PT1632248E - Anticorpo anti-interleucina-9 ou anticorpo anti-receptor de interleucina-9 para o tratamento da hiperreactividade brônquica - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "ANTICORPO ANTI-INTERLEUCINA-9 OU ANTICORPO ANTI-RECEPTOR DE INTERLEUCINA-9 PARA O TRATAMENTO DA HIPERREACTIVIDADE BRONQUICA"

REFERENCIA A UM PEDIDO RELACIONADO

Este pedido está relacionado com o Pedido Provisório de Patente dos U.S. N° de Série 60/002765, o qual foi apresentado em 24 de Agosto de 1995.

ÂMBITO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se à regulação da actividade da IL-9 e ao tratamento da hiperreactividade brônquica, com base na relação entre a IL-9 e o seu receptor.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A inflamação é um processo complexo no qual o sistema de defesa do corpo combate entidades estranhas. Enquanto que a batalha contra as entidades estranhas pode ser necessária para a sobrevivência do corpo, alguns sistemas de defesa respondem de forma não apropriada às entidades estranhas, mesmo às inócuas, como sendo perigosas e danificando, deste modo, o tecido envolvente na batalha subsequente. 1 A alergia atópica é um distúrbio ecogenético no qual os antecedentes genéticos ditam a resposta ao estímulo ambiental. 0 distúrbio é caracterizado, de um modo geral, por um aumento da capacidade dos linfócitos em produzir anticorpos IgE como resposta aos antigénios omnipresentes. A activação do sistema imunitário por estes antigénios leva à inflamação alérgica e pode ocorrer após a ingestão, penetração através da pele ou após inalação. Quando ocorre esta activação imunitária e a subsequente inflamação pulmonar, este distúrbio é caracterizado, de uma forma genérica, como asma. Para esta reacção inflamatória, determinadas células são críticas, e incluem as células T e as células apresentadoras de antigénio, as células B que produzem IgE e os mastócitos/basófilos e eosinófilos que se ligam à IgE. Estas células inflamatórias acumulam-se no local da inflamação alérgica e os produtos tóxicos que libertam contribuem para a destruição do tecido relacionado com o distúrbio.

Embora a asma seja geralmente definida como distúrbio inflamatório das vias aéreas, os sintomas clínicos são originados pela obstrução intermitente do fluxo de ar. Trata-se de um distúrbio incapacitante, crónico, que parece estar a aumentar em intensidade e gravidade1. Estima-se que 30 a 40% da população sofra de alergia atópica e que 15% das crianças e 5% dos adultos na população sofram de asma1. Por isso, é exercida uma enorme pressão sobre os recursos de cuidados de saúde. O mecanismo da susceptibilidade à atopia e à asma permanece desconhecido. De uma forma interessante, embora muitos indivíduos experimentem exposições ambientais semelhantes, apenas alguns indivíduos desenvolvem alergia atópica e asma. Esta hipersensibilidade aos alergénios ambientais, conhecida 2 como "atopia" é muitas vezes indicada pelos níveis séricos de IgE elevados ou pela resposta anormalmente extensa a alergénios no teste cutâneo em indivíduos atópicos quando comparada com os não-atópicos10. Há forte evidência de uma correlação estreita entre a alergia atópica e a asma que provém do facto de muitos asmáticos apresentarem evidência clínica e serológica de atopia4-9. Em especial, os asmáticos mais novos têm uma incidência elevada de atopia10. Além disso, os factores imunológicos associados com um aumento dos níveis séricos totais de IgE estão intimamente relacionados com a diminuição da função pulmonar3.

Tanto o diagnóstico como o tratamento destes distúrbios são problemáticos1. A avaliação do tecido inflamado dos pulmões é muitas vezes difícil e, com frequência, a fonte da inflamação não pode ser determinada. Sem conhecimento da fonte de inflamação das vias aéreas e da protecção do agente ou agentes ambientais estranhos, provocadores, o processo inflamatório não pode ser interrompido. Actualmente, é geralmente aceite que a falha no controlo da inflamação pulmonar leva, ao longo do tempo, a perda significativa da função pulmonar.

Os tratamentos correntes sofrem de uma série de desvantagens próprias. Os agentes terapêuticos principais, os β-agonistas, reduzem os sintomas, í. e., melhoram, transitoriamente, as funções pulmonares, mas não afectam a inflamação subjacente, de modo que o tecido pulmonar permanece ameaçado. Além disso, a utilização constante de β-agonistas origina a dessensibilização, o que reduz a eficácia e a segurança dos mesmos2. Os agentes que podem diminuir a inflamação subjacente, os esteróides anti-inflamatórios, têm a sua própria 3 lista conhecida de desvantagens que vão desde a imunossupressão à perda óssea2.

Devido aos problemas associados com as terapias convencionais, foram avaliadas estratégias de tratamento alternativo65-66. A glicoforina A64, ciclosporina65, e um fragmento não-peptidico, o IL-263, todos inibem a proliferação de linfócitos T dependente de interleucina-2 e, logo, da produção da IL-951, contudo, eles são conhecidos por terem muitos outros efeitos2. Por exemplo, a ciclosporina é utilizada como um imunossupressor após transplante de órgãos. Embora estes agentes possam representar alternativas aos esteróides no tratamento dos asmáticos63-66 , eles inibem a proliferação de linfócitos T dependente da interleucina-2 e as funções imunitárias potencialmente criticas associadas com a homeostase. O que é necessário na técnica é a identificação de uma via critica para o desenvolvimento da asma que explique a natureza episódica do distúrbio e a forte associação com a alergia que deriva destas funções imunitárias críticas. A natureza demonstrou que esta via é o alvo apropriado para terapia, uma vez que a variabilidade biológica existe, normalmente, nesta via e, por outro lado, esses indivíduos não ficam, de um modo geral, imunologicamente comprometidos ou doentes, excepto no que respeita aos seus sintomas de atopia.

Devido às dificuldades relacionadas com o diagnóstico e tratamento da asma, a complexa patofisiologia deste distúrbio está sob estudo intenso. Embora este distúrbio seja heterogéneo e possa ser difícil de definir porque pode tomar muitas formas, são encontradas certas características em comum entre os asmáticos. Exemplos de tais traços incluem os níveis séricos de IgE elevados, a resposta anormal ao desafio alergénico no teste 4 cutâneo, a hiperreactividade brônquica (BHR), a reversibilidade broncodilatadora e a obstrução das vias aéreas3-10. Estas expressões destes fenótipos relacionados com a asma podem ser estudadas como medidas quantitativas ou qualitativas.

Os níveis de igE elevados estão também fortemente correlacionados com a BHR, uma resposta broncoconstritora aumentada para uma variedade de estímulos4'6'8'9. Crê-se que a BHR reflecte a presença de inflamação nas vias aéreas6,8 e é considerada um factor de risco para a asma11-12. A BHR é acompanhada, em indivíduos asmáticos, por inflamação brônquica e por uma diátese alérgica13-21. Mesmo em crianças sem sintomas de atopia e asma, a BHR está fortemente associada com níveis de IgE elevados19.

Um certo número de estudos documenta uma componente hereditária da atopia e da asma ' ' . Contudo, os estudos de famílias têm sido difíceis de interpretar uma vez que estes distúrbios são influenciados, de modo significativo, pela idade e género, bem como por muitos factores ambientais, tais como os alergenios, as mfecções virais e os poluentes . Contudo, uma vez que não é conhecido defeito bioquímico associado com a susceptibilidade a estes distúrbios, os genes mutantes e os seus produtos genéticos anormais, apenas podem ser reconhecidos através dos fenótipos anómalos que eles produzem. Assim, um primeiro passo importante no isolamento e caracterização da componente hereditária é a identificação das localizações cromossómicas dos genes.

Cookson et al. forneceram a primeira descrição de uma localização genética para a atopia hereditária25. Estes investigadores descreveram a prova da ligação genética entre a 5 atopia e um marcador único numa região cromossómica especifica designada por llqlã.l. Mais tarde, sugeriram a prova da hereditariedade materna para a atopia neste locus26. Embora a hereditariedade materna (impressão genética) tenha sido observada para a atopia, nunca tinha sido explicada anteriormente. Contudo, os esforços para confirmar esta ligação não foram, geralmente, bem sucedidos27-31.

Recentemente, a subunidade β do receptor de elevada afinidade para a igE foi mapeada no cromossoma llq e foi descrita, neste gene, uma mutação putativa associada com a atopia32'33. Contudo, devido às dificuldades de terceiros na replicação desta ligação, o significado deste gene e 0 polimorfismo permanecem por esclarecer. Embora sejam necessários estudos adicionais para confirmar se esta mutação putativa causa atopia na população em geral, os dados até agora recolhidos sugerem que seja pouco provável este polimorfismo que represente uma causa frequente de atopia.

Porque os níveis séricos de IgE estão tão fortemente associados com o início e gravidade da alergia e da asma como distúrbios clínicos, a atenção focou-se nos estudos de regulação genética dos níveis séricos totais de IgE. Embora os estudos anteriores fornecessem prova da hereditariedade Mendeliana para os níveis séricos totais de IgE ' , uma mdicaçao da existência de um gene regulador, outros encontraram prova da hereditariedade poligénica da IgE, í. e., a existência de vários genes responsáveis39.

Os especialistas encontraram vários genes no cromossoma 5q, que podem ser importantes na regulação da IgE e no desenvolvimento ou progresso da inflamação brônquica associada 6 com a asma. Estes incluem os genes que codificam para as várias interleucinas, tais como IL-3, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, factor de estimulação de colónias de macrófagos-granulócitos (GM-CSF), receptor para o factor de estimulação de colónias de macrófagos (CSF-IR), factor acidico de crescimento dos fibroblastos (FGFA), bem como outros40. Dados recentes de estudos de famílias sugere a ligação genética entre os níveis séricos de IgE e os marcadores de ADN na região destes genes candidatos no cromossoma 5q41”42. Em conjunto, estes investigadores sugerem que um ou mais dos genes principais na vizinhança do complexo da interleucina no cromossoma 5q regula uma quantidade significativa da variabilidade biológica observada na IgE sérica que é provável que seja importante no desenvolvimento da atopia e da asma.

Foi também utilizada, previamente, a ligação (análise de "pares de irmãos") para identificar uma localização genética para a BHR. Dado que se sabia que a BHR estava associada com um gene principal para a atopia, foram examinadas as regiões cromossómicas relatadas como sendo importantes na regulação dos níveis séricos de IgE42. Foram identificadas, por análises de ligação, as regiões candidatas para a atopia. Estes estudos identificaram a existência de um gene principal para a atopia no cromossoma humano 5q31-q3342.

Assim, para determinar a localização cromossómica de um gene ou genes que conferem susceptibilidade à BHR, a qual será co-hereditária com um gene principal para a atopia, foram levadas a cabo experiências utilizando análises de ligação entre a BHR e os marcadores geneticos do cromossoma 5q ' ' . Com base na sensibilidade à histamina, foram identificados os indivíduos com BHR. Os marcadores úteis para mapeamento dos genes relacionados com a asma são apresentados na Figura 1. 7

De um modo específico, os genes candidatos para a asma, hiperreactividade brônquica e atopia são apresentados (à direita) na sua localização aproximada em relação aos marcadores apresentados. 0 mapa inclui os genes das interleucinas il-4, il-13, IL-5 e il-3; CDC25, ciclo de divisão celular 25; CSF2, factor de estimulação de colónias de macrófagos-granulócitos (GM-CSF); EGRl, gene da resposta precoce de crescimento 1; CD14, antigénio celular 14; ADRB2, o receptor adrenérgico β2; GRLl, receptor glucocorticóide específico dos linfócitos; PDGFR, do receptor do factor de crescimento derivado das plaquetas. As bandas 5q31-q33 estendem-se, aproximadamente, desde a IL-4 ao D5S410. As distâncias relatadas são fracções de recombinação de médias por sexo.

As análises de pares de irmãos relacionadas demonstraram, do ponto de vista estatístico, uma evidência significativa da ligação entre BHR e D5S436, o D5S658 e vários outros marcadores localizados na proximidade do cromossoma 5q31-q3379. Estes dados suportam fortemente a hipótese de que um ou mais genes espaçados e próximos no cromossoma 5q31-q33 determina a susceptibilidade à BHR, atopia e asma79, 80, 81, 82 .

Foi também demonstrada, recentemente, a ligação entre o fenótipo da asma e os marcadores genéticos no cromossoma 5q31-q33 . Esta região do genoma humano foi avaliada no que se refere à sua ligação com a asma, devido ao grande número de genes representando candidatos posicionais razoáveis para fornecer susceptibilidade genética para a atopia e para a BHR. A ligação foi demonstrada através da utilização dos λ ç o q ^ métodos descritos acima ' . De uma forma especifica, foram analisadas 84 famílias da Holanda, tanto por "pares de irmãos" como por LOD em relação aos marcadores desta mesma região do cromossoma 5q, que se mostrou anteriormente estar relacionado com a BHR e a atopia ' . Foi utilizado um algoritmo para classificar a doença obstrutiva das vias aéreas nas probandas asmáticas e nas suas famílias. Este esquema de classificação foi baseado, tal com descrito anteriormente, na presença ou ausência de BHR à histamina, sintomas respiratórios, história significativa como fumador (> 5 maços de tabaco por ano), atopia, tal como definida pela resposta do teste cutâneo, obstrução das vias aéreas (% de FEVl prevista, < 95% de Cl) e reversibilidade a um broncodilatador (> 9% da prevista).

Foi encontrada prova da ligação entre a asma e os marcadores no cromossoma 5q através da análise por pares de irmãos (N = 10, P < 0,05), e por análise da máxima verosimilhança com um modelo dominante para o fenotipo da asma . A asma estava ligada ao D5S658 com um LOD máximo de 3,64 a Θ = 0,03, utilizando um modelo dominante (afectado para classe 1, incerto para as classes de 2 a 4, não afectado para a classe 5) com uma frequência genética de 0,015 (prevalência de 3%) . Foi observado, relativamente ao D5S470, um LOD máximo de 2,71 a Θ = 0,0, o que é, aproximadamente, 5 cM telomérico ou longe da IL-9 relativamente ao D5S436 .

Após a deposição deste pedido original, foi sugerido que a IL-9 ou um gene próximo seria provavelmente importante para utilização na atopia e asma . A sugestão da IL-9 foi baseada numa correlação forte, numa população determinada de forma aleatória, entre o logaritmo dos níveis séricos totais de IgE e os alelos de um marcador genético no gene da IL-943. Este tipo de 9 associação de um marcador com um ou mais alelos específicos é denominado "desequilíbrio de ligação" e, de um modo geral, sugere que um gene próximo determina a variabilidade biológica em estudo . 0 gene da IL-9 foi mapeado para a região q31-q33 do cromossoma 540 . Apenas foi encontrada uma única cópia do gene no genoma humano45, 46 . A similaridade estrutural foi observada para os genes da IL-9 humanos e de murino45, 46 . Cada gene é constituído por cinco exões e quatro intrões, estendendo-se ao longo de aproximadamente quatro Kb de ADN. A expressão do gene parece estar restringida às células T activadas 45, 46 .

As funções da IL-9 estendem-se, agora, bem para além das que foram reconhecidas originalmente. Embora a IL-9 sirva como um factor de crescimento das células T, esta citocina também é conhecida por mediar o crescimento dos progenitores eritróides, das células B, dos mastócitos e dos timócitos fetais45,46 . A IL-9 actua de uma forma sinergética com a IL-3 originando a activação e proliferação dos mastócitos47. Esta citocina também potência a produção de IgE, IgC e igM, induzida pela IL-4, pelos linfócitos B normais humanos48. A IL-9 também potência a libertação de IgE e IgGl, induzida pela IL-4, pelos linfócitos B de murino49. Também foi demonstrado um papel crítico da IL-9 na resposta inflamatória das mucosas à infecção parasitária50,51.

Além da IL-9, o cromossoma 5q transporta numerosos candidatos a genes diferentes incluindo IL-3, IRFl, EGRl, ITK, GRLl, ADRB2, CSFlR, FGFA, ITGA2, CD14, PDGFR, CDC25, CSF2, IL-4, IL-5, IL-12B e IL-13. Estes podem também ser todos importantes na alergia atópica e como alvos potenciais para desenvolvimento terapêutico. Além disso, não há qualquer conhecimento na técnica 10 relativo ao modo como a sequência da IL-9 ou da função da IL-9 se correlaciona especificamente com a alergia atópica, a asma ou a hiperreactividade brônquica. Sem tal conhecimento, os especialistas não saberão como ou se utilizar a IL-9 para o diagnóstico ou para o tratamento destes distúrbios. A técnica fornece, assim, que a IL-9 é uma nova citocina com uma massa molecular aparente de, aproximadamente, entre 20 e 30 kD, como determinado por electroforese em gel de poliacrilamida e dodecilsulfato de sódio sob condições redutoras. É produzida na forma de uma proteína com 144 aminoácidos, a qual é processada numa glicoproteína com 126 aminoácidos. Yang et al.85 divulgam que a sequência de ADN codificando para a IL-9 compreende, aproximadamente, 630 nucleótidos, com, aproximadamente, 450 nucleótidos na grelha de leitura adequada para a proteína. É também conhecido na técnica que, através de excisão/união alternativa, podem ser produzidas múltiplas isoformas proteicas a partir de um locus genético único. A excisão/união alternativa é um mecanismo eficiente pelo qual podem ser produzidas múltiplas isoformas proteicas a partir de um locus genético único. A excisão/união alternativa é utilizada, em células diferenciadas nas terminações, para modificar, de forma reversível, a expressão proteica sem alterar o conteúdo genético das células. Estas isoformas proteicas são, de um modo preferido, expressas em diferentes tecidos ou durante diferentes estados de diferenciação ou activação celular. As isoformas proteicas podem ter diferentes funções e Alms e White clonaram e expressaram uma variante de excisão/união da IL-4 que ocorre naturalmente, formada pela omissão de exão 2, designada, 11 por isso, por IL-45286. Foi observado que a IL-452 inibia a proliferação de células T induzida pela IL-4.

Contudo, a técnica não tem qualquer conhecimento sobre as isoformas proteicas da IL-9 que são formadas por deleção de exões 2 e 3 ou sobre as funções reguladoras exibidas por estas proteínas truncadas. De uma forma especifica, não está clarificado o seu papel na regulação da actividade biológica, nomeadamente, na regulação negativa da expressão ou actividade da il-9 . Além disso, a formação de tais isoformas através de excisão/união alternativo não tinha sido anteriormente observada ou utilizada para fornecer variantes da IL-9 que funcionassem como agonistas ou antagonistas da citocina nativa. A técnica também não tem qualquer conhecimento sobre o papel do receptor da IL-9 nos distúrbios relacionados com a asma. Sabe-se que a IL-9 se liga a um receptor especifico expresso na superfície das células-alvo46'52'53. 0 receptor consiste, na verdade, em duas cadeias proteicas: uma cadeia proteica, conhecida como o receptor da IL-9, liga-se especificamente com a IL-9 e a outra cadeia proteica é a cadeia que é partilhada, em comum, com o receptor da IL-246. Além disso, foi clonado o ADNc humano do receptor da IL-946'52'53. Este ADNc codifica para uma proteína com 522 aminoácidos, a qual exibe uma homologia significativa com o receptor da IL-9 de murino. A região extracelular do receptor é altamente conservada, existindo entre as proteínas de murino e humanas uma homologia de 67%. A região citoplasmática do receptor é menos altamente conservada. 0 domínio citoplasmático humano é muito mais largo do que a região correspondente do receptor de murino46. 12

Foi também caracterizado o gene do receptor da IL-9.53 Pensa-se que exista como uma cópia única no genoma de murganho e que é composto por nove exões e oito intrões53. 0 genoma humano contém, pelo menos, quatro pseudogenes do receptor da IL-9. 0 gene humano do receptor IL-9 foi mapeado em relação à região subtelomérica de 320 kb dos cromossomas sexuais X e Y46. Contudo, apesar destes estudos, a técnica não tem qualquer conhecimento sobre uma relação entre o receptor da IL-9 e a alergia atópica, a asma ou a hiperreactividade brônquica.

Assim, a técnica também não tem qualquer conhecimento sobre como o gene da IL-9, o seu receptor e as suas funções estão relacionados com alergia atópica, asma, hiperreactividade brônquica e distúrbios associados. Por isso, existe uma necessidade especifica na técnica de informação genética sobre alergia atópica, asma, hiperreactividade brônquica e de elucidação do papel da IL-9 na etiologia destes distúrbios. Existe, também, uma necessidade de elucidação do papel, nestes distúrbios, do receptor da IL-9 e do gene do receptor da IL-9. Além disso, fundamentalmente com base neste conhecimento, existe uma necessidade de identificação dos agentes, i. e., dos anticorpos que são capazes de regular a interacção entre a IL-9 e o seu receptor para tratamento destes distúrbios.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A requerente satisfez a necessidade longamente sentida de um tratamento para uma redução de hiperreactividade brônquica fornecendo informação que demonstra o papel da IL-9 (também conhecida como o Factor Associado à Asma 1, ou AAFl) na patogénese deste distúrbio, informação essa que conduziu a 13 compostos que são capazes de regular a actividade da IL-9. A requerente também demonstrou a ligação conservada e as homologias de sintenia entre os murganhos e os seres humanos para um gene que determina a variabilidade biológica na hiperreactividade das vias aéreas. Estas relações identificam, de uma forma especifica, a IL-9 como um gene candidato. Adicionalmente, a requerente determinou que a IL-9 é critica para um certo número de respostas induzidas por antigénio em murganhos, incluindo a hiperreactividade brônquica, a eosinofilia, e as contagens celulares elevadas na lavagem bronquial e IgE sérica total elevada. Estas verificações tipificam a inflamação alérgica associada com a asma.

Além disso, a requerente determinou num aspecto de referência que uma variação no ácido nucleico de C para T na posição 3365 no exão 5 do gene da IL-9 humana produz a substituição de aminoácido prevista de uma metionina para uma treonina no codão 117 de IL-9. Quando esta substituição ocorre em ambos os alelos num indivíduo, está associada com menos evidência de alergia atópica incluindo asma, algumas respostas anormais a ensaio cutâneo e a uma baixa IgE total no soro. Deste modo, a requerente identificou a existência de um fenótipo não atópico, não asmático, caracterizado por metionina no codão 117 quando ocorre em ambos os produtos do gene de IL-9 num indivíduo. Como um corolário adicional significativo, a requerente identificou a existência de susceptibilidade a um fenótipo asmático, atópico, caracterizado por uma treonina no codão 117. Deste modo, a invenção inclui moléculas de ADN purificadas e isoladas possuindo esta sequência, assim como os péptidos codificados por este ADN. 14 A actividade biológica de IL-9 resulta da sua ligação ao receptor de IL-9 e a consequente propagação de um sinal regulador em células especificas. Deste modo, as funções de IL-9 podem ser interrompidas ou reguladas pela interacção de agonistas ou antagonistas de IL-9 com IL-9 ou o seu receptor. A regulação negativa, i. e., a redução das funções controlada por IL-9, é conseguida de vários modos. A administração de agonistas ou antagonistas que podem interromper a ligação de IL-9 ao seu receptor é um mecanismo chave e estes agonistas e antagonistas estão na invenção reivindicada. Os exemplos incluem a administração de produtos polipeptidicos codificados pelas sequências de ADN de IL-9 ou receptor de IL-9 em que as sequências de ADN contêm várias mutações. Estas mutações podem ser mutações pontuais, inserções, deleções ou variantes de excisão de IL-9 ou do seu receptor.

Um outro aspecto inclui a regulação da actividade de IL-9 por administração de "agonista e antagonistas". 0 especialista na técnica reconhecerá, imediatamente, que todas as moléculas contendo o requisito de conformação estrutural 3-dimensional e que contêm os resíduos essenciais ou críticos para a ligação ao receptor estão no âmbito desta invenção. Especificamente, os resíduos 43-60 e 71-90 da proteína madura parecem ser importantes para a ligação do receptor. A requerente mostrou que os péptidos KP-16 (resíduos 43-60) e KP-20 (resíduos 71-90) actuam como antagonistas do receptor. Adicionalmente, prevê-se que estes resíduos na molécula nativa de IL-9 formem estruturas em hélice anti-paralelas. A estrutura tridimensional da proteína sugere que, especificamente, a serina 52 e/ou o ácido glutâmico 53 interagem com lisina 85, a serina 56 interage com a lisina 82, e a treonina 59 interage com a valina 78. As coordenadas tridimensionais destas hélices anti-paralelas e os grupos 15 funcionais relacionados representam o requisito critico de conformação 3-dimensional para a ligação do receptor e os compostos que estimulam estas relações estão no âmbito desta invenção. A actividade biológica do receptor de IL-9 receptor (também denominado Factor 2 Associado a Asma, AAF2) pode também ser modulada utilizando moléculas solúveis de receptor de IL-9. Tal molécula evita a ligação de IL-9 ao receptor ligado às células e actua como um antagonista para IL-9 e está, também, no âmbito desta invenção.

Os anticorpos policlonais e monoclonais que bloqueiam a ligação de IL-9 ao seu receptor estão, também, no âmbito desta invenção e são agentes terapêuticos úteis no tratamento de alergia atópica incluindo asma e distúrbios relacionados.

Outro aspecto de referência refere-se à utilização de sequências de ADN isoladas contendo várias mutações, tais como mutações pontuais, inserções, deleções ou mutações de excisão de IL-9 ou o receptor de IL-9 em terapia génica. A expressão de IL-9 e receptor de IL-9 é também sub-regulada por administração de uma quantidade eficaz de sequências sintéticas de oligonucleótidos anti-sentido. Os compostos de oligonucleótidos ligam-se ao ARNm codificante para IL-9 humana e receptor de IL-9 inibindo, deste modo, a expressão destas moléculas. A estrutura de IL-9 e do receptor de IL-9 foi examinada e analisada em maior detalhe e os resíduos de aminoácidos de IL-9 críticos para a ligação do receptor foram identificados. Com 16 base em estudos estruturais e as características de ligação deste par especifico de ligação, outro aspecto inclui, também, as pequenas moléculas com cauda tais como a sua conformação estrutural proporciona os resíduos essenciais para bloquear a interacção de IL-9 com o receptor de IL-9. Este bloqueio resulta na modulação da actividade do receptor e estas moléculas são, deste modo, úteis no tratamento de alergias atópicas.

Outro aspecto é dirigido à regulação das vias de sinalização a jusante necessárias para a função de IL-9. A IL-9 induz a fosforilação da tirosina de Stat 3 que parecem ser únicos para a via 54 de sinalização de IL-9 e é útil como um alvo para inibidores. Os inibidores específicos e inibidores não específicos da cinase de tirosina, tais como as tirofostinas são, deste modo, úteis na regulação a jusante da actividade fisiológica de IL-9. Num outro aspecto, os compostos de aminoesterol são também úteis no tratamento de alergias atópicas e distúrbios relacionados porque estes estão também envolvidos no bloqueio da transdução de sinal da via de transdução de sinal de IL-9.

Os produtos discutidos acima representam vários agentes terapêuticos eficazes no tratamento de alergias atópicas, asma e outros distúrbios relacionados.

Deste modo, a requerente identificou o papel crítico da via de IL-9 na patogénese de alergia atópica, em particular, a hiperreactividade brônquica. Mais especificamente, a requerente proporcionou antagonistas e métodos de identificação de antagonistas que são capazes de regular a interacção entre IL-9 e o seu receptor como definido nas reivindicações. A requerente também descreve métodos para regular a actividade de IL-9 por: 17 1) administração de um composto possuindo uma actividade comparável com a de IL-9 contendo metionina no codão 117 e a capacidade de se ligar a um receptor para IL-9 numa quantidade suficiente para sub-regular a actividade de IL-9; e 2) por administração de produtos de proteína truncada codificados por sequências de ácido nucleico isoladas compreendendo as deleções de qualquer um ou mais dos exões 1, 2, 3, 4 ou 5.

Tendo identificado o papel crítico da via de IL-9 em alergia atópica, hiperreactividade brônquica e asma, a requerente descreve num aspecto de referência, um método para o diagnóstico de susceptibilidade a alergia atópica, asma e distúrbios relacionados. Por último, a requerente descreve um método para ensaiar as funções de IL-9 e o seus receptores para identificar compostos ou agentes que podem ser administrados numa quantidade suficiente para regular negativamente a expressão ou funções de IL-9 e o receptor de IL-9.

As figuras em anexo, as quais são aqui incorporadas e constituem uma parte desta descrição, ilustram diversas formas de realização da invenção e, em conjunto com a descrição, servem para explicar o princípio da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: Mapa que apresenta a ordem relativa e distância em centiMorgans [cM] entre os marcadores genéticos polimórficos úteis para o mapeamento de genes relacionados com asma.

Figura 2: Ilustração do mapa genético do cromossoma humano 5q31-q33 e regiões sinténicas no murganho. 18

Figura 3: A curva de classificação de LOD no cromossoma de murganho 13 para resposta das vias aéreas induzidas por atracurium em murganhos com susceptibilidade aumentada aos estímulos broncoconstritores.

Figura 4: Alinhamento de sequências de aminoácidos correspondentes ao exão 5 dos genes de IL-9 de humano e de murino. A primeira sequência é traduzida a partir do alelo Thr do gene humano. A sequência do meio é traduzida a partir do alelo Met do gene humano. A sequência final é traduzida a partir do gene de murino.

Figura 5: Histograma da correlação entre os alelos do gene humano de il-9 e os títulos de igE total no soro medidos em unidades internacionais. S/S denota indivíduos Thr/Thr, S/R denota indivíduos Thr/Met e R/R denota os indivíduos Met/Met.

Figura 6: ilustração do polimorfismo de sequência repetida no locus IL-9.

Figura 7: Sequência de ADNc traduzida da versão Thrll7 de IL-9.

Figura 8: Sequência de ADN traduzida da versão Metll7 de IL-9.

Figura 9: Mapa da construção de expressão em pFlag com Thr117.

Figura 10: Sequência da construção de expressão em pFlag para a versão Thrll7 do ADNc da região que rodeia o sítio de ligação. 19

Figura 11: Mapa da construção de expressão em pFlag com Metll7.

Figura 12: Sequência da construção de expressão em pFlag para a versão Metll7 do ADNc da região que rodeia o sitio de ligação.

Figura 13: Transferência de Western das proteínas IL-9 recombinantes.

Figura 14: Sequências de aminoácidos de péptidos inibidores .

Figura 15: Inibição por KP-16 da proliferação de M07e mediada por IL-9.

Figura 16: Inibição por KP-20 da proliferação de M07e mediada por IL-9.

Figura 17: Inibição por KP-23 da proliferação de M07e mediada por IL-9.

Figura 18: Inibição por vários tirofostinos da proliferação de M07e mediada por IL-9 • Figura 19: inibição por vários aminoesteróis da proliferação de M07e mediada por IL-9 • Figura 20: Caracterização do papel de IL-9 na resposta ao antigénio in vivo. 20

Figura 21: Exame histológico de pulmões de animais controlo, expostos a ova, e pré-tratados com anti-lL-9.

Figura 22: Inibição da resposta ao antigénio em resposta in vivo por anticorpos bloqueantes contra o receptor de IL-9 de murino.

Figura 24: Expressão de Metll7 IL-9 e Thrll7 IL-9 humanas.

Figura 25: Ligação das formas Metll7 e Thrll7 de IL-9 humanas recombinantes a um receptor solúvel.

Figura 26: Niveis de IL-9 no estado em esplenócitos de murino não estimulados e estimulados.

Figura 27: Um apêndice de unidades químicas.

Figura 28: Aminoesteróis isolados a partir de tubarão cação.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A requerente resolveu as necessidades na técnica pela elucidação de uma via da IL-9 e de composições que afectam essa via, que podem ser utilizadas no diagnóstico, prevenção ou tratamento de alergia atópica, incluindo asma e distúrbios relacionados. A asma envolve distúrbios inflamatórios das vias aéreas com obstrução reversível do fluxo de ar. A alergia tópica refere-se a atopia e distúrbios relacionados incluindo asma, hiperreactividade brônquica (BHR), rinites, urticária, distúrbios inflamatórios alérgicos do intestino e várias formas 21 de eczema. A atopia é uma hipersensibilidade aos alergénios ambientais expressos como a subida da IgE total no soro ou respostas anormais de ensaios cutâneos a alergénios em comparação com os controlos. A BHR refere-se a hiperreactividade brônquica, uma resposta broncoconstritora intensificada contra uma variedade de estimulos.

Por análise do ADN de famílias que exibem distúrbios relacionados com asma, a requerente identificou um polimorfismo no gene de IL-9 que se correlaciona com a variabilidade biológica da IgE total no soro como uma expressão mensurável de atopia. 0 gene de IL-9 (também conhecido como Factor 1 Associado a Asma ou AAFl) refere-se ao locus genético da interleucina-9, uma citocina que exibe uma variedade de funções que envolvem a regulação de sistemas mielóides e linfóides humanos. 0 gene IL-9 encontra-se na região q31-q33 do cromossoma humano 5 e cromossoma 13 no murganho.

Por polimorfismo, a requerente entende uma alteração numa sequência de ADN específica, denominado um "locus", da sequência prevalecente. Em geral, um locus é definido como polimórfico quando os técnicos identificaram dois ou mais alelos que incluem esse locus e o alelo menos comum existe com uma frequência de 1% ou mais. 0 presente polimorfismo leva a uma substituição de aminoácidos no resíduo 117 de IL-9. Especificamente, em vez do aminoácido hidrofílico treonina, a IL-9 exibe o aminoácido hidrofóbico metionina (Met IL-9). Num nível genético, o polimorfismo é uma substituição de um resíduo de timina por um resíduo de citosina na posição do resíduo de citosina na posição do nucleótido 3365 no gene da IL-9 humano como é descrito por 22

Renauld e colegas (1990) [números de acesso do GenBank M30135 e M30136]54, ou na posição de nucleótido comparável 4244 da sequência do gene da IL-9 humano reportada por Kelleher et al., (1991) [número de acesso GenBank M86593].

Os indivíduos com a treonina (Thr) no aminoácido 117 de IL-9 em qualquer um ou em ambos os alelos (Thr/Thr ou Thr/Met) geralmente exibem susceptibilidade a um fenótipo asmático ou de alergia atópica e estes genótipos são caracterizados por um elevado nível médio de IgE total no soro nas populações estudadas. Em contraste, os indivíduos com uma metionina (Met) no codão 117 de IL-9 em ambos os alelos (Met/Met) exibem uma ausência de asma, algumas respostas anormais ao ensaio cutâneo, e a baixa IgE total no soro. Deste modo, o genótipo Met/Met de IL-9 parece proteger contra asma ou alergia atópica.

De acordo com o exposto, num aspecto de referência uma molécula de ADN purificada e isolada compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica interleucina 9 humana contendo metionina na posição 117 (Met IL-9) ou um seu fragmento é descrito. O aspecto também inclui sequências degeneradas do ADN, assim como sequências que são substancialmente homólogas. A origem da IL-9 é humana. Alternativamente, o ADN ou seu fragmento pode ser sintetizado utilizando métodos conhecidos na técnica. É também possível produzir o composto por técnicas de engenharia genética, através de construção de ADN por qualquer técnica aceite, clonagem do ADN num veículo de expressão e transfecção do veículo numa célula que irá expressar o composto. Ver, por exemplo, os métodos apresentados em Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press [1985] . 23 A hiperreactividade das vias aéreas é encontrada em praticamente todos os asmáticos e nalgumas linhagens consanguíneas de murganhos (DBA/2)84. A hiperreactividade das vias aéreas é um factor de risco no desenvolvimento da asma em humanos e é utilizada em modelos animais da asma como uma medida fisiológica para avaliação da eficácia do tratamento para a asma. Estes dados, em conjunto com os resultados do mapeamento genético em humanos79 e em murino (ver Exemplos 1 e 2) sugerem um papel critico do produto do gene da IL-9 de murino na resposta das vias aéreas do murganho. Em particular, os murganhos DBA/2(D2) hiper-reactivos diferem dos murganhos C57BL/6(B6) hiporreactivos84 na expressão dos níveis de estado estacionário da IL-9 (ver Exemplo 14, Figura 26). Além disso, o pré-tratamento com anticorpos de bloqueio à lL-9/receptor da IL-9 pode proporcionar, facultativamente, a protecção completa da hiperreactividade e inflamação das vias aéreas induzidas pelo antigénio, em murganhos, demonstrando um papel regulador crítico para a IL-9 nestas respostas imunitárias. Assim, estes dados demonstram que, embora diferentes alterações moleculares produzam variabilidade biológica na reactividade das vias aéreas, em humanos e em murganhos, estas alterações aparecem no(s) mesmo(s) gene(s) (IL-9/IL-9R) que regula(m) esta via. Tomadas em conjunto, estas observações confirmam o papel crítico da IL-9 e do receptor da IL-9 na hiperreactividade das vias aéreas, na asma e na alergia atópica. Mais ainda, estes dados demonstram que os agentes da convenção, os quais bloqueiam a interacção da IL-9 com o receptor da mesma, protegem contra uma resposta induzida por antigénio, tal como as detalhadas acima.

Uma prova adicional da definição do papel crítico da IL-9 na patogénese da asma deriva, directamente, da observação da requerente de que a IL-9 é crítica para um certo número de 24 respostas induzidas por antigénio, em murganhos. Quando as funções da IL-9 são reguladas negativamente pelo pré-tratamento dos anticorpos, antes da exposição ao aerossol com antigénio, os animais podem ser totalmente protegidos em relação às respostas induzidas por antigénio. Estas respostas incluem: a hiperreactividade brônquica, a eosinofilia e as contagens celulares elevadas nas lavagens bronquiais, as alterações histológicas nos pulmões associadas com inflamação e a IgE sérica total elevada. Assim, o tratamento de hiperreactividade brônquica que é critico para a patogénese de alergia atópica e que caracteriza a inflamação alérgica associada com a asma, através da regulação negativa das funções da IL-9, está dentro do âmbito da presente invenção. A requerente também descreve a regulação da actividade de IL-9 através da administração de "agonistas e antagonistas" ao receptor de IL-9. 0 especialista na técnica reconhecerá, rapidamente, que todas as moléculas contendo o requisito de conformação estrutural 3-dimensional e que contêm os residuos essenciais ou críticos para a ligação ao receptor estão no âmbito desta invenção. A requerente mostrou que os péptidos KP-16 (residuos 43-60 deIL-9) e KP-20 (residuos 71-90 de IL-9) (produzidos utilizando técnicas convencionais de sintese automatizada de péptidos, por exemplo, o Peptide Synthesizer Modelo 431A da Applied Biosystems) actuam como antagonistas de IL-9. Especificamente, a requerente demonstrou que os residuos 43-60 e 71-90 da proteína madura parecem ser importantes para a ligação ao receptor. Adicionalmente, estes resíduos incluem a maior parte do exão 4 (aminoácidos 44-88) e prevê-se formarem estruturas hélicas anti-paralelas. A estrutura tridimensional da proteína sugere que, especificamente, a serina 52 e/ou ácido glutâmico 53 interagem com a lisina 85, a serina 56 interage com 25 a lisina 82 e a treonina 59 interage com a valina 78. As coordenadas tridimensionais destas hélices paralelas e os grupos funcionais relacionados representam o requisito de conformação 3-dimensional critico para a ligação ao receptor e os compostos que simulam estas relações estão no âmbito desta invenção. A demonstração de uma sequência de IL-9 associada com o fenótipo semelhante ao da asma e de um associado com a ausência de um fenótipo semelhante ao da asma, indica que a resposta inflamatória dos pulmões ao antigénio é dependente da il-9 e, por isso, que a regulação negativa da função da IL-9 deverá proteger contra a resposta induzida pelo antigénio. Além disso, a requerente descreve também métodos de diagnóstico da susceptibilidade a alergia atópica e distúrbios relacionados e para o tratamento destes distúrbios com base na relação entre IL-9 e o seu receptor.

Um receptor é um componente de ligação solúvel ou membranar que reconhece e se liga às moléculas e o receptor da IL-9 (também conhecido como Factor Associado à Asma 2 ou AAF2) da invenção é o componente que reconhece e se liga à IL-9. As funções do receptor da IL-9 consistem na ligação de uma molécula semelhante à IL-9 e na propagação do seu sinal regulador em células especificas57”60. Uma interrupção dessa função conduzirá a uma regulação negativa, i. e., à redução quer da expressão da IL-9 quer das funções controladas pela IL-9. Por consequência, em virtude desta interacção entre a IL-9 e o receptor da IL-9, certas funções do organismo são moduladas ou controladas. Para uma discussão geral sobre receptores, ver, Goodman e Gilman, "The Pharmacologic Basis of Therapeutics", (Sétima Edição, McMillan Publishing Company, N.I., EUA, 1985). 26

Um aspecto de diagnóstico envolve o reconhecimento de variações na sequência de ADN de IL-9. Um método envolve a introdução de uma molécula de ácido nucleico (também conhecida como uma sonda) possuindo uma sequência complementar a IL-9 sob condições de hibridação suficientes, como será facilmente entendido pelos da técnica. Num aspecto, a sequência ligar-se-à especificamente à Metll7 IL-9 ou a Thrll7 IL-9 e, noutra forma de realização, ligar-se-à a Metll7 IL-9 e a Thrll7 IL-9. Outro método de reconhecimento de variação de na sequência de ADN associada com estes distúrbios é a análise directa da sequência de ADN sequência por múltiplos métodos bem conhecidos na técnica77. Outro aspecto envolve a detecção de variação na sequência de ADN no gene de IL-9 gene associada com estes distúrbios73-77. Estes incluem a reacção de polimerização em cadeia, análise de polimorfismo de tamanho de fragmento por restrição (RFLP) e análise conformacional de cadeia única. Num aspecto preferido, a requerente proporciona, especificamente, um método para reconhecer, ao nivel genético, o polimorfismo na IL-9 associada com os alelos Thr e Met utilizando um Styl RFLP como aqui descrito. Noutro aspecto Nla, Pfiml, PflMl, e Ncol RFLP podem ser utilizados para distinguir estes dois alelos de genes de IL-9.

Outro aspecto envolve o tratamento de alergia atópica e distúrbios relacionados. Num aspecto preferido, a requerente proporciona um método de administração de um composto possuindo actividade comparável a Met IL-9 e a capacidade para se ligar a um receptor de IL-9 numa quantidade suficiente para regular negativamente a actividade de IL-9. Um composto possuindo actividade comparável a Met IL-9 é um composto que funciona do mesmo modo mas que não é necessariamente idêntico. Deste modo, pode ligar-se ao receptor de IL-9 mas sem os mesmos efeitos 27 fisiológicos. Os exemplos incluem as sequências de aminoácidos de IL-9 contendo várias mutações pontuais e/ou deleções e sequências substancialmente homólogas destas. Por exemplo, este composto pode interromper a ligação de Thr IL-9 ao receptor de IL-9 conforme medido por técnicas conhecidas na técnica. A invenção também inclui fragmentos funcionalmente eficazes das sequências de aminoácidos acima. Numa destas técnicas, a Thr IL-9 pode ser considerada um "ligando" para o receptor de IL-9 e a ligação entre as duas pode ser avaliada por ensaios de ligação ao ligando são bem conhecidos na técnica como apresentado em Goodman e Gilman's The Pharmacologic Basis of Therapeutics (Sétima Edição, MacMillan Publishing Company, N.I. EUA, 1985).

Noutro aspecto, o composto pode parecer o alelo Met de IL-9 na estrutura. Deste modo, tal composto pode incorporar uma metionina no codão 117 de IL-9 ou pode incorporar outro aminoácido hidrofóbico. Deste modo, outros aspectos são variantes de IL-9 compreendendo substituições de Thr na posição 117 por aminoácidos seleccionados do grupo consistindo em alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina. Alternativamente, o composto pode existir como um fragmento de IL-9 com uma composição estrutural semelhante a Met IL-9. Noutro aspecto o composto pode reter funções comparáveis a Met IL-9, mas pode não parecer Met IL-9 na estrutura. Por exemplo, a composição do composto pode incluir outras moléculas para além de aminoácidos.

Os ensaios específicos podem ser baseados na regulação conhecida de IL-9, em parte, na proliferação de linfócitos T, síntese de IgE e libertação a partir de mastócitos54-60 . Outro ensaio envolve a capacidade da IL-9 humana induzir especificamente a fosforilação de tirosina rápida e transiente 28 de várias proteínas em células M07e57. Porque esta resposta é dependente da expressão e activação do receptor de IL-9, representa um método simples ou ensaio para a caracterização de compostos potencialmente valiosos. A fosforilação da tirosina do factor de transcrição Stat3 parece estar especificamente relacionada com as acções de il-958 e esta resposta representa um método simples ou ensaio para a caracterização de compostos na invenção. Ainda outro método para caracterizar a função de IL-9 e moléculas semelhantes a IL-9, envolve o bem conhecido clone TSl e o clone DlO de murino disponíveis na ATCC utilizados para avaliar a função da IL-9 humana com um ensaio de proliferação celular59. A Met IL-9 que forma uma parte da invenção pode ser vista como um "agonista fraco" do receptor de IL-9. 0 termo agonista, de acordo com esta invenção, inclui compostos que mimam, pelo menos, alguns dos efeitos de compostos endógenos através da interacção ou ligação com um receptor. Os agonistas que interagem ou se ligam ao receptor de IL-9 na superfície de certas células iniciam uma série de alterações bioquímicas e fisiológicas que são características destas acções das citocinas. Para identificar outros agonistas fracos da invenção, pode testar-se para a ligação ao receptor de IL-9 ou para as funções semelhantes a IL-9 como aqui descrito e na literatura citada2'45-51'54-60 . A presente invenção também inclui antagonistas de IL-9 e o seu receptor. Os antagonistas são compostos que são por si desprovidos de actividade farmacológica mas causa efeitos prevenindo a acção de um agonista. Para identificar um antagonista da invenção, pode testar-se para a ligação competitiva com um agonista conhecido ou para a regulação negativa de funções semelhantes a IL-9 como aqui descrito e na literatura citada.^ 45-51,54-60 29 A ligação do agonista ou antagonista pode envolver todos os tipos conhecidos de interacções incluindo forças iónicas, ligações de hidrogénio, interacções hidrofóbicas, forças de van der Waals e ligações covalentes. Em muitos casos, ligações de vários tipos são importantes na interacção de um agonista ou antagonista com um receptor.

Num outro aspecto, estes compostos podem ser análogos de IL-9. Os análogos de IL-9 podem ser produzidos por mutações pontuais na sequência de ADN isolada para o gene, substituições de nucleótidos e/ou deleções que podem ser criadas por métodos que são todos bem descritos na técnica.62 Esta descrição também inclui variantes de excisão/união de IL-9 e divulgam as sequências de ácido nucleico isoladas de interleucina-9, que contêm deleções de um ou mais dos seus cinco exões. 0 termo "variantes de excisão/união", como aqui utilizado, denota uma molécula de ADN purificada e isolada que codifica IL-9 humana compreendendo, pelo menos, um exão. Não existe evidência de mutantes de excisão/união expressos naturalmente na técnica. Deste modo, o presente aspecto proporciona um ácido nucleico isolado contendo os exões 1, 4 e 5 da IL-9 humana. Outras variantes incluem sequências compreendendo os exões 1, 2, 3, 4, e 5; exões 1, 2, 3, e 4; exões 1, 2, 4, e 5 e exões 1, 3, 4, e 5. Deve ser entendido que estes exões podem conter várias mutações pontuais.

Exemplos específicos de péptidos antagonistas derivados de IL-9 incluem KP-16 (SEQ. ID N° 13) e KP-20 (SEQ. ID N° 14) que são derivados do exão 4. 0 exão 4 codifica 44 aminoácidos enquanto os péptidos acima mencionados contêm 16 e 20 aminoácidos, respectivamente, e estes não se sobrepõem. Estes péptidos exibem actividade inibidora considerável 30 individualmente e quando ensaiados em combinação. Adicionalmente, KP-23 (SEQ ID N° 15) e KP-24 (SEQ ID N° 16) são derivados do exão 5 e também exibem actividade semelhante. As variantes de excisão/união de IL-9 podem ser formadas por deleção de qualquer um ou mais dos exões 1 a 5 de IL-9. Como apresentado acima, os péptidos derivados destes exões apresentam uma capacidade reguladora e, de acordo com o exposto, são úteis no tratamento de alergias atópicas, incluindo asma. É conhecido na técnica que, em sistemas multienzimáticos, a primeira enzima ou enzima reguladora pode ser activada ou inibida pelo produto final do sistema multienzimático. Quando a concentração do produto final aumenta para além da concentração do estado estacionário, o produto final actuará como um activador ou inibidor especifico da enzima reguladora na sequência. Este mecanismo de retroacção é também relevante para o sistema de IL-9 e é observado que os vários polipéptidos são capazes de exercer este controlo de activação ou inibição na actividade do receptor de IL-9 e, possivelmente, a expressão ou função de outras citocinas e seus receptores que desempenham um papel na patogénese da asma. A invenção também inclui modificações de agonistas ou antagonistas que podem ser preparadas utilizando conhecimento que é rotina para os desta técnica. Por exemplo, a afinidade e um composto para um receptor é, geralmente, proximamente relacionada com a estrutura química do composto. Deste modo, as relações estrutura-actividade podem ser utilizadas para modificar os agonistas e antagonistas da invenção.

Por exemplo, as técnicas de cristalografia/difracção de raios X e RMN podem ser utilizadas fazer modificações da 31 invenção. Por exemplo, pode criar-se uma estrutura tridimensional da IL-9 humana que pode ser utilizada como um molde para construir modelos estruturais de mutantes de deleção utilizando gráficos moleculares. Estes modelos podem ser, então, utilizados para identificar e construir uma molécula de IL-9 mutante com afinidade para o receptor de IL-9 comparável a IL-9, mas com uma actividade biológica menor. 0 que se entende com menor actividade biológica é 2 a 100000 vezes menos do que IL-9, de um modo preferido 100 a 1000 vezes menos do que IL-9.

Ainda noutro aspecto, estes compostos também podem ser utilizados como sondas dinâmicas para a estrutura do receptor e para desenvolver antagonistas do receptor utilizando linhas de células dependentes de IL-9.

Adicionalmente, são também descritos compostos que evitam a síntese ou reduzem a estabilidade biológica de IL-9 ou o receptor de IL-9. A estabilidade biológica é uma medida do tempo entre a síntese da molécula e a sua degradação. Por exemplo, a estabilidade de uma proteína, péptido ou péptido mimético89 terapêutico pode ser prolongada utilizando D-aminoácidos, ou encurtada por alteração da sua sequência para o tornar mais susceptível à degradação enzimática.

Numa outra forma de realização, os agonistas e antagonistas da invenção são anticorpos para a IL-9 ou para o receptor da IL-9. Os anticorpos para a IL-9 e para o seu receptor podem ser tanto monoclonais como policlonais, preparados utilizando técnicas convencionais bem conhecidas na técnica (ver, Harlow & Lane, "Antibodies - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Estes podem ser utilizados para bloquear a ligação de IL-9 ao receptor. Numa forma de 32 realização, os anticorpos interactuam com a IL-9. Numa outra forma de realização, os anticorpos interactuam com o receptor da IL-9. A il-9 utilizada para originar estes anticorpos pode ser qualquer uma das variantes de IL-9 acima discutidas.

Os anticorpos também são produzidos a partir de sequências peptidicas da IL-9 ou do receptor da IL-9 utilizando técnicas convencionais na técnica {ver, "Protocols in Immunology",

Capítulo 9, Wiley). As sequências peptidicas, a partir do receptor da IL-9 de murino, que podem ser utilizadas para produzir o bloqueio dos antissoros foram identificadas como: GGQKAGAFTC (resíduos 1-10) (SEQ ID N° 19); LSNSIYRIDCHWSAPELGQESR (resíduos 11 -32) (SEQ ID N° 20) ; e CESYEDKTEGEYYKSHWSEWS (resíduos 184 -203 com um resíduo Cys adicionado no terminal N para acoplamento do péptido à proteína transportadora) (SEQ ID N° 21). Adicionalmente, foi identificado um epitopo, que se liga a um anticorpo de bloqueio direccionado para o receptor da IL-9 humana, como os resíduos 8-14 do receptor da IL-9 humana madura. Também foram identificados o (TCLTNNI) (SEQ ID N° 22) e dois epitopos que se ligam a anticorpos de bloqueio direccionados para a IL-9 humana, como os resíduos 50 a 67 (CFSERLSQMTNTTMQTRY) (SEQ ID N° 17) e OS resíduos 99 a 116 (TAGNALTFLKSLLEIFQK) (SEQ ID N° 16). Os epitopos humanos bem como os péptidos humanos que correspondem aos péptidos que produzem anticorpos de bloqueio nas sequências de murino são, muito provavelmente, úteis para a produção de anticorpos terapêuticos.

Ainda noutra forma de realização, os compostos da invenção podem ser acoplados a unidades químicas, incluindo proteínas que alteram as funções ou a regulação da via de IL-9 para benefício terapêutico na alergia atópica e asma61. Estas proteínas podem 33 incluir em combinação outras citocinas e factores de crescimento incluindo67 IL-4, IL-5, IL-3, IL-2, IL-13 e IL-10 que podem oferecer beneficio terapêutico adicional na alergia atópica e asma. Adicionalmente, a IL-9 da invenção pode também ser conjugados através de fosforilação e conjugados com biotinilados, tioato, acetilato, iodinato e qualquer dos reagentes de reticulação apresentados na Figura 27 (Pierce).

Numa outra forma de realização, a invenção inclui a regulação negativa de expressão de il-9 ou função por administração das moléculas solúveis do receptor de IL-9 que se ligam a IL-9. Renauld et al.59 mostraram a existência de uma forma solúvel do receptor de IL-9. Esta molécula pode ser utilizada para evitar a ligação de il-9 ao receptor ligado à célula e actuar como um antagonista de IL-9. Os receptores solúveis foram utilizados para ligar citocinas ou outros ligandos para regular a sua função.97 Um receptor solúvel é uma forma do receptor ligado à membrana que ocorre em solução ou fora da membrana. Os receptores solúveis podem ocorrer porque o segmento da molécula que normalmente se associa com a membrana está ausente. Este segmento é normalmente referido na técnica como o domínio transmembranar do gene ou segmento de ligação à membrana da proteína. Deste modo, em uma forma de realização da invenção, um receptor solúvel pode representar um fragmento ou um análogo do receptor ligado à membrana. Noutra forma de realização da invenção, a estrutura do segmento que se associa com a membrana pode ser modificada (e. g. polimorfismo da sequência de ADN ou mutação no gene) de modo que o receptor não seja inserido na membrana, ou o receptor é inserido, mas não é retido na membrana. Deste modo, um receptor solúvel, em contraste com a correspondente forma ligada à membrana, difere 34 em um ou mais segmentos do gene ou proteína do receptor que são importantes para a sua associação com a membrana52,53 .

Estes compostos podem ser formas conhecidas de um receptor solúvel de IL-9 que actua para se ligar a IL-9. Alternativamente, estes compostos podem assemelhar-se a formas conhecidas do receptor de IL-9, mas podem existir como fragmentos. Noutra forma de realização da invenção, o composto pode reter funções comparáveis ao receptor solúvel de IL-9, mas pode não se assemelhar ao receptor solúvel de IL-9 na composição. Por exemplo, a composição do composto pode incluir moléculas que não sejam aminoácidos. Deste modo, estes compostos irão ligar-se a IL-9 e prevenir que IL-9 actue no seu receptor de superfície celular.

Outro aspecto refere-se a terapia génica ou de anti-sentido. É agora conhecido na técnica que moléculas de ADN alteradas podem ser concebidas para proporcionar um efeito seleccionado específico, quando proporcionadas como terapia génica ou de anti-sentido. 0 segmento de ADN nativo que codifica para o receptor de IL-9, possui, como todas as cadeias de ADN de outros mamíferos, duas cadeias; uma cadeia de sentido e uma cadeia anti-sentido mantidas ligadas por ligações de hidrogénio. 0 ARNm que codifica para o receptor possui uma sequência de nucleótidos idêntica à cadeia de sentido, com a substituição esperada de timidina por uridina. Deste modo, com base no conhecimento da sequência do receptor, podem ser sintetizados oligonucleótidos sintéticos. Estes oligonucleótidos podem ligar-se ao ADN e ARN que codifica para o receptor. Os fragmentos activos da invenção, que são complementares ao ARNm e a cadeia codificante de ADN, têm normalmente, pelo menos, cerca de 15 nucleótidos, mais normalmente, pelo menos, 20 nucleótidos, 35 de um modo preferido, 30 nucleótidos e de um modo mais preferido pode ter 50 nucleótidos ou mais. A força da ligação entre as cadeias de sentido e anti-sentido é dependente das ligações de hidrogénio totais. Por isso, com base no número total de bases no ARNm, o comprimento óptimo da sequência de oligonucleótidos pode ser facilmente calculado pelo especialista na técnica. A sequência pode ser complementar a qualquer porção da sequência do ARNm, í. e., pode ser próxima do terminal 5' ou sitio de protecção ou a jusante do sítio de protecção, entre o sitio de protecção e o codão de iniciação e pode cobrir a totalidade ou apenas uma porção da região não codificante ou a região codificante. 0(s) sítio(s) particular (es) aos quais a sequência anti-sentido se liga irá (irão) variar dependendo do grau de inibição desejada, da singularidade da sequência, da estabilidade da sequência anti-sentido, etc.

Na prática deste aspecto, a expressão do receptor de IL-9 é regulada negativamente pela administração de uma quantidade eficaz de sequências de oligonucleótidos anti-sentido sintéticos descritos acima. Os compostos oligonucleotídicos da invenção ligam-se ao ARNm que codifica para IL-9 humana ou receptores de IL-9 inibindo, desse modo, a expressão (tradução) destas proteínas. Ver Gruss et al., "Interleukin 9 is expressed by primary and cultural Hodgkin and Reed-Sternberg cells." Câncer Res. 52:1026-31 (15 Fev. 1992).

As sequências de ADN isoladas que contêm várias mutações tais mutações pontuais, inserções, deleções, ou mutações de excisão/união de IL-9 são úteis também em terapia génica. 36

Adicionalmente à regulação directa do receptor de IL-9, um aspecto de referência também engloba métodos de regulação a jusante que envolve a inibição de transdução de sinal. Em particular, um outro aspecto refere-se à inibição da fosforilação da tirosina. É conhecido na técnica que as reacções de transferência de fosforilo altamente exergónica são catalisadas por várias enzimas conhecidas como cinases. Por outras palavras, uma cinase transfere grupos fosforilo entre ATP e um metabolito. A IL-9 induz a fosforilação da tirosina de múltiplas proteínas; é conhecido na técnica que, adicionalmente, à activação de cinases de tirosina JAKl e JAK3, a IL-9 também induz a fosforilação da tirosina de Stat356. A fosforilação de Stat3 é única para a via de transdução de sinal de IL-9 e isso é um alvo correcto para os inibidores54. Este aspecto inclui tirfostinas que são inibidores específicos de cinases de tirosina de proteína. Deste modo, as tirfostinas (obtidas por exemplo de Calbiochem) e outros inibidores semelhantes destas cinases são úteis na modulação de transdução de sinal e são úteis no tratamento de alergias atópicas e asma.

Ainda noutro aspecto, verificou-se, surpreendentemente, que os compostos de aminosterol são também úteis na inibição da transdução de sinal devido a estimulação de IL-9. Os compostos de aminosterol que são úteis são descritos no Pedido de Patente U.S., N° de Série 08/290826 e os seus pedidos relacionados 08/416883 e 08/478763 assim como em 08/483059 e nos seus pedidos relacionados 08/483057, 08/479455, 08/979957, 08/475572, 08/476855, 08/474799 e 08/487443. 37

Adicionalmente, estão incluídas composições farmacêuticas compreendendo os compostos da invenção, em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo os de origem no petróleo, animal, vegetal ou sintética, tais como o óleo de amendoim, o óleo de sementes de soja, o óleo mineral, o óleo de sésamo, e semelhantes. A água é um veículo preferido quando a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa. Também podem ser empregues como veículos líquidos as soluções de soro fisiológico e soluções aquosas de dextrose e glicerol, em particular, para soluções injectáveis. São descritos veículos farmaceuticamente aceitáveis em, Martin, E. W., Remington's Pharmaceutical Sciences.

Os compostos utilizados no método de tratamento podem ser administrados por via sistémica ou tópica, dependendo de considerações como o estado a ser tratado, a necessidade de tratamento em local específico, a quantidade do fármaco a ser administrada e considerações semelhantes.

Pode ser utilizada a administração tópica. Pode ser empregue qualquer formação tópica comum, tal como uma solução, suspensão, gel, unguento ou pomada e semelhantes. A preparação de tais formulações tópicas, são bem descritas na técnica das formulações farmacêuticas como exemplificado, por exemplo, em "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17a Edição, Mack Publishing Company, Easton, Pa. Para aplicação tópica, estes compostos também podem ser administrados como um pó ou spray, em particular, na forma de aerossol. 0 ingrediente activo pode ser administrado em composições farmacêuticas adaptadas para administração sistémica. Tal como é conhecido, se um fármaco é 38 para ser administrado sistemicamente, ele pode ser preparado na forma de pó, pílula, comprimidos, e que tais, ou na forma de um xarope ou elixir para administração oral. Para administração intravenosa, intraperitoneal ou intralesional, o composto será preparado na forma de uma solução ou suspensão capaz de ser administrada por meio de injecção. Em certos casos, pode ser útil formular estes compostos na forma de supositório ou numa formulação de libertação prolongada para depositar debaixo da pele ou injecção intermuscular. Numa forma de realização preferida, os compostos desta invenção são administrados por inalação. Para terapia de inalação, o composto pode estar numa solução útil para administração através de inaladores doseadores ou numa forma adequada para um inalador de pó seco.

Uma quantidade eficaz é aquela quantidade que vai fazer a regulação negativa quer da expressão da IL-9 quer das funções controladas pela IL-9. Uma dada quantidade eficaz irá variar de estado para estado e, em certas circunstâncias, pode variar com a gravidade do estado a ser tratado e da susceptibilidade do doente ao tratamento. Por conseguinte, para um dado instante e lugar, uma dada quantidade eficaz será mais bem determinada através de experimentação de rotina. Contudo, de acordo com a presente invenção, é previsível que no tratamento dos distúrbios relacionados com a asma constituirá, normalmente, uma quantidade terapeuticamente eficaz uma formulação que contenha entre 0,001 e 5%, em massa, de um modo preferido, entre cerca de 0,01 a 1%. Quando administrada por via sistémica, uma quantidade entre 0,01 e 100 mg por kg de massa corporal, por dia, mas, de um modo preferido, cerca de 0,1 a 10 mg/kg, resultará, em muitos casos, num resultado terapêutico. 39 A requerente também fornece um método de rastreio para os compostos que fazem a regulação negativa quer da expressão da IL-9 quer das funções controladas pela IL-9. É possível determinar se as funções expressas pela IL-9 são reguladas negativamente utilizando técnicas padrão na técnica57-60. Num aspecto específico, a requerente fornece um método para a identificação de compostos com funções comparáveis à Met IL-9. Assim, num aspecto, a IgE sérica total pode ser medida utilizando técnicas bem conhecidas na técnica42 para avaliar a eficácia de um composto na regulação negativa das funções da IL-9, in vivo. Noutro aspecto, a hiperreactividade brônquica, a lavagem broncoalveolar e a eosinofilia podem ser medidas utilizando técnicas bem conhecidas na técnica42 para avaliar a eficácia de um composto na regulação negativa das funções da IL-9, in vivo. Ainda, noutro aspecto, as funções da IL-9 podem ser avaliadas, in vitro. Como é do conhecimento dos especialistas na técnica, a IL-9 humana induz, de forma específica, a fosforilação rápida e transitória da tirosina de múltiplas proteínas em células M07e. A fosforilação da tirosina do factor transcripcional Stat3 parece estar relacionada, de forma específica, com as acções da IL-9. Outro método para caracterização da função da IL-9 e de moléculas semelhantes à IL-9 que dependem da "expressão estável" do receptor da IL-9, utiliza os bem conhecidos clones TS1 de murino para avaliar a função da IL-9 humana através de um ensaio de proliferação

C Q celular .

Um aspecto inclui, também, um ensaio de rastreio simples para ligação saturável e específica do ligando, com base em linhas celulares que expressam para o receptor da IL-946'59. 0 receptor da IL-9 é expresso numa vasta variedade de tipos de células, incluindo as células K562, C8166-45, as células B, as 40 células T, os mastócitos, os neutrófilos, os megacariócitos (células UT-7)53 as linhas celulares da leucemia megacarioblástica humana M07e57, TFl,59 os macrófagos, os timócitos fetais, a linha celular do rim humano 29353 e as linhas celulares progenitoras hipocampais embrionárias de murino46,52'53. Num outro aspecto, pode ser utilizado o receptor da il-9, solúvel, para avaliar a ligação do ligando e os antagonistas potenciais do receptor. A prática da presente invenção empregará os termos convencionais e as técnicas de biologia molecular, farmacologia, imunologia e bioquímica que são do conhecimento corrente dos especialistas na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et ai., "MOLECULAR CLONING - A LABORATORY MANUAL", 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1985) ou Ausubel et ai., "CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY", JOHN WILEY & SONS, INC., (1994).

Todavia, é fornecida a seguinte informação básica de fundo. 0 material genético do corpo ou ADN, está organizado em 46 cromossomas, em que cada um compreende dois braços unidos por um centrómero. Cada cromossoma é dividido em segmentos designados p ou q. O símbolo p é utilizado para identificar o braço curto de um cromossoma, conforme medido a partir do centrómero até ao telómero mais próximo. O braço comprido de um cromossoma é designado pelo símbolo q. A localização de um cromossoma é proporcionada pelo número do cromossoma (i. e., cromossoma 5) assim como as coordenadas da região p ou q (i. e., q31-q33). Adicionalmente, o corpo contém os cromossomas sexuais, X e Y. Durante a meiose, os cromossomas X e Y permutam informação de sequência de ADN em áreas conhecidas como as regiões pseudoautossómicas. 41 ADN, ácido desoxirribonucleico, consiste em duas cadeias complementares de nucleótidos, que incluem os quatro compostos de base diferentes, adenina [A], timina [T], citosina [C] e guanina [G] . A de uma cadeia liga-se com T da outra cadeia enquanto que a C de uma cadeia se liga a G da outra para formar "pares de bases" complementares, possuindo, cada par, uma base em cada cadeia.

Um agrupamento sequencial de três nucleótidos [um "codão"] codifica para um aminoácido. Deste modo, por exemplo, os três nucleótidos CAG codificam para o aminoácido Glutamina. Os 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente e os seus códigos de uma letra, são como se segue:

Alanina Ala A Arginina Arg R Asparagina Asn N Ácido aspártico Asp D Asparagina ou Ácido aspártico Asx B Cisteina Cys C Glutamina Gin Q Ácido de Glutamina Glu E Glutamina ou Ácido glutâmico Glx Z Glicina Gly G Histidina His H Isoleucina Ile I Leucina Leu L Lisina Lys K Metionina Met M Fenilalanina Phe F 42

Prolina Pro P Serina Ser s Treonina Thr T Triptofano Trp w Tirosina Tyr Y Valina Vai V

Os aminoácidos constituem as proteínas. Os aminoácidos podem ser hidrofílicos, í. e., apresentando uma afinidade para a água ou hidrofóbico, i. e., possuindo uma aversão à água. Deste modo, os aminoácidos designados como G, A, V, L, I, P, F, Y, W, C e M são hidrofóbicos e os aminoácidos designados como S, Q, K, R, H, D, E, N e T são hidrof ílicos. Em geral, a natureza hidrofílica ou hidrofóbica dos aminoácidos afecta a dobragem de uma cadeia peptídica e, consequentemente, a estrutura tridimensional de uma proteína. 0 ADN está relacionado com a proteína como se segue: ADN genómico ---> ARNm ---> proteína

I

I ADNc 0 ADN genómico compreende todas as sequências de ADN que se encontram na célula de um organismo. É "transcrito" em ARN mensageiro ["ARNm"]. 0 ADN complementar ["ADNc"] é uma cópia complementar do ARNm produzida através de transcrição reversa de ARNm. Contrariamente ao ADN genómico, tanto o ARNm como o ADNc contêm apenas as regiões do ADN que codificam a proteína ou que codificam o polipéptido, os denominados "exões." 0 ADN genómico pode também incluir "intrões," que não codificam proteínas. 43

De facto, os genes eucarióticos são descontínuos em relação às proteínas por eles codificados, consistindo em exões interrompidos por intrões. Após a transcrição em ARN, os intrões são removidos por excisão/união para criar o ARN mensageiro maduro (ARNm). Os pontos de excisão entre exões são, tipicamente, determinados por sequências de consenso que actuam como sinais para o processo de excisão. A excisão consiste numa deleção do intrão a partir de um transcrito de ARN primário e uma união ou fusão das extremidades do ARN restante em qualquer um dos lados do intrão excisado. A presença ou ausência de intrões, a composição de intrões e o número de intrões por gene, pode variar entre estirpes da mesma espécie, e entre espécies que possuem o mesmo gene funcional básico. Embora em muitos casos os seja assumido que os intrões não são essenciais e são benignos, a sua categorização não é absoluta. Por exemplo, um intrão de um gene pode representar um exão de outro. Em alguns casos, padrões de excisão alternativos ou diferentes podem criar proteínas diferentes a partir da mesma porção única de ADN. De facto, as características estruturais dos intrões e os mecanismos de excisão subjacentes formam a base para a classificação de diferentes tipos de intrões.

Em relação aos exões, estes podem corresponder a domínios ou motivos discretos, tais como, por exemplo, domínios funcionais, regiões de dobragem, ou elementos estruturais de uma proteína; ou a sequências de polipéptido curtas, tais como curvas reversas, ansas, sinais de glicosilação e outras sequências sinal, ou regiões de ligante de polipéptido não estruturado. Os módulos do exão do presente método combinatório podem compreender sequências de ácido nucleico correspondentes às sequências de exão que ocorrem naturalmente ou sequências de 44 exão que ocorrem naturalmente que foram mutadas (e. g. mutações pontuais, truncagens, fusões).

Regressando agora à manipulação de ADN, o ADN pode ser cortado, excisado e de outra forma manipulado utilizando "enzimas de restrição" que cortam ADN em certos sítios conhecidos e ligases de ADN que unem o ADN. Essas técnicas são bem conhecidas dos especialistas na técnica, como apresentado em textos, tais como Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press [1985] ou Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc. [1994]. 0 ADN de um tamanho e sequência específicos pode ser, então, inserido num "replicão", que é um qualquer elemento genético, tal como um plasmídeo, cosmídeo, ou vírus, que é capaz de replicação sob o seu próprio controlo. Um "vector recombinante" ou "vector de expressão" é um replicão no qual é inserido um segmento de ADN de modo a permitir a expressão do ADN, 1. e., produção da proteína codificada pelo ADN. Os vectores de expressão podem ser construídos no laboratório, obtidos de outros laboratórios ou adquiridos a partir de fontes comerciais. 0 vector recombinante [conhecido por vários termos na técnica] pode ser introduzido num hospedeiro através de um processo genericamente conhecido como "transformação."

Transformação significa a transferência de um segmento de ADN exógeno através de qualquer um de vários métodos, incluindo infecção, incorporação directa, transdução, cruzamento F, microinjecção, ou electroporação numa célula hospedeira. As células hospedeiras unicelulares, conhecidas de forma variada 45 como células hospedeiras recombinantes, células e cultura de células, incluem bactérias, leveduras, células de insectos, células vegetais, células de mamiferos e células humanas. Em formas de realização particularmente preferidas, as células hospedeiras incluem células de E. coli, Pseudomonas, Bacillis, Streptomyces, Leveduras, CHO, Rl-1, B-w, LH, COS-J, COS-7, BSCl, BSC40, BMT10, e S69. As células de leveduras incluem especialmente Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula e Torulopis.

Como será reconhecido pelos especialistas na técnica, a expressão do segmento de ADN pela célula hospedeira requer as sequências ou elementos de regulação apropriados. As sequências reguladoras variam de acordo com a célula hospedeira empregue, mas incluem, por exemplo, em procariotas, um promotor, sítio de ligação ao ribossoma, e/ou um sítio de terminação de transcrição. Em eucariotas, essas sequências reguladoras incluem um promotor e/ou um sítio de terminação de transcrição. Como os especialistas na técnica reconhecerão bem, a expressão do polipéptido pode ser melhorada, i. e., aumentada para acima dos níveis convencionais, por selecção cuidadosa e colocação destas sequências reguladoras.

Noutras formas de realização, os promotores que podem ser utilizados incluem o promotor de citomegalovírus humano (CMV), o promotor indutível da tetraciclina de vírus de símio (SV40), o promotor da repetição terminal da leucemia de murino moloney (LTR), o promotor do vírus do tumor mamário de murino indutível por glucocorticóide (mmtv), promotor da cinase de timidina de herpes, promotores da β-actina de murino e humana, região flanqueadora 5'de de IL-9 HTLVl e HIV, região flanqueadora 5' de receptor de IL-9 humano e de murganho, promotor tac bacteriano e 46 elementos intensificadores da região de ligação da estrutura de choque térmico de Drosophila (SAR). 0 ADN pode ser expresso como um polipéptido de qualquer comprimento, tais como péptidos, oligopéptidos e proteínas. Os polipéptidos também incluem modificações de tradução, tais como glicosilações, acetilações, fosforilaçãos e semelhantes.

Outra técnica de biologia molecular de interesse da presente invenção é "análise de ligação". A análise de ligação é um método analítico utilizado para identificar o cromossoma ou região cromossómica que está correlacionada com uma característica ou distúrbio44. Os cromossomas são as unidades básicas de hereditariedade em que os genes são organizados. Adicionalmente aos genes, os técnicos identificaram "marcadores de ADN" nos cromossomas. Os marcadores de ADN são sequências de ADN conhecidas cuja identidade e sequência pode ser rapidamente determinada. A metodologia de análise de ligação foi aplicada ao mapeamento de genes de doenças, por exemplo, genes relacionados com susceptibilidade a asma, a cromossomas específicos42'44.

Outras formas de realização da invenção serão óbvias para o especialista na técnica a partir da consideração da descrição e prática da invenção divulgada. Pretende-se que as especificações e exemplos sejam considerados exemplares apenas com um âmbito verdadeiro da invenção a ser indicado pelas reivindicações. 47

MÉTODOS

Na realização das experiências descritas nos Exemplos abaixo, a requerente utilizou os seguintes métodos:

Populações de Doentes

As famílias com asmas foram recrutadas de duas fontes27, 42, 29-93, 44 . Em cada caso, os doentes foram genotipados em relação ao polimorfismo na posição 3365 do gene da IL-9 humana [número de acesso no GenBank M30136].

Uma terceira população de 74 indivíduos foi apurada aleatoriamente em relação a asma e atopia da Costa Este dos Estados Unidos. A frequência da substituição de Met no codão 117 foi utilizada como uma estimativa não enviesada da prevalência desta variante na população geral.

Uma quarta população de 49 indivíduos foi apurada aleatoriamente em relação a asma e atopia da área de Filadélfia, Pensilvânia. Foram ensaiados igE e soro total pelo teste de imunoabsorção ligado a enzima [ELISA, Genzyme, Cambridge, Massachusetts]. 0 ADN foi extraído a partir de WBC no sangue periférico de cada indivíduo. A análise de marcadores genéticos (genotipagem) e genes candidatos foi realizada no ADN genómico extraído. Mais uma vez, a frequência da substituição de Met no codão 117 foi utilizada como uma estimativa não enviesada da prevalência desta variante na população geral. 48

Iniciadores Oligonucleotídicos,

Todos os iniciadores foram concebidos utilizando OLIGO 4.0. A caracterização do gene de IL-9 foi realizada utilizando iniciadores que rodeiam cada dos 5 exões da sequência relatada. As sequências iniciadoras que rodeiam cada exão foram: exão 1 [superior] [5' GCT CCA GTC CGC TGT CAA 3'] e [inferior] [5' CTC CCC CTG CAG CCT ACC 3'] [tamanho de produto 150 pb] ;

exão 2 [superior] [5' CGG GGC TGA CTA AAG GTT CT 3'; 1 e [inferior] [5' GTT CTT AAA GAG CAT TCA CT 3 ' ] [tamanho de produto 99 pb] ; exãc ) 3 [superior] [5' ATT TTC ACA TCT GGA ATC TTC ACT 3'] e [inferior] [5' AAT CCA AGG TCA ACA TTA TG 3' ] [tamanho de produto 113 pb]; exão 4 [superior] [5' TTT CTT TGA ATA AAT CCT TAC 3'] e [inferior] [5' GAA ATC ACC AAC AGG AAC ATA 3'] [tamanho de produto 206 pb] ; e exão 5 (superior) [5'ATC AAC TTT CAT CCC CAC AGT 3'] e [inferior] [5' GGA TAA ATA ATA TTT CAT CTT CAT 3']· Cada exão foi examinado, primeiro, por um ensaio de polimorfismo conformacional de cadeia simples [SSCP]. Os iniciadores para o exão 5 produziram um produto de 160 pb após amplificação pela reacção em cadeia pela polimerase [PCR], que foi também examinada por análise de sequência de fase sólida directa72, 77 . O iniciador superior foi sintetizado com um marcador de biotina em 5' e, após amplificação, o produto da PCR foi capturado por uma esfera paramagnética ligada a estreptavidina [Dynal] e caracterizado por sequenciação de Sanger como descrito noutro local77. Os polimorfismos da sequência foram distinguidos de artefactos através de análises repetidas. 49

Análise de SSCP. SSCP, um método para a detecção de polimorfismos de ADN com base nas alterações na migração de ADN de cadeia simples exposto a um campo eléctrico,71 foi realizado como apresentado em Schwengel et al., (1994) à temperatura ambiente com e sem glicerol a 10% utilizando electroforese em gel de poliacrilamida a 6% a uma concentração de monómero de ligação cruzada de 2,6 7%77. Foram misturados quatro pL de produto de PCR com 5 pL de tampão de terminação a 2X [formamida a 95%, EDTA a 20 mM, BPB a 0,05%, xileno cianol a 0,05%] e 1 pL de SDS a 0,5% e EDTA a 50 pM, desnaturado a 85-90 °C durante 8 minutos e, depois, imediatamente colocado em gelo. A electroforese foi realizada a 12 watts durante aproximadamente 24 horas em géis contendo glicerol e 12 horas em géis sem glicerol. Os géis foram então secos e expostos a película Kodak XAR®.

Sequenciação de ADN. A sequenciação de ADN directa dos produtos de PCR foi realizada utilizando técnicas de fase sólida após verificar a presença do tamanho correcto do produto de PCR num gel de agarose a 1% corado com brometo de etidio como apresentado em Schwengel et al., 1994. Foram incubados 20 pL de produto de PCR com 40 pL de Dynabeads® m-280 [Dynal] durante 15 minutos. As esferas foram lavadas e diluídas como sugerido pelo fabricante. Cada amostra foi subsequentemente lavada com tampão B&W contendo tris-HCl a 10 mM a pH 7,5, EDTA a 1 mM, NaCl a 2 M, desnaturado com NaOH a 0,1 N e, depois, lavada com NaOH a 0,1 N, tampão B&W e Tris-HCl a 10 mM, pH 8 e EDTA a 1 mM [TE] . O sedimento de esferas foi ressuspenso com 10 pL de H20. 50

As reacções de sequenciação de Sanger foram realizadas utilizando Sequenase [United States Biochemical Co.]. Foi incorporado 35S-dATP ou 35P-dATP nas reacções de sequenciação e os produtos foram sujeitos a electroforese através de géis de 5% ou de 6% de poliacrilamida contendo ureia a 7 M. Os géis foram secos sem fixação e expostos a película de raios x. Os alelos foram determinados por comparação dos genótipos dos pais e da descendência. Os artefactos não frequentes foram facilmente distinguidos dos verdadeiros polimorfismos da sequência por repetição. 0 ADN estava disponível e foi extraído a partir de leucócitos periféricos. 0 ADN genómico foi diluído para uma concentração de 200 pg/mL para amplificação27'42. Foram seleccionadas repetições de sequência simples [SSR] incluindo DXYS154 a partir da Genome Data Base [GDB; Welch library, Johns Hopkins University, Baltimore, MD] . A genotipagem do marcador sKK-1 foi realizada utilizando os seguintes iniciadores sKK-lU [5' CAA ATC TGA AGA GCA AAC TAT 3'] e SKK-1L [5' TTA AAA AAT TCA TTT CAG TAT TCT 3'] que produzem um produto de 90 pb. Cada produto de SSR foi amplificado por PCR72 e seleccionado em função do tamanho de acordo com métodos previamente descritos27'42. O manuseamento da amostra foi realizado como descrito por Weber et al. com pequenas modificações71'27,42 . Os genótipos foram determinados a partir de duas leituras independentes de cada autorradiografia. Os indivíduos que genotipam as famílias foram mantidos às cegas em relação aos resultados clínicos. 51

Análise de RFLP.

Como resultado do polimorfismo de C para T na posição 3365, foi produzido um polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição com Styl [RFLP] na posição 52 do produto de PCR do exão 5 de IL-9. Para testar a presença desta variante da sequência de ADN, o iniciador inferior do exão 5 foi marcado na sua extremidade antes da amplificação por PCR. 0 produto de PCR foi então digerido com Styl produzindo dois fragmentos de 108 pb [marcado] e 52 pb [não marcado] de comprimento. Este RFLP foi utilizado juntamente com SSCP para confirmar a presença deste polimorfismo em famílias e indivíduos.

Análise de Ligação e Gestão de Dados.

As análises de ligação foram realizadas utilizando métodos de pares de irmãos afectados [SIBPAL, S.A.G.E.],76 numa abordagem estabelecida para a investigação da base genética de características complexas, tais como BHR, atopia e asma. Os pares de irmãos afectados são normalmente testados primeiro, uma vez que uma proporção de pares de irmãos não afectados pode podem ainda ser veículos de genes, mas não expressam a característica. Em contraste com métodos de classificação de LOD em que o modelo de hereditariedade [dominante, recessivo, etc.] deve ser especificado exactamente, a análise por métodos de pares de irmãos não faz assumpções explícitas a este respeito. Deste modo, em análises de pares de irmãos a informação clínica dos pais não é utilizada em testes de ligação. A observação pertinente nestes métodos é quão frequentemente dois descendentes afectados partilham cópias do mesmo alelo marcador parental.44 Se a mesma cópia de um alelo marcador parental é 52 observada em diferentes descendentes, eles são referidos como sendo herdados de forma "idêntica por descendência." A ligação é sugerida quando os pais de irmãos afectados são idênticos por descendência para um alelo marcador significativamente mais frequente do que esperado pelo acaso [50%]. Quando o mesmo alelo marcador é transmitido com o gene da doença em descendência diferente, isto implica que o locus marcador está ligado, ou deve estar ligado suficientemente próximo no mesmo cromossoma, ao gene da doença de modo a que possam co-segregar durante a meiose. A característica é então mapeada através do conhecimento da localização cromossómica do marcador. A ligação em humanos pode também ser estabilizada pelo método de proporções de probabilidade. Este método envolve a comparação da probabilidade de os dados de uma família observada surgirem sob uma hipótese, por exemplo, ligação entre dois marcadores de ADN, em relação à probabilidade que de surgirem de uma hipótese alternativa, tipicamente, não estarem em ligação. A proporção destas probabilidades é denominada a proporção das probabilidades para uma hipótese em relação à outra. Por convenção, os geneticistas de mamíferos preferem o log da proporção das probabilidades ou a classificação de LOD. Geralmente, a ligação é considerada provada quando as probabilidades a favor da ligação versus não ligação se tornam esmagadoras, ou atingem 1000:1 [LOD = 3] . A ligação é rejeitada quando as probabilidades caem para 100:1 contra esta hipótese [LOD = -2] . A estimativa de probabilidade máxima é a fracção de recombinação em que a proporção de probabilidade é maior. Os LODs de múltiplos pedigrees são então adicionados até que a classificação aumente para 3 [significando uma probabilidade de 1 000:1] ou caia para -2 [indicando probabilidade de 100:1]. 53

Todos os dados clínicos e genotípicos são geridos utilizando EXCELL® num computador Macintosh® ou Sun Microsystems®. As análises estatísticas foram realizadas utilizando JMP [SAS Institute, Inc. Cary, NC] . Os Testes de Wilcoxon/Kruskal-Wallis [somas de classificação] foram utilizados para testar se os indivíduos que eram homozigóticos [Met/Met], heterozigóticos [Met/Thr], ou homozigóticos [Thr/Thr] no codão 117 diferem no seu IgE total no soro. Todos os valores de P são de duas caudas excepto análises de pares de irmãos afectados, em que um teste de uma cauda foi utilizado porque era esperado apenas uma partilha de alelos incrementada.

Tendo fornecido esta informação de fundo, a requerente descreve agora aspectos preferidos da invenção. EXEMPLO 1

Análise de Ligação Entre BHR e o Cromossoma 13 de Murino

Como um auxiliar dissecando os determinantes genéticos do complexo de BHR, a requerente desenvolveu modelos de murino que diferem na sua susceptibilidade genética a vários estímulos broncoconstritores. Modelos animais consanguíneos utilizando estirpes consanguíneas recombinantes [BXD] podem facilitar os estudos em curso em humanos para determinar o número de genes que regulam a susceptibilidade a 3HR, a magnitude do seu efeito e a sua localização cromossómica precisa. Em particular, a localização num modelo animal de um gene que determina a susceptibilidade a um factor de risco crítico para a asma pode auxiliar na clonagem posicionai deste gene em humanos. 54

Embora o(s) gene(s) que predispõe(m) a BHR e atopia ainda não tenham sido identificados antes desta invenção, o cromossoma 5q31-q33 foi conhecido como sendo sinténico com porções dos cromossomas 11, 13 e 18 de murganho. A Figura 2 ilustra as regiões sinténicas contendo numerosos candidatos posicionais que podem desempenhar potencialmente um papel na inflamação aérea associadas a BHR, atopia e asma. Especificamente, a região do cromossoma 5q31-q33 humano que demonstra evidência significativa para ligação a BHR é homóloga com porções dos cromossomas 11,

O A 13, e 18 de murganho que contem numerosos genes candidatos .

Em particular, foram recentemente sugeridos IL-9 ou um gene próximo como candidatos prováveis com base no desequilíbrio de ligação entre os níveis do log de igE total no soro e um marcador neste gene utilizando uma população apurada aleatoriamente43.

Apesar das comparações com intervalos de quatro candidatos, foi encontrada evidência para a ligação apenas para uma região, designada Aib 1 [broncoconstrição 1 induzida por atracurium]. A Figura 3 proporciona os resultados.

Especificamente, a Figura 3 apresenta a curva de classificação de LOD no cromossoma 13 de murganho para a capacidade de resposta aérea induzida por atracurium em estirpes 24 BXD RI que são derivadas das estirpes progenitoras com hipo-capacidade de resposta C57BL/6J e com hiper-capacidade de resposta, DBA/2J [linhas a cheio]. A curva de classificação de LOD que resulta da genotipagem selectiva de estirpes 20 BXD é também apresentada [linha a ponteado] . As estirpes de BXD -2, -6, -18 e -32 não foram utilizadas na segunda análise, uma vez que foram intermediários no fenótipo apresentando uma resposta média superior a 1 desvio padrão abaixo das respostas médias de DBA/2 55 e acima de C578L/6. A resposta de broncoconstritor para atracurium, 20 mg/kg administrado intravenosamente, foi avaliada pela permuta no pico de pressão de inspiração integrada ao longo do tempo [4 min], denominada o indice do tempo de pressão aérea [ΑΡΤΙ]. A ΑΡΤΙ induzida por atracurium conforme medido em 2-8 animais por estirpe Ri. Os dados do marcador foram obtidos a partir da base de dados RWE no programa de análise de dados Map Manager. A distância genética [cM] entre marcadores é indicada nas abcissas. As classificações de LOD foram calculadas pelo programa de MAPMAKER/QTL linkage. Foi detectado um QTL nesta região e denominado broncoconstrição-1 [Aibl] induzido por atracurium. A Figura 3 indica que este locus de característica quantitativa [QTL] está localizado na porção média do cromossoma 13 de murino e atingiu este intervalo um log de probabilidade máximo das probabilidades [LOD] de 2.42. Quarenta e quatro porcento da variância total na broncoconstrição induzida por atracurium foi explicada em Aibl quando todos os marcadores no BXD map foram analisados. O LOD para o cromossoma 13 aumentou para 2,85 quando as análises de QTL foram corridas após exclusão das quatro estirpes [BXD-2, -6, -18, e -32] que foram agentes de resposta intermédia ao atracurium. Os candidatos posicionais conhecidos na região ligada do cromossoma 13 incluem: receptor de dopamina Dl [Drdl], receptor 4 do factor de crescimento do fibroblasto [Fgfr4], antigénio-28 dos linfócitos [Ly28\, metiltransferase de tiopurina [Tpmt] e IL-9.

Uma vez que a requerente testava especificamente para a ligação a quarto regiões de candidatos no murganho, com base nos resultados de mapeamento anteriores em humanos, os dados aqui apresentados são altamente significativos. Como referido no 56 artigo clássico de Lander e Botstein, uma taxa falsa positiva para a ligação irá resultar se o limiar de LOD (T) for seleccionado de modo a que T = l/2(logl0 e) (2 a/n)2 (em que n é igual ao número de intervalos testados). Tipicamente, é necessário um mínimo de LOD de 3,3 como evidência de ligação67. Todavia, este limiar é baseado no pressuposto que se pesquisa o genoma inteiro. Estes mesmos requerentes salientam que um LOD de 0,83 é suficiente quando é apenas examinada uma região. Neste caso, com quatro regiões candidatas, um valor de P (a) de 0,0125 para cada região é necessário para obter um P < 0,05 verdadeiro, quando se corrigem comparações independentes múltiplas. Adoptando uma taxa de erro de 5% de que ocorra mesmo a descoberta de um único falso positivo, como sugerido por Soller e Brody68 e resolvendo a equação 1/2 (loglO e)(Z a/n)2, produz um limiar de LOD de pelo menos, 1,36. Foi obtida uma carga máxima LOD de 1,48 para o candidato ao gene de 11-9. Restringindo a taxa de erro de falsos positivos aceitáveis para ^ 0,1%, aumenta-se o limiar de LOD para 2,36. Deste modo, a LOD máxima criada de 2,42 para o intervalo candidato no cromossoma 13 (Aibl) é altamente significativo.

Estes dados de limiar de LOD proporcionam evidência de uma ligação conservada para BHR em humanos e murganhos. BHR em humanos liga-se à região no cromossoma 5q contendo um número de factores de crescimento e citocinas incluindo o gene IL-9 e o locus Aibl mapeia-se na região IL-9 do cromossoma 13 de murino. 57 EXEMPLO 2

Identificação de um Polimorfismo do Gene IL-9 A requerente demonstrou uma ligação conservada entre o murganho e humanos para bhr. Estes dados sugerem que a variação nas funções deste gene ou sequência de ADN pode ser importante na regulação da capacidade de resposta brônquica no murganho. Utilizando os métodos descritos acima, um produto único do tamanho correcto foi identificado por electroforese em gel para cada um dos exões de IL-9 humana após PCR. Foi identificado um polimorfismo único por SSCP no exão 5 do gene da IL-9 humano. A análise da sequência de ADN directa demonstrou uma substituição de nucleótidos de C para τ na posição 3365 [Número de acesso de GenBank M30136] do gene da IL-9 humano como a causa da nova conformação de SSCP. Esta alteração na sequência de ADN prevê uma substituição não conservadora de uma metionina [hidrofóbica] para uma treonina [hidrofilico] no aminoácido 117 da proteina IL-9. 0 exão 5 codifica este segmento da proteina que está dentro do intervalo mais altamente conservado da IL-9 humana em comparação com a sequência de IL-9 de murganho (ver Figura 4).

Os indivíduos foram genotipados a partir de várias populações para examinar a frequência destes alelos através de análise directa da substituição de nucleótidos na sequência codificante da IL-9 humana. Dois dos 394 indivíduos de um grupo de famílias asmáticas foram homozigóticos [Met/Met] no codão 117 [0,5%]. Existiram 91 indivíduos [23,1%] heterozigóticos e 301 [76,4%] homozigóticos [Thr/Thr]. A verdadeira prevalência para esta variante IL-9 é provável que seja significativamente 58 superior porque a população Italiana de famílias foi apurada através de doentes sintomáticos com asma. A partir de uma população separada etnicamente diversa apurada aleatoriamente em relação a atopia e a asma, existiam 1 de 49 indivíduos homozigóticos para [Met/Met] no codão 117 [2,0%]. Existiam 11 indivíduos [22,4%] heterozigóticos e 37 [75,5%] homozigóticos [Thr/Thr]. A prevalência de heterozigóticos Met/Thr foi de 18,9% numa quarta população apurada aleatoriamente em relação a atopia e asma. Deste modo, aproximadamente 20% da população representa provavelmente veículos do alelo τ na posição 3365 em comparação com a sequência relatada [Número de acesso de GenBank M30136]. Porque é bem conhecidos na técnica que a frequência de qualquer alelo na população é p2 + 2pq + q2, então, espera-se que aproximadamente 4% da população seja homozigótico Met/Met no codão 117 de IL-9.

Globalmente, a igE total no soro era, em média, 44,5 U.I. para indivíduos homozigóticos [Met/Met], que era significativamente diferente daqueles que eram homozigóticos de tipo selvagem [Thr/Thr] [351.7 U.I.] ou heterozigóticos [Met/Thr] [320,9 U.I.]. Ver Figura 5. Os indivíduos homozigóticos protegidos [Met/Met] não demonstraram evidência de alergia atópica excepto para um ensaio dermatológico positivo único num indivíduo. Estes dados indicam que este novo polimorfismo de ADN, quando herdado no estado homozigótico, está associado com protecção de alergia atópica, incluindo igE total baixa no soro. A Figura 6 ilustra a amplificação por PCR do polimorfismo de repetição simples da sequência de IL-9. Este marcador é comparado com o genótipo para estes indivíduos para o polimorfismo de comprimento do fragmento de restrição produzido 59 pelo polimorfismo de nucleótidos na posição 3365 em comparação com a sequência relatada [Número de acesso ao GenBank M30136]. São apresentadas duas famílias. Os indivíduos nas pistas 1 e 2 são os pais (Thr/Met) dos indivíduos nas pistas 3 (Met/Thr) e 4 (Met/Met); as pistas 5 (Thr/Thr) e 6 (Met/Met) são os pais da descendência nas pistas 7 (Met/Thr) e 8 (Met/Thr). 0 alelo mais pequeno para o polimorfismo de repetição da IL-9 sequência simples (a banda mais baixa em cada figura é de 248 nucleótidos de comprimento) está em desequilíbrio de ligação completo em relação ao alelo Metll7 (substituição de nucleótidos na posição 3365 em comparação com a sequência relatada [número de acesso ao GenBank M30136]) nestes indivíduos e em todos os indivíduos das populações testadas mundialmente. Isto era verdade em ambos os indivíduos apurados etnicamente diversos italianos e totalmente aleatórios estudados e, por isso, este marcador pode ser utilizado em termos de diagnóstico para detectar a presença do alelo Metll7. Estes dados são mais consistentes com a hipótese de esta variante ser largamente distribuída em populações por todo o mundo e surge antes de muitas destas populações se separarem. EXEMPLO 3

Receptor de expressão de IL-9 e ensaio de ligação ao ligando 0 recombinante purificado Thr IL-9, Met IL-9 e os compostos que se assemelham potencialmente a Met IL-9 na estrutura ou função são marcados radioactivamente utilizando o reagente de Bolton e Hunter, como descrito em Bolton AE e Hunter WM, Biochem J. 133: 529-539(1973). Este material é marcado para 60 actividade específica elevada de 2300 cpm/fmol ou superior. As células K562 e M07e humanas são cultivadas e ressuspensas, a 30 °C, em 0,8 mL de meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com 10% (vol/vol) de soro de bovino fetal, 2-mercaptoetanol a 50 mM, L-arginina a 0,55 mM, L-asparagina a 0,24 mM, e L-glutamina a 1,25 mM. As células K562 ou M07e são utilizadas como tal ou após transfecção com o gene do receptor de IL-9 como descrito abaixo. O ADN de plasmídeo contendo o receptor de IL-9 de comprimento total é clonado no plasmídeo pRC/RSV (In Vitrogen, San Diego) e purificado por centrifugação através de CSCI2. O ADN plasmídico (50 microgramas) é adicionado às células em cuvetes de 0,4 cm imediatamente antes da electroporação. Após um duplo pulso eléctrico (750 V/74 ohms/40 microFaradays e 100 V/74 ohms/2100 microFaradays) as células são imediatamente diluídas em meio fresco suplementado com IL-9. Após 24 h, as células são lavadas e incubadas em G418 (2,5 mg/mL, GIBCO) sem ligando, ou com várias concentrações de ligando marcado com 125l, a 20 °C, durante 3 h. É utilizado um excesso de ligando não marcado em experiências paralelas para estimar a ligação não específica. As células são, então, lavadas, filtradas, e recolhidas para contagem. A incorporação especifica é calculada por análise de Scatchard. Ensaios competitivos semelhantes são corridos utilizando IL-9 com Thrll7 marcado com 125I e várias quantidades de ligandos frios putativos para avaliar a ligação específica. O receptor solúvel de IL-9 incluindo os aminoácidos 44 a 270 (R&D Systems) foi incubado com diferentes formas de IL-9 recombinante humana. Foram incubadas quantidades variantes de FlagMetll7 e FlagThrll7 (descritos no Exemplo 7) em PBS, à temperatura ambiente, durante 30 minutos, com 0,5 pg de receptor solúvel. Foi adicionado tampão EBC (Tris a 50 mM pH 7,5; NaCl a 61 0,1 Μ; NP40 a 0,5%) (300 pL) juntamente com 1 μg de anticorpo monoclonal anti-FLAG (IBI) e incubado durante 1 hora em gelo. Foram adicionados 40 pL de solução de proteína A sepharose a cada amostra e misturados durante 1 hora, a 4 °C. As amostras foram centrifugadas durante 1 minuto a 11000 X G e os sedimentos foram lavados 4 vezes com 500 pL de EBC. Os sedimentos foram dissolvidos em 26 pL de tampão SDS a 2X, fervido durante 4 minutos, e sujeitos a electroforese através de um gel de poliacrilamida na presença de SDS a 18%. As transferências de Western foram realizadas como descrito no Exemplo 15 excepto que as transferências foram rastreadas com um anticorpo de anti-receptor de IL-9 (R&D Systems). A Figura 25 demonstra a ligação do receptor solúvel de IL-9 de proteínas de IL-9 recombinantes. A pista 1 é marcadores de peso molecular, pista 2 é o FlagMetll7 de IL-9 incubada com o receptor, a pista 3 é o FlagThrll7 de IL-9 incubada com o receptor. Estes dados demonstram que ambas as formas da proteína IL-9 recombinante estão ligadas ao receptor solúvel. Além disso, estes dados, juntamente com os do Exemplo 2 (em que os indivíduos heterozigóticos não diferem no Ig-E no soro dos homozigóticos Thrll7) são consistentes com a forma Metll7 de IL-9 que representa um agonista fraco. EXAMPLO 4

Expressão do receptor de IL-9 e ensaio funcional do ligando em células K562, C8166-95 e M07e

Thrll7 IL-9 recombinante, Metll7 IL-9 e compostos que se assemelham potencialmente a Met IL-9 na estrutura ou função 62 foram purificados e preparados para utilização em meio de Eagle modificado por Dulbecco. As células K562, C8166-45 ou M07e são utilizadas como tal ou após transfecção com o gene do receptor de IL-9 como descrito no Exemplo 3. Após 24 h de privação de factores de crescimento as células são incubadas sem (controlo) ou com quantidades variáveis de Thrll7 il-9, Metll7 il-9 purificado e os compostos assemelham-se potencialmente a Metll7 IL-9 na estrutura ou função. A proliferação celular é avaliada através da medição da actividade da fosfatase ácida. Resumidamente, as amostras em quadruplicado de células de M07e são cultivadas em placas de microtitulação de fundo plano (poços de 150 ou 200 microlitros) com ou sem ligando durante 72 a 96 horas a 37 graus C. A fosfatase ácida é medida como sugerido pelo fabricante (Clontech, Paio Alto, CA). Todas as experiências são repetidas, pelo menos, duas vezes. EXEMPLO 5

Isolamento celular e cultura

Foram isoladas células mononucleares de sangue periférico humano {PBMC} a partir de dadores saudáveis através de centrifugação em gradiente de densidade utilizando endotoxina testada Ficoll-Paque PLUS de acordo com o fabricante (Pharmacia Biotech, AB Uppsala, Suécia). Foram cultivadas células PBMC (5 x 106), células de baço de murganho (5 x 106) ou células M07e 5 x 106 em 7 mL de RPMI-1640 (Bethesda Research Labs (BRL), Bethesda, MD) suplementadas para uma concentração final de 10% com soro humano isogénico ou FBS inactivado por calor. As células foram cultivadas durante 24 h, a 37 °C, não estimuladas 63 ou estimuladas com PMA a 5 pg/mL PHA a 5 pg/mL, ou PHA a 5 μg/mL/rhIL2 50U (R&D Systems, Minneapolis, MN). EXEMPLO 6

Isolamentos de ARN, RT-PCR, clonagem e sequenciação de produtos de RT-PCR 0 ARN celular total foi extraido após 24 h de PBMC cultivadas, células de baço de murganho e células de M07e utilizando RNA PCR corekit (Perkin-Elmer Corp, Foster City, CA, de acordo com o fornecedor. Um pg de ARN de cada fonte foi desnaturada durante 5 minutos, a 65 °C e, depois, foi sujeito a transcriptase reversa para ADNc utilizando uma mistura de reacção de 20 pL (RNA PCR corekit, Perkin-elmer Corp, Foster City, CA) contendo 50 U de Transcriptase Reversa de MuMLV, 1 U/pL de Inibidor de ARNase, 2,5 mM de iniciador oligo d(T)16, 1 mM de cada um de dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 50 mM de KC1 10 mM de Tris-HCL, pH 7,0, MgCl2 a 25 mM. A mistura de reacção foi pipetada para tubos de termociclador, colocada num termociclador de PCR e sujeita a 1 ciclo (15 minutos a 42 °C, 5 minutos a 99 °C e 5 minutos a 4 °C). Foi utilizada uma reacção de transcrição reversa simulada como um controlo negativo.

Depois, esta mistura foi adicionada a um segundo tubo contendo 2 mM de MgCl2, 50 mM de KC1, 10 mM de Tris-HCl, pH 7,0, 65,5 pL de água Dl, 2,5 U de Amplitaq ADN polymerase e 1 pL (20 pM) cada um dos oligonucleótidos que representam o ADNc humano do exão 1 de IL-9 (directo) e exão 5 (reverso), para um volume final de 100 pL. A mistura de reacção foi sujeita às 64 seguintes condições de PCR: 120 segundos a 98 °C, depois 30 ciclos a: 30 segundo a 94 °C; 40 segundos a 55 °C; 40 segundos a 72 °C. Finalmente, a mistura de reacção foi ciciada uma vez durante 15 minutos, a 72 °C, para extensão.

Os produtos de PCR que representam o ADNc de hiL-9 foram sujeitos a electroforese em gel através de géis de agarose a 1,5% e visualizados utilizando coloração com brometo de etideo. Os produtos de uma reacção de transcriptase reversa simulada, em que a h20 foi substituída por arn e utilizada como controlo negativo de amplificação em todas as experiências.

Os pares de oligonucleótidos iniciadores de PCR utilizados nestas experiências para amplificar o ADNc incluem: o exão 1 da interleucina 9 humana (hIL-9) directo 5'-TCT CGA GCA GGG GTG TCC AAC CTT GGC G-3' (SEQ ID N°: 1) e exão 5 reverso 5' -GCA GCT GGG ATA AAT AAT ATT TCA TCT TCA T-3' (SEQ ID N° : 2); exão 1 de interleucina 9 de murganho (mIL-9) directo 5'-TCT CGA GCA GAG ATG CAG CAC CAC ATG GGG C-3' (SEQ ID N°: 3) e exão 5 de murganho reverso 5'-GCA GCT GGT AAC AGT TAT GGA GGG GAG GTT T-3' (SEQ ID N°: 4); as sequências de reconhecimento de restrição de XhoI e PvuII estão sublinhados nos iniciadores de IL-9 humano e de murganho. Os produtos de PCR foram subclonados no vector de TA Cloning (Invitrogen, San Diego, CA) . A amplificação do ADNc de murganho produziu um produto de 438 pb e amplificação do ADNc humano produziu um produto de 410 pb.

Os ADN complementares para a IL-9 humana e mIL-9 de murino foram produzidos e amplificados por RT-PCR utilizando os iniciadores específicos do exão 1 e 5 de IL-9 contendo sítios de digestão para as endonucleases de restrição Xhol e PvuII. Os produtos de amplificação para hIL-9 e mIL-9 foram isolados a 65 partir de géis de agarose a 2,5% utilizando silica (Sambrook, J. et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque). Após recuperação, os produtos de ADNc foram ligados no vector de TA Cloning (Invitrogen Corp., San Diego, CA) e, depois, utilizados para transformar células competentes invoíF', de acordo com as instruções do fabricante. Os plasmideos contendo as inserções de ADNc hIL-9 e mIL-9 foram isolados por técnicas convencionais (Sambrook, J. et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory

Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque). Após amplificação, a sequência de ADN incluindo e circundando cada inserção foi analisada quanto a erros induzidos por PCR ou clonagem.

As inserções de ADNc hIL-9 e mIL-9 foram sequenciadas pelo método de terminação de cadeia de didesoxi (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:5963), utilizando o iniciador directo de M13 (-20) (5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3' ) (SEQ ID N° : 18) e Sequenase™ (USB), e analisada por electroforese em gel (Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque). As inserções de ADNc hIL-9 e mIL-9 sem erros de sequência induzidos por clonagem e/ou Taq polimerase (ver sequências de ADNc traduzidas Figuras 7 e 8) foram subclonadas nos vectores de expressão (ver Figuras 9-12) ou utilizadas para criar mutações sem sentido e mutações de deleção. 66 EXEMPLO 7

Clonagem e expressão de construções de IL-9 in vitro Métodos Gerais de Clonagem para Construções A hIL-9 foi subclonada em vectores de expressão procarióticas. Os vectores TA2AAF1 met e thr foram digeridos por .EcoRI e o fragmento de 0,420 kB (contendo um sitio Xhol na extremidade 5' do adnc de hiL9) foi clonado num sitio £coRl contido com o poliligante de pBluescript (PBS) (Stratagene). Os clones no sentido de orientação do promotor T3 foram, então, digeridos com Xhol (o fragmento contido um sitio 5' Xhol da inserção de ADNc de IL-9 de vectores TA e um sitio 3' Xhol do poliligante de PBS) e as inserções foram subclonadas nos sítios Xhol dos vectores de expressão procarióticos pGEX e pFLAG.

Clonagem e expressão de construções de IL-9 no vector pGEX-4T-1 de fusão com o gene da glutationa s-transferase

Para a expressão, purificação e detecção da proteína IL-9, as inserções de ADNc de IL-9 foram subclonadas no sítio Xhol na cassete do sítio múltiplo de clonagem de 4,9 Kb do vector pGEX-4T-1 de fusão com o gene da glutationa s-transferase (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) através de técnicas convencionais. Resumidamente, clones TA contendo sequências de ADNc de IL-9 intactas e o vector pGEX-4T-l foram digeridos durante uma hora a 37 °C utilizando as endonucleases de restrição Xhol e Pvull na presença de tampão lx React 2 (New England Biolabs, Beverly, MA) (volume total de 50 pL) . Os produtos foram sujeitos a electroforese num gel preparativo de agarose a 1,5% com 10 pg/mL 67 de brometo de etídeo. A banda de ADN com tamanho apropriado foi excisada, a agarose foi fundida a 45 °C, durante 10 minutos, em 3 volumes solução stock de Nal. Uma solução de matriz de silica em H20 Dl (Geneclean II, LaJolla, CA) foi adicionada à solução a 5 pL por 5 pg de ADN e 1 pL por 0,5 pg de ADN acima de 5 pg. O sedimento foi incubado a 4 °C e ocasionalmente agitado durante 30 minutos. O sedimento foi, então, sedimentado por microcentrifugação, lavado 3 vezes em tampão com sal baixo e ressuspensas em 10 pL de H20 Dl para eluir o ADN da silica. Uma microcentrifugação final proporcionou os 10 pL de solução contendo o ADN purificado.

Os produtos foram ressuspensos em 50 pL de H20 Dl e precipitados pela adição de 2 volumes de etanol e 1/10 do volume de acetato de sódio a 3 M. As amostras foram centrifugadas à TA a 14000 rpm, durante 10 minutos, secas ao ar sob pressão negativa e ressuspensas num volume apropriado de H20 Dl. As ligações e transformações de bactérias DH5a (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) com as inserções de ADNc mIL-9 e hIL-9 no vector pGEX-4T-l foram efectuadas utilizando técnicas convencionais.

Para confirmar que as inserções de ADNc de hIL-9 contidas no vector pGEX-4T-l eram a sequência correcta de nucleótidos, os plasmideos contendo o ADNc candidato de IL-9 foram sequenciados através do método de terminação de cadeia mediado por didesoxi utilizando os oligonucleótidos específicos para ADNc acima mencionados mIL-9 e hIL-9 (iniciadores exão 1 directo, exão 5 reverso).

As proteínas de fusão recombinantes foram obtidas a partir de culturas em larga escala. A cultura durante a noite de 68 E. coli transformada (50 mL) foi inoculada em meio liquido LB/amp fresco. A cultura foi incubada durante 4 h, a 37 °C, com agitação vigorosa, foi então adicionado isopropil β-D-tiogalactopiranósido a uma concentração final de 1 mM, e a cultura foi incubada durante mais 1,5 h. As células foram recolhidas por centrifugação a 500 x g, a 4 °c, e as variantes recombinantes foram purificadas utilizando cromatografia de afinidade em coluna de glutationa-sepharose 4B (Pharmacia) para as proteínas de fusão com GST. Algumas variantes foram expressas como corpos de inclusão e foram purificadas a partir de corpos de inclusão insolúveis pelo processo descrito por Marston (1987. A purificação de polipéptidos eucarióticos expressos em E. coli em Clover D.M. ed. DNA cloning: A practical approach, IRL Press, Oxford, 59-88). Resumidamente, as células foram lisadas com lisozima seguido pelo tratamento com ácido desoxicólico. Os ácidos nucleicos contaminantes foram removidos por tratamento com DNase I. O material insolúvel foi lavado uma vez com 2 M de ureia e finalmente solubilizado em tampão de lise (50 mM de Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM de EDTA, 100 mM de NaCl) contendo 8 M de ureia. Os componentes solubilizados a partir dos corpos de inclusão foram dialisados passo a passo contra concentrações decrescentes de ureia (começando com 8, 6, 4 e 2 M de ureia) no tampão de lise para permitir a reorganização da proteína desnaturada. Finalmente, a amostra foi dialisada contra 2 M de ureia e 2,5% de β-mercaptoetanol (β-ΜΕ) e centrifugada a 10000 g durante 15 min. A proteína de fusão foi finalmente dialisada contra 0,01 M de Tris-Cl, pH 8,0. As proteínas de fusão expressas no vector pGEX-4T foram clivadas com 100 U de Trombina durante 6 h, a 37 °C, e recuperadas em fracções de fluxo após cromatografia em coluna glutationa-Sepharose 4B. A purificação final foi conseguida por cromatografia em coluna Sephadex G-100 69 (100x1,5 cm), empacotada e equilibrada com 0,05 M de tampão de bicarbonato de amónio.

Clonagem e expressão de construções de IL-9 no Vector de Expressão pFLAG-1™

Para a expressão, purificação e detecção do ADN da proteína IL-9 humana, as inserções de ADNc de IL-9 foram subclonadas no sitio Xho2 do sítio de clonagem (Xhol) do vector Flag de 5,3 7 Kb. A tecnologia FLAG está centrada na fusão de um péptido marcador FLAG de baixo peso molecular (1 kD), hidrofílico, com o N-Terminus de uma proteína recombinante expressa pelo Vector de Expressão pFLAG-1™ (1) (obtido de ibi Kodak). Cada colónia bacteriana foi cultivada em meio LB contendo 50 pg de ampicilina por mL até que a densidade óptica a 590 nm atingisse 0,6. Foi então adicionado IPTG para uma concentração final de 1 mM e as culturas incubadas por mais 1 h para induzir a síntese de proteína. As células foram recolhidas por centrifugação e o sedimento de células foi fervido em 50 pL de tampão de Laemmli (Laemmli, 1970) durante 10 min e sujeito a electroforese em géis de poliacrilamida a 10%. O anticorpo monoclonal anti-FLAG™ Ml foi utilizado para a detecção específica e eficiente da proteína de fusão FLAG em transferências de western (ver Figura 13) ou em mancha através da sua expressão, afinidade, purificação, e remoção do marcador FLAG. A proteína de fusão FLAG foi rapidamente purificada sob condições suaves, não desnaturantes numa cromatografia de afinidade de passo único com o anticorpo monoclonal Anti-FLAG™ igG Ml de murino covalentemente ligado a agarose. Após a purificação por afinidade, a proteína de fusão pode ser utilizada após remoção a partir da coluna de afinidade ou a proteína autêntica pode ser recuperada na forma 70 biologicamente activa por remoção proteolitica especifica e eficiente do péptido FLAG com enterocinase. A purificação final foi conseguida por cromatografia em coluna Sephadex G-100 (100x1,5 cm), empacotada e equilibrada com 0,05 M de tampão de bicarbonato de amónio. Os promotores acima descritos neste exemplo podem ser também utilizados com a tecnologia FLAG. SDS-PAGE e Análise de Imunotransferência A SDS-PAGE foi efectuada pelo método de Laemmli (Laemmli U.K. (1970) Nature 227, 680-685) utilizando um gel de poliacrilamida a 12,5% num sistema de mini-gel (unidade de gel vertical SE 280, Hoefer). Para a análise de imunotransferência, as proteínas separadas por SDS-PAGE foram transferidas para membranas de nitrocelulose, utilizando a unidade de transferência TE 22 Mighty small (Hoefer) em 25 mM de tampão Tris-glicina, pH 8,3, contendo 15% de metanol (Towbin H., et al., (1979) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76, 4350-4354). Os sítios de ligação não ocupados na membrana foram bloqueados por incubação durante 1 h com 20 mM de tampão Tris-HCl, pH 8,0, contendo 2% de albumina do soro bovino. As membranas foram então incubadas com diluição 1:200 de anticorpos durante a noite a 4 °C. As membranas foram lavadas e tratadas com IgG de cabra anti-coelho de conjugado com peroxidase ou fosfatase alcalina diluído 1:2000 durante 1 h. Após lavagem, os anticorpos ligados foram visualizados pela adição do reagente quimioluminescente com super-substrato (Pierce) ou o reagente de desenvolvimento de cor 4-cloro-l-naftol. A reacção foi interrompida por imersão das membranas em água destilada. A Figura 13 demonstra que as proteínas de fusão FLAG IL-9 humana recombinantes purificadas (Metll7 e Thrll7) têm o tamanho correcto e estão na grelha de 71 leitura correcta porque estas são reconhecidas pelo anticorpo monoclonal Anti-FLAG™ Ml. Métodos Analíticos A massa molecular das proteínas purificadas foi confirmada por espectrometria de massa de desabsorção laser assistida por matriz utilizando a estação de trabalho Perceptive Biosystems Voyager Biospectrometry. As análises de aminoácidos foram efectuadas após hidrólise da amostra em 6 N de HC1 a 110 °C durante 24 h em bolbos de vidro selados sob vácuo.

Degradação de Edman Automatizada A sequência parcial de aminoácidos das proteínas purificadas é determinada pela sequenciação automatizada passo a passo num sequenciador Applied Biosystems modelo 477A de fase gás com um modelo de analisador em tempo real 20A PTH. EXEMPLO 8

Deleção do exão 2 e/ou exão 3: mutaqénese e sequenciação das construções

As deleções no exão 2 e exão 3 humanos são criadas utilizando o ExSite PCR-based site-directed mutagenesis kit como sugerido pelo fabricante (Stratagene, La Jolla, CA) . Os iniciadores de PCR são como se segue: h9CDlU directo 5'-GTG ACC 72 AGT TGT CTC TGT TTG-3' (SEQ ID N°: 5); h9CDlL reverso 5'-CTG CAT CTT GTT GAT GAG GAA-3' (SEQ ID N°: 6); h9CD2U directO 5'-GAC AAC TGC ACC AGA CCA TGC-3' (SEQ ID N°: 7); h9CD2L reverso 5'-ATT AGC ACT GCA GTG GCA CTT-3' (SEQ ID N°: 8). As deleções no exão 2 são criadas utilizando o par de iniciadores h9CDlL directo e h9CDlL reverso. As deleções no exão 3 são criadas utilizando h9CD2u directo e h9CD2L reverso. As deleções que incluíam o exão 2 e o exão 3 utilizam o par de iniciadores h9CD2U directo h9CDlL reverso.

As deleções no exão 2 e exão 3 de murganho são criadas utilizando ExSite PCR-based site-directed mutagenesis kit como sugerido pelo fabricante (Stratagene, La Jolla, CA) . Os iniciadores de PCR são como se segue: m9CDlU directo 5'-GTG ACC AGC TGC TTG TGT CTC-3' (SEQ ID N°: 9); m9CDlL reverso 5'-CTT CAG ATT TTC AAT AAG GTA-3' (SEQ ID N°: 10); m9CD2U directo 5'-GAT GAT TGT ACC ACA CCG TGC-3' (SEQ ID N°: 11); m9CD2L reverso 5' -GTT GCC GCT GCA GCT ACA TTT-3' (SEQ ID N° : 12). As deleções no exão 2 são criadas utilizando o par de iniciadores m9CDlU directo e m9CDlL reverso. As deleções no exão 3 deleções são criadas utilizando m9CD2U directo e m9CD2L reverso. As deleções que incluem o exão 2 e exão 3 utilizam o par de iniciadores m9CD2U directo e m9CDlL reverso.

As construções mutagenizadas das inserções de ADNc de hIL-9 e mIL-9 são sequenciadas pelo método de terminação de cadeia mediado por didesoxi (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:5463), utilizando o iniciador de directo de M13 (-20) (5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3') (SEQ ID N° : 18) e sequenase™(USB), com análise em electroforese em gel (Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque). Os mutantes que não possuem o 73 exão 2, exão 3, ou ambos o exão 2 e o exão 3, e não apresentam erros de sequência induzidos pela Taq polimerase e podem ser utilizados para criar vectores de expressão. EXEMPLO 9

Linhas de células, ensaios de proliferação celular e inibição da actividade de IL-9

As linhas de células foram utilizadas para avaliar a função de péptidos, aminoesteróis, tirofostinas, rhIL-9, rmIL-9, e formas mutantes recombinantes destas proteínas, assim como todos os outros compostos que bloqueiam a função de il-9. Uma resposta proliferativa conforme medido e comparado com cada das outras citocinas, as formas variantes ou mutantes de IL-9 ou antagonistas de IL-9. Adicionalmente, os compostos foram testados quanto à sua capacidade para antagonizar a linha de base de resposta proliferativa. Uma vez estabelecida a linha de base da resposta proliferativa para uma citocina, uma perda estatisticamente significativa de resposta nos ensaios repetidos três vezes em triplicado foi considerada evidência para antagonismo. Uma verdadeira resposta antagonística foi diferenciada de tonicidade celular por observação directa, coloração com azul tripano (uma técnica bem conhecida do normal especialista na técnica) e perda de actividade de fosfatase ácida. A especificidade foi avaliada para o antagonista através da avaliação de se esta actividade foi substancialmente expressa contra outros agentes proliferativos, tais como o factor Steel, interleucina 3, ou interleucina 4. 74 A linha M07e é uma linha de células megacarioblásticas humana, cultivada em RPMI 1640 (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD), 20% de Soro Fetal de Bovino (Hyclone) e 10 ng/mL de IL-3 (R&D Systems, Minneapolis, MN) . A linha MJ é uma linha de células linfoblastóide humana independente de citocina cultivada em RPMI 1640 (GIBCO/BRL) . K562 é uma linha de células de ertroleucemia humana, cultivadas em RPMI 1640 (GIBCO/BRL) e 10% de soro fetal de bovino (Hyclone). C8166-45 é uma linha que composta o receptor de IL-9, cultivada em RPMI 1640 GIBCO/BRL) e 10% de Soro Fetal de bovino (Hyclone) . Todas as linhas de células respondem a citocinas incluindo IL-9. As linhas de células são alimentadas e re-semeadas a 2 X 105 célula/mL a cada 72 horas.

As células foram centrifugadas durante 10 minutos, a 2000 rpm e ressuspensas em RPMI 1640 com 0,5% de Albumina de Soro Bovino (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) e os cofactores insulina-transferrina-selénio (ITS) (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) . As células foram contadas utilizando um hemocitómetro e diluidas para uma concentração de 1 X 105 células/mL e colocadas numa placa de microtitulação de 96 poços. Cada poço continha 0,15 ou 0,2 mL dando uma concentração final de 2 x 104 células por poço.

As células M07e foram estimuladas com 50 ng/mL de Factor de Célula Estaminal (SCF) (R&D Systems, Minneapolis, MN) isolado, 50 ng/mL de SCF mais 50 ng/mL IL-3 (R&D Systems, Minneapolis, MN) ou 50 ng/mL de SCF mais 50 ng/mL de IL-9. Foi incluido um controlo que contém células e meio basal apenas. Foram adicionadas diluições seriadas dos compostos de teste (i. e., proteínas IL-9 recombinantes, péptidos, pequenas moléculas) para cada condição de teste em triplicado. A linha de células MJ foi utilizada como controlo independente para citotoxicidade não 75 específica. As culturas foram incubadas durante 72-96 horas, a 37 °C, em 5% de C02. A proliferação celular foi ensaiada utilizando o Abacus Cell Proliferation Kit (Clontech, Paio Alto, CA) que determina a quantidade de fosfatase ácida intracelular presente como uma indicação do número de células. 0 substrato fosfato de p-nitrofenilo (pNPP) foi convertido pela fosfatase ácida em p-nitrofenol que foi medido como indicador da concentração de enzima. 0 pNPP foi adicionado a cada poço e incubado a 37 °C durante uma hora. Foi então adicionado 1 N de hidróxido de sódio para interromper a reacção enzimática e a quantidade de p-nitrofenol foi quantificada utilizando um leitor de placas Dynatech 2000 (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) a um comprimento de onda de 410 nm. As curvas padrão que comparam o número de células com a absorvência óptica foram utilizadas para determinar o intervalo linear do ensaio. Os resultados do ensaio foram apenas utilizados quando as medidas de absorvência estão no intervalo linear do ensaio. A Figura 14 ilustra a sequência de aminoácidos de três péptidos antagonistas da função de IL-9. Cada péptido foi incubado com células M07e e a inibição do crescimento celular induzida por IL-9 foi determinada por comparação com condições de controlo (sem péptido) (ver Figuras 15-17). Não existiu evidência de citotoxicidade com qualquer dos péptidos. É previsto que os péptidos KP-16 e KP-20 se situem nas duas hélices alfa anti-paralelas e definam um domínio de ligação crítico do receptor de IL-9 para o ligando IL-9. O polimorfismo de proteína no codão 117 situa-se em KP-23 e KP-24 que também exibiram propriedades antagonísticas, demonstrando, ainda, a 76 importância desta região que circunda o sitio de variação genética. A Figura 18 ilustra o efeito de tirofostinas (obtidas a partir de Calbiochem) no crescimento dependente de IL-9 da célula M07e in vitro. Cada tirofostina foi incubada com células M07e e a inibição do crescimento celular induzida por IL-9 foi determinada por comparação com condições de controlo (sem tratamento). Não existiu evidência de citotoxicidade com qualquer dos tratamentos. As tirofostinas B46 e B56 proporcionaram a maior inibição sugerindo uma relação estrutura actividade comum. A Figura 19 ilustra o efeito de aminoesteróis isolados a partir de figado de tubarão como apresentado na U.S.S.N. 08/290 826, 08/416883, 08/478763, e/ou 08/483059 no crescimento dependente de IL-9 da célula M07e in vitro. Cada aminoesterol foi incubado com células M07e a 20 pg/mL do meio de cultura e a inibição do crescimento celular induzida por IL-9 foi determinada por comparação com as condições de controlo (no tratamento). Não se verificou evidência de citotoxicidade com qualquer dos tratamentos. Os aminoesteróis 3 e 6 proporcionaram consistentemente a maior inibição de crescimento. EXEMPLO 10

Ensaio para a proliferação de células que segregam IqE

As linhas de células B podem ser utilizadas para avaliar a função de rIL-9 e formas mutantes recombinantes destas proteínas assim como outros antagonistas de IL-9. A proliferação de 77 células que segregam IgE é medida para a rIL-9 e comparada com outras citocinas ou formas variantes de rIL-9. Adicionalmente, os compostos são testados quanto à sua capacidade para antagonizar a resposta proliferativa basal das células que segregam IgE para rIL-9. uma vez que a resposta de linha de base para IgE é estabelecida para uma citocina, uma perda estatisticamente significativa (P< 0,05) de resposta em ensaios repetidos três vezes em triplicado é considerado evidência para antagonismo. Uma resposta verdadeiramente antagonistica é diferenciada da toxicidade celular por coloração com azul tripano (uma técnica bem conhecida dos especialista normal da técnica).

Preparação das células e culturas

Os linfócitos do sangue periférico (PBL) são isolados a partir de sangue heparinizado de dadores saudáveis ou por fragmentação de baços de murganhos. As células mononucleares são separadas por centrifugação em gradientes de Ficoll/Hypaque (Pharmacia, Uppsala, Suécia). Os linfócitos B semi-purifiçados são obtidos por roseta com neuraminidase (Behring, Marburg, FRG) - tratadas células vermelhas do sangue de ovelha e feitas aderir ao plástico durante 1 hora, a 37 °C. As células B são também purificadas utilizando separação paramagnética com esferas magnéticas revestidas com anti-CD20 (DYNAL) de acordo com as recomendações do fabricante. A proporção relativa de células B, células T e monócitos é determinada por citometria de luxo utilizando anticorpos monoclonais específicos para CD23, CD3 e CD14, respectivamente (Becton Dickinson, Mountain View, CA) . Resumidamente, 78 106 células/mL são incubadas com uma diluição 1:1000 de anti-CD23 conjugado com ficoeritrina e anti-CD3 conjugado com fluoresceina e anticorpos anti-CDl4, durante 30 minutos a 4 °C. Após 3 lavagens por centrifugação com PBS estéril e 1% de albumina do soro bovino (Sigma) a fluorescência é medida com um citofluorógrafo (FACSTAR Plus, Becton Dickinson, Grenoble, França). Tipicamente, existem 45% de células CD20+, 35% de CD3+ e 10% de CD14+ numa contagem de 5000 células por amostra.

As células são cultivadas a uma densidade de 2xl06 células/mL de RPMl 1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitela inactivado pelo calor (FCS), 2 mM de glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina e 20 mM de HEPES (RPMl-FCS) a 37 °C sob uma atmosfera humidificada de 5% de C02/95% de ar. As culturas são incubadas com concentrações crescentes de IL-4, rhIL-9, rmIL-9 ou formas mutantes recombinantes destas proteínas, isoladas ou em combinação. As experiências de competição são efectuadas com misturas de um ou mais destas moléculas recombinantes ou outros antagonistas de IL-9. As culturas são mantidas durante 9-13 dias.

Frequência de células B que segregam IgE A frequência das células B humanas que segregam IgE em resposta a IL-9 humana ou de murino é determinada utilizando um ensaio ELISA em mancha (Dugas et al., 1993, Eur J Immunol 23:1687-1692; Renz, H. et al., 1990. J. Immunology. 145:3641. as placas de nitrocelulose de 96 poços de fundo plano são revestidas durante a noite, a 4 °C, com mAb anti-IgE humana purificada de cabra diluída em 0,1 M de tampão NaHC03 (2,5 pg/mL). Após uma lavagem com PBS-Tween 20, as placas são 79 incubadas durante 1 hora, com RPMI-FCS para saturar os sítios de ligação não específicos. As células B obtidas após 9-13 dias de cultura são recolhidas, lavadas duas vezes e ressuspensas a 101 células/mL de RPMI-FCS, depois transferidas para as placas revestidas com anti-IgE seguidas por uma incubação de 18 horas a 37 °C. Um mab anti-IgE humana de murganho conjugado com peroxidase em várias diluições é adicionada durante 2 horas a 37 °C após lavagem. As manchas são visualizadas após adição de diamino-benzidina diluída em 0,1 M de Tris-HCl contendo 0,03% de h202 . Após 24 horas as manchas são contadas com um microscópio invertido com uma ampliação de 25X. Os dados são expressos como o número de células que segregam IgE por 106 células. EXEMPLO 11 ELISA para IgE segregada por células co-estimuladas com IL-9

As células são isoladas, preparadas e estimuladas como descrito acima no Exemplo 10. Placas de microtitulação de fundo plano (Nunc) são revestidas com anti-IgE humana de coelho (1:2000, diluição final; Serotec, Oxford, GB), em 200 pL de 10 mM de tampão de bicarbonato (pH 9,6). Após incubação durante a noite, a 4 °C, as placas são lavadas quatro vezes com salino tamponado com fosfato (PBS) contendo 0,05%, durante 1 h, à temperatura ambiente com RPMI-FCS para saturar sítios não específicos de ligação a proteína. Após lavagem, 200 pL de diluições seriadas de IgE humana (Eurobio, Les Ulis, França), padrões em PBS-Tween são adicionados às respectivas placas para estabelecer curvas de calibração. As diluições dos sobrenadantes de cultura a ser testados são, então, adicionadas e, após 2 h à 80 temperatura ambiente, as placas são lavadas e 200 pL de anti-IgE específico conjugado com fosfatase alcalina diluído (1:250; Serotec), anti-lgG ou anti-lgM (Behring) é adicionado nas placas apropriadas. Após 2 h à temperatura ambiente, as placas são lavadas e é adicionado 200 pL (0,5 mg/mL) de p-nitrofenilfosfato (Sigma) em tampão citrato. As placas são incubadas a 37 °C e absorvência (A) é medida a 405 nm utilizando um autoleitor (Dynatech Laboratories Inc, Chantilly, VA) . Os limiares da sensibilidade dos ensaios são 100 pg/mL para IgE, 1 ng/mL para igG, e 2 ng/mL para igM e a variação entre as determinações em duplicado das amostras não excede, tipicamente, os 10%. EXEMPLO 12 O papel da IL-9 em modelos murinos de asma: A resposta das vias aéreas de animais não sensibilizados

Animais

Foram obtidos, do "Jackson Laboratory" (Bar Harbor, ME), murganhos-macho certificados como isentos de vírus, variando de 5 a 6 semanas de idade. Os animais foram colocados em gaiolas em "câmaras" de fluxo laminar, com filtração de ar de elevada eficiência (HEPA), numa instalação isenta de virus e de antigénios e durante 3 a 7 dias antes da manipulação experimental foi permitido o acesso livre a ração seca peletizada para roedor e a água. As instalações animais foram mantidas a 22 °C e o ciclo iluminação:escuridão foi controlado, de forma automática (10/14 h de iluminação:escuridão).

Murganhos-macho e fêmea DBA/2 (D2), C57BL/6 (B6) e (B6D2)Fl (Fl), com 5 a 6 semanas de idade, foram adquiridos do "Jackson 81

Laboratory", Bar Harbor, ME, ou do "National Câncer Institute", Frederick, MD. Os murganhos BXD foram adquiridos do "Jackson Laboratory", Bar Harbor, ME. A ração e a água estavam presentes ad libitum.

Fenotipagem e eficácia do pré-tratamento

Para determinar a resposta broncoconstritora, foi medida a pressão do sistema respiratório na traqueia e registada antes e durante a exposição ao fármaco. Os murganhos foram anestesiados e instrumentados, como descrito previamente. (Levitt, R. C. e Mitzner, W., FASEB J., 2:2605-2608 (1988); Levitt, R. C. e Mitzner, W., J. Appl. Physiol., 67(3):1125-1132 (1989); Kleeberger, S., Bassett, D., Jakab, G. J. e Levitt, R. C., Am. J. Physiol., 258(2):L313-320 (1990); Levitt, R. C., Pharmacogenetics, 1:94-97 (1991); Levitt, R. C. e Ewart, S. L., Am. J. of Respir. Crit. Care Med., 151:1537-1542 (1995); Ewart, S., Levitt, R. C. e Mitzner, W., no prelo, J. Appl. Phys., (1995)). A reactividade das vias aéreas foi medida em relação a um ou mais dos seguintes: 5-hidroxitriptamina (5HT) (sigma). Um ramo de construção adicional que pode ser utilizado é a acetilcolina (sigma), o atracúrio (glaxo Welcome). Foi utilizada uma medida, simples e com repetibilidade, da alteração no Ppi, após o desafio broncoconstritor, e a qual foi designada como o índice Tempo- pressão das Vias Aéreas (ΑΡΤΙ) (Levitt, R. C. e Mitzner, W., FASEB J., 2:2605-2608 (1988); Levitt, R. C. e Mitzner, W., J. Appl . Physiol., 67(3):1125-1132 (1989)) . 0 ΑΡΤΙ foi avaliado através da alteração do pico de pressão inspiratória (Ppi) integrada desde o tempo da injecção até que a pressão de pico retorne à linha de base ou patamar. Ο ΑΡΤΙ foi comparável com a resistência das vias aéreas (Rrs), contudo, o 82 ΑΡΤΙ incluiu um componente adicional relacionado com a recuperação resultante da broncoconstrição.

Foi identificada, em estudos anteriores, a distribuição, por linhagem, da reactividade brônquica em múltiplas linhagens de murganhos consanguíneos (Levitt, R. C. e Mitzner, W., FASEB J., 2:2605-2608 (1988); Levitt, R. C. e Mitzner, W., J. Appl. Physiol., 67(3):1125-1132 (1989)). Foram determinados a Rrs e/ou ο ΑΡΤΙ em murganhos A/J, C3H/HeJ, DBA/2J e C57BL/6J.

Antes de os sacrificar, em animais completamente anestesiados, foi recolhido sangue completo por punção com agulha na veia cava inferior, para medições da igE sérica. As amostras foram centrifugadas para separar as células e o soro foi recolhido e utilizado para medir os níveis totais de IgE. As amostras que não foram medidas, de imediato, foram congeladas a -20 °C.

Foram realizadas a lavagem broncoalveolar e as análises celulares, como descrito noutros locais (Kleeberger et al., 1990) .

Todas as amostras da IgE sérica foram medidas utilizando um ensaio anticorpo/sanduíche, ELISA. As placas de microtitulação ("Corning" N° 2585096, "Corning", N.I.) foram revestidas, 50 pL por poço, com anticorpo de rato anti-lgE de murganho ("Southern Biotechnology", N° 1130-01, Birmingham, AL) numa concentração de 2,5 pg/mL em solução tampão de revestimento de carbonato de sódio/bicarbonato de sódio com azida de sódio ("Sigma", N° S-7795, N° S-6014 e N° S-8032, St. Louis. MO). As placas foram cobertas com película aderente e foram incubadas, a 4 °C, durante 16 h. As placas foram lavadas, por três vezes, com uma 83 solução tampão de lavagem de Tween-20 a 0,05% ("Sigma" N° P-7949) em soro fisiológico tamponado com fosfato ("Biofluids", N° 313, Rockville, MD), e incubadas durante cinco minutos para cada lavagem. O bloqueio dos sítios de ligação não-específicos foi conseguido por adição de 200 pL, por poço, de albumina de soro bovino a 5% ("Sigma", N° A-7888) em PBS, cobrindo com película aderente e incubando a 37 °C durante 2 h. Após lavagem, por três vezes, com solução tampão de lavagem, foram adicionados aos poços, duplicados das amostras de ensaio de 50 pL. As amostras de ensaio, foram ensaiadas após serem diluídas, com solução tampão de lavagem de BSA a 5%, de 1:10, 1:50 e 1:100. Para além das amostras de ensaio, para obter uma curva padrão foi ensaiado um conjunto de padrões de igE ("PharMingen", N° 03121D, San Diego, CA) a concentrações desde 0,8 ng/mL a 200 ng/mL em BSA a 5% em solução tampão de lavagem. Foi utilizado um branco sem amostra ou padrão para acertar a zero o leitor de placas (fundo). Após adição das amostras e dos padrões, a placa foi coberta com película aderente e incubada à temperatura ambiente durante 2 h. Após lavagem, por três vezes, com tampão de lavagem, foram adicionados 50 pL de um segundo anticorpo de rato anti-lgE de murganho conjugado com peroxidase de rábano ("PharMingen", N° 02137E) numa concentração de 250 ng/mL em BSA a 5% em solução tampão de lavagem. A placa foi coberta com película aderente e incubada à temperatura ambiente durante 2 h. Após lavagem, por três vezes, com tampão de lavagem, foram adicionados, a cada poço, 100 pL do substrato de O-fenilaminodiamina ("Sigma" N° P-1526) a 0,5 mg/mL em solução tampão de citrato 0,1 M (da "Sigma", N° C-8532). Após 5 a 10 min, a reacção foi parada com 50 pL de h2S04 a 12,5% ("vwr", N° 3370-4, Bridgeport, NJ) e foi medida a absorvância a 490 nm num leitor de placas Dynatech MR-5000 (Chantilly, VA). Foi traçada uma curva padrão a partir das concentrações padrão de 84

IgE com a concentração de antigénio no eixo dos xx' (escala logarítmica) e a absorvância no eixo dos y (escala linear). A concentração de IgE nas amostras foi obtida por interpolação a partir da curva padrão. EXEMPLO 13 0 papel da IL-9 em modelos murinos de asma: A resposta das vias aéreas de animais sensibilizados

Animais, fenotipagem e optimizaçao da sensibilização com antigénio.

Os animais e o manuseamento foram, no essencial, como descrito no Exemplo 12. A sensibilização com albumina de ovo de perú (AOP) e o desafio com aerossol foram levados a cabo para avaliar o efeito na BHR, na LBA e na IgE sérica. A AOP foi injectada I.P. (25 pg) ao dia zero, antes da nebulização com AOP ou com soro fisiológico. Os murganhos foram desafiados por nebulização com AOP ou com soro fisiológico, a qual foi dada uma vez por dia durante 5 a 7 dias com início quer no dia 13 ou 14. As medições dos fenótipos da IgE sérica, da LBA e da BHR, foram efectuadas ao dia 21. Foram avaliados, o efeito de uma exposição ao aerossol de AOP ao dia 7 no desafio broncoconstritor com 5-HT e acetilcolina, bem como a IgE sérica total, as contagens de células totais LBA e as contagens de células diferenciais e a reactividade brônquica. Foi examinado, através da medição da BHR, da LBA e da IgE sérica, o efeito do anticorpo (Ab) ou do pré-tratamento com soro fisiológico na inflamação pulmonar induzida pelo aerossol de soro fisiológico ou pelo aerossol de 85 ΑΟΡ. Foi administrado o Ab I.P. 2 a 3 dias antes da nebulização com soro fisiológico ou com AOP. A histologia pulmonar foi levada a cabo após terem sido removidos os pulmões durante anestesia profunda. Uma vez que uma instrumentação prévia pode introduzir adulteração, foram utilizados animais diferentes para estes estudos. Assim, um pequeno grupo de animais foi tratado, em paralelo, exactamente da mesma forma do que o coorte sofrendo diversos pré-tratamentos, com excepção de que estes animais não foram utilizados para outros ensaios para além dos ensaios de reactividade brônquica. Após o ensaio de reactividade brônquica, os pulmões foram removidos e submersos em azoto liquido. 0 seccionamento criogénico e o exame histológico foram efectuados de uma forma rotineira.

Foram adquiridos anticorpos policlonais neutralizantes para a IL-9 de murino da "R&D Systems", Minneapolis, MN e foram produzidos anticorpos de bloqueio para o receptor da IL-9 de murino para a "Magainin Pharmaceuticals Inc.", pela "Lampine Biological Laboratories", Ottsville, PA utilizando conjuqados peptidicos produzidos na "Magainin". Os antissoros policlonais foram preparados em coelhos contra sequências peptídicas a partir do receptor da IL-9 de murino. Os péptidos utilizados para produzir os antissoros foram: GGQKAGAFTC (residuos 1-10) (SEQ ID N° 19); LSNSIYRIDCHWSAPELGQESR (residuos 11-32) (SEQ ID N° 20); e CESYEDKTEGEYYKSHWSEWS (residuos 184-203 com um residuo Cys adicionado ao terminal N para acoplamento do péptido à proteina transportadora) (SEQ ID N° 21) . Os antissoros foram produzidos utilizando as técnicas descritas em "Protocols in Immunology", Capitulo 9, Wiley. De uma forma resumida, os péptidos foram acoplados à proteina transportadora ("Keyhole 86

Limpet"), hemocianina ("Sigma") através da cadeia lateral do resíduo Cys utilizando o agente de reticulação bifuncional, MBS (da "Pierce"). Os conjugados peptídicos foram utilizados para imunizar os coelhos com adjuvantes apropriados e foram obtidos os antissoros úteis após várias injecções de reforço do conjugado peptídico. Os anticorpos foram utilizados terapeuticamente para a regulação negativa das funções da IL-9 e para avaliar a importância deste caminho na reactividade pulmonar da linha de base, na IgE sérica e na LBA no murganho não-sensibilizado. Após o pré-tratamento com Ab, foram determinados a BHR, a LBA e os níveis séricos de IgE da linha de base, relativos aos controlos. Em experiências adicionais foram administrados, I.P., IL-9 recombinante humana e de murino, no dia anterior e diariamente durante a sensibilização com antigénio (dias 13 - 18). Os animais foram depois fenotipados, como descrito. A resposta fenotípica de um animal representativo tratado ao dia zero com soro fisiológico, I.P., e desafiado nos dias 14-20 com soro fisiológico (como descrito no Exemplo 12) é apresentada na Figura 20, gráfico 1 (ao cimo). A IgE sérica total da linha de base (controlo) foi de 9,2 ng/mL. A contagem de células totais da lavagem broncoalveolar (LBA) apresentou 182500 células por mililitro de LBA. Estes animais não demonstraram hiperreactividade brônquica quando comparados com os controlos históricos (Levitt, R. C. e Mitzner, W., J. Appl. Physiol., 67(3):1125-1132 (1989)). A Figura 20, gráfico 2 (em cima, ao centro) apresenta um animal representativo de um grupo pré-sensibilizado ao dia zero com AOP, I.P. e desafiado com soro fisiológico nos dias 14-20. Estes animais não diferem dos murganhos não-sensibilizados na 87 sua resposta à broncoconstrição, à IgE sérica e à contagem de células da LBA, (Figura 7, gráfico no topo). A Figura 20, gráfico 3 (em baixo, ao centro) apresenta um animal representativo dos pré-sensibilizados ao dia zero com AOP, I.P. e desafiados com antigénio (AOP) nosdias 14-20. Estes animais desenvolveram hiperreactividade brônquica (aproximadamente duas a três vezes superior à dos controlos), IgE sérica elevada (aproximadamente, uma centena de vezes superior à dos controlos) e números aumentados de células inflamatórias nas vias aéreas, tal como demonstrado pelas contagens elevadas de células da LBA (aproximadamente trinta vezes superior) como comparados com os dos controlos (Figura 20, 2 gráficos no topo) . Muitas das células recrutadas para as vias aéreas, como resultado deste desafio antigénico, foram os eosinófilos. A Figura 20, gráfico 4 (em baixo) apresenta um animal representativo dos pré-sensibilizados ao dia zero com AOP, I.P., pré-tratados com anticorpos policlonais neutralizantes para a IL-9 de murino (aproximadamente, 200 pg/murganho, I.P., em 0,5 mL de PBS) e expostos a antigénio (AOP) nos dias 14-20. Estes animais foram protegidos em relação à resposta ao antigénio. Eles não diferem, de forma significativa, na sua reactividade brônquica, na IgE sérica, e nas contagens de células da LBA, em relação aos controlos (Figura 20, 2 gráficos do topo). A Figura 21 ilustra o efeito da exposição, três dias antes, com antigénio ao AOP (como acima descrito), com e sem pré-tratamento com anticorpos policlonais neutralizantes para a IL-9 de murino, I.P., em animais representativos. A figura da 88 esquerda (A1-2-1B) é uma secção histológica dos pulmões dos animais de controlo (sensibilizados à AOP mas expostos unicamente a uma exposição com aerossol de soro fisiológico). A figura do meio (Al-3-5) é uma secção histológica dos pulmões dos animais sensibilizados à AOP e sujeitos a uma exposição em aerossol de AOP. A figura da direita (Al-4-5) é uma secção histológica dos pulmões dos animais sensibilizados à AOP e expostos a uma exposição com aerossol de AOP, os quais foram pré-tratados três dias antes com anticorpos policlonais neutralizantes para a IL-9 de murino. 0 pré-tratamento com anticorpos neutralizantes produziu a confirmação histológica da protecção total da exposição com antigénio. A Figura 22, gráfico 1 (no topo) apresenta um animal representativo de murganhos pré-sensibilizados ao dia zero com AOP, I.P., e expostos a antigénio (AOP) nos dias 13-18. Estes animais desenvolveram hiperreactividade brônquica (aproximadamente duas a três vezes superior à dos controlos), e números aumentados de células inflamatórias, incluindo os eosinófilos, nas vias aéreas, tal como demonstrado pelas contagens elevadas de células da LBA, como comparados com os controlos (Figura 20, 2 gráficos no topo) . Muitas das células recrutadas para as vias aéreas, como resultado desta exposição ao antigénio, foram os eosinófilos. A Figura 22, gráfico 2 (em baixo) apresenta um animal representativo dos pré-sensibilizados ao dia zero com AOP, I.P., pré-tratados com anticorpos policlonais neutralizantes para o receptor da IL-9 de murino (aproximadamente, 1 mg/murganho, I.P., em 0,5 mL de PBS), e desafiados com antigénio (AOP) nos dias 13-18. Este animal representativo foi protegido em relação à resposta ao antigénio. Esta resposta não diferiu, de forma 89 significativa, na reactividade brônquica, nas contagens de células de LBA, em relação aos controlos (Figura 20, 2 gráficos no topo) . Estes dados demonstram a eficácia potencial do tratamento da alergia atópica com anticorpos para o receptor da IL-9. EXEMPLO 14

Isolamento e Cultura de Baço de Murino

Os murganhos foram anestesiados e os baços foram removidos assepticamente. Os baços foram picados com tesouras e suavemente passados através de uma malha de arame (autoclavada) [peneira N° 60] . As células foram ressuspensas em 40 mL de RPMI-1640 [GIBCO, BRL, Rockville, MD], e centrifugadas durante 5 min. a 250 X G por duas vezes. O sedimento foi ressuspenso em 10 mL de tampão de lise para remover RBCs [4,15 g de NH4C1, 0,5 g KHC03; 0,19 g de EDTA para 500 mL com ddH20] . As células foram incubadas

durante cerca de 5 minutos a 37 °C, e 40 mL de RPMI-FCS

[RPMI-1640, 10% de AFBS, 50 μΜ de BME, 2 mM de glutamina, contendo penicilina e estreptomicina]. Estas células foram centrifugadas de novo, durante 5 minutos, a 250 X G e ressuspensas em 20 mL de RPMI-FCS com ou sem 5 pg/mL de concanavalina A [Sigma N° C5275]. A IL-9 foi avaliada às 48 horas em esplenócitos não tratados e após estimulação com concanavalina A de murganhos DBA/2J (D2) e C57BL/6J (B6). A IL-9 foi amplificada por RT-PCR (como apresentado no Exemplo 6), e pesquisada com uma sonda de murino especifica para IL-9 após transferência de Southern. As transferências de Southern foram efectuadas por técnicas "convencionais". Resumidamente, os produtos de RT-PCR foram sujeitos a electroforese em géis de agarose a 2%. Os géis foram corados com brometo de etídeo e 90 fotografados com uma régua para determinar o peso molecular do ADN na transferência de Southern. Os géis foram então imersos em 0,5 N de NaOH durante 30 minutos e neutralizados em 0,5 M de Tris, pH 7,0 durante 30 minutos. O ADN foi transferido para membrana de nylon zetaprobe (BioRAD) por transferência por capilaridade em 20x SSC durante a noite. No dia seguinte, a membrana foi seca ao ar, cozida a 80 °C durante 15 minutos e pré-hibridado em 6X SSC e 0,1% de SDS durante 1 hora a 42 °C. Foi adicionada uma sonda de oligonucleótido marcada com cinase na extremidade com p32 (5'-AATTACCTTATTGAAAATCTGAAG-3') à solução de hibridação mais 0,1 mg/mL de ADN de esperma de salmão fragmentado e incubada durante a noite a 42 °C. No dia seguinte, o filtro foi lavado em 3X SSC e 0,1% de SDS a 37 °C durante 30 minutos e o filtro foi exposto ao filme durante 1 hora. A Figura 26 ilustra os níveis de estado estacionário de IL-9 após 48 horas para cada linhagem de murganho. A IL-9 foi observada em esplenócitos D2 (D2 —) não estimuladas, enquanto não foi detectada IL-9 nos murganhos B6 (B6-). Enquanto houve um aumento significativo de IL-9 após estimulação com concanavalina A em esplenócitos D2 (D2 + ), não foi detectável IL-9 em murganhos B6 (B6+) apesar do tratamento com concanavalina A. EXEMPLO 15 A expressão de Metll7 IL-9 e Thrll7 IL-9 humana em PBMCs SDS-PAGE e Análise de Imunotransferência

Após obtenção das proteínas isoladas de PBMC humanas de dadores saudáveis que inibem os genótipos do tipo selvagem (Thrll7) ou Metll7-IL-9 como apresentado no Exemplo 13, e a SDS-PAGE foi efectuada pelo método de Laemmli (Laemmli U.K. 91 (1970) Nature 227, 680-685) utilizando um gel de poliacrilamida a 18% num sistema de mini-gel (unidade de gel vertical Xcell II, Novex). Para a análise de imunotransferência, as proteínas separadas por SDS-PAGE foram transferidas para membranas de nitrocelulose utilizando a unidade de transferência SD transblot (Biorad) em 25 mM de tampão Tris-glicina, pH 8,3, contendo 15% de metanol (Towbin H., et al., (1979) (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76, 4350-4354). Os sítios de ligação não ocupados na membrana foram bloqueados por incubação durante 1 hora a toda a noite com 20 mM de tampão Tris-HCl, pH 8,0, mais 0,05% de tween 20 (TBST) contendo 5% de leite em pó. As membranas foram então incubadas com uma diluição 1:1000 de anticorpo policlonal anti-IL-9 humana de cabra (R&D Systems), durante 1 hora, à temperatura ambiente. As membranas foram lavadas com TBST e tratadas com uma diluição 1:10000 de anti-IgG de cabra de murganho conjugado com peroxidase de rábano durante 1 hora. Após lavagem com TBST, os anticorpos ligados foram visualizados por adição do sistema de quimioluminescência com o substrato de sinal super (Pierce) . A Figura 24 demonstra a expressão de proteínas IL-9 humana a partir de PBMC em cultura 48 horas após estimulação com mutagénico em indivíduos cujos genótipos foram determinados por análise genómica do gene de IL-9. A pista 1 tem marcadores de peso molecular, a pista 2 é um Metll7 homozigótico, a pista 3 é um heterozigótico Metll7/Thrll7, a pista quatro é um Thrll7 homozigótico. Foi observado um único produto com o tamanho aproximado esperado (14 kD) em cada um dos PBMC individuais após a estimulação com mutagénico. Estes dados demonstram que ambas as formas da proteína IL-9 são expressas e estáveis no estado estacionário. 92

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE:Magainin Pharmaceuticals Inc. (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Factores Associados A Asma Como Alvo Para Tratamento De Alergias Atópicas Incluindo Asma E Distúrbios Relacionados. (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 22 (iv) MORADA PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Finnegan, Henderson, Farabow, Garrett & Dunner, L.L.P. (B) RUA: 1300 I Street, N.W. (C) CIDADE: Washington (D) ESTADO: D.C.

(E) PAÍS: EUA (F) ZIP: 20005-3315 (v) FORMA DE LEITURA EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: Compatível com IBM PC

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA DE COMPUTADOR: Patentin Release N° 1.0, Versão N° 1.30 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: PCT/US96/12757 (B) DATA DO PEDIDO: 23-AUG-1996 (C) CLASSIFICAÇÃO: 104 (viii) INFORMAÇÃO DO ADVOGADO/AGENTE: (A) NOME: Fordis, Jean B. (B) NÚMERO DE REGISTO: 32984 (C) NUMERO DE REFERÊNCIA/ARQUIVO: 5387.056-304 (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÃO: (A) TELEFONE: (202)408-4000 (B) TELEFAX: (202)408-4400 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:l: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:l: TCTCGAGCAG GGGTGTCCAA CCCTGGCG 28 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 105 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:2 GCAGCTGGGA TAAATAATAT TTCATCTTCA T (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:3 TCTCGAGCAG AGATGCAGCA CCACATGGGG C (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:4

GCAGCTGGTA ACAGTTATGG AGGGGAGGTT T (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:5 GTGACCAGTT GTCTCTGTTT G (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:6

CTGCATCTTG TTGATGAGGA A (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:7: GACAACTGCA CCAGACCATG C 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:8: ATTAGCACTG CAGTGGCACT T 21 108 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:9: GTGACCAGCT GCTTGTGTCT C (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:10

CTTCAGATTT TCAATAAGGT A (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:ll: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:ll GATGATTGTA CCACACCGTG C (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:12

GTTGCCGCTG CAGCTACATT T (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:13:

Ser Asp Asn Ala Thr Arg Pro Ala Phe Ser Glu Arg Leu Ser Gin Met 15 10 15

Thr Asn (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:14:

Phe Ser Arg Vai Lys Lys Ser Vai Glu Vai Leu Lys Asn Asn Lys Ala 15 10 15

Pro Tyr (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:15: 111 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:15:

Glu Gin Pro Ala Asn Gin Thr Thr Ala Gly Asn Ala Leu Thr Phe Leu 15 10 15

Lys Ser (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:16:

Thr Ala Gly Asn Ala Leu Thr Phe Leu Lys Ser Leu Leu Glu lie Phe 1 5 10 15

Gin Lys 112 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:17:

Cys Phe Ser Glu Arg Leu Ser Gin Met Thr Asn Thr Thr Met Gin Thr 15 10 15

Arg Tyr (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:18: GTAAAACGAC GGCCAGT 17 113 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:19:

Gly Gly Gin Lys Ala Gly Ala Phe Thr Cys 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:20:

Leu Ser Asn Ser lie Tyr Arg lie Asp Cys His Trp Ser Ala Pro Glu 1 5 10 15

Leu Gly Gin Glu Ser Arg 20 114 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:21:

Cys Glu Ser Tyr Glu Asp Lys Thr Glu Gly Glu Tyr Tyr Lys Ser His 15 10 15

Trp Ser Glu Trp Ser 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°:22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:22:

Thr Cys Leu Thr Asn Asn lie 1 5

Lisboa, 20 de Dezembro de 2010 115

Claims (16)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um anticorpo, que é um anticorpo anti-interleucina-9 ou um anticorpo anti-receptor de interleucina-9, que bloqueia a ligação da interleucina-9 ao receptor da interleucina-9, para a preparação de um medicamento para a redução da hiperreactividade brônquica num doente.
2. 2. Anticorpo, que é um anticorpo anti-interleucina-9 ou um anticorpo anti-receptor de interleucina-9, que bloqueia a ligação da interleucina-9 ao receptor de interleucina-9, para utilização na redução de hiperreactividade brônquica num doente.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou o anticorpo para utilização de acordo com reivindicação 2, em que o referido anticorpo se liga a interleucina-9.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou o anticorpo para utilização de acordo com a reivindicação 2, em que o referido anticorpo se liga ao receptor de interleucina-9.
5. 5. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1, 3 ou 4 ou o anticorpo para utilização de acordo com qualquer das reivindicações 2-4, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal.
6. 6. Utilização de um receptor de interleucina-9 solúvel que bloqueia a ligação da interleucina-9 ao receptor de 1 interleucina-9 para a preparação de um medicamento para a redução de hiperreactividade brônquica num doente.
7. 7. Receptor de interleucina-9 solúvel que bloqueia a ligação da interleucina-9 ao receptor de interleucina-9 para utilização na redução de hiperreactividade brônquica num doente.
8. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 6 ou o receptor de interleucina-9 solúvel para utilização de acordo com a reivindicação 7, em que a referida proteína do receptor de interleucina-9 solúvel se liga a interleucina-9.
9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 6 ou o anticorpo para utilização de acordo com a reivindicação 2 ou o receptor de interleucina-9 solúvel para utilização de acordo com reivindicação 7, em que o referido medicamento ou anticorpo ou receptor de interleucina-9 solúvel é administrado numa quantidade suficiente para regular negativamente a expressão de interleucina-9.
10. 10. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 6 ou o anticorpo para utilização de acordo com a reivindicação 2 ou o receptor de interleucina-9 solúvel para utilização de acordo com a reivindicação 7, em que o referido medicamento ou anticorpo ou receptor de interleucina-9 solúvel é administrado numa quantidade suficiente para reduzir a eosinofilia na lavagem brônquica de um doente.
11. 11. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 6 ou o anticorpo para utilização de acordo com a reivindicação 2 2 ou o receptor de interleucina-9 solúvel para utilização de acordo com a reivindicação 7, em que o referido medicamento ou anticorpo ou receptor de interleucina-9 solúvel é administrado por inalação.
12. 12. Utilização ou o anticorpo para utilização ou o receptor de interleucina-9 solúvel para utilização de acordo com a reivindicação 11, em que o referido medicamento ou anticorpo ou receptor de interleucina-9 solúvel é administrado por um inalador com medidor de dose.
13. 13. Utilização ou o anticorpo para utilização ou o receptor de interleucina-9 solúvel para utilização de acordo com a reivindicação 11, em que o referido medicamento ou anticorpo ou receptor de interleucina-9 solúvel é administrado por um inalador de pó seco.
14. 14. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 6 ou o anticorpo para utilização de acordo com a reivindicação 2 ou o receptor de interleucina-9 solúvel para utilização de acordo com a reivindicação 7, em que o referido medicamento ou anticorpo ou receptor de interleucina-9 solúvel é administrado por injecção.
15. 15. Utilização ou o anticorpo para utilização ou o receptor de interleucina-9 solúvel para utilização de acordo com a reivindicação 14, em que o referido medicamento ou anticorpo ou receptor de interleucina-9 solúvel é administrado por injecção intravenosa. 3
16. 16. Utilização ou o anticorpo para utilização ou o receptor de interleucina-9 solúvel para utilização de acordo com a reivindicação 14, em que o referido medicamento ou o anticorpo ou receptor de interleucina-9 solúvel é administrado por injecção subcutânea. Lisboa, 20 de Dezembro de 2010 4