DE69933696T2

DE69933696T2 - Cytokinrezeptor-kette

Info

Publication number: DE69933696T2
Application number: DE69933696T
Authority: DE
Inventors: Mary Natick COLLINS; Debra Medford DONALDSON; Lori Arlington FITZ; Tamlyn Walnut Creek NEBEN; J. Matthew Hudson WHITTERS; Clive Boston WOOD; Johns Hopkins University Marsha Baltimore WILLS-KARP
Original assignee: Genetics Institute LLC; Johns Hopkins University
Current assignee: Genetics Institute LLC; Johns Hopkins University
Priority date: 1998-12-14
Filing date: 1999-12-13
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2019-12-14
Also published as: JP2003511007A; JP2010263889A; WO2000036103A9; AU2177500A; PT1141286E; CN104611339A; ES2277460T3; JP2014113165A; AU780031B2; DK1141286T3; EP1141286A4; EP1141286A1; US7507706B1; WO2000036103A1; ATE342976T1; CA2356779C; JP5519087B2; EP1141286B1; NZ512942A; DE69933696D1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines IL-13-Antagonisten bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer mit IL-13 in Zusammenhang stehenden Erkrankung bei einem Säuger, wobei es sich bei dem Antagonisten um einen Antikörper gegen IL-13 oder ein an IL-13 bindendes Fragment davon handelt und wobei es sich bei der in Zusammenhang mit IL-13 stehenden Erkrankung um Atopie, eine allergische Erkrankung, Asthma, eine Immunkomplexerkrankung, eine entzündliche Erkrankung der Lunge, eine Immunschwäche oder Krebs handelt.
Stand der Technik
Es sind verschiedene regulatorische Moleküle, die als Cytokine bekannt sind, identifiziert worden, einschließlich Interleukin-13 (IL-13). Bei McKenzie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3735 (1993); Minty et al., Nature 362: 248 (1993); und Aversa et al., WO94/04680 sind verschiedene Proteinformen von IL-13 sowie für verschiedene Formen von IL-13-Aktivität codierende DNA beschrieben. Somit umfaßt der Begriff „TL-13" Proteine mit der in diesen Dokumenten beschriebenen Sequenz und/oder biologischen Aktivität, gleichgültig, ob diese mittels rekombinanter Gentechnik produziert, aus Zellquellen, die den Faktor natürlicherweise oder nach Induktion mit anderen Faktoren produzieren, aufgereinigt oder mit chemischen Techniken synthetisiert oder mit einer Kombination der vorstehenden Techniken produziert wurden.
IL-13 ist ein Cytokin, das mit der Produktion mehrerer biologischer Aktivitäten in Zusammenhang gebracht wird, einschließlich der Induktion des Umschaltens zwischen IgG 4 und IgE, einschließlich in menschlichen unreifen B-Zellen (Punnonen et al., J.Immunol. 152: 1094 (1994)); Induktion der Transkription der schweren Kette (e) von IgE in der Keimbahn sowie der Expression von CD 23 in normalen menschlichen B-Zellen (Punnonen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3730 (1993)); und der Induktion der B-Zellproliferation in Gegenwart von CD 40L bzw. and-CD40-mAb (Cocks et al., Int. Immunol. 5: 657 (1993)). Zwar weisen viele Aktivitäten von IL-13 eine Ähnlichkeit mit denen von IL-4 auf, doch besitzt IL-13 im Gegensatz zu IL-4 keine wachstumsfördernden Wirkungen auf aktivierte T-Zellen oder T-Zellklonen (Zurawski et al., EMBO J. 12: 2663(1993)).
Wie die meisten Cytokine zeigt IL-13 gewisse biologische Aktivitäten, indem es mit einem IL-13-Rezeptor ("IL-13R") auf der Oberfläche von Zielzellen interagiert. IL-13R und der IL-4-Rezeptor ("IL-4R") teilen miteinander eine gemeinsame Komponente, die für die Rezeptoraktivierung benötigt wird; allerdings bindet IL-13 nicht an mit dem 130 kd großen IL-4-R transfizierte Zellen (Zurawski et al., supra). Somit muß der IL-13R wenigstens eine andere ligandenbindende Kette enthalten. Cytokinrezeptoren setzen sich üblicherweise aus zwei oder drei Ketten zusammen. Kürzlich wurde über die Klonierung einer ligandenbindenden Kette für IL-13 berichtet (Hilton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 497–501).
Es wäre wünschenswert, die Sequenz einer weiteren IL-13 bindenden Kette von IL-13R zu identifizieren und zu klonieren, so daß aus verschiedenen Gründen, einschließlich der Produktion von Therapeutika und dem Screening auf Inhibitoren der Bindung von IL-13 an den Rezeptor sowie der Rezeptorsignalgebung, IL-13R-Proteine produziert werden können.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Durch die vorliegende Erfindung wird die Verwendung eines IL-13-Antagonisten bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer mit IL-13 in Zusammenhang stehenden Erkrankung bei einem Säuger bereitgestellt, wobei es sich bei dem Antagonisten um einen Antikörper gegen IL-13 oder ein IL-13 bindendes Fragment davon handelt und wobei es sich bei der mit IL-13 in Zusammenhang stehenden Erkrankung um Atopie, eine allergische Erkrankung, Asthma, eine Immunkomplexerkrankung, eine entzündliche Erkrankung der Lunge, Immunschwäche oder Krebs handelt.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt ist die Verwendung eines IL-13-Antagonisten bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der Interaktion von IL-13 mit einem IL-13bc-Protein bei einer Erkrankung, die ausgewählt ist aus Atopie, einer allergischen Erkrankung, Asthma, einer Immunkomplexerkrankung, einer entzündlichen Erkrankung der Lunge, Immunschwäche oder Krebs, wobei es sich bei dem Antagonisten um einen Antikörper gegen IL-13 oder ein an IL-13 bindendes Fragment davon handelt.
Ebenso beschrieben werden für die IL-13 bindenden Ketten des Interleukin-13-Rezeptors codierende Polynukleotide offenbart, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, die aus den Rezeptoren von Maus und Mensch. In bestimmten Ausführungsformen wird durch die Erfindung ein isoliertes Polynukleotid bereitgestellt, umfassend eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 256 bis Nukleotid 1404;
(b) die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 3 von Nukleotid 103 bis Nukleotid 1242;
(c) eine von der Sequenz der in (a) oder (b) angegebenen Nukleotidsequenz als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes variierenden Nukleotidsequenz;
(d) einer zur Hybridisierung an das in (a) oder (b) angegebene Nukleotid unter stringenten Bedingungen fähigen Nukleotidsequenz;
(e) einer für ein Spezieshomolog der in (a) oder (b) angegebenen Sequenz codierenden Nukleotidsequenz; und
(f) einer allelischen Variante der in (a) oder (b) angegebenen Nukleotidsequenz.

Vorzugsweise codiert die Nukleotidsequenz für ein Protein mit einer biologischen Aktivität des menschlichen IL-13-Rezeptors. Die Nukleotidsequenz kann mit einer Expressionskontrollsequenz operativ verknüpft sein. In bevorzugten Ausführungsformen umfaßt das Polynukleotid die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 256 bis Nukleotid 1404; die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 319 bis Nukleotid 1257; die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 1324 bis Nukleotid 1404; die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 3 von Nukleotid 103 bis Nukleotid 1242; die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 3 von Nukleotid 178 bis Nukleotid 1125 oder die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 3 von Nukleotid 1189 bis Nukleotid 1242.
Ferner werden isolierte Polynukleotide beschrieben, umfassend eine Nukleotidsequenz, codierend für ein Peptid oder Protein, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2;
(b) der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 von Aminosäure 22 bis 334;
(c) der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 von Aminosäure 357 bis 383;
(d) der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4;
(e) der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4 von Aminosäure 26 bis 341;
(f) der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4 von Aminosäure 363 bis 380; und
(g) Fragmenten von (a)–(f) mit einer biologischen Aktivität der IL-13-Rezeptor-Bindungskette. Weitere bevorzugte Ausführungsformen codieren für die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 von Aminosäure 1 bis 331 sowie die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 von Aminosäure 26 bis 331.

Ebenso werden mit den Polynukleotiden transformierte Wirtszellen, vorzugsweise Säugerzellen, beschrieben.
Ebenso wird hier ein Verfahren zur Herstellung eines IL-13bc-Proteins beschrieben. Dabei umfaßt das Verfahren:

(a) die Anzucht einer Kultur der Wirtszelle der vorliegenden Erfindung in einem geeigneten Kulturmedium; und
(b) das Auf reinigen des menschlichen IL-13bc-Proteins aus der Kultur.

Ebenso werden nach diesem Verfahren hergestellte Proteine bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung sieht ebenso ein isoliertes IL-13bc-Protein vor, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) der Aminosäuresequenz der SEQ IDNO: 2;
(b) der Aminosäuresequenz der SEQ IDNO: 2 von Aminosäure 22 bis 334;
(c) der Aminosäuresequenz der SEQ IDNO: 2 von Aminosäure 357 bis 383;
(d) der Aminosäuresequenz der SEQ IDNO: 4;
(e) der Aminosäuresequenz der SEQ IDNO: 4 von Aminosäure 26 bis 341;
(f) der Aminosäuresequenz der SEQ IDNO: 4 von Aminosäure 363 bis 380; und
(g) Fragmenten von (a)–(f) mit einer biologischen Aktivität der IL-13-Rezeptor-Bindungskette.

Vorzugsweise umfaßt das Protein die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2; die Sequenz von Aminosäure 22 bis 334 der SEQ ID NO: 2; die Sequenz von SEQ ID NO: 4; oder die Sequenz von Aminosäure 26 bis 341 der SEQ ID NO: 4. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist die angegebene Aminosäuresequenz Teil eines Fusionsproteins (mit einer zusätzlichen, nicht von IL-13bc abgeleiteten Aminosäuresequenz). Bevorzugte Fusionsproteine umfassen ein Antikörperfragment, wie z.B. ein FE-Fragment. Besonders bevorzugte Ausführungsformen umfassen die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 von Aminosäure 1 bis 331 sowie die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 von Aminosäure 26 bis 331.
Ebenso werden ein Protein der vorliegenden Erfindung sowie einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger umfassende pharmazeutische Zusammensetzungen beschrieben.
Ferner werden Zusammensetzungen beschrieben, die einen Antikörper umfassen, der spezifisch mit einem wie hier beschriebenen Protein reagiert.
Verfahren zur Identifizierung eines Inhibitors der Bindung von IL-13 an den IL-13bc- oder IL-13-Rezeptor werden ebenso beschrieben. Dabei umfassen diese Verfahren:

(a) das Kombinieren eines IL-13bc-Proteins oder eines Fragments davon mit IL-13 oder einem Fragment davon, wobei diese Kombination einen ersten Bindungsansatz bildet;
(b) Messen der Menge an Bindung zwischen dem Protein und dem IL-13 oder Fragment in dem ersten Bindungsansatz;
(c) Kombinieren einer Verbindung mit dem Protein und dem IL-13 oder Fragment zur Bildung eines zweiten Bindungsansatzes;
(d) Messen der Menge an Bindung im zweiten Bindungsansatz; und
(e) Vergleichen der Menge an Bindung im ersten Bindungsansatz mit der Menge an Bindung im zweiten Bindungsansatz;

Verfahren zur Hemmung der Bindung von IL-13 an die IL-13bc-Proteine oder den IL-13-Rezeptor in einem Säugerindividuum werden ebenso offenbart, wobei man in den Verfahren eine therapeutisch wirksame Menge einer ein IL-13bc-Protein, einen IL-13bc- oder IL-13R-Inhibitor oder einen Antikörper gegen ein IL-13bc-Protein enthaltenden Zusammensetzung verabreicht.
Ebenso werden Verfahren zur Potenzierung der IL-13-Aktivität beschrieben, bei denen man ein Protein mit IL-13-Aktivität mit einem Protein gemäß Anspruch 11 kombiniert und eine derartige Kombination mit einer wenigstens eine andere IL-13R-Kette als IL-13bc expremierenden Zelle in Kontakt bringt. Vorzugsweise wird der Schritt des Inkontaktbringens dabei durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer solchen Kombination an ein Säugerindividuum durchgeführt.
Weitere Verfahren werden für die Behandlung einer im Zusammenhang mit IL-13 stehenden Erkrankung in einem Säugerindividuum offenbart, wobei man in dem Verfahren eine therapeutisch wirksame Menge einer einen IL-13-Antagonisten sowie einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger umfassenden Zusammensetzung verabreicht. Andere beschriebene Verfahren beziehen sich auf ein Verfahren zur Hemmung der Interaktion von IL-13 mit einem IL-13bc-Protein in einem Säugerindividuum, wobei man eine therapeutisch wirksame Menge einer einen IL-13-Antagonisten sowie einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger umfassenden Zusammensetzung verabreicht. Dabei ist der Antagonist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem IL-13bc-Protein, einer löslichen Form von IL-13Rα1, einem Antikörper gegen IL-13 oder einem IL-13-Bindungsfragment davon, einem Antikörper gegen IL-13bc oder einem IL-13bc-Bindungsfragment davon, einem Antikörper gegen IL-13Rα1 oder einem IL-13Rα1-Bindungsfragment davon, IL-13R-Bindungsmutanten von IL-4, einem kleinen zur Hemmung der Interaktion von IL-13 mit IL-13bc fähigen kleinen Molekül sowie einem zur Hemmung der Interaktion von IL-13 mit IL-13Rα1 fähigen kleinen Molekül.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1: In der Abbildung sind Fotographien von IL-13, IL-4, IL-11 sowie scheintransfizierten COS-Zellen nach Inkontaktbringen mit IL-13bc-FC, wie in Beispiel 4 unten beschrieben, dargestellt.
2: Umkehrung der allergeninduzierten Überansprechbarkeit der Atemwege durch in-vivo-Blockade von Interleukin-13. 10 Tage nach dem ersten intratrachialen Challenge wurden OVA- und PBS-immunisierte Mäuse wiederum intratrachial einem Challenge mit entweder OVA oder PBS unterworfen. Dabei wurde Mäusen sIL-13bc-Fc (400 μg) oder eine äquivalente Menge hU-IgG-Kontrolle durch intraperitoniale Injektion am Tag –1, 0, +1 und +3 des sekundären Antigen-Challenge gegeben. Der allergische Phänotyp wurde 4 Tage nach dem PBS- bzw. OVA-Challenge beurteilt. (A) AHR (Airway Hyper Responsiveness [=Überansprechbarkeit der Atemwege]) gegenüber einem Acetylcholin-Challenge, definiert durch den zeitintegrierten Anstieg des SpitzenAtemwegdrucks (APTI [= Airway-Pressure-Time Index]) in cmH₂O × S. (B) Inflammatorische Zellzusammensetzung bronchoalgeolärer Lavagen. Differentielle Zellprozentanteile wurden durch lichtmikroskopische Bewertung von „Cytospin"-Präparationen bestimmt. Die Daten sind als absolute Zellzahlen ausgedrückt. (C) OVA-spezifische Serum-IgE-Konzentrationen. Ergebnisse sind als Mittelwerte +/– SEM (Standardabweichung) von 8–10 Tieren pro Gruppe dargestellt. *P < 0,05, verglichen mit entsprechenden PBS-Kontrollgruppen; **P < 0,05, verglichen mit der OVA/Hu-Ig-Gruppe (Einweg-ANOVA mit anschließendem „least significant difference"-Test nach Fischer für Mehrfachvergleiche).
3: Auswirkungen der IL-13-Blockade auf allergengetriebene Zunahmen schleimhaltiger Zellen im Atemwegsepithel. Lungenschnitte (N = 4 pro Versuchsgruppe, 4 Schnitte pro Tier) wurden in Formalin fixiert, in 10 μm-Schnitte geschnitten und mit Hämatoxilin und Eosin sowie Perjodsäure- Schiff gefärbt. Es sind repräsentative Schnitte dargestellt. Balken = 100 μm. PBS/Hu-Ig: PBS-immunisierte und einem Challenge unterworfene Kontrollen, wobei nur wenige schleimhaltige Zellen zu sehen sind. OVA/Hu-Ig:allergeninduzierte Zunahmen interstitieller inflammatorischer Zellen und Zunahmen der Anzahl an schleimhaltigen Becherzellen. OVA/sIL-13bc-Fc: dramatischer Hemmeffekt der IL-13-Blockade auf die allergeninduzierte Schleimproduktion von Becherzellen.
4: IL-13-Induktion einer Hyperreaktivität der Atemwege. Naiven Mäusen wurde rekombinantes IL-13 (5 μg/Maus, 50-μl-Volumen) oder PBS täglich durch intratrachiales Einträufeln gegeben. 24 Std. nach der letzten Behandlung wurden (A) AHR (Airway Hyper Responsiveness), (B) BAL-Eosinophil-Spiegel, (C) Gesamt-IgE-Serumspiegel und (D) Schleimwert („mucus score") bestimmt. Bei den Ergebnissen handelt es sich um Mittelwerte ±SEM (senkrechte Balken) von 7–10 Tieren pro Gruppe. *P < 0,05, verglichen mit PBS-Gruppe (Student's t-Test).
Ausführliche Beschreibung bevorzugter Ausführunsformen
In der vorliegenden Anmeldung wurden erstmals für die IL-13 bindende Kette von IL-13R (nachfolgend "IL-13bc") codierende Polynukleotide, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, für Maus- und menschliches IL-13bc codierende Polynukleotide, identifiziert und bereitgestellt.
Durch SEQ ID NO: 1 ist die Nukleotidsequenz einer für das Maus-IL-13bc codierenden cDNA bereitgestellt. Durch SEQ ID NO: 2 wird die vorhergesagte Aminosäuresequenz der Rezeptor-Kette, einschließlich einer putativen Signalsequenz von Ami nosäuren 1–21, bereitgestellt. Man nimmt an, daß das reife Maus-IL-13bc die Sequenz der Aminosäuren 22–383 der SEQ ID NO: 2 aufweist. Die reife Maus-Rezeptor-Kette weist wenigstens drei unterschiedliche Domänen auf: eine extrazelluläre Domäne (umfassend ungefähr Aminosäuren 22–334 der SEQ ID NO: 2), eine Transmembrandomäne (umfassend ungefähr Aminosäuren 335–356 der SEQ ID NO: 2) sowie eine intrazelluläre Domäne (umfassend ungefähr Aminosäuren 357–383 der SEQ ID NO: 2).
Durch SEQ ID NO: 3 wird die Nukleotidsequenz einer für das menschliche IL-13bc codierenden cDNA bereitgestellt. Durch SEQ ID NO: 4 wird die vorhergesagte Aminosäuresequenz der Rezeptor-Kette, einschließlich einer putativen Signalsequenz von Aminosäuren 1–25 bereitgestellt. Man nimmt an, daß das reife menschliche IL-13bc die Sequenz von Aminosäuren 26–380 der SEQ ID NO: 4 aufweist. Die reife menschliche Rezeptor-Kette weist wenigstens drei unterschiedliche Domänen auf: eine extrazelluläre Domäne (umfassend ungefähr Aminosäuren 26–341 der SEQ ID NO: 4), eine Transmembrandomäne (umfassend ungefähr Aminosäuren 342–362 der SEQ ID NO: 4) sowie eine intrazelluläre Domäne (umfassend ungefähr Aminosäuren 363–380 der SEQ ID NO: 4).
Die ersten 81 Aminosäuren der menschlichen IL-13bc-Sequenz sind mit der translatierten Sequenz eines als "yg99f10. r1 Homo sapiens cDNA clone 416485" identifizierten EST (Expressed Sequence Tag) mit der zugewiesenen Datenbankzugangsnummer R52795.gbe_st2 identisch. In dieser EST-Sequenz gibt es keine Homologien oder Sequenzmotive, die dem Fachmann die Identifizierung des codierten Proteins als Cytokinrezeptor ermöglichen würden. Ein diesem Datenbankeintrag entsprechender cDNA-Klon ist über das I. M. A. G. E. Consortium öffentlich zugänglich. Nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung wurde ein solcher Klon von den Anmeldern bestellt und sequenziert. Es wurde festgestellt, daß es sich bei der Sequenz dieses Klons um die von den Anmeldern als SEQ ID NO: 3 hier zuvor mitgeteilte Sequenz handelt.
Ebenso lassen sich lösliche Formen des IL-13bc-Proteins produzieren. Zu derartigen löslichen Formen gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, Proteine, die die Aminosäuren 1–334 oder 22–334 der SEQ ID NO: 2 oder die Aminosäuren 1–341 oder 26–341 der SEQ ID NO: 4 umfassen. Die löslichen Formen des IL-13bc sind ferner dadurch gekennzeichnet, daß sie in wäßriger Lösung, vorzugsweise bei Raumtemperatur, löslich sind. Ebenso können nur die intrazelluläre Domäne oder einen Teil davon umfassende IL-13bc-Proteine produziert werden. Alle Formen von IL-13bc mit weniger als der vollen Länge werden hier zusammen mit den Volllängen- und reifen Formen als „IL-13bc" oder „IL-13bc-Proteine" bezeichnet. IL-13bc-Proteine mit weniger als der vollen Länge können durch Expression eines entsprechenden Fragments des für das Volllängen-IL-13bc-Protein codierenden Polynukleotids (SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3) produziert werden. Diese entsprechenden Polynukleotidfragmente sind ebenso beschrieben. Modifizierte Polynukleotide, wie sie oben beschrieben sind, können mit Standardtechniken der Molekularbiologie hergestellt werden, einschließlich Konstruktion entsprechender gewünschter Deletionsmutanten, stellengerichteter Mutagenese-Verfahren oder mit der Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung entsprechender Oligonukleotidprimer.
Ein Protein, wie es hier beschrieben ist, weist „eine biologische Aktivität der IL-13-Rezeptor-Bindungskette" auf, falls es eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften besitzt: (1) die Fähigkeit zur Bindung von IL-13 oder eines Fragments davon (vorzugsweise eines biologisch aktiven Fragments davon); und/oder (2) die Fähigkeit zur Interaktion mit der zweiten nicht IL-13 bindenden Kette von IL-13R zur Produktion eines Signals, das für die Bindung von IL-13 an IL-13R charakteristisch ist. Vorzugsweise handelt es sich bei der biologischen Aktivität, die das Protein besitzt, um die Fähigkeit, an IL-13 oder ein Fragment davon, besonders bevorzugt mit einem Wert für K_D von etwa 0,1 bis etwa 100 nM zu binden. Verfahren zur Bestimmung davon, ob ein bestimmtes Protein oder Peptid eine solche Aktivität aufweist, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, die in den hier bereitgestellten Beispielen beschriebenen Verfahren.
IL-13bc oder aktive Fragmente davon (IL-13bc-Proteine) können an Trägermoleküle, wie beispielsweise Immunglobuline, fusioniert werden. So können beispielsweise lösliche Formen des IL-13bc über „Linker"-Sequenzen an den FC-Teil eines Immunglobulins fusioniert werden. Andere Fusionsproteine, wie beispielsweise solche mit GST, LEX-A oder MBP, können ebenso verwendet werden.
Ferner werden allelische Varianten der Nukleotidsequenzen, wie die unter SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 aufgeführt sind, beschrieben, das heißt natürlich vorkommende alternative Formen des isolierten Polynukleotids der SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3, die ebenso für IL-13bc-Proteine, vorzugs weise für solche Proteine mit einer biologischen Aktivität von IL-13bc, codieren. Ebenso beschrieben sind isolierte Polynukleotide, die an die unter SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 aufgeführte Nukleotidsequenz unter hochstringenten Bedingungen (z.B. 0,1 × SSC bei 65°C) hybridisieren. Isolierte Polynukleotide, die für IL-13bc-Proteine codieren, sich jedoch von der unter SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 aufgeführten Nukleotidsequenz aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes unterscheiden, sind ebenso beschrieben. Ebenso sind Variationen in der Nukleotidsequenz, wie sie unter SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 aufgeführt ist, die durch Punktmutationen oder durch induzierte Modifikationen verursacht werden, beschrieben.
Ebenso beschrieben sind für Homologe des Maus- und menschlichen IL-13bc aus anderen Tierspezies, insbesondere anderen Säugerspezies, codierende Polynukleotide. Spezies-Homologe lassen sich identifizieren und isolieren, indem man aus den hier offenbarten Maus- oder menschlichen Sequenzen Sonden oder Primer herstellt und eine Bibliothek aus einer entsprechenden Spezies, wie beispielsweise aus PBMCs, Thymus oder Testis der relevantes Spezies konstruierte Bibliotheken, einem Screening unterzieht.
Die isolierten Polynukleotide können operativ mit einer Expressionskontrollsequenz, wie z.B. den bei Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19, 4485–4490 (1991) offenbarten pMT2- oder pED-Expressionsvektoren, operativ verknüpft werden, um das IL-13bc-Protein rekombinant zu produzieren. Im Fachgebiet sind viele geeignete Expressionskontrollsequenzen bekannt. Ebenso sind allgemeine Verfahren zur Expression re kombinanter Proteine bekannt und beispielhaft bei R. Kaufman, Methods in Enzymology 185, 537–566 (1990) aufgeführt. „Operativ verknüpft", wie hier definiert, bedeutet enzymatisch oder chemisch ligiert unter Bindung einer covalenten Bildung zwischen dem erfindungsgemäßen isolierten Polynukleotid und der Expressionskontrollsequenz, und zwar so, daß das IL-13bc-Protein von einer Wirtszelle exprimiert wird, die mit der ligierten Polynukleotid/Expressionskontrollsequenz transformiert (transfiziert) worden ist.
Eine Reihe von Zellarten können als geeignete Wirtszellen zur Expression des IL-13bc-Proteins dienen. Dabei können alle zur Expression eines funktionellen IL-13bc-Proteins fähigen Zellarten verwendet werden. Zu geeigneten Säugerwirtszellen gehören beispielsweise Affen-COS-Zellen, CHO (Chinese Hamster Ovary)-Zellen, menschliche 293-Nierenzellen, menschliche A431-Epidermiszellen, menschliche CoLo205-Zellen, 3T3-Zellen, CV-1-Zellen, andere transformierte Primatenzelllinien, normale diploide Zellen, aus einer in-vitro-Kultur von primärem Gewebe stammende Zellstämme, primäre Explantate, HeLa-Zellen, Maus-L-Zellen, BHK-, HL-60-, U937-, HaK-, Rat2-BaF3-, 32D-, FDCP-1-, PC12-, Mix- oder C2C12-Zellen.
Das IL-13bc-Protein kann auch produziert werden, indem man das erfindungsgemäße isolierte Polynukleotid mit geeigneten Kontrollsequenzen in einem oder mehreren Insekten-Expressionsvektoren operativ verknüpft und ein Insekten-Expressionssystem einsetzt. Materialien und Verfahren für Baculovirus/Insektenzellen-Expressionssysteme sind kommerziell in Kit-Form beispielsweise von Invitrogen, San Diego, California, U.S.A. (der MaxBac^®-Kit) erhältlich, wobei derartige Verfahren im Fachgebiet allgemein bekannt sind, wie bei Summers und Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) beschrieben. Lösliche Formen des IL-13bc-Proteins können auch in Insektenzellen unter Verwendung entsprechender isolierter Polynukleotide, wie oben beschrieben, produziert werden.
Als Alternative kann das IL-13bc-Protein in niederen Eukaryonten, wie z.B. Hefe, oder in Prokaryonten, wie z.B. Bakterien, produziert werden. Zu geeigneten Hefestämmen zählen Saccharomyces cerevisiae, Schizisaccharomyces pombe, Kluyveromycesstämme, Candida bzw. alle Hefestämme, die zur Expression heterologer Proteine fähig sind. Zu geeigneten Bakterienstämmen zählen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium bzw. alle Bakterienstämme, die zur Expression heterologer Proteine fähig sind.
Die Expression in Bakterien kann zur Bildung von Einschlußkörperchen führen, die das rekombinante Protein beinhalten. Somit kann eine Rückfaltung des rekombinanten Proteins erforderlich sein, um aktives oder aktiveres Material zu produzieren. Im Fachgebiet sind mehrere Verfahren zur Gewinnung korrekt gefalteter heterologer Proteine aus bakteriellen Einschlußkörperchen bekannt. Bei diesem Verfahren wird im allgemeinen das Protein aus den Einschlußkörperchen solubilisiert und anschließend vollständig unter Verwendung eines Chaotrops denaturiert. Liegen in der primären Aminosäuresequenz des Proteins Cysteinreste vor, so ist es häufig notwendig, die Rückfaltung in einer Umgebung durchzuführen, die die korrekte Ausbildung von Disulfidbrückenbindungen gestat ten (einem Redoxsystem). Allgemeine Verfahren zur Rückfaltung sind bei Kohno, Meth. Enzym., 185:187–195 (1990) offenbart. Weitere geeignete Verfahren sind in der EP 0433225 sowie der gleichzeitig anhängigen Anmeldung USSN 08/163,877 beschrieben.
Das IL-13bc-Protein kann auch als Produkt transgener Tiere, beispielsweise als Bestandteil der Milch transgener Kühe, Ziegen, Schweine oder Schafe, die durch somatische oder Keimzellen, die eine für das IL-13bc-Protein codierende Polynukleotidsequenz enthalten, charakterisiert sind, exprimiert werden.
Das IL-13bc-Protein kann durch Anziehen einer Kultur transformierter Wirtszellen unter zur Expression des gewünschten Proteins notwendigen Kulturbedingungen hergestellt werden. Das erhaltene exprimierte Protein kann dann aus dem Kulturmedium oder aus Zellextrakten aufgereinigt werden. Lösliche Formen des IL-13bc-Proteins lassen sich aus konditionierten Medien aufreinigen. Membrangebundene Formen des IL-13bc-Proteins lassen sich dadurch aufreinigen, daß man eine Gesamtmembranfraktion aus der exprimierenden Zelle präpariert und die Membranen mit einem nichtionischen Detergens, wie z.B. Triton X-100, extrahiert.
Das IL-13bc-Protein läßt sich mit dem Fachmann bekannten Verfahren aufreinigen. So kann man beispielsweise das IL-13bc-Protein unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Proteinkonzentrationsfilters, beispielsweise einer Amiconoder Millipore-Pellicon-Ultrafiltrationseinheit, konzentrieren. Nach dem Konzentrationsschritt kann das Konzentrat auf eine Reinigungsmatrix, wie beispielsweise ein Gelfiltrationsmedium, aufgetragen werden. Als Alternative kann man ein Anionenaustauschharz, beispielsweise eine Matrix oder ein Substrat mit daran hängenden Diethylaminoethyl (DEAE)- oder Polyethylenimin (PEI)-Gruppen, einsetzen. Bei den Matrizes kann es sich um Acrylamid, Agarose, Dextran, Zellulose oder andere, üblicherweise bei der Proteinreinigung eingesetzte Arten handeln. Als Alternative kann man einen Kationenaustauschschritt einsetzen. Zu geeigneten Kationenaustauschern gehören verschiedene unlösliche Matrizes, die Sulfopropyl- oder Carboxymethylgruppen umfassen. Dabei sind Sulfopropylgruppen bevorzugt (z.B. S-Sepharose^®-Säulen). Die Aufreinigung des IL-13bc-Proteins aus dem Kulturüberstand kann auch einen oder mehrere Säulenschritte über solche Affinitätsharze wie etwa Conkanavalin-A-Agarose, Heparin-Toyopearl oder Cibacrom blue 3GA Sepharose beinhalten oder mittels hydrophober Interaktionschromatograpie unter Verwendung solcher Harze wie etwa Phenylether, Butylether oder Propylether oder mittels Immunaffinitätschromatographie erfolgen. Schließlich lassen sich zur weiteren Aufreinigung des IL-13bc-Proteins ein oder mehrere Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC)-Schritte unter Einsatz hydrophober RP-HPLC-Medien, z.B. Kieselgel mit daran hängenden Methyl- oder anderen aliphatischen Gruppen, einsetzen. Ebenso können bei der Reinigung Affinitätssäulen, die IL-13 oder Fragmente davon oder Antikörper gegen das IL-13bc-Protein enthalten, nach bekannten Verfahren verwendet werden. Einige oder alle der oben genannten Reinigungsschritte können auch in verschiedenen Kombinationen oder zusammen mit anderen bekannten Verfahren eingesetzt werden, so daß ein weitgehend gereinigtes, isoliertes rekombinantes Protein bereitgestellt wird. Vorzugsweise wird das isolierte IL-13bc-Protein so aufgereinigt, daß es weitgehend frei von anderen Säugerproteinen ist.
IL-13bc-Proteine können auch zum Screening auf Agenzien, die zur Bindung an IL-13bc oder IL-13R fähig sind oder die Bindung von IL-13 an das IL-13 oder IL-13bc (entweder die extrazellulären oder intrazellulären Domänen) stören und somit als Inhibitoren der normalen Bindung und Cytokinwirkung fungieren können („IL-13R-Inhibitoren"), verwendet werden. Bindungstests unter Verwendung eines gewünschten Bindungsproteins, das gegebenenfalls immobilisiert sein kann, sind im Fachgebiet allgemein bekannt und können für diesen Zweck unter Verwendung des erfindungsgemäßen IL-13bc-Proteins verwendet werden. Zur Identifizierung derartiger Agenzien können auf aufgereinigten Zellen beruhende oder auf Proteinen beruhende (zellfreie) Screening-Tests verwendet werden. So kann beispielsweise das IL-13bc-Protein in gereinigter Form auf einem Träger immobilisiert und die Bindung an gereinigtes IL-13bc-Protein in Gegenwart und in Abwesenheit potentieller Hemmstoffe gemessen werden. Als Alternative kann in einem geeigneten Bindungstest eine lösliche Form des erfindungsgemäßen IL-13bc eingesetzt werden. Ein weiteres Beispiel eines Systems, bei dem ein Screening auf Inhibitoren durchgeführt werden kann, ist in Beispiel 2 unten beschrieben.
In einem derartigen Screening-Test wird ein erster Bindungsansatz gebildet, indem man IL-13 oder ein Fragment davon mit dem IL-13bc-Protein kombiniert, wobei die Menge der Bindung im ersten Bindungsansatz (B₀) gemessen wird. Ebenso wird ein zweiter Bindungsansatz gebildet, in dem IL-13 oder ein Fragment davon, das IL-13bc-Protein sowie die Verbindung oder das Agens, für die bzw. das das Screening durchgeführt wird, miteinander kombiniert werden, wobei die Menge an Bindung im zweiten Bindungsansatz (B) gemessen wird. Die Menge an Bindung im ersten und zweiten Bindungsansatz wird beispielsweise verglichen, indem man eine Berechnung des Verhältnisses B/B₀ durchführt. Dabei wird eine Verbindung oder ein Agens als zur Hemmung der Verbindung fähig betrachtet, falls eine Abnahme der Bindung im zweiten Bindungsansatz im Vergleich zum ersten Bindungsansatz beobachtet wird. Gegebenenfalls kann man die zweite Kette von IL-13R zu einem oder beiden Bindungsansätzen hinzugeben. Die Formulierung und Optimierung der Bindungsansätze liegt im Bereich des fachmännischen Könnens, wobei derartige Bindungsansätze auch zur Verbesserung oder Optimierung der Bindung notwendige Puffer und Salze enthalten können und der erfindungsgemäße Screening-Test zusätzliche Kontrolltests umfassen kann.
Somit können Verbindungen, bei denen sich herausstellte, daß sie die Bindungsaktivität des IL-13bc-Proteins an IL-13 oder sein Fragment zu einem beliebigen Grad, vorzugsweise um wenigstens etwa 10%, stärker bevorzugt um mehr als etwa 50% oder mehr, verringern, identifiziert und anschließend in anderen Bindungstests und in-vivo-Tests einem zweiten Screening unterzogen werden. Mit diesen Mitteln können Verbindungen, die eine Hemmaktivität für die IL-13bc-Bindung aufweisen und als Therapeutika geeignet sein können, identifiziert werden.
Ebenso können IL-13bc-Proteine sowie für diese codierende Polynukleotide als Diagnostika zum Nachweis der Expression oder des Vorhandenseins von IL-13bc, IL-13R, IL-13 oder IL-13bc, IL-13R oder IL-13 exprimierenden Zellen verwendet werden. Die Proteine oder Polynukleotide können für einen derartigen Zweck in Standardverfahren für diagnostische Tests unter Verwendung dieser Arten von Materialien eingesetzt werden. Dem Fachmann sind geeignete Verfahren allgemein bekannt.
„IL-13R", wie hier verwendet, bezieht sich auf IL-13bc und/oder eine zweite IL-13-Rezeptor-Kette, die als „IL-13Rα1" oder „NR4" bekannt ist (siehe Maus-Rezeptor-Kette, Hilton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996,93:497–501; menschliche Rezeptor-Kette, Aman et al., J. Biol. Chem. 1996, 271:29265–70 und Gauchat et al., Eur. J. Immunol. 1997, 27:971–8).
IL-13bc wirkt als Vermittler der bekannten biologischen Aktivitäten von IL-13. Daher können das IL-13bc-Protein (insbesondere lösliche IL-13bc-Proteine), IL-13R-Inhibitoren (d.h. Antagonisten der Interaktion von IL-13 mit IL-13R (wie beispielsweise Antikörper gegen IL-13R (einschließlich insbesondere gegen IL-13bc oder gegen IL-13Rα1) sowie Fragmente davon, Antikörper gegen IL-13 und Fragmente davon, lösliche IL-13Rα1-Proteine sowie ein kleines Molekül und andere Inhibitoren der Interaktion von IL-13 mit IL-13R (einschließlich mit IL-13bc und/oder mit IL-13Rα1) bei der Behandlung oder Modulation verschiedener medizinischer Erkrankungen, mit denen IL-13 in Zusammenhang gebracht wird oder die durch die Aktivität (oder das Fehlen davon) von IL-13 herbeigeführt werden (zusammen als „mit IL-13 in Zusammenhang stehende Erkrankungen" bezeichnet) geeignet sein. Mutierte Formen von IL-4, die an IL-13R binden, lassen sich ebenso als IL-13-Antagonisten verwenden (siehe die bei Shanafelt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95:9454–8; Aversa et al., J. Exp. Med. 1993, 178:2213–8; und Grunewald et al., J. Immunol. 1998, 160:4004–9 offenbarten Beispiele).
Zu in Zusammenhang mit IL-13 stehenden Erkrankungen gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, Ig-vermittelte Erkrankungen und Krankheiten, insbesondere IgE-vermittelte Erkrankungen (einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Atopie, allergische Erkrankungen, Asthma, Immunkomplexerkrankungen (wie beispielsweise Lupus, Nephrotisches Syndrom, Nephritis, Glomerulonephritis; Thyroiditis und Morbus Basedow)); entzündliche Erkrankungen der Lunge; Immunschwächen, insbesondere Mangel an hämatopoetischen Vorläuferzellen, oder damit in Verbindung stehende Störungen; Krebs und andere Krankheiten. Derartige Krankheitszustände können von Krankheit, Inkontaktkommen mit Strahlung oder Arzneistoffen herrühren und umfassen beispielsweise Leukopänie, Infektionen mit Bakterien und Viren, Anämie, Mangel an B- oder T-Zellen, wie beispielsweise Mangel an Immunzellen oder hamötopoetischen Zellen nach einer Knochenmarkstransplantation. Da IL-13 die Makrophagenaktivierung hemmt, können IL-13bc-Proteine auch bei der Verbesserung der Makrophagenaktivierung geeignet sein (d.h. bei Impfung, Behandlung von Mykobakterien- oder intrazellulären Organismen oder parasitären Infektionen).
IL-13bc-Proteine können auch zur Potenzierung der Wirkungen von IL-13 in-vitro und in-vivo verwendet werden. Beispiels weise läßt sich ein IL-13bc-Protein mit einem Protein mit IL-13-Aktivität (vorzugsweise IL-13) kombinieren und die erhaltene Kombination mit einer wenigstens eine andere IL-13R-Kette als IL-13bc (vorzugsweise alle IL-13R-Ketten außer IL-13bc, wie z.B. IL-13Rα1) exprimierenden Zelle in Kontakt bringen. Dabei wird der Schritt des Inkontaktbringens vorzugsweise so durchgeführt, daß einem Säugerindividuum in-vivo eine therapeutisch wirksame Menge einer derartigen Kombination verabreicht wird. Die bereits erfolgte Zusammenlagerung des IL-13-Proteins mit dem IL-13bc-Protein unterstützt die Bildung des für die korrekte Signalgebung notwendigen vollständigen IL-13/IL-13R-Komplexes. Siehe beispielsweise die von Economides et al., Science 270:1351 (1995) beschriebenen Verfahren.
IL-13bc-Protein und IL-13R-Inhibitoren können sowohl in aus Zellen aufgereinigter als auch in rekombinant hergestellter Form als pharmazeutische Zusammensetzung verwendet werden, wenn sie mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger kombiniert werden. Eine derartige Zusammensetzung kann neben IL-13bc oder dem Inhibitor und dem Träger verschiedene Verdünnungsmittel, Füllstoffe, Salze, Puffer, Stabilisatoren, Solubilisatoren und andere im Fachgebiet allgemein bekannte Materialien enthalten. Dabei versteht man unter dem Begriff „pharmazeutisch unbedenklich" ein nichttoxisches Material, das die Wirksamkeit der biologischen Aktivität des Wirkstoffs bzw. der Wirkstoffe nicht stört. Die Eigenschaften des Trägers sind vom Verabreichungsweg abhängig.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann auch Cytokine, Lymphokine oder andere hämatopoetische Fakto ren, wie z.B. M-CSF, GM-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, G-CSF, Stammzellenfaktor und Eritropoetin, enthalten. Ebenso kann die pharmazeutische Zusammensetzung Anti-Cytokin-Antikörper enthalten. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann thrombolytische oder Anti-Thrombose-Faktoren, wie beispielsweise Plasminogenaktivator und Faktor VIII, enthalten. Ferner kann die pharmazeutische Zusammensetzung andere Entzündungshemmer enthalten. Solche zusätzlichen Faktoren und/oder Agenzien können in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten sein, um eine synergistische Wirkung zusammen mit dem isolierten IL-13bc-Protein oder IL-13bc-Inhibitor zu produzieren oder durch das isolierte IL-13bc oder den IL-13bc-Inhibitor verursachte Nebenwirkungen zu minimieren. Umgekehrt kann isoliertes IL-13bc oder IL-13bc-Inhibitor in Formulierungen des jeweiligen Cytokins, Lymphokins, anderen hämatopoetischen Faktors, thrombolytischen oder Anti-Thrombose-Faktors oder Entzündungshemmers enthalten sein, um Nebenwirkungen des Cytokins, Lymphokins, anderen hämatopoetischen Faktors, thrombolytischen oder Anti-Thrombose-Faktors oder Entzündungshemmers zu minimieren.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann in Form eines Liposoms vorliegen, in dem isoliertes IL-13bc-Protein oder IL-13bc-Inhibitor neben anderen pharmazeutisch unbedenklichen Trägern mit amphipatischen Agenzien, wie z.B. Lipiden, die in Aggregatform als Mizellen, unlösliche Monolayer, Flüssigkristalle oder lamellare Schichten, die in wäßriger Lösung, existieren, kombiniert ist. Zu geeigneten Lipiden für die liposomale Formulierung gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, Monoglyceride, Diglyceride, Sulfatide, Lysolecithin, Phospholipide, Saponin, Gallensäuren und dergleichen. Die Herstellung derartige liposomaler Formulierungen liegt im Bereich des fachmännischen Könnens, wie beispielsweise im US-Patent Nr. 4,235,871, US-Patent Nr. 4,501,728, US-Patent Nr. 4,837,028 sowie US-Patent Nr. 4,737,323, die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen sind, offenbart.
Unter dem Begriff „therapeutisch wirksame Menge", wie hier verwendet, versteht man die Gesamtmenge eines jeden aktiven Bestandteils der pharmazeutischen Zusammensetzung oder des Verfahrens, die ausreicht, um einen sinnvollen Nutzen für den Patienten zu zeigen, beispielsweise die Linderung von Symptomen, die Heilung oder eine Erhöhung der Heilungsrate derartiger Erkrankungen. Wird der Ausdruck auf einen individuellen allein verabreichten Wirkstoff angewandt, so bezieht er sich auf diesen Inhaltsstoff allein. Wird der Ausdruck auf eine Kombination angewandt, so bezieht er sich auf die Gesamtmenge der Wirkstoffe, die den Therapieeffekt herbeiführt, gleichgültig ob die Verabreichung in Kombination, nacheinander oder gleichzeitig erfolgt.
Bei der Praktizierung des Behandlungsverfahrens oder der Verwendung der vorliegenden Erfindung wird eine therapeutisch wirksame Menge von isoliertem IL-13bc-Protein oder IL-13bc-Inhibitor einem Säugetier verabreicht. Dabei kann isoliertes IL-13bc-Protein oder IL-13bc-Inhibitor gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren entweder allein oder in Kombination mit anderen Therapien, wie beispielsweise Behandlungen unter Einsatz von Cytokinen, Lymphokinen oder anderen hämatopoetischen Faktoren, verabreicht werden. Bei der Verabrei chung zusammen mit einem oder mehreren Cytokinen, Lymphokinen oder anderen hämatopoetischen Faktoren kann das IL-13bc-Protein oder der IL-13bc-Inhibitor entweder gleichzeitig mit dem Cytokin bzw. den Cytokinen, Lymphokin bzw. Lymphokinen, anderen hämatopoetischen Faktor(en), thrombolytischen oder Anti-Thrombose-Faktoren oder nacheinander verabreicht werden. Erfolgt die Verabreichung nacheinander, so entscheidet der behandelnde Arzt über die geeignete Abfolge der Verabreichung von IL-13bc-Protein oder IL-13bc-Inhibitor in Kombination mit Cytokin(en), Lymphokin(en), anderem bzw. anderen hämatopoetischen Faktor(en), thrombolytischen oder Anti-Thrombose-Faktoren.
Die Verabreichung von IL-13bc-Protein oder IL-13bc-Inhibitor zur Verwendung in der pharmazeutischen Zusammensetzung oder zur Praktizierung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung läßt sich mit einer Vielfalt herkömmlicher Wege, wie beispielsweise orale Einnahme, Inhalation oder kutane, subkutane oder intravenöse Injektion, durchführen. Dabei ist die intravenöse Verabreichung an den Patienten bevorzugt.
Wird eine therapeutisch wirksame Menge von IL-13bc-Protein oder IL-13bc-Inhibitor oral verabreicht, so liegt das IL-13bc-Protein bzw. der IL-13bc-Inhibitor in Form einer Tablette, Kapsel, eines Pulvers, einer Lösung oder eines Elixiers vor. Wird die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung in Tablettenform verabreicht, so kann sie zusätzlich einen festen Träger, wie beispielsweise eine Gelatine oder ein Adjuvans, enthalten. Die Tablette, Kapsel und das Pulver enthalten etwa 5–95% IL-13bc-Protein oder IL-13bc-Inhibitor und vorzugsweise etwa 25–90% IL-13bc-Protein oder IL-13bc-Inhibitor. Erfolgt die Verabreichung in flüssiger Form, so kann ein flüssiger Träger, wie beispielsweise Wasser, Petroleum, tierische oder pflanzliche Öle, wie beispielsweise Erdnußöl, Mineralöl, Sojaöl oder Sesamöl, oder synthetische Öle zugegeben werden. Die Flüssigform der pharmazeutischen Zusammensetzung kann ferner eine physiologische Kochsalzlösung, Dextrose oder eine andere Saccaridlösung oder Glykole, wie beispielsweise Ethylenglykol, Propylenglykol oder Polyethylenglykol, enthalten. Bei der Verabreichung in flüssiger Form enthält die pharmazeutische Zusammensetzung etwa 0,5 bis 90 Gew.-% IL-13bc-Protein oder IL-13bc-Inhibitor und vorzugsweise etwa 1 bis 50 Gew.-% IL-13bc-Protein oder IL-13bc-Inhibitor.
Wird eine therapeutisch wirksame Menge an IL-13bc-Protein oder IL-13bc-Inhibitor über intravenöse, kutane oder subkutane Injektion verabreicht, so liegt das IL-13bc-Protein bzw. IL-13bc-Inhibitor in Form einer pyrogenfreien, parenteral unbedenklichen wäßrigen Lösung vor. Die Herstellung solcher parenteral unbedenklichen Proteinlösungen unter entsprechender Berücksichtigung des pH-Werts, der Isotonie, Stabilität und dergleichen liegt im Bereich des fachmännischen Könnens. Dabei sollte eine bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung zur intravenösen, kutanen oder subkutanen Injektion neben IL-13bc-Protein oder IL-13bc-Inhibitor ein isotonisches Vehikel, wie z.B. Sodium Chloride Injection, Ringer's Injection, Dextrose Injection, Dextrose and Sodium Chloride Injection, Lactated Ringer's Injection, oder ein anderes Vehikel, wie es im Fachgebiet bekannt ist, enthalten. Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann auch Stabilisatoren, Konservierungsstoffe, Puffer, Antioxidantien oder andere dem Fachmann bekannte Additive enthalten.
Die Menge an IL-13bc-Protein oder IL-13bc-Inhibitor in der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung hängt von der Art und Schwere der behandelten Erkrankung sowie von der Art vorhergehender Behandlungen, die der Patient durchlaufen hat, ab. Letztendlich entscheidet der behandelnde Arzt über die Menge an IL-13bc-Protein oder IL-13bc-Inhibitor, mit der jeder einzelne Patient zu behandeln ist. Dabei verabreicht der behandelnde Arzt zunächst geringe Dosen des IL-13bc-Proteins oder des IL-13bc-Inhibitors und beobachtet die Reaktion des Patienten. Größere Dosen an IL-13bc-Protein bzw. IL-13bc-Inhibitor können verabreicht werden, bis die optimale therapeutische Wirkung für den Patienten erzielt wird, wobei an diesem Punkt die Dosierung im allgemeinen nicht weiter erhöht wird. Es ist vorgesehen, daß die verschiedenen, zur Durchführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung verwendeten pharmazeutischen Zusammensetzungen etwa 0,1 μg bis etwa 100 mg IL-13bc-Protein bzw. IL-13bc-Inhibitor pro kg Körpergewicht enthalten sollten.
Die Dauer der intravenösen Therapie unter Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung variiert je nach Schwere der behandelten Krankheit sowie Zustand und potentieller ideosynkratischer Reaktion eines jeden einzelnen Patienten. Es ist vorgesehen, daß die Dauer der Applikation des IL-13bc-Proteins oder IL-13bc-Inhibitors jeweils im Bereich von 12–24 Stunden kontinuierlicher intravenöser Verabreichung liegt. Dabei entscheidet letztendlich der behandelnde Arzt über die angemessene Dauer der intrave nösen Therapie mit der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung.
IL-13bc-Proteine können auch zur Immunisierung von Tieren zur Gewinnung polyklonaler und monoklonaler Antikörper, die spezifisch mit dem IL-13bc-Protein reagieren und die Bindung von IL-13 oder Fragmenten davon an den Rezeptor hemmen können, verwendet werden. Derartige Antikörper können unter Verwendung des gesamten IL-13bc als Immunogen oder durch Verwendung von Fragmenten von IL-13bc, wie beispielsweise des löslichen reifen IL-13bc, erhalten werden. Kleinere Fragmente des IL-13bc können auch zur Immunisierung von Tieren verwendet werden. Die Peptidimmunogene können zusätzlich einen Cysteinrest am Carboxylterminus enthalten, wobei sie mit einem Hapten, wie z.B. KLH (keyhole limpet hemocyanin), konjugiert werden. Zusätzliche Peptidimmunogene können durch Austausch von Tyrosinresten gegen sulfatierte Tyrosinreste erzeugt werden. Verfahren zur Synthese derartiger Peptide sind im Fachgebiet bekannt, beispielsweise wie bei R.P. Merrified, J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149–2154 (1963); J.L. Krstenansky, et al., FEBS Lett. 211, 10 (1987).
Neutralisierende oder nichtneutralisierende Antikörper (vorzugsweise monoklonale Antikörper), die an IL-13bc-Protein binden, können ebenso geeignete Therapeutika für bestimmte Tumore darstellen sowie bei der Behandlung von oben beschriebenen Erkrankungen nützlich sein. Diese neutralisierenden monoklonalen Antikörper können zur Blockierung der IL-13-Bindung an das IL-13bc fähig sein.
Beispiel 1
Isolierung von IL-13bc-cDNAs
Isolierung der Maus-IL-13-Rezeptor-Kette
5 μg PolyA+-RNA wurden aus dem Thymus von 6–8 Wochen alten C3H/HeJ-Mäusen präpariert. Doppelstrangige, hemimethylierte cDNA wurde unter Verwendung des cDNA-Synthesekits von Stratagene gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Dabei wurde kurz gesagt der erste Strang zum Priming mit einem OligodT-Xho-Primer versehen, wobei nach der Synthese des Zweitstranges EcoRI-Adaptoren hinzugegeben wurden und die cDNA mit XhoI verdaut und aufgereinigt wurde. Die cDNA wurde in die XhoI-EcoRI-Stellen des Lambda-Vektors Zap Express (Stratagene) ligiert und unter Verwendung der Verpackungsextrakte Gigapak II Gold (Stratagene) gemäß den Anweisungen des Herstellers verpackt. Eine Bibliothek von 1,5 × 10⁶ erhaltenen rekombinanten Phagen wurde nach den Anweisungen des Herstellers amplifiziert. Diese Bibliothek wurde einem Screening mit einer degenerierten 17mer-Oligonukleotidsonde der Sequenz KSRCTCCABKCRCTCCA (SEQ ID NO:5) (K = G + T; S = C + G; R = A + G; B = C + G + T) unter Verwendung von TMAC-Standardhybridisierungsbedingungen wie beschrieben (Current Protocols In Molecular Biology, Ausbel, et al., Herausgeber, JohnWiley and Sons, 1995, Abschnitt 6.4.3) unterzogen. Der Klon A25 wurde identifiziert, da er an die 17mer-Sonde, jedoch nicht an aus bekannten Hämatopoietin-Rezeptoren stammenden Sonden hybridisierte. Dieser Klon wurde in Plasmidform aus dem ZapExpress-Vektor nach Anweisung des Herstellers isoliert und die DNA-Sequenz bestimmt. Die DNA-Sequenz codierte für ein neues Mitglied der Hämatopoietin-Rezeptorfamilie.
Der das Polynukleotid mit der Sequenz der SEQ ID NO: 1 enthaltende Klon A25 wurde bei der ATCC als pA25pBKCMV mit der Zugangsnummer 69997 am 22. Februar 1996 hinterlegt.
Isolierung der menschlichen IL-13-Rezeptor-Kette
Ein Teilfragment des menschlichen Homologs des Mausrezeptors wurde mittels PCR unter Verwendung von aus der Maussequenz abgeleiteten Oligonukleotiden isoliert. Dabei wurde cDNA aus menschlicher Testis-PolyA+-RNA, die von Clontech erhalten wurde, hergestellt. Ein DNA-Fragment von 274 Basenpaaren wurde aus dieser cDNA mittels PCR mit den folgenden Oligonukleotiden amplifiziert: ATAGTTAAACCATTGCCACC (SEQ ID NO:6) und CTCCATTCGCTCCAAATTCC (SEQ ID NO:7), wobei AmpliTaq-Polymerase (Promega) in 1 × Taq-Puffer mit 1,5 mM MgCl₂ über 30 Inkubationszyklen (94°C × 1 minute, 42°C für 1 Minute, und 72°C für 1 Minute) verwendet wurde. Die DNA-Sequenz dieses Fragments wurde bestimmt, und zwei Oligonukleotide wurden aus einem inneren Teil dieses Fragments mit der folgenden Sequenz hergestellt: AGTCTATCTTACTITTACTCG (SEQ ID NO:8) und CATCTGAGCAATAAATATTCAC (SEQ ID NO:9). Diese Oligonukleotide wurden als Sonden zum Screening einer von Clontech bezogenen menschlichen Testis-cDNA-Bibliothek (Kat.-Nr. HL1161) verwendet. Filter wurden bei 52°C unter Verwendung von 5 × SSC-Standardhybridisierungsbedingungen hybridisiert und in 2 × SSC bei 52°C gewaschen. 22 Klone wurde isoliert, die an beide Oligonukleotide in einem Screen von 400000 Klonen hybridisierten. Die DNA-Sequenz wurde für vier der cDNA-Klone bestimmt, wobei alle Klone für den gleichen neuen Hämatopoietinrezeptor codierten. Die vorhergesagte DNA-Sequenz der menschlichen Rezeptor-Kette voller Länge ist als SEQ ID NO: 3 dargestellt.
Der menschliche Klon wurde bei der ATCC als phA25#11pDR2 mit der Zugangsnummer 69998 am 22. Februar 1996 hinterlegt.
Beispiel 2
Expression von löslichem IL-13bc-Protein und Aktivitätstest
Produktion und Aufreinigung von löslichem IL-13bc-Ig
Für die Aminosäuren 1-331 der extrazellulären Domäne von Maus-IL-13bc codierender DNA wurde mit einer für gly-ser-gly codierenden Spacer-Sequenz mittels PCR fusioniert und im Leseraster mit für die CH₂-CH₃-Hinge-Bereiche des menschlichen IgG 1 codierenden Sequenzen des COS-1-Expressionsvektors pED.Fc ligiert. IL-13bc-Ig wurde von DEAE-Dextrantransfizierten COS-1-Zellen produziert und über Protein-A-Sefarose-Chromatographie (Pharmacia) aufgereinigt.
B9-Proliferationstest
Die Stimulierung der Proliferation von B9-Zellen (Aarden et al. Eur. J. Immunol. 1987. 17:1411–1416) als Reaktion auf IL-13 oder IL-4 wurde über den Einbau von 3H-Thymidin in DNA gemessen. Dabei wurden Zellen (5 × 10³/Loch) in 96-Loch-Platten mit Wachstumsfaktoren in variierenden Konzentrationen enthaltenden Medien in Gegenwart oder Abwesenheit von IL-13bc-Ig bei 1 μg/ml ausgebracht. Nach 3 Tagen Inkubation wurde 1 μ CI/Loch 3H-Thymidin zugegeben und die Zellen weitere 4 Std. inkubiert. Die eingebaute Radioaktivität wurde unter Verwendung eines LKB 1205-Plattenablesegeräts bestimmt.
Die B9-Zelllinie proliferierte als Reaktion auf IL-13, IL-4 oder IL-6. Dabei wurden lediglich Reaktionen auf IL-13 durch das lösliche IL-13bc-Ig gehemmt, was darauf hindeutet, daß dieser Rezeptor IL-13, jedoch nicht IL-4 oder IL-6, spezifisch bindet. In den Tabellen sind CPM angegeben. Zwei separate Experimente sind dargestellt.
Beispiel 3
Mit Oberflächenplasmonresonanz (Biacore-Analyse) gemessene direkte Bindung von löslichem IL-13bc an IL-13
Zur direkten Messung der spezifischen Bindung von IL-13 an gereinigtes IL-13bc-Ig (Pharmacia, Johnsson et al., 1991) wurde ein Biacore-Biosensor verwendet. Dabei wurden ungefähr 10000 bis 17000 Resonanzeinheiten (RU [=Resonance Units]) gereinigtes IL-13bc-Ig, menschliches IgG 1 oder irrelevanter Rezeptor jeweils kovalent an unterschiedlichen Durchflußzellen auf dem Sensorchip, wie vom Hersteller empfohlen, immobilisiert. (Die RU's spiegeln die Masse an an der Sensorchip-Oberfläche gebundenem Protein wider.) Gereinigtes IL-13 wurde über die Durchflußzellen hinweg mit 5 μl/min jeweils 10 min in Gegenwart oder Abwesenheit von überschüssigem gereinigten IL-13bc-Ig injiziert. Die Bindung wurde als Unterschied in den RU vor und nach der Probeninjektion quantifiziert. Eine spezifische IL-13-Bindung von 481,9 RU wurde lediglich für immobilisiertes IL-13bc-Ig beobachtet, wohinge gen die Koinjektion von IL-13 plus IL-13bc-Ig zu keiner Bindung an das immobilisierte IL-13bc-Ig (4RU) führte. Eine IL-13-Bindung wurde weder für immobilisiertes IgG noch für IL-11R-Ig beobachtet (5,4 bzw. 3,7 RU).
Beispiel 4
Bindung von in COS-Zellen exprimiertem IL-13 an markiertes IL-13bc-Ig-Fusionsprotein: COS in-situ-Nachweis von IL-13 mit IL-13bc-Fc
Expressionsvektoren für IL-13, IL-4, IL-11 oder Leervektor wurden in COS-1-Zellen in Platten zur Doppelbestimmung über das DEAE-Dextran-Verfahren transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen zweimal in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und in der Kulturschale 10 Min bei 4°C mit Methanol fixiert. Nach der Fixierung wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und anschließend einmal mit Bindungspuffer (PBS, 1% (w/v) Rinderserumalbumin), (0,1% (w/v) Natriumazid) gespült und 2 Stunden bei 4°C in Bindungspuffer mit IL-13bc-FC bei 1,0 μg/ml oder mit relevanten Anti-Cytokin-Antiseren inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und bei 4°C unter Schütteln in 1:500 verdünntem Bindungspuffer, mit alkalischer Phosphortase markiertem Kaninchen-F(ab) 2'-Anti-Mensch-IgG (für den FC-Fusionsnachweis) oder Kaninchen-F(ab) 2'-Anti-Ratte-IgG (für Anti-Cytokin-Nachweis) inkubiert. Die Zellen wurden wiederum zweimal in PBS gewaschen. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase wurde unter Verwendung von Nitroblau-Tetrazolium und 5-Brom-4-chlor-3-indonylphosphat sichtbar gemacht.
Die spezifische Bindung wurde unter dem Mikroskop beobachtet. Dabei zeigten lediglich mit IL-13 transfizierte Zellen eine spezifische Bindung an IL-13bc-Ig (siehe Foto der transfizierten Zellen, die Figur).
Beispiel 5
Andere Systeme zur Bestimmung der biologischen Aktivität von IL-13bc-Protein
Andere Systeme lassen sich zur Bestimmung davon verwenden, ob ein spezifisches IL-13bc-Protein eine „biologische Aktivität" von IL-13bc, wie hier definiert, zeigt. Nachfolgend sind Beispiele für solche Systeme angegeben.
Tests für die IL-13-Bindung
Die Fähigkeit eines IL-13bc-Proteins zur Bindung von IL-13 oder eines Fragments davon läßt sich mit allen geeigneten Tests, die eine solche Bindung nachweisen können, bestimmen. Es folgen einige geeignete Beispiele.
Die Bindung von IL-13 an den extrazellulären Bereich des IL-13bc-Proteins führt spezifisch zu einer schnellen Induktion von Phosphotyrosin auf dem Rezeptorprotein. Tests zur Ligandenbindungsaktivität, wie sie durch Induktion der Phosphorylierung gemessen wird, sind unten beschrieben.
Als Alternative wird ein IL-13bc-Protein (wie beispielsweise eine lösliche Form der extrazellulären Domäne) produziert und zum Nachweis der IL-13-Bindung verwendet. So wird beispielsweise ein DNA-Konstrukt hergestellt, bei dem die extrazelluläre Domäne (vor, vorzugsweise unmittelbar vor, der vorhergesagten Transmembrandomäne verkürzt) im Leseraster mit einer für die C_H2- und C_H3-Hinge-Domänen eines menschlichen Immunglobulins (Ig) γl codierenden cDNA ligiert wird. Dieses Konstrukt wird in einen entsprechenden Expressionsvektor für COS-Zellen, wie beispielsweise pEDΔC oder pMT2 erzeugt. Das Plasmid wird transient in COS-Zellen transfiziert. Das sezernierte IL-13bc-Ig-Fusionsprotein wird in dem konditionierten Medium gesammelt und durch Protein-A-Chromatographie aufgereinigt.
Das gereinigte IL-13bc-Ig-Fusionsprotein wird zur Demonstration der IL-13-Bindung in einer Reihe von Anwendungen verwendet. IL-13 läßt sich als Beschichtung auf die Oberfläche einer ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)-Platte auftragen, wobei anschließend zusätzliche Bindungsstellen mit Rinderserumalbumin oder Kasein unter Verwendung von Standard-ELISA-Puffern blockiert werden. Das IL-13bc-Ig-Fusionsprotein wird dann an das Festphasen-IL-13 gebunden und die Bindung mit einem mit Meerrettichperoxidase konjugierten sekundären Ziege-Anti-Mensch-Ig nachgewiesen. Die Aktivität von spezifisch gebundenem Enzym läßt sich mit ei nem colorimetrischen Substrat, wie beispielsweise Tetramethylbenzidin, und durch Ablesen der Absorption messen.
IL-13 kann auch auf der Oberfläche von Zellen, beispielsweise durch Bereitstellen einer Transmembrandomäne oder einer Glykosylphosphatidylinositol (GPI)-Verknüpfung, exprimiert werden. Das membrangebundene IL-13 exprimierende Zellen lassen sich mit dem IL-13bc-Ig-Fusionsprotein identifizieren. Die lösliche IL-13bc-Ig-Fusion wird an der Oberfläche dieser Zellen gebunden und mit an einen Fluoreszenzfarbstoff, wie beispielsweise Fluoreszein-Isothiocyanat, konjugierten Ziege-Anti-Mensch-Ig sowie Durchflußcytometrie nachgewiesen.
Interaktionsfalle
Ein gentechnisches Hefeselektionsverfahren, die „Interaction Trap" (Interaktionsfalle) [Gyuris et al, Cell 75:791–803, 1993] läßt sich zur Bestimmung davon verwenden, ob ein IL-13bc-Protein eine biologische Aktivität von IL-13bc, wie hier definiert, aufweist. Bei diesem System hängt die Expression von Reportergenen von sowohl LexAop-Leu2 als auch LexAop-LacZ von der Interaktion zwischen dem Köderprotein, beispielsweise in diesem Fall eine Spezies, die mit menschlichem IL-13bc interagiert, und der Beute, beispielsweise in diesem Fall das menschliche IL-13bc-Protein, ab. Somit kann man die Stärke der Interaktion über das Niveau der Expression von Leu2 oder LacZ messen. Das einfachste Verfahren besteht darin, die Aktivität des von LacZ codierten Proteins, β-Galactosidase, zu messen. Diese Aktivität läßt sich anhand des Grades der Blaufärbung auf dem X-Gal enthaltenden Medium oder Filter beurteilen. Zur quantitativen Messung der β- Galactosidaseaktivität finden sich Standardtests in "Methods in Yeast Genetics" Cold Spring Harbor, New York, 1990 (von Rose, M.D., Winston, F., und Hieter, P.).
Falls man bestimmen möchte, ob das IL-13bc-Protein mit einer bestimmten Spezies (wie beispielsweise einem cytosolischen Protein, das an die intrazelluläre Domäne des IL-13bc in-vivo bindet) interagiert, läßt sich bei derartigen Verfahren diese Spezies als „Köder" in der Interaktionsfalle verwenden, wobei das zu testende IL-13bc-Protein als „Beute" dient, oder umgekehrt.
Beispiel 6
Behandlung von Asthma unter Verwendun von löslichem IL-13bc-Protein
Es wurde ein gut charakterisiertes Mausmodell für allergisches Asthma verwendet, bei dem das Inkontaktkommen mit Allergen zu AHR (Airway Hyper Responsiveness), pulmonaler Eosinophilie, Erhöhungen der Spiegel von antigenspezifischem Serum IgE sowie Steigerungen des Schleimgehalts von Atemwegsepithelien führt (3, 11). Männliche A/J-Mäuse wurden intraperitoneal immunisiert und anschließend einem intratrachealen Challenge mit löslichem Ovalbumin (OVA) ausgesetzt, wobei der allergische Phänotyp 4 Tage nach dem Antigen-Challenge beurteilt wurde (13). Die Blockade von IL-13 wurde durch die systemische Verabreichung eines löslichen IL-13bc-IgGFc-Fusionsproteins (sIL-13bc-Fc), das spezifisch an IL-13 bindet und dieses neutralisiert, 24 Stunden vor dem anschließenden intratrachialen Allergen-Challenge durchgeführt (14). Das Challenge allergen ionisierter Mäuse führte zu signifikanten Erhöhungen der Reagibilität der Atemwege gegenüber Acetylcholin (15) (2A). Die Blockade von IL-13 führte zu einer vollständigen Umkehr einer derartigen etablierten allergeninduzierten AHR; somit ist IL-13 für die Expression von AHR in diesem Modell notwendig. Die Fähigkeit der IL-13-Ablation zur Umkehrung von AHR nach voller Entwicklung des Phänotyps allergischen Asthmas steht im Gegensatz zur Unfähigkeit der IL-4-Ablation zur Erzielung einer derartigen Umkehrung. Der der Wirksamkeit der IL-4Ra-Blockade zugrunde liegende Mechanismus bei der Umkehrung der allergeninduzierten AHR kann in der Hemmung IL-13-vermittelter Vorgänge liegen, was mit der Tatsache übereinstimmt, daß die Stat6-Aktivierung der IL-4Ra-vermittelten Signalgebung bei beiden Cytokinen nachgeschaltet ist. Dabei ist IL-13 vermutlich der für die allergeninduzierte AHR verantwortliche primäre aus CD4+-T-Zellen stammende Faktor.
Zur Beurteilung von der IL-13-abhängigen Expression von AHR zugrunde liegenden Kandidatenmechanismen wurden von uns bekannte allergische Effektorkaskaden charakterisiert. Eosinophile wurden als primäre Effektorzellen mit Asthma und asthmatischer AHR in Zusammenhang gebracht (16), doch wirkte sich die Hemmung von IL-13 vor einer wiederholten Antigenherausforderung nicht signifikant auf die allergeninduzierte pulmonale Eosinophilie (17) aus (2B). Zur Beurteilung der Relevanz IgE-vermittelter Wege wurde von uns OVAspezifisches Serum-IgE gemessen (18). OVA-spezifische IgE-Spiegel wurden in OVA-sensibilisierten und einem OVA-Challenge unterzogenen Mäusen beobachtet, während in mit PBS immunisierten und einem PBS-Challenge unterzogenen Mäusen keine antigen-spezifischen Antikörperspiegel nachgewiesen wurden (2C). Die Blockade von IL-13 führte zu keiner Veränderung OVA-spezifischer IgE-Spiegel, ein Mangel an Supression, der wahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen ist, daß die IL-13-Blockade nach anfänglichem Antigen-Priming und Antikörperbildung stattfand. Trotzdem zeigen diese Ergebnisse, daß AHR in diesem Modell nicht von der IgE-Produktion abhängig ist, was mit Berichten übereinstimmt, daß allergische AHR normalerweise in Mäusen mit IgE-Mangel und B-Zellmangel entwickelt wird (19).
In Kongruenz mit der Pathologie von menschlichem Asthma ist das allergische Asthma in Mausmodellen mit einem deutlichen Anstieg des Schleimgehalts des Atemwegepithels assoziiert (5, 11). Die Hypersekretion von Schleim ist besonders stark in Autopsiepräparaten aus Patienten, die an akuten Asthmaattacken verstorben sind (20). Die Blockade von IL-13 kehrt allergeninduzierte Zunahmen an schleimhaltigen Zellen in den Atemwegen um (3), wodurch demonstriert wird, daß allergeninduzierte Erhöhungen des Schleimgehalts in Atemwegen von IL-13 abhängen. Mit diesem Vorgang wird auch IL-4 in Zusammenhang gebracht, da transgene IL-4-Mäuse eine deutliche Becherzellhyperplasie in Abwesenheit einer Antigensensibilisierung zeigen (5). Allerdings wird durch die Übertragung von Th2-Klonen sowohl aus Mäusen mit IL-4-Mangel als auch Kontrollmäusen in die Atemwege der Maus eine Schleimüberproduktion induziert (21), was wiederum darauf schließen läßt, daß die immunregulatorische Rolle von IL-4 sorgfältig von seiner Rolle als Effektormolekül unterschieden werden muß.
Durch die tägliche Verabreichung von rekombinantem IL-13 (rIL-13) an die Atemwege naiver (nichtimmunisierter) Mäuse wurde AHR induziert, was zeigt, daß Steigerungen der IL-13-Aktivität zur Induktion von AHR ausreichten (4A) (22). AHR entwickelte sich 72 Stunden nach dem Beginn der rIL-13-Verabreichung. Ein signifikanter Einstrom von Eosinophilen in Bronchoalveoläre Lavage wurde früh nach der rIL-13-Verabreichung beobachtet, doch wurde eine pulmonale Eosinophilie zur Zeit der Expression der AHR nicht beobachtet (4B). Obwohl die Signifikanz des zeitlichen Verlaufs des Eosinophileinstroms weiterhin unklar ist, läßt sich daraus schließen, daß IL-13 allein zur Initiierung der eosinophilen Infiltration der Atemwege ausreichend sein kann, vielleicht über seine Fähigkeit zur Heraufregulierung der Chemokinexpression (23). Die Atemwegsverabreichung von rIL-13 führte auch zu einem zeitabhängigen Anstieg des Gesamtserum-IgE (4C) (24), was mit der bereits berichteten Fähigkeit von IL-13 zur Regulation der IgE-Synthese (25) übereinstimmt. Die Erhöhungen des Serum-IgE waren von jeglicher Immunisierung mit Allergen unabhängig, Ergebnisse, die mit der Beobachtung im Einklang stehen, daß der menschliche asthmatische Phänotyp besser mit Gesamtserum-IgE-Konzentrationen als mit allergenspezifischen Serum-IgE-Konzentrationen korreliert (26). Wie aus den obigen Untersuchungen zur IL-13-Hemmung vorhergesagt, wurde durch die Verabreichung von RIL-13 ein Anstieg der Schleimproduktion in den Atemwegen induziert (4D) (27).
Literaturangaben und Anmerkungen

1. R. M. Sly, Ann. Allergy 53,20 (1984); R. Evans et al., Chest 91, 65S (1987); N. Halfon and P. W. Newcheck, Am. J. Pub. Health 76,1308 (1986); R. M. Jackson, M. R. Sears, R. Beaglehole, H. H. Rea, Chest 94,914 (1988); P. J. Gergen und K. B. Weiss, JAMA 264,1688 (1990); W. M. Vollmer, A. S. Buist, M. L.Osborne, J. Clin.Epid. 45,999 (1992).
2. R. Beasley, W. R. Roche, J. A. Roberts, S. T. Holgate, Am. Rev. Respir. Dis. 139,806 (1989); R. Pauwels, Clin. Exp. Allergy 19, 395 (1989); J. Bousquet et al., N. Eng. J. Med. 323,1033 (1990).
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13. 6 Wochen alte männliche A/J-Mäuse wurden von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) bezogen und unter Abzügen mit „Laminar flow" in einem umweltkontrollierten spezifischen krankheitskeimfreien Tierhaus über die Dauer der Experimente gehalten (N = 4-10 Mäuse/Versuchsgruppe). Die hier angegebenen Untersuchungen folgten den Prinzipien für die Forschung mit Labortieren wie durch den Animal Welfare Act (Tierschutzgesetz) und die Richtlinien des Department of Health, Education and Welfare (N.I.H) für die experimentelle Verwendung von Tieren angegeben sind. Mäuse wurden mit einer Intraperitonealinjektion von 10 μg Ovalbumin (OVA; Crude grade IV, Sigma; St. Louis, MO) in 0,2 ml PBS oder von PBS allein immunisiert. 14 Tage nach der Immunisierung wurden die Mäuse mit einem Gemisch aus Ketamin und Xylazin (45 bzw. 8 mg/kg) betäubt und einem intratrachealen Challenge mit 50 μl einer 1,5%igen Lösung von OVA oder einem äquivalenten Volumen PBS als Kontrolle unterzogen. Zehn Tage nach diesem ersten Antigen-Challenge wurden die Mäuse einem erneuten intratrachealen Challenge mit entweder OVA oder PBS unterzogen. Die Charakterisierung des allergischen Phänotyps erfolgte 96 Stunden nach dem zweiten Antigen-Challenge.
14. Menschliches IL-13bc wurde wie oben beschrieben kloniert. Für die lösliche Expression des Maus-Homologs wurde ein für die extrazelluläre Domäne des Maus sIL-13bc kodierende und im Leseraster mit den CH2/CH3-Hinge-Bereichen von menschlichem Igel (wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben) fusionierte DNA enthaltender pED-Expressionsvektor in CHO-Zellen transfiziert [D. D. Donaldson et al., J.Immunol. 161, 2317(1998)]. Das sIL-13bc-Fc wurde mit rProtein A-Sepharose [J. F. Urban et al., Immunity 8, 255 (1998)] aufgereinigt. Der in-vitro-ID₅₀-Wert, wie er anhand der Fähigkeit zur Neutralisierung von 3 ng/ml Maus-IL-13 im B9-Proliferationstest bestimmt wurde, betrug ungefähr 10 ng/ml. Als Kontrolle für sIL-13bc-Fc verwendetes menschliches IgG wurde auf ähnliche Weise mittels rProtein A-Sepharose-Chromatographie aus einer 10%igen Lösung von menschlichem Immunglobulin, die im Handel für die intravenöse Verabreichung erhältlich ist (Miles)[ibid] aufgereinigt. Mäusen wurde sIL-13bc-Fc (400 μg) oder eine äquivalente Menge hu-IgG-Kontrolle durch intraperitoneale Injektion an Tag –1, 0, +1 und +3 des sekundären Antigen-Challenge gegeben.
15. Die Reaktivität der Atemwege auf die intravenöse Verabreichung von Acetylcholin wurde drei Tage nach dem letzten intratrachealen Challenge gemessen (11). Dabei wurden Mäuse mit Natriumpentobarbital (90 mg/kg) betropft, intubiert, mit einer Geschwindigkeit von 120 Atemzüge/Minute mit einem konstanten Luftstromvolumen (0,2 ml) beatmet und mit Decamethoniumbromid (25 mg/kg) gelähmt. Nach Einstellen eines stabi len Luftdrucks wurde Acetylcholin intravenös (50 μg/kg) injiziert und der dynamische Luftdruck fünf Minuten verfolgt.
16. G. J. Gleich, J.All. Clin. Immunol. 8,422 (1990).
17. Die bronchoalveoläre Lavage wurde wie beschrieben ausgeführt (11).
18. Eine Niere wurde entnommen und das gesammelte Blut für die Antikörperanalyse wie beschrieben aufgefangen (11). Serum wurde durch Zentrifugation abgetrennt und bis zur Analyse bei –80°C gelagert. Serum OVA-spezifische IgE-Spiegel wurden mittels Sandwich-ELISA bestimmt. Dabei wurden Proben Löcher mit 0,01 OVA-Lösung in PBS beschichtet, mit 10% FBS in PBS blockiert und mit 0,05 Tween-20 in PBS gewaschen. Serumproben wurden 1:10 und 1:100 mit 10% FBS in PBS verdünnt. Nach einer Inkubation über Nacht wurden die Platten mit 0,05% Tween-20 in PBS gewaschen und mit biotinkonjugiertem Anti-Maus-IgE (PharMingen, San Diego, CA) versetzt. Nach einem Waschschritt wurden 0,0025 mg/ml Avidin-Peroxidase (Sigma) in 10% FBS/PBS zugegeben und die Platten mit ABTS (2,2'-Azino-di[3-ethylbenzthiazonsulfonat]) (Kirkegaard und Perry) entwickelt. Die Platten wurden bei 405 nm innerhalb von 30 Minuten ausgelesen. Die angegebenen OD-Werte stammen von 1:10 verdünnten Serumproben, da sich herausstellt, daß dieses Werte unterhalb des Sättigungspunkts des Tests verglichen mit den OD-Werten von 1:100 mit 10% FBS/PBS verdünnten Serumproben lagen.
19. P. D. Mehlhop et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,1344 (1997); M. Korsgren et al., J. Exp. Med. 185, 885 (1997).
20. T. Aikawa et al., Chest 101, 916 (1992).
21. L. Cohn, R. J. Homer, A. Marinov, J. Rankin, K. Bottomly. J. Exp. Med. 186,1737 (1997).
22. Für eine Honigbiene-Melittin-Leitsequenz [D.C. Tessier, D. Y. Thomas, H. E. Khouri, F. Laliberte, T. Vernet, Gene 2, 177 (1991)] mit daran anschließendem Sechs-Histidin-Tag kodierende DNA wurde über eine Enterokinase-Schnittstelle an den reifen Bereich von Maus-IL-13 bei G1y21 fusioniert und im Säuger-Expressionsvektor pHTop konstruiert. H6-EK-Maus-IL-13-Protein wurde von stabil transfizierten CHO-Zellen produziert und über Ni-NTA-Chromatographie auf eine Reinheit von mehr als 97%, wie durch SDS-PAGE bestimmt, auf gereinigt. Die Proteinkonzentration wurde anhand der Absorption bei 280 nm bestimmt, wobei die Endotoxinverunreinigung weniger als 30 EU/mg betrug, wie mit dem LAL-Test (Cape Cod Associates) gemessen wurde. Der ED₅₀-Wert von H6-EK-Maus-IL-13 wurde mit dem Ba/F3. IL-13R 1-Proliferationstest bestimmt und betrug 1 ng/ml. Maus-rIL-13 (5 μg in einem Gesamtvolumen von 50 μl) wurde mit einem Gemisch aus Ketamin und Xylazin (45 bzw. 8 mg/kg) betäubten naiven Mäusen über intratracheales Einträufeln täglich verabreicht.
23. M. Goebeler et al., Immunol. 91, 450 (1997).
24. Ein Maus-IgE-spezifischer ELISA-Test wurde zur Quantifizierung von Gesamt-IgE-Immunoglobulinspiegeln in Serum unter Verwendung von der Firma PharMingen erhaltener komplementärer Antikörperpaare für Maus-IgE (R35-72 und R35-92) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Proben (einer 1:10-Verdünnung in 10% FBS in PBS) wurden in Doppelbestimmung aus jedem Tier untersucht. Die abgelesenen OD-Werte der Proben wurden in pg/ml-Werte unter Verwendung von aus mit bekannten Konzentrationen von rekombinantem Maus-IgE (5–2000 pg/ml) erzeugten Standardkurven erhaltenen Werten umgewandelt, wobei die Endkonzentration durch Multiplizieren mit dem Verdünnungsfaktor erhalten wurde.
25. C. L. Emson, S. E. Bell, A. Jones, W. Wisden, A. N. J. McKeazie, J. Exp. Med. 188, 399 (1998).
26. L. R. Friedhoff, D. G. Marsh, Int. Arch. All. Immunol. 100, 355 (1993).
27. Zur Untersuchung der Wirkungen von rIL-13 auf den Schleimzellgehalt des Atemwegepithels wurden Lungen entnommen und in 10% Formalin fixiert. Anschließend wurden sie in 70% Ethanol gewaschen, entwässert, in Glykolmethacrylat eingebettet, in 10 μM dicke Schnitte geschnitten, auf Objektträger aufgebracht und mit Hämatoxylin und Eosin sowie Periodsäure-Schiff gefärbt. Es wurden vier Schnitte pro Tier untersucht; pro Lungenschnitt wurden vier Felder bewertet. Die Schnitte wurden auf einer Skala von 1–4 bewertet, wobei 1 keinen Schleimzellgehalt repräsentiert.
28. J. Luyimbazi, X. Xu, M. Wills-Karp, unveröffentlichte Ergebnisse.
29. C.Walker et al., Am. Rev. Respir. Dis. 146, 109 (1992); M. Humbert et al., J. All. Clin. Immunol. 99, 657 (1997); S. K. Huang, J. Immunol. 155, 2688 (1995).
30. D. G. Marsh, et al., Science 264, 1152 (1996).
31. L. J. Rosenwasser. N. Engl. J. Med. 337, 1766 (1977).
32. G. K. Hershey et al., N Engl. J. Med. 337, 1720 (1997).

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines IL-13 Antagonisten zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Erkrankung bei einem Säuger, die in Zusammenhang mit IL-13 steht, wobei dieser Antagonist ein IL-13 Antikörper oder ein an IL-13 bindendes Fragment davon ist, und wobei diese in Zusammenhang mit IL-13 stehende Erkrankung Atopie, eine allergische Erkrankung, Asthma, eine Immunkomplexerkrankung, eine entzündliche Erkrankung der Lunge, eine Immunschwäche oder Krebs ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei diese Erkrankung eine IgE-vermittelte Erkrankung ist.
Die Verwendung gemäß Ansprüchen 1 oder 2, wobei diese Erkrankung Atopie ist.
Die Verwendung gemäß Ansprüchen 1 oder 2, wobei diese Erkrankung eine allergische Erkrankung ist.
Die Verwendung gemäß Ansprüchen 1 oder 2, wobei diese Erkrankung Asthma ist.
Die Verwendung gemäß Ansprüchen 1 oder 2, wobei diese Erkrankung eine Immunkomplexerkrankung ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei diese Immunkomplexerkrankung Lupus, Nephritis, Thyroiditis, Glomerulonephritis, Morbus Basedow oder Nephrotisches Syndrom ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei diese Immunkomplexerkrankung Lupus ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei diese Immunkomplexerkrankung Nephritis ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei diese Immunkomplexerkrankung Thyroiditis ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei diese Immunkomplexerkrankung Glomerulonephritis ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei diese Immunkomplexerkrankung Morbus Basedow ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei diese Immunkomplexerkrankung Nephrotisches Syndrom ist.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei dieser Antagonist ein IL-13 Antikörper ist.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei dieser Antagonist ein an IL-13 bindendes Fragment eines IL-13 Antikörpers ist.
Verwendung eines IL-13 Antagonisten zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der Interaktion von IL-13 mit einem IL-13bc Protein bei einer Erkrankung, die ausgewählt ist aus Atopie, einer allergischen Erkrankung, Asthma, einer Immunkomplexerkrankung, einer ent zündlichen Erkrankung der Lunge, einer Immunschwäche oder Krebs, wobei dieser Antagonist ein IL-13 Antikörper oder ein an IL-13 bindendes Fragment davon ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei diese Immunkomplexerkrankung Lupus, Nephrotisches Syndrom, Nephritis, Thyroiditis, Glomerulonephritis oder Morbus Basedow ist.
Die Verwendung eines IL-13 Antagonisten zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Atopie bei einem Säuger, wobei dieser Antagonist ein IL-13 Antikörper oder ein an IL-13 bindendes Fragment davon ist.