CN104611339A - 细胞因子受体链 - Google Patents

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Abstract

本发明在此描述了细胞因子受体链。本发明也公开了编码IL－13受体和其片段的多核苷酸。本发明还公开了IL－13受体蛋白质，制备它们的方法，IL－13与其受体结合的抑制剂和它们的鉴别方法。本发明还提供了使用这些分子和IL－13/IL－13R相互作用的拮抗剂的医学治疗方法。

Description

细胞因子受体链
本申请是1999年12月13日递交的申请号为99815591.8，发明名称为“细胞因子受体链”的分案申请。
本发明是1997年4月30日提交的申请序列号No.08/841,751申请的部分继续申请，而序列号为No.08/841,751的申请是1996年3月1日提交的序列号No.08/609,572申请的分案申请。
本发明的领域
本发明涉及对IL-13具有亲和力的哺乳动物细胞因子受体蛋白质(包括但不限于人类和鼠科动物受体蛋白质)，其片段和用来表达这种蛋白质的重组多核苷酸和细胞。
本发明的背景
已有多种调节分子，称为细胞因子被确定，包括白细胞介素-13(IL-13)。IL-13的多种蛋白质形式和编码多种形式的IL-13活性的DNA也在McKenzie等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：3735(1993)；Minty等人，自然362：248(1993)；和Aversa等人，WO94/04680中作了描述。因此，“IL-13”包括具有这些文献中所描述的序列和/或生物活性的蛋白质，不论是通过重组基因工程技术制备的，从自然产生因子或用其他因子诱导产生因子的细胞源中提纯的，或是通过化学技术合成的，或前述技术的组合中获得的。
IL-13是与几种生物活性的产生有关的细胞因子，包括诱导IgG4和IgE转换，包含在人类未成熟B细胞中[Punnonen等人，免疫学期刊，152：1094(1994)]；在正常人类B细胞中诱导种系IgE重链(ε)转录和CD23表达[Punnonen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3730(1993)]；在存在CD40L或抗CD40mAb情况下诱导B细胞增殖[Cocks等人，国际免疫学，5：657(1993)]。尽管IL-13的许多活性与IL-4的活性相似，但与IL-4相反，IL-13对活化的T细胞或T细胞克隆体没有生长促进作用[Zurawski等人，EMBO J.12：2663(1993)]。
如同多数细胞因子，IL-13通过与在靶细胞表面的IL-13受体(“IL-13R”)相互作用表现出某些生物活性。IL-13R和IL-4受体(“IL-4R”)具有相同的组分，其是受体活化所需的；然而，IL-13不与用130kD IL-4R转染的细胞结合(Zurawski等人，同上)。因此，IL-13R必须含有至少一条其他配体结合链。细胞因子受体通常含有两条或三条链。IL-13的一条配体结合链的克隆最近已有报道(Hilton等人，Proc.Natl.Acad.Sci.93：497-501)。
因此需要鉴别和克隆IL-13R的任何其他IL-13结合链的序列，以使IL-13R蛋白质可为各种目的制备，包括制备治疗试剂，筛查IL-13结合受体的抑制剂和受体信号传递。
本发明的概述
依据本发明，公开了编码白细胞介素-13受体的IL-13结合链的多核苷酸，包括但不限于鼠科动物和人类受体的多核苷酸。在某些实施方案中，本发明提供了包括从下列组中选取的核苷酸序列的分离多核苷酸：
(a)从核苷酸256到核苷酸1404的SEQ ID NO：1核苷酸序列；
(b)从核苷酸103到核苷酸1242的SEQ ID NO：3核苷酸序列；
(c)由于遗传密码的简并从(a)或(b)定义的核苷酸序列的序列中变化而来的核苷酸序列；
(d)在严格条件下能与(a)或(b)定义的核苷酸杂交的核苷酸序列；
(e)编码(a)或(b)定义的序列的物种同源体的核苷酸序列；
(f)(a)或(b)定义的核苷酸序列的等位基因变体。
较好地，核苷酸序列编码具有人类IL-13受体生物活性的蛋白质。核苷酸序列可操作地与表达控制序列结合。在较好的实施方案中，多核苷酸包括从核苷酸256到核苷酸1404的SEQ IDNO：1的核苷酸序列；从核苷酸319到核苷酸1257的SEQ ID NO：1的核苷酸序列；从核苷酸1324到核苷酸1404的SEQ ID NO：1的核苷酸序列；从核苷酸103到核苷酸1242的SEQ ID NO：3的核苷酸序列；从核苷酸178到核苷酸1125的SEQ ID NO：3的核苷酸序列；从核苷酸1189到核苷酸1242的SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
本发明还提供了含有编码包括在下列组中选取的氨基酸序列的肽或蛋白质的核苷酸序列的分离多核苷酸：
(a)SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(b)从氨基酸22到氨基酸334的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(c)从氨基酸357到氨基酸383的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(d)SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
(e)从氨基酸26到氨基酸341的SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
(f)从氨基酸363到氨基酸380的SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
(g)具有IL-13受体结合链生物活性的(a)-(f)的片段。
其他较好的实施方案编码从氨基酸1到331的SEQ ID NO：2的氨基酸序列和从氨基酸26到331的SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
本发明还提供了用多核苷酸转化的宿主细胞，较好地是哺乳动物细胞。
在其他实施方案中，本发明提供了制备IL-13bc蛋白质的方法。该方法包括：
(a)在适当的培养介质中培养本发明的宿主细胞培养物；
(b)从培养物中提纯IL-13bc蛋白质。
本发明还提供了包括在下列组中选取的氨基酸序列的分离IL-13bc蛋白质：
(a)SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(b)从氨基酸22到氨基酸334的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(c)从氨基酸357到氨基酸383的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(d)SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
(e)从氨基酸26到氨基酸341的SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
(f)从氨基酸363到氨基酸380的SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
(g)具有IL-13受体结合链生物活性的(a)-(f)的片段。
较好地，蛋白质包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列；从氨基酸22到氨基酸334的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；SEQ ID NO：4的氨基酸序列；从氨基酸26到氨基酸341的SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在其他较好的实施方案中，特异氨基酸序列组成融合蛋白(含有不是从IL-13bc衍生的其他氨基酸序列)。较好的融合蛋白质包括抗体片段，如Fc片段。特别较好的实施方案包括从氨基酸1到氨基酸331的SEQ ID NO：2的氨基酸序列和从氨基酸26到氨基酸331的SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
本发明还提供了含有本发明的蛋白质和药学可接受的载体的药学组合物。
本发明进一步提供了包括与本发明的蛋白质特异反应的抗体的组合物。
本发明还提供了鉴别结合IL-13bc或IL-13受体的抑制剂的方法。这些方法包括：
(a)将IL-13bc蛋白质或其片段与IL-13或其片段结合，所说的结合形成第一结合混合物；
(b)测定在第一结合混合物中蛋白质和IL-13或片段结合的量；
(c)将一种化合物与蛋白质和IL-13或片段结合形成第二结合混合物；
(d)测定在第二结合混合物中结合的量；
(e)比较在第一结合混合物中的结合量和在第二结合混合物中的结合量；
其中当第二结合混合物的结合量降低发生时，化合物能抑制IL-13与IL-13受体的结合。
本发明还提供了通过这些方法鉴别的IL-13R的抑制剂和含抑制剂的药学组合物。
本发明还公开了在哺乳动物受试体中抑制IL-13与IL-13bc蛋白质或IL-13受体结合的方法，其包括服用治疗上有效量的含有IL-13bc蛋白质，IL-13bc或IL-13R抑制剂或IL-13bc蛋白质抗体的组合物。
本发明还提供了改善IL-13活性的方法，其包括将具有IL-13活性的蛋白质与权利要求11的蛋白质结合，并将这样的结合物与除了IL-13bc外至少表达IL-13R一条链的细胞接触。较好地，接触步骤通过给哺乳动物受试体服用治疗上有效量的这种结合物来实施。
本发明还提供了在哺乳动物受试体内治疗与IL-13相关的病况的方法。所说的方法包括服用治疗上有效量的含有IL-13拮抗剂和药学可接受的载体的组合物。其他方法提供了一种在哺乳动物受试体中抑制IL-13和IL-13bc蛋白质相互作用的方法，包括服用治疗上有效量的含有IL-13拮抗剂和药学可接受的载体的组合物。较好地，拮抗剂是从下列组中选取的，包括：IL-13bc蛋白质，IL-13Rα1的可溶形式，IL-13或其IL-13结合片段的抗体，IL-13bc或其IL-13bc结合片段的抗体，IL-13Rα1或其IL-13Rα1结合片段的抗体，IL-4的IL-13R结合突变体，能抑制IL-13与IL-13bc相互作用的小分子，和能抑制IL-13与IL-13Rα1相互作用的小分子。
本发明附图的简单描述
图1：演示了如在下面实施例4中所描述的用IL-13bc-Fc处理后，IL-13，IL-4，IL-11和模拟转染COS细胞的照片。
图2：演示了通过体内阻断白细胞介素-13过敏原-诱导气管过度反应的逆转。在初始气管内攻击后10天，将用OVA-和PBS-免疫接种的鼠再次用OVA或PBS实施气管内攻击。在-1天，0天，+1天和+3天通过腹腔内注射给鼠服用sIL-13bc-Fc(400μg)或等同量的对照物人类IgG。在PBS和OVA攻击后4天测定过敏显型。(A)对乙酰胆碱攻击的气管过度反应(AHR)，表示为随时间累积的气管压力的升高〔气管-压力-时间指数[APTI]为厘米H2O×秒〕。(B)支气管肺泡洗液的炎性细胞组合物。通过光显微镜评定的Cytospin制备确定细胞分化百分比。数据表示为细胞的绝对量。(C)OVA-特异血清IgE浓度。结果是每组8-10只动物的平均+/-SEM。与各自的PBS对照组比较，*P＜0.05；与OVA/人类Ig组比较，**P＜0.05(单道ANOVA，接着进行多种比较的Fisher最小显著区别试验)。
图3：IL-13阻断对过敏原引起的增加气管上皮细胞中含粘液细胞的影响。肺块(每次试验N＝4，每只动物4块)固定在福尔马林中，切成10uM的块，并用苏木精和曙红染色，进行高碘酸希夫反应。显示代表性块。条形＝100μm。PBS/人类-Ig：PBS-免疫接种及攻击对照物，显示少量含粘液细胞。OVA/人类-Ig：过敏原诱导增加了间质炎性细胞并增加了含粘液的杯状细胞。OVA/sIL-13bc-Fc：IL-13对过敏原诱导杯状细胞粘液产生的显著抑制作用。
图4：IL-13诱导气管过度反应性。首次用于试验的鼠通过气管内滴入每日服用重组IL-13(5μg/鼠，50μl体积)或PBS。最后治疗后24小时，(A)气管过度反应，(B)BAL嗜曙红细胞量，(C)血清总IgE量，(D)确定粘液评分。结果是每组7-10只动物的平均+/-SEM(垂直条形)。与PBS组(学生试验)比较，*P＜0.05。
本发明较好的实施方案的详细描述
本申请的发明者首先鉴别并提供了编码IL-13R的IL-13结合链(本文后面称为“IL-13bc”)的多核苷酸，包括但不限于编码鼠科动物和人类IL-13bc的多核苷酸。
SEQ ID NO：1提供了编码鼠科动物IL-13bc的cDNA的核苷酸序列。SEQ ID NO：2提供了受体链的预测氨基酸序列，包括从氨基酸1-22的推定信号序列。成熟鼠科动物IL-13bc认为具有SEQ ID NO：2的氨基酸22-383的序列。成熟鼠科动物受体链具有至少三个不同区域：胞外域(约包括SEQ ID NO：2的氨基酸22-334)，跨膜域(约包括SEQ ID NO：2的氨基酸335-356)和胞内域(约包括SEQ ID NO：2的氨基酸357-383)。
SEQ ID NO：3提供了编码人类IL-13bc的cDNA的核苷酸序列。SEQ ID NO：4提供了受体链的预测氨基酸序列，包括从氨基酸1-25的推定信号序列。成熟人类IL-13bc认为具有SEQID NO：4的氨基酸26-380的序列。成熟人类受体链具有至少三个不同区域：胞外域(约包括SEQ ID NO：4的氨基酸26-341)，跨膜域(约包括SEQ ID NO：4的氨基酸342-362)和胞内域(约包括SEQ ID NO：4的氨基酸363-380)。
人类IL-13bc的前81个氨基酸序列与称为“ygppf10.r1Homo sapiens cDNA克隆41648”的指定数据库登记号R52795-.gb-est2的已表达的序列标志(EST)的翻译序列相同。在这个EST序列中没有能使此领域中所技术人员鉴别编码蛋白质为细胞因子受体的同源性或序列基元。对于这个数据库进入的cDNA克隆体是从L.M.A.G.E.协会公共可获得的。在本申请的优先权日期后，这样的克隆体由申请人定购并测序。这种克隆体的序列确定为由申请人以前公开的，本文的SEQ ID NO：3。
IL-13bc蛋白质的可溶形式也可制备。这种可溶形式没有限制地包括含有SEQ ID NO：2的氨基酸1-334或氨基酸22-334或SEQ ID NO：4的氨基酸1-341或氨基酸26-341的蛋白质。IL-13bc蛋白质的可溶形式进一步特点在于在水溶液中是可溶的，较好地是在室温下。仅包括胞内域或其部分的IL-13bc蛋白质也可制备。少于全长的任何形式的IL-13bc都包括在本发明的范围内，本文共同地称全长和成熟形式为“IL-13bc”或“IL-13bc蛋白质”。少于全长的IL-13bc蛋白质可通过表达相应片段的编码全长IL-13bc蛋白质(SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3)的多核苷酸来制备。这些相应的多核苷酸片段也是本发明的一部分。如上所述修饰的多核苷酸也可通过标准分子生物学技术制备，包括构建适当的所需缺失突变体，位点定向诱变法，或通过使用适当的寡聚核苷酸引物的聚合酶链反应。
为了本发明的目的，如果蛋白质具有一个或多个下列特性，那么该蛋白质就具有“IL-13受体链的生物活性”：(1)能结合IL-13或其片段(较好地是其生物活性片段)；和/或(2)能与IL-13R的第二条非IL-13结合链相互作用产生IL-13与IL-13R结合的信号特性。较好地，蛋白质具有的生物活性是能结合IL-13或其片段，更好地是KD约为0.1到约100nM。确定是否具体蛋白质或肽具有这种活性的方法没有限制地包括本文提供的实施例中所描述的方法。
IL-13bc或其活性片段(IL-13bc蛋白质)可与载体分子如免疫球蛋白融合。如IL-13bc的可溶形式可提供“接头”序列与免疫球蛋白的Fc部分融合。其他融合蛋白质，如与GSR，Lex-A或MBP的融合蛋白质也可使用。
本发明还包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3列出的核苷酸序列的等位基因变体，即，同样编码IL-13bc蛋白质的SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：3的分离多核苷酸的自然发生的可替换形式，较好地是那些具有IL-13bc生物活性的蛋白质。还包括在本发明中的有在高度严格条件下(如在65℃0.1×SSC)，与SEQID NO：1或SEQ ID NO：3中列出的核苷酸序列杂交的分离多核苷酸。由于遗传密码的简并编码IL-13bc蛋白质的但不同与在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中列出的核苷酸序列的多核苷酸也包括在本发明中。由于点突变或通过诱导修饰产生的SEQID NO：1或SEQ ID NO：3中列出的核苷酸序列的变化都包括在本发明中。
本发明还提供了编码其他动物物种，特别是哺乳动物物种的鼠科动物和人类IL-13bc的同族体的多核苷酸。物种同族体可通过从本文所公开的鼠科动物或人类序列制备探针或引物以及筛查从适当物种获得的文库，如从相关物种获得的PBMC，胸腺或睾丸构建的文库来鉴别及分离。
为了重组制备IL-13bc蛋白质，本发明的分离多核苷酸可以可操作地结合表达控制序列，如在Kaufman等人，核酸研究，19，4485-4490(1991)中所公开的pMT2或pED表达载体。多种适合的表达控制序列在此领域中是众所周知的。表达重组蛋白质的常用方法也是众所周知的，并在R.Kaufman，酶学方法，185，537-566(1990)中示例。如本文所定义的，“可操作地结合”意指酶促或化学地连接以在本发明的分离多核苷酸和表达控制序列之间形成共价键，这样，已用连接的多核苷酸/表达控制序列转化的(转染的)宿主细胞就表达了IL-13bc蛋白质。
许多种类的细胞可用作为IL-13bc蛋白质表达适当的宿主细胞。可使用能表达功能IL-13bc蛋白质的任何细胞种类。适当的哺乳动物宿主细胞包括，如猴子COS细胞，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，人类肾脏293细胞，人类表皮A431细胞，人类Colo205细胞，3T3细胞，CV-1细胞，其他转化的灵长类细胞系，正常双倍染色体细胞，从初级组织，初级移植体的体外培养物衍生的细胞品系，HeLa细胞，鼠L细胞，BHK，HL-60，U937，HaK，Rat2，BaF3，32D，FDCP-1，PC12，M1x，或C2C12细胞。
IL-13bc蛋白质也可通过在一个或多个昆虫表达载体中将本发明的多核苷酸与适当的控制序列可操作地结合，并使用昆虫表达系统来制备。杆状病毒/昆虫细胞表达系统使用的方法和物料，可从如Invitrogen，San Diego，美国加州(MaxBac试剂盒)以试剂盒的形式购得，并且这种方法在此领域中也是众所周知的，如在Summers和Smith，得克萨斯州农业试验站公报No.1555(1987)中所描述的，该文献通过在此引述而合并于本篇。IL-13bc蛋白质的可溶形式也可在昆虫细胞中使用如上所述的适当的分离多核苷酸来制备。
可替换地，IL-13bc蛋白质可制备在小型真核生物中，如酵母，或制备在原核生物中，如细菌。适当的酵母品系包括酿酒酵母(Saccharomyces ceremisiae)，裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，科普属品系(Kluyveromyces)，假丝酵母(Candida)，或任何能表达异源蛋白质的酵母品系。适当的细菌品系包括，埃希氏杆菌(Escherichia coli)，杆状菌(Bacillus subtilis)，沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，或任何能表达异源蛋白质的细菌品系。
在细菌中表达会导致形成掺入重组蛋白质的包含体。因此，为了制备活性或更具活性的物质，可能需要重组蛋白质的重折叠。从细菌包含体中获得正确折叠的异源蛋白质的几种方法在此领域中是众所周知的。这些方法通常包括从包含体中溶解蛋白质，然后使用离液试剂完全使蛋白质变性。当半胱氨酸残基在蛋白质的初级氨基酸序列中存在时，常常需要在可以正确形成二硫键的环境(氧化还原系统)中实施重折叠。重折叠的常用方法在Kohno，酶学方法，185：187-195(1990)中公开。EP0433225和共同待审的USSN 08/163,877中描述了其他适用的方法。
本发明的IL-13bc蛋白质也可表达为转基因动物的产品，如表达为转基因牛，山羊，猪或绵羊的奶，其特点在于体细胞或生殖细胞含有编码IL-13bc蛋白质的多核苷酸序列。
本发明的IL-13bc蛋白质可在表达所需蛋白质需要的培养条件下，通过培养转化宿主细胞的培养物来制备。然后将产物表达蛋白质从培养基或细胞提取物中提纯。本发明IL-13bc蛋白质的可溶形式可从条件培养基中提纯。本发明的IL-13bc蛋白质的膜结合形式可通过从表达细胞中制备总膜组分，并用非-离子清洗剂如Triton X-100萃取膜来提纯。
IL-13bc蛋白质可使用此领域中的技术人员已知的方法来提纯。如本发明的IL-13bc蛋白质可使用购得的蛋白质浓缩滤膜，如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元来浓缩。浓缩步骤后，浓缩物可加入到提纯基质如凝胶过滤介质中。可替换地，也可使用阴离子交换树脂，如具有二乙氨基乙基(DEAE)或聚乙烯亚胺(PEI)侧基团的基质或底物。基质可以是丙烯酰胺，琼脂糖，右旋糖苷，纤维素或通常使用在蛋白质提纯中的其他种类。可替换地，也可使用阳离子交换步骤。适当的样离子交换剂包括多种含有磺丙基和羧甲基基团的不溶基质，。磺丙基是较好的(如S-琼脂糖柱)。从培养物上清液中提纯IL-13bc蛋白质也可包括流经一个或多个亲和树脂柱的步骤，如伴刀豆球蛋白A-琼脂糖，肝磷脂-toyopearl或Cibacrom蓝3GA琼脂糖；或使用树脂如苯基酯，丁基酯，或丙基酯通过疏水相互作用层析步骤；或通过免疫亲和层析步骤。最后，使用疏水RP-HPLC介质，如含有甲基或其他脂肪族侧基团的硅胶，可实施一个或多个反相高效液相层析(RP-HPLC)步骤进一步提纯IL-13bc蛋白质。依据已知方法，含有IL-13或其片段的亲和柱或含有IL-13bc蛋白质抗体的亲和柱也可使用在提纯步骤中。一些或全部前述提纯步骤，以多种组合方式或连同其他已知方法，都可用来提供基本上纯的分离重组蛋白质。较好地，分离IL-13bc蛋白质是纯的，以致基本上其不含其他哺乳动物蛋白质。
本发明IL-13bc蛋白质可用来筛查能结合IL-13bc或IL-13R的试剂，或筛查干扰IL-13与IL-13或IL-13bc结合的(胞外或胞内域)并因此能用作为正常结合和细胞因子活性抑制剂(“IL-13R抑制剂”)的试剂。使用所需蛋白质(固定的或不固定的)的结合测试法在此领域中是众所周知的，并可使用本发明的IL-13bc蛋白质用作这种目的。基于提纯细胞的或基于蛋白质(不含细胞)的筛查测试可用来鉴别这种试剂。如，IL-13bc蛋白质可以提纯形式固定在载体上，在存在和不存在可能的抑制试剂的情况下，测定与提纯IL-13bc蛋白质的结合。适当的结合测试可以可替换地使用本发明的IL-13bc蛋白质的可溶形式。其中抑制剂可得到筛查的系统的另一个实施例在如下的实施例2中描述。
在这样的筛查测试中，通过将IL-13或其片段与IL-13bc蛋白质结合形成第一结合混合物，测定在第一结合混合物(BO)中的结合量。通过将IL-13或其片段，IL-13bc蛋白质与要进行筛查的化合物或试剂结合形成第二结合混合物，测定第二结合混合物(B)中的结合量。比较第一结合混合物中和第二结合混合物中的结合量，如，通过计算B/BO的比率。与第一结合混合物相比，如果在第二结合混合物中观察到结合量下降，那么可以认为化合物或试剂能抑制结合。任意地，IL-13R的第二条链可加入到一种或两种结合混合物中。结合混合物的配制和优化在此领域技术范围内，这样的结合混合物也可含有需要增强或优化结合的缓冲液和盐，其他对照测试也包括在本发明的筛查测试中。
因此可鉴别发现能将IL-13bc蛋白质与IL-13或其片段结合活性降低到任何程度的化合物，较好地至少约10％，更好地大于约50％或更多，然后再在其他结合测试中和体内测试中进行筛查。通过这些方法，也可鉴别对IL-13bc结合具有抑制性活性的适于作治疗试剂的化合物。
IL-13bc蛋白质，和编码它们的多核苷酸，也可用作诊断试剂，来检测IL-13bc，IL-13R，IL-13或表达IL-13bc，IL-13R或IL-13的细胞的存在或表达。使用这些种类的物质，蛋白质或多核苷酸可在标准方法中用作这种目的进行诊断测试。适合的方法对此领域中的技术人员是众所周知的。
如本文所使用的，“IL-13R”是指IL-13bc和/或称为“IL-13Rα1”或“NR4”第二条IL-13受体链(参看：鼠科动物受体链，Hilton等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996，93：497-501；人类受体链，Aman等人，生物化学期刊，1996，271：29265-70，和Gauchat等人，欧洲免疫学期刊，1997，27：971-8)。
IL-13bc作为IL-13已知生物活性的中介体。因此，IL-13bc蛋白质(较好地是可溶IL-13bc蛋白质)，IL-13R抑制剂(即，IL-13与IL-13R相互作用的拮抗剂(如，IL-13R的抗体(具体包括IL-13bc或IL-13Rα1的抗体)))和其片段，IL-13的抗体和其片段，可溶IL-13Rα1蛋白质，和IL-13与IL-13R相互作用(包括与IL-13bc和/或与IL-13Rα1的相互作用)的小分子和其他抑制剂，可用在治疗或调理多种IL-3与其有关或受到IL-13的活性(或其降低)影响的医学病况(总称“与IL-13相关病况”)。结合IL-13R的IL-4的突变形式也可用作为IL-13拮抗剂(参看，如在Shanafelt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1998，95：9454-8；Aversa等人，医学专家期刊，1993，178：2213-8；和Grunewald等人，免疫学期刊，1998，160：4004-9中所描述的)。
与IL-13相关病况包括但不限于Ig-调节的病况和疾病，具体地是IgE调节的病况[包括但不限于遗传性过敏症，过敏性病况，哮喘，免疫复合疾病(如，狼疮，肾病综合症，肾炎，血管球性肾炎，甲状腺炎和Grave症)]；肺的炎性病况；免疫缺损，造血祖细胞的特异缺损，和与其相关的病变；癌症和其他疾病。这种病理状况可由疾病，放射或药物治疗引起，包括如，白血球减少症，细菌性和病毒性感染，B细胞或T细胞缺少如骨髓移植后免疫细胞或造血细胞缺损。因为IL-13抑制巨噬细胞活化，所以IL-13bc蛋白质也可用来增强巨噬细胞活化(即，在疫苗中，治疗真菌或胞内微生物，或寄生性感染)。
IL-13bc蛋白质还可用来在体内和体外加强IL-13的作用。如，IL-13bc蛋白质可与具有IL-13活性的蛋白质(较好地是IL-13)结合，产生的组合物可与除IL-13bc链外表达至少一条IL-13R链细胞接触(较好地所有链是IL-13R不是IL-13bc，如IL-13Rα1)。较好地，接触步骤通过给哺乳动物受试体体内服用治疗上有效量的这种组合物来实施。预建立的IL-13蛋白质和IL-13bc蛋白质的缔合可协助形成特定信号所需的完全IL-13/IL-13R复合物。参看实施例，由Economides等人描述的方法，科学，270；1351(1995)。
从细胞中提纯或重组制备的，IL-13bc蛋白质和IL-13R抑制剂，当与药学可接受的载体组合时，可用作为药学组合物。这样的组合物可含有，除了IL-13bc或抑制剂和载体外，多种稀释剂，填充剂，盐，缓冲液，稳定剂，溶剂，和其他此领域中众所周知的物质。“药学可接受的”意指不干扰活性组分的生物活性效果的无-毒性物质。载体的特性将取决于服用途径。
本发明的药学组合物也可含有细胞因子，淋巴因子，或其他造血因子如M-CSF，GM-CSF，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-14，IL-15，G-CSF，干细胞因子，和促红细胞生成素。药学组合物也可包括抗细胞因子抗体。药学组合物可含有溶血栓因子或抗-溶血栓因子，如血纤蛋白溶酶原激活物和因子VIII。药学组合物还进一步包括其他抗炎性试剂。这种额外的因子和/或试剂可包括在药学组合物中，以与分离IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂一起产生配合效果，或减小由分离IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂产生的副作用。相反地，分离IL-13bc或IL-13bc抑制剂可包含在具体细胞因子，淋巴因子，其他造血因子，溶血栓因子或抗溶血栓因子，或抗-炎性试剂的配方中，以减小细胞因子，淋巴因子，其他造血因子，溶血栓因子或抗溶血栓因子，或抗-炎性试剂的副作用。
本发明的药学组合物可以是在脂质体形式中，其中，除了其他药学可接受的载体，分离IL-13bc蛋白质和IL-13bc抑制剂与两亲性试剂组合，两亲性试剂如以聚集形式如胶束，不溶单层，液晶，或水溶液中的片晶形式存在的脂质。适合脂质体配方的脂质包括，没有限制地，单酸甘油酯，甘油二酯，硫脂，溶血卵磷脂，磷脂，皂角苷，胆酸等等。这种脂质体配方的制备在此领域中技术范围内，如在美国专利No.4,235,871；美国专利No.4,501,728；美国专利No.4,837,028；美国专利No.4,737,323中所描述的，所有这些文献都通过在此引述而合并于本篇。
如本文所使用的，“治疗上有效量”是指药学组合物或方法中的活性组分的量足以显示显著的患者受益，如改善病况的症状，治疗病况，或增加治疗病况的速度。当给个体使用活性组分，单独服用时，该术语仅指活性组分。当组合服用时，该术语是指产生治疗效果的活性组分的组合量，不论是组合形式服用，顺序服用或同时服用。
在实施本发明的治疗方法或应用中，给哺乳动物服用治疗上有效量的分离IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂。分离IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂可依据本发明的方法或单独服用，或与其他治疗试剂一起服用，如使用细胞因子，淋巴因子或其他造血因子的治疗试剂。当与一种或多种细胞因子，淋巴因子或其他造血因子一起服用时，IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂可与细胞因子，淋巴因子，其他造血因子，溶血栓因子或抗-溶血栓因子同时服用，或顺序服用。如果顺序服用，实施医师应确定服用IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂与细胞因子，淋巴因子，其他造血因子，溶血栓因子或抗-溶血栓因子的适当顺序。
服用使用在本发明的药学组合物中的或用来实施本发明的方法的IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂，可通过多种传统方法实施，如口服，吸入，或皮肤，皮下或静脉内注射。对于患者静脉内服用是较好的。
当治疗上有效量的IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂口服时，IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂应是片剂，胶囊，溶液或西也剂。当以片剂形式服用时，本发明的药学组合物还可含有固体载体如凝胶或辅剂。片剂，胶囊和粉末含有约5％到95％的IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂，较好地含有约25％到90％的IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂。当以液体形式服用时，可加入液体载体如水，石油，动物或植物源的油，如花生油，大豆油或芝麻油，或合成油。液体形式的药学组合物还可进一步病况生理盐水溶液，右旋糖或其他糖类溶液，或二醇如乙二醇，丙二醇或聚乙二醇。当以液体形式服用时，药学组合物可含有约0.5％到90％重量比的IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂，较好地含有约1％到50％的IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂。
当治疗上有效量的IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂可通过静脉内，皮肤或皮下注射服用时，IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂应是不含热原质的，非肠道可接受的水溶液形式。制备这样的非肠道可接受的蛋白质溶液，适当地考虑到PH，等张性，稳定性等等，在此领域的技术范围内。较好的适合静脉内，皮肤或皮下注射的药学组合物应含有，除了IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂外，等张赋形剂如氯化钠注射液，Ringer注射液，葡萄糖注射液，葡萄糖和氯化钠注射液，乳酸盐Ringer注射液，或其他此领域中已知的赋形剂。本发明的药学组合物还可以含有稳定剂，防腐剂，缓冲液，抗氧化剂，或此领域中的技术人员已知的其他添加剂。
在本发明的药学组合物中的IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂的量取决于要治疗的病况的性质和严重性，取决于患者已进行的预先治疗的性质。最终，实施医师来确定治疗每个个体患者的IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂的量。开始，实施医师应给患者服用低剂量的IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂，并观察患者反应。服用较大剂量的IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂，直到从患者获得最优的治疗效果，在这个点上，剂量不再逐渐增加。可考虑认为，用来实施本发明的方法的多种药学组合物应每公斤体重含有约0.1μg到约100毫克的IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂。
使用本发明的药学组合物的静脉治疗的持续时间应是变化的，取决于要治疗疾病的严重性，和每个个体患者的情况和可能的特殊反应。可以考虑认为，每次使用IL-13bc蛋白质或IL-13bc抑制剂的持续时间应在连续静脉内服用的12小时到24小时范围内。最终，实施医师来确定使用本发明的药学组合物的静脉治疗的适当的持续时间。
本发明的IL-13bc蛋白质也可用来免疫接种动物以获得特异地与IL-13bc蛋白质反应的多克隆和单克隆抗体，其可抑制IL-13或其片段与受体的结合。这样的抗体可以使用完整IL-13作为免疫原获得，或通过使用IL-13bc的片段，如可溶成熟IL-13bc获得。IL-13bc的较小片段也可用来免疫接种动物。肽免疫原还可在羧基末端含有半胱氨酸残基，并与半抗原如匙孔戚血蓝蛋白(KLH)缀合。其他肽免疫原可通过用硫酸化酪氨酸替换酪氨酸残基产生。合成这种肽的方法在此领域中是众所周知的，如R.P.Merrifield，美国化学科学期刊，85，2149-2154(1963)；J.K.Krstenansky等人，FEBS Lett.211，10(1987)。
结合IL-13bc蛋白质的中和或非-中和抗体(较好地是单克隆抗体)也可以是某些肿瘤的治疗试剂，也可用在上面描述的病况治疗中。这些中和单克隆抗体能阻断IL-13与IL-13bc的结合。
实施例1 分离IL-13bc cDNA
分离鼠科动物IL-13受体链
从6-8周大的C3H/HeJ鼠的胸腺中制备5μg的聚腺苷酸+RNA。使用Stratagene cDNA合成试剂盒依据制造商的指示制备双链，半甲基化的cDNA。简单地，第一条链用寡脱氧胸苷酸-Xho引物引发，在第二条链合成后，加入EcoRI衔接子，用XhoI消化cDNA，并提纯。将cDNA连接到Zap表达(stratagene)λ载体的XhoI-EcoRI位点上，并依据制造商的指示使用Gigapak II金包装提取物(stratagene)包装。依据制造商指示扩增1.5×106产物重组噬菌体文库。使用如(分子生物学的当前方案，Ausubel等人编辑，John Wiley&Sons，1995，6.4.3章)所描述的标准TMAC杂交条件，用序列位KSRCTCCABK CRCTCCA(SEQ IDNO：5)(K＝G+T；S＝C+G；R＝A+G；B＝C+G+T)的简并17mer寡核苷酸探针筛查文库。克隆体A25被识别，因为其与17mer探针杂交，但不与从已知的血细胞生成素受体衍生的探针杂交。依据制造商的指示将这个克隆体从Zap表达载体中分离到质粒中，确定DNA序列。DNA序列编码血细胞生成素受体家族的新型成员。
在1996年2月22日以登记号69997，将含有具有SEQ ID NO：1序列的聚核苷酸的克隆体25用ATCC沉积为pA25pBKCMV。
分离人类IL-13受体链
通过PCR使用从鼠科动物序列衍生的寡核苷酸分离鼠科动物受体的人类同系物的部分片段。从CLONTECH获得的人类睾丸聚腺苷酸+RNA中制备cDNA。通过PCR，使用下列寡核苷酸，在含有1.5mM氯化镁的1X Taq缓冲液中，使用AmpliTaq聚合酶进行30个周期的温育(94℃×1分钟，42℃1分钟，72℃1分钟)，扩增274个碱基对的DNA片段，寡核苷酸：ATAGTTAAACCATTGCCACC(SEQ ID NO：6)和CTCCATTCGCTCCAAATTCC(SEQ ID NO：7)。确定这个片段的DNA序列，从这个片段的内部制备两种寡核苷酸，具有下列序列：AGTCTATCTTACTTTTAGTCG(SEQ ID NO：8)和CATCTGAGCAATAAATATTCAC(SEQ ID NO：9)。这些寡核苷酸用作为探针来筛查从CLONTECH(产品目录#HL1161)购得的人类睾丸cDNA文库。使用标准5x SSC杂交条件在52℃杂交滤膜，并在52℃用2XSSC冲洗。分离在400,000个克隆体的筛查中与两种寡核苷酸都杂交的二十二个克隆体。从四个cDNA克隆体确定DNA序列，所有编码相同的新型血细胞生成素受体。全长人类受体链的预定DNA序列如SEQ ID NO：3所示。
在1996年2月22日以登记号69998将人类克隆体用ATCC沉积为phA25#11pDR2。
实施例2 可溶IL-13bc蛋白质的表达及活性测定
可溶IL-13bc-Ig的制备和提纯
通过PCR，将编码鼠科动物IL-13bc的胞外域的氨基酸1-331的DNA与编码gly-ser-gly的间隔序列融合，并连接在具有编码COS-I表达载体pED.Fc的人类IgG1的绞链区域CH2CH3序列的读框内。从DEAE-右旋糖苷转染的COS-1细胞制备IL-13bc-Ig，并通过蛋白质A琼脂糖层析法(Pharmacia)提纯。
B9增殖测定
通过将3H-胸腺嘧啶掺入到DNA中测定IL-13或IL-4对B9细胞增殖的刺激作用(Aarden等人，免疫学欧洲期刊，1987，17：1411-1416)。在存在或不存在1ug/毫升的IL-13bc-Ig的情况下，将细胞(5×103/培养皿)接种在96培养皿的板中，板中有含有不同浓度的生长因子的介质。温育3天后，加入1μCi/培养皿的3H-胸腺嘧啶，再将细胞温育4小时。使用LKB1205板读取仪确定掺入放射性活度。
对IL-13，IL-4或IL-6反应B9细胞增殖。可溶IL-13bc-Ig仅抑制对IL-13的反应，说明这种受体特异结合IL-13，不结合IL-4或IL-6。表格显示了每分钟计数。显示两个不同的试验。
实施例3 通过表面细胞质基因组共振(Biacore分析)测定可溶
IL-13bc和IL-13的直接结合
Biacore生物传感器用来直接测定IL-13和提纯IL-13bc-Ig的特异结合(Pharmacia，Johnsson等人，1991)。如制造商所建议的，将提纯IL-13bc-Ig，人类IgG1或不相关受体的约10,000到17,000个共振单元(RU)共价固定在传感器片上的不同流动池中。(RU是结合在传感器片表面的蛋白质质量的反映)。在存在或不存在过量提纯IL-13bc-Ig的情况下，将提纯IL-13以5μl/分钟经10分钟注射穿过流动池。结合定量为样品在注射前和后RU的不同。对于固定IL-13bc-Ig仅观察到481.9RU的特异IL-13结合，而共同注射IL-13和IL-13bc-Ig与固定IL-13bc-Ig没有结合(4RU)。对于固定IgG或IL-11R-Ig没有观察到IL-13结合(分别为5.4和3.7RU)。
实施例4
表达在COS细胞中的IL-13与标记IL-13bc-Ig融合蛋白质的结合：IL-13与IL-13bc-Fc的COS原位检测
通过DEAR-右旋糖苷法，将IL-13，IL-4，IL-11的表达载体或空载体转染到重复试验板中的COS-1细胞中。两天后将转染细胞用磷酸缓冲液盐水(PBS)冲洗两遍，并在培养板中在4℃用甲醇固定10秒。接着用PBS冲洗固定细胞两遍，然后用结合缓冲液(PBS1％(w/v)牛血清清蛋白，1％(w/v)叠氮化钠)漂洗，在4℃，在含有1.0μg/毫升IL-13bc-Fc或相关的抗细胞因子抗血清的结合缓冲液中温育2小时。将细胞在PBS中冲洗两遍，在4℃，在以1∶500稀释在结合缓冲液中的碱性磷酸酯酶标记兔F(ab)2’抗-田鼠IgG中(进行Fc融合检测)或兔F(ab)2’抗-田鼠IgG(进行细胞因子检测)中晃动温育。细胞再次用PBS冲洗两遍。使用硝基蓝四唑和磷酸5-溴代-4-氯代-3-吲哚酯观察碱性磷酸酯酶活性。
在显微镜下观察特异结合。仅有用IL-13转染的细胞显示出与IL-13bc-Ig特异结合。(参看转染细胞照片，图示)
实施例5 确定IL-13bc蛋白质的生物活性的其他方法
可使用其他方法确定是否特异IL-13bc蛋白质表现出如本文所定义的IL-13bc的“生物活性”。下列这些方法的实例。
测定IL-13结合
IL-13bc蛋白质结合IL-13或其片段的能力可通过任何适当的能检测这种结合的测试法确定。这些适当的实施例如下。
IL-13与IL-13bc蛋白质的胞外域结合会特异地产生磷酸酪氨酸对受体蛋白质的快速诱导。通过磷酸化作用测定配体结合活性的测试法如下描述。
可替换地，制备IL-13bc蛋白质(如，胞外域的可溶形式)并用来检测IL-13结合。如制备DNA构建，其中胞外域(在预定的跨膜区域前截断，较好地在之前立即截断)与编码人类免疫球蛋白(IgG)γ1的CH2和CH3绞链域的cDNA在读框内连接。这种构建产生在COS细胞的适当表达载体中，如pEDΔC或pMT2。质粒瞬时转染到COS细胞中。分泌的IL-13bc-Ig融合蛋白质收集到条件培养基中，并通过蛋白质A层析法提纯。
提纯的IL-13bc-Ig融合蛋白质在多种应用中用来演示IL-13结合。可将IL-13覆盖在酶结合免疫吸附剂测试(ELISA)板的表面，然后使用标准ELISA缓冲液用牛血清清蛋白或酪蛋白阻断其他结合位点。IL-13bc-Ig融合蛋白质然后与固相IL-13结合，用与山葵过氧化酶缀合的次级山羊抗-人Ig检测结合。特异结合酶的活性可用比色底物，如四甲基对二氨基联苯和吸光度读数来测定。
IL-13也可表达在细胞表面，如通过提供跨膜域或葡糖基磷脂酰纤维醇(GPI)键。表达膜结合IL-13的细胞可使用IL-13bc-Ig融合蛋白质鉴别。可溶IL-13bc-Ig融合蛋白质与这些细胞的表面结合，使用与荧光染料如荧光素异硫氰酸酯缀合的山羊抗-人Ig和流式细胞计量术来测定。
相互作用阱
酵母基因选择法，“相互作用阱”[Gyrris等人，细胞，75：791-803，1993]，可用来确定IL-13bc蛋白质是否具有本文所描述的IL-13bc的生物活性。在这个方法中，LexAop-Leu2和LexAop-LacZ的受体基因表达依赖于诱饵蛋白质间的相互作用，如与人类IL-13bc相互作用的蛋白种类，和捕获者，如人类IL-13bc蛋白质。因此，通过Leu2或LacZ表达程度可测定相互作用的强度。最简单的方法是测定LacZ编码蛋白质，β-牛乳糖的活性。该活性可通过含X-Gal培养基或滤膜上的蓝色度来判断。对于定量测定β-牛乳糖的活性，标准测试法可在“酵母基因学方法”，冷泉港，纽约，1990(Rose，M.D.，Winston，F.，和Hieter，P.)中找到。
在这些方法中，如果要确定IL-13bc蛋白质是否与具体物种蛋白质(如，体内结合IL-13bc的胞内域的胞质蛋白)相互作用，物种蛋白可在相互作用阱中用作“诱饵”，要测定的IL-13bc蛋白质作为“捕获者”，或相反。
实施例6 使用可溶IL-13bc蛋白质治疗哮喘
使用过敏性哮喘特点显著的鼠科动物模型，其中过敏原暴露导致气管过度反应(“AHR”)，肺部嗜曙红细胞过多，增加抗原-特异血清IgE含量，并且增加气管上皮粘液的量(3，11)。雄性A/J鼠腹腔内免疫接种，随后用可溶卵清蛋白(OVA)进行气管内攻击，在抗原攻击(13)后4天评定过敏显型。在随后气管内过敏原攻击(14)前24小时，通过系统服用可溶IL-13bc-IgGFc融合蛋白质(sIL-13bc-Fc)，其特异结合并中和IL-13，实施IL-13阻断。对抗原免疫接种的鼠的攻击产生气管对乙酰胆碱反应的显著增加(15)(图2A)。对IL-13的阻断致使这种已建立的过敏原-诱导AHR完全逆转；因此，在这种模型中IL-13对表达AHR是必要的。在过敏性哮喘显型完全发展后，IL-13消除能逆转AHR，相比IL-4消除不能实施这种逆转。在逆转过敏原诱导AHR中IL-4Rα的阻断效力的基础机理可能是对IL-13调节过程的抑制作用，与两种细胞因子Stat6激活是在IL-4Rα-调节信号的下游的事实一致。IL-13可能是引起过敏原-诱导AHR的初级CD4+T细胞-衍生因子。
为了评定AHR的与IL-13相关的表达可能的基础机理，我们定性已知的过敏性效应子级联。嗜曙红细胞已显示为哮喘和哮喘AHR的初级效应细胞(16)，但在重复抗原刺激前对IL-13的抑制作用没有显著地影响过敏原-诱导肺部嗜曙红细胞过多(17)(图2B)。为了评定IgE-调节途径的相关性，我们测定OVA-特异血清IgE(18)。OVA-特异量的IgE在OVA-敏化的和攻击的鼠中可观察到，而在PBS-免疫接种的和攻击的鼠中没有检测到抗原-特异抗体(图2C)。IL-13的阻断没有改变OVA-特异IgE量，缺少抑制作用可能是由于IL-13阻断发生在初始抗原引发和抗体形成之后。虽然如此，这些结果显示，在这种模型中，AHR不依赖于IgE的产生，这与过敏性AHR在IgE缺失和B细胞缺失鼠中可正常发展的报道一致(19)。
与人类哮喘的病理一致，鼠科动物模型中的过敏性哮喘也与气管上皮细胞的粘液量显著增加有关(5，11)。在死于急性哮喘发作的患者尸体解剖样品中粘液过量分泌特别显著(20)。IL-13的阻断逆转了气管中过敏原-诱导的含粘液细胞的增加(图3)，说明过敏原诱导的-起气管内粘液含量增加与IL-13有关。IL-4也牵连在这个过程中，因为在没有抗原敏化作用存在的情况下，IL-4转基因鼠表现出显著的杯状细胞增生(5)。然而，Th2克隆体从IL-4-缺失鼠和对照物鼠到鼠科动物气管中的转移诱导了粘液过量产生(21)，再一次说明，IL-4的免疫调节作用需要仔细地与其作为效应子分子的作用相区别。
给首次用于试验的(未免疫接种的)鼠的气管中每天服用重组IL-13(rIL-13)诱导AHR，显示IL-13活性的增加足以诱导AHR(图4A)(22)。在开始服用rIL-13后AHR发展72小时。在服用rIL-13后很早就观察到嗜曙红细胞显著流入到支气管肺泡洗液液体中，然而，肺部嗜曙红细胞过多在AHR表达时没有观察到(图4B)。尽管嗜曙红细胞流入的显著时间过程保持的不明显，但它说明仅IL-13可能足以启动气管的嗜曙红细胞渗透，也许是通过它能向上调节趋化因子表达(23)。气管服用rIL-13也产生与时间相关的总血清IgE的增长(图4C)(24)，与预先报道的IL-13能调节IgE合成一致(25)。血清IgE的增加与用任何过敏原免疫接种无关，说明与人类哮喘显型与总血清IgE浓度比过敏原-特异血清IgE浓度更相关的观察结果一致(26)。如从上述对IL-13抑制作用的研究中所预测的，服用rIL-13诱导增加气管粘液产生(如4D)(27)。
参考文献和注释
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13.从Jackson实验室(Bar Harbor，ME)获得六周大雄性A/J鼠，在试验持续期间将它们放置在层流罩下的试验控制特异不含病原的动物装置中(N＝4-10只鼠/试验组)。本文所描述的研究与由动物安全法规所规定的试验动物研究法则和健康，教育和安全(N.I.H.)部门试验使用动物的指示一致。通过腹腔内注射10ug卵清蛋白(OVA；粗制等级IV，Sigma；St.Louis，MO)的0.2毫升PBS溶液或仅注射PBS对鼠免疫接种。免疫接种后14天，将鼠用氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物(分别为45和8毫克/公斤)麻醉，用50ul 1.5％OVA溶液实施气管内攻击，或用等同体积量的PBS攻击作为对照物。第一次抗原攻击后10天，用OVA或PBS再一次实施气管内攻击。第二次抗原攻击后96小时实施过敏显型定性。
14.如上所述克隆人类IL-13。对于鼠科动物同系物的可溶表达，将含有编码鼠科动物sIL-13胞外域DNA的pED表达载体，与人类IgG1d绞链区域CH2/CH3(如在前面实施例中所描述的)融合在读框内，转染到CHO细胞内(D.D.Donaldson等人，免疫学期刊，161，2317(1998))。用r蛋白质A-琼脂糖提纯sIL-13bc-Fc(J.F.Urban等人，免疫学8，255(1998))。通过在增殖测试中中和3ng/毫升的鼠科动物IL-13的能力确定体外ID50约为10ng/毫升。人类IgG，用作sIL-13bc-Fc的对照物，从购得用来静脉内服用(Miles)[ibid]的人类免疫球蛋白的10％溶液中通过r蛋白质A-琼脂糖层析法同样提纯。在-1天，0天，+1天，和+3天通过静脉内注射sIL-13bc-Fc(400μg)，或等同量对照物人类-IgG，实施次级抗原攻击。
15.在最终气管内攻击后3天，测定气管对静脉内服用乙酰胆碱的反应性(11)。将鼠用戊巴比妥钠(90毫克/公斤)麻醉，插入管子，用连续定时涨落体积的空气(0.2毫升)，以120呼吸/分钟通气，用溴代十烃季铵(25毫克/公斤)使其瘫痪。建立稳定的气管压力后，静脉内注射乙酰胆碱(50ug/公斤)，接着动态压力5分钟。
16.G.J.Gleich，J.Clin.Immunol，8，422(1990)。
17.如(11)所述实施支气管肺泡灌洗。
18.切除肾，汇集的血液收集进行如(11)所述的抗体分析。离心分离血清，并保存在-80℃直到分析进行。通过夹层ELISA测定血清OVA-特异IgE量。将样品用0.01％OVA的PBS溶液覆盖，用10％的FBS的PBS阻断，用0.05％Tween-20的PBS溶液冲洗。血清样品用10％FBS的PBS溶液以1∶10和1∶100稀释。温育过夜后，将板用0.05％Tween-20的PBS溶液冲洗，加入生物素-缀合的抗鼠IgE(PharMingen，San Diego，CA)。冲洗后，加入0.0025毫克/毫升的抗生物素蛋白过氧化酶(Sigma)的10％FBS/PBS溶液，将板用ABTS(2，2’-连氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸))(Kirkegaard和Perry)显影。在30分钟内读取405nm的板。记录O.D.值是以1∶10稀释的血清样品的，因为通过比较用10％FBS/PBS以1∶100稀释的样品的O.D.值，证实这些值低于测试的饱和点。
19.P.D.Mehlhop等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94，1344(1997)；M.Korsgren等人，医学专家期刊，185，916(1996)。
20.T.Aikawa等人，Chest 101，916(1992)。
21.L.Cohn，R.J.Homer，A.Marinov，J.Rankin，K.Bottomly，医学专家期刊，186，1737〔1997〕。
22.编码接着六个组氨酸标记的蜜蜂蜂毒素前导序列的DNA(D.C.Tessier，D.Y.Thomas，H.E.Khouri，F.Laliberte，T.Vernet，基因2，177(1991))通过肠激酶裂解部位融合到Gly21上的鼠科动物IL-13的成熟区域，并构建在哺乳动物表达载体pHTop中。从稳定转染的CHO细胞制备H6-EK鼠科动物IL-13蛋白质，并通过Ni-NTA层析法提纯到通过SDS-PAGE确定的大于97％的纯度。通过在280nm吸光度确定蛋白质浓度，通过CapeCod Associates LAL测试法测定内毒素污染少于30EU/毫克。通过Ba/F3.IL-13R1增殖测定法确定H6-EK鼠科动物IL-13的ED50为1ng/毫升。给用氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物(分别为45和8毫克/公斤)麻醉的首次用于试验的鼠每天气管内滴入服用鼠科动物rIL-13(总体积50ul中含有5ug)。
23.M.Goebeler等人，免疫学91，450(1997)。
24.使用从PharMingen获得的鼠IgE的互补抗体对(R35-72和R35-92)，依据制造商的指示，使用鼠科动物IgE-特异ELISA来定量血清中总IgE免疫球蛋白的量。测定每个动物的重复试验样品(10％FBS的PBS溶液的1/10稀释液)。使用从重组鼠IgE(5-2000pg/毫升)生成的标准曲线中获得的值将样品的O.D.读数转化成pg/毫升，通过乘以稀释率获得最终浓度。
25.C.L.Emson，S.E.Bell，A.Jones，W.Wisden，A.N.J.Mckenzie，医学专家期刊，188，399(1998)。
26.L.R.Friedhoff，D.G.Marsh，Int.Arch.All.免疫学，100，355(1993)。
27.为了测定rIL-13对气管上皮细胞的粘液细胞含量的影响，将肺切除并固定在10％的福尔马林中。然后将它们用70％乙醇冲洗，脱水，嵌入乙二醇甲基丙烯酸酯中，切成10uM的块，安装在幻灯片上，用苏木精和曙红染色，并进行高碘酸希夫反应。每只动物测定四块；每块肺评定4个区域。在1-4范围评定肺块，1表示没有粘液细胞含量。
28.J.Luyimbazi，X.Xu，M.Wills-Karp，未公布结果。
29.C.Walker等人，美国呼吸系统疾病评述146，109(1992)；M.Humbert等人，J.All.Clin.免疫学99，657(1997)；S.K.Huang，免疫学期刊155，2688(1995)。
30.D.G.Marsh等人，科学264，1152(1996)。
31.L.J.Rosenwasser，N.Engl.J.Med.337，1766(1977)。
32.G.K.Hershey等人，N.Engl.J.Med.337，1720(1997)。
本文所引用的所有专利和参考文献都通过在此引述而合并于此，如同全文列出。

Claims (47)

1.一种分离的多核苷酸，包括从下列组中选取的核苷酸序列：
(a)从核苷酸256到核苷酸1404的SEQ ID NO：1核苷酸序列；
(b)从核苷酸103到核苷酸1242的SEQ ID NO：3核苷酸序列；
(c)由于遗传密码的简并从(a)或(b)定义的核苷酸序列的序列中变化而来的核苷酸序列；
(d)在严格条件下能与(a)或(b)定义的核苷酸杂交的核苷酸序列；
(e)编码(a)或(b)定义的序列的物种同族体的核苷酸序列；
(f)(a)或(b)定义的核苷酸序列的等位基因变体。
2.依据权利要求1的多核苷酸，其中所说的核苷酸序列编码具有IL-13R结合链生物活性的蛋白质。
3.依据权利要求1的多核苷酸，其中所说的核苷酸序列是可操作地结合表达控制序列。
4.依据权利要求1的多核苷酸，包括从核苷酸319到核苷酸1257的SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
5.依据权利要求1的多核苷酸，包括从核苷酸1324到核苷酸1404的SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
6.依据权利要求1的多核苷酸，包括从核苷酸178到核苷酸1125的SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
7.依据权利要求1的多核苷酸，包括从核苷酸1189到核苷酸1242的SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
8.一种用权利要求3的多核苷酸转化的宿主细胞。
9.依据权利要求8的宿主细胞，其中所说的细胞是哺乳动物细胞。
10.一种制备IL-13bc蛋白质的方法，所说的方法包括：
(a)在适当的培养介质中培养权利要求8的宿主细胞培养物；
(b)从培养物中提纯IL-13bc蛋白质。
11.一种分离的IL-13bc蛋白质，包括从下列组中选取的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(b)从氨基酸22到氨基酸334的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(c)从氨基酸357到氨基酸383的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(d)SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
(e)从氨基酸26到氨基酸341的SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
(f)从氨基酸363到氨基酸380的SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
(g)具有IL-13受体结合链生物活性的(a)-(f)的片段。
12.依据权利要求11的蛋白质，包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
13.依据权利要求11的蛋白质，包括从氨基酸22到氨基酸334的SEQ ID NO：2的序列。
14.依据权利要求11的蛋白质，包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
15.依据权利要求11的蛋白质，包括从氨基酸26到氨基酸341的SEQ ID NO：4的序列。
16.一种药学组合物，包括权利要求11的蛋白质和药学可接受的载体。
17.一种依据权利要求10制备的蛋白质。
18.一种组合物，包括特异与权利要求11的蛋白质反应的抗体。
19.一种鉴别结合IL-13或IL-13受体的抑制剂的方法，其包括：
(a)将权利要求11的蛋白质与IL-13或其片段结合，所说的结合形成第一结合混合物；
(b)测定在第一结合混合物中蛋白质和IL-13或片段结合的量；
(c)将一种化合物与蛋白质和IL-13或片段结合形成第二结合混合物；
(d)测定在第二结合混合物中结合的量；
(e)比较在第一结合混合物中的结合量和在第二结合混合物中的结合量；
其中当第二结合混合物的结合量降低发生时，化合物能抑制IL-13与IL-13受体的结合。
20.一种由权利要求19的方法鉴别的抑制剂。
21.一种药学组合物，包括权利要求20的抑制剂和药学可接受的载体。
22.一种在哺乳动物受试体中抑制IL-13结合IL-13受体的方法，所说的方法包括服用治疗上有效量的权利要求21的组合物。
23.一种在哺乳动物受试体中抑制IL-13结合IL-13受体的方法，所说的方法包括服用治疗上有效量的权利要求16的组合物。
24.一种在哺乳动物受试体中抑制IL-13结合IL-13受体的方法，所说的方法包括服用治疗上有效量的权利要求18的组合物。
25.一种分离的多核苷酸，包括编码含有从下列组中选取的氨基酸序列的肽或蛋白质的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(b)从氨基酸22到氨基酸334的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(c)从氨基酸357到氨基酸383的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(d)SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
(e)从氨基酸26到氨基酸341的SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
(f)从氨基酸363到氨基酸380的SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
(g)具有IL-13受体结合链生物活性的(a)-(f)的片段。
26.依据权利要求11的蛋白质，其中所说的氨基酸序列是部分融合蛋白质。
27.依据权利要求26的蛋白质，包括Fc片段。
28.一种在哺乳动物受试体内治疗IL-13相关的病况的方法，所说的方法包括服用治疗上有效量的权利要求16的组合物。
29.依据权利要求28的方法，其中所说的包括是IgE-调节的病况。
30.依据权利要求29的方法，其中所说的病况是从下列组中选取的，包括遗传性过敏症，过敏性病况，哮喘和免疫复合疾病。
31.依据权利要求30的方法，其中所说的病况是从下列组中选取的，病况狼疮，肾炎，甲状腺炎和Grave症。
32.一种改善IL-13活性的方法，所说的方法包括将具有IL-13活性的蛋白质与权利要求11的蛋白质结合，并将这样的组合物与除了IL-13bc外表达至少一条IL-13R链的细胞接触。
33.依据权利要求32的方法，其中接触步骤通过给哺乳动物受试体服用治疗上有效量的这种组合物来实施。
34.依据权利要求11的蛋白质，包括从氨基酸1到氨基酸331的SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
35.依据权利要求11的蛋白质，包括从氨基酸26到氨基酸331的SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
36.依据权利要求25的多核苷酸，其编码包括从氨基酸1到氨基酸331的SEQ ID NO：2的氨基酸序列肽或蛋白质。
37.依据权利要求25的多核苷酸，其编码包括从氨基酸26到氨基酸331的SEQ ID NO：2的氨基酸序列肽或蛋白质。
38.依据权利要求28的方法，其中所说的病况是肺的炎症病况。
39.一种在哺乳动物受试体内治疗IL-13相关的病况的方法，所说的方法包括服用治疗上有效量的包括IL-13拮抗剂和药学可接受的载体的组合物。
40.依据权利要求39的方法，其中所说的病况是IgE-调节的病况。
41.依据权利要求40的方法，其中所说的病况是从下列组中选取的，包括遗传性过敏症，过敏性病况，哮喘和免疫复合疾病。
42.依据权利要求41的方法，其中所说的病况是从下列组中选取的，包括狼疮，肾炎，甲状腺炎和Grave症。
43.依据权利要求39的方法，其中所说的拮抗剂是从下列组中选取的，包括IL-13bc蛋白质，IL-13Rα1的可溶形式，IL-13或其IL-13结合片段的抗体，IL-13bc或其IL-13bc结合片段的抗体，IL-13Rα1或其IL-13Rα1结合片段的抗体，IL-4的IL-13R结合突变体，能炎症IL-13与IL-13bc相互作用的小分子，和能炎症IL-13与IL-13Rα1相互作用的小分子。
44.依据权利要求43的方法，其中所说的IL-13bc蛋白质是权利要求11的蛋白质。
45.一种在哺乳动物受试体中抑制IL-13与IL-13bc蛋白质相互作用的方法，所说的方法包括服用治疗上有效量的含有IL-13拮抗剂和药学可接受的载体的组合物。
46.依据权利要求45的方法，其中所说的拮抗剂是从下列组中选取的，包括IL-13bc蛋白质，IL-13Rα1的可溶形式，IL-13或其IL-13结合片段的抗体，IL-13bc或其IL-13bc结合片段的抗体，IL-13Rα1或其IL-13Rα1结合片段的抗体，IL-4的IL-13R结合突变体，能炎症IL-13与IL-13bc相互作用的小分子，和能炎症IL-13与IL-13Rα1相互作用的小分子。
47.依据权利要求46的方法，其中所说的IL-13bc蛋白质是权利要求11的蛋白质。
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