CN102482352B

CN102482352B - 抗il-17br的抗体

Info

Publication number: CN102482352B
Application number: CN201080022541.4A
Authority: CN
Inventors: 安德努·尼尔·詹姆斯·麦肯锡; 丹尼尔·内尔
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: British Research and Innovation Agency
Priority date: 2009-04-06
Filing date: 2010-03-31
Publication date: 2015-06-10
Anticipated expiration: 2030-03-31
Also published as: AU2010233535B2; CA2757104C; CA2757104A1; AU2010233535A1; HK1170745A1; JP5767625B2; WO2010116123A1; US8586037B2; DK2417161T3; US20140044718A1; JP2012522531A; US8852589B2; EP2417161B1; EP2417161A1; CN102482352A; US20120020985A1; ES2633767T3; GB0905972D0

Abstract

本发明提供与白介素-17受体B结合的抗体D9.2和基于D9.2的抗体分子。这些可用于如哮喘、溃疡性结肠炎或克罗恩氏病的治疗。

Description

抗IL-17BR的抗体

技术领域

本发明涉及针对白介素17B受体(IL-17BR)的抗体，包括其结合片段。

背景技术

哮喘是常见的慢性气道炎性疾病。在最近的几十年中患者的数量显著增加，且世界卫生组织估计全世界约有三十亿人患有哮喘。变应性哮喘的特征为由多种刺激性刺激物引发的不可控的气道高反应性(AHR)且与进入肺的II型炎性浸润有关。

炎性肠道病(IBD)为结肠(也称作大肠)的粘膜层的慢性炎性感染，其包括两种疾病症状：溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩氏病(CD)。治疗IBD的常规疗法包括抗生素或类固醇衍生药物或者抗-TNF-α剂；然而；这些疗法目前在诱导或维持患者的临床症状缓解方面并不成功(Hanauer等，2008)。UC被认为是Th2-介导的疾病，典型的小鼠模型表明肠道炎症的发展与Ⅱ型细胞因子有关(Heller等，2002)。

不同的白介素-17B受体如IL-25R、IL-17BR、IL-17RB或IL-17RH1，通过其与IL-17A受体(IL-17RA)的同源性在表达的序列标志数据库中被首次鉴定出来(Tian等，2000)。IL-17BR随后表现出与IL-17B和IL-25结合(Lee等，2001；Shi等，2000；Tian等，2000)。IL-25与IL-17BR(1.4nM)的结合比IL-17B(7.6nM)更具亲和力。

IL-25是IL-17细胞因子家族(IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D和IL-17F-其与1型炎症相关)的成员，其与IL-17家族的其它成员显著不同，这是因为IL-25的产生诱导了II型细胞因子表达，II型细胞因子表达与脾肿大、IgG1和IgE的血清水平提高以及肺和消化道的病理变化(包括嗜酸性浸润、粘膜分泌增加和上皮细胞增生)有关(Fort等，2001；Lee等，2001；Moseley等，2003；Pan等，2001)。IL-25的遗传切除(genetic ablation)或阻断抗-IL-25抗体的使用已经清楚地表明IL-25不仅在预防寄生虫感染中非常重要(Fallon等，2006；Owyang等，2006)，而且在调节哮喘的应答特性中也发挥了重要作用(Ballantyne等，2007)。IL-25似乎是通过其诱导Ⅱ型细胞因子如IL-13释放的能力来刺激这些应答，Ⅱ型细胞因子如IL-13最初来自先天非B-/非-T(NBNT)细胞(Fallon等，2006；Fort等，2001)，且随后来自适应性T细胞应答(Angkasekwinai等，2007；Wang等，2007)。

已经从肺、脑、胰脏、肾脏、甲状腺和嗜酸细胞的库中鉴定了il17br信使(message)(Lee等，2001；Shi等，2000)。在肺平滑肌细胞中的表达似乎是被免疫调节的(Lajoie-Kadoch等，2006)。

与在哮喘中的作用相似，IL-25mRNA或蛋白质已经从多种在肺中的细胞类型中检测到，包括肺泡巨噬细胞、肥大细胞、嗜酸细胞和嗜碱粒细胞(Wang等，2007)。更近些年来，由过敏原刺激的人和小鼠肺上皮细胞所产生的IL-25已有助于IL-25调节变应性肺应答的潜在作用(Angkasekwinai等，2007)。另外，已经报道IL-25诱导炎性细胞因子和趋化因子从肺成纤维细胞产生以及细胞外基质成分从气道平滑肌细胞产生。另外，近来的研究已经表明在哮喘患者的活组织中针对IL-25和IL-17BR的转录显著升高，这与嗜酸性浸润有关(Wang等，2007)。用针对IL-25的阻断单克隆抗体处理OVA致敏小鼠导致AHR下降以及在支气管肺泡灌洗液中对OVA攻击和胆碱施用应答的IL-13浓度更低。

最近，Rickel等(J Immunol 181，4299-4310(2008))在基于人细胞的初级检测中使用阻断人IL-17RA的单克隆抗体来阻止IL-25的活性。这表明IL-25活性需要IL-17BR和IL-17RA。然而，也有报道称IL-17A和IL-17F通过含有IL-17RA和IL-17RC的杂聚肽复合物转导信号。

Rickel等也描述了与小鼠IL-17BR反应的抗体，其在变应性哮喘的小鼠模型中阻断IL-25-诱导的肺部炎症。至今尚未报道过与人IL-17BR反应的抗体。

与IBD的作用相似，在小鼠的慢性结肠炎实验模型中已经观察到产生IL-25，这与Th1向Th2型应答的转换有关(Fichtner-Feigl等，2008)，并且在小鼠的胃肠道中发现IL-25的高mRNA表达(Fort等，2001)。而且，IL-25基因位于人14号染色体的克罗恩氏病敏感区，尽管其与疾病潜在的关联仍有待于研究(Buning等，2003)。

发明内容

本发明人已经鉴定出与IL-17BR高亲和性和特异性结合的抗体分子。

本发明所描述的抗体分子可用于阻断IL-25在体内的生物活性，并且预防气道炎症、AHR和结肠炎。

在抗原攻击的小鼠中，施用本文所描述的抗体分子表现出IL-13和IL-5的水平下降，其二者为调节哮喘的重要细胞因子，且将肺中的产生IL-13的细胞数量降低至与不含抗原攻击或抗原攻击的IL-17BR不足小鼠的水平相似。本文所描述的抗体分子也可以显著地降低气道高反应性。另外，本文所描述的抗体分子可以降低与疾病相关的体内γ/δT细胞扩张。这表明本文所描述的抗体分子抑制了两种已知的对于哮喘发作重要途径；IL-13产生和γ/δT细胞应答性。

上述抗原攻击的小鼠在哮喘实验模型中被OVA(卵清蛋白)抗原攻击。在IBD实验模型中被OXA(噁唑酮)抗原攻击的小鼠，施用本发明所述的抗体分子后表现出IBD死亡率降低和临床症状减少，例如由炎症和出血引发的体重减轻和结肠缩短。

本发明所描述的抗体分子可与小鼠和人的IL-17BR交叉反应，并且可抑制人IL-25与人IL-17BR的结合。因此，该抗体分子可用于小鼠模型以研究其体内作用机理。另外，本发明所描述的抗体分子可阻断人细胞中IL-25/IL-17BR复合物的生物作用。因此本发明所描述的抗体分子对于治疗诸如哮喘的疾病具有潜在的用途。

本发明的一个方面提供结合IL-17BR且包含抗体VH域的抗体分子，所述抗体VH域包含具有如SEQ ID NO：7氨基酸序列的VH CDR3。

优选地，抗体分子阻断IL-17BR与IL-25的结合且降低或抑制至少下组之一：IL-25-介导的AHR、IL-13产生、IL-25-介导的IL-5产生、IL-25-介导的IL-8产生，以及r/δT细胞扩张和浸润。

抗体分子可包含VH域，其包含SEQ ID NO：7的VH CDR3以及SEQ ID NO：5的CDR1和SEQ ID NO：6的CDR2。

VH域可与VL域配对，例如VL域与SEQ ID NO：8的CDR1、SEQ ID NO：9的CDR2和SEQ ID NO：10的CDR3。在一些实施方案中，VH域可与SEQ ID NO：4的VL域配对。

在一些实施方案中，抗体分子可包含VH域和VL域，其中VH域包含SEQ ID NO：5的VH CDR1、SEQ ID NO：6的VH CDR2和SEQ ID NO：7的VH CDR3，且VL域包含SEQ ID NO：8的VLCDR1、SEQ ID NO：9的VL CDR2和SEQ ID NO：10的VL CDR3。

VH域可进一步包含人或非人构架区，例如SEQ ID NO：2中表示的构架区。在一些实施方案中，抗体分子可包含SEQ ID NO：2的VH域。

VL域可进一步包含人或非人构架区，例如SEQ ID NO：4中表示的构架区。在一些实施方案中，抗体分子可包含SEQ ID NO：4的VL域。

在一些实施方案中，抗体分子可包含SEQ ID NO：2的VH域和SEQ ID NO：4的VL域。

本发明的一些方面还提供编码本发明所述的抗体分子的分离的核酸、包含该核酸的载体，以及在宿主细胞中表达该核酸以产生本发明的抗体分子的多种方法。

本发明还提供本发明抗体分子的用途，例如以药物组合物的形式用于治疗疾病，例如IL-25介导的疾病，诸如过敏、哮喘和结肠炎。

本发明的这些及另外的方面通过参考所附实施例在下文中进行详细描述。

附图说明

图1表示抗-IL-17BR克隆D9.2对于由ELISA结合的人和鼠类IL-17BR是可交叉反应的；柱形图表示培养基(白色柱)或D9.2抗体克隆(黑色柱)与固定化鼠科IL-17BR-Fc、人IL-17BR-Fc或人IgG对照的结合。

图2表示在转染的COS7细胞和在初级小鼠细胞上D9.2结合IL-17BR；用鼠科(a)或人(b)IL-17BR表达载体转染的COS7细胞表达由D9.2识别的IL-17BR。将细胞用1μg/ml D9.2培养20分钟，然后清洗；在用抗-小鼠IgG FITC以0.5μg/ml培养20分钟后采用FACS检测D9.2结合。(c)体外分化的Th2细胞表达IL-17BR并被D9.2结合；在Th1细胞上的表达很低或没有。(d)在三天连续的腹膜内的400ng IL-25剂量后，IL-17BR-表达的非B非T(NBNT)细胞种群在野生型(d，e)的肠系膜淋巴节中出现，但不在IL-17BR敲除(d，f)小鼠中出现；这样的种群由D9.2识别并产生IL-13。

图3表示D9.2结合IL-17BR，但不与小鼠或人IL-17RA、IL-17RC、或IL-17RD交叉反应；简而言之，将ELISA板用IL-17R-家族成员涂覆；在4℃下以2μg/ml的浓度将IL-17RA、IL-17BR、IL-17RC或IL-17RD或IL-13Rα对照培养过夜，在室温下用PBS/0.05％吐温洗涤且在PBS/10％FCS阻断4小时；使用链霉亲和素-HRP和ELISA显色溶液以及405nm的检测吸收检测生物素化的D9.2结合。

图4表示小鼠单克隆抗体D9.2而非其它小鼠单克隆抗-IL17BR抗体(3b9、2c1、5h9、7e1、10c6、10e6)，抑制人IL-25与人IL-25受体的结合；各个纯化的小鼠单克隆抗体在hIL17Br/Fc(100ng/ml)中被稀释(x100)，最终浓度在100ng/ml的hIL17Br/Fc溶液中为1μg/ml；简而言之，将[抗体x hIL17Br/Fc]混合物加入至人IL-25-涂覆的板，培养1小时30分钟且洗涤三次；在室温下将抗-hIgG(Fc)-HRP缀合物(Serotec)加入至该板并培养45分钟，洗涤三次并用TMB显色；用1M HCL使反应停止。在450nm下读取光密度，并从所有的读数中减去试剂空白读数。

图5表示D9.2抗体阻断体外NBNT细胞和CD4+(T和/或NKT)细胞的IL-13产生；(a)NBNT细胞；简而言之，从首次接受试验的BALB/c小鼠切除肠系膜淋巴结并去除CD3+和CD19+细胞；将NBNT细胞接种(plated)在圆底96-孔板，3x10⁵细胞/孔，并在仅RPMI 10％(培养基(MEDIA))或10ng/ml IL-25(IL-25)的RPMI10％FCS培养72小时；将D9.2从最高浓度为2μg/ml开始以一系列浓度加入至孔内，并培养1.5小时，随后向这些孔加入10ng/mlIL-25；然后在37℃下将板培养72小时，随后用ELISA测定上清液的IL-13含量；(b)CD4+(T和/或NKT)细胞；从首次接受试验的野生型BALB/c小鼠摘取脾脏并制备单细胞悬液；在96-孔板中以1x10⁶细胞/ml培养分离的CD4+细胞，或者在仅RPMI中，或者在具有或不具有1μg/ml D9.2的RPMI和10ng/ml IL-25中；培养细胞72小时，随后将上清液取出用于采用ELISA分析IL-13蛋白水平。

图6表示D9.2抑制IL-25诱导的从小鼠肾癌(RENCA)细胞系以剂量依赖性方式产生KC(小鼠IL-8)；在室温下采用各种浓度的D9.2或IgG1对照抗体将IL-25(100ng/ml)预培养30-60分钟，随后加入细胞；TNF-α(10ng/ml)被加入至RENCA细胞-涂覆的板，随后立即加入IL-25蛋白质/D9.2混合物；用100ng/ml的IL-25和10ng/ml TNF-α(IL-25+TNF-α)或仅对照培养基(Media)，将无抗体的对照样品培养24小时，随后加入细胞。在刺激后24小时用ELISA测定KC释放。

图7表示D9.2抑制IL-25-诱导的从人肾癌(TK-10)细胞系以剂量依赖性方式产生IL-8；在室温下将各种浓度的D9.2或IgG1对照抗体将IL-25(100ng/ml)预培养30-60分钟；TNF-α(10ng/ml)被加入至TK-10细胞-涂覆的板，随后立即加入IL-25蛋白质/D9.2混合物；用100ng/ml的IL-25和10ng/ml TNF-α(IL-25+TNF-α)或仅对照培养基(Media)，将无抗体的对照样品培养24小时，随后加入该细胞；在刺激后24小时用ELISA测定IL-8释放。

图8表示D9.2在体内阻断了IL-25应答；(a)当用在体外再刺激时，来自致敏的卵清蛋白(OVA)和受攻击小鼠的纵隔淋巴结细胞产生IL-13；相比于IL-17BR KO小鼠的应答，在OVA攻击之前施用D9.2降低了IL-13应答水平；(b)当用OVA在体外再刺激时，来自OVA致敏和受攻击小鼠的纵隔淋巴结细胞产生IL-5；相比于IL-17BR KO小鼠的应答，在OVA攻击前施用D9.2降低IL-5应答水平；(c)D9.2治疗降低了OVA致敏和受攻击的小鼠的肺中产生IL-13细胞的数量；染色IL-13的细胞内细胞因子显示了OVA致敏和受攻击小鼠(其在IL-17BR KO小鼠中不存在)中产生IL-13细胞的种群，并且在OVA攻击前用抗-IL-17BR抗体D9.2处理的动物中被降低；(d)在IL-17BR KO小鼠中与在OVA攻击之前施用D9.2的小鼠中，OVA致敏和受攻击的小鼠的脾中的γ-δT-细胞数量被降低；(e)D9.2治疗降低OVA致敏和受攻击的小鼠中的AHR。

图9表示D9.2在体内阻断IBD小鼠模型中的IL-25应答；(a)被噁唑酮攻击的动物的存活百分比低于仅施用乙醇的对照；在致敏和攻击之前施用D9.2降低死亡率；(b)基于体重减轻结合各个动物的前身状况和行为来计算临床分数；相比于接受同种型抗体的小鼠，施用D9.2导致临床分数的改善；(c)相比于对照，IBD小鼠的结肠长度减低。D9.2施用防止IBD动物的这种降低。

序列：

参照以下序列识别号对本发明的抗体分子进一步描述：

SEQ ID NO：1 编码D9.2VH的核苷酸序列

SEQ ID NO：2 D9.2VH氨基酸序列

SEQ ID NO：3 编码D9.2VL的核苷酸序列

SEQ ID NO：4 D9.2VL氨基酸序列

SEQ ID NO：5 D9.2VH CDR1氨基酸序列

SEQ ID NO：6 D9.2VH CDR2氨基酸序列

SEQ ID NO：7 D9.2VH CDR3氨基酸序列

SEQ ID NO：8 D9.2VL CDR1氨基酸序列

SEQ ID NO：9 D9.2VL CDR2氨基酸序列

SEQ ID NO：10 D9.2VL CDR3氨基酸序列

进一步的序列在所附的序列表中列出。

发明详述

本申请涉及抗原-抗体类型的反应。

一般地，抗体的重链可变区(VH域)在抗体与抗原的结合中发挥重要作用。VH域的CDR3区被发现比CDR1和CDR2区更加多变，因此在多数抗体中提供了针对抗体靶标的特异性。因此本发明的抗体分子基于D9.2抗体的VH CDR3区的周围区域的。在一些优选的实施方案中，本发明的抗体分子包含D9.2抗体的VH域的全部三个CDR。

包含本发明的CDR的抗体分子的结构通常为抗体分子的重链或轻链序列或者其重要部分，其中CDR位于相应于天然产生的VH和VL抗体可变域的CDR的位置，该可变域由重排的免疫球蛋白基因编码。免疫球蛋白可变域的结构和位置可参考以下文献来确定：Kabat，E.A.等，免疫相关的蛋白序列(Sequences of Proteinsof Immunological Interest)，第4版，美国健康与人类服务部(USDepartment of Health and Human Services)，1987及其更新版。查询这个数据库可获得很多学术和商业在线的资源。例如，参见Martin，A.C.R.通过计算机蛋白使用Kabat抗体序列数据库，蛋白质：结构、功能和遗传学(Accessing Kabat Antibody SequenceDatabase by Computer PROTEINS：Structure，Function andGenetics)，25(1996)，130-133以及相关联的在线资源，当前可在以下网址获得：http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html。

一般地，抗体分子包含VH域，其与VL域配对以提供抗体抗原结合域，尽管在一些实施方案中，VH域可单独用于结合抗原。例如，D9.2VH域(SEQ ID NO：2)可与D9.2VL域(SEQ ID NO：4)配对，以形成包含D9.2VH和VL域的抗体抗原结合位点。或者，D9.2VH域可与VL域而非D9.2VL域配对。

如在本发明中进一步所述，在本领域中已经很好地建立了轻链重组(promiscuity)本发明。

本发明所描述的抗体分子可结合人IL-17BR和/或小鼠IL-17BR。例如抗体分子可结合人IL-17BR，而未表现出或基本上未表现出与小鼠IL-17BR的结合。或者，本发明的抗体分子可结合小鼠IL-17BR，而未表现出或基本上未表现出与人IL-17BR的结合。

优选地，本发明的抗体分子与人和小鼠IL-17BR交叉反应。例如，交叉反应抗体分子结合人IL-17BR和小鼠IL-17BR。

如本发明所描述的抗体分子可结合IL-17BR，其亲和性基本上与D9.2类似，例如具有90％至110％的D9.2的结合亲和性。一般地，抗体分子将对IL-17BR有特异性。也就是说，抗体分子可结合IL-17BR，但未表现出或基本上未表现出与IL-17R族的其它成员的结合。优选地，对IL-17BR有特异性的抗体分子结合IL-17BR，但未表现出或基本上未表现出与IL-17RA、IL-17RC和/或IL-17RD的结合。

典型地，特异性可采用诸如应用抗原板的ELISA的结合检测法来测定。

本发明所描述的抗体分子与IL-17BR的结合可通过与重组IL-17BR的竞争来去除。

可使用常规技术在适当条件下比较本发明所描述的不同抗体分子的结合亲和性和中和效价(neutralisation potency)。

抗体分子包括任何具有所需的特异性和/或与IL-17BR结合的抗体抗原-结合位点的结合成员或物质。抗体分子的实例包括免疫球蛋白同种型及其同型亚类；抗体片段，诸如Fab、Fab’、Fab’-SH、scFv、Fv、dAb和Fd；基因工程抗体分子，诸如Fab₂、Fab₃、二链抗体、三链抗体、四链抗体和微抗体；以及其它多肽，其包含抗体抗原-结合位点，而不论是天然的或全合成或部分合成的。因此也包括嵌合分子，其包含与另外的多肽结合的抗原结合域或等价物。嵌合抗体的克隆和表达描述于欧洲专利EP-A-0120694和EP-A-0125023中。

抗体分子的实例包括(i)Fab片段，其由VL、VH、CL和CH1域组成；(ii)Fd片段，其由VH和CH1域组成；(iii)Fv片段，其由单链抗体的VL和VH域组成；(iv)dAb片段(Ward，E.S.等，自然(Nature)341，544-546(1989))，其由VH域组成；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab′)₂片段，包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH域和VL域通过肽连接子(linker)而连接在一起，肽连接子使这两个域相互联合以形成抗原结合位点(Bird等，科学(Science)，242，423-426，1988；Huston等，PNASUSA，85，5879-5883，1988)；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)；以及(ix)″双体(diabodies)″，由基因融合构造的多价或多特异性片段(WO94/13804；P.Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444-6448，1993)。可通过整合连接VH和VL域的二硫化物桥来使Fv、scFv或双体分子稳定(Y.Reiter等，自然生物技术(Nature Biotech)，14，1239-1245，1996)。也可以制备包含scFv与CH3连接的微体(minibody)(S.Hu等，Cancer Res.，56，3055-3061，1996)。抗体分子及其构造和使用方法描述于如下文献中：Holliger&Hudson，自然生物技术(Nature Biotechnology)23(9)：1126-1136(2005)。

当使用双特异性抗体分子时，其可为常见的双特异性抗体，其可用多种方法来制备(Holliger，P.和Winter G.生物技术当前述评(Current Opinion Biotechnol).4，446-449(1993))，例如通过化学方法制备或从杂交细胞制备，或可为上述任何的双特异性抗体片段。可构造无Fc区的双体和scFv，仅使用可变域，可能减小抗个体基因型反应的影响。

双特异性二体，与双特异性全抗体相反，也可以特异性地使用，因为其可易于在大肠杆菌中构造及表达。可易于使用噬菌体展示(WO94/13804)从库中选择具有适合的结合特异性的二体(以及很多其它的多肽，诸如抗体片段)。如果二体的一个臂保持不变，例如具有定向抗IL-217BR的特异性，则当另一个臂变化且合适特异性的抗体被选择时，可形成库。双特异性全抗体可通过knobs-into-holes技术来制备(J.B.B.Ridgeway等，Protein Eng.，9，616-621，1996)。

能够使用单克隆和其它抗体及应用重组DNA技术及来产生其它保持原抗体特异性的抗体分子或嵌合分子。这样的技术可包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补决定区(CDRs)的DNA，引入至不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加构架区。参见专利文献例如EPA-184187、GB 2188638A或EP-A-239400。

优选地将CDR区移植于人构架区。人构架区可通过很多方法来选择，例如通过比较小鼠构架区或小鼠V区序列与已知的人构架区或V区序列，并选择氨基酸相似度或同源性最高的或其最高程度之一的人构架区。可对天然人序列的构架区进行修饰以进一步优化所得的CDR-移植抗体。

尽管包含一对VH和VL域的抗体分子是优选的，但也可以使用基于VH或VL域序列的单结合域。已知单免疫球蛋白域，尤其是VH域，可以特异性的方式结合目标抗原。

在其中一个单链结合域的情况下，这些域可用于筛选能够形成可结合IL-17BR的双域抗体分子的互补域，如本发明下文所描述的。

抗体分子可进一步包含抗体恒定区或其部分。例如，VL域可在羧基末端与包括人Cκ或Cλ链的抗体轻链恒定域连接，优选为Cλ链。类似地，基于VH域的抗体分子可在其羧基末端与源自任何同种抗体的免疫球蛋白重链的全部或部分连接，同种抗体为例如，IgG、IgA、IgE和IgM以及任何同种的亚类，特别地为IgG1和IgG4。优选IgG4。可应用Fc区，如在WO99/58572所公开的Δnab和Δnac。

本发明的抗体分子的构架区也可以包括糖基化序列，其包括一个或多个糖基化位点。取决于表达抗体的宿主细胞，糖基化的形式能够变化。因此可对编码糖基化位点的核酸构建体进行修饰来去除该位点，或者这样的位点可被引入蛋白质。例如，在真核蛋白质中的N-糖基化位点由三联体Asn-X-Y来表征，其中X为除Pro以外的任何氨基酸，且Y是Ser或Thr。对编码这些三联体的核苷酸序列进行适当的替换、增加或缺失将导致糖残基在Asn侧链的连接阻碍。单个核苷酸的变化，例如Asn被不同氨基酸替换，足以使N-糖基化位点失活。已知用于使蛋白质中的N-糖基化位点失活的方法包括那些美国专利No.5,071,972和欧洲专利EP276,846中所描述的方法。

术语“抗原-结合域”指包含与部分或全部抗原特异性结合或互补的区域的抗体分子部分。如果抗原很大，抗体可仅与抗原的特定部分结合，该部分被称为表位。抗原结合域可通过一个或多个抗体可变域(例如所谓的由VH域组成的Fd抗体片段)来提供。优选地，抗原结合域包含抗体轻链可变区(VL)或至少其实质性部分和抗体重链可变区(VH)或至少其实质性部分。

免疫球蛋白可变域的主要部分包含至少三个CDR区域，以及插入其介于中间的构架区。优选地，该部分还也包括至少约50％的第一和第四构架区之一的一个或两者，该50％是第一构架区的50％羧基末端和第四构架区50％氨基末端。处于可变区的实质性部分的N-末端或C-末端的另外的残基可为那些与天然可变区非正常关联的残基。例如，通过由重组DNA技术合成构建的抗体分子构造技术可导致引入由连接子(linker)键编码的N-氨基或C-羧基末端残基，引入这些连接子键以有助于克隆或其它操作步骤。其它操作步骤包括引入连接子以将本发明的可变域连接至另外的蛋白质序列，其包括免疫球蛋白重链、其它可变域(例如在二体的产生中)或如下文所更详细描述的蛋白质标签。

通常将抗体分子和核酸编码抗体分子分离，例如，与其天然结合的物质诸如其它多肽或核酸分离，这些物质发现于其自然环境，或者当采用重组DNA技术在体内或体外进行这样的制备时发现于其被制备(诸如细胞培养)的环境。

如果被用于涂覆在免疫分析中使用的微滴定板，或与在诊断或治疗中使用的药用载体或稀释剂混合，抗体分子和核酸可用稀释剂和佐剂进行配制，以及出于实用目的进行分离——例如通常用明胶或其它载体来将该分子混合。抗体分子可被糖基化，无论是天然地或通过异种真核细胞系统(例如，CHO或NS0(ECACC85110503)细胞)，或它们可为未糖基化的(例如如果在原核细胞中表达所产生)。

除抗体序列以外，如本发明所描述的抗体分子可包含其它氨基酸，例如，形成肽或多肽如折叠域，或赋予该分子具有除结合抗原以外的其它功能特征。

在一些实施方案中，抗体分子可携带可检测的或功能性的标签，或者可与毒素或酶缀合(例如通过肽键或连接子)。

标记物可为产生或可被诱导产生信号的分子，包括但不限于荧光剂、放射性同位素标记、酶、化学发冷光剂或光敏剂。因此，通过检测荧光或冷光、放射性、酶活性或光吸收可检测和/或测定结合。

适合的标记物包括放射性标记物，诸如¹³¹I或⁹⁹Tc，使用抗体成像领域中已知的常规化学方法，其可结合抗体分子。标记物还包括酶标记物，诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(“G6PDH”)、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶和乙酰胆碱酯酶。标记物包括荧光标记物或荧光剂，诸如荧光素及其衍生物、荧光物、若丹明化合物和衍生物以及GFP(GFP，“绿荧光蛋白”)。标记物还包括化学部分诸如生物素，其可通过与特异性同源可检测部分结合来检测，例如标记的卵白素。

如果另外的特征为多肽域或标记物，抗体分子可通过重组技术来制备，例如通过编码抗体分子和另外的域的融合的核酸的表达。

与IL-17BR反应的抗体分子可包含本发明所列出的VH和VL域以及CDR的变体。变体可通过序列改变或突变及筛选的方法来获得。

根据本发明的抗体分子也可以与任何结合IL-17BR并包含本发明所描述的VH和/或VL域的抗体分子竞争结合IL-17BR本发明，更优选地，抗体分子包含SEQ ID NO：2的VH域和SEQ ID NO：4的VL域。因此，本发明的另一方面提供的抗体分子包含人抗体抗原-结合位点，其与D9.2竞争结合IL-17BR。在抗体分子间的竞争能够易于在在体外测定，例如使用ELISA和/或通过将特异性报告分子标记至抗体分子，该抗体分子可在其它未标记抗体分子的存在下检测，以识别结合相同表位或重叠表位的抗体分子。

在本领域中可知用于获得抗IL-17BR的抗体分子的各种方法，且其可与D9.2竞争结合IL-17BR。

如上所述，可应用本发明所公开的可变域氨基酸序列的变体。特定的变体可包括一个或多个氨基酸序列变化(氨基酸残基的增加、缺失、替换和/或插入)，可为小于约20个变化、小于约15变化、小于约10变化，或小于约5个、4个、3个、2个或1个变化。可以在一个或多个构架区和/或一个或多个CDR中产生变化。

基本上如本发明所列出的CDR氨基酸序列可作为CDR在人可变域或其实质性部分中携带。例如，基本上如本发明所列出VHCDR3序列可作为VH CDR3在人重链可变域或其实质性部分中携带。

本发明的另一方面提供抗体分子，其结合IL-17BR且包含抗体VH域，该VH域包含基本上如SEQ ID NO：7所示的VH CDR3。

抗体分子可包含VH域，其包含分别基本上如SEQ ID NOS：5、6和7所示的VH CDR1、CDR2和CDR3。

VH域可与VL域配对，例如，具有基本上分别如SEQ ID NOS：8、9和10所示的CDR1、CDR2和CDR3的VL域。

在一些实施方案中，抗体分子可包含，具有基本上分别如SEQID NOS：5、6和7所示的VH CDR1、CDR2和CDR3的VH域；和具有基本上分别如SEQ ID NOS：8、9和10所示CDR1，CDR2和CDR3的VL域。

VH和VL域可具有人或非人构架区，例如基本上如分别在SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的构架区中所示的构架区。

在一些实施方案中，抗体分子可包含基本上分别如SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：4所示的VH和VL域序列。

“基本上如...所示”表示本发明的相关的CDR或VH或VL域等同于或高度相似于本发明所示序列的特异性的域。“高度相似”涵盖在CDR和/或VH或VL域中，可替换1-5，优选地1-4，如1-3，或1，或2，或3，或4个氨基酸。

可通过对D9.2VH和/或VL基因中一个或两个进行随机诱变以在整个可变域内发生突变来产生抗体分子的序列变体。这一技术描述于Gram等(1992，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，89：3576-3580)，其使用了易错PCR。

另一可用方法是直接诱变VH或VL基因的CDR区。这样的技术描述于Barbas等，(1994，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，91：3809-3813)和Schier等(1996，J.Mol.Biol.263：551-567)。

上述所有技术为本领域已知且其本身不形成本发明的部分。本领域技术人员能够运用这样的技术使用本领域的常规方法来提供如本发明所述的抗体分子。

因此，本发明的另一方面提供获得抗IL-17BR的抗体分子的方法，其包括：

提供编码抗体分子的起始核酸，该抗体分子具有一个或多个(例如一个、两个、三个、四个、五个或全部六个)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的CDR序列；

修饰所述核酸以改变该CDR序列或这些序列；

表达所述被修饰的抗体分子；以及

检测所述被修饰的抗体分子用于结合IL-17BR。

优选地所述修饰将在多个起始核酸分子上进行，以提供具有各种结合亲和性的被修饰序列组库(repertoire)。

该起始核酸优选包含全部三个SEQ ID NO：2的重链CDR，以SEQ ID NO：2本身的形式或以另一构架序列来进行。

可针对单个CDR进行修饰，例如CDR3，或者同时针对两个或三个CDR区进行修饰。

在本发明中应用的可变域可从任何种系(germ-line)或重排的人可变域中获得，或可为基于已知人可变域的通用序列(consensussequence)的合成可变域。使用重组DNA技术，如本发明所描述的CDR序列(例如CDR3)可被引入至缺少CDR(尤其是CDR3)的可变域的组库。

例如，Marks等(生物/技术(Bio/Technology)，1992，10：779-783)描述了产生抗体可变域的组库的方法，其中针对在可变域的5’端或邻近5’端处的通用引物被用于连接通用引物至人VH基因的第三构架区，以提供缺少CDR3的VH可变域的组库。Marks等还描述了该组库如何能够与特异性抗体的CDR3结合。使用类似的技术，本发明的CDR3-衍生的序列可用缺少CDR3的VH或VL域的组库进行改组(shuffled)，且改组的全VH或VL域与同源VL或VH域结合以提供如本发明公开的抗体分子。然后，该组库可在适合的宿主系统如WO92/01047的噬菌体表现系统中表现，以便能够选择适合的抗体分子。组库可由任何从10⁴个体成员高至，例如从10⁶至10⁸或10¹⁰个成员组成。

相似的改组或组合技术也在Stemmer的以下文献中公开：自然(Nature)，1994，370：389-391，其中描述的技术与β-内酰胺酶基因相关，但观察到该方法可用于产生抗体。

因此本发明的另一方面提供制备对IL-17BR特异性的抗体分子的方法，该方法包括：

(a)提供编码VH域的核苷酸的起始组库，该VH域包括待替换的CDR3或则缺少编码CDR3的区；

(b)将所述组库与编码基本上如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的供体核酸结合，从而所述供体核酸被插入到组库的CDR3区中，以便提供编码VH域的核酸的产物组库；

(c)表达所述产物组库的核酸；

(d)挑选(selecting)对IL-17BR特异性的抗体分子；以及

(e)回收(recovering)所述抗体分子或编码其的核酸。

产物组库可从相同的载体或不同的载体用VL域共表达。VL域可以是本发明所描述的VL域，例如SEQ ID NO：4的VL域，或可为如下文所述与链改组有关的一个或多个不同的VL域。

可应用相似的方法，其中基本上如SEQ ID NO：10所示的VLCDR3与编码VL域的核苷酸组库结合，该VL域包括待替换的CDR3或缺少编码CDR3的区。对于上述方法，VL产物组库可从相同载体或不同的载体用VH域共表达。VH域可为本发明所描述的VH域，例如SEQ ID NO：2的VH域，或可为如下所描述的与链改组相关的一个或多个不同VH域。

相似地，一个或多个或全部三个CDR可被移植到VH或VL域的组库，然后对其进行筛选以获得抗体分子或对IL-17BR特异的抗体分子。

本发明的另一方面涉及以该方式获得的抗体分子。

本发明的另一方面提供用于获得针对IL-17BR的抗体抗原-结合域的方法，该方法包含将本发明所描述的抗体分子的VL域(包括如上所述的变体)与一个或多个VL域结合，并检测该VH/VL组合或针对IL-17BR的抗体-抗原结合域的组合。

所述VL域可具有基本上如本发明所示的氨基酸序列。例如，该VL域可基本上如SEQ ID NO：4所示。

可应用相似的方法，其中本发明所公开的VL域的一个或多个序列变体与一个或多个VH域相结合。

其可通过噬菌体展示筛选方法使用在WO92/01047中公开的所谓的分级双组合方法能够获得，在WO92/01047中包含H或L链克隆的个体克隆用于感染编码其它链(L或H)的克隆的整个库，并且根据诸如在上述参考文献中所描述的噬菌体展示技术选择所得的双链抗体分子。

本发明的另一方面提供用于选择针对IL-17BR的抗体分子的方法，该方法包括：

(a)提供抗体VH域，其包含具有SEQ ID NO.7的氨基酸序列的VH CDR3；

(b)将所述VH域与多个抗体VL域结合以提供抗体分子；

(c)筛选所述抗体分子用于结合IL-17BR；以及

(d)挑选结合IL-17BR的抗体分子。

在该方法中，所述VH和VL域可以通过重组DNA表达的蛋白质的形式提供，尤其通过噬菌体或噬菌粒DNA的形式。

大量的VL域可为从10⁴个单个域高至，例如从10⁶至10⁸或10¹⁰个域。

IL-17BR，在本领域中也被称为IL-25R、IL-17RB或IL-17RH1，其可通过商业途径(例如R&D Systems，MN，USA)作为Fc-融合蛋白获得，或可参考本领域中可获得的IL-17BR的序列来克隆或合成。

鼠科IL-17BR(GeneID：核酸：NM_019583.3 GI：142368701；NP_062529.2 GI：83025064)由Tian等所描述，2000(下文的文献11)。人IL-17BR(GeneID：55540，核酸：NM_018725.3GI：112382255；Protein NP_061195.2GI：27477074)由Shi，Y.，等描述，2000(下文的文献10)。

对于产生抗体或在免疫分析中使用，可使用重组IL-17BR的片段，尤其是含有细胞外域的那些片段。

在进一步的方面，本发明提供分离的核酸，其包含上文所描述的编码抗体分子、VH域或VL域的核苷酸序列，例如分别如SEQID NOS：2和4所示的VH或VL域，以及制备本发明所描述的抗体分子、VH域或VL域的方法，其包含在一些条件下表达所述核酸，产生所述抗体分子、VH域或VL域，并回收。

本发明的另一方面提供核酸，其通常是分离的，其编码本发明所描述的VH CDR或VL CDR序列，尤其是选自SEQ ID NOs：5、6和7的VH CDR、选自SEQ ID NOs：8、9和10的VL CDR，最优选为D9.2VH CDR3(SEQ ID NO.7)。

本发明的核酸可包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的序列或其相关部分(例如CDR-编码区)，或通过定点诱变修饰的这些序列的变体以编码本发明的其它VH和VL域。然而，密码子使用是可变的，例如在所需的宿主细胞中使序列表达最优化。

本发明的另一方面提供编码本发明抗体分子的分离的核酸。核酸包括DNA和RNA。在本发明优选的一个方面，本发明提供如上述所定义的编码本发明CDR或VH或VL域的核酸。

根据本发明的核酸可包含DNA或RNA，且可为全部或部分合成的。参照如本发明所列出的核苷酸序列，其包含具有特定序列的DNA分子，并包含具有特定序列的RNA分子，其中除非上下文另有要求U被T替换。

本发明的一些方面也提供载体，例如以质粒、病毒的的形式，例如’噬菌体或噬菌粒、粘粒、转录或表达盒(cassette)，其包含至少一个上述的核酸。

可选择或构建适合的载体，其包含合适的调节序列，包括适合的启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其它合适的序列。对于更详细的信息，参见，例如分子克隆：实验室手册：第2版(Molecular Cloning：a LaboratoryManual：2nd edition)，Sambrook等，1989，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)。

载体也包括可在体内感染人细胞的病毒载体，例如腺病毒的、逆转录病毒的或腺相关病毒的载体。这样的载体可用于在人或动物对象的细胞中表达本发明的抗体分子，以使所述抗体分子产生并向所述对象转移。

编码本发明的抗体分子的核酸序列在一方面可操作地连接于启动子，以影响抗体分子在宿主细胞中的表达。该序列可在其5’端包括前导序列，以有助于在和/或从宿主细胞中表达和/或分泌抗体分子。很多适合的前导序列在本领域中是已知的，并且可由本领域技术人员依照宿主细胞来进行选择。

很多用于操作核酸的已知技术和方案，例如制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA引入细胞和基因表达以及蛋白质分析，在如下文献中详细描述：现代分子生物学(Current Protocols in MolecularBiology)，第2版，Ausubel等编，John Wiley&Sons，1992。Sambrook等和Ausubel等的公开作为参考合并入本发明。

另一方面提供用本发明的核酸转化的宿主细胞(例如载体形式的核酸序列)。

核酸可被整合至宿主细胞的基因组(例如染色体)。依照标准技术，可通过包含促进与基因组重组的序列来促进整合。

另一方面提供产生本发明公开的抗体分子的方法，该方法包括从编码的核酸产生表达。这样的方法可包含在产生所述抗体分子的条件下培养宿主细胞。

在通过表达产生之后，VH或VL域或抗体分子可使用任何适合的技术被分离和/或纯化，然后被适当使用。制备方法可包括产物分离和/或纯化的步骤。

经产物纯化之后，抗体分子可通过物理或化学方法进行修饰，例如引入保护基团，其可改变(诸如提高)蛋白的稳定性或生物半衰期。例如，蛋白的乙二醇化以获得本领域所已知的作用，且本发明的抗体分子可为乙二醇化的形式。

制备方法可包含将产物配制为组合物，其包含至少一种另外的成分，如药用赋形剂。

本发明还提供重组宿主细胞，其包含一种或上述的核酸或载体。

用于在多种不同的宿主细胞中克隆及表达抗体分子的系统是已知的。适合的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和环状病毒系统。本领域中用于异种多肽表达的可用哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NS0小鼠黑素瘤细胞、YB2/0大鼠骨髓瘤细胞以及多种其它细胞。常见的优选细菌宿主细胞为大肠杆菌。

在原核细胞诸如大肠杆菌中表达抗体和抗体片段，本领域中已经很好地建立。综合来看，参见例如Plückthun，A.生物/技术(Bio/Technology)9：545-551(1991)。在培养的真核细胞中表达，作为抗体分子产生的选项对于本领域技术人员也是可用的，参见近来的综述，例如Ref，M.E.(1993)生物技术当前述评(Curr.Opinion Biotech.)4：573-576；Trill J.J.等(1995)生物技术当前述评(Curr.Opinion Biotech.)6：553-560。

本发明所列出的数据首次表现了抗IL-17BR的抗体对于预防或减轻体内气道高应答性(哮喘的一种主要症状)是有效的。

本发明的另一方面提供预防或减轻有此需要的对象(例如人)中的气道高应答性，其包含向对象施用结合IL-17BR的抗体分子，例如如上所述的抗体分子。本发明的另一方面提供预防、减轻或治疗有此需要的对象的哮喘或其它IL-25介导的症状的方法，其包含向对象施用结合IL-17BR的抗体分子。其它IL-25介导的症状包括过敏和结肠炎，其包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。哮喘包括变应性哮喘。

因此本发明的另一方面提供一种预防或减轻有此需要的对象(例如人)的结肠炎症的方法，其包含向对象施用结合IL-17BR的抗体分子，例如如上所述的抗体分子。本发明的另一方面提供预防、减轻或治疗IBD的方法，其包含向对象施用结合IL-17BR的抗体分子。IL-25介导的症状包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。其它IL-25介导的症状包括结肠炎(结肠的炎症)，包括慢性结肠炎。

上述方法可用如上所述的抗体分子(包括其组合物)来进行，其用于结合IL-17BR和对抗IL-17BR/IL-25结合的作用，在各种IL-17BR发挥作用的疾病和症状中具有治疗潜能。该方法也可以与其它结合IL-17BR的抗体分子(包括其组合物)一起使用，并对抗IL-17BR/IL-25结合的作用，其可按照如下实施例中的描述来获得。

如上所述的抗体分子(包括其组合物)可用于对人或动物对象进行治疗(包括预防性治疗)或诊断的方法。这样的治疗或诊断方法(其可包括预防性治疗)可包含向所述对象施用有效量的本发明的抗体分子。示例性的疾病和症状在下文中讨论。

还提供本发明所描述的抗体分子(包括其组合物)在制备用于人或动物对象的药物中的应用。

其中抗-IL-17BR抗体分子可用于提供益处的临床症状包括任何IL-17BR/IL-25结合具有临床结果的症状，因此一般地，本发明所描述的抗体分子可用于治疗任何IL-25介导的症状，例如与有害的Th2应答或Ⅱ型应答有关的。在一些实施方案中，本发明的抗体分子可用于治疗过敏和哮喘，尤其是哮喘。在一些实施方案中，本发明的抗体分子可用于治疗IBD，尤其是治疗UC和/或CD。

抗IL-17BR治疗可通过注射(例如静脉注射)或通过局部给药的方式。抗-IL-17BR可通过基因-介导的技术来给药。可选的剂型方案可提供适合的用于口服或栓剂途径的剂型。给药途径可通过该治疗的物理化学特征由对疾病的特别研究来确定，以效能最优化或使副作用最小化。

所提供的组合物可施用于个体。优选地以“治疗有效的量”给药，其为足以对患者表现出益处的量。这样的益处可至少改善至少一种症状。给药的实际量、频率和疗程将取决于所治疗的疾病的特征和严重性。治疗的处方，例如剂量等，由全科医生和其它医师来决定。抗体的适当剂量在本领域中是公知的；参见Ledermann J.A.等(1991)Int.J.癌症(Cancer)47：659-664；Bagshawe K.D.等(1991)抗体、免疫缀合物和放射性药物(Antibody，Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals)4：915-922。

精确的剂量将取决于一些因素，包括该抗体是用于诊断还是用于治疗、待治疗区域的大小和位置、该抗体的确切特性(例如全抗体、片段或双功能抗体)、任何与抗体结合的可检测的标记物或其它分子。典型的抗体剂量范围为0.5mg-1.0g，并且其可适当地作为丸剂或静脉灌注数小时来给药以达到所需的剂量。其它给药方法包括静脉灌输数小时以获得相似的总累计剂量。这是成年人的单一治疗剂量，其可成比例地调整为儿童和婴儿的剂量，对于其它抗体形式也可以根据分子量按比例调整。治疗可根据医师的指导每日、每周两次、每周一次或每月一次间隔地重复。

给药的方式还包括留置装置(indwelling device)的预先涂敷或以其它方式引入到留置装置中，抗体对这一装置的最佳量通过适当的实验来确定。

在一些实施方案中，抗体分子可为单体片段，诸如F(ab)或scFv。这种抗体片段的优点为，相对短的半衰期和血小板活化的风险更小，其可以由受体群集引起。引起血小板活化的群集例如可以是IL-17BR分子或者具有FcγRII分子的IL-17BR。

如果使用的是全抗体，其形式优选地为不能够活化和/或破坏血小板。优选的选择是从IgG1主链衍生的(新型的Fc基因构建体WO99/58572，Clark，Armour，Williamson)IgG4同种型或者“设计者(designer)”同种型。可以使用小抗体片段，诸如F(ab’)₂。另外，可使用具有双重表位特异性(例如对于由scFv D9.2识别的表位)的全抗体或片段(例如F(ab’)₂或二体)。尽管这样的实施方案可促进受体群集，与个体受体结合速率高能够不产生该问题。

本发明所描述的抗体分子通常以药物组合物的形式来施用，其可包含除该抗体分子以外的至少一种成分。

因此根据本发明的药物组合物以及根据本发明的使用，除了活性成分以外，还可包含药用赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂或本领域技术人员所熟知的其它材料。这样的材料应该是非毒性的且不干扰该活性成分的功效。载体或其它材料的精确特性取决于给药的方式，该方式可以为口服或注射，例如静脉注射。

抗体分子的治疗制剂可以通过将具有所需纯度的抗体分子与可选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(参见例如“雷明顿：药学的科学与实践(Remington：Science and Practice ofPharmacy)”，第20版，2000，pub.Lippincott，Williams&Wilkins.)进行混合来制备，其形式可为冻干粉末或水溶液。可接受的载体、赋形剂或稳定剂对于接受者在所应用的剂量和浓度下是无毒的，且其包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸，抗氧化剂如抗坏血酸，低分子量(小于约10个残基)多肽，蛋白质如血清蛋白、明胶或免疫球蛋白，亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸或赖氨酸，单糖、二糖和其它包括葡萄糖、甘露糖或糊精的碳水化合物，螯合剂如EDTA，糖醇如甘露糖或山梨醇，形成盐的抗衡离子如钠，和/或非离子型表面活性剂如吐温、嵌段共聚物或聚乙二醇(PEG)。

对于用于体内给药的抗体分子，其必须是无菌的。在冻干或重构之前或之后，其通过无菌滤膜过滤是易于完成。抗体分子通常以无菌形式存储或存储在溶液中。

口服施用的药物组合物可为片剂、胶囊、粉末或液体形式。片剂可以包含固体载体如明胶或佐剂。液态药用组合物通常包含液体载体如水、石油、动物或植物油。可以包含生理盐水、右旋糖或其它糖溶液或二醇类，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。

对于静脉注射或患处的注射，活性成分的形式为非肠胃的可接受水溶液，其无热源且具有适合的pH值、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员可使用例如等渗介质如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液。如果需要的话，可包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。

本发明的抗体分子可单独或与其它治疗联合施用，同时施用还是相继施用取决于治疗的状况。其它治疗包括施用适合剂量的缓痛药剂，如非甾体抗炎药(例如阿司匹林、扑热息痛、布洛芬或酮洛芬)，或麻醉剂如吗啡，施用止吐药，或施用至少一种其它抗哮喘的活性化合物，通常可产生气道松弛或增进粘液清除的支气管扩张剂，例如β拮抗剂(例如沙丁胺醇、沙美特罗)、色甘酸二钠、甾体类或PDE_IV抑制剂。

本发明的另一方面提供的方法包括引起或允许本发明提供的抗体分子与IL-17BR的结合。如本发明所提到的，这样的结合可在体内发生，例如在施用抗体分子之后、或在施用编码抗体分子的核酸后，或者其在体外发生，例如在ELISA、免疫印迹、免疫细胞化学、免疫沉淀或亲和色谱中。

可测定抗体分子与IL-17BR结合的量。定量与检测样品中抗原的量相关，其与诊断目的有关。

可通过任何适合的方法来测定抗体分子对于样品的反应性。放射免疫测定法(RIA)为一种选择。放射性标记的抗原与未标记的抗原(检测样品)混合，并允许结合至抗体分子。结合的抗原与未结合的抗原物理分离，并且测定与抗体结合的放射性抗原的量。在检测样品中存在的抗原越多，放射性抗原与抗体分子结合得越少。使用与报告分子连接的抗原或类似物，竞争性结合检测也可以与非放射性抗原一起使用。报告分子可以是具有光谱分离的吸收或发射特性的荧光物、荧光剂或激光染料。适合的荧光物包括荧光素、若丹明、藻红蛋白和德克萨斯红。适合的发色染料包括二氨基联苯胺。

其他的报告分子包括大分子胶粒或颗粒材料如着色的、磁性或顺磁性乳胶微球，能直接或间接导致可视觉观察、电子检测或以其他方式记录的可检测信号的生物或化学活性剂。这些分子可为催化例如产生或改变颜色或导致电特性变化的反应的酶。它们在分子上是活跃的，以便在能态间的电子跃迁产生特征光谱吸收或发射。它们可包括与生物传感器配合使用的化学实体。可应用生物素/亲和素或生物素/链霉亲和素和碱性磷酸酶检测系统。

由单个抗体-报告分子缀合物产生的信号可以用来推导出样品中的相关抗体结合(正常和测试)的绝对或相对量化数据。

本发明还提供了上述抗体分子用于在竞争法检测中测量抗原水平的用途，也就是说通过将本发明的抗体分子应用在竞争检测中来测量样品中抗原水平的方法。这就可能不必进行未结合抗原与结合抗原的物理分离。将报告分子与抗体分子连接以便发生物理或光学变化是一种可能性。报告分子分子可直接或间接产生可检测的、且优选可测量的信号。报告分子之间的连接可为直接或间接的共价连接，如通过肽键或非共价地连接。通过肽键的连接可为编码抗体和报告分子的基因融合的重组体表达所导致。

本发明还提供了直接测量抗原水平，其例如在生物传感器系统中采用了本发明所描述的抗体分子。

确定结合的模式并非本发明的特征，本领域的技术人员可根据其偏好和一般知识选择一个合适的模式。

本发明进一步扩展到的抗体分子，其与任何抗体分子竞争结合IL-17BR，所述任何抗体分子结合抗原且包含包括具有基本上如本发明所列出的氨基酸的CDR的VH和/或VL域，本发明或包含具有基本上如本发明所列出氨基酸序列的VH和/或VL域。抗体分子之间的竞争易于在体外进行测定，例如通过将特异性报告分子标记于一个可在其他未标记抗体分子存在下被检测到的抗体分子，以便能够识别结合相同的表位或覆盖表位的抗体分子。例如采用ELISA或流式细胞仪可测定竞争。

竞争反应可用于选择一个或多个抗体分子如D9.2的衍生物，D9.2可具有一个或多个另外的或改进的性能。除IL-17BR不从其小配体而是从抗体分子洗脱以外，这与根据本发明的D9.2的选择方法类似。这可能是重要的，因为这会产生更大比例的直接与母源竞争的子代抗体分子。事实上，这样被选中的子代抗体分子可能比母源具有更大的对于抗体的亲和力(允许提高亲和力，这可能会导致每个噬菌体表现出一个以上的抗体分子)。目前选择提高亲和力的“子代”噬菌体抗体分子的方法包括：

使用低于原始母源抗体解离常数的(标记的)目标抗原浓度；

霍金斯等(1992年)描述了使用过量未标记的目标抗原作为竞争者。然而，他们并未确切指明“改良的”抗体必须取代/占据如母源(parent)的相同的表位。引入洗脱步骤会产生取代母源的更高比例的子代抗体分子。以这种方式选择的子代抗体分子可以结合非常相似的表位至母源抗体分子，但具有更大的亲和力。

在竞争测试中，可以应用IL-17BR的肽片段，尤其是包括目标表位的肽。可以使用在任一端具有表位序列和一个或多个氨基酸的肽。这样的肽可以说“基本上由”特定的顺序组成。根据本发明的抗体分子可能是这样的，以便其对于IL-17BR的结合由具有或包括给定序列的肽来抑制。对此检测，可以使用具有任一序列和一个或多个氨基酸的肽。

通过肽的淘选，例如从噬菌体展示库中可以分离结合特定肽的抗体分子。

结合本发明公开，本发明的各个进一步的方面和实施方案对于本领域技术人员将是明显的。本说明书所提及的所有文件通过引用整体并入本发明。

本发明所使用的“和/或”被认为是特定公开两个特定特征或成分的任何一个，其包括或不包括另一个。例如“A和/或B”被认为是特定公开(i)A、(ii)B，以及(iii)A和B，就如同本发明单独列出每一个。

除非上下文另有规定，所列出的特性的描述和定义不局限于本发明的任何特定的方面或实施方案，并且同样适用于所描述的所有方面和实施方案。

现在通过实例的方式且参考上述描述的附图来说明本发明的某些方面和实施方案。

实施例

材料和方法

采用ELISA筛选上清液

将于0.1M NaHCO₃中的1μg/ml鼠或人IL-17Br-Fc融合蛋白以50μl/孔涂覆96-孔免疫板(Nunc)，4℃过夜或在室温下3小时。第二天，用PBS 0.05％吐温洗涤孔5次，然后在室温下用PBS 10％FCS封闭4小时。在这4小时期间，将来自杂交瘤细胞培养物的上清液用50μg/ml hIgG孵育。这可以封闭上清液中已经对融合蛋白Fc部分产生抗性的任何抗体。未接受这种处理的上清液也包括在ELISA中，以在各个样品中给出指示量的抗-Fc抗体。

在4小时封闭步骤后，用PBS 0.05％吐温洗涤免疫板5次，加入纯(neat)上清液，50μl/孔。将上清液留在板上在4℃过夜或在室温下3小时，然后用PBS 0.05％吐温洗涤孔5次。将于PBS 10％FCS中的50μl 0.5μg/ml抗-小鼠免疫球蛋白-HRP(DAKO)加入到各个孔，在室温下放置1小时，然后用PBS 0.05％吐温最后洗涤8次。用ELISA显色溶液检测结合抗体，在Tecan免疫板记录仪上记录A405。

为了将产生的抗融合蛋白Fc部分的抗体与直接抗IL-17BR的那些抗体区分，用hIgG涂覆对照板，按上述方案加入上清液。在hIgG涂覆的板上给出高A405的样品不做进一步研究。

流式细胞计数筛选转染的COS7细胞

将鼠和人IL-17BR基因的cDNAs分别克隆到pME18S表达载体，分别称作mIL17BR-pME18S和hIL17BR-pME18S。

将2×10⁶COS7细胞的DMEM 10％FCS接种到10cm平皿上，在37℃孵育过夜。第二天，将4μg mIL17BR-pME18S或hIL17BR-pME18S与于500μl不含血清的Optimem中的10μl脂质体进行混合，在室温下孵育30分钟，然后加入到接种的(plated)细胞中。然后在37℃孵育细胞6小时，加入新鲜培养基。收获细胞用于转染后48小时FACS分析。

在FACS分析中，用不同浓度的候选抗-IL17BR抗体在PBS 2％FCS中孵育转染的或未转染的细胞30分钟。然后洗涤细胞，用于PBS 2％FCS中的2μg/ml抗-小鼠IgG FITC(BD Pharmingen)进一步孵育30分钟。最后，细胞用PBS 2％FCS洗涤2次，在BectonDickinson FACScalibur仪器中分析IL-17Br表达。

D9.2交叉反应性

用IL-17R-家族成员涂覆ELISA板；IL-17RA、IL-17BR、IL-17RC，或IL-17RD，或IL-13Rα对照品(安迪公司(R&D system))以2μg/ml在4℃过夜，然后用PBS/0.05％吐温洗涤，用PBS/10％FCS在室温下封闭4小时。加入于PBS/10％FCS中的1μg/ml的生物素化的D9.2，在4℃孵育过夜。然后洗涤板，加入链霉亲和素-HRP，在室温下孵育1hr。接着最后洗涤一次板，加入ELISA显色溶液，在405nm下测定吸光度。

小鼠单克隆抗体-人IL-17BR结合测定

以0.5μg/ml将人IL-25(hIL17e)(R&D sys)涂覆到NuncMaxisorp微孔板，在室温下孵育1小时30分钟。洗涤板三次，然后用Tris/1％BSA封闭1小时。将hIL 17Br/Fc嵌合体(安迪公司)稀释至100ng/ml。用hIL17Br/Fc(100ng/ml)将各纯化的小鼠单克隆抗体稀释(×100)至在100ng/ml的hIL17Br/Fc溶液中终浓度为1μg/ml。在室温下孵育[抗体×hIL17Br/Fc]混合物1小时30分钟。将[抗体×hIL17Br/Fc]混合物加入到hIL17e-涂覆的板，孵育1小时30分钟，然后洗涤三次。将抗-hIgG(Fc)-HRP缀合物(Serotec)加入到板上，在室温下孵育45分钟，然后洗涤三次，用TMB显色。用1M HCl停止反应。在450nm下读取光密度，从全部读数中减去试剂空白读数。

IL-17BR/IL25抑制测定

从首次接受试验的(naive)BALB/c小鼠中摘除(removed)肠系膜淋巴结，通过70μm细胞-染色仪完成单-细胞悬液。用PBS2％FCS洗涤细胞，然后去除T-细胞和B-细胞。可以通过如下步骤完成：用5μg/ml生物素化的抗-CD19和抗-CD3抗体在冰上孵育细胞30分钟，然后用浓度为4磁珠/细胞的抗-生物素免疫磁珠(Invitrogen)在4℃孵育20分钟。然后洗涤混合物，通过磁铁从未标记的非-B非-T(NBNT)细胞部分(fraction)中分离标记的T-和B-细胞。采用FACS测定NBNT部分的纯度，染色B220、CD4和CD8。

然后以3×10⁵细胞/孔将NBNT细胞接种到圆底96-孔板，在单独的RPMI 10％中或在含10ng/ml IL-25的RPMI 10％FCS中孵育72小时。将候选的IL-17BR封闭抗体加入到孔中，从最高浓度2μg/ml进行系列稀释，孵育1.5小时，向这些孔加入10ng/ml IL-25。然后将板在37℃孵育72小时，收获上清液，通过Quantikine ELISA(安迪公司)测定IL-13蛋白含量。

对于CD4+(T和/或NKT)细胞，从首次接受试验的野生型BALB/c小鼠中摘取脾脏，制备单细胞悬液。进行红细胞裂解，然后用MACS缓冲液(Miltenyi Biotec)洗涤细胞。根据制造商说明使用CD4微珠(Miltenyi Biotec)通过阳性选择进行CD4+细胞分离。然后将CD4+细胞以1×10⁶细胞/ml在96-孔板中在单独的RPMI或者在含有或不含有1μg/ml D9.2的补充了10ng/ml IL-25的RPMI中培养。培养细胞72小时，然后取上清液通过Quantikine ELISA(安迪公司)分析IL-13的蛋白水平。

肾癌细胞系生物测定

人TK-10肾癌细胞从国家癌症研究所(NCI)获得。RENCA细胞从Centocor R&D的细胞生物学部获得。两种细胞系均保存在含有10％FCS的DMEM生长培养基中，在37℃、5％CO₂于湿度环境下。将细胞接种到96-孔平底组织培养物处理的板上，密度为2.5×10⁴细胞/孔，总体积为100μl完整生长培养基。然后过夜孵育，用1×PBS洗涤细胞，然后用100ng/ml的IL-25和10ng/ml TNF-α的OptiMEM减少血清的培养基，或仅用培养基作对照，孵育24hr。IL-25刺激20-24小时后收集细胞上清液，在-20℃保存备用，采用用于KC的小鼠Quantikine ELISA或用于IL-8的人QuanitkineELISA(安迪公司)进行可溶性KC/IL-8释放的分析。

检测D9.2或IgG1对照预防IL-25-介导的IL-8(KC)释放的能力。对于抑制试验，用不同浓度的D9.2或抗-c-myc小鼠IgG1(克隆9E10.2)对照抗体在室温下预培养恒定量IL-25(100ng/ml)30-60分钟，随后添加到各自的细胞中。将TNF-α(10ng/ml)加入到细胞中，随后立即加入IL-25蛋白/D9.2。在刺激后24hr如上所述测定IL-8(KC)释放。

小鼠

用于变应性哮喘实验模型的BALB/c小鼠从英国Harlan获得，用于IBD实验模型的BALB/c小鼠从查尔斯河(Charles River)获得。将小鼠保存在SABU/CBS/Ares-MRC或国家心肺研究所(National Heart and Lung Institute facilities)的特定无病原菌的环境下。本报告中概述的所有动物实验的开展均获得了英国内政部(UK Home Office)的批准。

致敏作用和过敏原暴露

对于变应性哮喘的实验模型，在第0天和第12天，通过腹膜内施用OVA(20μg/注射)络合矾或1∶1的PBS∶矾(对照)，对BALB/c小鼠野生型小鼠或IL-17BR敲除小鼠在BALB/c的背景下致敏。在第19、20、21天施用PBS或1％OVA气雾剂，每天20分钟。在第22天处死动物，收集组织。

对于IBD实验模型，在第0天，通过皮肤施用于100％乙醇中的4％(w/v)噁唑酮(OXA)溶液或仅乙醇(对照)，对BALB/c小鼠致敏。在第7天直肠内施用于50％乙醇中的3％(w/v)噁唑酮溶液或仅50％乙醇(对照)。在第9天处死动物，收集组织。

施用抗-IL-17BR抗体

在变应性哮喘实验模型中，对于接受抗体治疗的小鼠，在每次喷雾前2小时，腹膜内注射于PBS中的250μg D9.2或抗-c-myc小鼠IgG1对照抗体(克隆9E10.2)。每只小鼠接受3剂量的抗体。

在IBD实验模型中，对于接受抗体治疗的小鼠，在致敏(第1天)和激发(challenge)(第6天)24小时前，腹膜内注射于PBS中的500μg D9.2或抗-KLH小鼠IgG1对照抗体。因此，每只小鼠接受2剂量的抗体。

评价AHR

如图8(e)，通过腹膜内(i.p.)施用内毒素-低卵清蛋白对小鼠致敏，通过每天喷雾施用雾化的PBS(对照)或OVA进行激发，共6天。

最后3次喷雾，每次喷雾2小时前，对接受D9.2抗体治疗的小鼠施用腹膜内注射于PBS中的250μg D9.2或抗-c-myc小鼠IgG1对照抗体(克隆9E10.2)。最后一次气雾剂激发后24小时，使用全体固定式呼吸仪(restrained whole body plethysmograph)(EMMS，英国)评价AHR。将动物麻醉、气管造口并以175呼吸/min的速率通风(MiniVent 845通风器，EMMS，英国)，潮气量200μl/stroke。记录稳定的基线肺阻力3分钟后，采用超声雾化器通过气雾剂施用增加浓度的乙酰基-β-氯化甲胆碱(乙酰甲胆碱(methacholine))(Sigma-Aldrich)10秒，记录3分钟期间的肺阻力。采用eDaq软件分析气道阻力、依从性和标准肺参数。

纵膈淋巴节再激发

将来自PBS-或OVA-处理的小鼠的纵膈淋巴结推进70μm细胞-染色器以完成单细胞悬液。计数细胞并以3×10⁵细胞/孔接种于圆底96-孔板。在单独的RPMI 10％FCS中或在100μg/ml OVA的存在下培养细胞72小时。然后收集上清液用Quantikine ELISA试剂盒(安迪公司)分析IL-13浓度。

评价IBD

如图9，在第0天通过皮肤施用噁唑酮的乙醇溶液对小鼠致敏，在第7天施用噁唑酮的乙醇溶液进行激发。对照组只接受乙醇处理。在第1天和第6天对接受抗体治疗的小鼠施用腹膜内注射D9.2或抗-KLH小鼠IgG1抗体(对照)。在第9天处死动物，收集组织。(在图9(a)和9(b)中，第7、8、9天分别被编号为第0、1、2天。)

在第7、8、9天，称量小鼠体重，评价它们的一般状况和行为，并对各个动物赋予从0至3的临床分数，基于文献Wang等2004中描述的方法，将第7天的临床分数设置为0(图9b)。在第9天处死动物，获得各个小鼠的结肠，检查和测量(图9(c))。

实施例1：抗IL-17BR抗体的产生

我们最初试图用来自人IL-17BR氨基酸序列的合成肽通过免疫小鼠产生抗体。尽管产生了单克隆抗-肽抗体，我们未能生产出能识别成熟人IL-17BR蛋白的抗体。然后我们试图通过免疫野生型小鼠产生抗人IL-17BR蛋白的融合蛋白的抗体。尽管进行了多次免疫和杂交瘤融合，我们未能生产出高亲和性的抗IL-17BR抗体。

小鼠也表达了IL-17BR形式，我们作出这样的假设：是否我们不能产生有用的抗体受到在小鼠和人IL-17BR分子之间缺少新的表位的限制。我们生产了不能表达IL-17BR的IL-17BR-缺陷小鼠系。设计出IL-17BR-缺陷小鼠以排除所有IL-17BR的形式，包括其它的剪接变体。人和小鼠IL-17BR之间结合接口的高保守度可以降低在野生型小鼠中产生封闭抗体的可能性，因此，除去内源性IL-17BR能够促进抗IL-17BR配体结合位点抗体的发展。该方案也增加了产生IL-17BR抗体的可能性，其可以封闭小鼠和人IL-25的结合。由于交叉反应抗体能检测小鼠疾病模型的有效性，因此很有用。

对IL-17BR-缺陷动物产生和特性化后，用IL-17BR-Fc融合蛋白进行免疫。该方案确实证明了比使用野生型小鼠更成功，但仍需要筛查大量的杂交瘤细胞以鉴定候选的抗体。

产生于il17br^-/-小鼠的免疫抗小鼠IL-17BR-Fc融合蛋白的一大组抗体，通过ELISA进行筛查用于结合人和小鼠IL-17BR。识别的抗-IL-17BR抗体之一(D9.2)通过ELISA与鼠和人IL-17BR结合得很好(图1)，与用小鼠IL-17BR cDNA或人IL-17BR cDNA转染的在COS细胞上表达的天然小鼠和人IL-17BR蛋白结合得也很好(图2)。

实施例2：D9.2的体外检测

通过测定D9.2与其它IL-17受体家族成员的相互作用来检测D9.2的特异性。D9.2不与IL-17A受体(IL-17RA)、IL-17C受体(IL-17RC)或IL-17D受体(IL-17RD)交叉反应(图3)。

该筛查鉴定了几种与IL-17RB结合的抗体，然而仅D9.2能抑制人IL-25与人IL-17BR之间的相互作用(图4)。

测定了D9.2抑制IL-25生物活性的能力。IL-25诱导2-型细胞因子如IL-13，最初从固有的非-B/非-T(NBNT)细胞(Fallon等，2006；Fort等，2001)和从T细胞(Angkasekwinai等，2007)的释放。另外，人TK-10(肾癌细胞系)和小鼠肾癌(RENCA)细胞系都分泌趋化因子IL-8(已知为小鼠中的KC)以应答用TNF-α和IL-25产生的刺激(Sayers等，1990)。

在体外生物测定中，通过初级小鼠NBNT细胞(图5a)和CD4+T/NKT细胞(图5b)，D9.2抑制了由IL-17BR/IL-25结合，即IL-13的IL-25-依赖性产物，触发的生物活性。

另外，D9.2在体外抑制了来自IL-25-刺激的小鼠RENCA细胞的KC产物(图6)。

明显地D9.2也能抑制人IL-25的生物活性。在剂量-依赖性模式中，D9.2抑制了人TK-10细胞的IL-25-依赖性IL-8分泌物(图7)。

进一步在体内系统中研究了这些特性的结合，以证明治疗哮喘的有用性。其它实验证明了治疗IBD的功效。

实施例3：变应性哮喘的实验模型

首先用抗原OVA致敏BALB/c小鼠，然后用雾化的OVA激发。致敏的和激发的BALB/c小鼠发展成独特的哮喘表型。与被PBS激发的对照BALB/c小鼠相比，其以增加的AHR为特征，然后暴露于激发剂乙酰甲胆碱中，嗜酸性粒细胞浸润气道，杯状细胞增生，血清IgE分泌。

使用这种模型时，在激发态，用同种型对照抗-c-myc IgG1(克隆9E10.2)或抗-IL-17BR克隆D9.2处理BALB/c小鼠。明显地，施用D9.2降低了抗原激发后产生的IL-13的水平，以及抗原再激发后产生的IL-5至与不存在抗原激发或在IL-17BR-缺陷小鼠中发现的相似水平(图8a和b)。在抗原激发的小鼠肺中，IL-13-产生的细胞的数量也降低至这种水平(图8c)。相似地，还发现γ/δT细胞的疾病相关的扩张在用D9.2治疗后也被封闭(图8d)。Jin等(2007，J Immunol.)已经显示不存在γ/δT细胞将造成无法发展AHR，这表明抗-IL-17BR抗体能抑制哮喘发作时已知必要的两种途径-IL-13产生和γ/δT细胞应答性。另外，在小鼠的哮喘模型中，用D9.2治疗降低了人哮喘的一个关键特征，气道高反应性。

实施例4：炎性肠道疾病(IBD)的实验模型

首先用半抗原噁唑酮(OXA)致敏BALB/c小鼠，然后直肠内注射相同的化学药品激发。致敏的和激发的小鼠发展成独特的IBD表型，以体重减轻、结肠缩短和大肠发炎为特征，伴随便血(与仅用乙醇对照相比)。

使用这种模型，先处理BALB/c小鼠，随后用OXA以及同种型对照抗-KLH IgG1或抗-IL17BR(克隆D9.2)致敏和激发。施用D9.2降低了动物的疾病指标，导致较低的死亡率(图9(a))和改善的临床分数，即减少了表现为体重减轻和行为以及动物外观的IBD临床体征(图9(b))。另外，与接受抗-KLH对照抗体的小鼠相比，D9.2能保护结肠避免其因炎症和出血导致的缩短(图9(c))，用D9.2治疗的小鼠的结肠显示较少的炎症和出血。

实施例5：D9.2的克隆和测序

从D9.2细胞克隆分离RNA，通过反向转录反应制备cDNA，以从D9.2克隆免疫球蛋白序列。

使用保守5’VH区引物MHV2(SEQ ID NO：11)结合IgG1恒定区引物MHCG1(SEQ ID NO：12)，通过PCR扩增免疫球蛋白重链(IgH)cDNA。

相似地，使用保守5’IgK区引物MKV3(SEQ ID NO：13)结合kappa恒定区引物MKC(SEQ ID NO：14)，扩增免疫球蛋白轻链(IgK)。

PCR反应全程使用热稳定性聚合酶Phusion(NEB F-531L)。

使用TOPO-blunt克隆试剂盒(Cat 45-0245)将VH2+MHCG1的D9.2扩增产物直接连接到pCRIIBlunt-TOPO载体，作为轻链扩增反应的扩增产物。通过挑取白色菌落于琼脂网格上并置于PCR筛选混合物中，将用连接的pCRII-blunt载体构建体转化的大肠杆菌(E.coli)TOP10细菌克隆到LB-氨苄西林-XGal琼脂板上。将克隆的质粒插入片段用PCR扩增。扩增产物经凝胶电泳，鉴定预测的产物。每个克隆的过夜培养物(5ml)，其产生恰当大小(correct-sized)的PCR扩增产物，用质粒小提试剂盒产品(QIAprepSpin Miniprep Kit Protocol)(分类号27106)进行处理，产生DNA质粒小量抽提物(minipreps)。根据说明书用M13正向和反向引物对每个选择的质粒进行测序。

重复RT-PCR全循环、克隆和DNA序列分析，每个免疫球蛋白链得到两个完整的独立序列。

VH和Vkappa基因的完整演绎核苷酸序列分别如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：3所示。这些序列包括在各个可变基因片段起始部分的前导序列，该可变基因片段编码用于将新的合成抗体链转运到内质网的信号序列；它们不出现在最终的重链和轻链中。

免疫学和分子生物学试剂

缩略语

序列

SEQ ID NO：1编码D9.2VH的核苷酸序列

cttcttcttagcaacacctacatgtgtccactcccaggtccaattgcagcagcctggggctg

agctggtgaggcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaagacttctggctacacgttcatc

agttattggatgaactgggttaagcaggggcctgagcaaggccttgagtggattggaagaat

tgatccttacgatagtgaaattcagtacaatcaaaagttcaaggacaaggccatattgactg

tagacaaatcctccagcgcagcctacatgcaactcatcagcctgacatctgaggactctgcg

gtctattactgtgcaagatcggggggtttcgactggtttgcgtactggggccaagggactct

ggtcactgtctctgcagccaaaacgacacccccatcagtctatccactgaagggcgaattcc

agcacactggcggccgttac

SEQ ID NO：2 D9.2VH氨基酸序列

FFLATPTCVHSQVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKTSGYTFISYWMNWVKQGGPEQGLEWIGR

IDPYDSEIQYNQKFKDKAILTVDKSSSAAYMQLISLTSEDSAVYYCARSGGFDWFAYWGQGT

LVTVS

SEQ ID NO：3编码D9.2VL的核苷酸序列

atgagtgtgctcactcaggtcctggcgttgctgctgctgtggcttacagatgccagatgtga

catccagatgactcagtctccagcctccctatctgtatctgtgggagaaactgtcaccatca

catgtcgagcaagtgagaatattaacagtaatttagcatggtatcagcagaaaaagggaaaa

tctcctcagctcctggtctatgatgtaacaaacttagcagatggtgtgccatcaaggttcag

tggcagtggatcaggcacacaatattccctcaagatcaacagcctgcagtctgaagattttg

ggagttattactgtcaacatttttggcgtcctccgtacacgttcggaggggggaccaatctg

gaaataaaa

SEQ ID NO：4 D9.2VL氨基酸序列

MSVLTQVLALLLLWLTDARCDIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENINSNLAWYQQKKGK

SPQLLVYDVTNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGSYYCQHFWRPPYTFGGGTNL

EIK

SEQ ID NO：5D9.2VH CDR1氨基酸序列

SYWMN

SEQ ID NO：6 D9.2VH CDR2氨基酸序列

RIDPYDSEIQYNQKFKD

SEQ ID NO：7 D9.2VH CDR3氨基酸序列

SGGFDWFAY

SEQ ID NO：8 D9.2VL CDR1氨基酸序列

RASENINSNLA

SEQ ID NO：9 D9.2VL CDR2氨基酸序列

DVTNLAD

SEQ ID NO：10 D9.2VL CDR3氨基酸序列

QHFWRPPYT

SEQ ID NO：11 MHV2引物序列

atgggatggagctrtatcatsytctt(r＝a/g，s＝c/g，y＝t/c)

SEQ ID NO：12 MHCG1引物序列

cagtggatagacagatggggg

SEQ ID NO：13 MKV3引物序列

atgagtgtgctcactcaggtcctggsgttg

SEQ ID NO：14 MKC引物序列

actggatggtgggaagatgg

参考文献

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Claims

1.抗体分子，其结合IL-17BR且包含：

VH域，所述VH域包含具有如SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的CDR1、如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的CDR2以及如SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的CDR3；

VL域，所述VL域包含具有如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的CDR1、如SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的CDR2以及如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的CDR3。

2.根据权利要求1所述的抗体分子，其中所述VH域包含人构架区。

3.根据权利要求1所述的抗体分子，其中所述VH域包含SEQ IDNO:2。

4.根据前述权利要求中任一项所述的抗体分子，其中所述抗体分子与人IL-17BR和小鼠IL-17BR具有交叉反应性。

5.根据权利要求1所述的抗体分子，其中所述VL域包含人构架区。

6.根据权利要求1所述的抗体分子，其中所述VL域包含SEQ IDNO:4。

7.根据权利要求1所述的抗体分子，其为Fab、F(ab')2、scFv抗体片段。

8.根据权利要求1所述的抗体分子，其包含抗体恒定区。

9.根据权利要求8所述的抗体分子，其中所述恒定区为IgG1或IgG4恒定区。

10.根据权利要求8所述的抗体分子，其包含全抗体。

11.分离的核酸，其包含编码前述权利要求任一项的抗体分子的核苷酸序列。

12.用于表达前述任一项权利要求所述抗体分子的表达载体，所述表达载体包含可操作地连接至启动子的权利要求11所述的核酸。

13.宿主细胞，其携带权利要求12所述的表达载体。

14.生产抗体分子的方法，所述方法包括在用于制备所述抗体分子的条件下培养权利要求13所述的宿主细胞。

15.根据权利要求14所述的方法，其还包括将所述抗体分子分离。

16.根据权利要求14或15所述的方法，还包括将所述抗体分子配制为包含至少一种附加成分的组合物。

17.组合物，其包含权利要求1～10中任一项所述的抗体分子和药用载体。

18.根据权利要求17所述的组合物，其为冻干粉形式。

19.有效量的权利要求1～10中任一项所述的抗体分子或权利要求17所述的组合物在制备用于治疗或预防哮喘的药物中的用途。

20.有效量的权利要求1～10中任一项所述的抗体分子或权利要求17所述的组合物在制备用于治疗或预防炎性肠道病的药物中的用途。

21.根据权利要求20所述的用途，其中所述炎性肠道病为溃疡性结肠炎或克罗恩氏病。

22.制备抗IL-17BR的抗体分子的方法，其包括：

(a)提供抗体VH域，所述VH域包含具有如SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的VH CDR3；

(b)将所述VH域与多个抗体VL域结合以提供抗体分子；

(c)筛选所述抗体分子以与IL-17BR结合；以及

(d)挑选与IL-17BR结合的抗体分子。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述VH域如权利要求2或3所定义。

24.制备抗IL-17BR的抗体分子的方法，其包括：

(a)提供编码VH域的核酸的启动组库，所述VH域包括待替换的CDR3或缺少CDR3编码区；

(b)将所述组库与编码具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的VH CDR3的供体核酸结合，从而将所述供体核酸插入所述组库中的CDR3区，以提供编码VH域的核酸的产物组库；

(c)表达所述产物组库的核酸；

(d)挑选对IL-17BR具有特异性的抗体分子；以及

(e)回收所述抗体分子或对其进行编码的核酸。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述产物组库与VL域共表达。