ES2277460T3 - Cadena del receptor de la citoquina. - Google Patents

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Debra Donaldson
Lori Fitz
Tamlyn Neben
Matthew J. Whitters
Clive Wood
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Abstract

El uso de un antagonista de IL-13 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una condición asociada con la IL-13 en un sujeto mamífero, en donde dicho antagonista es un anticuerpo contra la IL-13 o un fragmento de estos se une a la IL-13 y en donde dicha condición asociada con la IL- 13 es la atopia, una condición alérgica, el asma, una enfermedad del complejo antígeno-anticuerpo, una condición inflamatoria de los pulmones, inmunodeficiencia, o el cáncer.

Description

Cadena del receptor de la citoquina.
Campo de la invención
La presente invención se relaciona con el uso de un antagonista de IL-13 en la fabricación de un medicamento para tratar una condición asociada con la IL-13 en un sujeto mamífero, en donde dicho antagonista es un anticuerpo contra IL-13 o uno de sus fragmentos de enlace de la IL-13 y en donde dicha condición relacionada con IL-13 es la atopia, una condición alérgica, el asma, una enfermedad del complejo antígeno-anticuerpo, una condición inflamatoria de los pulmones, inmunodeficiencia, o el cáncer.
Antecedentes de la invención
Una variedad de moléculas reguladoras, conocidas como citoquinas, han sido identificadas incluyendo la interleucina-13 (IL-13). Varias formas de proteínas de IL-13 y el ADN que codifica varias formas de actividad de la IL-13 se describen en McKenzie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3735 (1993); Minty et al., Nature 362:248 (1993); y Aversa et al., WO94/04680. De tal manera, el término "TL-13" incluye las proteínas que tienen la secuencia y/o actividad biológica descritas en estos documentos, tanto si se producen por técnicas de ingeniería genética recombinante; se purifican de fuentes de células que producen el factor naturalmente o bajo la inducción con otros factores; como sintetizadas por técnicas químicas; o una combinación de lo precedente.
La IL-13 es una citoquina que ha sido implicada en la producción de varias actividades biológicas incluyendo: inducción de IgG4 e intercambio de IgE, incluyendo en células B inmaduras humanas (Punnonen et al., J. Immunol. 152:1094 (1994)); inducción de la transcripción de la cadena pesada de la línea germinal IgE (\varepsilon) y la expresión de CD23 en células B humanas normales (Punnonen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3730 (1993)); e inducción de la proliferación de la célula B en la presencia de CD40L o y-CD40 mAb (Cocks et al., Int. Immunol. 5:657 (1993)). A pesar de que varias actividades de la IL-13 son similares a aquellas de la IL-4, en contraste con IL- 4, la IL-13 no tiene crecimiento que promueva los efectos sobre las células T activadas o los clones de la célula T (Zurawski et al, EMBO J. 12:2663 (1993)).
Como la mayoría de las citoquinas, la IL-13 muestra ciertas actividades biológicas interactuando con un receptor IL-13 ("IL-13R") sobre la superficie de las células blanco. La IL-13R y el receptor IL-4 ("IL-4R") comparten un componente común, el cual se requiere para la activación del receptor; sin embargo, la IL-13 no se une a las células transfectadas con la IL-4R 130 kD (Zurawski et al., supra). De esta manera, la IL-13R debe contener al menos otra cadena de enlace al ligando. Los receptores de la citoquina comúnmente se componen o de dos o tres cadenas. La clonación de una cadena de enlace al ligando para IL-13 se ha reportado recientemente (Hilton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:497-501).
Sería deseable identificar y clonar la secuencia para cualquier otra cadena de enlace para la IL-13 de IL-13R a fin de que las proteínas IL-13R puedan ser producidas por varias razones, incluyendo la producción de terapéuticos y de selección para los inhibidores del enlace de la IL-13 con el receptor y la señalización del receptor.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona el uso de un antagonista de la IL-13 en la fabricación de un medicamento para tratar una condición asociada con la IL-13 en un sujeto mamífero, en donde dicho antagonista es un anticuerpo contra IL-13 o uno de sus fragmentos de enlace de la IL-13 y en donde dicha condición relacionada con la IL-13 es la atopia, una condición alérgica, el asma, una enfermedad del complejo antígeno-anticuerpo, una condición inflamatoria de los pulmones, inmunodeficiencia, o el cáncer.
Otro aspecto de la invención es el uso de un antagonista de la IL-13 en la fabricación de un medicamento para inhibir la interacción de la IL-13 con una proteína IL-13bc en una condición seleccionada de la atopia, una condición alérgica, el asma, una enfermedad del complejo antígeno-anticuerpo, una condición inflamatoria de los pulmones, inmunodeficiencia, o el cáncer, en donde dicho antagonista es un anticuerpo contra IL-13 o uno de sus fragmentos de enlace de la IL-13.
También se describen los polinucleótidos que codifican las cadenas de enlace de la IL-13 del receptor de la interleucina-13 se revelan, incluyendo sin limitación aquellos de los receptores murina y humano. En ciertas modalidades, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de:
(a)
la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 del nucleótido 256 al nucleótido 1404;
(b)
la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3 del nucleótido 103 al nucleótido 1242;
(c)
una secuencia de nucleótidos que varía de la secuencia de la secuencia de nucleótidos especificada en (a) o (b) como un resultado de degeneración del código genético;
(d)
una secuencia de nucleótidos capaz de hibridizar bajo condiciones rigurosas al nucleótido especificado en (a) o (b);
(e)
una secuencia de nucleótidos que codifica una especie homóloga de la secuencia especificada en (a) o (b): y
(f)
una variante alélica de la secuencia de nucleótidos especificada en (a) o (b).
Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos codifica una proteína que tiene una actividad biológica del receptor IL-13 humano. La secuencia de nucleótidos puede estar unida operablemente a una secuencia control de expresión. En las modalidades preferidas, el poli nucleótido contiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 del nucleótido 256 al nucleótido 1404; la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 del nucleótido 319 al nucleótido 1257; la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 del nucleótido 1324 al nucleótido 1404; la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N0:3 del nucleótido 103 al nucleótido 1242; la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:3 del nucleótido 178 al nucleótido 1125; o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:3 del nucleótido 1189 al nucleótido 1242.
Adicionalmente se describen los polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de:
(a)
la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2;
(b)
la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 de los aminoácidos 22 a 334;
(c)
la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 de los aminoácidos 357 a 383;
(d)
la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4;
(e)
la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N0:4 de los aminoácidos 26 a 341;
(f)
la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 de los aminoácidos 363 a 380; y
(g)
los fragmentos de (a)-(f) que tienen una actividad biológica de la cadena de enlace del receptor IL-13. Otras modalidades preferidas codifican la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 de los aminoácidos 1 a 331 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 de los aminoácidos 26 a 331.
Las células huésped, preferiblemente las células de mamífero, transformadas con los polinucleótidos también se describen.
También se describe en esta un procedimiento para producir una proteína IL-13bc. El procedimiento comprende:
(a)
el crecimiento de un cultivo de la célula huésped de la presente invención en un medio de cultivo apropiado; y
(b)
la purificación de la proteína humana IL-13bc a partir del cultivo.
Las proteínas producidas de acuerdo con estos métodos también se proporcionan.
La presente invención también proporciona una proteína IL-13bc aislada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de:
(a)
la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2;
(b)
la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 de los aminoácidos 22 a 334;
(c)
la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 de los aminoácidos 357 a 383;
(d)
la secuencia de aminoácidos de la SEQ IID NO: 4;
(e)
la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 de los aminoácidos 26 a 341;
(f)
la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N0:4 de los aminoácidos 363 a 380; y
(g)
los fragmentos de (a)-(f) que tienen actividad biológica de la cadena de enlace de receptor IL-13.
Preferiblemente la proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; la secuencia del aminoácido 22 a 334 de la SEQ ID NO: 2; la secuencia de la SEQ ID NO: 4; o la secuencia del aminoácido 26 a 341 de la SEQ ID NO: 4. En otras modalidades preferidas, la secuencia de aminoácidos especificada adicional es parte de una proteína de fusión (con una secuencia de aminoácidos no derivada de la IL-13bc). Las proteínas de fusión preferidas comprenden un fragmento del anticuerpo, tal como un fragmento de Fe. Particularmente las modalidades preferidas comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 de los aminoácidos 1 a 331 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 de los aminoácidos 26 a 331.
También se describen, las composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de la presente invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Adicionalmente se describen las composiciones que comprenden un anticuerpo que reacciona específicamente con una proteína según lo descrito en esta.
Los métodos de identificación de un inhibidor del enlace de la IL-13 con la IL-13bc o el receptor IL-13 también se describen. Estos métodos comprenden:
(a)
la combinación de una proteína IL-13bc o de uno de sus fragmentos con la IL-13 o un fragmento de esta, dicha combinación forma una primera mezcla de enlace;
(b)
la medición de la cantidad de enlace entre la proteína y la IL-13 o el fragmento en la primera mezcla de enlace;
(c)
la combinación de un compuesto con la proteína y la IL-13 o un fragmento para formar una segunda mezcla de enlace;
(d)
la medición de la cantidad de enlace en la segunda mezcla de enlace; y
(e)
la comparación de la cantidad de enlace en la primera mezcla de enlace con la cantidad de enlace en la segunda mezcla de enlace;
en donde el compuesto es capaz de inhibir el enlace de la IL-13 con la proteína IL-13bc o con el receptor IL-13 cuando una disminución en la cantidad de enlace de la segunda mezcla de enlace ocurre. También se describen, los inhibidores de IL-13R identificados por estos métodos y las composiciones farmacéuticas que los contienen.
Los métodos de inhibición del enlace de la IL-13 con las proteínas IL-13bc o con el receptor IL-13 en un sujeto mamífero también son revelados, los cuales comprenden la administración de una cantidad efectiva terapéuticamente de una composición que contiene una proteína IL-13bc, una IL-13bc o un inhibidor IL-13R o un anticuerpo contra la proteína IL-13bc.
Los métodos también descritos para el aumento de la potencia de la actividad de la IL-13, que comprende la combinación de una proteína que tiene actividad de la IL-13 con una proteína de la reivindicación 11 y que contiene tal combinación con una célula que expresa al menos una cadena de IL-13R fuera de IL-13bc. Preferiblemente, la etapa de contacto se realiza mediante la administración de una cantidad efectiva terapéuticamente de dicha combinación a un sujeto mamífero.
Los métodos adicionales se revelan para tratar una condición asociada con la IL-13-probada en un sujeto mamífero, dicho método comprende la administración de una cantidad efectiva terapéuticamente de una composición que comprende un antagonista de IL-13 y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Otros métodos descritos se relacionan con un método de inhibición de la interacción de IL-13 con una proteína IL-13bc en un sujeto mamífero que comprende la administración de una cantidad efectiva terapéuticamente de una composición que comprende un antagonista de IL-13 y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, el antagonista se selecciona del grupo que consiste de una proteína IL-13bc, una forma soluble de IL-13R\alpha1, un anticuerpo contra IL-13 o uno de sus fragmentos de enlace de la IL-13, un anticuerpo contra IL-13bc o uno de sus fragmentos de enlace de la IL-13bc, un anticuerpo contra IL-13R\alpha1 o uno de sus fragmentos de enlace de la IL-13R\alpha1, mutantes del enlace de la IL-13R de la IL-4, una pequeña molécula capaz de inhibir la interacción de la IL-13 con IL-13bc y una pequeña molécula capaz de inhibir la interacción de la IL-13 con IL-13R\alpha1.
Breve descripción de las figuras
Fig. 1: La figura presenta fotografías de la IL-13, IL-4, IL-11 y células COS transfectadas simuladas después de la exposición a IL- 13bc-Fc según lo descrito en el Ejemplo 4 abajo.
Fig. 2: Inversión de la hiper sensibilidad de las vías aéreas inducida por un alergeno, mediante el bloqueo in vivo de interleucina-13. 10 días después del desafío intratraqueal inicial, los ratones inmunizados OVA- y PBS-se desafiaron otra vez intratraquealmente con OVA o PBS. Los ratones se dispensaron con sIL-13bc-Fc (400 ug) o una cantidad equivalente de hu-IgG control mediante inyección intraperitoneal en el Día -1, O, +1 y +3 del desafío secundario con el antígeno. El fenotipo alérgico se evaluó 4 días después del desafío PBS u OVA. (A) Hiper sensibilidad de las vías respiratorias (AHR) para un desafío de la acetilcolina, definido por subida de la presión máxima de las vías aéreas integradas al tiempo (índice del tiempo de la presión de las vías aéreas [APTI] en cm. de H_{2}O x seg.). (B) Composición de la célula inflamatoria de fluidos del lavado broncoalveolar. Los porcentajes diferenciales de células se determinaron por evaluación microscópica de luz de las preparaciones de citocentrífuga. Los datos se expresan como números absolutos de células. (C) concentraciones de OVA-específica del suero IgE. Los resultados son promedios +/- SEM de 8-10 animales por grupo. *P < 0.05 comparado con los grupos control PBS respectivos; **P < 0.05 comparado con el grupo OVA/Hu-Ig (ANOVA de una vía seguido por la prueba de la diferencia menos significante de Fisher para comparaciones multiples).
Fig. 3: Los efectos del bloqueo de IL-13 sobre el incremento manejado del alergeno en células que contienen moco en el epitelio de las vías aéreas. Secciones del pulmón (N = 4 por grupo experimental, cuatro secciones por animal) se fijaron en formalina, se cortaron en secciones de 10um y se tiñeron con hematoxilina y eosina, y ácido Schiff intermitente. Las secciones representativas se muestran. Bars =100 um. PBS/Hu-Ig: PBS-inmunizado y los controles desafiados, probaron que pocas células contienen moco. OVA/Hu-Ig: alergeno-inducido incremento en las células inflamatorias intersticiales e incremento en el número de células caliciformes que contienen moco. OVA/sIL-13bc-Fc: efecto inhibitorio dramático del bloqueo de IL-13 sobre la producción alergeno-inducida de moco en las células caliciformes.
Fig. 4: IL-13 inducción de hipersensibilidad de las vías aéreas. Los ratones Naive se dispensaron con IL-13 recombinante (5 ug/ratón, 50 ul volumen) o PBS diariamente por instalación intratraqueal. 24 horas después del último tratamiento, se determinaron, (A) Hiper sensibilidad de las vías aéreas, (B) niveles de eosinófilo BAL, (C) niveles de IgE total en suero, y (D) grado de moco. Los resultados son promedios +/- SEM (barras verticales) de 7-10 animales por grupo. *P < 0.05 comparado con el grupo PBS (test de Student).
Descripción detallada de las modalidades preferidas
Los inventores de la presente aplicación, por primera vez han identificado y proporcionado los polinucleótidos que codifican la cadena de enlace a IL-13 de la IL-13R (a partir de este momento "IL-13bc"), incluyendo sin limitación los polinucleótidos que codifican la IL-13bc humana y murina.
La SEQ ID NO: 1 proporciona la secuencia de nucleótidos de un ADNc que codifica la IL-13bc murina. La SEQ ID NO: 2 proporciona la secuencia predicha de aminoácidos de la cadena del receptor, incluyendo una secuencia señal putativa de los aminoácidos 1-21. La IL-13bc murina madura se considera que tiene la secuencia de aminoácidos 22-383 de la SEQ ID NO: 2. La cadena del receptor de murina madura tiene al menos tres dominios distintos: un dominio extracelular (que comprende aproximadamente los aminoácidos 22-334 de la SEQ ID NO: 2), un dominio transmembrana (que comprende aproximadamente los aminoácidos 335-356 de la SEQ ID NO:2) y un dominio intracelular (que comprende aproximadamente los aminoácidos 357-383 de la SEQ ID NO:2).
La SEQ ID NO: 3 proporciona la secuencia de nucleótidos de un ADNc que codifica la IL-13bc humana. La SEQ ID NO: 4 proporciona la secuencia predicha de aminoácidos de la cadena del receptor, incluyendo una secuencia señal putativa de los aminoácidos 1-25. La IL-13bc humana madura se considera que tiene la secuencia de aminoácidos 26-380 de la SEQ ID NO: 4. La cadena del receptor humana madura tiene al menos tres dominios distintos: un dominio extracelular (que comprende aproximadamente los aminoácidos 26-341 de la SEQ ID NO: 4), un dominio transmembrana (que comprende aproximadamente los aminoácidos 342-362 de la SEQ ID NO: 4) y un dominio intracelular (que comprende aproximadamente los aminoácidos 363-380 de la SEQ ID NO:4).
Los primeros 81 aminoácidos de la secuencia humana IL-13bc son idénticos a la secuencia traducida de una secuencia tag expresada (EST) identificada como "yg99f10.r1 Homo sapiens clon de ADNc 41648 5'" y asignada en la base de datos número de acceso R52795.gbest2. No hay homologías o motivos de secuencias en esta secuencia EST que conduciría a aquellos de habilidad en el oficio a identificar la proteína codificada como un receptor de citoquina. Un clon de ADNc que corresponde a esta entrada de la base de datos está públicamente-disponible del I.M.A.G.E. Consortium. Subsiguiente a la fecha de la prioridad de la presente aplicación, tal clon se pide por los solicitantes y en secuencia. La secuencia de tal clon se determinó para que la secuencia sea previamente reportada por los solicitantes como SEQ ID NO: 3 en esta.
Las formas solubles de la proteína IL-13bc también se pueden producir. Tales formas solubles incluyen sin limitación proteínas que contienen aminoácidos 1-334 o 22-334 de la SEQ ID NO: 2 o aminoácidos 1-341 o 26-341 de la SEQ ID NO: 4. Las formas solubles de IL-13bc adicionalmente se caracterizan por ser solubles en solución acuosa, preferiblemente a temperatura ambiente. Las proteínas IL- 13bc que contienen solamente el dominio intracelular o una porción de estos también se pueden producir. Cualquiera de las formas de IL-13bc de menos de la longitud completa se refiere colectivamente aquí como formas de longitud completa y madura como "IL-13bc" o " proteínas IL-13bc". Las proteínas IL-13bc de menos de la longitud completa pueden ser producidas mediante la expresión de un fragmento correspondiente del polinucleótido que codifica la proteína IL-3bc de longitud completa (SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3). Estos fragmentos polinucleótidos correspondientes también se describen. Los polinucleótidos modificados según se describen anteriormente se pueden hacer por técnicas de biología molecular estándar, incluyendo la construcción de los apropiados mutantes con deleciones deseados, métodos de mutagénesis de sitio-dirigido o por la reacción en cadena de la polimerasa utilizando cebadores de oligonucleótidos apropiados.
Una proteína según lo descrito en esta tiene "una actividad biológica de la cadena del enlace del receptor IL-13" si este posee una o más de las siguientes características: (1) la capacidad de unir la IL-13 o uno de sus fragmentos (preferiblemente un fragmento de estos activo biológicamente); y/o (2) la capacidad para interactuar con el segunda cadena no-enlace de IL-13 de IL-13R para producir una señal característica del enlace de IL-13 con la IL-13R. Preferiblemente, la actividad biológica poseída por la proteína es la capacidad de unir la IL-13 o un fragmento de esta, más preferiblemente con un K_{D} de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 nM. Los métodos para la determinación tanto de una proteína particular o un péptido tiene dicha actividad incluye sin limitación los métodos descritos en los ejemplos proporcionados en esta.
La IL-13bc o los fragmentos activos de estos (proteínas IL-13bc) pueden estar combinadas para transportar las moléculas tales como inmunoglobulinas. Por ejemplo, las formas solubles de la IL-13bc pueden estar combinadas a través de secuencias "ligador" a la porción Fc de una inmunoglobulina. Otras proteínas de fusión, tal como aquellas con GST, Lex-A o MBP, también se pueden utilizar.
Adicionalmente se describen las variantes alélicas de las secuencias nucleótido según se publica en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3, es decir, las formas alternativas que ocurren naturalmente del polinucleótido aislado de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3 que también codifican las proteínas IL-13bc, preferiblemente aquellas proteínas que tienen una actividad biológica de IL-13bc. También se describen los polinucleótidos aislados que hibridizan a la secuencia de nucleótidos publicadas en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3 bajo condiciones altamente rigurosas (por ejemplo, 0.1xSSC a 65°C). Los polinucleótidos aislados que codifican las proteínas IL-13bc pero que difieren de la secuencia de nucleótidos publicada en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3 por virtud de la degeneración del código genético también se describen. También se describen, las variaciones en la secuencia de nucleótidos como las publicadas en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3 que se motivan por mutaciones de punto o por modificaciones inducidas.
También se describen los polinucleótidos que codifican los homólogos de la murina y la IL-13bc humana de otra especie animal, particularmente otra especie mamífero. Las especies homólogas pueden ser identificadas y aisladas o construidas por sondas o cebadores a partir de la murina o secuencias humanas reveladas en esta y la selección de un banco de una especie apropiada, tal como por ejemplo bancos construidos de PBMCs, timo o testículo de la especie relevante.
Los polinucleótidos aislados pueden estar unidos operablemente a una secuencia control de expresión tal como los vectores de expresión pMT2 o pED revelados en Kaufman et al., Ácidos Nucleicos Res. 19, 4485-4490 (1991), con el fin de producir la proteína IL-13bc recombinantemente. Muchas secuencias control de expresión apropiadas son conocidas en el oficio. Los métodos de expresión generales de proteínas recombinantes también son conocidos y se ejemplifican en R. Kaufman, los métodos en Enzymology 185, 537-566 (1990). Como se define en esta "unidos operablemente" significa ligado enzimáticamente o químicamente para formar un enlace covalente entre el polinucleótido aislado de la invención y la secuencia control de expresión, de una manera tal que la proteína IL- 13bc se expresa por una célula huésped que ha sido transformada (transfectada) con la secuencia control de expresión/polinucleótido ligada.
Un número de tipos de células pueden actuar como células huésped apropiadas para la expresión de la proteína IL-13bc. Cualquier tipo de célula capaz de expresar la proteína IL-13bc funcional puede ser utilizada en Apropiadas células huésped de mamífero incluye, por ejemplo, células COS de mono, células de Ovario de Hamster Chino (CHO), células 293 de riñón humano, células A431 epidérmico humano, células Colo205 humano, células 3T3, células CV-1, otras líneas celulares de primate transformadas, células diploides normales, cepas de células derivadas a partir de cultivo in vitro de tejido primario, explantes primarios, células HeLa, células L de ratón, BHK. HL-60, U937, HaK, Rat2, BaF3, 32D, FDCP-1, PC12, Mezcla o células C2C12.
La proteína IL-13bc también se puede producir por unión de manera operable del polinucleótido aislado de la invención con las secuencias control apropiadas en uno o más vectores de expresión de insecto, y empleando un sistema de expresión de insecto. Los materiales y métodos para los sistemas de expresión de células baculovirus/insecto están comercialmente disponibles en forma de kit, por ejemplo de, Invitrogen, San Diego, California, U.S.A. (el kit MaxBac®), y dichos métodos son bien conocidos en el oficio, según lo descrito en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). Las formas solubles de la proteína IL-13bc también se pueden producir en células de insecto utilizando polinucleótidos aislados apropiados según lo descrito
arriba.
Alternativamente, la proteína IL-13bc se puede producir en eucariotas inferiores tal como levadura o en procariotas tal como bacteria. Cepas de levadura apropiadas incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe. Cepas Kluyveromyces, Candida, o cualquier cepa de levadura capaz de expresar las proteínas heterólogas. Cepas bacterianas apropiadas incluyen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, o cualquier cepa bacteriana capaz de expresar las proteínas heterólogas.
La expresión en bacterias puede resultar en la formación de cuerpos de inclusión que incorporan la proteína recombinante. De tal manera, el plegamiento de la proteína recombinante se puede requerir con el fin de producir material activo o más activo. Varios métodos de obtención de proteínas heterólogas correctamente plegadas a partir de cuerpos de inclusión bacterianos son conocidos en el oficio. Estos métodos generalmente involucran solubilización de la proteína a partir de los cuerpos de inclusión, luego la desnaturalización de la proteína completamente utilizando un agente caotrópico. Cuando los residuos de cisteina están presentes en la secuencia primaria de aminoácidos de la proteína, Es a menudo necesario realizar el plegamiento en un ambiente que permita la correcta formación de los enlaces disulfuro (un sistema redox). Métodos generales de plegamiento se revelan en Kohno, Meth. Enzym., 185:187-195 (1990).
EP 0433225 y copending application USSN 08/163,877 describe otros métodos apropiados.
La proteína IL-13bc también se puede expresar como un producto de animales transgénicos, por ejemplo, como un componente de la leche de vacas, cabras, cerdos, u ovejas transgénicos que se caracterizan por células somáticas o de germen que contienen una polisecuencia de nucleótidos que codifica la proteína IL-13bc.
La proteína IL-13bc se puede preparar cultivando un cultivo de células huésped transformadas bajo las condiciones de cultivo necesarias para expresar la proteína deseada. La proteína expresada resultante luego se puede purificar a partir del medio de cultivo o de los extractos celulares. Las formas solubles de la proteína IL-13bc se pueden purificar a partir de los acondicionados. Las formas de enlace-membrana de la proteína IL-13bc se pueden purificar preparando una fracción de la membrana total a partir de la expresión celular y la extracción de las membranas con un detergente no-iónico tal como Triton X-100.
La proteína IL-13bc se pueden purificar utilizando métodos conocidos por aquellos de habilidad en el oficio. Por ejemplo, la proteína IL-13bc se puede concentrar utilizando un filtro de concentración de proteínas comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Continuando la etapa de concentración, el concentrado puede ser aplicado a una matriz de purificación tal como un medio de filtración por gel. Alternativamente, puede ser empleada, una resina intercambio aniónico por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos pendientes dietilaminoetil (DEAE) o polietilenimina (PEI). Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrán, celulosa u otros tipos comúnmente empleados en purificación de proteínas. Alternativamente, una etapa de intercambio catiónico puede ser empleada. Intercambiadores catiónicos apropiados incluyen varias matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropil o carboximetilo. Se prefieren los grupos sulfopropil (por ejemplo, columnas S-Sepharose®). La purificación de la proteína de la IL-13bc a partir del sobrenadante del cultivo también puede incluir una o más etapas de columna sobre tales resinas de afinidad como concanavalina A-agarosa, heparina-toyopearl® o Cibacrom blue 3GA Sepharose®; o por cromatografía interacción hidrofóbica utilizando dichas resinas como fenil éter, butil éter, o propil éter; o por cromatografía de inmunoafinidad. Finalmente, una o más etapas de cromatografía líquida de alta resolución de fase reversa (RP-HPLC) empleando medios de RP-HPLC hidrofóbicos, por ejemplo, silica gel que tiene grupos pendientes metil u otros grupos alifáticos, pueden ser empleados para purificar adicionalmente la proteína IL-13bc. Las columnas de afinidad que incluyen IL-13 o fragmentos de estas o incluyen anticuerpos para la proteína IL-13bc también pueden ser utilizadas en la purificación de acuerdo con métodos conocidos. Algunas o todas las etapas de purificación precedentes, en varias combinaciones o con otros métodos conocidos, también pueden ser empleadas para proporcionar una proteína recombinante aislada sustancialmente purificada. Preferiblemente, la proteína IL-13bc aislada se purifica con el fin de que esta sea sustancialmente libre de otras proteínas de
mamífero.
Las proteínas IL-13bc también pueden ser utilizadas para selección por los agentes que son capaces de unir a la IL-13bc o la IL-13R o que interfieren con el enlace de IL-13 con la IL-13 o la IL-13bc (tanto el dominio extracelular o intracelular) y de esta manera actuar como inhibidores del enlace normal y la acción de la citoquina ("inhibidores de la IL-13R "). Ensayos de enlace utilizando un enlace deseado de proteína, inmovilizado o no, son bien conocidos en el oficio y pueden ser utilizados para este propósito utilizando la proteína IL-13bc de la invención. La célula purificada basada o proteína basada (célula libre) ensayos selección pueden ser utilizados para identificar tales agentes. Por ejemplo, la proteína IL-13bc puede ser inmovilizada en la forma purificada sobre un excipiente y el enlace para purificar la proteína IL-13bc puede ser medido en la presencia y en la ausencia de agentes que inhiben el potencial. Un ensayo de enlace apropiado puede emplear alternativamente la forma de IL-13bc soluble de la invención. Otro ejemplo de un sistema en el que los inhibidores pueden ser seleccionados se describe en el Ejemplo 2 de abajo.
En dicho ensayo de selección, una primera mezcla de enlace se forma por la combinación de la IL-13 o un fragmento de esta y la proteína IL- 13bc, y se mide la cantidad de enlace en la primera mezcla de enlace (Bo). Una segunda mezcla ligada también se forma por la combinación de la IL-13 o un fragmento de estos, la proteína IL-13bc, y el compuesto o agente para ser seleccionado, y se mide la cantidad de enlace en la segunda mezcla ligada (B). Las cantidades de enlace en la primera y segunda mezclas de enlace se comparan, por ejemplo, representando un cálculo de la relación B/Bo, Un compuesto o agente se considera que es capaz de inhibir el enlace si se observa una disminución en el enlace en la segunda mezcla ligada como comparado con la primera mezcla de enlace. Opcionalmente, la segunda cadena de IL-13R pueden ser adicionadas a una o ambas mezclas del enlace. La formulación y optimización de las mezclas de enlace esta dentro del nivel de habilidad en el oficio, tales mezclas de enlace también pueden contener soluciones reguladoras y las sales necesarias para mejorar y optimizar el enlace, y los ensayos control adicionales pueden ser incluidos en el ensayo de selección de la invención.
Los compuestos encontrados para reducir la actividad del enlace de la proteína IL-13bc con la IL-13 o su fragmento a cualquier grado, preferiblemente por al menos aproximadamente 10%, más preferiblemente mayor de aproximadamente 50% o más, así pueden ser identificadas y luego secundariamente seleccionados entre otros ensayos de enlace y ensayos in vivo. Mediante estos métodos los compuestos que tienen actividad inhibitoria para el enlace de IL-13bc que pueden ser apropiados como agentes terapéuticos, se pueden identificar.
Las proteínas IL-13bc, y los polinucleótidos que las codifican, también pueden ser utilizados como agentes de diagnóstico para la detección de la expresión o presencia de IL-13bc, IL-13R, IL-13 o las células expresión IL-13bc, IL-13R o IL-13. Las proteínas o polinucleótidos se pueden emplear para tales propósitos en procedimientos estándar para ensayos de diagnóstico utilizando estos tipos de materiales. Apropiados métodos son bien conocidos por aquellos de habilidad en el oficio.
Como se usa en esta "IL-13R" se refiere a IL-13bc y/o una segunda cadena IL-13 receptor conocida como
"IL-13R\alpha1" o "NR4" (ver: cadena del receptor murina, Hilton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996,93:497-501; cadena del receptor humano, Aman et al., J. Biol. Chem. 1996, 271:29265-70, y Gauchat et al., Eur. J. Immunol. 1997, 27:971-8).
La IL-13bc actúa como un mediador de las actividades biológicas conocidas de la IL-13. Consecuentemente, la proteína IL-13bc (particularmente, proteínas IL-13bc solubles), inhibidores de la IL-13R (i.e., antagonistas de interacción de la IL-13 con IL-13R (tal como, por ejemplo, anticuerpos para IL-13R (incluyendo particularmente a IL-13bc o a IL-13R\alpha1) y los fragmentos de estas, los anticuerpos contra IL-13 y los fragmentos de estos, las proteínas IL-13R\alpha1 solubles, y una molécula pequeña y otros inhibidores de la interacción de IL-13 con IL-13R (incluyendo con IL-13bc y/o con IL-13R\alpha1) pueden ser útiles en el tratamiento o modulación de varias condiciones médicas en las que la IL-13 se implica o que se realizan por la actividad (o carecen de estos) de IL-13 (colectivamente "condiciones asociadas con IL-13"). Las formas mutadas de IL-4 que unen a IL-13R también pueden ser utilizadas como antagonistas de IL-13 (ver, por ejemplo, aquellas reveladas en Shanafelt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95:9454-8; Aversa et al., J. Exp. Med. 1993, 178:2213-8; y Grunewald et al., J. Immunol. 1998, 160:4004-9).
Las condiciones asociadas con IL-13 incluyen sin limitación condiciones mediadas por Ig y enfermedades, particularmente condiciones mediadas por IgE (incluyendo sin limitación la atopia, condiciones alérgicas, el asma, las enfermedades del complejo antígeno-anticuerpo (tal como, por ejemplo, el lupus, el síndrome nefrótico, la nefritis, la glomerulonefritis, la tiroiditis y la enfermedad de Graves)); las condiciones inflamatorias de los pulmones; deficiencias inmunes, específicamente deficiencias en células progenitoras hematopoyéticas, o desórdenes relacionados con esto; el cáncer y otras enfermedades. Tales estados patológicos pueden resultar de una enfermedad, exposición a la radicación o fármacos, e incluyen, por ejemplo, leucopenia, infecciones bacterianas y virales, anemia, deficiencias de células B o células T tal como deficiencia de célula inmune o de célula hematopoyética seguida de un transplante de médula ósea. Dado que IL-13 inhibe la activación del macrófago, las proteínas IL-13bc también pueden ser útiles para mejorar la activación del macrófago (i.e., en la vacunación, el tratamiento de organismos micobacterianos o intracelulares, o las infecciones de parásitos).
Las proteínas IL-13bc también pueden ser utilizadas para potenciar los efectos de la IL-13 in vitro e in vivo. Por ejemplo, una proteína IL- 13bc se puede combinar con una proteína que tiene actividad de IL-13 (preferiblemente IL-13) y la combinación resultante se puede conectar con una expresión celular de al menos una cadena IL-13R fuera de IL-13bc (preferiblemente todas las cadenas IL-13R fuera de IL-13bc, tal como IL-13R\alpha1). Preferiblemente, la etapa de contacto se realiza mediante la administración de una cantidad efectiva terapéuticamente de dicha combinación a un sujeto mamífero in vivo. La asociación pre-establecida de la proteína IL-13 con la proteína IL-13bc ayudará en la formación del complejo IL-13/IL-13R completo necesario para una correcta señalización. Ver por ejemplo los métodos descritos por Economides et al., Science 270:1351 (1995).
La proteína IL-13bc y los inhibidores IL-13R, purificados a partir de las células o producidos recombinantemente, pueden ser utilizados como una composición farmacéutica cuando se combina con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Tal composición puede contener, además de IL-13bc o un inhibidor y los excipientes, varios diluentes, rellenos, sales, soluciones reguladoras, estabilizadores, solubilizadores, y otros materiales bien conocidos en el oficio. El término "farmacéuticamente aceptable" significa un material no-tóxico que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica del ingrediente(s) activo(s). Las características de los excipientes dependerán de la ruta de administración.
La composición farmacéutica de la invención también puede contener citoquinas, linfocinas, u otros factores hematopoyeticos tal como M-CSF, GM-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-I4, IL- 15, G-CSF, factor de células madres, y eritropoyetina. La composición farmacéutica también puede incluir anticuerpos anti-citoquina. La composición farmacéutica puede contener factores trombolíticos o anti-trombóticos tal como activator plasminógeno y Factor VIII. La composición farmacéutica puede además contener otros agentes anti-inflamatorios. Tales factores y/o agentes adicionales pueden ser incluidos en la composición farmacéutica para producir un efecto sinergista con la proteína IL-13bc aislada o el inhibidor IL-13bc, o minimizar los efectos colaterales causados por la IL-13bc aislada o el inhibidor IL-13bc. A la inversa, la IL-13bc aislada o el inhibidor IL-13bc pueden ser incluidos en las formulaciones de la citoquina particular, linfocina, otro factor hematopoyetico, factor trombolítico o anti-trombótico, o agente anti-inflamatorio para minimizar los efectos colaterales de la citoquina, linfocina, otro factor hematopoyetico, factor trombolítico o anti-trombótico, o agente anti-inflamatorio.
La composición farmacéutica de la invención puede estar en la forma de un liposoma en la cual la proteína IL-13bc aislada o el inhibidor IL-13bc se combina, además con otros excipientes aceptables farmacéuticamente, con agentes amfipáticos tal como lípidos los cuales existen en forma agregada como micelas, capas monomoleculares insolubles, cristales líquidos, o capas laminares que existen en solución acuosa. Apropiados lípidos para formulación liposomal incluyen, sin limitación, monoglicéridos, diglicéridos, sulfatides, lisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares, y similares. La preparación de tales formulaciones liposomales está dentro del nivel de habilidad en el oficio, según se revela, por ejemplo, en la Patente U.S. No. 4,235,871; Patente U.S. No. 4,501,728; Patente U.S. No. 4,837,028; y Patente U.S. No. 4,737,323, de las cuales todas se incorporan en esta por referencia.
Como se usa en esta, el término "cantidad efectiva terapéuticamente" significa la cantidad total de cada activo componente de la composición farmacéutica o del método es decir suficiente para mostrar un significativo beneficio al paciente, por ejemplo, mejora de los síntomas de, curación, o del incremento en el índice de curación de tales condiciones. Cuando se aplica un ingrediente activo individual, administrado solo, el término se refiere a ese ingrediente únicamente. Cuando se aplica en una combinación, el término se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes activos que resultan en el efecto terapéutico, tanto si se administra en combinación, en serie o simultáneamente.
En la práctica el método del tratamiento o el uso de la presente invención, una cantidad efectiva terapéuticamente de la proteína IL-13bc aislado o el inhibidor IL-13bc se administra a un mamífero. La proteína IL-13bc aislada o el inhibidor IL-13bc pueden ser administrados de acuerdo con el método de la invención ya sea solo o en combinación con otras terapias tales como tratamientos empleando citoquinas, linfocinas u otros factores hematopoyeticos. Cuando se co-administra con una o más citoquinas, linfocinas u otros factores hematopoyeticos, la proteína IL-13bc o el inhibidor IL-13bc pueden ser administrados ya sea simultáneamente con la citoquina(s), linfocina(s), otro(s) factor(s) hematopoyetico(s), factores trombolíticos o anti-trombóticos, o secuencialmente. Si se administra secuencialmente, el médico que da asistencia decidirá sobre la apropiada secuencia de administración de la proteína IL-13bc o el inhibidor IL-13bc en combinación con citoquina(s), linfocina(s), otro(s) factor(s) hematopoyetico(s), factores trombolíticos o anti-trombóticos.
La administración de la proteína IL-13bc o el inhibidor IL-13bc utilizado en la composición farmacéutica o en la práctica del método de la presente invención se puede realizar en una variedad de vías convencionales, tal como ingestión oral, inhalación, o inyección cutánea, subcutánea, o intravenosa. Se prefiere la administración intravenosa al paciente.
Cuando una cantidad efectiva terapéuticamente de la proteína IL-13bc o el inhibidor IL-13bc se administra vía oral, la proteína IL-13bc o el inhibidor IL-13bc estarán en la forma de una tableta, cápsula, polvo, solución o elixir. Cuando se administra en la forma de tableta, la composición farmacéutica de la invención puede adicionalmente contener un excipiente sólido tal como una gelatina o un adyuvante. La tableta, la cápsula, y el polvo contienen desde aproximadamente 5 a 95% de la proteína IL-13bc o el inhibidor IL-13bc, y preferiblemente desde aproximadamente 25 a 90% de la proteína IL-13bc o inhibidor IL-13bc. Cuando se administra en forma líquida, se puede adicionar un excipiente líquido tal como agua, petróleo, aceites de origen animal o vegetal tal como aceite de maní, aceite mineral, aceite de soja, o aceite de ajonjolí, o aceites sintéticos. La forma líquida de la composición farmacéutica puede además contener una solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacárido, o glicoles tal como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Cuando se administra en forma líquida, la composición farmacéutica contiene desde aproximadamente 0.5 a 90% en peso de la proteína IL-13bc o el inhibidor IL-13bc, y preferiblemente desde aproximadamente 1 a 50% de la proteína IL-13bc o el inhibidor IL-13bc.
Cuando una cantidad efectiva terapéuticamente de la proteína IL-13bc o el inhibidor IL-13bc se administra por inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, la proteína IL-13bc o el inhibidor IL-13bc estarán en la forma de una solución acuosa vía parenteral de pirógeno-libre, aceptable. La preparación de tales soluciones de la proteína vía parenteral aceptable, teniendo el debido respeto al pH, isotonicidad, estabilidad, y similares, está dentro de la habilidad en el oficio. Una composición farmacéutica preferida para inyección intravenosa, cutánea, o subcutánea debería contener, además de la proteína IL-13bc o del inhibidor IL-13bc un vehículo isotónico tal como Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer, Inyección de Dextrosa, Dextrosa e Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Lactato de Ringer, u otro vehículo como se conoce en el oficio. La composición farmacéutica de la presente invención también puede contener estabilizadores, preservativos, soluciones reguladoras, antioxidantes, u otro aditivo conocido por aquellos de habilidad en el oficio.
La cantidad de proteína IL-13bc o el inhibidor IL-13bc en la composición farmacéutica de la presente invención dependerá de la naturaleza y severidad de la condición que es tratada, y sobre la naturaleza de previos tratamientos que el paciente ha experimentado. Finalmente, el médico que atiende decidirá la cantidad de proteína IL-13bc o del inhibidor IL-13bc con la que tratar cada paciente individual. Inicialmente, el médico que atiende administrará dosis bajas de la proteína IL-13bc o del inhibidor IL-13bc y observará la respuesta del paciente. La dosis más grande de la proteína IL-13bc o el inhibidor IL-13bc puede ser administrada hasta que el efecto terapéutico óptimo se obtiene para el paciente, y en ese punto la dosificación generalmente no se incrementa más allá. Se contempla que las varias composiciones farmacéuticas utilizadas en la práctica del método de la presente invención deben contener aproximadamente 0.1 \mug a aproximadamente 100 mg de la proteína IL-13bc o el inhibidor IL-13bc por kg de peso corporal.
La duración de la terapia intravenosa utilizando la composición farmacéutica de la presente invención variará, dependiendo de la severidad de la enfermedad que es tratada y la condición y la potencial respuesta idiosincrásica de cada paciente individual. Se contempla que la duración de cada aplicación de la proteína IL-13bc o del inhibidor IL-13bc estará en el rango de 12 a 24 horas de administración intravenosa continua. Finalmente el médico que atiende decidirá sobre la duración apropiada de la terapia intravenosa utilizando la composición farmacéutica de la presente invención.
Las proteínas IL-13bc de la invención también pueden ser utilizadas para inmunizar animales para obtener anticuerpos policlonales y monoclonales que reaccionan específicamente con la proteína IL-13bc y que pueden inhibir el enlace de IL-13 o los fragmentos de estos con el receptor. Tales anticuerpos se pueden obtener utilizando la IL-13bc total como un inmunógeno, o utilizando los fragmentos de IL-13bc, tal como la IL-13bc madura soluble. Los fragmentos más pequeños de la IL-13bc también pueden ser utilizados para inmunizar animales. Los inmunógenos péptidos adicionalmente pueden contener un residuo de cisteina en el terminal carboxilo, y se conjugan con un hapteno tal como Hemocianina extraída del molusco (KLH). Inmunógenos de péptidos adicionales pueden ser generados por el reemplazo de los residuos de tirosina con residuos de tirosina sulfato. Los métodos para la síntesis de tales péptidos son conocidas en el oficio, por ejemplo, como en R.P. Merrifield, J. Amer. Chem.Soc. 85, 2149-2154 (1963); J.L. Krstenansky, et al., FEBS Lett. 211, 10 (1987).
Los anticuerpos que neutralizan o no-neutralizan (preferiblemente anticuerpos monoclonales) unidos a una proteína IL-13bc también pueden ser terapéuticos útiles para ciertos tumores y también en el tratamiento de las condiciones descritas arriba. Estos anticuerpos monoclonales que neutralizan pueden ser capaces de bloquear el enlace de IL-13 con la IL-13bc.
Ejemplo 1 Aislamiento de IL-13bc cADNs Aislamiento de la cadena del receptor IL-13 murina
5 ug de poliA+ RNA se preparó a partir del timo de ratones C3H/HeJ de 6-8 semanas de edad. El ADNc bicatenario, hemimetilado se preparó utilizando el kit de síntesis de ADNc de Stratagene de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, la primera hebra se ceba con un oligodT-Xho cebador, y después la síntesis de la segunda hebra, se adicionan los adaptadores EcoRI, y el ADNc se digiere con XhoI, y se purifica. El ADNc se liga a los sitios XhoI-EcoRI del vector lambda Zap Express (Stratagene), y se empaqueta utilizando los extractos de empaquetamiento Gigapak II Gold (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un banco de 1.5 x 10^{6} del fago recombinante resultante se amplificó siguiendo las instrucciones del fabricante. Este banco se seleccionó con una sonda degenerada de un oligonucleótido 17mer de la secuencia KSRCTCCABK CRCTCCA (SEQ ID NO: 5) (K = G+T; S= C+G; R=A+G; B=C+G+T) utilizando las condiciones hibridación estándar TMAC según lo descrito (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., editors., John Wiley y Sons, 1995, section 6.4.3). El Clon A25 se identificó porque este hibridiza a la sonda 17mer, pero no a las sondas derivadas de receptores hematopoyéticos conocidos. Este clon se aisló en una forma de plásmido del vector ZapExpress según las instrucciones del fabricante, y se determinó la secuencia de ADN. La secuencia de ADN codificó a un miembro novedoso de la familia del receptor hematopoyético.
El Clon A25 que contiene el polinucleótido que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 se depositó con ATCC como pA25pBKCMV en el número de acceso 69997 en Febrero 22, 1996.
Aislamiento de la cadena del receptor IL-13 humana
Un fragmento parcial del homólogo humano del receptor murina se aisló por PCR utilizando oligonucleótidos derivados de la secuencia murina. El ADNc se preparó a partir del testículo humano polyA+ RNA que se obtuvo de Clontech. Un fragmento de ADN de 274 pares de base se amplificó a partir de este ADNc por PCR con los siguientes oligonucleótidos: ATAGTTAAACCATTGCCACC (SEQ ID NO: 6) y CTCCATTCGCTCCAAATTCC (SEQ ID NO: 7) utilizando polimerasa AmpliTaq (Promega) en 1X Taq solución reguladora que contiene MgCl2 1.5 mM durante 30 ciclos de incubación (94°C x 1 minuto, 42°C por 1 minuto, y 72ºC por 1 minuto). La secuencia de ADN de este fragmento se determinó, y dos oligonucleótidos se prepararon a partir de una porción interna de este fragmento con la siguiente secuencia: AGTCTATCTTACTITTACTCG (SEQ ID NO: 8) y CATCTGAGCAATAAATATTCAC (SEQ ID NO: 9). Estos oligonucleótidos se utilizaron como sondas para seleccionar un banco de ADNc de testículo humano adquirido de CLONTECH (cat #HL1161). Los filtros se hibridizaron a 52°C utilizando las condiciones de hibridación estándar 5XSSC y se lavaron en 2X SSC a 52°C. Veintidós clones se aislaron, esos que hibridizan a ambos oligonucleótidos en una selección de 400,000 clones. La secuencia de ADN se determinó a partir de cuatro de los clones ADNc, y se codifico toda del mismo receptor hematopoyético novedoso. La secuencia predicha de ADN de la cadena del receptor humano integral se muestra como la SEQ ID NO: 3.
El clon humano se depositó con ATCC como phA25#11pDR2 en el número de acceso 69998 en Febrero 22, 1996.
Ejemplo 2 Expresión de la Proteína IL-13bc Soluble y Ensayo de la Actividad Producción y purificación de la IL-13bc-Ig soluble.
El ADN que codifica los aminoácidos 1-331 del dominio extracelular de IL-13bc murina se combinó con una secuencia espaciadora que codifica gly-ser-gly por PCR y se liga en el marco con las secuencias que codifican las regiones bisagra CH2 CH3 de IgG1 humano del vector de expresión COS-1 pED.Fc . La IL-13bc-Ig se produce a partir de las células COS-1 transfectadas DEAE-dextrán y se purifica por medio de la cromatografía proteína A sepharose (Pharmacia).
Ensayo de proliferación B9
La estimulación de la proliferación de las células B9 (Aarden et al. Eur. J. Immunol. 1987. 17:1411-1416) en respuesta a la IL-13 o la IL-4 se midió mediante la incorporación de 3H-timidina en el ADN. Las células (5 x 103/pozo) se sembraron en placas de 96 pozos con medios que contienen factores de crecimiento que varían de concentraciones en la presencia o ausencia de la IL-13bc-Ig a 1 ug/ml. Después de la incubación durante 3 días, se adicionó luCi/pozo de 3H-timidina y las células se incubaron por un adicional de 4 horas. La radioactividad incorporada se determinó utilizando un lector de Placa LKB 1205.
La línea celular B9 prolifera en respuesta a la IL-13, la IL-4 o la IL-6. Únicamente las respuestas a la IL-13 se inhibieron por la IL-13bc-Ig soluble, indicando que este receptor se une a la IL-13 específicamente, pero no a la IL-4 o a la IL-6. Las tablas muestran el cpm. Se muestran dos experimentos separados.
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Ejemplo 3 Enlace Directo de IL-13bc Soluble con la IL-13 Medido por Resonancia por Plasmón de Superficie (Análisis Biacore)
Un biosensor Biacore se utilizó para medir directamente el enlace específico de IL-13 a una IL-13bc-Ig purificada (Pharmacia, Johnsson et al., 1991). Aproximadamente 10,000 a 17,000 unidades de resonancia (RU) de IL-13bc-Ig purificada, la IgG1 humano o receptor irrelevante se inmovilizado cada uno covalentemente a diferente flujo de células sobre la pieza sensor según lo recomendado por el fabricante. (RU's son una reflección de la masa de la proteína unida a la superficie de la pieza sensor). La IL-13 purificada se inyectó a través del flujo de células a 5 ul/min durante 10 minutos en la presencia o ausencia del exceso de IL-13bc-Ig purificada. El enlace se cuantificó como la diferencia en RU antes y después de la inyección de la muestra. El enlace IL-13 específico de 481.9 RU se observó únicamente para la IL-13bc-Ig inmovilizada mientras que la co-inyección de IL-13 más la IL-13bc-Ig resulta en ningún enlace con la IL-13bc-Ig inmovilizada (4 RU). No se observó ningún enlace IL-13 para IgG inmovilizado o IL-11R-Ig (5.4 y 3.7 RU respectivamente).
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Ejemplo 4 Enlace de IL-13 Expresada en Las Células COS para marcar la Proteína de Fusión IL-13BC-Ig: Detección in situ de COS de la IL-13 con IL- 13bc-Fc
Los vectores de expresión para IL-13, IL-4, IL-11 o vector vacío se transfectaron en las células COS-1 en placas por duplicado vía el método DEAE-dextrán. Dos días después de la transfección las células se lavaron dos veces en solución salina reguladora fosfato (PBS) y se fijaron en el plato de cultivo durante 10' a 4°C con metanol. Seguido a la fijación las células se lavaron dos veces con PBS luego se enjuagaron una vez con solución reguladora de enlace (PBS, 1% (w/v) albúmina de suero bovino,).1% (w/v) azida de sodio) y se incubaron durante dos horas a 4°C en solución reguladora de enlace con IL-13bc-Fc a 1.0 ug/ml o con antisuero anti-citoquina relevante. Las células se lavaron dos veces con PBS y se incubaron a 4ºC con agitación en IgG diluido anti-humano de Conejo marcado con fosfatasa alcalina de F (ab) 2' 1:500 en la solución reguladora de enlace (para la detección de la fusión Fc) o IgG anti-rata de Conejo F (ab) 2' (para la detección anti-citoquina). Las células de nuevo se lavaron dos veces en PBS. La actividad de la fosfatasa alcalina se visualizó utilizando azul de nitrotetrazolio y 5-bromo- 4-cloro-3-indolil-fosfato.
El enlace específico se visualizó bajo el microscopio. Únicamente las células transfectadas con IL-13 mostraron el enlace específico para IL13bc-Ig. (ver foto de las células transfectadas, la Figura).
Ejemplo 5 Otros Sistemas para la Determinación de la Actividad Biológica de la Proteína IL-13bc
Otros sistemas pueden ser utilizadas para determinar si una proteína IL-13bc específica exhibe una "actividad biológica" de IL-13bc como se define en esta. Los siguientes son ejemplos de tales sistemas.
Ensayos para el Enlace IL-13
La capacidad de una proteína IL-13bc para unir la IL-13 o un fragmento de estos, puede estar determinada por cualquier análisis conveniente que pueda detectar tal enlace. Los siguientes son algunos ejemplos apropiados.
El enlace de IL-13 con la región extracelular de la proteína IL-13bc específicamente causará una rápida inducción de fosfotirosina sobre la proteína receptor. Se describen abajo, los ensayos para la actividad del enlace del ligando según se mida por la inducción de la fosforilación.
Alternativamente, una proteína IL-13bc (tal como, por ejemplo, una forma soluble del dominio extracelular) se produce y utiliza para detectar el enlace IL-13. Por ejemplo, una construcción ADN se prepara en la cual el dominio extracelular (truncado anteriormente, preferiblemente inmediatamente anterior, al dominio predicho de la transmembrana) se liga en marco a un ADNc que codifica los dominios bisagra C_{H}2 y C_{H}3 de una inmunoglobulina (Ig) \gamma1 humana. Esta construcción se genera en un vector de expresión apropiado para las células COS, tal como pED\DeltaC o pMT2. El plásmido temporalmente se transfecta en las células COS. La proteína de fusión IL- 13bc-Ig secretada se colecta en el medio acondicionado y se purifica por cromatografía de proteína A.
La proteína de fusión IL-13bc-Ig purificada se utiliza para demostrar el enlace IL-13 en un número de aplicaciones. La IL-13 puede estar cubierta dentro de la superficie de una placa de Ensayo con sustancias inmunoabsorbentes unidas a Enzimas (ELISA), y luego los sitios de enlace bloqueados con albúmina de suero bovino o caseina utilizando soluciones reguladoras de ELISA estándar. La proteína de fusión IL-13bc-Ig luego se une a la fase-sólida IL-I3, y el enlace se detecta con un Ig anti-humano de cabra secundario conjugado con peróxidasa de rábano picante. La actividad de la enzima unida específicamente se puede medir con un sustrato colorimétrico, tal como tetrametil benzidina y las lecturas de absorbancia.
La IL-13 también se puede expresar sobre la superficie de células, por ejemplo proporcionando un dominio transmembrana o un enlace glicosil fosfatidil inositol (GPI). Las células de expresión del enlace de la membrana IL-13 pueden ser identificadas utilizando la proteína de fusión IL-13bc-Ig. La fusión IL-13bc-Ig soluble se une a la superficie de estas células y se detecta con Ig antihumano de cabra conjugado a un fluorocromo, tal como fluorescina isotiocianato y citometría de flujo.
Trampa de Interacción
Un método de selección genética de levadura, la "trampa de interacción" [Gyuris et al, Cell 75:791-803, 1993], puede ser utilizado para determinar si una proteína IL-13bc tiene una actividad biológica de IL-13bc como se define en esta. En este sistema, la expresión de genes reportero a partir de LexAop-Leu2 y LexAop-LacZ dependiendo de la interacción entre la proteína cebo, por ejemplo en este caso una especie que interactúa con IL-13bc humana, y la presa, por ejemplo en este caso la proteína humana IL-13bc. De tal manera, alguien puede medir la fuerza de la interacción por el nivel de la expresión de Leu2 o LacZ. El método más simple es medir la actividad de la proteína codificada LacZ, \beta-galactosidasa. Esta actividad puede ser juzgada por el grado azulado sobre el X-Gal que contiene el medio o filtro. Para la medición cuantitativa de la actividad de la \beta-galactosidasa, se pueden encontrar ensayos estándar en "Methods in Yeast Genetics" Cold Spring Harbor, New York, 1990 (by Rose, M.D., Winston, F., y Hieter, P.).
En dichos métodos, si un deseo es determinar si la proteína IL-13bc interactúa con una especie particular (tal como, por ejemplo, una proteína citosílica que se une al dominio intracelular de la IL-13bc in vivo), esa especie puede ser utilizada como el "cebo" en la trampa de interacción con la proteína IL-13bc para ser probada sirve como la "presa", o viceversa.
Ejemplo 6 Tratamiento del Asma Utilizando una Proteína IL-13bc Soluble
Se utilizó, un modelo bien-caracterizado de murina para asma alérgica, en el que la exposición al alergeno conduce a la Hipersensibilidad de las vías aéreas ("AHR"), la eosinofilia pulmonar, elevaciones en suero de los niveles IgE antígeno-específico, y el incremento en el contenido de moco en la vía aérea epitelial (3, 11). Ratones machos A/J se inmunizaron vía intraperitoneal y posteriormente se desafiaron vía intratraqueal con ovalbúmina (OVA) soluble, siendo el fenotipo alérgico evaluado 4 días después del desafío con el antígeno (13). El bloqueo de IL-13 se realizó por la administración sistémica de una proteína de fusión IL-13bc-IgGFc soluble (sIL-13bc- Fc), que específicamente se une a y neutraliza la IL-13, 24 horas antes del subsiguiente desafío con el alergeno intratraqueal (14). El desafío de los ratones alergeno-inmuinizado resultó en un incremento significante en sensibilidad de las vías aéreas para acetilcolina (15) (Fig. 2A). El bloqueo de IL-13 resultó en la inversión completa de dicha AHR alergeno-inducida establecida; de esta manera la IL-13 es necesaria para la expresión de AHR en este modelo. La capacidad de ablación de IL-13 para revertir la AHR después del desarrollo completo del fenotipo de asma alérgica contrasta con la incapacidad de ablación de IL-4 para realizar dicha inversión. El mecanismo subyacente de la eficacia del bloqueo de IL-4R\alpha para revertir la AHR alergeno-inducida puede ser la inhibición del proceso mediado por IL-13, consistente con el hecho de que la activación de Stat6 es en dirección 3' de la señalización mediada por IL-4R\alpha por ambas citoquinas. La IL-13 es probablemente el factor de células T-derivadas CD4+ primarias responsable para la AHR alergeno-inducida.
Para evaluar los mecanismos candidatos subyacentes de expresión de IL-13-dependiente de la AHR, se caracterizan las cascadas alérgicas efector conocidas. Los eosinófilos han sido implicados como células efector primarias en la AHR del asma y el asmático (16), pero la inhibición de la IL-13 previo a la provocación del antígeno repetido no afectó significantemente la eosinofilia pulmonar alergeno-inducida (17) (Fig. 2B). Para evaluar la relevancia de las sendas mediadas por IgE, medimos la OVA-específica en el IgE del suero (18). Los niveles de OVA-específicos de IgE se observaron en ratones OVA-sensibilizados y -desafiados, mientras que no se detectaron ningún nivel de anticuerpos antígeno-específico en ratones PBS-inmunizados y -desafiados (Fig. 2C). El bloqueo de IL-13 no alteró los niveles de OVA-específicos en IgE, una falta de supresión que es probablemente debido al hecho de que el bloqueo de IL-13 ocurre después de la formación inicial del cebado del antígeno y del anticuerpo. No obstante, estos resultados muestran que la AHR no es dependiente sobre la producción de IgE en este modelo, consistente con los reportes de que la AHR alérgica desarrolla normalmente en ratones deficientes en IgE y deficientes en célula B (19).
En congruencia con la patología del asma humana, el asma alérgica en modelos murina se asocia con un incremento marcado en el contenido de moco del epitelio de las vías aéreas (5, 11). La hipersecreción de moco es particularmente profunda en la autopsia de especimenes de pacientes quienes murieron de ataques de asma agudos (20). El bloqueo de las IL-13 opuestas alergeno-inducida incrementa en el moco- que contiene las células en las vías aéreas (Fig. 3), demostrando que los incrementos alergeno-inducido en el contenido de moco en las vías aéreas dependen de la IL-13. La IL-4 también está implicada en este procedimiento, como los ratones transgénicos IL-4 muestran marcada hiperplasia de la célula caliciforme en la ausencia de sensibilización del antígeno (5). Sin embargo, la transferencia de los clones Th2 a partir de ratones IL-4- deficientes y ratones control dentro de las vías aéreas murina induce la superproducción de moco (21), sugiriendo, con todo otra vez, que el papel inmunoregulador de la IL-4 necesita estar cuidadosamente diferenciado de su papel como una molécula efector.
La administración diaria del recombinante IL-13 (rIL-13) a las vías aéreas de AHR inducida en ratones naive (no-inmunizados), demuestra que el incremento en la actividad de la IL-13 fue suficiente para inducir la AHR (Fig. 4A) (22). La AHR desarrollada en las 72 horas después del inicio de la administración de la rIL-13. Un influjo significante de eosinófilos dentro del fluido de lavado broncoalveolar se observó temprano después de la administración de la rIL-13, sin embargo la eosinofilia pulmonar no se observó en el tiempo de expresión de la AHR (Fig. 4B). A pesar de que la significancia del transcurso de tiempo del influjo eosinófilo permanece difusa, esto sugiere que la IL-13 sola puede ser suficiente para iniciar la infiltración eosinofílica de las vías aéreas, quizás a través de su capacidad para favorecer la expresión de quimicina (23). La administración de rIL-13 en las vías aéreas también resulta en un incremento dependiente del tiempo en el IgE del suero total (Fig. 4C) (24), en línea con la capacidad previamente-reportada de la IL-13 para regular la síntesis del IgE (25). El incremento de IgE en el suero fue independiente de cualquier inmunización con alergeno, descubriendo que resuena con la observación de que el fenotipo asmático humano correlaciona mejor con el total, antes que con el alergeno-específico, concentraciones de IgE en suero (26). Como se predijo a partir de los estudios de inhibición de la IL-13 arriba, la administración de rIL-13 induce a un incremento en la producción de moco en las vías aéreas (Fig. 4D) (27).
Referencias y Notas
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13. Los ratones macho A/J de seis-semanas-edad se obtuvieron de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) y se alojaron bajo campana de flujo laminar en un ambientalmente específico controlado libre de patógenos, facilidad del animal para la duración de los experimentos (N = 4-10 ratones/grupo experimental). Los estudios reportados aquí conformaron los principios para la investigación de animales de laboratorio delineados por las directrices para el uso de animales experimentales del Animal Welfare Act y el Department de Health, Education y Welfare (N.I.H.). Los ratones se inmunizaron mediante una inyección intraperitoneal de 10 ug ovalbúmina (OVA; grado crudo IV, Sigma; St. Louis, MO) en 0.2 ml de PBS o PBS solo. 14 días después de la inmunización, los ratones se anestesiaron con una mezcla de ketamina y xilazina (45 y 8 mg/kg, respectivamente) y se desafiaron vía intratraqueal con 50 ul de una solución al 1.5% de OVA o un volumen equivalente de PBS como un control. 10 días después de este primer desafío con el antígeno, los ratones se desafiaron de nuevo vía intratraqueal con OVA o PBS. La caracterización del fenotipo alérgico se realizó 96 horas después del segundo desafío con el antígeno.
14. La IL-13bc humano se clono según se describen arriba. Por la expresión soluble del homólogo murina, un vector de expresión pED que contiene el ADN que codifica el dominio extracelular sIL-13bc murina, combinadas en marco con las regiones bisagra CH2/CH3 de IgG1 humano (según lo descrito en ejemplos previos), se transfectó dentro de las células CHO [D. D. Donaldson et al., J. Immunol. 161, 2317 (1998)]. La sIL-13bc-Fc se purificó con rProtein A-Sepharose [J. F. Urban et al., Immunity 8, 255 (1998)]. La ID_{50} in vitro, como se determina por la capacidad para neutralizar 3 ng/ml de IL-13 murina en el ensayo de proliferación B9 fue aproximadamente 10 ng/ml. La IgG humana, utilizado como un control para la sIL-13bc-Fc, de modo semejante se purificó por cromatografía rProtein A-Sepharose de una solución al 10% de globulina inmune humana es decir, comercialmente disponible, por administración intravenosa (Miles) [ibid]. Los ratones fueron dispensados con sIL-13bc-Fc (400ug), o una cantidad equivalente del control hu-IgG, por inyección intraperitoneal en el Día -1, O, +1, y +3 del desafío secundario con el antígeno.
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15. La reactividad de la vías aéreas para una administración intravenosa de acetilcolina se midió (11), 3 días después de desafío final intratraqueal. Los ratones se anestesiaron con pentobarbital sódico (90 mg/kg), se intubaron, ventilado a un índice de 120 respiraciones/minuto con un volumen de marea constante del aire (0.2 ml), y paralizados con bromuro de decametonio (25 mg/kg). Después de establecer una presión estable de las vías aéreas, la acetilcolina se inyectó vía intravenosa (50 ug/kg) y la presión dinámica de las vías aéreas se siguió durante 5 minutos.
16. G. J. Gleich, J. All. Clin. Immunol. 8, 422 (1990).
17. Lavado broncoalveolar se realizó según lo descrito (11).
18. Un riñón se extirpo, y la sangre combinada se colecto para el análisis de anticuerpo según lo descrito (11). El suero se separó por centrifugación y se almacenó a -80ºC hasta el análisis. Los niveles de IgE OVA-específico en suero se determinaron por ELISA de fase doble. Los pozos de las muestras se cubrieron con una solución de 0.01% de OVA en PBS, bloqueados con 10% de FBS en PBS, y se lavaron con 0.05% de Tween-20 en PBS. Las muestras de suero se diluyeron 1:10 y 1:100 con 10% FBS en PBS. Después de una incubación durante la noche, las placas se lavaron con 0.05% Tween-20 en PBS y se adicionó IgE anti-ratón biotina-conjugada (PharMingen, San Diego, CA). Después de un lavado, 0.0025 mg/ml de peroxidasa avidina (Sigma) en 10% de FBS/PBS se adicionó, y las placas se desarrollaron con ABTS (2.2’-azino-did [3-etil-benzatiazona sulfonato]) (Kirkegaard y Perry). Las placas se leyeron a 405 nm dentro de 30 minutos. Los valores 0.D. reportados son de muestras de suero diluidas 1:10 dado que estos valores se probaron que están debajo del punto de saturación del ensayo por comparación de los valores O.D. de las muestras diluidas de suero 1:100 con 10% de FBS/PBS.
19. P. D. Mehlhop et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1344 (1997); M. Korsgren et al., J. Exp. Med. 185, 885 (1997).
20. T. Aikawa et al., Chest 101, 916 (1992).
21. L. Cohn, R. J. Homer, A. Marinov, J. Rankin, K. Bottomly. J. Exp. Med. 186, 1737 (1997).
22. ADN que codifica una guía de melitina de abeja [D. C. Tessier, D. Y. Thomas, H. E. Khouri, F. Laliberte, T. Vernet, Gene 2, 177 (1991)] seguido por un tag seis-histidina se combinó por un sitio de hendidura enteropeptidasa en la región madura de IL-13 murina en Gly21 y se construyó en el vector de expresión de mamífero pHTop. La proteína IL-13 murina H6-EK se produce a partir de las células CHO establemente- transfectadas y se purifica vía cromatografía Ni-NTA para una pureza mayor del 97% según se determinó por SDS-PAGE. La concentración de la proteína se determinó por absorción a 280 nm y la contaminación de endotoxina fue menor de 30 EU/mg según se midió mediante el ensayo Cape Cod Associates LAL. La ED_{50} de IL-13 murina H6-EK según se determinó por el ensayo de proliferación Ba/F3.IL-13R 1 fue lng/ml. La rIL-13 Murine (5ug en un volumen total de 50 ul) se administró diariamente por instalación intratraqueal a los ratones naive anestesiados con una mezcla de ketamina y xilazina (45 y 8 mg/kg, respectivamente).
23. M. Goebeler et al., Immunol. 91, 450 (1997).
24. Un ELISA IgE-específico murina se utilizó para cuantificar los niveles totales de inmunoglobulina IgE en suero utilizando pares de anticuerpo complementarios para IgE de ratón (R35-72 y R35-92) obtenido de PharMingen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras por duplicado (de una dilución 1/10 en 10% de FBS en PBS) se examinaron a partir de cada animal. Las lecturas de muestras O.D. se convirtieron a pg/ml utilizando los valores obtenidos de curvas estándar curves generadas con concentraciones conocidas de IgE recombinante de ratón (5-2000 pg/ml), y la concentración final se obtuvo multiplicando por el factor de dilución.
25. C. L. Emson, S. E. Bell, A. Jones, W. Wisden, A. N. J. McKeazie, J. Exp. Med. 188, 399 (1998).
26. L. R. Friedhoff, D. G. Marsh, Int. Arch. All. Immunol. 100, 355 (1993).
27. Para examinar los efectos de rIL-13 sobre el contenido de célula mucosa del epitelio de las vías aéreas, los pulmones se extirparon y se fijaron en 10% de formalina. Luego se lavaron en 70% de etanol, deshidratado, se incrustaron en glicol metacrilato, se cortaron en secciones de 10 uM, se montaron en portaobjetos, y se tiñeron con hematoxilina y eosina y ácido Schiff intermitente. Se examinaron cuatro secciones por animal; 4 campos se puntuaron por sección del pulmón. Las secciones se puntuaron sobre una escala de 1-4 con 1 representando ningún contenido de célula mucosa.
28. J. Luyimbazi, X. Xu, M. Wills-Karp, resultados no-publicados.
29. C. Walker et al., Am. Rev. Respir. Dis. 146, 109 (1992); M. Humbert et al., J. All. Clin. Immunol. 99, 657 (1997); S. K. Huang, J. Immunol. 155, 2688 (1995).
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<110> Collins, Mary
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Donaldson, Debra 
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Fitz, Lora 
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Neben, Tamlyn 
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Whitters, Matthew 
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Wood, Clive 
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Wills-Karp, Marsha 
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Genetics Institute, Inc. 
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Johns Hopkins University 
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<120> Cadena del Receptor de la Citoquina
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<130> GI 5268A
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<140>
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<141>
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<160> 9
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<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
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<211> 1525
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<212> ADN
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<213> Mus sp.
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<220>
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<221> CDS
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<222> (256)..(1404)
\newpage
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<400> 1
4
5 
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<210> 2
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<211> 383
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<212> PRT
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<213> Mus sp.
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<400> 2
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6 
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7 
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<210> 3
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<211> 1369
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (103)..(1245)
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<400> 3
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8
9
10 
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<210> 4
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<211> 380
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 4
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11
12 
\newpage
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<210> 5
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> oligonucleótido
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<400> 5
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ksrctccabk crctcca 
\hfill
17 
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<210> 6
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> oligonucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskip
atagttaaac cattgccacc 
\hfill
20 
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<210> 7
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido
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<400> 7
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\hskip-.1em\dddseqskip
ctccattcgc tccaaattcc 
\hfill
20 
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<210> 8
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> oligonucleótido
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskip
agtctatctt acttttactc g 
\hfill
21 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> oligonucleótido
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<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskip
catctgagca ataaatattc ac 
\hfill
22

Claims (18)

1. El uso de un antagonista de IL-13 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una condición asociada con la IL-13 en un sujeto mamífero, en donde dicho antagonista es un anticuerpo contra la IL-13 o un fragmento de estos se une a la IL-13 y en donde dicha condición asociada con la IL-13 es la atopia, una condición alérgica, el asma, una enfermedad del complejo antígeno-anticuerpo, una condición inflamatoria de los pulmones, inmunodeficiencia, o el cáncer.
2. El uso de la Reivindicación 1, en donde dicha condición es una condición mediada por IgE.
3. El uso de las Reivindicaciones 1 ó 2, en donde dicha condición es la atopia.
4. El uso de las Reivindicaciones 1 ó 2, en donde dicha condición es una condición alérgica.
5. El uso de las Reivindicaciones 1 ó 2, en donde dicha condición es asma.
6. El uso de las Reivindicaciones 1 ó 2, en donde dicha condición es una enfermedad del complejo antígeno-anticuerpo.
7. El uso de la Reivindicación 6, en donde dicha enfermedad del complejo antígeno-anticuerpo es el lupus, la nefritis, la tiroiditis, la glomerulonefritis, la enfermedad de Graves, o el síndrome nefrótico.
8. El uso de la Reivindicación 7, en donde dicha enfermedad del complejo antígeno-anticuerpo es el lupus.
9. El uso de la Reivindicación 7, en donde dicha enfermedad del complejo antígeno-anticuerpo es la nefritis.
10. El uso de la Reivindicación 7, en donde dicha enfermedad del complejo antígeno-anticuerpo es la tiroiditis.
11. El uso de la Reivindicación 7, en donde dicha enfermedad del complejo antígeno-anticuerpo es la glomerulonefritis.
12. El uso de la Reivindicación 7, en donde dicha enfermedad del complejo antígeno-anticuerpo es la enfermedad de Graves.
13. El uso de la Reivindicación 7, en donde dicha enfermedad del complejo antígeno-anticuerpo es el síndrome nefrótico.
14. El uso de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 13, en donde dicho antagonista es un anticuerpo contra la IL-13.
15. El uso de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 13, en donde dicho antagonista es un fragmento enlace de IL-13 de un anticuerpo contra IL-13.
16. El uso de un antagonista de IL-13 en la fabricación de un medicamento para inhibir la interacción de IL-13 con una proteína IL-13bc en una condición seleccionada de la atopia, una condición alérgica, el asma, una enfermedad del complejo antígeno-anticuerpo, una condición inflamatoria de los pulmones, inmunodeficiencia, o el cáncer, en donde dicho antagonista es un anticuerpo contra IL-13 o uno de sus fragmentos de enlace de la IL-13.
17. El uso de la Reivindicación 16, en donde dicha enfermedad del complejo antígeno-anticuerpo es el lupus, el síndrome nefrótico, la nefritis, la tiroiditis, la glomerulonefritis, o la enfermedad de Graves.
18. El uso de un antagonista de IL-13 en la fabricación de un medicamento para tratar la atopia en un sujeto mamífero, en donde dicho antagonista es un anticuerpo contra IL-13 o uno de sus fragmentos de enlace de la IL-13.
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