DE69635305T2

DE69635305T2 - Verwendung eines anti-interleukin-9 antikörpers zur herstellung eines medikamentes zur behandlung von asthma

Info

Publication number: DE69635305T2
Application number: DE69635305T
Authority: DE
Inventors: Clifford Roy LEVITT; W. Lee Maloy; U Prasad KARI; Nicolas Nicolaides
Original assignee: Genaera Corp
Current assignee: Ligand Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1995-08-24
Filing date: 1996-08-23
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2016-08-24
Also published as: JP2007169287A; EP2241329A2; EP1632248B8; AU6895696A; WO1997008321A1; JP3948495B2; CA2666298A1; DK1632248T3; ES2354360T3; JP4813380B2; EP2241329A3; EP1632248B1; DK0846173T3; EP0846173B1; CA2230240C; EP1632248A1; DE69635305D1; CA2230240A1; ATE484294T1; JPH11514851A

Description

BEZUGNAHME AUF VERWANDTE ANMELDUNG
Diese Anmeldung ist verwandt mit der US vorläufigen Anmeldung Nr. 60/002,765, die am 24. August 1995 eingereicht wurde.
GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft die Verwendung eines Antikörpers für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Asthma, basierend auf der Beziehung zwischen IL-9 und seinem Rezeptor.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Eine Entzündung ist ein komplexer Prozess, bei dem die Verteidigungssysteme des Körpers gegen fremde Einheiten kämpfen. Obwohl der Kampf des Körpers gegen fremde Einheiten für das Überleben notwendig sein kann, reagieren einige Verteidigungssysteme auf die fremden Einheiten in überschießender Weise, selbst wenn es sich um ungefährliche handelt, und erkennen diese als gefährlich und beschädigen dadurch das umgebende Gewebe in dem darauffolgenden Kampf.
Eine atopische Allergie ist eine ökogenetische Störung, bei der der genetische Hintergrund die Reaktion auf Umweltstimuli diktiert. Die Störung wird allgemein durch eine erhöhte Fähigkeit von Lymphocyten zur Produktion von IgE-Antikörpern als Reaktion auf ubiquitär vorliegende Antigene charakterisiert. Die Aktivierung des Immunsystems durch diese Antigene führt zu einer allergischen Entzündung und kann nach einer Verdauungsaufnahme, Penetration durch die Haut oder nach Inhalation auftreten. Wenn diese Immunaktivierung auftritt und darauf eine Lungenentzündung folgt, wird diese Störung breit als Asthma gekennzeichnet. Bestimmte Zellen sind für diese entzündliche Reaktion kritisch und sie beinhalten T-Zellen und Antigen präsentierende Zellen, B-Zellen, die IgE produzieren und Mastzellen/Basophile und Eosinophile, die IgE binden. Diese Entzündungszellen akkumulieren sich an der Stelle der allergischen Entzündung und die toxischen Produkte, die sie freisetzen, tragen zu der Gewebszerstörung bei, die mit dieser Störung in Bezug steht.
Während Asthma allgemein als entzündliche Störung der Luftwege definiert ist, ergeben sich klinische Symptome aus einer intermittierenden Luftflussobstruktion. Es handelt sich um eine chronisch schwächende Störung, die im Hinblick auf Prävalenz und Schwere anzusteigen scheint¹. Es wird geschätzt, dass 30 bis 40% der Population an einer atopischen Allergie leiden und 15% der Kinder und 5% der Erwachsenen der Population leiden an Asthma. So liegt eine enorme Last auf unseren Gesundheitsvorsorgequellen.
Der Mechanismus der Empfindlichkeit für eine atopische Allergie und Asthma ist noch unbekannt. Interessanter Weise entwickeln nur bestimmte Individuen eine atopische Allergie und ein Asthma, obwohl die meisten Individuen ähnliche Umweltbelastungen erleben. Diese Hyperempfindlichkeit gegenüber Umweltallergien, die als "Atopie" bekannt ist, ist häufig bei erhöhten Serum-IgE-Niveaus oder abnorm starker Hauttestreaktion gegenüber Allergenen bei atopischen Individuen im Vergleich von nonatopischen Individuen indiziert.¹⁰ Deutliche Beweise für eine enge Beziehung zwischen einer atopischen Allergie und Asthma werden von der Tatsache abgeleitet, dass die meisten Asthmatiker klinische und serologische Evidenz einer Atopie aufweisen^4-9. Insbesondere haben jüngere Asthmatiker eine hohe Inzidenz einer Atopie.¹⁰ Zusätzlich stehen immunologische Faktoren, die mit einem Anstieg der Gesamtserum-IgE-Niveaus assoziiert sind, sehr eng in Beziehung mit einer beeinträchtigten Lungenfunktion.³
Sowohl die Diagnose als auch die Behandlung dieser Störungen sind problematisch.¹ Die Bewertung von entzündetem Lungengewebe ist häufig schwierig und häufig kann die Quelle der Entzündung nicht bestimmt werden. Ohne Kenntnis der Quelle der Luftwegsentzündung und einem Schutz vor dem auslösenden Fremdumweltmittel oder den Mitteln kann der entzündliche Prozess nicht unterbrochen werden. Es wird nun allgemein akzeptiert, dass ein Fehlschlagen der Kontrolle der Lungenentzündung zu einem signifikanten Verlust der Lungenfunktion über die Zeit führt.
Gegenwärtige Behandlungen leiden an ihren eigenen Nachteilen. Die Haupttherapeutika, β-Agonisten, reduzieren Symptome, d.h. sie verbessern vorübergehend die Lungenfunktionen, beeinflussen jedoch nicht die zugrundeliegende Entzündung, so dass das Lungengewebe gefährdet bleibt. Zusätzlich führt eine konstante Verwendung von β-Agonisten zu einer Desensibilisierung, was ihre Wirksamkeit und Sicherheit reduziert.² Die Mittel, die die zugrundeliegende Entzündung vermindern können, die antientzündlichen Steroide, haben ihre ei gene bekannte Liste von Nachteilen, die von einer Immunsuppression bis zu einem Knochenverlust reichen kann.²
Aufgrund der Probleme, die mit konventionellen Therapien assoziiert sind, wurden alternative Behandlungsstrategien untersucht.^65-66 Glycophorin A,⁶⁴ Cyclosporin,⁶⁵ und ein Nonoapeptidfragment von IL-2,⁶³ inhibieren alle die Interleukin-2 abhängige T-Lymphocytenproliferation und daher die IL-9-Produktion,⁵¹ es ist jedoch bekannt, dass sie auch viele andere Wirkungen aufweisen.³ Z.B. wird Cyclosporin als immunosuppressives Mittel nach einer Organtransplantation verwendet. Obwohl diese Mittel Alternativen zu den Steroiden für die Behandlung von Asthmatikern darstellen können^63-66, inhibieren sie die Interleukin-2 abhängige T-Lymphocytenproliferation und potentiell kritische Immunfunktionen, die mit einer Homöostase assoziiert sind. Was auf dem Gebiet benötigt wird, ist die Identifizierung eines Stoffwechselweges, der für die Entwicklung von Asthma kritisch ist, der die episodenhafte Natur der Störung und die enge Assoziation mit einer Allergie erklärt, er sich stromabwärts von diesen kritischen Immunfunktionen befindet. Die Natur demonstrierte, dass dieser Weg das geeignete Ziel für eine Therapie ist, da eine biologische Variabilität in der Regel auf diesem Weg existiert und da diese Individuen andererseits im allgemeinen nicht in ihrem Immunsystem komprommitiert oder krank sind, mit Ausnahme ihrer atopischen Symptome.
Aufgrund der Schwierigkeiten, die bei der Diagnose und Behandlung von Asthma angetroffen werden, befindet sich die komplexe Pathophysiologie dieser Störung unter intensiver Betrachtung. Obwohl diese Störung heterogen ist und u.U. schwierig zu definieren, da sie viele Formen annehmen kann, finden sich bestimmte Merkmale bei allen Asthmatikern. Beispiele für solche Merkmale beinhalten erhöhte Serum-IgE-Niveaus, eine abnormale Hauttestreaktion auf eine Allergenaussetzung, eine bronchiale Hyperreaktivität [BHR], eine Bronchodilatator-Reversibilität und eine Obstruktion des Luftflusses.^3-10 Diese Ausprägungen der Asthma-verwandten Phänotypen können als quantitative oder qualitative Messungen untersucht werden.
Erhöhte IgE-Niveaus stehen auch in enger Beziehung zu BHR, einer erhöhten Bronchokonstriktionsreaktion auf eine Vielzahl von Stimuli.^4,6,8,9 Es wird angenommen, dass BHR die Gegenwart einer Luftwegsentzündung reflektiert,^6,8 und es wird angenommen, dass es sich hierbei um einen Risikofaktor für Asthma handelt.^11-12 BHR wird von einer Bronchialentzündung begleitet und einer allergischen Diathese bei asthmatischen Individuen^13-21. Selbst bei Kindern ohne Symptome einer Atopie und Asthma ist eine BHR stark mit erhöhten IgE-Niveaus assoziiert¹⁹.
Eine Anzahl von Studien dokumentieren eine vererbliche Komponente für Atopie und Asthma^4,10,21. Es war jedoch schwierig Familienstudien zu interpretieren, da diese Störungen signifikant durch Alter und Geschlecht beeinflusst werden, wie auch durch viele Umgebungsfaktoren, wie Allergene, virale Infektionen und verschmutzende Stoffe^22-24. Da es außerdem keinen bekannten biochemischen Defekt gibt, der mit einer Empfänglichkeit für diese Störungen assoziiert ist, können die mutierten Gene und ihre abnormalen Genprodukte nur durch die anormalen Phänotypen erkannt werden, die sie erzeugen. So ist es ein wichtiger erster Schritt bei der Isolierung und Charakterisierung einer vererblichen Komponente, das die chromosomalen Stellungen der Gene identifiziert werden.
Cookson et al. stellten die erste Beschreibung einer genetischen Lokalisierung einer vererbten Atopie bereit.²⁵ Diese Untersucher beschrieben Beweise für eine genetische Verbindung zwischen einer Atopie und einem einzelnen Marker auf einem spezifischen chromosomalen Bereich, der als 11q13.1 bezeichnet wurde. Später schlugen sie Beweise für eine mütterliche Vererbung für eine Atopie auf diesem Lokus vor.²⁶ Obwohl die mütterliche Vererbung [genetischer Fingerabdruck] für eine Atopie beobachtet wurde, wurde sie früher nie erklärt. Bemühungen, diese Verbindung zu bestätigen, waren jedoch nicht erfolgreich.^27-31
In der letzten Zeit wurde die β-Untereinheit des hoch affinen IgE-Rezeptors auf das Chromosom 11q kartiert und eine putative Mutation, assoziiert mit einer Atopie wurde auf diesem Gen beschrieben.^32-33 Aufgrund der Schwierigkeiten von anderen diese Verbindung zu replizieren, verbleibt die Signifikanz dieses Gens und des Polymorphismus unklar. Während zusätzliche Studien nötig sein werden, um zu bestätigen, ob diese putative Mutation eine Atopie in der allgemeinen Population auslösen kann, legen Daten, die bis jetzt gesammelt wurden nahe, dass dieser Polymorphismus vermutlich kein häufiger Anlass einer Atopie ist.
Da die Serum-IgE-Niveaus so eng mit dem Ausbruch und der Schwere der Allergie und dem Asthma als klinische Störungen assoziiert sind, fokussierte sich die Aufmerksamkeit auf Studien einer genetischen Regulation von Gesamtserum-IgE-Niveaus. Während Studien der Vergangenheit Beweise für eine Mendelsche Vererbung im Hinblick auf Gesamtserum-IgE-Niveaus bereitstellten,^34-38 eine Indikation der Existenz eines regulatorischen Gens, haben andere Beweise für eine polygenetische Vererbung von IgE, d.h. die Existenz etlicher verantwortlicher Gene gefunden.³⁹
Fachleute haben etliche Gene angetroffen, die für die Regulation von IgE und die Entwicklung oder das Fortschreiten einer Bronchialentzündung, assoziiert mit Asthma, wichtig sein könnten, und zwar auf dem Chromosom 5q. Sie beinhalten Gene, die etliche Interleukine kodieren, wie z.B. IL-3, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, Granulozytenmakrophagenkolonie-stimulierenden Faktor [GM CSF], einen Rezeptor für den Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktor [CSF-1R], Fibroblastenwachstumsfaktor (sauer) [FGFA], wie auch andere.⁴⁰ Beweise aus letzter Zeit von Familienstudien legen eine genetische Verbindung zwischen Serum-IgE-Niveaus und DNA-Markern im Bereich dieser Kandidatengene auf dem Chromosom 5q nahe.^41-42 Zusammengenommen legen diese Untersuchungen nahe, dass eins oder mehrere Hauptgene in der Nachbarschaft des Interleukinkomplexes auf dem Chromosom 5q eine signifikante Menge der beobachteten biologischen Variabilität bei Serum-IgE regulieren, von dem zu vermuten ist, dass es für die Entwicklung von Atopie und Asthma wichtig ist.
Eine Bindung [Geschwisterpaar-Analysen] wurde ebenfalls vorher verwendet, um eine genetische Lokalisierung für BHR zu identifizieren.⁷⁹ Da BHR bekanntlich mit einem Hauptgen für die Atopie assoziiert ist, wurden chromosomale Bereiche, von denen berichtet wurde, dass sie für die Regulation von Serum-IgE-Niveaus wichtig sind, untersucht.⁴² Kandidatenbereiche für eine Atopie wurden durch Bindungsanalysen identifiziert. Diese Studien identifizierten die Existenz eines Hauptgens für eine Atopie auf dem menschlichen Chromosom 5q31–q33.⁴²
Daher wurden zur Bestimmung der chromosomalen Stellung eines Gens [von Genen], das eine Empfänglichkeit gegenüber BHR bereitstellt, und dass als mit einem Hauptgen für die Atopie zusammen vererbt würde, Experimente unter Verwendung von Bindungsanalysen zwischen BHR und genetischen Markern auf dem Chromosom 5q durchgeführt.^42,79,82 Individuen mit BHR wurden durch Reaktivität gegenüber Histamin identifiziert. Marker, die für die Kartierung von mit Asthma in Bezug stehenden Genen nützlich waren, sind in 1 dargestellt.
Spezifisch sind Genkandidaten für Asthma, Bronchialhyperreaktivität und Atopie dargestellt [rechts], und zwar in ihrer ungefähren Stellung relativ zu den dargestellten Markern. Die Karte beinhaltet die Interleukingene IL-4, IL-13, IL-5 und IL-3; CDC25, Zellteilungscyclus-25; CSF2, Granulocyten- Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktor [GMCSF]; EGR1 frühes Wachstumsresponsegen-1; CD14, Zellantigen 14; ADRB2, den β2-adrenergen Rezeptor; GRL1, den Lymphocyten-spezifischen Glucocorticoid-Rezeptor; PDGFR, den Blutblättchen abgeleiteten Wachstumsfaktorrezeptor. Die Banden 5g31–q33 erstrecken sich ungefähr von IL-4 bis D5S410. Die berichteten Abstände sind geschlechtsgemittelte Rekombinationsfraktionen.
Durchgeführte Geschwisterpaaranalysen demonstrierten statistisch signifikante Beweise für eine Verbindung zwischen BHR und D5S436, D5S658 und etlichen anderen Markern, die nahebei auf dem Chromosom 5g31–q33 lokalisiert sind.⁷⁹ Diese Daten unterstützen deutliche die Hypothese, dass ein oder mehr eng beabstandete Gene (ein Gen) auf dem Chromosom 5g31–q33 die Empfänglichkeit gegenüber BHR, Atopie und Asthma bestimmen.^79,80,81,82
Kürzlich wurden auch Verbindungen zwischen dem Asthamphänotyp und genetischen Markern auf dem Chromosom 5g31–q33 demonstriert.⁸³ Dieser Bereich des menschlichen Genoms wurde im Hinblick auf eine Verbindung zu Asthma untersucht, aufgrund der großen Anzahl von Genen, die mögliche Positionskandidaten für die Bereitstellung einer genetischen Empfindlichkeit für Atopie und BHR bereitstellten.
Eine Verbindung wurde unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren demonstriert.^42,83 Spezifisch wurden 84 Familien aus den Niederlanden mit sowohl Geschwisterpaaren als auch LODs im Hinblick auf Marker für diesen selben Bereich auf dem Chromosom 5q analysiert, von denen bereits vorher gezeigt wurde, dass sie mit deiner BHR und Atopie verbunden sind.^42,83 Ein Algorithmus wurde verwendet um die obstruktive Luftwegerkrankung beim Asthmaprobanden und ihren Familien zu kategorisieren. Dieses Klassifizierungsschema basierte wie vorher beschrieben auf der Gegenwart oder Abwesenheit von BHR zu Histamin, respiratorischen Symptomen, signifikanter Rauchgeschichten [< 5 Packungen pro Jahr], Atopie wie definiert durch Hauttestreaktion, Luftwegobstruktion [FEV1% vorhergesagt < 95% CI] und Reversibilität gegenüber einem Bronchodilatator [> 9% vorhergesagt].
Es wurden Beweise für eine Verbindung zwischen Asthma und Markern auf den Chromosom 5q durch durchgeführte Geschwisterpaaranalyse (N = 10, P < 0,05) und durch eine maximale Wahrscheinlichkeitsanalyse mit einem dominanten Modell für den Asthmaphänotyp gefunden.⁸³
Asthma war mit D5S658 mit einem maximalen LOD von 3,64 bei θ = 0,03 unter Verwendung eines dominanten Modells [Klasse 1 betroffen, Klasse 2–4 unsi cher, Klasse 5 nicht betroffen] mit einer Genfrequenz von 0,015 [Prävalenz 3%] verbunden. Ein maximaler LOD von 2,71 bei θ = 0,0 wurde für D5S470 beobachtet, das ungefähr 5 cM Telomer ist oder entfernt von IL-9, relativ zu D5S436.⁸³
Folgend auf die ursprüngliche Einreichung dieser Anmeldung wurde vorge schlagen, dass IL-9 oder ein nahegelegenes Gen vermutlich von wichtiger Verwendung bei Atopie und Asthma sein könnte.⁴³ Der IL-9-Vorschlag basierte auf einer engen Korrelation bei einer statistisch bestimmten Population zwischen log Serumgesamt-IgE-Niveaus und Allelen eines genetischen Markers im IL-9-Gen.⁴³ Dieser Assoziationstyp mit einem oder mehr spezifischen Allelen eines Markers wird als ein "Bindungsungleichgewicht" bezeichnet und legt allgemein nahe, dass ein nahegelegenes Gen die biologische Variabilität, die untersucht wird, bestimmt.⁴⁴
Das IL-9-Gen wurde auf den q31–q33-Bereich des Chromosoms 5 kartiert.⁴⁰ Nur eine Einzelkopie des Gens wird in dem menschlichen Genom angetroffen.^45,46 Eine strukturelle Ähnlichkeit wurde für die menschlichen und murinen IL-9-Gene beobachtet.^45,46 Jedes Gen besteht aus fünf Exons und vier Introns, die sich über ungefähr vier Kb der DNA erstrecken. Die Expression des Gens scheint auf aktivierte T-Zellen begrenzt zu sein.^45,46
Die Funktionen von IL-9 erstrecken sich nun deutlich über die ursprünglich erkannten hinaus. Während IL-9 als T-Zellwachstumsfaktor dient, ist von diesem Cytokin auch bekannt, dass es das Wachstum von Erythroidvorläufern, B-Zellen, Mastzellen und fötalen Thymocyten vermittelt.^45,46 IL-9 wirkt synergistisch mit IL-3 bei der Auslösung einer Mastzellaktivierung und Proliferation.⁴⁷ Dieses Cytokin potenziert auch die IL-4 induzierte Produktion von IgE, IgG und IgM durch normale menschliche B-Lymphocyten.⁴⁷ IL-9 potenziert auch die IL-4 induzierte Freisetzung von IgE und IgG1 durch murine B-Lymphocyten.⁴⁹ Eine kritische Rolle für IL-9 bei der entzündlichen Mukosa-Reaktion auf Parasiteninfektionen wurde ebenfalls demonstriert.^50,51
Zusätzlich zu IL-9 trägt das Chromosom 5q etliche andere Genkandidaten, einschließlich IL-3, IRF1, EGR1, ITK, GRL1, ADRB2, CSF1R, FGFA, ITGA2, CD14, PDGFR, CDC25, CSF2, IL-4, IL-5, IL-12B und IL-13. Diese können alle für eine atopische Allergie und als potentielle Ziele für eine therapeutische Entwicklung wichtig sein. Außerdem fehlt auf dem Gebiet jede Kenntnis im Hinblick darauf, wie die Sequenz von IL-9 oder die Funktion von IL-9 spezifisch mit einer atopischen Allergie, einem Asthma oder einer Bronchialhyperreaktivität in Beziehung steht. Ohne solche Kenntnisse können die Fachleute nicht wissen wie oder ob IL-9 entweder für eine Diagnose oder Behandlung dieser Störungen zu verwenden ist.
Was das Gebiet tatsächlich bereitstellt, ist, dass IL-9 ein neues Cytokin mit einem anscheinenden Molekulargewicht von ungefähr zwischen 20 bis 30 kD, bestimmt durch Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen ist. Es wird als 144 Aminosäureprotein erzeugt, das zu einem 126 Aminosäureglycoprotein verarbeitet wird. Yng et al.⁸⁵ offenbaren, dass die DNA-Sequenz, die IL-9 kodiert, ungefähr 630 Nucleotide umfasst, mit ungefähr 450 Nucleotiden in dem richtigen Leserahmen für das Protein.
Es war ebenfalls auf dem Gebiet bekannt, das multiple Proteinisoforme aus einem einzelnen genetischen Lokus durch alternatives Spleißen erzeugt werden können. Alternatives Spleißen ist ein effizienter Mechanismus, durch den multiple Proteinisoforme von einem einzelnen genetischen Lokus erzeugt werden können. Alternatives Spleißen wird bei terminal differenzierten Zellen verwendet um die Proteineexpression ohne Veränderung des genetischen Gehalts der Zellen reversibel zu modifizieren. Diese Proteinisoforme werden vorzugsweise in unterschiedlichen Geweben oder während unterschiedlichen Stadien der Zelldifferenzierung oder -aktivierung exprimiert. Proteinisoforme können unterschiedliche Funktionen aufweisen und Alms und White haben eine natürlich auftretende Spleißvariante von IL-4, gebildet durch Weglassung von Exon 2 und daher IL-4δ2 genannt, kloniert und exprimiert.⁸⁶ Es wurde beobachtet, dass IL-4δ2 die durch IL-4 induzierte T-Zellproliferation inhibiert.
Auf dem Gebiet fehlt jedoch jede Kenntnis über IL-9-Proteinisoforme, die durch Deletionen durch Exon 2 oder 3 gebildet werden oder über die regulatorischen Funktionen, die von diesen verkürzten Proteinen ausgeübt werden. Insbesondere ist ihre Rolle bei der Regulation der biologischen Aktivität, nämlich der Herabregulation der IL-9-Expression oder -Aktivität unklar. Weiterhin wurde die Bildung solcher Isoforme durch alternatives Spleißen noch nicht beobachtet oder verwendet um Varianten von IL-9 bereitzustellen, die als Agonisten oder Antagonisten des nativen Cytokins fungieren.
Dem Gebiet fehlt auch jede Kenntnis über die Rolle des IL-9-Rezeptors im Hinblick auf mit Asthma in bezug stehende Störungen. Es ist bekannt, dass IL-9 an einen spezifischen Rezeptor bindet, der auf der Oberfläche von Zielzellen exprimiert wird.^46,52,53 Der Rezeptor besteht tatsächlich aus zwei Proteinket ten: eine Proteinkette, die als IL-9-Rezeptor bekannt ist und die spezifisch an IL-9 bindet und einer anderen Proteinkette, wobei es sich um die Kette handelt, die er sich mit dem IL-2-Rezeptor teilt.⁴⁶ Zusätzlich wurde die menschliche IL-9-Rezeptor-cDNA kloniert.^46,52,53 Diese cDNA kodiert ein 522 Aminosäureprotein, das eine signifikante Homologie zu dem murinen IL-9-Rezeptor zeigt. Der extrazelluläre Bereich des Rezeptors ist hoch konserviert mit einer 67%igen Homologie zwischen den murinen und humanen Proteinen. Der Cytoplasmabereich des Rezeptors ist weniger stark konserviert. Die menschliche Cytoplasmadomäne ist sehr viel größer als der korrespondierende Bereich des murinen Rezeptors.⁴⁶
Das IL-9-Rezeptorgen wurde ebenfalls charakterisiert.⁵³ Es wird angenommen, dass es als einzelne Kopie im Mausgenom existiert und aus neuen Exons und acht Introns besteht.⁵³ Das menschliche Genom enthält mindestens vier IL-9-Rezeptorpseudogene. Das menschliche IL-9-Rezeptorgen wurde auf den 320 kb subtelomeren Bereich der Geschlechtschromosomen X und Y kartiert.⁴⁶ Nichtsdestotrotz fehlt trotz dieser Studien auf dem Gebiet jede Kenntnis über eine Beziehung zwischen dem IL-9-Rezeptor und einer atopischen Allergie, Asthma oder einer Bronchialhyperreaktivität.
So fehlt auf dem Gebiet jede Kenntnis, wie das IL-9-Gen, sein Rezeptor und ihre Funktionen mit Asthma in bezug stehen. Daher besteht ein spezifischer Bedarf auf dem Gebiet an einer genetischen Information hinsichtlich Asthma und einer Erhellung der Rolle von IL-9 bei der Ätiologie dieser Störung. Es besteht auch ein Bedarf an einer Erhellung der Rolle des IL-9-Rezeptors und des IL-9-Rezeptorgens bei dieser Störung. Weiterhin besteht insbesondere, basierend auf dieser Kenntnis, ein Bedarf an einer Identifizierung von Mitteln, d.h. Antikörpern, die dazu in der Lage sind, die Wechselwirkung zwischen IL-9 und seinem Rezeptor zur Behandlung dieser Störung zu regulieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Anmelderin hat den lange bestehenden Bedarf an einer Behandlung von Asthma durch Bereitstellung von Informationen, die die Rolle in IL-9 demonstrieren (ebenfalls als Asthma-assoziierter Faktor 1 oder AAFI) bei der Pathogenese dieser Störung befriedigt, wobei diese Information zu Verbindungen geführt hat, die in der Lage sind, die Aktivität von IL-9 zu regulieren. Die Anmelderin hat auch eine konservierte Verbindung und Synteniehomologie zwischen Mäusen und Menschen für ein Gen demonstriert, das die biologische Variabilität bei der Luftweghyperreaktivität bestimmt. Diese Beziehungen identifi zieren spezifisch IL-9 als einen Genkandidaten. Zusätzlich hat die Anmelderin bestimmt, dass IL-9 für eine Anzahl von antigen-induzierten Reaktionen bei Mäusen einschließlich einer Bronchialhyperreaktivität, einer Eosinophilie und erhöhten Zellzahlen bei der Bronchial-Lavage und einem erhöhten Gesamtserum-IgE kritisch ist. Diese Feststellungen typifizieren die allergische Entzündung, die mit einem Asthma assoziiert ist.
Polyklonale und monoklonale Antikörper, die die Bindung von IL-9 an seinen Rezeptor blockieren, werden in dieser Erfindung beansprucht und sind nützliche Therapeutika bei der Behandlung von Asthma.
Die begleitenden Figuren, die in diese Beschreibung inkorporiert sind und einen Teil derselben bilden, illustrieren etliche Ausführungsformen der Erfindung und dienen zusammen mit der Beschreibung zur Erklärung des Prinzips der Erfindung.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Kennzeichnung der Rolle von IL-9 bei der Antigenreaktion in vivo.
2: Histologische Untersuchung von Lungen von Kontrolle, OVA ausgesetzten und anti-IL-9 vorbehandelten Tieren.
3: Inhibition der Antigenreaktion in vivo durch Blockierung von Antikörpern für den murinen IL-9-Rezeptor.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Anmelderin hat die Bedürfnisse auf dem Gebiet gelöst, indem ein IL-9-Weg erhellt wurde und Zusammensetzungen, die diesen Weg beeinflussen, die bei der Diagnose, Verhinderung oder Behandlung von Asthma verwendet werden können. Asthma beinhaltet entzündliche Störungen der Luftwege mit einer reversiblen Luftflussobstruktion.
Eine Luftweg-Hyperreaktivität wird bei im wesentlichen allen Asthmatikern und einigen Stämmen von Inzuchtmäusen angetroffen (DBA/2).⁸⁴ Eine Luftweg-Hyperreaktivität ist ein Risikofaktor für die Entwicklung von Asthma beim Menschen und wird als Tiermodell für Asthma als physiologisches Maß zur Bewertung der Wirksamkeit einer Behandlung von Asthma verwendet. Diese Daten, zusammen mit den menschlichen⁷⁹ und murinen genetischen Kartierungsergebnissen (siehe Beispiele 1 und 2) legen eine kritische Rolle für das murine IL-9-Genprodukt bei der Luftwegreaktion der Mäuse nahe. Insbesondere unterscheiden sich die hyperreaktiven DBA/2(D2)-Mäuse von den C57BL/6(B6) hyperreaktiven Mäusen⁸⁴ in ihrer Expression von Gleichgewichtszustandsniveaus von IL-9 (siehe Beispiel 14). Weiterhin kann die Vorbehandlung mit blockierenden Antikörpern gegen IL-9/IL-9-Rezeptor optional einen vollständigen Schutz gegen eine antigeninduzierte Luftweg-Hyperreaktivität und eine Entzündung bei Mäusen bereitstellen, was eine kritische regulatorische Rolle für IL-9 bei diesen Immunreaktionen demonstriert. So demonstrieren diese Daten, dass obwohl unterschiedliche molekulare Veränderungen eine biologische Variabilität bei der Luftweg-Reaktivität bei Menschen und Mäusen erzeugt, diese Veränderungen sich von demselben Gen (Genen) (IL-9/IL-9R) ergeben, die diesen weg regulieren. Zusammengenommen bestätigen diese Beobachtungen die kritische Rolle von IL-9 und dem IL-9-Rezeptor bei der Luftweg-Hyperreaktivität, Asthma und atopischer Allergie. Weiterhin demonstrieren diese Daten, dass die konventionellen Mittel, die die Wechselwirkung von IL-9 mit einem Rezeptor blockieren, gegen eine antigeninduzierte Reaktion schützen, wie die oben detailliert erklärten.
Weitere Beweise, die die kritische Rolle von IL-9 bei der Pathogenese von Asthma definieren, stammen direkt von den Beobachtungen der Anmelderin ab, dass IL-9 für eine Anzahl von antigeninduzierten Rektionen bei Mäusen kritisch ist. Wenn die Funktionen von IL-9 durch eine Antikörpervorbehandlung vor einer Aerosolaussetzung mit Antigen herab reguliert werden, können die Tiere vollständig vor den antigeninduzierten Reaktionen geschützt werden. Die Reaktionen beinhalten: Bronchialhyperreaktivität, Eosinophilie und erhöhte Zellzahlen in der Bronchial-Lavage, histologische Veränderungen in der Luge, assoziiert mit einer Entzündung und erhöhte Gesamtserum-IgE-Niveaus. So liegt die Behandlung solcher Reaktionen, die die mit Asthma assoziierte allergische Entzündung kennzeichnen, durch Herabregulation der Funktionen von IL-9 im Umfang dieser Erfindung.
Der Fachmann würde leicht erkennen, dass alle Moleküle, die die benötigte dreidimensionale strukturelle Konformationen und die für die Rezeptorbindung essentiellen oder kritischen Reste enthalten im Umfang der Erfindung liegen.
Die Demonstration einer IL-9-Sequenz, assoziiert mit einem asthmaähnlichen Phänotyp und einer, assoziiert mit dem Fehlenden eines asthmaähnlichen Phänotyps zeigt an, dass die entzündliche Reaktion der Lungen gegenüber dem Antigen von IL-9 abhängt und dass daher die Herabregulation der Funktion von IL-9 gegen die antigeninduzierte Reaktion schützen soll.
Ein Rezeptor ist eine lösliche oder membrangebundene Komponente, die ein Molekül bindet und dieses erkennt und der IL-9-Rezeptor (auch bekannt als asthmaassoziierter Faktor 2 oder AAF2) der Erfindung ist die Komponente, die IL-9 erkennt und daran bindet. Die Funktionen des IL-9-Rezeptors bestehen aus der Bindung an das IL-9 ähnliche Molekül und der Propagation des regulatorischen Signals in spezifischen Zellen.^57-60 Eine Unterbrechung dieser Funktion wird zu einer Herabregulation führen, d.h. einer Reduktion von entweder Expression von IL-9 oder den durch IL-9 kontrollierten Funktionen. Dementsprechend werden durch diese Wechselwirkung zwischen IL-9 und dem IL-9-Rezeptor bestimmte Funktionen des Organismus moduliert oder kontrolliert. Für eine allgemeine Diskussion von Rezeptoren, siehe Goodman and Gilman's, The Pharmacologic Basis of Therapeutics (Seventh Edition, MacMillan Publishing Company, N.Y. USA, 1985).
Die Erfindung involviert die Behandlung von Asthma.
Zusätzlich stellt diese Erfindungen auch Verbindungen bereit, die die Synthese von IL-9 oder dem IL-9-Rezeptor verhindern oder ihre biologische Stabilität reduzieren.
Gemäß anderen Ausführungsformen sind die Agonisten und Antagonisten der Erfindung Antikörper gegen IL-9 und den IL-9-Rezeptor. Die Antikörper gegen IL-9 und seinen Rezeptor können entweder monoklonal oder polyklonal sein, hergestellt unter Verwendung von Standardverfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind (siehe Harlow & Lane's, Antibodies – A Laboratory Manuel (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Sie können verwendet werden, um IL-9 an seiner Bindung an den Rezeptor zu hindern. In einer Ausführungsform treten die Antikörper in Weselwirkung mit IL-9. In einer anderen Ausführungsform treten die Antikörper in Wechselwirkung mit dem IL-9-Rezeptor. Das zur Erzeugung dieser Antikörper verwendete IL-9 kann jede der oben diskutierten IL-9-Varianten sein.
Antikörper werden auch aus Peptidsequenzen von IL-9 oder dem IL-9-Rezeptor unter Verwendung von Standardverfahren auf dem Gebiet erzeugt (siehe Protocols in Immunology, Kapitel 9, Wiley). Die Peptidsequenzen des murinen IL-9-Rezeptors, die zur Erzeugung von blockierenden Antiseren verwendet werden können, wurden wie folgt identifiziert: GGQKAGAFTC (Reste 1–10) (SEQ ID NO: 19); LSNSIYRIDCHWSAPELGQESR (Reste 11–32) (SEQ ID NO: 20); und CESYEDKTEGEYYKSHWSEWS (Reste 184–203 mit einem Cys-Rest, der zum N-Terminus zugefügt wurde, zur Kopplung des Peptids ans Trägerprotein) (SEQ ID NO: 21). Zusätzlich wurde ein Epitop, das an einen blockierenden Antikörper bindet, gerichtet gegen den menschlichen IL-9-Rezeptor als Reste 8–14 auf dem reifen IL-9-Rezeptor identifiziert (TCLTNNI) (SEQ ID NO: 22) und zwei Epitope, die an blockierende Antikörper binden, gerichtet gegen menschliches IL-9 wurden ebenfalls identifiziert, und zwar als Reste 50–67 (CFSERLSQMTNTTMQTRY) (SEQ ID NO: 23) und Reste 99–116 (TAGNALTFLKSLLEIFQK) (SEQ ID NO: 16). Die menschlichen Epitope wie auch die menschlichen Peptide, die zu den Peptiden korrespondieren, die blockierende Antikörper in den murinen Sequenzen erzeugen, sind höchst wahrscheinlich für die Erzeugung therapeutischer Antikörper nützlich.
Zusätzlich beinhaltet die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend die Verbindungen der Erfindung zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger. Pharmazeutisch akzeptable Träger können sterile Flüssigkeiten sein, wie z.B. Wasser und Öle, einschließlich diejenigen von Erdöl, tierischen, pflanzlichen oder synthetischen Ursprung, wie z.B. Erdnussöl, Sojaöl, Mineralöl, Sesamöl und ähnliche. Wasser ist ein bevorzugter Träger, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung intravenös verabreicht werden soll. Salzlösungen und wässrige Dextrose und Glycerinlösungen können ebenfalls als flüssige Träger verwendet werden, insbesondere für injizierbare Lösungen. Geeignete pharmazeutische Träger werden in Martin, E. W., Remington's Pharmaceutical Science beschrieben.
Die in dieser Erfindung verwendeten Antikörper können systemisch oder topisch verabreicht werden, abhängig von Betrachtungen im Hinblick auf den zu behandelnden Zustand, einen Bedarf an einer ortspezifischen Behandlung, die Menge des zu verabreichenden Arzneimittels und ähnliche Betrachtungen.
Es kann eine topische Verabreichung verwendet werden. Jede übliche topische Formulierung, wie eine Lösung, Suspension, Gel, Salbe oder Paste und ähnliche können verwendet werden.
Die Herstellung solcher topischen Formulierungen ist auf dem Gebiet der pharmazeutischen Formulierungen sehr gut beschrieben, wie beispielhaft dargestellt z.B. in Remington's Pharmaceutical Science, Ausgabe 17, Mack Publishing Company, Easton, Pa. Für die topische Anwendung könnten diese Verbindungen auch als Pulver oder Spray, insbesondere in Aerosolform verabreicht werden. Der Wirkstoff kann in pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden, die an eine systemische Verabreichung angepasst sind. Wie bekannt ist, kann ein Arzneimittel, wenn es systemisch verabreicht werden soll, als Pulver, Pille, Tabletten oder ähnliches oder als Sirup oder Elixier für die orale Verabreichung formuliert werden. Für die intravenöse, intraperitoneale oder intralesionale Verabreichung wird die Verbindung als Lösung oder Suspension hergestellt werden, die durch Injektion verabreichbar ist. In bestimmten Fällen kann es nützlich sein, diese Verbindungen als Suppositorium oder als Formulierung mit verzögerter Freisetzung als Depot unter der Haut oder für die intramuskuläre Injektion zu formulieren. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden die Verbindungen dieser Erfindung durch Inhalation verabreicht. Für die Inhalationstherapie kann die Verbindung in einer Lösung vorliegen, die für die Verabreichung durch Inhalatoren mit abgemessenen Dosierungen nützlich ist oder in einer Form, die für einen Trockenpulverinhalator geeignet ist.
Eine effektive Menge ist diejenige Menge, die entweder die Expression von IL-9 oder die durch IL-9 kontrollierte Funktionen herabregulieren wird. Eine gegebene effektive Menge wird von Zustand zu Zustand variieren und kann in bestimmten Fällen je nach Schwere des zu behandelnden Zustands und der Empfänglichkeit des Patientens gegenüber der Behandlung variieren. Dementsprechend wird eine gegebene effektive Menge am besten zu dem Zeitpunkt und an dem Ort durch Routineexperimente bestimmt. Es wird jedoch vorhergesagt, dass bei der Behandlung von mit Asthma in Beziehung stehenden Störungen gemäß der vorliegenen Erfindung eine Formulierung, enthaltend 0,001 bis 5 Gew.-%, vorzugsweise ungefähr 0,01 bis 1% in der Regel eine therapeutisch effektive Menge bilden wird. Wenn sie systemisch verabreicht wird, wird eine Menge zwischen 0,01 bis 100 mg pro kg Körpergewicht pro Tag, vorzugsweise ungefähr 0,1 bis 10 mg/kg in den meisten Fällen eine therapeutische Wirkung bewirken.
Die Anmelderin stellt auch ein Verfahren für ein Screening auf Verbindungen bereit, die die Expression von IL-9 oder die durch IL-9 kontrollierten Funktionen herabregulieren. Man kann bestimmen, ob die durch IL-9 exprimierten Funktionen herabreguliert werden, indem auf dem Gebiet standardisierte Verfahren verwendet werden.^57-60 In einer spezifischen Ausführungsform stellt die Anmelderin ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen bereit, deren Funktionen mit Met IL-9 vergleichbar sind. So kann in einer Ausführungsform Gesamtserum-IgE unter Verwendung von auf dem Gebiet wohl bekannten Techniken⁴² gemessen werden, um die Wirksamkeit einer Verbindung für die Herabregulation der Funktionen von IL-9 in vivo zu bestimmen. In einer anderen Ausführungsform kann eine bronchiale Hyperreaktivität, bronchiolveolare Lavage und eine Eosinophilie unter Verwendung von auf dem Gebiet bekannten Techniken⁴² gemessen werden, um die Wirksamkeit einer Verbindung bei der Herabregulation der Funktionen von IL-9 in vivo zu bestimmen. In noch einer weiteren Ausführungsform können die Funktionen von IL-9 in vivo bewertet werden. Wie dem Fachmann be kannt, induziert menschliches IL-9 spezifisch die schnelle und vorübergehende Tyrosinphophorylierung von multiplen Proteinen in MO7e-Zellen. Die Tyrosinphosphorylierung von Stat3-Transkriptionsfaktor scheint spezifisch mit den Wirkungen von IL-9 verbunden zu sein. Ein anderes Verfahren zur Kennzeichnung der Funktion von IL-9 und IL-9-ähnlichen Molekülen, das von der "stabilen Expression" des IL-9-Rezeptors abhängt, verwendet die wohl bekannten murinen TS1-Klone um die menschliche IL-9-Funktion mit einem zellulärem Proliferationsassay zu bewerten.⁵⁹
Die Erfindung beinhaltet auch einen einfachen Screeningassay für eine gesättigte und spezifische Ligandenbindung, basierend auf Zelllinien, die den IL-9-Rezeptor exprimieren.^46,54 Der IL-9-Rezeptor wird auf einer großen Vielzahl von Zelltypen exprimiert, einschließlich K562, C8166-45, B-Zellen, T-Zellen, Mastzellen, Neutrophilen, Megakaryocyten (UT-7-Zellen),⁵³ der menschlichen Megakaryoblasten-Leukämiezelllinie MO7e,⁵⁷ TF1,⁵⁹ Makrophagen, fötalen Thymocyten, der menschlichen Nierenzelllinie 293,⁵³ und den Mausembryo-Hippocampus-Vorläuferzelllinien.^46,52,53 Gemäß einer anderen Ausführungsform kann ein löslicher IL-9-Rezeptor verwendet werden, um eine Ligandenbindung und potentielle Rezeptorantagonisten zu bewerten.
Die Praxis der vorliegenden Erfindung wird die für die Molekularbiologie, Pharmakologie, Immunologie und Biochemie konventionellen Bezeichnungen und Techniken verwenden, die im Wissen des gewöhnlichen Fachmanns auf dem Gebiet liegen. Siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press [1985], oder Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology, John Wile & Sons, Inc. [1994].
BEISPIEL 1
Die Rolle von IL-9 in Mausmodellen von Asthma:
Die Luftwegreaktion von nicht-sensibilisierten Tieren
Tiere
Zertifizierte virusfreie männliche Mäuse im Alter von 5 bis 6 Wochen wurden von dem Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erhalten. Die Tiere wurden in hoch-effizienten, teilchengefilterter Luft (HEPA) laminären Flusshüllen in einer virus- und antigenfreien Einrichtung beherbergt und es wurde ihnen freier Zugang zu Nagetierfutter in Pelletform und Wasser für 3 bis 7 Tage vor einer experimentellen Manipulation gewährt. Die Tiereinrichtungen wurden bei 22°C gehalten und der Licht:Dunkel-Zyklus wurde automatisch kontrolliert (10:14 Std. Licht:Dunkel). Männliche und weibliche DBA/2(D2), C57BL/6(B6) und (B6D2)F1 (F1) Mäuse mit einem Alter von 5 bis 6 Wochen wurden von Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, käuflich erworben oder vom National Cancer Institute, Frederick, MD. BXD-Mäuse wurden vom Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME erhalten. Nahrungsmittel und Wasser standen ad libitum zur Verfügung.
Phänotypisierung und Wirksamkeit der Vorbehandlung
Um die bronchokonstriktive Reaktion zu bestimmen, wurde der respiratorische Systemdruck in der Trachea und vor und während einem Aussetzen gegenüber dem Arzneimittel festgehalten. Die Mäuse wurden anästhesiert und, wie früher beschrieben, instrumentell bearbeitet. (Levitt RC und Mitzner W., FASEB J 2: 2605–2608 (1988); Levitt RC. und Mitzner W., J Appl Physiol 67(3): 1125–1132 (1989); Kleeberger S., Bassett D., Jakab GJ. Und Levitt RC., Am J Physiol 258(2) L313–320 (1990): Levitt RC., Pharmacogenetics 1: 94–97 (1991); Levitt RC., und Ewart SL.; Am J of Respir Crit Care Med 151: 1537–1542 (1995); Ewart S., Levitt RC. und Mitzner W., In press, J Appl Phys (1995). Eine Luftwegreaktivität wurde mit einem oder mehreren der Folgenden gemessen: 5-Hydroxytryptamin (5HT) (Sigma). Eine zusätzliche Verzweigungskonstruktion, die verwendet werden kann ist Acetylcholin (Sigma), Atracurium (Glaxo Welcome). Ein einfaches und wiederholbares Maß der Veränderung von Ppi, folgend auf eine bronchiokonstriktive Aussetzung wurde verwendet und wurde als Airway Pressure Time Index (APTI) bezeichnet (Levitt RC. und Mitzner W., FASEB J 2: 2605–2608 (1988); Levitt RC. und Mitzner W., J Appl Physiol 67(3): 1125–1132 (1989). Der APTI wurde durch Veränderung des Peak-Inspirationsdrucks (Ppi) bewertet, integriert vom Zeitpunkt der Injektion bis dass der Peakdruck auf eine Basislinie zurückkehrte oder ein Plateau bildete. Der APTI war mit der Luftwegresistenz vergleichbar (Rrs), jedoch beinhaltete APTI eine zusätzliche Komponente in Beziehung zu der Erholung von der Bronchokonstriktion.
Die Stammverteilung der bronchialen Reaktivität wurde bei multiplen Inzucht-Mausstämmen in vorherigen Studien identifiziert (Levitt RC. und Mitzner W., FASEB J 2: 2605–2608 (1988); Levitt RC. und Mitzner W., J Appl Physiol 67(3): 1125–1132 (1989). Rrs und/oder APTI wurden in A/J, C3H/HeJ, DBA/2J, C57BL/6J Mäusen bestimmt.
Vor der Opferung wurde das gesamte Blut für Serum-IgE-Messungen durch Nadelpunktierung der Vena cava in ferior bei vollständig anästhesierten Tieren gesammelt. Die Proben wurden zum Abtrennen von Zellen abzentrifugiert und Serum wurde gesammelt und verwendet um Gesamt-IgE-Niveaus zu messen. Die nicht gemessenen Proben wurden direkt bei –20° eingefroren.
Eine bronchialveoläre Lavage und zelluläre Analysen wurden wie an anderer Stelle beschrieben durchgeführt (Kleeberger et al., 1990).
Alle IgE-Serumproben wurden unter Verwendung eines ELISA-Antikörper-Sandwichassays gemessen. Mikrotiterplatten (Corning #2585096, Corning, NY) wurden beschichtet, mit 50 μl pro Vertiefung, und zwar mit einem Ratten-Anti-Maus-IgE-Antikörper (Sourthern Biotechnology #1130-01, Birmingham, AL) mit einer Konzentration von 2,5 μg/ml in Beschichtungspuffer von Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat mit Natriumazid (Sigma #S-7795, #S-6014 und #S-8032, St Louis, MO). Die Platten wurden mit einer Plastikhülle bedeckt und für 16 Stunden bei 4°C inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit einem Waschpulver von 0,05% Tween-20 (Sigma #P-7949) gewaschen, in phosphatgepufferter Salzlösung (BioFluids #313, Rockville, MD), wobei für fünf Minuten für jede Waschung inkubiert wurde. Die Blockierung nicht-spezifischer Bindungsstellen wurde durch Zugabe von 200 μl pro Vertiefung von 5%igem Rinderserumalbumin (Sigma #A-7888) in PBS bewirkt, Abdecken mit einer Plastikhülle und Inkubation für 2 Stunden bei 37°C. Nach dreimaligem Waschen mit Waschpuffer wurden Duplikat-50 μl-Testproben den Vertiefungen zugefügt. Die Testproben wurden nach einer 1:10, einer 1:50 und einer 1:100 Verdünnung mit 5% BSA in Waschpuffer bewertet. Zusätzlich zu den Testproben wurde ein Satz IgE-Standards (PharMingen #03121D, San Diego, CA) bei Konzentrationen von 0,8 ng/ml bis 200 ng/ml in 5% BSA in Waschpuffer bewertet, um eine Standardkurve zu erzeugen. Eine Leerprobe ohne Probe oder Standard wurde verwendet, um die Plattenablesevorrichtung auf Null einzustellen (Hintergrund). Nach Zugaben von Proben und Standards wurde die Platte mit einer Plastikhülle bedeckt und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem waschen mit Waschpuffer wurden 50 μl eines zweiten Antikörper-Ratten-Anti-Maus-IgE-Meerrettichperoxidasekonjugats (PharMingen #02137E) mit einer Konzentration von 250 ng/ml in 5% BSA in Waschpuffer zugefügt. Die Platte wurde mit einer Kunststoffhülle abgedeckt und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit Waschpuffer wurden 100 μl des Substrats 0,5 mg/ml O-Phenylamindiamin (Sigma #P-1526) in 0,1 M Citratpuffer (Sigma #C-8532) jeder Vertiefung zugefügt. Nach 5 bis 10 Minuten wurde die Reaktion mit 50 μl 12,5% H₂SO₄ (VWR #33-70-4, Bridgeport, NJ) beendet und die Absorption bei 490 nm auf einer Dynatech MR-5000-Plattenablesevorrichtung (Chantilly, VA) gemessen. Eine Standardkurve wurde aus den Standard-IgE-Konzentrationen mit einer Antigenkonzentration auf der x-Achse (log-Skala) und einer Absorption auf der y-Achse (lineare Skala) konstruiert. Die Konzentration von IgE in den Proben wurde aus der Standardkurve interpoliert.
BEISPIEL 2
Die Rolle von IL-9 in murinen Modellen von Asthma:
Die Luftwegreaktion bei sensibilisierten Tieren
Tiere, Phänotypisierung und Optimierung der Antigensensibilisierung
Die Tiere und ihre Behandlung waren essentiell dieselben wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Sensibilisierung mit Truthahneialbumin (OVA) und eine Aerosolaussetzung wurden durchgeführt, um die Wirkung von BHR, BAL und Serum-IgE zu bewirken. OVA wurde I. P. (25 μg) am Tag 0 vor OVA oder einer Salzaerosolisierung injiziert. Die Mäuse wurden mit OVA oder Salzaerosolisierung antigenausgesetzt, die einmal täglich für 5 bis 7 Tage gegeben wurden, beginnend entweder am Tag 13 oder 14. Phänotypische Messungen von Serum-IgE, BAL und BHR wurden am Tag 21 durchgeführt. Die Wirkung einer 7-tägigen OVA-Aerosolaussetzung auf die bronchiokonstriktive Antigenaussetzung mit 5-HT und Acetylcholin wurden zusammen mit Gesamtserum-IgE, BAL-Gesamtzellzahlen und Differentialzellzahlen und der Bronchialreaktivität bewertet. Die Wirkung des Antikörpers (Ab) oder einer Salzvorbehandlung auf Salzaerosol oder OVA-Aerosol induzierte Lungenentzündung wurde unter Messung von BHR, BAL und Serum-IgE überprüft. Der Antikörper wurde I. P. 2 bis 3 Tage vor der Aerosolisierung von Salzlösung oder OVA verabreicht.
Eine Lungenhistologie wurde durchgeführt, nachdem die Lungen während einer tiefen Anästhesie entfernt wurden. Da vorherige Instrumentalisierung zu Artefakten führen kann, wurden getrennte Tiere für diese Studien verwendet. So wurde eine kleine Gruppe von Tieren parallel exakt wie in der Kohorte behandelt, die verschiedene Vorbehandlungen durchliefen, außer dass diese Tiere für andere Test außer der Bronchialreaktivität nicht verwendet wurden. Nach dem Test auf Bronchialreaktivität wurden die Lungen entfernt und in flüssigen Stickstoff eingetaucht. Eine Kryosektion und histologische Überprüfung wurden auf Routineweise durchgeführt.
Polykonale neutralisierende Antikörper für murines IL-9 wurden von R & D Systems, Minneapolis, MN käuflich erworben und blockierende Antikörper für murinen IL-9-Reseptor wurden von Magainin Pharmaceuticals Inc. Durch Lampine Biological Labatories, Ottsville, PA unter Verwendung von bei Magainin produzierten Peptidkonjugaten erzeugt. Die polyklonalen Antiseren wurden im Kaninchen gegen Peptidsequenzen des murinen IL-9-Rezeptors hergestellt. Die zur Produktion der Antiseren verwendeten Peptide waren: GGQKAGAFTC (Reste 1–10)(SEQ ID NO: 19); LSNSIYRIDCHWSAPELGQESR (Reste 11–32)(SEQ ID NO: 20); und CESYEDKTEGEYYKSHWSEW (Reste 184–203 mit einem Cys-Rest, der zum N-Terminus zugefügt wurde zur Kopplung des Peptids ans Trägerprotein)(SEQ ID NO: 21). Die Antiseren wurden unter Verwendung von Techniken erzeugt, die in Protocols in Immunology, Kapitel 9, Wiley beschrieben werden. Kurz gefasst werden die Peptide an das Trägerprotein, Schlüsselloch-Napfschnecken, Hämocyanin (Sigma) durch die Seitenkette des Cys-Rests unter Verwendung des bifunktionellen Vernetzungsmittels MBS (Pierce) gekoppelt. Peptidkonjugate wurden verwendet um Kaninchen zu immunisieren, mit geeigneten Adjuvanzien und nützliche Antiseren wurden nach etlichen Boosterinjektionen des Peptidkonjugats erhalten. Die Antikörper wurden therapeutisch verwendet, um die Funktion von IL-9 herabzuregulieren und die Wichtigkeit dieses Wegs zu einer Grundlinien-Lungenreaktivität, Serum-IgE und BAL in den nicht-sensibilisierten Mäusen zu bewerten. Nach einer Antikörpervorbehandlung wurden Grundlinien-BHR, BAL und Serum-IgE-Niveaus relativ zu Kontrollen bestimmt. In zusätzlichen Experimenten wurden rekombinante humane und murine IL-9 I. P. einen Tag vor und täglich während der Antigensensibilisierung (Tage 13–18) verabreicht. Die Tiere wurden dann wie beschrieben phänotypisiert.
Die phänotypische Reaktion eines repräsentativen Tiers, behandelt mit Salzlösung I. P. am Tag null und an den Tagen 14–20 mit Salzlösung Antigen ausgesetzt (wie beschrieben in Beispiel 1) wird in 1 Panel 1 (oben) dargestellt. Das Grundlinien-(Kontroll-)Serumgesamt-IgE betrug 9,2 ng/ml. Bronchoalveroläre Lavage (BAL) Gesamtzellzahlen zeigten 182.500 Zellen pro ml BAL. Diese Tiere zeigten keine Bronchialhyperreaktivität im Vergleich mit historischen Kontrollen (Levitt RC. und Mitzner W., J Appl Physiol 6(3): 1125–1132; 1989).
1 Panel 2 (oben Mitte) zeigt ein repräsentatives Tier von einer Gruppe, präsensibilisiert mit OVA I. P. am Tag null und mit Salzlösung an den Tagen 14–20 Antigen ausgesetzt. Diese Tiere unterschieden sich in ihrer Reaktion zu Bronchiokonstriktor, Serum-IgE oder BAL-Zellzahlen nicht von den unsensibilisierten Mäusen (7 oberes Panel).
1 Panel 3 (untere Mitte) zeigt ein repräsentatives Tier von den mit OVA I. P. am Tag null vorsensibilisierten und mit Antigen (OVA) an Tagen 14–20 Antigen ausgesetzten. Diese Tiere entwickelten eine Bronchialhyperreaktivität (auf ungefähr zwei- bis dreifach über den Kontrollen), erhöhtes Serum-IgE (fast tausendfach über den Kontrollen) und eine erhöhte Anzahl entzündlicher Zellen im Luftweg, wie demonstriert durch erhöhte BAL-Zellzahlen (ungefähr dreißigfach) im Vergleich mit Kontrollen (1, obere 2 Panels). Die meisten der Zellen, die als Ergebnis dieser Antigenaussetzung zum Luftweg geleitet wurden, waren Eosinophole.
1 Panel 4 (unten) zeigt ein repräsentatives Tier von denjenigen von OVA I. P. am Tag null präsensiblisierten, mit polyklonalen neutralisierenden Antikörpern für murines IL-9 vorbehandelten (ungefähr 200 μg/Maus I. P. in 0,5 ml PBS) und mit Antigen ausgesetzten (OVA) an den Tagen 14–20. Diese Tiere waren vor einer Reaktion gegenüber dem Antigen geschützt. Sie unterschieden sich nicht signifikant in ihrer Bronchialreaktivität, Serum-IgE oder BAL-Zellzahlen von den Kontrollen (1 obere 2 Panels).
2 illustriert die Wirkung einer Antigenaussetzung gegenüber OVA (wie oben beschrieben) mit und ohne Vorbehandlung mit polyklonalen neutralisierenden Antikörpern gegen murines IL-9 I. P, drei Tage vorher bei repräsentativen Tieren. Die linke Figur (A1-2-1B) ist eine histologische Sektion aus den Lungen von Kontrolltieren (sensibilisiert mit OVA, aber nur einer Salzlösungaerosolaussetzung ausgesetzt). Die mittlere Figur (A1-3-5) ist eine histologische Sektion aus Lungen von Tieren, die gegenüber OVA sensibilisiert und einem OVA-Aerosol ausgesetzt wurden. Die rechte Figur (A1-4-5) ist eine histologische Sektion der Lungen von Tieren, die gegenüber OVA sensibilisiert und einer OVA-Aerosolaussetzung ausgesetzt wurden, und die drei Tage vorher mit polyklonalen neutralisierenden Antikörpern gegenüber murines IL-9 vorbehandelt wurden. Die Vorbehandlung mit neutralisierendem Antikörper erzeugte eine histologische Bestätigung eines vollständigen Schutzes vor der Antigenaussetzung.
3 Panel 1 (oben) zeigt ein repräsentatives Tier von Mäusen, die mit OVA I. P. am Tag null vorbehandelt und Antigen (OVA) an den Tagen 13–18 ausgesetzt wurden. Diese Tiere entwickelten eine Bronchialhyperreaktivität (ungefähr zwei- bis dreifach gegenüber den Kontrollen) und erhöhte Zahlen entzündlicher Zellen, einschließlich Eosinophiler, in den Luftwegen, wie demonstriert durch erhöhte BAL-Zahlen im Vergleich mit den Kontrollen (1 obere 2 Panels). Viele der Zellen, die als Ergebnis dieser Antigenaussetzung zum Luftweg geführt wurden, waren Eosinophile.
3 Panel 2 (unten) zeigt ein repräsentatives Tier von denjenigen, die mit OVA I. P. am Tag null präsensibilisiert, und polyklonalen neutralisierenden Antikörpern gegen den murinen IL-9-Rezeptor vorbehandelt (ungefähr 1 mg pro Maus I. P. in 0,5 ml PBS) und gegenüber Antigen (OVA) an den Tagen 13–18 ausgesetzt wurden. Dieses repräsentative Tier war gegenüber einer Reaktion auf das Antigen geschützt. Diese Reaktion unterschied sich nicht signifikant im Hinblick auf Bronchialreaktivität, BAL-Zellzahlen von den Kontrollen (1 obere 2 Panels). Diese Daten demonstrieren die potentielle Wirksamkeit einer Behandlung atopischer Allergie mit Antikörpern gegen den IL-9-Rezeptor.

1. Gergen PJ, und Weiss KB: The increasing problem of asthma in the United States. Am Rev Respir Dis 146: 824–824, 1992.
2. Goodman und Gilman's The Pharmacologic Basis of Therpeutics, Seventh Edition, MacMillan Publishing Company, N.Y. USA, 1985.
3. Burrows B, Martinez FD, Halonen M, Barbee RA und Cline MG: Association of asthma with serum IgE levels and skin-test reactivity to allergens. New Eng J Med 320: 271–277, 1989.
4. Clifford RD, Pugsley A, Radford M, und Holgate ST: Symptoms, atopy, and bronichial response to methacholine in parents with asthma and their children. Arch Dis in Childhood 62: 66–73, 1987.
5. Gergen PJ: The association of allergen skin test reactivity and respiratory disease among whites in the U.S. population. Arch Intern Med 151: 487–492, 1991.
6. Burrows B, Sears MR, Flannery EM, Herbison GP und Holdaway MD: Relationship of bronchial responsiveness assessed by methacholine to serum IgE, lung function, symptoms, and diagnoses in 11-year-old New Zealand children. J Allergy Clin Immunol 90: 376–385, 1992.
7. Johannson SGO, Bennich HH, und Berg T: The clinical significance of IgE. Prog Clin Immunol 1: 1–25, 1972.
8. Sears MR, Burrows B, Flannery EM, Herbison GP, Hewitt CJ, und Holdaway MD: Relation between airway responsiveness and serum IgE in children with asthma and in apparently normal children New Engl J Med 325(15): 1067–1071, 1991.
9. Halonen M, Stern D, Taussig LM, Wright A, Ray CG, und Martinez FD: The predictive relationship between serum IgE levels at birth and subsequent incidences of lower respiratory illnesses and eczema in infants. Am Rev Respir Dis 146: 666–670, 1992.
10. Marsh DG, Meyers DA, und Bias WB: The epidemiology and genetics of atopic allergy. New Eng J Med 305: 1551–1559, 1982.
11. Hopp RJ, Bewtra AK, Biven R, Nair NM, Townley RG: Bronchial reactivity pattern in nonasthmatic parents of asthmatics. Ann Allergy 1988; 61: 84–186.
12. Hopp RJ, Townley RG, Biven RE, Bewtra AK, Nair NM. Die presence of airway reactivity before the development of asthma. Am Rev Respir Dis 1990; 141: 2–8.
13. Ackerman V, Marini M, Vittori E, et al. Detection of cytokines and theircell sources in bronchial biopsy specimens from asthmatic patients: relationship to atopic status, symptoms, and level of airway hyperresponsiveness. Chest 1994; 105: 687–696.
14. Hamid G, Azzawi M, Ying S, et al. Expresion of mRNA for interleukin-5 in mucosal bronchial biopsies from asthma. J Clin Invest 1991; 87: 1541–1546.
15. Djukanovic R, Roche WR, Wilson JW, et al. Mucosal inflammation in asthma. Am Rev Respir Dis 1990; 142: 434–57.
16. Robinson DS, Hamid Q, Ying S, et al. Predominant TH2-like bronchoalveolar T lymphocyte population in atopic asthma. N Engl J Med 1992; 326: 298–304.
17. Robinson DS, Hamid Q, Ying S, et al. Prednisolone treatment in asthma is associated with modulation of bronchoalveolar lavage cell interleukin-4, interleukin-5, und interferon-cytokine gene expression. Am Rev Respir Dis 1993; 148: 401–406
18. Robinson DS, Ying S, Bentley A, et al. Relationship among numbers of bronchoalveolar lavage cells expressing messenger ribonucleic acid for cytokines, asthma symptoms, ang airway methacholine responsiveness in atopic asthma. J Allergy Clin Immunol 1993; 92: 397–403.
19. Sears M, Burrows B, Flannery EM, Herbison GP, Hewitt CJ, Holdaway MD. Relation betweein airway responsiveness and serum IgE in children with asthma and in apparently normal children. N Eng J Med 1991; 325: 1067–1071.
20. Burrows B, Sears MR, Flannery EM, Herbison GP, Holdaway MD. Relationsship of bronchial responsiveness assessed by methacholine to serum IgE, lung funtkon, symptoms, and dignoses in 11-year-old New Zealand children. J Allergy Clin Immunol 1992; 90: 376–385.
21. Clifford RD, Pugsley A, Radford M, Holgate St. Symptoms, atopy, and bronchial response to methacholine in parents with asthma and their children. Arch Dis Childhood 1987; 62: 66–73.
22. O'Connor GT, Sparrow D, und Weiss ST: The role of allergy and nonspecific BHR in the pathogenesis of COPD. Am Rev Respir Dis 140: 225–252, 1989.
23. Cogswell JJ, Halliday DF, und Alexander JR: Respiratory infections in the first year of life in children at the risk of developing atopy. Brit Med J 284: 1011–1013, 1982.
24. Boushey HA, Holtzman MJ, Sheller JR, und Nadel JA: BHR. Am Rev Respir Dis 121: 389–413, 1980.
25. Cookson WOCM, und Hipkin JM: Linkage between immunoglobin E responses underlying asthma and rhinitis and chromosome 11q. Lancet 1291–1295, 1989.
26. Moffatt MF, Sharp PA, Faux JA, Young RP, Cookson WOCM, und Hiokins JP; Factors confounding genetic linkage between atopy and chromosome 11q. Clin Exp Allergy 22: 1046–1051, 1992.
27. Amelung P, Panhuysen C, Postma DS, Levitt RC, Koeter GH, Francomano C, Bleeker ER, und Meyers DA: Atopy, asthma and bronchial hyperresponsiveness: Exclusion of linkage to markers on chromosome 11q and 6p. Clin Exper Allergy 22: 1077–1084, 1992.
28. Rich SS, Roitman-Johnson B, Greenberg B, Roberts S, und Blumenthal MN: Genetic evidence of atopy in three large kindreds: no evidence of linkarge to D11S97. Clin Exp Allergy 22: 1070–1076, 1992.
29. Lympany P, Welsh K, MacCochrane G, Kemeny DM, und Lee TH: Genetic analysis using DNA polymorphism of the linkage between chromosome 11q13 and atopy and BHR to methacholine. J Allergy Clin Immunol 89: 619–628, 1992a.
30. Lympany P, Welsh KI, Cochrane GM, Kemeny DM, und Lee TH: genetic analysis of the linkage between chromosome 11q and atopy. Clin Exp Allergy 22: 1085–1092, 1992b.
31. Hizawa N, Yamagushi E, Ohe M, Itoh A, Furuya K, Ohnuma N, und Kawakami Y: Lack of linkage between atopy and locus 11q13. Clinical and Experimental Allergy 22: 1065–1069, 1992.
32. Sanford AJ, Shirakawa T, Moffatt MF, Daniels SE, Ra C, Faux JA, Young RP, Nakamura Y, Lathrop GM, Cookson WOCM, und Hopkin JM: Localization of atopy and b subunit of high-affinity IgE receptor (FceR1) on chromosome 11q. Lancet 341: 332–334, 1993.
33. Shirakawa T, Airong L, Dubowitz M, Dekker JW, Shwa AE, Faux JA, Ra C, Cookson WOCM, und Hipkin JM: Association between atopy and variants of the β-subunit of the high-affinity immunoglobulin E receptor. Nature Genetics 7: 125–130, 1994.
34. Marsh DG, Bias WB, und IshizakaK: Genetic control of basal serum immunoglobulin E level and its effect on specific reaginic sensitivity. Proc Natl Acad Sci USA 71: 3588–3592, 1974.
35. Gerrard JW, Rao DC, und Morton NE: A genetic study of IgE. Am J Hum Genet 30: 46–58, 1978.
36. Meyers DA, Beaty TH, Freidhoff LR, und Marsh DG: Inheritance of serum IgE (basal levels) in man. Am J Hum Genet 41: 51–62, 1987.
37. Meyers DA, Bias WB, und Marsh DG: A genetic study of total IgE levels in the Amish. Hum Hered 32: 15–23, 1982.
38. Martinez FD, Holberg CJ, Halonen M, Morgan WJ, Wright AL, und Taussig LM: Evidence for mendelian inheritance of serum IgE levels in Hispanic and Non-hispanic white families. Am J Hum Genet 55: 555–565, 1994.
39. Blumenthal MN, Namboordiri KK, Mendell N, Gleich G, Elston RC, und Yunis E: Genetic transmission of serum IgE levels. Am J Med Genet 10: 219–228 1981.
40. The Genome Data Base. The Welch Library, The Johns Hopkins Medical Institutions, Balitmore, Maryland, USA.
41. Marsh DG, Neely JD, Breazeale DR, et al. Linkage analysis of IL4 and other chromosome 5g31.1 markers and total serum immunoglobulin E concentrations. Science 1994; 264: 1152–1156.
42. Meyers DA, Postma DS, Panhuysen CIM, et al. Evidence for a locus regulating total serum IgE levels mapping to chromosome 5. Genomics 1994; 23: 464 470.41.
43. Doull, I., Lawrecne, S., Watson, M., Begishvile, T., Beasley, R., Lampe, R., Holgate, S. T., Morton, N. E. Allelic association of markers on chromosome 5q and 11q with atopy and bronchial hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med, 1996; 153: 1280–1284.
44. Ott J. Analysis of human genetic linkage. Baltimore, Maryland: The Johns Hopkins University Press, 1991.
45. Renauld, J-C, Houssiau, F, Druez, C. Interleukin-9. Int Rev Exp Pathology 1993; 34A: 99–109.
46. Renauld, J-C, Kermouni, A, Vink, A, Louahed, J, Van Snick, J. Interleukin-9 and its receptor: involvement in mast cell differentiation and T cell oncogenesis. J Leukoc Biol 1995; 57: 353–360.
47. Hultner, L, Moeller, J, Schmitt, E, Hager, G, Reisbach, G, Ring, J. Dormer, Rp. Thiol-sensitive mast cell lines derived from mouse bone marrow respond to a mast cell growth-enhancing activity different from both IL-3 and IL-4. J Immunol 1989; 142: 3440–3446.
48. Dugas, B, Renauld, J-C, Pene, J, Bonnefoy, J, Peti-Frere, C, Braquet, J, Van Snick, J, Mencia-Huerta, JM. Interleukin-9 potentiates the interleukin-4-induced imunoglobulin [IgG, IgM and IgE] production by normal human B lymphocytes. Eur J Immunol 1993; 23: 1687–1692.
49. Petit-Frere, C, Dugas, B, Braquet, P, Mencia-Huerta, JM. Interleukin-9 potentiates the interleukin-4-induced IgE and IgGl release from murine B lymphocytes. Immunology 1993; 79: 146–151.
50. Behnke, JM, Wahid, FN, Grencis, RK, Else, KJ, Ben-Smith, AW, Goyal, PK. Immunological relationships during primary infection with Heligmosomoides polygyrus [Nematospiroides dubius]: downregulation of specific cytokine secretion [IL-9 and IL-10] correlates with poor mastocytosis and chronic survival of adult worms. Parasite Immunol 1993; 15: 415–421.
51. Gessner, A, Blum, H, Rollinghoff, M. Differential regulation of IL-9 expression after infection with Leischmania major in susceptible and resistant mice. Immunobiology 1993; 189: 419–435.
52. Renauld J-C, Druez C, Kermouni A, et al. Expression cloning of the murine and human interleukin 9 receptor cDNAs. Proc Natl Acad Sci 89: 5690–5694 (1992).
53. Chang M-S, Engel G, Benedict C et al. Isolation and characterization of the Human interleukin-9 receptor gene. Blood 83: 3199–3205 (1994).
54. Renauld J-C, Goethals A, Houssiau F, et al. Human P40/IL-9. Expression in activated CD4+ T cells, Genomic Organization, and Comparison with the Mouse Gene. J Immunol 144: 4235–4241 (1990).
55. Kelleher K, Bean K, Clark SC, et al. Human interleukin-9: genomic sequence, chromosomal location, and sequences essential for its expression in human T-cell leukemia virus (HTLV-I-transformed human T cells. Blood 77: 1436–1441 (1991).
56. Houssiau FA, Schandene L, Steens M, et al. A cascade of cytokines is responsible for IL-9 expression in human T cells. Involvement of IL-2, IL-2, and IL-10. J of Immunol. 154: 2624–2630 (1995).
57. Miyazawa K, Hendrie PC, Kim Y-J, et al. Recombinant human interleukin-9 induces protein tyrosin phosphorylation and synergizes with steel factor to stimulate proliferation of the human factor-dependent cell line. MO7e. Blood 80: 1692 (1992).
58. Yin T, Tsang M L-S, Yang Y-C. JAK1 kinase forms complexes with interleukin-4 receptor and 4PS/insulin receptor substrate-1-like protein and is activated by interleukin-4 and interleukin-9 in T lymphocytes. J Biol Chem 269: 26614–26617 (1994).
59. Renauld J-C, Druez C, Kermouni A, et al. Expression cloning of the murine and human interleukin 9 receptor cDNAs. Proc Natl Acad Sci 89: 5690–5694 (1992).
60. Chang M-S, Engel, G, Benedict C et al. Isolation and characterization of the Human interleukin-9 receptor gene. Blood 83: 3199–3205 (1994).
61. Kreitman RJ, Puri RK, Leland P, et al. Site-specific conjugation to interleukin-4 containing mutated cysteine residues produces interleukin 4-toxin conjugates with improved binding and activity. Biochemistry 33: 11637–11644 (1994)
62. Simoncsits A, Bristulf J, Tjornhammar ML, et al. Deletion mutants of human interleukin 1 beta significantly reduced agonist properties: search for the agonist/antagonist switch in ligands to the interleukin 1 receptors. Cytokine 6: 206–214 (1994).
63. Zav'yalov VP, Navolotskaya EV, Isaev IS, et al. Nonapeptide corresponding to the sequence 27–35 of the mature human IL-2 efficiently competes with rIL-2 for binding to thymocyte receptors. Immunol Lett 31: 285–288 (1992).
64. Chu JW, und Skiarom FJ. Glycophorin A interacts with interleukin-2 and inhibits interleukin-2-dependent T-lymphocyte proliferation. Cell Immunol 145: 223–239 (1992).
65. Alexander AG, Barnes NC, Kay AB. Trial of cyclosporin in corticosteroid-dependent chronic severe asthma. Lancet 339: 324–328 (1992).
66. Morely J. Cyclosporin A in asthma therapy: a pharmacological rationale. J Autoimmun 5 Suppl A: 265–269 (1992).
67. Lander, E. S., Botstein, D. Mapping Mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps. Genetics 121, 185–199 (1989).
68. Soller, M., Brody, T. On the power of experimental designs for the detection of linkage between marker loci and quantitative loci in crosses between inbred lines. Theor Appl Genet 47: 35–39 (1976).
69. Kvaloy K, Galvagni F, und Brown WAR. The sequence organization of the long arm pseudoautosomal region of the human sex chromosomes. Hum Mol Genet 3: 771–778 (1994).
70. Freije D, Helms C, Watson MS, et al. Science 258: 1784–1787 (1992).
71. Wber JL, MayPE. Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaktion. Am J Human Genet 1989; 44: 388–396.
72. Saiki KK, Gelfand DH, Stoffel S, et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA-Polymerase. Science 1988; 239: 487–491.
73. Sheffield VC, Beck JS, Kwitek AE, Sandstrom DW, und Stone EM: The sensitivity of single-strand conformation polymorphism analysis for the detection of single base substitutions. Genomics 16: 325–332, 1993.
74. Orita M, Suzuki Y, Sekiya T, und Hayashi K: Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms using the polymerase chain reaction. Genomics 5: 874–9, 1989.
75. Sarkar G, Yoon H-S, und Sommer SS: Dideoxy fingeringprint (ddF): A rapid and efficient screen for the presence of mutations. Genomics 13: 441–443, 1992.
76. Cotton RG: Detection of single base changes in nucleic acids. Biochemical Journal 263(1): 1–10, 1989.
77. Schwengel D, Nouri N, Meyers D, und Levitt RC: Linkage mapping of the human thromboxane A2 receptor (TBXA2R) to chromosom 19p13.3 using transcribed 3' untranslated DNA sequence polymerphisms. Genomics 18: 212–215, 1993.
78. SAGE, Statistical Analysis for Genetic Epidemiology (1992). Release 2.1. Computer program package available from Department of Biometry and Genetics, LSU Medical Center, New Orleans, LA.
79. Postma DS, Bleecker ER, Holroyd KJ, Amelung PJ, Panhuysen CIM, Xu J, Meyers DA, Levitt RC: Genetic Susceptibility to Asthma: Bronchial Hyperresponsiveness Coinherited with a Major Gene for Atopy. N Engl J Med 333: 894–900 (1995).
80. Xu J, Levitt RC, Panhuysen CIM, Postma DS, Taylor EW, Amelung PJ, Holroyd KJ, Bleecker ER, Meyers DA: Evidence for two-unlinked loci regulating serum total IgE levels. Am J Hum Genet 57: 425–430 (1995).
81. Meyers DA, Xu J, Holroyd KJ, Panhuysen CIM, Amelung PJ, Postma DS, Levitt RC, Bleecker ER. Two locus segregation and linkage analysis for total serum IgE levels. Clin Exp Allergy 25: 113–115 (1995).
82. Bleecker ER, Amelung PJ, Levitt RC, Postma DS, Meyers DA. Evidence for linkage of total serum IgE and bronchial hyerresponsiveness to chromosome 5q: a major regulatory locus important in asthma. Clin Exp Allergy 25: 84–88 (1995).
83. Panhuysen CIM, Levitt RC, Postma DS, et al., Evidence for a susceptibility locus for asthma mapping to chromosome 5q. Journal of Investigative Medicine 43: 281A (1995).
84. Levitt RC, Eleff SM, Zhang L-Y, Leeberger SR, und Ewart SL. Linkage homology for bronchial hyperresponsiveness between DNA markers on human chromosome 5q31–q33 and mouse chromosome 13. Clin Exp Allergy 25: 61–63 (1995).
85. Yang et al., U.S. Patent No. 5,414,071 Human cytokine IL-9 (09. Mai 1995).
86. Alms W und White B. Human interleukin variants generated by alternative splicing PCT/US95/04094 (WO 95/27052).
87. Cytokine handbook, Angus Thomson (1994).
88. Martinati LC, Trabetti E, Casartelli A, Boner AL, Pignatti PF. Affected sib-pair and mutation analyses of the high affinity IgE receptor beta chain locus in Italian families with atopic asthmatic children. Am J Respir Crit Care Med, 1996; 153: 1682–1685.
89. Kauvar, M. Lawrence, Peptide mimetic drugs: A comment on progress and prospects, Nature Biotechnology Band 13, Juni 1996.

Andere Ausführungsformen der oben beschriebenen Erfindung werden für den Fachmann unter Betrachtung der Beschreibung und der Praxis der hier offenbarten Erfindung deutlich werden. Es wird beabsichtigt, dass die Beschreibung und Beispiele nur exemplarisch betrachtet werden sollen, während der tatsächliche Umfang und der Geist der Erfindung durch die folgenden Ansprüche angegeben wird.

Claims

Verwendung eines Antikörpers, wobei es sich um einen Anti-Interleukin-9-Antikörper oder einen Anti-Interleukin-9-Rezeptor-Antikörper handelt, der die Interleukin-9-Bindung an den Interleukin-9-Rezeptor blockiert, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Asthma.
Verwendung gemäss Anspruch 1, wobei der Antikörper in einer ausreichenden Menge vorliegt, um die Aktivität von Interleukin-9 herabzuregulieren.
Verwendung gemäss einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei der Antikörper die Eosinophilen in einer Bronchiallavage bei einem Patienten reduziert.
Verwendung gemäss Anspruch 3, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Verwendung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Antikörper ein Antigen-Bindungsfragment ist.
Verwendung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Medikament durch Injektion verabreicht wird.
Verwendung gemäss Anspruch 6, wobei das Medikament durch intravenöse Injektion verabreicht wird.
Verwendung gemäss Anspruch 6, wobei das Medikament durch subkutane Injektion verabreicht wird.
Verwendung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Medikament durch Inhalation verabreicht wird.
Verwendung gemäss Anspruch 9, wobei das Medikament durch eine Inhalationsvorrichtung verabreicht wird.
Verwendung gemäss Anspruch 10, wobei das Medikament durch eine Dosierdosisinhalationsvorrichtung verabreicht wird.
Verwendung gemäss Anspruch 10, wobei das Medikament durch eine Trockenpulverinhalationsvorrichtung verabreicht wird.