 de la SEQ ID NO:4).
Los primeros 81 aminoácidos de la secuencia
humana IL-13bc son idénticos a la secuencia
traducida de una secuencia tag expresada (EST) identificada como
"yg99f10.r1 Homo sapiens clon de ADNc 41648 5'" y
asignada en la base de datos número de acceso R52795.gbest2. No hay
homologías o motivos de secuencias en esta secuencia EST que
conduciría a aquellos de habilidad en el oficio a identificar la
proteína codificada como un receptor de citoquina. Un clon de ADNc
que corresponde a esta entrada de la base de datos está
públicamente-disponible del I.M.A.G.E. Consortium.
Subsiguiente a la fecha de la prioridad de la presente aplicación,
tal clon se pide por los solicitantes y en secuencia. La secuencia
de tal clon se determinó para que la secuencia sea previamente
reportada por los solicitantes como SEQ ID NO: 3 en esta.
Las formas solubles de la proteína
IL-13bc también se pueden producir. Tales formas
solubles incluyen sin limitación proteínas que contienen aminoácidos
1-334 o 22-334 de la SEQ ID NO: 2 o
aminoácidos 1-341 o 26-341 de la SEQ
ID NO: 4. Las formas solubles de IL-13bc
adicionalmente se caracterizan por ser solubles en solución acuosa,
preferiblemente a temperatura ambiente. Las proteínas IL- 13bc que
contienen solamente el dominio intracelular o una porción de estos
también se pueden producir. Cualquiera de las formas de
IL-13bc de menos de la longitud completa se refiere
colectivamente aquí como formas de longitud completa y madura como
"IL-13bc" o " proteínas
IL-13bc". Las proteínas IL-13bc
de menos de la longitud completa pueden ser producidas mediante la
expresión de un fragmento correspondiente del polinucleótido que
codifica la proteína IL-3bc de longitud completa
(SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3). Estos fragmentos polinucleótidos
correspondientes también se describen. Los polinucleótidos
modificados según se describen anteriormente se pueden hacer por
técnicas de biología molecular estándar, incluyendo la construcción
de los apropiados mutantes con deleciones deseados, métodos de
mutagénesis de sitio-dirigido o por la reacción en
cadena de la polimerasa utilizando cebadores de oligonucleótidos
apropiados.
Una proteína según lo descrito en esta tiene
"una actividad biológica de la cadena del enlace del receptor
IL-13" si este posee una o más de las siguientes
características: (1) la capacidad de unir la IL-13 o
uno de sus fragmentos (preferiblemente un fragmento de estos activo
biológicamente); y/o (2) la capacidad para interactuar con el
segunda cadena no-enlace de IL-13 de
IL-13R para producir una señal característica del
enlace de IL-13 con la IL-13R.
Preferiblemente, la actividad biológica poseída por la proteína es
la capacidad de unir la IL-13 o un fragmento de
esta, más preferiblemente con un K_{D} de aproximadamente 0.1 a
aproximadamente 100 nM. Los métodos para la determinación tanto de
una proteína particular o un péptido tiene dicha actividad incluye
sin limitación los métodos descritos en los ejemplos proporcionados
en esta.
La IL-13bc o los fragmentos
activos de estos (proteínas IL-13bc) pueden estar
combinadas para transportar las moléculas tales como
inmunoglobulinas. Por ejemplo, las formas solubles de la
IL-13bc pueden estar combinadas a través de
secuencias "ligador" a la porción Fc de una inmunoglobulina.
Otras proteínas de fusión, tal como aquellas con GST,
Lex-A o MBP, también se pueden utilizar.
Adicionalmente se describen las variantes
alélicas de las secuencias nucleótido según se publica en la SEQ ID
NO: 1 o la SEQ ID NO: 3, es decir, las formas alternativas que
ocurren naturalmente del polinucleótido aislado de la SEQ ID NO: 1 o
la SEQ ID NO: 3 que también codifican las proteínas
IL-13bc, preferiblemente aquellas proteínas que
tienen una actividad biológica de IL-13bc. También
se describen los polinucleótidos aislados que hibridizan a la
secuencia de nucleótidos publicadas en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID
NO: 3 bajo condiciones altamente rigurosas (por ejemplo, 0.1xSSC a
65°C). Los polinucleótidos aislados que codifican las proteínas
IL-13bc pero que difieren de la secuencia de
nucleótidos publicada en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3 por
virtud de la degeneración del código genético también se describen.
También se describen, las variaciones en la secuencia de nucleótidos
como las publicadas en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3 que se
motivan por mutaciones de punto o por modificaciones inducidas.
También se describen los polinucleótidos que
codifican los homólogos de la murina y la IL-13bc
humana de otra especie animal, particularmente otra especie
mamífero. Las especies homólogas pueden ser identificadas y aisladas
o construidas por sondas o cebadores a partir de la murina o
secuencias humanas reveladas en esta y la selección de un banco de
una especie apropiada, tal como por ejemplo bancos construidos de
PBMCs, timo o testículo de la especie relevante.
Los polinucleótidos aislados pueden estar unidos
operablemente a una secuencia control de expresión tal como los
vectores de expresión pMT2 o pED revelados en Kaufman et al.,
Ácidos Nucleicos Res. 19, 4485-4490 (1991),
con el fin de producir la proteína IL-13bc
recombinantemente. Muchas secuencias control de expresión apropiadas
son conocidas en el oficio. Los métodos de expresión generales de
proteínas recombinantes también son conocidos y se ejemplifican en
R. Kaufman, los métodos en Enzymology 185,
537-566 (1990). Como se define en esta "unidos
operablemente" significa ligado enzimáticamente o químicamente
para formar un enlace covalente entre el polinucleótido aislado de
la invención y la secuencia control de expresión, de una manera tal
que la proteína IL- 13bc se expresa por una célula huésped que ha
sido transformada (transfectada) con la secuencia control de
expresión/polinucleótido ligada.
Un número de tipos de células pueden actuar como
células huésped apropiadas para la expresión de la proteína
IL-13bc. Cualquier tipo de célula capaz de expresar
la proteína IL-13bc funcional puede ser utilizada en
Apropiadas células huésped de mamífero incluye, por ejemplo, células
COS de mono, células de Ovario de Hamster Chino (CHO), células 293
de riñón humano, células A431 epidérmico humano, células Colo205
humano, células 3T3, células CV-1, otras líneas
celulares de primate transformadas, células diploides normales,
cepas de células derivadas a partir de cultivo in vitro de
tejido primario, explantes primarios, células HeLa, células L de
ratón, BHK. HL-60, U937, HaK, Rat2, BaF3, 32D,
FDCP-1, PC12, Mezcla o células C2C12.
La proteína IL-13bc también se
puede producir por unión de manera operable del polinucleótido
aislado de la invención con las secuencias control apropiadas en uno
o más vectores de expresión de insecto, y empleando un sistema de
expresión de insecto. Los materiales y métodos para los sistemas de
expresión de células baculovirus/insecto están comercialmente
disponibles en forma de kit, por ejemplo de, Invitrogen, San Diego,
California, U.S.A. (el kit MaxBac®), y dichos métodos son bien
conocidos en el oficio, según lo descrito en Summers y Smith,
Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555
(1987). Las formas solubles de la proteína
IL-13bc también se pueden producir en células de
insecto utilizando polinucleótidos aislados apropiados según lo
descrito
arriba.
arriba.
Alternativamente, la proteína
IL-13bc se puede producir en eucariotas inferiores
tal como levadura o en procariotas tal como bacteria. Cepas de
levadura apropiadas incluyen Saccharomyces cerevisiae,
Schizosaccharomyces pombe. Cepas Kluyveromyces, Candida,
o cualquier cepa de levadura capaz de expresar las proteínas
heterólogas. Cepas bacterianas apropiadas incluyen Escherichia
coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, o cualquier
cepa bacteriana capaz de expresar las proteínas heterólogas.
La expresión en bacterias puede resultar en la
formación de cuerpos de inclusión que incorporan la proteína
recombinante. De tal manera, el plegamiento de la proteína
recombinante se puede requerir con el fin de producir material
activo o más activo. Varios métodos de obtención de proteínas
heterólogas correctamente plegadas a partir de cuerpos de inclusión
bacterianos son conocidos en el oficio. Estos métodos generalmente
involucran solubilización de la proteína a partir de los cuerpos de
inclusión, luego la desnaturalización de la proteína completamente
utilizando un agente caotrópico. Cuando los residuos de cisteina
están presentes en la secuencia primaria de aminoácidos de la
proteína, Es a menudo necesario realizar el plegamiento en un
ambiente que permita la correcta formación de los enlaces disulfuro
(un sistema redox). Métodos generales de plegamiento se revelan en
Kohno, Meth. Enzym., 185:187-195
(1990).
EP 0433225 y copending application USSN 08/163,877 describe otros métodos apropiados.
EP 0433225 y copending application USSN 08/163,877 describe otros métodos apropiados.
La proteína IL-13bc también se
puede expresar como un producto de animales transgénicos, por
ejemplo, como un componente de la leche de vacas, cabras, cerdos, u
ovejas transgénicos que se caracterizan por células somáticas o de
germen que contienen una polisecuencia de nucleótidos que codifica
la proteína IL-13bc.
La proteína IL-13bc se puede
preparar cultivando un cultivo de células huésped transformadas bajo
las condiciones de cultivo necesarias para expresar la proteína
deseada. La proteína expresada resultante luego se puede purificar a
partir del medio de cultivo o de los extractos celulares. Las formas
solubles de la proteína IL-13bc se pueden purificar
a partir de los acondicionados. Las formas de
enlace-membrana de la proteína
IL-13bc se pueden purificar preparando una fracción
de la membrana total a partir de la expresión celular y la
extracción de las membranas con un detergente
no-iónico tal como Triton X-100.
La proteína IL-13bc se pueden
purificar utilizando métodos conocidos por aquellos de habilidad en
el oficio. Por ejemplo, la proteína IL-13bc se puede
concentrar utilizando un filtro de concentración de proteínas
comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de
ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Continuando la etapa de
concentración, el concentrado puede ser aplicado a una matriz de
purificación tal como un medio de filtración por gel.
Alternativamente, puede ser empleada, una resina intercambio
aniónico por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos
pendientes dietilaminoetil (DEAE) o polietilenimina (PEI). Las
matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrán, celulosa u otros
tipos comúnmente empleados en purificación de proteínas.
Alternativamente, una etapa de intercambio catiónico puede ser
empleada. Intercambiadores catiónicos apropiados incluyen varias
matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropil o
carboximetilo. Se prefieren los grupos sulfopropil (por ejemplo,
columnas S-Sepharose®). La purificación de la
proteína de la IL-13bc a partir del sobrenadante
del cultivo también puede incluir una o más etapas de columna sobre
tales resinas de afinidad como concanavalina
A-agarosa, heparina-toyopearl® o
Cibacrom blue 3GA Sepharose®; o por cromatografía interacción
hidrofóbica utilizando dichas resinas como fenil éter, butil éter, o
propil éter; o por cromatografía de inmunoafinidad. Finalmente, una
o más etapas de cromatografía líquida de alta resolución de fase
reversa (RP-HPLC) empleando medios de
RP-HPLC hidrofóbicos, por ejemplo, silica gel que
tiene grupos pendientes metil u otros grupos alifáticos, pueden ser
empleados para purificar adicionalmente la proteína
IL-13bc. Las columnas de afinidad que incluyen
IL-13 o fragmentos de estas o incluyen anticuerpos
para la proteína IL-13bc también pueden ser
utilizadas en la purificación de acuerdo con métodos conocidos.
Algunas o todas las etapas de purificación precedentes, en varias
combinaciones o con otros métodos conocidos, también pueden ser
empleadas para proporcionar una proteína recombinante aislada
sustancialmente purificada. Preferiblemente, la proteína
IL-13bc aislada se purifica con el fin de que esta
sea sustancialmente libre de otras proteínas de
mamífero.
mamífero.
Las proteínas IL-13bc también
pueden ser utilizadas para selección por los agentes que son capaces
de unir a la IL-13bc o la IL-13R o
que interfieren con el enlace de IL-13 con la
IL-13 o la IL-13bc (tanto el dominio
extracelular o intracelular) y de esta manera actuar como
inhibidores del enlace normal y la acción de la citoquina
("inhibidores de la IL-13R "). Ensayos de
enlace utilizando un enlace deseado de proteína, inmovilizado o no,
son bien conocidos en el oficio y pueden ser utilizados para este
propósito utilizando la proteína IL-13bc de la
invención. La célula purificada basada o proteína basada (célula
libre) ensayos selección pueden ser utilizados para identificar
tales agentes. Por ejemplo, la proteína IL-13bc
puede ser inmovilizada en la forma purificada sobre un excipiente y
el enlace para purificar la proteína IL-13bc puede
ser medido en la presencia y en la ausencia de agentes que inhiben
el potencial. Un ensayo de enlace apropiado puede emplear
alternativamente la forma de IL-13bc soluble de la
invención. Otro ejemplo de un sistema en el que los inhibidores
pueden ser seleccionados se describe en el Ejemplo 2 de abajo.
En dicho ensayo de selección, una primera mezcla
de enlace se forma por la combinación de la IL-13 o
un fragmento de esta y la proteína IL- 13bc, y se mide la cantidad
de enlace en la primera mezcla de enlace (Bo). Una segunda mezcla
ligada también se forma por la combinación de la
IL-13 o un fragmento de estos, la proteína
IL-13bc, y el compuesto o agente para ser
seleccionado, y se mide la cantidad de enlace en la segunda mezcla
ligada (B). Las cantidades de enlace en la primera y segunda mezclas
de enlace se comparan, por ejemplo, representando un cálculo de la
relación B/Bo, Un compuesto o agente se considera que es capaz de
inhibir el enlace si se observa una disminución en el enlace en la
segunda mezcla ligada como comparado con la primera mezcla de
enlace. Opcionalmente, la segunda cadena de IL-13R
pueden ser adicionadas a una o ambas mezclas del enlace. La
formulación y optimización de las mezclas de enlace esta dentro del
nivel de habilidad en el oficio, tales mezclas de enlace también
pueden contener soluciones reguladoras y las sales necesarias para
mejorar y optimizar el enlace, y los ensayos control adicionales
pueden ser incluidos en el ensayo de selección de la invención.
Los compuestos encontrados para reducir la
actividad del enlace de la proteína IL-13bc con la
IL-13 o su fragmento a cualquier grado,
preferiblemente por al menos aproximadamente 10%, más
preferiblemente mayor de aproximadamente 50% o más, así pueden ser
identificadas y luego secundariamente seleccionados entre otros
ensayos de enlace y ensayos in vivo. Mediante estos métodos
los compuestos que tienen actividad inhibitoria para el enlace de
IL-13bc que pueden ser apropiados como agentes
terapéuticos, se pueden identificar.
Las proteínas IL-13bc, y los
polinucleótidos que las codifican, también pueden ser utilizados
como agentes de diagnóstico para la detección de la expresión o
presencia de IL-13bc, IL-13R,
IL-13 o las células expresión
IL-13bc, IL-13R o
IL-13. Las proteínas o polinucleótidos se pueden
emplear para tales propósitos en procedimientos estándar para
ensayos de diagnóstico utilizando estos tipos de materiales.
Apropiados métodos son bien conocidos por aquellos de habilidad en
el oficio.
Como se usa en esta
"IL-13R" se refiere a IL-13bc
y/o una segunda cadena IL-13 receptor conocida
como
"IL-13R\alpha1" o "NR4" (ver: cadena del receptor murina, Hilton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996,93:497-501; cadena del receptor humano, Aman et al., J. Biol. Chem. 1996, 271:29265-70, y Gauchat et al., Eur. J. Immunol. 1997, 27:971-8).
"IL-13R\alpha1" o "NR4" (ver: cadena del receptor murina, Hilton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996,93:497-501; cadena del receptor humano, Aman et al., J. Biol. Chem. 1996, 271:29265-70, y Gauchat et al., Eur. J. Immunol. 1997, 27:971-8).
La IL-13bc actúa como un
mediador de las actividades biológicas conocidas de la
IL-13. Consecuentemente, la proteína
IL-13bc (particularmente, proteínas
IL-13bc solubles), inhibidores de la
IL-13R (i.e., antagonistas de interacción de la
IL-13 con IL-13R (tal como, por
ejemplo, anticuerpos para IL-13R (incluyendo
particularmente a IL-13bc o a
IL-13R\alpha1) y los fragmentos de estas, los
anticuerpos contra IL-13 y los fragmentos de estos,
las proteínas IL-13R\alpha1 solubles, y una
molécula pequeña y otros inhibidores de la interacción de
IL-13 con IL-13R (incluyendo con
IL-13bc y/o con IL-13R\alpha1)
pueden ser útiles en el tratamiento o modulación de varias
condiciones médicas en las que la IL-13 se implica o
que se realizan por la actividad (o carecen de estos) de
IL-13 (colectivamente "condiciones asociadas con
IL-13"). Las formas mutadas de
IL-4 que unen a IL-13R también
pueden ser utilizadas como antagonistas de IL-13
(ver, por ejemplo, aquellas reveladas en Shanafelt et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95:9454-8; Aversa
et al., J. Exp. Med. 1993, 178:2213-8; y
Grunewald et al., J. Immunol. 1998,
160:4004-9).
Las condiciones asociadas con
IL-13 incluyen sin limitación condiciones mediadas
por Ig y enfermedades, particularmente condiciones mediadas por IgE
(incluyendo sin limitación la atopia, condiciones alérgicas, el
asma, las enfermedades del complejo
antígeno-anticuerpo (tal como, por ejemplo, el
lupus, el síndrome nefrótico, la nefritis, la glomerulonefritis, la
tiroiditis y la enfermedad de Graves)); las condiciones
inflamatorias de los pulmones; deficiencias inmunes, específicamente
deficiencias en células progenitoras hematopoyéticas, o desórdenes
relacionados con esto; el cáncer y otras enfermedades. Tales
estados patológicos pueden resultar de una enfermedad, exposición a
la radicación o fármacos, e incluyen, por ejemplo, leucopenia,
infecciones bacterianas y virales, anemia, deficiencias de células B
o células T tal como deficiencia de célula inmune o de célula
hematopoyética seguida de un transplante de médula ósea. Dado que
IL-13 inhibe la activación del macrófago, las
proteínas IL-13bc también pueden ser útiles para
mejorar la activación del macrófago (i.e., en la vacunación, el
tratamiento de organismos micobacterianos o intracelulares, o las
infecciones de parásitos).
Las proteínas IL-13bc también
pueden ser utilizadas para potenciar los efectos de la
IL-13 in vitro e in vivo. Por ejemplo,
una proteína IL- 13bc se puede combinar con una proteína que tiene
actividad de IL-13 (preferiblemente
IL-13) y la combinación resultante se puede conectar
con una expresión celular de al menos una cadena
IL-13R fuera de IL-13bc
(preferiblemente todas las cadenas IL-13R fuera de
IL-13bc, tal como IL-13R\alpha1).
Preferiblemente, la etapa de contacto se realiza mediante la
administración de una cantidad efectiva terapéuticamente de dicha
combinación a un sujeto mamífero in vivo. La asociación
pre-establecida de la proteína IL-13
con la proteína IL-13bc ayudará en la formación del
complejo IL-13/IL-13R completo
necesario para una correcta señalización. Ver por ejemplo los
métodos descritos por Economides et al., Science 270:1351
(1995).
La proteína IL-13bc y los
inhibidores IL-13R, purificados a partir de las
células o producidos recombinantemente, pueden ser utilizados como
una composición farmacéutica cuando se combina con un excipiente
farmacéuticamente aceptable. Tal composición puede contener, además
de IL-13bc o un inhibidor y los excipientes, varios
diluentes, rellenos, sales, soluciones reguladoras, estabilizadores,
solubilizadores, y otros materiales bien conocidos en el oficio. El
término "farmacéuticamente aceptable" significa un material
no-tóxico que no interfiere con la eficacia de la
actividad biológica del ingrediente(s) activo(s). Las
características de los excipientes dependerán de la ruta de
administración.
La composición farmacéutica de la invención
también puede contener citoquinas, linfocinas, u otros factores
hematopoyeticos tal como M-CSF,
GM-CSF, IL-1, IL-2,
IL-3, IL4, IL-5,
IL-6, IL-7, IL-8,
IL-9, IL-10, IL-11,
IL-12, IL-I4, IL- 15,
G-CSF, factor de células madres, y eritropoyetina.
La composición farmacéutica también puede incluir anticuerpos
anti-citoquina. La composición farmacéutica puede
contener factores trombolíticos o anti-trombóticos
tal como activator plasminógeno y Factor VIII. La composición
farmacéutica puede además contener otros agentes
anti-inflamatorios. Tales factores y/o agentes
adicionales pueden ser incluidos en la composición farmacéutica para
producir un efecto sinergista con la proteína
IL-13bc aislada o el inhibidor
IL-13bc, o minimizar los efectos colaterales
causados por la IL-13bc aislada o el inhibidor
IL-13bc. A la inversa, la IL-13bc
aislada o el inhibidor IL-13bc pueden ser incluidos
en las formulaciones de la citoquina particular, linfocina, otro
factor hematopoyetico, factor trombolítico o
anti-trombótico, o agente
anti-inflamatorio para minimizar los efectos
colaterales de la citoquina, linfocina, otro factor hematopoyetico,
factor trombolítico o anti-trombótico, o agente
anti-inflamatorio.
La composición farmacéutica de la invención
puede estar en la forma de un liposoma en la cual la proteína
IL-13bc aislada o el inhibidor
IL-13bc se combina, además con otros excipientes
aceptables farmacéuticamente, con agentes amfipáticos tal como
lípidos los cuales existen en forma agregada como micelas, capas
monomoleculares insolubles, cristales líquidos, o capas laminares
que existen en solución acuosa. Apropiados lípidos para formulación
liposomal incluyen, sin limitación, monoglicéridos, diglicéridos,
sulfatides, lisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares,
y similares. La preparación de tales formulaciones liposomales está
dentro del nivel de habilidad en el oficio, según se revela, por
ejemplo, en la Patente U.S. No. 4,235,871; Patente U.S. No.
4,501,728; Patente U.S. No. 4,837,028; y Patente U.S. No. 4,737,323,
de las cuales todas se incorporan en esta por referencia.
Como se usa en esta, el término "cantidad
efectiva terapéuticamente" significa la cantidad total de cada
activo componente de la composición farmacéutica o del método es
decir suficiente para mostrar un significativo beneficio al
paciente, por ejemplo, mejora de los síntomas de, curación, o del
incremento en el índice de curación de tales condiciones. Cuando se
aplica un ingrediente activo individual, administrado solo, el
término se refiere a ese ingrediente únicamente. Cuando se aplica en
una combinación, el término se refiere a cantidades combinadas de
los ingredientes activos que resultan en el efecto terapéutico,
tanto si se administra en combinación, en serie o
simultáneamente.
En la práctica el método del tratamiento o el
uso de la presente invención, una cantidad efectiva terapéuticamente
de la proteína IL-13bc aislado o el inhibidor
IL-13bc se administra a un mamífero. La proteína
IL-13bc aislada o el inhibidor
IL-13bc pueden ser administrados de acuerdo con el
método de la invención ya sea solo o en combinación con otras
terapias tales como tratamientos empleando citoquinas, linfocinas u
otros factores hematopoyeticos. Cuando se
co-administra con una o más citoquinas, linfocinas u
otros factores hematopoyeticos, la proteína IL-13bc
o el inhibidor IL-13bc pueden ser administrados ya
sea simultáneamente con la citoquina(s), linfocina(s),
otro(s) factor(s) hematopoyetico(s), factores
trombolíticos o anti-trombóticos, o secuencialmente.
Si se administra secuencialmente, el médico que da asistencia
decidirá sobre la apropiada secuencia de administración de la
proteína IL-13bc o el inhibidor
IL-13bc en combinación con citoquina(s),
linfocina(s), otro(s) factor(s)
hematopoyetico(s), factores trombolíticos o
anti-trombóticos.
La administración de la proteína
IL-13bc o el inhibidor IL-13bc
utilizado en la composición farmacéutica o en la práctica del método
de la presente invención se puede realizar en una variedad de vías
convencionales, tal como ingestión oral, inhalación, o inyección
cutánea, subcutánea, o intravenosa. Se prefiere la administración
intravenosa al paciente.
Cuando una cantidad efectiva terapéuticamente de
la proteína IL-13bc o el inhibidor
IL-13bc se administra vía oral, la proteína
IL-13bc o el inhibidor IL-13bc
estarán en la forma de una tableta, cápsula, polvo, solución o
elixir. Cuando se administra en la forma de tableta, la composición
farmacéutica de la invención puede adicionalmente contener un
excipiente sólido tal como una gelatina o un adyuvante. La tableta,
la cápsula, y el polvo contienen desde aproximadamente 5 a 95% de la
proteína IL-13bc o el inhibidor
IL-13bc, y preferiblemente desde aproximadamente 25
a 90% de la proteína IL-13bc o inhibidor
IL-13bc. Cuando se administra en forma líquida, se
puede adicionar un excipiente líquido tal como agua, petróleo,
aceites de origen animal o vegetal tal como aceite de maní, aceite
mineral, aceite de soja, o aceite de ajonjolí, o aceites sintéticos.
La forma líquida de la composición farmacéutica puede además
contener una solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución
de sacárido, o glicoles tal como etilenglicol, propilenglicol o
polietilenglicol. Cuando se administra en forma líquida, la
composición farmacéutica contiene desde aproximadamente 0.5 a 90% en
peso de la proteína IL-13bc o el inhibidor
IL-13bc, y preferiblemente desde aproximadamente 1 a
50% de la proteína IL-13bc o el inhibidor
IL-13bc.
Cuando una cantidad efectiva terapéuticamente de
la proteína IL-13bc o el inhibidor
IL-13bc se administra por inyección intravenosa,
cutánea o subcutánea, la proteína IL-13bc o el
inhibidor IL-13bc estarán en la forma de una
solución acuosa vía parenteral de pirógeno-libre,
aceptable. La preparación de tales soluciones de la proteína vía
parenteral aceptable, teniendo el debido respeto al pH,
isotonicidad, estabilidad, y similares, está dentro de la habilidad
en el oficio. Una composición farmacéutica preferida para inyección
intravenosa, cutánea, o subcutánea debería contener, además de la
proteína IL-13bc o del inhibidor
IL-13bc un vehículo isotónico tal como Inyección de
Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer, Inyección de Dextrosa,
Dextrosa e Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Lactato de
Ringer, u otro vehículo como se conoce en el oficio. La composición
farmacéutica de la presente invención también puede contener
estabilizadores, preservativos, soluciones reguladoras,
antioxidantes, u otro aditivo conocido por aquellos de habilidad en
el oficio.
La cantidad de proteína IL-13bc
o el inhibidor IL-13bc en la composición
farmacéutica de la presente invención dependerá de la naturaleza y
severidad de la condición que es tratada, y sobre la naturaleza de
previos tratamientos que el paciente ha experimentado. Finalmente,
el médico que atiende decidirá la cantidad de proteína
IL-13bc o del inhibidor IL-13bc con
la que tratar cada paciente individual. Inicialmente, el médico que
atiende administrará dosis bajas de la proteína
IL-13bc o del inhibidor IL-13bc y
observará la respuesta del paciente. La dosis más grande de la
proteína IL-13bc o el inhibidor
IL-13bc puede ser administrada hasta que el efecto
terapéutico óptimo se obtiene para el paciente, y en ese punto la
dosificación generalmente no se incrementa más allá. Se contempla
que las varias composiciones farmacéuticas utilizadas en la práctica
del método de la presente invención deben contener aproximadamente
0.1 \mug a aproximadamente 100 mg de la proteína
IL-13bc o el inhibidor IL-13bc por
kg de peso corporal.
La duración de la terapia intravenosa utilizando
la composición farmacéutica de la presente invención variará,
dependiendo de la severidad de la enfermedad que es tratada y la
condición y la potencial respuesta idiosincrásica de cada paciente
individual. Se contempla que la duración de cada aplicación de la
proteína IL-13bc o del inhibidor
IL-13bc estará en el rango de 12 a 24 horas de
administración intravenosa continua. Finalmente el médico que
atiende decidirá sobre la duración apropiada de la terapia
intravenosa utilizando la composición farmacéutica de la presente
invención.
Las proteínas IL-13bc de la
invención también pueden ser utilizadas para inmunizar animales para
obtener anticuerpos policlonales y monoclonales que reaccionan
específicamente con la proteína IL-13bc y que pueden
inhibir el enlace de IL-13 o los fragmentos de estos
con el receptor. Tales anticuerpos se pueden obtener utilizando la
IL-13bc total como un inmunógeno, o utilizando los
fragmentos de IL-13bc, tal como la
IL-13bc madura soluble. Los fragmentos más pequeños
de la IL-13bc también pueden ser utilizados para
inmunizar animales. Los inmunógenos péptidos adicionalmente pueden
contener un residuo de cisteina en el terminal carboxilo, y se
conjugan con un hapteno tal como Hemocianina extraída del molusco
(KLH). Inmunógenos de péptidos adicionales pueden ser generados por
el reemplazo de los residuos de tirosina con residuos de tirosina
sulfato. Los métodos para la síntesis de tales péptidos son
conocidas en el oficio, por ejemplo, como en R.P. Merrifield, J.
Amer. Chem.Soc. 85, 2149-2154 (1963); J.L.
Krstenansky, et al., FEBS Lett. 211, 10 (1987).
Los anticuerpos que neutralizan o
no-neutralizan (preferiblemente anticuerpos
monoclonales) unidos a una proteína IL-13bc también
pueden ser terapéuticos útiles para ciertos tumores y también en el
tratamiento de las condiciones descritas arriba. Estos anticuerpos
monoclonales que neutralizan pueden ser capaces de bloquear el
enlace de IL-13 con la IL-13bc.
5 ug de poliA+ RNA se preparó a partir del timo
de ratones C3H/HeJ de 6-8 semanas de edad. El ADNc
bicatenario, hemimetilado se preparó utilizando el kit de síntesis
de ADNc de Stratagene de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Brevemente, la primera hebra se ceba con un
oligodT-Xho cebador, y después la síntesis de la
segunda hebra, se adicionan los adaptadores EcoRI, y el ADNc se
digiere con XhoI, y se purifica. El ADNc se liga a los sitios
XhoI-EcoRI del vector lambda Zap Express
(Stratagene), y se empaqueta utilizando los extractos de
empaquetamiento Gigapak II Gold (Stratagene) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Un banco de 1.5 x 10^{6} del fago
recombinante resultante se amplificó siguiendo las instrucciones del
fabricante. Este banco se seleccionó con una sonda degenerada de un
oligonucleótido 17mer de la secuencia KSRCTCCABK CRCTCCA (SEQ ID
NO: 5) (K = G+T; S= C+G; R=A+G; B=C+G+T) utilizando las condiciones
hibridación estándar TMAC según lo descrito (Current Protocols in
Molecular Biology, Ausubel, et al., editors., John Wiley y
Sons, 1995, section 6.4.3). El Clon A25 se identificó porque este
hibridiza a la sonda 17mer, pero no a las sondas derivadas de
receptores hematopoyéticos conocidos. Este clon se aisló en una
forma de plásmido del vector ZapExpress según las instrucciones del
fabricante, y se determinó la secuencia de ADN. La secuencia de ADN
codificó a un miembro novedoso de la familia del receptor
hematopoyético.
El Clon A25 que contiene el polinucleótido que
tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 se depositó con ATCC como
pA25pBKCMV en el número de acceso 69997 en Febrero 22, 1996.
Un fragmento parcial del homólogo humano del
receptor murina se aisló por PCR utilizando oligonucleótidos
derivados de la secuencia murina. El ADNc se preparó a partir del
testículo humano polyA+ RNA que se obtuvo de Clontech. Un fragmento
de ADN de 274 pares de base se amplificó a partir de este ADNc por
PCR con los siguientes oligonucleótidos: ATAGTTAAACCATTGCCACC (SEQ
ID NO: 6) y CTCCATTCGCTCCAAATTCC (SEQ ID NO: 7) utilizando
polimerasa AmpliTaq (Promega) en 1X Taq solución reguladora que
contiene MgCl2 1.5 mM durante 30 ciclos de incubación (94°C x 1
minuto, 42°C por 1 minuto, y 72ºC por 1 minuto). La secuencia de ADN
de este fragmento se determinó, y dos oligonucleótidos se prepararon
a partir de una porción interna de este fragmento con la siguiente
secuencia: AGTCTATCTTACTITTACTCG (SEQ ID NO: 8) y
CATCTGAGCAATAAATATTCAC (SEQ ID NO: 9). Estos oligonucleótidos se
utilizaron como sondas para seleccionar un banco de ADNc de
testículo humano adquirido de CLONTECH (cat #HL1161). Los filtros
se hibridizaron a 52°C utilizando las condiciones de hibridación
estándar 5XSSC y se lavaron en 2X SSC a 52°C. Veintidós clones se
aislaron, esos que hibridizan a ambos oligonucleótidos en una
selección de 400,000 clones. La secuencia de ADN se determinó a
partir de cuatro de los clones ADNc, y se codifico toda del mismo
receptor hematopoyético novedoso. La secuencia predicha de ADN de la
cadena del receptor humano integral se muestra como la SEQ ID NO:
3.
El clon humano se depositó con ATCC como
phA25#11pDR2 en el número de acceso 69998 en Febrero 22, 1996.
El ADN que codifica los aminoácidos
1-331 del dominio extracelular de
IL-13bc murina se combinó con una secuencia
espaciadora que codifica gly-ser-gly
por PCR y se liga en el marco con las secuencias que codifican las
regiones bisagra CH2 CH3 de IgG1 humano del vector de expresión
COS-1 pED.Fc . La
IL-13bc-Ig se produce a partir de
las células COS-1 transfectadas
DEAE-dextrán y se purifica por medio de la
cromatografía proteína A sepharose (Pharmacia).
La estimulación de la proliferación de las
células B9 (Aarden et al. Eur. J. Immunol. 1987.
17:1411-1416) en respuesta a la
IL-13 o la IL-4 se midió mediante la
incorporación de 3H-timidina en el ADN. Las células
(5 x 103/pozo) se sembraron en placas de 96 pozos con medios que
contienen factores de crecimiento que varían de concentraciones en
la presencia o ausencia de la
IL-13bc-Ig a 1 ug/ml. Después de la
incubación durante 3 días, se adicionó luCi/pozo de
3H-timidina y las células se incubaron por un
adicional de 4 horas. La radioactividad incorporada se determinó
utilizando un lector de Placa LKB 1205.
La línea celular B9 prolifera en respuesta a la
IL-13, la IL-4 o la
IL-6. Únicamente las respuestas a la
IL-13 se inhibieron por la
IL-13bc-Ig soluble, indicando que
este receptor se une a la IL-13 específicamente,
pero no a la IL-4 o a la IL-6. Las
tablas muestran el cpm. Se muestran dos experimentos separados.
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\vskip1.000000\baselineskip
Un biosensor Biacore se utilizó para medir
directamente el enlace específico de IL-13 a una
IL-13bc-Ig purificada (Pharmacia,
Johnsson et al., 1991). Aproximadamente 10,000 a 17,000
unidades de resonancia (RU) de
IL-13bc-Ig purificada, la IgG1
humano o receptor irrelevante se inmovilizado cada uno
covalentemente a diferente flujo de células sobre la pieza sensor
según lo recomendado por el fabricante. (RU's son una reflección de
la masa de la proteína unida a la superficie de la pieza sensor). La
IL-13 purificada se inyectó a través del flujo de
células a 5 ul/min durante 10 minutos en la presencia o ausencia del
exceso de IL-13bc-Ig purificada. El
enlace se cuantificó como la diferencia en RU antes y después de la
inyección de la muestra. El enlace IL-13 específico
de 481.9 RU se observó únicamente para la
IL-13bc-Ig inmovilizada mientras que
la co-inyección de IL-13 más la
IL-13bc-Ig resulta en ningún enlace
con la IL-13bc-Ig inmovilizada (4
RU). No se observó ningún enlace IL-13 para IgG
inmovilizado o IL-11R-Ig (5.4 y 3.7
RU respectivamente).
Los vectores de expresión para
IL-13, IL-4, IL-11 o
vector vacío se transfectaron en las células COS-1
en placas por duplicado vía el método DEAE-dextrán.
Dos días después de la transfección las células se lavaron dos veces
en solución salina reguladora fosfato (PBS) y se fijaron en el plato
de cultivo durante 10' a 4°C con metanol. Seguido a la fijación las
células se lavaron dos veces con PBS luego se enjuagaron una vez con
solución reguladora de enlace (PBS, 1% (w/v) albúmina de suero
bovino,).1% (w/v) azida de sodio) y se incubaron durante dos horas a
4°C en solución reguladora de enlace con
IL-13bc-Fc a 1.0 ug/ml o con
antisuero anti-citoquina relevante. Las células se
lavaron dos veces con PBS y se incubaron a 4ºC con agitación en IgG
diluido anti-humano de Conejo marcado con fosfatasa
alcalina de F (ab) 2' 1:500 en la solución reguladora de enlace
(para la detección de la fusión Fc) o IgG anti-rata
de Conejo F (ab) 2' (para la detección
anti-citoquina). Las células de nuevo se lavaron dos
veces en PBS. La actividad de la fosfatasa alcalina se visualizó
utilizando azul de nitrotetrazolio y 5-bromo-
4-cloro-3-indolil-fosfato.
El enlace específico se visualizó bajo el
microscopio. Únicamente las células transfectadas con
IL-13 mostraron el enlace específico para
IL13bc-Ig. (ver foto de las células transfectadas,
la Figura).
Otros sistemas pueden ser utilizadas para
determinar si una proteína IL-13bc específica exhibe
una "actividad biológica" de IL-13bc como se
define en esta. Los siguientes son ejemplos de tales sistemas.
La capacidad de una proteína
IL-13bc para unir la IL-13 o un
fragmento de estos, puede estar determinada por cualquier análisis
conveniente que pueda detectar tal enlace. Los siguientes son
algunos ejemplos apropiados.
El enlace de IL-13 con la región
extracelular de la proteína IL-13bc específicamente
causará una rápida inducción de fosfotirosina sobre la proteína
receptor. Se describen abajo, los ensayos para la actividad del
enlace del ligando según se mida por la inducción de la
fosforilación.
Alternativamente, una proteína
IL-13bc (tal como, por ejemplo, una forma soluble
del dominio extracelular) se produce y utiliza para detectar el
enlace IL-13. Por ejemplo, una construcción ADN se
prepara en la cual el dominio extracelular (truncado anteriormente,
preferiblemente inmediatamente anterior, al dominio predicho de la
transmembrana) se liga en marco a un ADNc que codifica los dominios
bisagra C_{H}2 y C_{H}3 de una inmunoglobulina (Ig) \gamma1
humana. Esta construcción se genera en un vector de expresión
apropiado para las células COS, tal como pED\DeltaC o pMT2. El
plásmido temporalmente se transfecta en las células COS. La proteína
de fusión IL- 13bc-Ig secretada se colecta en el
medio acondicionado y se purifica por cromatografía de proteína
A.
La proteína de fusión
IL-13bc-Ig purificada se utiliza
para demostrar el enlace IL-13 en un número de
aplicaciones. La IL-13 puede estar cubierta dentro
de la superficie de una placa de Ensayo con sustancias
inmunoabsorbentes unidas a Enzimas (ELISA), y luego los sitios de
enlace bloqueados con albúmina de suero bovino o caseina utilizando
soluciones reguladoras de ELISA estándar. La proteína de fusión
IL-13bc-Ig luego se une a la
fase-sólida IL-I3, y el enlace se
detecta con un Ig anti-humano de cabra secundario
conjugado con peróxidasa de rábano picante. La actividad de la
enzima unida específicamente se puede medir con un sustrato
colorimétrico, tal como tetrametil benzidina y las lecturas de
absorbancia.
La IL-13 también se puede
expresar sobre la superficie de células, por ejemplo proporcionando
un dominio transmembrana o un enlace glicosil fosfatidil inositol
(GPI). Las células de expresión del enlace de la membrana
IL-13 pueden ser identificadas utilizando la
proteína de fusión IL-13bc-Ig. La
fusión IL-13bc-Ig soluble se une a
la superficie de estas células y se detecta con Ig antihumano de
cabra conjugado a un fluorocromo, tal como fluorescina isotiocianato
y citometría de flujo.
Un método de selección genética de levadura, la
"trampa de interacción" [Gyuris et al, Cell
75:791-803, 1993], puede ser utilizado para
determinar si una proteína IL-13bc tiene una
actividad biológica de IL-13bc como se define en
esta. En este sistema, la expresión de genes reportero a partir de
LexAop-Leu2 y LexAop-LacZ
dependiendo de la interacción entre la proteína cebo, por ejemplo en
este caso una especie que interactúa con IL-13bc
humana, y la presa, por ejemplo en este caso la proteína humana
IL-13bc. De tal manera, alguien puede medir la
fuerza de la interacción por el nivel de la expresión de Leu2 o
LacZ. El método más simple es medir la actividad de la proteína
codificada LacZ, \beta-galactosidasa. Esta
actividad puede ser juzgada por el grado azulado sobre el
X-Gal que contiene el medio o filtro. Para la
medición cuantitativa de la actividad de la
\beta-galactosidasa, se pueden encontrar ensayos
estándar en "Methods in Yeast Genetics" Cold Spring Harbor, New
York, 1990 (by Rose, M.D., Winston, F., y Hieter, P.).
En dichos métodos, si un deseo es determinar si
la proteína IL-13bc interactúa con una especie
particular (tal como, por ejemplo, una proteína citosílica que se
une al dominio intracelular de la IL-13bc in
vivo), esa especie puede ser utilizada como el "cebo" en la
trampa de interacción con la proteína IL-13bc para
ser probada sirve como la "presa", o viceversa.
Se utilizó, un modelo
bien-caracterizado de murina para asma alérgica, en
el que la exposición al alergeno conduce a la Hipersensibilidad de
las vías aéreas ("AHR"), la eosinofilia pulmonar, elevaciones
en suero de los niveles IgE antígeno-específico, y
el incremento en el contenido de moco en la vía aérea epitelial (3,
11). Ratones machos A/J se inmunizaron vía intraperitoneal y
posteriormente se desafiaron vía intratraqueal con ovalbúmina (OVA)
soluble, siendo el fenotipo alérgico evaluado 4 días después del
desafío con el antígeno (13). El bloqueo de IL-13 se
realizó por la administración sistémica de una proteína de fusión
IL-13bc-IgGFc soluble
(sIL-13bc- Fc), que específicamente se une a y
neutraliza la IL-13, 24 horas antes del subsiguiente
desafío con el alergeno intratraqueal (14). El desafío de los
ratones alergeno-inmuinizado resultó en un
incremento significante en sensibilidad de las vías aéreas para
acetilcolina (15) (Fig. 2A). El bloqueo de IL-13
resultó en la inversión completa de dicha AHR
alergeno-inducida establecida; de esta manera la
IL-13 es necesaria para la expresión de AHR en este
modelo. La capacidad de ablación de IL-13 para
revertir la AHR después del desarrollo completo del fenotipo de asma
alérgica contrasta con la incapacidad de ablación de
IL-4 para realizar dicha inversión. El mecanismo
subyacente de la eficacia del bloqueo de
IL-4R\alpha para revertir la AHR
alergeno-inducida puede ser la inhibición del
proceso mediado por IL-13, consistente con el hecho
de que la activación de Stat6 es en dirección 3' de la señalización
mediada por IL-4R\alpha por ambas citoquinas. La
IL-13 es probablemente el factor de células
T-derivadas CD4+ primarias responsable para la AHR
alergeno-inducida.
Para evaluar los mecanismos candidatos
subyacentes de expresión de
IL-13-dependiente de la AHR, se
caracterizan las cascadas alérgicas efector conocidas. Los
eosinófilos han sido implicados como células efector primarias en la
AHR del asma y el asmático (16), pero la inhibición de la
IL-13 previo a la provocación del antígeno repetido
no afectó significantemente la eosinofilia pulmonar
alergeno-inducida (17) (Fig. 2B). Para evaluar la
relevancia de las sendas mediadas por IgE, medimos la
OVA-específica en el IgE del suero (18). Los niveles
de OVA-específicos de IgE se observaron en ratones
OVA-sensibilizados y -desafiados, mientras que no se
detectaron ningún nivel de anticuerpos
antígeno-específico en ratones
PBS-inmunizados y -desafiados (Fig. 2C). El bloqueo
de IL-13 no alteró los niveles de
OVA-específicos en IgE, una falta de supresión que
es probablemente debido al hecho de que el bloqueo de
IL-13 ocurre después de la formación inicial del
cebado del antígeno y del anticuerpo. No obstante, estos resultados
muestran que la AHR no es dependiente sobre la producción de IgE en
este modelo, consistente con los reportes de que la AHR alérgica
desarrolla normalmente en ratones deficientes en IgE y deficientes
en célula B (19).
En congruencia con la patología del asma humana,
el asma alérgica en modelos murina se asocia con un incremento
marcado en el contenido de moco del epitelio de las vías aéreas (5,
11). La hipersecreción de moco es particularmente profunda en la
autopsia de especimenes de pacientes quienes murieron de ataques de
asma agudos (20). El bloqueo de las IL-13 opuestas
alergeno-inducida incrementa en el moco- que
contiene las células en las vías aéreas (Fig. 3), demostrando que
los incrementos alergeno-inducido en el contenido de
moco en las vías aéreas dependen de la IL-13. La
IL-4 también está implicada en este procedimiento,
como los ratones transgénicos IL-4 muestran marcada
hiperplasia de la célula caliciforme en la ausencia de
sensibilización del antígeno (5). Sin embargo, la transferencia de
los clones Th2 a partir de ratones IL-4- deficientes
y ratones control dentro de las vías aéreas murina induce la
superproducción de moco (21), sugiriendo, con todo otra vez, que el
papel inmunoregulador de la IL-4 necesita estar
cuidadosamente diferenciado de su papel como una molécula
efector.
La administración diaria del recombinante
IL-13 (rIL-13) a las vías aéreas de
AHR inducida en ratones naive (no-inmunizados),
demuestra que el incremento en la actividad de la
IL-13 fue suficiente para inducir la AHR (Fig. 4A)
(22). La AHR desarrollada en las 72 horas después del inicio de la
administración de la rIL-13. Un influjo significante
de eosinófilos dentro del fluido de lavado broncoalveolar se
observó temprano después de la administración de la
rIL-13, sin embargo la eosinofilia pulmonar no se
observó en el tiempo de expresión de la AHR (Fig. 4B). A pesar de
que la significancia del transcurso de tiempo del influjo eosinófilo
permanece difusa, esto sugiere que la IL-13 sola
puede ser suficiente para iniciar la infiltración eosinofílica de
las vías aéreas, quizás a través de su capacidad para favorecer la
expresión de quimicina (23). La administración de
rIL-13 en las vías aéreas también resulta en un
incremento dependiente del tiempo en el IgE del suero total (Fig.
4C) (24), en línea con la capacidad
previamente-reportada de la IL-13
para regular la síntesis del IgE (25). El incremento de IgE en el
suero fue independiente de cualquier inmunización con alergeno,
descubriendo que resuena con la observación de que el fenotipo
asmático humano correlaciona mejor con el total, antes que con el
alergeno-específico, concentraciones de IgE en suero
(26). Como se predijo a partir de los estudios de inhibición de la
IL-13 arriba, la administración de
rIL-13 induce a un incremento en la producción de
moco en las vías aéreas (Fig. 4D) (27).
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13. Los ratones macho A/J de
seis-semanas-edad se obtuvieron de
The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) y se alojaron bajo campana
de flujo laminar en un ambientalmente específico controlado libre de
patógenos, facilidad del animal para la duración de los experimentos
(N = 4-10 ratones/grupo experimental). Los estudios
reportados aquí conformaron los principios para la investigación de
animales de laboratorio delineados por las directrices para el uso
de animales experimentales del Animal Welfare Act y el Department
de Health, Education y Welfare (N.I.H.). Los ratones se inmunizaron
mediante una inyección intraperitoneal de 10 ug ovalbúmina (OVA;
grado crudo IV, Sigma; St. Louis, MO) en 0.2 ml de PBS o PBS solo.
14 días después de la inmunización, los ratones se anestesiaron con
una mezcla de ketamina y xilazina (45 y 8 mg/kg, respectivamente) y
se desafiaron vía intratraqueal con 50 ul de una solución al 1.5% de
OVA o un volumen equivalente de PBS como un control. 10 días después
de este primer desafío con el antígeno, los ratones se desafiaron de
nuevo vía intratraqueal con OVA o PBS. La caracterización del
fenotipo alérgico se realizó 96 horas después del segundo desafío
con el antígeno.
14. La IL-13bc humano se clono
según se describen arriba. Por la expresión soluble del homólogo
murina, un vector de expresión pED que contiene el ADN que codifica
el dominio extracelular sIL-13bc murina, combinadas
en marco con las regiones bisagra CH2/CH3 de IgG1 humano (según lo
descrito en ejemplos previos), se transfectó dentro de las células
CHO [D. D. Donaldson et al., J. Immunol. 161,
2317 (1998)]. La sIL-13bc-Fc
se purificó con rProtein A-Sepharose [J. F. Urban
et al., Immunity 8, 255 (1998)]. La
ID_{50} in vitro, como se determina por la capacidad para
neutralizar 3 ng/ml de IL-13 murina en el ensayo de
proliferación B9 fue aproximadamente 10 ng/ml. La IgG humana,
utilizado como un control para la
sIL-13bc-Fc, de modo semejante se
purificó por cromatografía rProtein A-Sepharose de
una solución al 10% de globulina inmune humana es decir,
comercialmente disponible, por administración intravenosa (Miles)
[ibid]. Los ratones fueron dispensados con
sIL-13bc-Fc (400ug), o una cantidad
equivalente del control hu-IgG, por inyección
intraperitoneal en el Día -1, O, +1, y +3 del desafío secundario con
el antígeno.
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15. La reactividad de la vías aéreas para una
administración intravenosa de acetilcolina se midió (11), 3
días después de desafío final intratraqueal. Los ratones se
anestesiaron con pentobarbital sódico (90 mg/kg), se intubaron,
ventilado a un índice de 120 respiraciones/minuto con un volumen de
marea constante del aire (0.2 ml), y paralizados con bromuro de
decametonio (25 mg/kg). Después de establecer una presión estable de
las vías aéreas, la acetilcolina se inyectó vía intravenosa (50
ug/kg) y la presión dinámica de las vías aéreas se siguió durante 5
minutos.
16. G. J. Gleich, J. All. Clin.
Immunol. 8, 422 (1990).
17. Lavado broncoalveolar se realizó según lo
descrito (11).
18. Un riñón se extirpo, y la sangre combinada
se colecto para el análisis de anticuerpo según lo descrito (11). El
suero se separó por centrifugación y se almacenó a -80ºC hasta el
análisis. Los niveles de IgE OVA-específico en suero
se determinaron por ELISA de fase doble. Los pozos de las muestras
se cubrieron con una solución de 0.01% de OVA en PBS, bloqueados con
10% de FBS en PBS, y se lavaron con 0.05% de
Tween-20 en PBS. Las muestras de suero se diluyeron
1:10 y 1:100 con 10% FBS en PBS. Después de una incubación durante
la noche, las placas se lavaron con 0.05% Tween-20
en PBS y se adicionó IgE anti-ratón
biotina-conjugada (PharMingen, San Diego, CA).
Después de un lavado, 0.0025 mg/ml de peroxidasa avidina (Sigma) en
10% de FBS/PBS se adicionó, y las placas se desarrollaron con ABTS
(2.2’-azino-did
[3-etil-benzatiazona sulfonato])
(Kirkegaard y Perry). Las placas se leyeron a 405 nm dentro de 30
minutos. Los valores 0.D. reportados son de muestras de suero
diluidas 1:10 dado que estos valores se probaron que están debajo
del punto de saturación del ensayo por comparación de los valores
O.D. de las muestras diluidas de suero 1:100 con 10% de FBS/PBS.
19. P. D. Mehlhop et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 94, 1344 (1997); M. Korsgren
et al., J. Exp. Med. 185, 885
(1997).
20. T. Aikawa et al., Chest
101, 916 (1992).
21. L. Cohn, R. J. Homer, A.
Marinov, J. Rankin, K. Bottomly. J. Exp.
Med. 186, 1737 (1997).
22. ADN que codifica una guía de melitina de
abeja [D. C. Tessier, D. Y. Thomas, H. E.
Khouri, F. Laliberte, T. Vernet, Gene
2, 177 (1991)] seguido por un tag
seis-histidina se combinó por un sitio de hendidura
enteropeptidasa en la región madura de IL-13 murina
en Gly21 y se construyó en el vector de expresión de mamífero pHTop.
La proteína IL-13 murina H6-EK se
produce a partir de las células CHO establemente- transfectadas y se
purifica vía cromatografía Ni-NTA para una pureza
mayor del 97% según se determinó por SDS-PAGE. La
concentración de la proteína se determinó por absorción a 280 nm y
la contaminación de endotoxina fue menor de 30 EU/mg según se midió
mediante el ensayo Cape Cod Associates LAL. La ED_{50} de
IL-13 murina H6-EK según se
determinó por el ensayo de proliferación
Ba/F3.IL-13R 1 fue lng/ml. La rIL-13
Murine (5ug en un volumen total de 50 ul) se administró diariamente
por instalación intratraqueal a los ratones naive anestesiados con
una mezcla de ketamina y xilazina (45 y 8 mg/kg,
respectivamente).
23. M. Goebeler et al.,
Immunol. 91, 450 (1997).
24. Un ELISA IgE-específico
murina se utilizó para cuantificar los niveles totales de
inmunoglobulina IgE en suero utilizando pares de anticuerpo
complementarios para IgE de ratón (R35-72 y
R35-92) obtenido de PharMingen de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Las muestras por duplicado (de una
dilución 1/10 en 10% de FBS en PBS) se examinaron a partir de cada
animal. Las lecturas de muestras O.D. se convirtieron a pg/ml
utilizando los valores obtenidos de curvas estándar curves generadas
con concentraciones conocidas de IgE recombinante de ratón
(5-2000 pg/ml), y la concentración final se obtuvo
multiplicando por el factor de dilución.
25. C. L. Emson, S. E. Bell, A.
Jones, W. Wisden, A. N. J. McKeazie, J. Exp.
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26. L. R. Friedhoff, D. G. Marsh,
Int. Arch. All. Immunol. 100, 355 (1993).
27. Para examinar los efectos de
rIL-13 sobre el contenido de célula mucosa del
epitelio de las vías aéreas, los pulmones se extirparon y se fijaron
en 10% de formalina. Luego se lavaron en 70% de etanol,
deshidratado, se incrustaron en glicol metacrilato, se cortaron en
secciones de 10 uM, se montaron en portaobjetos, y se tiñeron con
hematoxilina y eosina y ácido Schiff intermitente. Se examinaron
cuatro secciones por animal; 4 campos se puntuaron por sección del
pulmón. Las secciones se puntuaron sobre una escala de
1-4 con 1 representando ningún contenido de célula
mucosa.
28. J. Luyimbazi, X. Xu, M.
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no-publicados.
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\hskip1cmWood, Clive
\hskip1cmWills-Karp, Marsha
\hskip1cmGenetics Institute, Inc.
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<120> Cadena del Receptor de la
Citoquina
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<130> GI 5268A
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1525
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (256)..(1404)
\newpage
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 383
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Mus sp.
\newpage
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<400> 2
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\newpage
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<210> 3
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<211> 1369
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (103)..(1245)
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 380
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> oligonucleótido
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<400> 5
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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\hfill20
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<212> ADN
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<220>
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\hskip-.1em\dddseqskipctccattcgc tccaaattcc
\hfill20
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<210> 8
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\hskip-.1em\dddseqskipagtctatctt acttttactc g
\hfill21
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\hskip-.1em\dddseqskipcatctgagca ataaatattc ac
\hfill22
Claims (18)
1. El uso de un antagonista de
IL-13 en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de una condición asociada con la IL-13
en un sujeto mamífero, en donde dicho antagonista es un anticuerpo
contra la IL-13 o un fragmento de estos se une a la
IL-13 y en donde dicha condición asociada con la
IL-13 es la atopia, una condición alérgica, el asma,
una enfermedad del complejo antígeno-anticuerpo, una
condición inflamatoria de los pulmones, inmunodeficiencia, o el
cáncer.
2. El uso de la Reivindicación 1, en donde dicha
condición es una condición mediada por IgE.
3. El uso de las Reivindicaciones 1 ó 2, en
donde dicha condición es la atopia.
4. El uso de las Reivindicaciones 1 ó 2, en
donde dicha condición es una condición alérgica.
5. El uso de las Reivindicaciones 1 ó 2, en
donde dicha condición es asma.
6. El uso de las Reivindicaciones 1 ó 2, en
donde dicha condición es una enfermedad del complejo
antígeno-anticuerpo.
7. El uso de la Reivindicación 6, en donde dicha
enfermedad del complejo antígeno-anticuerpo es el
lupus, la nefritis, la tiroiditis, la glomerulonefritis, la
enfermedad de Graves, o el síndrome nefrótico.
8. El uso de la Reivindicación 7, en donde dicha
enfermedad del complejo antígeno-anticuerpo es el
lupus.
9. El uso de la Reivindicación 7, en donde dicha
enfermedad del complejo antígeno-anticuerpo es la
nefritis.
10. El uso de la Reivindicación 7, en donde
dicha enfermedad del complejo antígeno-anticuerpo es
la tiroiditis.
11. El uso de la Reivindicación 7, en donde
dicha enfermedad del complejo antígeno-anticuerpo es
la glomerulonefritis.
12. El uso de la Reivindicación 7, en donde
dicha enfermedad del complejo antígeno-anticuerpo es
la enfermedad de Graves.
13. El uso de la Reivindicación 7, en donde
dicha enfermedad del complejo antígeno-anticuerpo es
el síndrome nefrótico.
14. El uso de cualquiera de las Reivindicaciones
1 a 13, en donde dicho antagonista es un anticuerpo contra la
IL-13.
15. El uso de cualquiera de las Reivindicaciones
1 a 13, en donde dicho antagonista es un fragmento enlace de
IL-13 de un anticuerpo contra
IL-13.
16. El uso de un antagonista de
IL-13 en la fabricación de un medicamento para
inhibir la interacción de IL-13 con una proteína
IL-13bc en una condición seleccionada de la atopia,
una condición alérgica, el asma, una enfermedad del complejo
antígeno-anticuerpo, una condición inflamatoria de
los pulmones, inmunodeficiencia, o el cáncer, en donde dicho
antagonista es un anticuerpo contra IL-13 o uno de
sus fragmentos de enlace de la IL-13.
17. El uso de la Reivindicación 16, en donde
dicha enfermedad del complejo antígeno-anticuerpo es
el lupus, el síndrome nefrótico, la nefritis, la tiroiditis, la
glomerulonefritis, o la enfermedad de Graves.
18. El uso de un antagonista de
IL-13 en la fabricación de un medicamento para
tratar la atopia en un sujeto mamífero, en donde dicho antagonista
es un anticuerpo contra IL-13 o uno de sus
fragmentos de enlace de la IL-13.
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