KR100862931B1 - Ｉｌ-13 및 ｉｌ-13 수용체 사슬의 길항작용에 의한섬유증의 치료 방법 - Google Patents

Ｉｌ-13 및 ｉｌ-13 수용체 사슬의 길항작용에 의한섬유증의 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 제한없이 가용형 IL-13 수용체를 포함하는 IL-13 길항물질을 이용하여 조직 섬유증의 형성을 치료하거나 억제하는 방법에 관한 것이다.

Description

ＩＬ-13 및 ＩＬ-13 수용체 사슬의 길항작용에 의한 섬유증의 치료 방법{TREATMENT OF FIBROSIS BY ANTAGONISM OF ＩＬ-13 AND ＩＬ-13 RECEPTOR CHAINS}
본 출원은 1996년 3월 1일 출원된 출원 번호 08/609,572의 분할 출원인 1997년 4월 30일 출원된 출원 번호 08/841,751의 CIP 출원이다.
본 발명은 IL-13과 그의 수용체 및 수용체 성분의 상호작용의 길항작용에 의해 섬유증을 치료 및 억제하는 방법에 관한 것이다.
인터류킨-13(IL-13)을 포함하는 시토킨으로 공지된 여러가지 조절 분자는 동정되어 왔다. IL-13의 여러가지 단백질 형태 및 IL-13 활성의 다양한 형태를 암호화하는 DNA는 문헌[참조: MaKenzie 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3735 (1993); Minty 등, Nature 362: 248 (1993); 및 Aversa 등, WO 94/04680]에 기재되어 있다. 따라서, 본원에 사용한 용어 "IL-13"는 유전자 재조합 기법에 의해 사용된 것이든, 자연적으로 또는 다른 인자에 의한 유도에 의해 상기 인자를 생성하는 세포원으로부터 정제된 것이든, 화학적 기법에 의해 합성된 것이든, 상기한 것들의 조합물이든 상기 문헌에 기술된 서열 및/또는 생물학적 활성을 보유하는 단백질을 포함한다.
IL-13은 인간 미성숙 B 세포를 포함하는 IgG4 및 IgE 스위칭의 유도[참조: Punnonen 등, J. Immunol. 152: 1094 (1994)]; 정상적인 인간 B 세포내에서 배 계통 IgE 중쇄 (ε) 전사 및 CD23 발현의 유도[참조: Punnonen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3730 (1993)]; 및 CD40L 또는 항-CD40 mAb의 존재하에서 B 세포 증식의 유도[참조: Cocks 등, Int. Immunol. 5: 657 (1993)]를 포함하는 몇몇 생물학적 활성의 생성에 연루되어온 시토킨이다. IL-13의 많은 활성은 IL-4와 유사함에도 불구하고, IL-4와는 대조적으로, IL-13은 활성화된 T 세포 또는 T 세포 클론에 대한 성장 촉진 효과를 보유하지 않는다[참조: Zurawski 등, EMBO J. 12: 2663 (1993)].
대부분의 시토킨과 같이, IL-13은 표적 세포 표면 상에서 IL-13 수용체("IL-13R")와의 상호작용에 의해 특정 생물학적 활성을 나타낸다. IL-13R 및 IL-4 수용체("IL-4R")는 수용체 활성화를 위해 필요한 공통적인 성분을 공유하나; IL-13은 130 kD IL-4R로 형질감염된 세포에 결합하지 않는다(Zurawski 등, 상기참조). 따라서, IL-13은 1 이상의 다른 리간드 결합 사슬을 보유하여야만 한다. 시토킨 수용체는 일반적으로 2개 또는 3개의 사슬로 구성되어 있다. IL-13에 대한 한 리간드 결합 사슬의 클로닝은 최근 보고되었다[참조: Hilton 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 497-501].
IL-13R의 임의의 다른 IL-13 결합 사슬에 대한 서열을 동정하고 클로닝하여 IL-13R 단백질이 수용체에 대한 IL-13 결합 및 수용체 신호전달의 억제제를 스크리닝 및 치료제의 생성을 포함하는 여러가지 이유를 위해 생성될 수 있도록 하는 것 이 바람직하다.
발명의 개요
본 발명은 제한없이 쥐과동물 및 인간 수용체로부터 유래된 것을 포함하는, IL-13 수용체의 IL-13 결합 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 개시한다. 특정 구체예에서, 본 발명은
(a) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 256 내지 뉴클레오티드 1404;
(b) 서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 103 내지 뉴클레오티드 1242;
(c) 유전 암호의 축퇴성으로 인해 상기 (a) 또는 (b)에 기재한 뉴클레오티드 서열과는 다른 뉴클레오티드 서열;
(d) 엄한 조건하에서 상기 (a) 또는 (b)에 기재한 뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열;
(e) 상기 (a) 또는 (b)에 기재한 서열의 종 상동체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및
(f) 상기 (a) 또는 (b)에 기재한 뉴클레오티드 서열의 대립유전자 변이체
로 구성되는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 뉴클레오티드 서열은 인간 IL-13 수용체의 생물학적 활성을 보유하는 단백질을 암호화하는 것이 바람직하다. 상기 뉴클레오티트 서열은 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열중 256번 뉴클레오티드 내지 1404번 뉴클레오티드; 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열중 319번 뉴클레오티드 내지 1257번 뉴클레오티드; 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열중 1324번 뉴클레오티드 내지 1404번 뉴클레오티드; 서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열중 103번 뉴클레오티드 내지 1242번 뉴클레오티드; 서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열중 178번 뉴클레오티드 내지 1125번 뉴클레오티드; 또는 서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열중 1189번 뉴클레오티드 내지 1242번 뉴클레오티드를 포함한다.
또한, 본 발명은
(a) 서열 번호 2의 아미노산 서열;
(b) 서열 번호 2의 아마노산 서열중 22번 아미노산 내지 334번 아미노산;
(c) 서열 번호 2의 아미노산 서열중 357번 아미노산 내지 383번 아미노산;
(d) 서열 변호 4의 아미노산 서열;
(e) 서열 번호 4의 아미노산 서열중 26번 아미노산 내지 341번 아미노산;
(f) 서열 번호 4의 아미노산 서열중 363번 아미노산 내지 380번 아미노산;및
(g) IL-13 수용체 결합 사슬의 생물학적 활성을 보유하는 상기 (a) 내지 (f)의 단편
으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제 공한다. 기타 바람직한 구체예는 서열 번호 2의 아미노산 서열중 1번 아미노산 내지 331번 아미노산 및 서열 번호 2의 아미노산 서열중 26번 아미노산 내지 331번 아미노산을 암호화한다.
숙주 세포, 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 포유류 세포도 제공된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 IL-13bc 단백질을 생성하는 방법을 제공하는데, 이 방법은
(a) 본 발명의 숙수 세포 배양물을 적합한 배양 배지 내에서 성장시키는 단계; 및
(b) 상기 배양물로부터 인간 IL-13bc 단백질을 정제하는 단계
를 포함한다.
이들 방법에 따라 제조된 단백질도 제공된다.
또한, 본 발명은
(a) 서열 번호 2의 아미노산 서열;
(b) 서열 번호 2의 아미노산 서열중 22번 아미노산 내지 334번 아미노산;
(c) 서열 번호 2의 아미노산 서열중 357번 아미노산 내지 383번 아미노산;
(d) 서열 번호 4의 아미노산 서열;
(e) 서열 번호 4의 아미노산 서열중 26번 아미노산 내지 341번 아미노산;
(f) 서열 번호 4의 아미노산 서열중 363번 아미노산 내지 380번 아미노산; 및
(g) IL-13 수용체 결합 사슬의 생물학적 활성을 보유하는 상기 (a) 내지 (f)의 단편
으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 IL-13bc 단백질을 제공한다. 상기 단백질은 서열 번호 2의 아미노산 서열; 서열 번호 2의 아미노산 서열중 22번 아미노산 내지 334번 아미노산; 서열 번호 4의 아미노산 서열; 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열중 26번 아미노산 내지 341번 아미노산을 포함하는 것이 바람직하다. 다른 바람직한 구체예에서, 특정된 아미노산 서열은 융합 단백질의 일부분이다(IL-13bc로부터 유도되지 않는 추가의 아미노산 서열을 보유함). 바람직한 융합 단백질은 항체 단편, 예를 들어 Fc 단편을 포함한다. 특히 바람직한 구체예는 서열 번호 2의 아미노산 서열중 1번 아미노산 내지 331번 아미노산 및 서열 번호 2의 아미노산 서열중 26번 아미노산 내지 331번 아미노산을 포함한다.
또한, 본 발명의 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물도 제공된다.
본 발명은 추가로 본 발명의 단백질에 특이적으로 반응하는 항체를 포함하는 조성물을 제공한다.
또한, IL-13bc 또는 IL-13 수용체에 결합하는 IL-13의 억제제를 동정하는 방법이 제공되는데, 이 방법은
(a) IL-13bc 단백질 또는 이의 단편과 IL-13 또는 이의 단편을 결합하여 제1 결합 혼합물을 형성하는 단계;
(b) 상기 제1 결합 혼합물 내에서 상기 단백질과 IL-13 또는 단편 사이의 결합량을 측정하는 단계;
(c) 상기 단백질 및 IL-13 또는 단편과 화합물을 결합하여 제2 결합 혼합물을 형성하는 단계;
(d) 상기 제2 결합 혼합물 내에서 결합량을 측정하는 단계; 및
(e) 상기 제1 결합 혼합물 내에서의 결합량과 상기 제2 결합 혼합물 내에서의 결합량을 비교하는 단계(이때, 상기 화합물은, 제2 결합 혼합물의 결합량이 감소되는 경우, IL-13bc 단백질 또는 IL-13 수용체에 결합하는 IL-13을 억제할 수 있음)
를 포함한다. 이들 방법으로 동정된 IL-13R의 억제제 및 이들을 함유하는 약학 조성물도 제공된다.
또한, 포유류 개체 내에서 IL-13bc 단백질 또는 IL-13 수용체에 대한 IL-13의 결합을 억제하는 방법도 제공되는데, 이 방법은 IL-13bc 단백질, IL-13bc 또는 IL-13R 억제제 또는 IL-13bc 단백질에 대한 항체를 함유하는 조성물을 치료 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
또한, IL-13 활성을 강화하는 방법도 제공되는데, 이 방법은 IL-13 활성을 보유하는 단백질과 본 발명의 단백질을 결합하는 단계 및 이러한 결합체와 IL-13bc 이외의 IL-13R의 1 이상의 사슬을 발현하는 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 접촉 단계는 상기 조성물의 치료 유효량을 포유류 개체에 투여함으로써 수행하는 것이 바람직하다.
또한, 포유류 개체 내에서 IL-13-관련된 질환을 치료하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 IL-13 길항물질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 포유류 개체 내에서 IL-13과 IL-13bc와의 상호작용을 억제하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 IL-13 길항물질과 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 치료 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 상기 길항물질은 IL-13bc 단백질, 가용형 IL-13Rα1, IL-13에 대한 항체 또는 이의 IL-13-결합 단편, IL-13bc에 대한 항체 또는 이의 IL-13bc-결합 단편, IL-13Rα1에 대한 항체 또는 이의 IL-13Rα1-결합 단편, IL-4의 IL-13R-결합 돌연변이체, IL-13과 IL-13bc의 상호작용을 억제할 수 있는 소분자 및 IL-13과 IL-13Rα1과의 상호작용을 억제할 수 있는 소분자로 구성되는 군으로부터 선택된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 포유류 개체에서 조직 섬유증을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 단백질과 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는데, 상기 단백질은
(a) 서열 번호 2의 아미노산 서열;
(b) 서열 번호 2의 아마노산 서열중 22번 아미노산 내지 334번 아미노산;
(c) 서열 번호 2의 아미노산 서열중 357번 아미노산 내지 383번 아미노산;
(d) 서열 변호 4의 아미노산 서열;
(e) 서열 번호 4의 아미노산 서열중 26번 아미노산 내지 341번 아미노산;
(f) 서열 번호 4의 아미노산 서열중 363번 아미노산 내지 380번 아미노산;및
(g) IL-13 수용체 결합 사슬의 생물학적 활성을 보유하는 상기 (a) 내지 (f) 의 단편
으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 포유류 개체에서 조직 섬유증의 형성을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 단백질과 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는데, 상기 단백질은
(a) 서열 번호 2의 아미노산 서열;
(b) 서열 번호 2의 아마노산 서열중 22번 아미노산 내지 334번 아미노산;
(c) 서열 번호 2의 아미노산 서열중 357번 아미노산 내지 383번 아미노산;
(d) 서열 변호 4의 아미노산 서열;
(e) 서열 번호 4의 아미노산 서열중 26번 아미노산 내지 341번 아미노산;
(f) 서열 번호 4의 아미노산 서열중 363번 아미노산 내지 380번 아미노산;및
(g) IL-13 수용체 결합 사슬의 생물학적 활성을 보유하는 상기 (a) 내지 (f)의 단편
으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 구체예는 포유류 개체에서 조직 섬유증을 치료 또는 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) IL-13 길항물질 및 IL-4 길항물질로 구성되는 군으로부터 선택되는 분자; 및 (b) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
섬유증을 치료 또는 억제하는 방법의 실시에 있어서, 조직 섬유증은 간, 피부 표피, 피부 내피, 근육, 건, 연골, 심장 조직, 췌장 조직, 폐 조직, 자궁 조직, 신경 조직, 고환, 난소, 부신, 동맥, 정맥, 결장, 소장, 담즙관 및 장으로 구성되는 군으로부터 선택된 조직; 가장 바람직하게는 간 조직(주혈흡충에 의해 감염된 조직을 포함함)에 영향을 미치는 것이 바람직하다. 특정 구체예에서, 섬유증을 상처(외과적 절개를 포함함) 치료에 기인한다.
길항물질을 이용하여 섬유증을 치료 또는 억제하는 방법의 실시에 있어서, 길항물질은 IL-13bc 단백질, 가용형 IL-13Rα1, IL-13에 대한 항체 또는 이의 IL-13-결합 단편, IL-13bc에 대한 항체 또는 이의 IL-13bc-결합 단편, IL-13Rα1에 대한 항체 또는 이의 IL-13Rα1-결합 단편, IL-4의 IL-13R-결합 돌연변이체, IL-13과 IL-13bc의 상호작용을 억제할 수 있는 소분자 및 IL-13과 IL-13Rα1과의 상호작용을 억제할 수 있는 소분자로 구성되는 군으로부터 선택하는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 구체예에서, 상기 길항물질은
(a) 서열 번호 2의 아미노산 서열;
(b) 서열 번호 2의 아마노산 서열중 22번 아미노산 내지 334번 아미노산;
(c) 서열 번호 2의 아미노산 서열중 357번 아미노산 내지 383번 아미노산;
(d) 서열 변호 4의 아미노산 서열;
(e) 서열 번호 4의 아미노산 서열중 26번 아미노산 내지 341번 아미노산;
(f) 서열 번호 4의 아미노산 서열중 363번 아미노산 내지 380번 아미노산;및
(g) IL-13 수용체 결합 사슬의 생물학적 활성을 보유하는 상기 (a) 내지 (f)의 단편
으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 IL-13bc 단백 질이다.
길항물질을 이용하여 이러한 방법을 수행하는 다른 바람직한 구체예에서, 길항물질은 가용형 IL-4R, IL-4에 대한 항체 또는 이의 IL-4-결합 단편, IL-4R에 대한 항체 또는 이의 IL-4R-결합 단편 및 IL-4와 IL-4R과의 상호작용을 억제할 수 있는 소분자로 구성되는 군으로부터 선택된다.
도 1: 본 도면은 IL-13, IL-4, IL-11 및 후술하는 실시예 4에 기술된 바와 같이 IL-13bc-Fc에 노출시킨후의 모방 형질전환된 COS 세포의 사진이다.
도 2: 본 도면은 주혈흡충증 병인론에서 IL-4 및 IL-13의 역할을 나타내는 도면이다. C57BL/6WT 및 IL-4-결핍(4KO) 마우스는 쉬스토소마 만소니(Schistosoma mansoni)의 유미유충으로 감염시키고, 감염후 8주가 경과되면 희생시켜 간 육아종(패널 A), 조직 호산구증가증(패널 B) 및 간 섬유증(패널 C)의 크기를 평가하였다. 별도의 마우스 군은 방법 부분에서 기술한 바와 같이, 대조용 Fc 또는 sIL-13Rα2-Fc로 처리하였다. 확인된 데이타는 개개의 마우스로부터 측정하였으며, 라인은 각각의 군에 대한 평균값을 의미한다. 통계학적 비교는 학생 t-시험(패널 A 및 패널 B) 및 공분산(Covariance) 분석(패널 C)에 의해 수행하였다. 중요한 비교 및 그들의 p 값을 도면에 나타냈다. 모든 데이타는 2회의 연구에서 얻어진 것이다.
도 3: 간 콜라겐은 sIL-13Rα2-Fc-처리된/감염된 마우스에서 감소한다. 간 절편은 초회항원자극에 의해 감염하고 8주가 지난후에 제조하였다. 거의 동일한 조직 난 부담을 보유하는 대조용 Fc-처리된(패널 A 및 B) 및 sIL-13Rα2-Fc-처리된 WT 감염된 마우스로부터 유래한 절편은 피크로시리우스 레드(패널 A 및 C)로 염색하고, 콜라겐이 풍부한 부위가 밝게 나타나도록(패널 B 및 D) 극광을 이용하여 발광시켰다. 복굴절 부위는 양성 콜라겐 염색을 나타냈으며, 나타난 부위는 각각의 간에 대해 대표적인 부위였다(40배 확대). sIL-13Rα2-Fc-처리된 마우스의 간 절편은 대조용 동물과 비교하여 단지 매우 작은 육아종 및 문맥관 관련된 콜라겐을 나타냈다.
도 4: Th1/Th2-형 시토킨 프로필은 sIL-13Rα2-Fc-처리에 의해 영향을 받지 않는다. C57BL/6 WT 및 IL-4-결핍(4KO) 마우스는 25개의 쉬스토소마 만소니의 유미유충으로 감염시켰으며, 별도의 마우스 군은 방법 단락에서 기술한 바와 같이 대조용-Fc 또는 sIL-13Rα2-Fc로 처리하였다. 장간막 림프 결절 세포는 개개의 마우스로부터 분리하였으며, 단일 세포 현탁액(24웰 평판에서 3 x 106 세포/웰)을 제조하였으며, 단지 배지(□), SEA 20 ㎍/ml(○) 또는 SEA와 함께 항-CD4 mAb(△)로 자극하였다. 모든 시토킨은 방법 단락에서 기술한 바와 같이 자극후 72 시간에 ELISA에 의해 배양 상청액 내에서 분석하였다. 기호는 개개의 마우스에 대한 값을 나타내며, 막대는 각 군에서 평균을 나타낸다.
도 5: Th2형 시토킨 mRNA 발현은 감염된 IL-4-결핍 마우스의 간에서는 감소하나, IL-13 장애에 의해서는 영향받지 않는다. C57BL/6WT 및 IL-4-결핍(4KO) 마우스는 쉬스토소마 만소니의 25개의 유미유충으로 감염시키고, 별도의 마우스 군은 방법 단락에서 기술한 바와 같이 대조용-Fc 또는 sIL-13Rα2-Fc로 처리하였다. 모든 동물은 감염후 8주째에 희생시켰으며, 방법 단락에서 기술한 바와 같이 RT-PCR 분석을 위한 간 시험편을 제조하였다. 확인된 데이타는 군당 9 내지 10 마리 동물의 개별적인 값이며, 막대는 각각의 군내에서의 평균값이다. *는 테이타가 WT 대조용-Fc 군과는 상당히 상이함을 나타내고 있는데, 이는 학생 t-테스트(p<0.05)로 부터 측정된다. 5 마리의 감염되지 않은 WT(●) 및 5 마리의 감염되지 않은 IL-4-결핍 마우스(○)는 각각의 시토킨에 대해 Y-축 상에 나타냈다. 모든 데이타는 2회의 연구를 통해 얻어진 것이다.
도 6: 콜라겐 I 및 콜라겐 III mRNA 발현은 감염된 sIL-13Rα2-Fc 처리한 마우스의 간에서는 감소하나, IL-4 결핍에 의해서는 영향을 받지않는다. C57BL/6WT 및 IL-4-결핍(4KO) 마우스는 쉬스토소마 만소니의 25개의 유미유충으로 감염시키고, 별도의 마우스 군은 방법 단락에서 기술한 바와 같이 대조용-Fc 또는 sIL-13Rα2-Fc로 처리하였다. 모든 동물은 감염후 8주째에 희생시켰으며, 방법 단락에서 기술한 바와 같이 RT-PCR 분석을 위한 간 시험편을 제조하였다. 확인된 데이타는 군당 9 내지 10 마리 동물의 개별적인 값이며, 막대는 각각의 군내에서의 평균값이다. *는 테이타가 WT 및 IL-4 결핍성 대조용-Fc 군과는 상당히 상이함을 나타내고 있는데, 이는 학생 t-테스트(p<0.05)로 부터 측정된다. 5 마리의 감염되지 않은 WT(●) 및 5 마리의 감염되지 않은 IL-4-결핍 마우스(○)에서의 평균값은 각각의 시토킨에 대해 Y-축 상에 나타냈다. 모든 데이타는 2회의 연구를 통해 얻어진 것이다.
도 7: IL-13은 쥐과동물 3T3 섬유아세포에서 I형 콜라겐 합성을 유도한다. 세포는 배지(1 레인), rIL-4 1000 유닛/ml(2 레인) 또는 rIL-13 20 ng/ml(각각 3 레인 및 4 레인, R & D 시스템즈 및 제네틱스 인스티튜트)를 이용하여 48 시간 동안 자극하였다. 총 세포 용해물은 환원 조건하에서 6% SDS-PAGE로 분리하고, 니트로셀룰로즈 막에 이전하고, 토끼 IgG 항-마우스 I 형 콜라겐으로 탐침하였다. 상부 이중선 및 하부 밴드(화살표)는 5 레인에서 분리된 정제된 래트 I형 콜라겐에 상응한다(패널 A). 하부 도면(패널 B)은 밀도측정값이다(임의 픽셀 유닛).
바람직한 구체예의 상세한 설명
본 발명은 최초로 동정된, 제한없이 쥐과동물 및 인간 IL-13bc를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, IL-13R의 IL-13 결합 사슬을 암호화하는 폴리펩티드(이하, "IL-13bc"라 칭함)를 제공한다.
서열 번호 1은 쥐과동물 IL-13bc를 암호화하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 서열 번호 2는 수용체 사슬의 예상된 아미노산 서열을 제공하는데, 이는 1번 아미노산 내지 21번 아미노산으로 이루어진 추정적인 신호 서열을 포함한다. 성숙한 쥐과동물 IL-13bc는 서열 번호 2의 아미노산 22 내지 383의 서열을 보유하는 것으로 생각된다. 성숙한 쥐과동물 수용체 사슬은 3개 이상의 구별되는 도메인을 보유한다: 외세포성 도메인(대략 서열 번호 2의 아미노산 22 내지 334을 포함함), 경막 도메인(대략 서열 번호 2의 아미노산 335 내지 356을 포함함) 및 내세포성 도메인(대략 서열 번호 2의 아미노산 357 내지 383을 포함함).
서열 번호 3은 인간 IL-13bc를 암호화하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 서열 번호 4는 수용체 사슬의 예상된 아미노산 서열을 제공하는데, 이는 아미노산 1 내지 25로 이루어지는 추정적인 신호 서열을 포함한다. 성숙한 인간 IL- 13bc는 서열 번호 4의 아미노산 26 내지 380의 서열을 보유하는 것으로 생각된다. 성숙한 인간 수용체 사슬은 3개 이상의 구별되는 도메인을 보유한다: 외세포성 도메인(대략 서열 번호 4의 아미노산 26 내지 341을 포함함), 경막 도메인(대략 서열 번호 4의 아미노산 342 내지 362을 포함함) 및 내세포성 도메인(대략 서열 번호 4의 아미노산 363 내지 380을 포함함).
인간 IL-13bc 서열의 초기 81개의 아미노산은 "yg99f10.r1 호모 사피엔스 cDNA 클론 41648 5"로 동정되고, 할당된 데이타베이스 승인 번호가 R52795.gb_est2인 발현된 서열 태그(EST)의 해독된 서열과 동일하다. 상기 EST 서열내에는 당업자가 시토킨 수용체로서 암호화된 단백질을 동정하도록 하는 상동체 또는 서열 모티프는 존재하지 않는다. 이 테이타베이스 엔트리에 상응하는 cDNA는 I.M.A.G.E. 협회로부터 자유롭게 이용할 수 있다. 본 출원의 우선일 이후에 이러한 클론은 출원인에 의해 요청되고 서열이 결정되었다. 이러한 클론의 서열은 서열 번호 3에 제시한 바와 같이 출원인에 의해 이미 보고된 서열로 결정되었다.
또한, 가용형 IL-13bc 단백질도 생성할 수 있다. 이러한 가용형은 제한없이 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 334 또는 22 내지 334 또는 서열 번호 4의 아미노산 1 내지 341 또는 26 내지 341을 포함하는 단백질을 포함한다. 상기 가용형 IL-13bc는 수용액 내에서, 바람직하게는 실온에서 가용성이라는 것을 추가의 특징으로 한다. 또한, 단지 내세포성 도메인 또는 이의 부분을 포함하는 IL-13bc 단백질도 생성할 수 있다. 전장 보다 짧은 임의 형태의 IL-13bc는 본 발명에 포함되며, 본원에서는 총체적으로 전장의 성숙한 형태를 "IL-13bc" 또는 "IL-13bc 단백질"이라 칭 한다. 전장 보다 짧은 IL-13bc 단백질은 전장 IL-13bc 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 1 또는 서열 번호 3)의 상응하는 단편을 발현시킴으로써 생성할 수 있다. 또한, 이들 상응하는 폴리뉴클레오티드 단편도 본 발명의 일부이다. 상기한 바와 같이 변형된 폴리뉴클레오티드는 적합한 요구되는 결실 돌연변의 구성, 위치-지정된 돌연변이유발법 또는 적합한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하는 폴리머라제 연쇄 반응을 포함하는 표준 분자 생물학 기법에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 단백질은 하기 특성중 하나 이상을 보유한다면, "IL-13 수용체 결합 사슬의 생물학적 활성"을 보유한다: (1) IL-13 또는 이의 단편(바람직하게는 이의 생물학적 활성 단편)에 결합할 수 있는 능력; 및/또는 (2) IL-13R의 제2 비-IL-13-결합 사슬과 상호작용하여 IL-13R에 대한 IL-13 결합의 신호 특성을 생성할 수 있는 능력. 상기 단백질이 보유하는 생물학적 활성은 IL-13 또는 이의 단편에 결합하는 능력이 바람직하며, 더 바람직한 경우는 Kㅇ 가 약 0.1 내지 약 100 nM인 경우이다. 특정 단백질 또는 펩티드가 이러한 활성을 보유하는지 여부를 결정하는 방법으로는 본원의 실시예에 기술된 방법을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
IL-13bc 또는 이의 활성 단편(IL-13bc 단백질)은 면역글로불린과 같은 담체 분자에 융합될 수 있다. 예를 들어, 가용형 IL-13bc는 "링커" 서열을 통해 면역글로불린의 Fc 부분에 융합될 수 있다. 다른 융합 단백질, 예를 들어 GST, Lex-A 또는 MBP도 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 기술한 바와 같은 뉴클레오티드 서열의 대립유전자 변이체, 즉 IL-13bc 단백질, 바람직하게는 IL-13bc의 생물학적 활성을 보유하는 단백질을 암호화하는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 분리된 뉴클레오티드의 자연 발생하는 대체 형태를 포함한다. 또한, 본 발명은 매우 엄한 조건(예를 들어, 0.1xSSC, 65℃) 하에서 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 기재된 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. IL-13bc 단백질을 암호화하나 유전 코드의 축퇴성으로 인해 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 기재된 뉴클레오티드 서열과는 상이한 분리된 폴리뉴클레오티드도 본 발명에 포함된다. 점 돌연변이 또는 유도된 변형에 의해 유발된 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 기재한 바와 같은 뉴클레오티드 서열의 변이체도 본 발명에 포함된다.
또한, 본 발명은 다른 동물종, 특히 다른 포유류종으로부터 쥐과동물 및 IL-13bc의 상동체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 종 상동체는 본원에 개시된 쥐과동물 또는 인간 서열로부터 프로브 또는 프라이머를 제조하고, 적합한 종으로부터 유래한 라이브러리, 예를 들어 관련 종의 PBMC, 흉선 또는 고환으로부터 구성된 라이브러리를 스크리닝함으로써 동정 및 분리할 수 있다.
본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드는 문헌[참조: Kaufman 등, Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991)]에 개시된 pMT2 또는 pED 발현 벡터와 같은 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 재조합 방법으로 IL-13bc 단백질을 생성할 수 있다. 다수의 적합한 발현 조절 서열은 당업계에 공지되어 있다. 또한, 재조합 단백질을 발현하는 일반적인 방법도 공지되어 있으며, 문헌[참조: R. Kaufman, Methods in Enzymology 185, 537-566 (1990)]에 기재되어 있다. 본원에 사용한 용어 "작동가능하게 연결된"은 효소적으로 또는 화학적으로 연결되어 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드와 발현 조절 서열 사이에 공유 결합을 형성하는 것을 의미하는데, 이러한 방식으로 IL-13bc 단백질은 연결된 폴리뉴클레오티드/발현 조절 서열로 형질전환(형질감염)된 숙주 세포에 의해 발현된다.
다수 유형의 세포가 IL-13bc 단백질의 발현을 위해 적합한 숙주 세포로서 작용할 수 있다. 기능성 IL-13bc 단백질을 발현할 수 있는 임의 유형의 세포를 사용할 수 있다. 예를 들어, 적합한 포유류 숙주 세포는 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 신장 293 세포, 인간 표피 A431 세포, 인간 Colo205 세포, 3T3 세포, CV-1 세포, 기타 형질전환된 영장류 세포주, 통상의 배수성 세포, 시험관 내에서 1차 조직 배양물로부터 유도된 세포 균주, 1차 외식편, HeLa 세포, 마우스 L 세포, BHK, HL-60, U937, HaK, Rat2, BaF3, 32D, FDCP-1, PC12, M1x 또는 C2C12 세포를 들 수 있다.
또한, IL-13bc 단백질은 하나 이상의 곤충 발현 벡터내의 적합한 조절 서열에 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드를 작동가능하게 연결하고, 곤충 발현 시스템을 이용함으로써 제조할 수 있다. 바쿨로비루스/곤충 세포 발현 시스템을 위한 재료 및 방법은 키트 형태, 예를 들어 인비트로겐(미국 캘리포니아 샌디에고)의 MaxBac(등록상표) 키트로 시판되며, 이러한 방법들은 문헌[참조: Summer 및 Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987); 본원에 참고 인용함]에 기재되어 있는 바와 같이 당업계에 공지되어 있다. 또한, 가용형 IL- 13bc 단백질은 상기한 바와 같이 적절히 분리된 폴리뉴클레오티드를 이용하여 곤충 세포 내에서 생성할 수 있다.
또는, IL-13bc 단백질은 효모와 같은 하급 진핵생물 또는 박테리아와 같은 원핵생물에서 생성할 수도 있다. 적합한 효모 균주로는 사카로마이세스 세레비제(Saccaromyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼브 (Schizosaccaromyces pombe), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 균주, 칸디다 (Candida), 또는 이종 단백질을 발현할 수 있는 임의의 효모 균주를 들 수 있다. 적합한 박테리아 균주로는 에스케리치아 콜리(Escherichia coli), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 또는 이동 단백질을 발현할 수 있는 임의의 박테리아 균주를 들 수 있다.
박테리아 내에서의 발현은 재조합 단백질에 혼입되는 봉입체를 형성시킬 수 있다. 따라서, 재조합 단백질의 재접힘이 활성 또는 더 활성인 물질을 생성하기 위해 필요할 수 있다. 박테리아 봉입체로부터 정확하게 접혀진 이종 단백질을 얻기 위한 몇몇 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이들 방법은 일반적으로 봉입체로부터 단백질을 용해시키고, 이어서 카오트로픽 제제를 이용하여 상기 단백질을 완전히 변성시키는 과정을 포함한다. 시스테인 잔기가 상기 단백질의 1차 아미노산 서열내에 존재하는 경우, 이는 종종 이황화 결합을 가능하게 하는 환경(redox 시스템)에서 재접힘을 수행할 필요가 있다[참조: Kohno, Meth. Enzym., 185: 187-195 (1990)]. EP 0433225 및 동시계류중인 출원 USSN 08/163,877호에는 다른 방법이 기재되어 있다.
또한, 본 발명의 IL-13bc 단백질은 소정 단백질을 발현하기 위해 필요한 배양 조건 하에서 형질전환된 숙주 세포를 성장시켜 제조할 수 있다. 이어서, 생성되는 발현된 단백질은 배양 배지 또는 세포 추출물로부터 정제할 수 있다. 본 발명의 가용형 IL-13bc 단백질은 조절 배지로부터 정제할 수 있다. 본 발명의 막 결합형 IL-13bc 단백질은 상기 발현 세포로부터 유래한 총 막 분획을 제조하고, 트리톤 X-100과 같은 비이온성 세정제로 막을 추출하여 정제할 수 있다.
IL-13bc 단백질은 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 정제할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 IL-13bc 단백질은 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘 또는 밀리포어 펠리콘 한외여과 유닛을 이용하여 농축할 수 있다. 농축 단계후, 농축물은 젤 여과 매체와 같은 정제 매트릭스에 적용할 수 있다. 또는, 음이온 교환 수지, 예를 들어 현수된 디에틸아미노에틸(DEAE) 또는 폴리에틸렌이민(PEI)기를 보유하는 매트릭스 또는 기재를 이용할 수 있다. 상기 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로즈, 덱스트란, 셀룰로즈 또는 단백질 정제 분야에서 통상적으로 사용되는 기타 유형을 사용할 수 있다. 또는, 양이온 교환 단계를 사용할 수 있다. 적합한 양이온 교환기로는 설포프로필기 또는 카르복시메틸기를 함유하는 여러가지 불용성 매트릭스를 들 수 있다. 설포프로필기가 바람직하다(예를 들어, S-세파로즈(등록상표) 컬럼). 또한, 배양 상청액으로부터 IL-13bc 단백질을 정제는 콘카나발린 A-아가로즈, 헤파린-토요펄(등록상표) 또는 시바크롬 블루 3GA 세파로즈(등록상표)와 같은 친화성 수지 상에서 1 이상의 컬럼 단계; 또는 페닐 에테르, 부틸 에테르, 또는 프로필 에테르와 같은 수지를 이용하는 소수성 상호작용 크로마토그래피; 또는 면역친화성 크로마토그래피를 들 수 있다. 최종적으로, 소수성 RP-HPLC 매체, 예를 들어 현수된 메틸기 또는 기타 지방족기를 보유하는 실리카 겔을 이용하는 하나 이상의 역상 고 성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 단계를 이용하여 IL-13bc 단배질을 정제할 수 있다. IL-13 또는 이의 단편 또는 IL-13bc 단백질에 대한 항체를 포함하는 친화성 컬럼은 공지된 방법에 따라 정제에 이용할 수 있다. 전술한 정제 단계중 일부 또는 전부를 이용하여 실질적으로 정제된, 분리된 재조합 단백질을 제공할 수 있다. 분리된 IL-13bc 단백질은 정제되어 다른 포유류 단백질을 실질적으로 함유하지 않는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 IL-13bc 단백질은 IL-13bc 또는 IL-13R에 결합할 수 있는 제제 또는 IL-13 또는 IL-13bc(외세포성 도메인 또는 내세포성 도메인)에 대한 IL-13의 결합을 방해하여 정상적인 결합 및 시토킨 작용의 억제제("IL-13R 억제제")로 작용할 수 있는 제제를 스크리닝하는데 사용된다. 고정화된 것이든 아니든 소정의 결합 단백질을 이용하는 결합 분석은 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명의 IL-13bc 단백질을 이용하여 상기 목적으로 사용할 수 있다. 정제된 세포계 또는 단백질계(무세포) 스크리닝 분석을 이용하여 이러한 제제를 동정할 수 있다. 예를 들어, IL-13bc 단백질은 담체 상에 정제된 형태로 고정될 수 있으며, 정제된 IL-13bc 단백질에 대한 결합은 가능한 억제제의 존재 또는 부재하에서 측정할 수 있다. 또는, 적합한 결합 분석은 본 발명의 가용형 IL-13bc 단백질을 이용할 수 있다. 억제제를 스크리닝하는 시스템의 다른 예는 실시예 2에 기술되어 있다.
이러한 스크리닝 분석에서, 제1 결합 혼합물은 IL-13 또는 이의 단편과 IL- 13bc 단백질을 결합함으로써 형성되며, 제1 결합 혼합물내의 결합량(B0)이 측정된다. 또한, 제2 결합 혼합물은 IL-13 또는 이의 단편, IL-13bc 단백질 및 스크리닝하려는 화합물 또는 제제를 결합함으로써 형성되며, 제2 결합 혼합물내의 결합량(B)이 측정된다. 제1 및 제2 결합 혼합물내의 결합량은, 예를 들어 B/B0 비를 계산함으로써 비교한다. 제1 결합 혼합물에 비해 제 2 결합 혼합물에서의 결합이 감소되는 것이 관찰되는 경우, 화합물 또는 제제는 결합을 억제할 수 있는 것으로 생각된다. 필요에 따라, IL-13R의 제2 사슬이 상기 결합 혼합물 둘 다 또는 어느 하나에 첨가될 수 있다. 결합 혼합물의 제조 및 최적화는 당업자에게는 통상적인 것이며, 또한 이러한 결합 혼합물은 결합을 증강시키거나 최적화하기 위해 필요한 완충액 및 염을 함유할 수 있으며, 추가의 대조 분석은 본 발명의 스크리닝 분석에 포함될 수 있다.
따라서, IL-13 또는 그의 단편에 대한 IL-13bc 단백질의 결합 활성을 어느 정도, 바람직하게는 약 10% 이상, 더 바람직하게는 약 50% 이상 감소시키는 것으로 확인된 화합물을 동정할 수 있고, 이어서 2차적으로 기타 결합 분석 및 생체내 분석에서 스크리닝할 수 있다. 이러한 방법에 의해 치료제로 적합할 수 있는 IL-13bc 결합에 대한 억제 활성을 보유하는 화합물을 동정할 수 있다.
또한, IL-13bc 단백질 및 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 IL-13bc, IL-13R, IL-13 또는 IL-13bc, IL-13R 또는 IL-13을 발현하는 세포의 존재 또는 발현을 검출하기 위한 진단제로서 사용할 수 있다. 단백질 또는 폴리뉴클레오티드는 이러한 유형의 물질을 이용하는 진단 분석을 위한 표준 방법에서 그러한 목적으로 사용할 수 있다. 적합한 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
본원에 사용한 용어 "IL-13R"은 IL-13bc 및/또는 "IL-13Rα1" 또는 "NR4"로 공지된 제 2 IL-13 수용체 사슬을 의미한다[참조: 쥐과동물 수용체 사슬, Hilton 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 497-501 (1996); 인간 수용체 사슬, Aman 등, J. Biol. Chem. 271: 29265-70 (1996) 및 Gauchat 등, Eur. J. Immunol., 27:971-8 (1997)].
IL-13bc는 IL-13의 공지된 생물학적 활성의 중재자로서 작용한다. 결과적으로, IL-13bc 단백질(특히, 가용형 IL-13bc 단백질), IL-13R 억제제(즉, IL-13과 IL-13R과의 상호작용의 길항물질(예를 들어, IL-13R에 대한 항체(특히, IL-13bc 또는 IL-13Rα1에 대한 항체를 포함함) 및 이의 단편, IL-13에 대한 항체 및 이의 단편, 가용성 IL-13Rα1 단백질, 소분자 및 IL-13과 IL-13R의 상호작용(IL-13bc 및/또는 IL-13Rα1과의 상호작용을 포함함)의 기타 억제제)는 IL-13이 연루되거나 그 IL-13의 활성(또는 활성의 결핍)에 의해 영향받는 다양한 의학적 질환(총칭하여 "IL-13-관련된 질환")의 치료 또는 조절에 유용할 수 있다. 또한, IL-13에 결합하는 IL-4의 돌연변이된 형태도 IL-13 길항물질로 사용할 수 있다[참조: 예를 들어, Shanafelt 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:9454-8 (1998); Aversa 등, J. Exp. Med., 178: 2213-8 (1993); 및 Grunewald 등, J. Immunol., 160: 4004-9 (1998)].
IL-13-관련 질환으로는 Ig-매개된 질환 및 질병(아토피, 알러지 질환, 천식, 면역 복합 질병(예, 루프스, 신증후군, 신장염, 사구체신염, 갑상선염 및 그레이브스병)을 포함하나 이로 제한되는 것은 아님); 폐의 염증성 질환; 면역 결핍증, 특히 조혈 선조 세포의 결핍 또는 이와 관련된 질병; 암 및 기타 질병을 들 수 있는데, 이로 제한되는 것은 아니다. 이러한 병리학적 상태는 질병, 방사선 또는 약물에 대한 노출에 기인할 수 있으며, 이의 예로는 백혈구감소증, 박테리아 및 바이러스 감염, 빈혈, B 세포 또는 T 세포 결핍증(예, 골수 이식후의 면역 세포 또는 조혈 세포 감소증)을 들 수 있다. IL-13은 거식세포 활성화를 억제하기 때문에, IL-13bc 단백질은 거식세포 활성화(즉, 백신화, 미코박테리아 또는 내세포성 유기체 또는 기생충 감염의 치료)에 유용할 수 있다.
또한, IL-13bc 단백질은 시험관내 또는 생체내에서 IL-13의 효과를 증강시키는데 사용할 수 있다. 예를 들어, IL-13bc 단백질은 IL-13 활성을 보유하는 단백질(바람직하게는, IL-13)과 조합될 수 있으며, 생성되는 조합물은 IL-13bc 이외에 IL-13R의 하나 이상의 사슬(바람직하게는, IL-13bc 이외의 IL-13R의 모든 사슬, 예 IL-13Rα1)을 발현하는 세포와 접촉시킬 수 있다. 상기 접촉 단계는 생체내에서 포유류 개체에 상기 조합물의 치료 유효량을 투여함으로써 수행된다. IL-13 단백질과 IL-13bc 단백질의 이미 확립된 회합은 적합한 신호전달을 위해 필요한 완전한 IL-13/IL-13R 복합체의 형성에 조력할 것이다. 예를 들어, 문헌[참조: Economides 등, Science 270: 1351 (1995)]을 참조할 것.
세포로부터 정제되거나 재조합 방법에 의해 생성된 IL-13bc 단백질 및 IL-13R 억제제는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 약학 조성물로서 유용할 수 있 다. 이러한 조성물은 또한 IL-13bc 또는 억제제 및 담체, 여러가지 희석제, 충전제, 염, 완충액, 안정제, 용해제 및 기타 당업계에 공지된 물질을 함유할 수 있다. 본원에 사용한 용어 "약학적으로 허용가능한"은 활성 성분(들)의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않는 비독성 물질을 의미한다. 상기 담체의 특성은 투여 경로에 따라 달라질 것이다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 시토킨, 림포킨 또는 M-CSF, GM-CSF, 인터류킨(예, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4...IL-24, IL-25), G-CSF, 줄기 세포 인자 및 적혈구생성인자와 같은 기타 조혈인자를 함유할 수 있다. 또한, 약학 조성물은 항-시토킨 항체를 포함할 수 있다. 약학 조성물은 추가로 기타 항-염증성 제제를 포함할 수 있다. 이러한 부가 인자 및/또는 제제는 상기 약학 조성물에 포함되어 분리된 IL-13bc 단백질 또는 IL-13bc 억제제와 상승 효과를 창출하거나 분리된 IL-13bc 또는 IL-13bc 억제제에 의해 유발된 부작용을 최소화한다. 반대로, 분리된 IL-13bc 또는 IL-13bc 억제제는 특정 시토킨, 림포킨, 기타 조혈 인자, 혈전융해 또는 항 혈전 인자 또는 항염증성 인자의 제제 내에 포함되어 시토킨, 림포킨, 기타 조혈 인자, 혈전융해 또는 항-혈전 인자 또는 항 염증성 인자에 의해 유발된 부작용을 최소화한다.
본 발명의 약학 조성물은 분리된 IL-13bc 단백질 또는 IL-13bc 억제제가 조합되고, 또한 기타 약학적으로 허용가능한 담체, 양친매성 제제, 예를 들어 수용액 내에서 마이셀, 불용성 단층, 지질 결정 또는 라멜라 층과 같은 응집된 형태내에 존재하는 지질과 같은 양친매성 제제와 함께 리포좀 형태로 존재할 수 있다. 리포 좀을 제조하는데 적합한 지질로는 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 설파티드, 리소레시틴, 인지질, 사포닌, 담즙산 등을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 이러한 리포좀 제제의 제조는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제4,235,871호, 미국 특허 제4,501,728호, 미국 특허 제4,837,028호 및 미국 특허 제4,737,323호에 기재되어 있다. 상기 특허는 모두 본원에 참고로 인용한 것이다.
본원에서 사용한 용어 "치료 유효량"은 의미있는 효과, 예를 들어 이러한 질환의 징후 완화, 치료, 치료 속도의 증가를 나타내기에 충분한 약학 조성물 또는 방법에서 각각의 활성 성분의 총 양을 의미한다. 투여되는 개개의 활성 성분의 양에 적용되는 경우, 상기 용어는 병용하든, 연속하여 투여하든 동시에 투여하든 치료 효과를 나타내는 활성 성분의 총량을 의미한다.
본 발명의 치료 방법을 실시하거나, 용도에 맞게 본 발명을 적용하는 경우, 분리된 IL-13bc 단백질 또는 IL-13bc 억제제의 치료 유효량을 포유동물에게 투여한다. 분리된 IL-13bc 단백질 또는 IL-13bc 억제제는 본 발명의 방법에 따라 단독으로 또는 기타 치료법, 예를 들어 시토킨, 림포킨 또는 기타 조혈 인자를 이용하는 치료화 함께 투여될 수 있다. 하나 이상의 시토킨, 림포킨 또는 기타 조혈 인자와 함께 투여되는 경우, IL-13bc 단백질 또는 IL-13bc 억제제는 시토킨(들), 림포킨(들), 기타 조혈 인자(들), 혈전융해인자 또는 항혈전 인자와 동시에 투여되거나, 연속하여 투여될 수 있다. 연속적으로 투여되는 경우, 담당의사는 시토킨(들), 림포킨(들), 기타 조혈 인자(들), 혈전융해인자 또는 항혈전 인자와 함께 IL-13bc 단백질 또는 IL-13bc 억제제를 투여하는 적합한 순서를 결정해야 할 것이다.
약학 조성물에 사용된, 또는 본 발명의 방벙을 실시하기 위해 사용된 IL-13bc 단백질 또는 IL-13bc 억제제의 투여는 여러 가지 통상적인 투여 방법, 예를 들어 경구 투여, 흡입 또는 경피 투여, 피하 투여 또는 정맥내 주입에 의해 수행할 수 있다. 환자에게 정맥내 투여하는 것이 바람직하다.
IL-13bc 단백질 또는 IL-13bc 억제제의 치료 유효량을 경구 투여하는 경우, IL-13bc 단백질 또는 IL-13bc 억제제는 정제, 캡슐, 분말, 용액등의 형태일 것이다. 정제로 투여하는 경우, 본 발명의 약학 조성물은 부가적으로 젤라틴 또는 보조제와 같은 고형 담체를 함유할 수 있다. 정제, 캡슐 및 분말은 IL-13bc 단백질 또는 IL-13bc 억제제 약 5 내지 95%, 바람직하게는 약 25 내지 90%를 포함한다. 액체 형태로 투여하는 경우, 물, 석유, 동물성 기름 또는 식물성 기름(예, 땅콩유, 광유, 대두유, 또는 참깨유) 또는 합성유와 같은 액상 담체가 첨가될 수 있다. 약학 조성물의 액체 형태는 생리적 염수 용액, 덱스트로즈 또는 기타 사카린 용액 또는 글리콜(예, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜)을 추가로 함유할 수 있다. 액체 형태로 투여하는 경우, 약학 조성물은 IL-13bc 단백질 또는 IL-13bc 억제제 약 0.5 내지 90 중량%, 바람직하게는 약 1 내지 50 중량%를 포함한다.
IL-13bc 단백질 또는 IL-13bc 억제제의 치료 유효량이 정맥내, 경피 또는 피하 주입에 의해 투여되는 경우, IL-13bc 단백질 또는 IL-13bc 억제제는 발열원이 없는 상태의 비경구적으로 허용할 수 있는 수용액 형태일 수 있다. pH, 등장성, 안정성 등을 고려하여 비경구적으로 허용가능한 단백질 용액의 제조는 당업자에게는 명백할 것이다. 정맥내, 경피 또는 피하 주입을 위해 바람직한 약학 조성물은 IL-13bc 단백질 또는 IL-13bc 억제제 이외에 강장 비히클, 예를 들어 염화 나트륨 주입액, 링커 주입액, 덱스트로즈 주입액, 덱스트로즈 및 염화 나트륨 주입액, 락테이트화 링거 용액 또는 당업계에 공지된 기타 비히클을 포함하여야 한다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 안정제, 보존제, 완충제, 산화방지제, 또는 당업자에게 공지된 기타 첨가제를 함유할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 사용되는 IL-13bc 단백질 또는 IL-13bc 억제제의 양은 치료하려는 질환의 특성 및 경중에 따라 달라질 것이며, 환자가 이전에 받고 있는 치료의 특성에 따라서도 달라질 것이다. 궁극적으로, 담당 의사는 개개의 환자를 치료하기 위한 IL-13bc 단백질 또는 IL-13bc 억제제의 양을 결정하여야 한다. 먼저 담당의사는 소량의 IL-13bc 단백질 또는 IL-13bc 억제제를 투여하여 환자의 반응을 관찰한다. 그후, 환자에게서 최적 치료 효과가 얻어질 때까지 더 많은 양의 IL-13bc 단백질 또는 IL-13bc 억제제를 투여하고, 그 시점에서는 일반적으로 투여량을 증가시키지 않는다. 본 발명의 방법에 사용하기 위해 고려된 여러 가지 약학 조성물은 체중 1 kg당 약 0.1 ㎍ 내지 약 100 mg(바람직하게는, 약 20 ㎍ 내지 약 500 ㎍)의 IL-13bc 단백질 또는 IL-13bc 억제제를 함유하여야 한다.
본 발명의 약학 조성물을 이용한 정맥내 치료법의 지속기간은 치료하려는 질병의 경중 및 개개 환자의 가능한 특이체질적 반응에 따라 달라질 것이다. IL-13bc 단백질 또는 IL-13bc 억제제의 각각 투여의 지속기간은 연속적인 정맥 투여시 12 내지 24시간이다. 궁극적으로 담당 의사는 본 발명의 약학 조성물을 이용하는 정맥 내 치료법의 적합한 지속기간을 결정해야 할 것이다.
또한, 본 발명의 IL-13bc 단백질은 IL-13bc 단백질과 특이적으로 반응하고, 수용체에 대한 IL-13 또는 이의 단편의 결합을 억제할 수 있는 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 얻기 위해서 동물을 면역화하는데 사용할 수 있다. 이러한 항체들은 면역원으로서 전체적인 IL-13bc 또는 IL-13bc의 단편, 예를 들어 가용성 성숙 IL-13bc를 이용하여 얻을 수 있다. 펩티드 면역원은 추가로 카르복실 말단에 시스테인 잔기를 함유할 수 있으며, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)과 같은 햅텐에 접합될 수 있다. 추가의 펩티드 면역원은 티로신 잔기를 설페이트화된 티로신 잔기로 대체하으로써 생성할 수 있다. 이러한 펩티드를 합성하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[참조: R.P. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963); J.L. Krstenansky 등, FEBS Lett. 211, 210 (1987)]에 기재되어 있다.
또한, IL-13bc에 결합하는 중화 항체 또는 비중화 항체(모노클로날 항체가 바람직함)는 특정 종양 치료에 유용할 수 있으며, 상기한 바와 같은 질환 치료에 유요할 수 있다. 이들 중화 모노클로날 항체는 IL-13bc에대한 IL-13 결합을 차단할 수 있다.
실시예 1
IL-13bc cDNA의 분리
폴리A + RNA 5 ㎍은 6 내지 8주된 C3H/HeJ 마우스의 흉선으로부터 제조하였다. 이본쇄의 헤미메틸화된 cDNA는 제조사의 지시에 따라 스트라타진의 cDNA 합성 키트를 이용하여 제조하였다. 개략적으로, 제1 스트랜드는 올리고 dT-Xho 프라이머를 이용하여 프라이밍하고, 제2 스트랜드를 합성한 후, EcoRI 어댑터를 첨가하고, cDNA는 XhoI로 분해하고, 정제하였다. cDNA는 잽 익스프레스(Zap Express; 스트라타진) 람다 벡터의 XhoI-EcoRI 위치에 연결하고, 제조자의 지시에 따라 기가팩 II 골드 팩케이징 추출물(스트라타진)을 이용하여 팩케이징하였다. 1.5 x 106 개의 생성된 재조합 파지 라이브러리는 제조자의 지시에 따라 증폭시켰다. 이 라이브러리는 문헌[참조: Ausubel 등. Current Protocols in Molecular Biology, John & Wiley and Sons, 6.4.3편 (1995)]에 기술된 바와 같이 축퇴성 17량체 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 서열 KSRCTCCABKCRCTCCA(서열 번호 5)(K=G+T; sS=C+G; R=A+G; B=C+G+T)를 이용하여 스크리닝하였다. 클론 A25를 동정하였는데, 그 이유는 이것이 17량체 프로브에는 혼성화하나, 공지된 조혈인자 수용체로부터 유도된 프로브에는 혼성화하지 않았기 때문이다. 이 클론은 제조사의 지시에 따라 잽 익스프레스 벡터로부터 플라스미드 형으로 분리하였으며, DNA 서열을 결정하였다. DNA 서열은 조혈인자 수용체 패밀리의 신규한 일원을 암호화하였다.
서열 번호 1의 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 클론 A25는 1996년 2월 22일자로 ATCC에 pA25pBKCMV(수탁 번호 69997)로 기탁하였다.
인간 IL-13 수용체 사슬의 분리
쥐과동물 수용체의 인간 상동체의 부분 단편은 쥐과동물 서열로부터 유도된 올리고뉴클레오티드를 이용하는 PCR에 의해 분리하였다. cDNA는 클론테크로부터 구입한 인간 고환 폴리A + RNA로부터 제조하였다. 274개의 염기쌍으로 이루어진 DNA 단편은 다음 올리고뉴클레오티드: ATAGTTAAACCATTGCCACC(서열 번호 6) 및 CTCCATTCGCTCCAAATTCC(서열 번호 7)를 이용하고, 1.5 mM MgCl2를 함유하는 1X Taq 완충액 내의 앰플리Taq 폴리머라제(프로메가)를 이용하여 30회의 항온처리(94℃에서 1분, 42℃에서 1분 및 72℃에서 1분) 기간동안 이 cDNA로부터 PCR로 증폭하였다. 이 단편의 DNA 서열을 결정하였으며, 2개의 올리고뉴클레오티드는 하기 서열을 갖는 이 단편의 내부 부분으로부터 제조하였다: AGTCTATCTTACTTTTACTCG(서열 번호 8) 및 CATCTGAGCAATAAATATTCAC(서열 번호 9). 이들 올리고뉴클레오티드를 프로브로 사용하여 클론테크로부터 구입한 인간 고환 cDNA 라이브러리(카타록 # HL1161)를 스크리닝하였다. 필터는 표준 5X SSC 혼성화 조건하의 52℃에서 혼성화하였으며, 52℃의 2X SSC에서 세정하였다. 400,000개의 클론을 스크리닝하여 상기 올리고뉴클레오티드 둘 다에 혼성화하는 22개의 클론을 분리하였다. DNA 서열은 cDNA 클론중 4개로부터 결정하였으며, 이들 모두는 동일한 신규 조혈인자 수용체를 암호화하였다. 전장 인간 수용체 사슬의 예상된 DNA 서열은 서열 번호 3에 나타냈다.
인간 클론은 1996년 2월 22일자로 ATCC에 phA25#11pDR2(수탁 번호 69998)로 기탁하였다.
실시예 2
가용성 IL-13bc 단백질의 발현 및 활성 분석
가용성 IL-13bc-Ig의 생성 및 정제
쥐과동물 IL-13bc의 외세포성 도메인의 아미노산 1 내지 331을 암호화하는 DNA는 PCR에 의해 gly-ser-gly를 암호화하는 스페이서 서열에 융합되어 COS-1 발현 벡터 pED.Fc의 인간 IgG1의 힌지 CH2CH3 영역을 암호화하는 서열을 보유하는 프레임 내에 연결되었다. IL-13bc-Ig는 DEAE-덱스트란 형질감염된 COS-1 세포로부터 생성하였으며, 단백질 A 세파로즈 크로마토그래피(파마시아)에 의해 정제하였다.
B9 증식 분석
IL-13 또는 IL-14에 대한 반응의 B9 세포의 증식 촉진[참조: Aarden 등, Eur. J. Immunol. 17: 1411-1416 (1987)]은 DNA내로 혼입하는 3H-티미딘에 의해 측정하였다. 세포(5 x 103/웰)는 IL-13bc-Ig 1 ㎍/ml의 존재 또는 부재하에서 농도를 변화시키면서 성장 인자를 함유하는 배지를 보유하는 96웰 평판내로 접종하였다. 3일 동안 항온처리하고, 3H-티미딘 1 μCi/웰을 첨가하고, 세포는 추가로 4 시간 동안 항온처리하였다. 혼입된 방사능은 LKB 1205 평판 판독기를 이용하여 측정하였다.
B9 세포주는 IL-13, IL-4 또는 IL-6에 반응하여 증식하였다. 단지 IL-13에 반응하는 것은 가용성 IL-13bc-Ig에 의해 억제되었는데, 이는 이 수용체가 IL-13에 특이적으로 결합하나, IL-4 또는 IL-6에는 결합하지 않음을 의미하는 것이다. 하기 표들은 cpm을 나타낸다. 2개의 별도의 실험을 나타낸다.
시토킨 희석율 IL-13 (3 ng/ml) IL-13 + A25-Fc (1 ㎍/ml) IL-4 (20 ng/ml) IL-4 + A25-Fc (1 ㎍/ml) Cos IL-6 (1/10,000)
1 37734 1943 6443 6945 37887
1/3 30398 1571 2680 2442 36500
1/10 16101 1461 1767 1771 33335
1/30 2148 1567 1619 1783 27271
1/100 1574 1419 1522 1576 18831
1/300 1512 1531 1373 1577 7768
1/1000 1316 1392 1190 1474 2760
1/3000 1834 1994 1482 1819 1672
시토킨 희석율 IL-13 (3 ng/ml) IL-13 + A25-Fc (5 ㎍/ml) IL-4 (20 ng/ml) IL-4 + A25-Fc (5 ㎍/ml) Cos IL-6 (1/10,000) Cos IL-6 + A25-Fc (5 ㎍/ml)
1 6413 295 1216 1158 6969 7703
1/3 5432 281 518 656 7827 8804
1/10 2051 281 489 520 8345 10027
1/30 506 319 279 476 8680 9114
1/100 430 372 288 423 7426 10364
1/300 330 287 323 420 5531 6254
1/1000 326 389 348 nt 2524 nt
시토킨 없슴 339 279 404 394 326 279

실시예 3
표면 플라즈몬 공명(바이어코어 분석)에 의해 측정한 IL-13에 대한 가용성 IL-13bc의 직접 결합
바이어코어 바이오센서를 이용하여 정제된 IL-13bc-Ig에 대한 IL-13의 특이적인 결합을 직접 측정하였다[참조: Johnsson 등, Pharmacia (1991)]. 정제된 IL-13bc-Ig, 인간 IgG1 또는 무관한 수용체 약 10,000 내지 17,000 공명 단위(RU)는 제조사의 추천에 따라 센서 칩 상에 상이한 플로우 세포에 각각 공유적으로 고정화하였다. (RU는 센서 칩 표면에 결합한 단백질 매스의 반사임) 정제된 IL-13은 과량의 정제된 IL-13bc-Ig의 존재 또는 부재하에서 10분 동안 5 ㎕/분으로 플로우 세포를 횡단하여 주입하였다. 결합은 샘플 주입 전 및 후에 RU의 차이로 정량화하였다. 481.9 RU라는 특이성 IL-13 결합은 단지 고정된 IL-13bc-Ig에서 관찰된 반면, IL-13 + IL-13bc-Ig의 동시주입은 고정화된 IL-13bc-Ig(4 RU)에 결합하지 않았다. 고정된 IgG 또는 IL-11R-Ig에 대한 결합은 관찰되지 않았다(각각, 5.4 및 3.7 RU).
샘플 IL-13bc-Ig (10,383 RU) IgG 대조용 (13,399 RU) IL-11R-Ig (17,182 RU)
100 ng/ml 인간 IL-13 481.9 RU 결합 5.4 RU 결합 3.7 RU 결합
100 ng/ml 인간 IL-13 + 가용성 IL-13bc-Ig 4.0 RU 결합 테스트하지 않음 테스트하지 않음

실시예 4
표지된 IL-13bc-Ig 융합 단백질에 대한 COS 세포 내에서 발현된 IL-13의 결합: IL-13bc-Fc를 이용하는 IL-13의 COS 내 검출
IL-13, IL-4, IL-11을 위한 발현 벡터 또는 빈 벡터를 DEAE-덱스트란 법에 의해 이중 평판에서 COS-1 내로 형질감염시켰다. 형질감염후 2일이 경과하면, 세포는 인산염 완충 염수(PBS)로 2회 세척하고, 4℃에서 10' 동안 메탄올을 이용하여 배양 접시 내에 고정하였다. 고정후, 세포는 PBS로 2회 세정하고, 이어서 결합 완충액(PBS, 1%(w/v) 소 혈청 알부민 1%(w/v) 나트륨 아지드)으로 1회 세정하고, IL-13bc-Fc 1.0 ㎍/ml 또는 관련 항-시토킨 항혈청을 보유하는 4℃의 결합 완충액 내에서 2 시간 동안 항온처리하였다. 세포는 PBS로 2회 세정하고, 결합 완충액 내에서 1:500 희석된 알칼리성 포스파타제 표지된 토끼 F(ab)2' 항-인간 IgG(Fc 융합 검출용) 또는 토끼 F(ab)2'항-래트 IgG(항-시토킨 검출용) 내에서 교반하면서 4℃에서 항온처리하였다. 세포는 PBS를 이용하여 다시 2회 세정하였다. 알칼리성 포스파타제 활성은 니트로 블루 테트라졸륨 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트를 이용하여 가시화하였다.
특이적인 결합은 현미경으로 관찰하였다. 단지 IL-13으로 형질감염된 세포만 IL-13bc-Ig에 대한 특이적인 결합을 나타냈다(도면의 형질감염된 세포 사진을 참조할 것).
실시예 5
IL-13bc 단백질의 생물학적 활성을 측정하기 위한 다른 시스템
다른 시스템은 특이적인 IL-13bc 단백질이 본원에 기술한 바와 같은 IL-13bc의 "생물학적 활성"을 나타내는지의 여부를 결정하기 위해 사용하였다. 다음은 이러한 시스템의 예이다.
IL-13 결합을 위한 분석
IL-13 또는 이의 단편에 결합하는 IL-13bc 단백질의 능력은 이러한 결합을 검출할 수 있는 임의의 적합한 분석에 의해 측정할 수 있다.
IL-13bc 단백질의 외세포성 영역에 대한 IL-13의 결합은 수용체 단백질에 대한 포스포티로신의 신속한 유도를 특이적으로 유발시킨다. 이하, 인산화의 유도에 의해 측정된 바와 같이 리간드 결합 활성에 대한 분석에 대해 기술한다.
또는, IL-13bc 단백질(예를 들어, 외세포성 도메인의 가용형)을 생성하고, 이를 이용하여 IL-13 결합을 검출하였다. 예를 들어, 외세포성 도메인(예상된 경막 도메인 전에 절단된, 바람직하게는 예상된 경막 도메인 직전에 절단된)이 인간 면역글로블린(Ig) γ1의 힌지 CH2 및 CH3를 암호화하는 cDNA에 대한 프레임 내에 연결된 cDNA 구성물을 제조하였다. 이 구성물은 COS 세포를 위한 적절한 발현 벡터,예를 들어 pED△C 또는 pMT2내에서 생성하였다. 상기 플라스미드는 일시적으로 COS 세포내로 형질감염하였다. 분비된 IL-13bc-Ig 융합 단백질은 조절된 배지 내에서 수집하였으며, 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
정제된 IL-13bc-Ig 융합 단백질을 이용하여 여러가지 용도에서 IL-13 결합을 입증하였다. IL-13는 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 평판 상에 코팅할 수 있으며, 이어서 추가의 결합 부위는 표준 ELISA 완충액을 이용하여 소 혈청 알부민 또는 카제인으로 차단하였다. 이어서, IL-13bc-Ig 융합 단백질은 고체상 IL-13에 결합하였으며, 결합은 호스래디시 퍼옥시다제에 접합된 2차 염소 항-인간 Ig를 이용하여 검출하였다. 특이적으로 결합된 효소의 활성은 비색측정 기질, 예를 들어 테트라메틸 벤지딘 및 흡광도 판독으로 측정할 수 있다.
또한, IL-13은 세포 표면 상에서, 예를 들어 경막 도메인 또는 글루코실 포스파티딜 이노시톨(GPI) 결합을 제공함으로써 발현될 수 있다. 막 결합된 IL-13을 발현하는 세포는 IL-13bc-Ig 융합 단백질을 이용하여 동정할 수 있다. 가용성 IL-13bc-Ig 융합 단백질은 이들 세포의 표면에 결합하며, 플루오로크롬, 예를 들어 플루오레세인 이소티오시아네이트 및 유량 세포계수법으로 검출할 수 있다.
상호작용 트랩
효모 유전 선택법인 "상호작용 트랩"[참조: Gyuris 등, Cell 75: 791-803 (1993)]을 이용하여 IL-13bc 단백질이 본원에 기술한 바와 같은 IL-13bc의 생물학적 활성을 보유하는지 여부를 결정할 수 있다. 이 시스템에서, LexAop-Leu2 및 LexAop-LacZ으로부터 리포터 유전자의 발현은 미끼 단백질, 예를 들어 이 경우에는 인간 IL-13bc와 상호작용하는 종 및 피식자, 예를 들어 이 경우에는 인간 IL-13bc 단백질 사이의 상호작용에 의존한다. 따라서, Leu2 또는 LacZ 발현의 수준에 의해 상기 상호작용의 강도를 측정할 수 있다. 가장 간단한 방법은 LacZ 암호화된 단백질, 즉 β-갈락토시다제의 활성을 측정하는 것이다. 이 활성은 배지를 포함하는 X-Gal 또는 필터 상에서 청색의 정도에 의해 판단할 수 있다. β-갈락토시다제 활성의 정량적인 측정을 위해서는, 문헌[참조: Rose, M.D., Winston, F. 및 Hieter, P., "Methods in Yeast Genetics" Cold Spring Harbor, New York, (1990)]에 기술된 표준 방법을 이용하여 확인할 수 있다.
이러한 방법에서, IL-13bc 단백질이 특정 종(예를 들어, 생체내에서 IL-13bc의 내세포성 도메인에 결합하는 세포질 단백질)과 상호작용하는지 여부를 결정하길 원한다면, 상기 종은 테스트하려는 IL-13bc 단백질과의 상호작용 트랩에서 "미끼"로서 사용될 수 있으며, 역으로 "피식자"로 사용될 수도 있다.
실시예 6
가용성 IL-13R을 이용하는 섬유증의 억제
섬유증 조직의 발생은 상해후 정상적인 치료 과정의 일부분이다. 그럼에도 불구하고, 몇몇 상황에서, 상해받은 조직의 정상적인 기능을 방해하는 과도한 콜라겐의 파괴적인 축적이 존재하게 된다. 실제로 콜라겐 합성 및 조직 손상은 몇몇 자가면역질병, 알러지성 질병 및 염증성 질병1-7을 포함하는 다수의 만성 및 쇠약성 질병의 주요한 병리학적 증거이다. 상처 조직 형성8,9의 과정에 관한 방대한 양의 기작 정보가 존재하지만, 섬유증 과정을 억제하는 과정에서 염증 세포 및 시토킨의 역할 을 이해하는 데는 여전히 커다란 격차가 존재한다.
본원에 사용된 용어 "섬유증"은 섬유 조직 형성과 관련된 임의의 질환을 포함한다(이러한 섬유 형성은 바람직할 수도 있고 바람직하지 않을 수도 있다). 이러한 질환으로는 결합조직염, 섬유종의 형성(섬유종증), 섬유성장(폐 섬유성장을 포함함), 섬유탄력섬유증(심내막 섬유탄력섬유증을 포함함), 섬유근종의 형성, 섬유 강직증, 유섬유종의 형성, 섬유선종의 형성, 섬유점액증의 형성 및 섬유방광염(낭포성 섬유증을 포함함)을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
IL-13 수용체 복합체는 IL-4 수용체, 저친화성 결합 사슬 IL-13Rα1 및 고친화성 결합 사슬 IL-13Rα235,42-45 를 포함하는 적어도 3개의 특징적 성분으로 구성된다. 최근, 가용성 IL-13Rα2-Fc 융합 단백질을 제조하였으며, 이를 이용하여 시험관내35 및 생체내30,39-41 둘 다에서 IL-13을 성공적으로 중화하였다. 상기 융합 단백질은 높은 친화성으로 IL-13에 결합하나 IL-4를 중화하지는 않기 때문에, 상기 단백질은 IL-13의 특정 역할을 결정하기 위한 탁월한 도구를 제공한다. 본 연구에서, 본 발명자들은 야생형 IL-13 길항물질과 IL-4-결핍성 마우스를 이용하여 쥐과동물 주혈흡충증에서 폐 섬유증의 발생에 대한 IL-13 및 IL-4의 기여에 대해 면밀히 분석하였다. 이들 연구에서, 육아종 형성은 호산구 및 매스트 세포 보충에 집중하여 상세히 조사하였으며, 더 중요한 것은 난-유도된 섬유증의 발생은 생화학적, 조직학적 및 분자 기법을 이용하여 정량하였다는 점이다. 또한, 본 발명자들은 시험관내 장간막 림프 결절에서 및 생체내 육아종증성 간 둘다에서 Th1/Th2-유형 시토킨 반응의 조절에 대한 IL-4 및 IL-13의 기여에 대해 조사하였다. 이 연구 결과로부터 IL-13 및 IL-4는 주혈흡충증 병인에서 몇몇 잉여 활성을 나타내는 것으로 확인된 한편, 상기 두 시토킨에 대한 명확한 활성도 명확하게 규명하였다. 가장 중요하고 신규한 발견은 IL-4가 아니라 IL-13이 I형 및 III형 콜라겐 mRNA 생성 및 감염된 마우스에서 폐 섬유증의 생성을 유발하는 주요한 Th2-유형 시토킨이라는 점이다. 따라서, 본 발명자들의 발견으로부터 sIL-13Rα2-Fc와 같은 IL-13 억제제/길항물질이 섬유증, 예를 들어 만성 감염성 질병과 관련된 질병의 예방에 치료적 잇점을 보유할 수 있음을 확인하였다.
결과
주혈흡충증 병인에서 IL-4, IL-13 또는 이중 IL-4/IL-13 결핍의 비교 효과: sIL-13Rα2-Fc 치료는 에스. 만소니 감염된 마우스에서 폐 섬유증을 현저히 감소시킨다.
주혈흡충증의 병인에서 IL-4 및 IL-13의 조절 역할을 비교하기 위해, 본 발명자들은 C57BL/6WT 및 IL-4-결핍성 마우스를 25개의 에스. 만소니 유미유충을 이용하여 경피적으로 감염시켰다. 별개 군의 동물은 재료 및 방법에서 기술한 바와 같이 sIL-13Rα2-Fc 또는 대조용-Fc로 처리하였다. 처리는 알을 낳은후 5주째에 개시하였으며, 모든 동물은 감염후 8주째에 희생시켰으며, 몇몇 기생충학적 및 면역학적 변수에 대해 조사하였다. 표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 모두 4개의 마우스 군은 유사한 유충 버던(worn burden)을 보유하며, 유충 한 쌍당 생성된 조직 난은 상기 군 중에서 변화되지 않았다. 감염후 8주째에, 피크 조직 반응 시간45, WT 마우스는 IL-13 차단의 결과로 육아종 크기의 현저한 변화는 없었다(도 24). 흥미로운 것은, 대조용-Fc 처리한 IL-4-결핍성 마우스도 감소된 육아종성 반응을 나타내지 않았으며, 실제로 육아종은 이들 마우스에서 현저히 더 컸다. 이들 관찰 결과를 비교하면, IL-4-결핍성 마우스는, IL-13이 억제되는 경우, 육아종성 반응을 현저히 감소시켰다(도 2A, 우측). 실제로, 이중 IL-4-결핍성/sIL-13Rα2-Fc-처리된 마우스는 대조용 또는 sIL-13Rα2-Fc-처리된 WT 동물과 비교하여 평균적으로 육아종 부피를 40 내지 50% 감소시켰으며, 대조용-Fc-처리된 IL-4-결핍성 마우스와 비교시 75% 이상 감소시켰다.
또한, 병변의 세포 조성은 지엠사-염색된 간 절편에서 평가하였으며, 표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, IL-4-결핍성 마우스는 육아종-관련된 매스트 세포의 현저한 감소를 나타냈다. 대조적으로, IL-13 억제만으로는 매스트 세포 수의 현저한 변화는 없었으며, IL-13 차단은 이미 IL-4 결핍성 마우스의 매스트 세포의 매우 감소된 수에 대해 추가로 영향을 미치지 않았다. 육아종-관련된 호산구를 평가하는 경우, 다소 유사하지만, 여전히 확실한 발견이 관찰되었다(도 2B). 여기서, 호산구의 수는 WT 마우스에서 IL-13 차단에 의해 46%에서 64%로 증가하였으며, IL-4 결핍의 결과로 현저히 감소(28%)하였다. 조직 호산구증가증에서 IL-13과 IL-4의 명백하게 대조적인 역할에도 불구하고, 더욱 더 놀라운 연합된 억제 활성이 IL-4-결핍 마우스를 IL-13 억제제로 처리하는 경우 관찰되었다. 이들 마우스에서, 육아종 호산구의 평균적인 수는 10% 미만이다. 최종적으로, WT 대 IL-4-결핍 동물에서 실질 또는 난-관련된 간 괴사의 정도에 변화가 없는 반면, sIL-13Rα2-Fc-처리된 WT 및 IL-4-결핍성 군 둘 다에서는 전체적인 실질 괴사에 현저한 감소가 관찰되었다.
아마도 가장 중요한 것은 피크로시리우스 레스로 염색한 조직 절편에서 확인할 수 있는 바와 같이, sIL-13Rα2-Fc 처리만으로 WT 마우스에서 간 육아종의 콜라겐 함량을 현저히 감소시켰다는 것이다(표 3 및 도 3). 대조적으로, 감염된 IL-4-결핍성 마우스는 현미경 분석에 따르면 육아종 콜라겐 침착에 검출할 수 있는 변화는 없었다. 흥미롭게도, 이들 변수에서는 IL-13 및 IL-4의 연합된 또는 상승 효과는 나타나지 않았는데, 그 이유는 sIL-13Rα2-Fc-처리된-WT 및 -IL-4-결핍 마우스간에 현저한 차이는 없었기 때문이다(표 3). 도 3은, 유사한 유충수, 조직 난 버던 및 육아종 크기가 대조용 및 sIL-13Rα2-Fc 처리된 WT 마우스에서 확인된 한편, IL-13 차단은 간에서 콜라겐 침착에 대한 실질적인 억제 효과를 보유함을 나타내고 있다. 최종적으로, 폐 섬유증의 정도는 히드록시프롤린 수준을 평가함으로써 측정할 수 있는데(도 2C), 이는 상기한 조직학적 기법 보다는 더 정량적이다. 가용성 IL-13 길항물질 단독은 간 히드록시프롤린 수준을 현저히 감소시킨 반면, IL-4-결핍은 덜 현저히 감소시켰다. 이중 IL-4/IL-13 결핍은 sIL-13Rα2-Fc 처리된 WT 마우스에서 이미 관찰된 수준 미만으로 히드록시프롤린 수준을 감소시키지 않았다(도 2C). 이들 데이타로부터 IL-13이 쥐과동물 주혈흡충증에서 폐 섬유증을 발생시키는 우세한 Th2-관련된 시토킨임을 입증할 수 있었다.
Th2-유형 시토킨 생성은 IL-4-결핍 마우스에서 감소되나, IL-13 억제에 의해 영향받지 않는다.
IL-4는 CD4+ Th2 세포 발생을 일으키는 주 시토킨인 것은 널리 알려져 있지 만21,22, Th2-유형 반응의 생성 및 유지에서 IL-13의 역할은 논란의 대상이었으며, 숙주 유전물질 및 연구30,34,38의 감염성 질병 모델에 의해 영향받을 수 있다. 따라서, 간 병리학에서 sIL-13Rα2-Fc-유도된 변화가 Th1/Th2 시토킨 발란스에서의 변경에 의해 생성되는지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 감염된 마우스로부터 장간막 림프 결절 및 비장을 분리하였으며, 단일 세포 현탁액을 제조하였고, 시험관 내에서 기생충 항원을 이용하여 상기 배양물을 재자극하였다. 추가의 세포 배양물은 항-CD4+ mAb의 존재하에서 기생충 항원에 대해 노출시켜 시토킨 생성이 CD4+ T 세포 반응에 의존하는지 여부를 조사하였다. 세포 상청액은 IL-4, IL-13, IL-5, IL-10 및 IFN-γ에 대해 ELISA를 이용하여 분석하였다. 예상된 바와 같이15, WT 마우스로부터 제조된 장간막(도 5) 및 비장 배양물(데이타는 나타내지 않음)은 매우 편향된 Th2-형 시토킨 반응을 나타냈다.
이들은 SEA 자극에 대한 반응으로 높은 수준의 IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13을 생성하였으며, IFN-γ는 거의 생성하지 않거나 생성하지 않았다. 대조적으로, IL-4-결핍 마우스는 더 혼란한 Th1/Th2-유형 프로필을 나타냈다. 실제로, 현저한 SEA-특이성 IFN-γ반응은 IL-4-결핍성 마우스에서 검출되었는데, 이는 이전 연구 결과23,24와 일치하는 것이다. IL-13, IL-10 및 더 낮은 정도의 IL-5의 수준은 WT 마우스와 비교하는 경우 현저히 감소되었음에도 불구하고, 이들 시토킨의 수준은 이들 동물에서 검출되었다. 중요한 것은 낮지만 현저한 IL-4-의존성 IL-13 반응의 유 지는 IL-4의 부재하에서 유지되는 현저한 육아종성 반응을 설명할 것이다(도 2). 놀랍게도, 폐 섬유종에 대한 그의 현저한 억제 효과는 sIL-13Rα2-Fc는 WT 또는 IL-4-결핍성 마우스에서 Th1 또는 Th2-유형 시토킨 반응에 대한 현저한 효과는 없었다는 것이다. 또한, 주목해야 할 점은 모든 경우에서, 시토킨 생성은 CD4+ T 세포 반응에 매우 의존한다는 것인데, 그 이유는 항-CD4 mAb-처리된 ESA-자극된 배양물 어떤 배양물에서도 거의 또는 전혀 시토킨 발현이 검출되지 않았기 때문이다.
IL-4-결핍성 마우스 및 sIL-13Rα2-Fc-처리된 마우스의 육아종 간에서 Th1/Th2-유형 시토킨 mRNA 발현의 변화
유사한 패턴의 시토킨 발현이 생체내 육아종 생성 부위에서 관찰되는가 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 감염후 8주된 여러가지 군의 마우스로부터 간 mRNA를 분리하고, 정량적 RT-PCR을 수행하였다. 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 감염된 WT 마우스는 강한 Th2-유형의 시토킨 mRNA 프로필을 나타냈는데, 이로부터 IL-4, IL-13, IL-5 및 IL-10 mRNA의 현저한 증가를 확인할 수 있었다. 또한, WT 마우스는 IFN-γmRNA의 발현에서 중간 정도의 발현을 나타냈는데, 이는 이전의 관찰19과 일치하는 것이다. 이들 발견과는 대조적으로, IL-13 및 IL-5 mRNA 수준은 IL-4-결핍 마우스에서 더욱 낮아진 반면, IL-10 및 TNF-α mRNA는 현저히 증가하였으며, IFN-γ mRNA 발현은 변화되지 않았다. 다시, 장간막 림프 결절 및 비장세포 배양물로부터 얻은 시험관내 결과와 유사하게, IL-13 차단은 WT 마우스 또는 IL-4-결핍성 마우스에서 시토킨 mRNA 발현 패턴에 대한 현저한 영향은 없었다. 그러나, 섬유증에서 감소를 설명할 수 있을것 같지 않음에도 불구하고 sIL-13Rα2-Fc로 처리한 IL-4-결핍성 마우스에서 IL-10 mRNA 수준의 중간 정도의 증가가 관찰되었는데, 그 이유는 IL-10의 고도의 발산성 수준이 sIL-13Rα2-Fc-처리된 WT 대 IL-4-결핍성 마우스에서 검출되지만, 섬유증에서 유사한 감소가 관찰되었기 때문이다. 또한, TGF-β1 및 TGF-β2 mRNA 발현은 육아종성 조직에서 조사되었으나, 감염된 IL-4-결핍성 마우스 또는 sIL-13Rα2-Fc로 처리한 동물에서 현저한 변화는 검출되지 않았다(데이타는 도시하지 않음).
콜라겐 I 및 콜라겐 III mRNA 수준은 sIL-13Rα2-Fc 처리된 마우스의 간에서 감소하였으나, IL-4-결핍에 의해서는 영향받지 않는다.
상기한 바와 같은 시험관내 및 생체내 시토킨 연구에서 시사하는 것은 sIL-13Rα2-Fc의 항-섬유증 효과가 Th1 또는 Th2 유형 시토킨 발현의 변화에 의해서는 설명되지 않는다는 것이다. 따라서, 후속 실험에서, 본 발명자들은 콜라겐 I(Col I) 및 콜라겐 III(Col III) mRNA 발현 패턴을 조사하여 sIL-13Rα2-Fc-유도된 섬유증의 감소가 이들 두 중요한 콜라겐 생성 유전자의 발현의 변화를 수반하는가 여부를 결정하였다19. 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, IL-13 차단은 WT 마우스 및 IL-4-결핍성 마우스 둘 다에서 Col I 및 Col III mRNA 발현을 현저히 감소시켰다. IL-4-결핍성 마우스에서 Col I 및 Col III mRNA의 감염 유도된 수준의 변화는 없었으며, sIL-13Rα2-Fc-처리된 WT 마우스와 비교하는 경우, 유사하게 처리된 IL-4-결핍성 마우스에서 추가의 감소는 없었다.
IL-13은 마우스 3T3 섬유아세포에서 콜라겐 생성을 촉진한다.
생체내에서 IL-13 차단이 감염된 WT 마우스 및 IL-4-결핍성 마우스의 간에서 Col I 및 Col III mRNA 발현을 현저히 감소시키는 것을 확인한 본 발명자들은 IL-13이 섬유아세포에서 콜라겐 합성을 직접적으로 촉진하는지 여부를 확인하고자 하였다. 이 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 웨스턴 블로팅에 의해 쥐과동물 3T3 섬유아세포에서 I 형 콜라겐의 유도를 조사하였다. 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, IL-13은 자극후 48 시간만에 콜라겐 합성을 유도하였다. 최소 I형 콜라겐은 자극되지 않은 세포(도 7의 1 레인) 또는 매우 이른 시점의 시토킨-활성화된 배양물(데이타는 나타내지 않음)에서 검출되었다. 또는, IL-4는 I형 콜라겐 합성을 유도하였으며(2 레인), 고수준의 분비된 콜라겐은 시토킨 활성화된 배양물(둘다)로부터 얻은 상청액에서 용이하게 검출할 수 있었다(데이타는 나타내지 않음). 상기 반응의 특이성은 정제된 I형 콜라겐(5 레인)을 이용하여 확인하였으며, 박테리아 콜라게나제 처리를 통해 항체가 콜라겐에 특이적임을 확인하였다(데이타는 나타내지 않음).
논의
CD4+Th2-유형 시토킨 패턴은 에스. 만소니로 감염된 마우스에서 면역 반응을 지배하였다12,13. 그러나, 이전에 수행된 IL-4-결핍성 마우스를 이용한 IL-4 결손 연구 및 실험은 주혈흡충증의 병인에서 이 시토킨의 필수불가결한 역할을 밝혀내지 못했다15,23,24. 실제로, 몇몇 연구에서 섬유증의 부분적인 감소가 관찰되었지만15, 난-유도된 육아종 형성은 IL-4의 완전한 부재하에서 진행되었다23,24. 이들 관찰과는 대조적으로, 육아종 형성 및 폐 섬유증의 발생은 몇몇 Th2-관련된 시토킨의 생성에 주요한 결손을 나타내는46 Stat6-결핍성 마우스에서 현저하게 억제되었다46. IL-4 및 IL-13 둘 다는 Stat6을 통해 신호전달하며, 따라서 감염된 IL-4-결핍성 마우스 및 Stat6-결핍성 마우스 사이에서 관찰된 병리학의 명백한 차이는 IL-13에 의해 설명될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 질병의 진행에서 IL-4 및 IL-13의 구별되는 기여는 Stat6 또는 IL-4-결핍성 마우스 연구만으로는 확인할 수 없었다. 이 연구에서, 본 발명자들은 감염된 WT 마우스 및 IL-4-결핍성 마우스에서 IL-13의 강력한 억제제를 사용하였는데, 이로써 IL-13 및 IL-4가 충분할 뿐만 아니라 주혈흡충증의 병인에서 독특한 역할을 수행함을 확인할 수 있었다.
몇몇 연구를 통해 밝혀진 바와 같이, Th2-유형 시토킨 반응은 생체내에서 IL-4 또는 IL-4 수용체의 부재하에서 발생할 수 있었는데26,39, 이는 본 발명자들의 관찰과 일치하였으며, 그 이유는 감소되었으나 현저한 IL-13, IL-10 및 IL-5 발현은 감염된 IL-4-결핍성 마우스의 장간막 림프 결절(도 4) 및 간(도 5)에서 검출되었기 때문이다. 또한, 이들의 생성은 CD4+T 세포 반응에 매우 의존하였는데(도 4), 이는 추가로 통상적인 Th2-유형의 반응이 확립되었음을 시사하는 것이다. 이들 발견은 최대 IL-13 발현이 IL-4에 의존성인 한편, IL-13의 계속된 생성이 IL-4의 부재하에서 현저한 육아종성 반응의 유지를 설명할 수 있음을 나타낸다23-25. 실제로, IL-13만으로의 차단은 WT 마우스에서 육아종 크기에 영향을 미치지 않은 한편, 나머지 IL-4-결핍성 마우스을 억제하는 것은 육아종 부피의 매우 현저한 감소로 귀착되었다(도 2A). 이들 발견으로부터 확인할 수 있는 것은 IL-4 및 IL-3 둘다 육아종 발생을 매개하는데 충분하며, IL-4-결핍성 마우스에서 육아종의 생성 대 Stat6-결핍성 마우스에서 육아종의 거의 완전한 결핍을 명백하게 설명한다는 것이다. 또한, 이들은 폐 난 육아종 모델에서 최근의 발견을 지지한다30. 육아종은 난에 의해 방출된 잠재적으로 치명적인 간독소를 차단함으로써 중요한 숙주-보호성 역할을 수행하기 때문에, 숙주는 바람직한 숙주-기생충 관계를 보장하기 위하여 육아종 형성을 위한 여분의 기작을 진화시킬 수 있다.
이들 관찰은 IL-4 및 IL-13이 육아종 형성에 활동적으로 참여하는 한편, 매스트 세포 보충, 조직 호산구증가증 및 가장 중요한 것은 간 섬유증의 생성에서 양 시토킨의 독특한 역할이 본 연구에 의해 밝혀졌다. 감염된 마우스로부터 얻은 간 절편의 조직학적 조사 결과, IL-13은 매스트 세포(표 3) 또는 호산구(도 2B) 분화 및 보충에 필요하지 않음을 확인하였는데, 그 이유는 sIL-13Rα2-Fc-처리된 WT 마우스의 육아종은 상기 세포 유형 어느 것에서도 감소되지 않았기 때문이다. 실제로, 호산구 수는 IL-13-억제된 WT 마우스의 병변에서 현저하게 증가되었는데(도 2B), 이는 IL-13이 이 효과를 부분적으로 길항작용함을 의미하는 것이다. 대조적으로, 매스트 세포는 IL-4-결핍성 마우스내의 병변에 거의 완전히 존재하지 않으며, 호산구는 50% 이상 감소하였다. 흥미로운 것은, IL-13은 IL-4-결핍성 마우스에서 감소되었으나 현저한 난-유도된 조직 호산구증가증을 부분적으로 지지하는 것으로 보인다는 것인데, 그 이유는 IL-4-결핍성 동물/sIL-13Rα2-Fc-처리된 동물에서 호산구가 10% 미만으로 감소되었기 때문이다. 그럼에도 불구하고, 이들 데이타는 IL-4가 호산구의 발생 및 육아종 내에서 매스트 세포 군집의 발생을 일으키는 우세한 시토킨임을 시사하고 있다.
아마도, 본 연구로부터 성취한 가장 중요한 효과는 간 섬유증이 sIL-13Rα2-Fc에 의해 차단될 수 있다는 점이다. 실제로, 현미경 기법(표 3), 생화학적 기법(도 2C) 및 분자 기법(도 6)은 모두 IL-4가 아닌 IL-13이 난-유도된 간 섬유증의 발생에서 중요한 역할을 수행한다는 것을 시사하고 있다. 이전 연구 결과 Th1/Th2 시토킨 발란스가 에스. 만소니 감염된 마우스에서 조직 섬유증의 정도에 현저한 효과를 미칠 수 있다는 것이다19. 그럼에도 불구하고, 본 연구는 sIL-13Rα2-Fc의 효과가 Th 세포 시토킨 반응의 회피를 통해 중재하지 않음을 시사하고 있다. IL-13을 차단하는 것은 시험관 내에서 장간막 림프 결절(도 4) 또는 비장 세포에 의한 IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-10 또는 IL-13의 생성에 현저한 영향을 미치지 않았으며, 또한 병변 형성 부위에서 생체내 시토킨 mRNA 발현의 변화는 없었다(도 5). 이들 관찰과는 대조적으로, IL-4-결핍성 마우스는 배액 림프 결절(도 4)에서 증가된 IFN-γ반응 및 상기 두 림프 결절(도 4) 및 간(도 5)에서 감소된 IL-5 및 IL-3 발현을 나타냈다. 따라서, 히드록시프롤린 분석에 의해 IL-4-결핍성 마우스에서 검출된 섬유증의 약간의 감소(도 2C)는 감소된 IL-13 생성에 기여할 수 있다. IL-4 생성이 IL-13 차단에 의해 영향받지 않으나, 섬유증은 이들 동물에서 최대로 감소된다는 사실은 IL-13에 의해 수행되는 역할의 중요성을 강조하는 것이다. 실제로, sIL-13Rα2-Fc- 처리된 IL-4-결핍성 마우스는 히드록시프롤린 수준에서 추가의 감소를 거의 나타내지 않았으며(도 2C), 유사하게 처리된 WT 마우스에서 관찰된 것에 비해 콜라겐 I 또는 III mRNA 발현에서 차이를 나타내지 않았다. 또한, WT 동물과 비교하는 경우, 대조용-Fc-처리된 IL-4-결핍성 마우스에서 콜라겐 I 또는 III mRNA 발현에서 변화가 없었는데, 이는 IL-4의 기여에 대한 강조를 약화시킨다. 게다가, 3T3 세포를 이용한 시험관내 연구는 최초로 섬유아세포에서 콜라겐 생성을 자극할 수 있는 IL-13의 능력을 입증하였으며(도 7), 따라서, 섬유증에 대한 IL-13의 효과는 더 직접적이며, Th1/Th2 시토킨 반응에서 조절과는 무관할 수 있다는 것을 입증하였다. 이러한 결론은 IL-13 수용체가 섬유아세포에서 발현되며32, IL-13이 인간 폐 섬유아세포에서 부착 분자 및 염증성 시토킨 발현을 증가시킴48을 확인한 최근의 연구를 통해 지지된다. 최종적으로, IL-13(도 7) 및 IL-449둘다는 섬유아세포에서 콜라겐 생성을 촉진시킬 수 있으며, 배양된 림프 결절 세포가 IL-4보다 거의 100배 이상의 IL-13을 생성한다는 사실(도 4)은 단지 이 과정에서 IL-13의 잠재적으로 중요한 기여를 강조하는 작용을 한다. 실제로, 폐 육아종 모델에서의 연구로부터 밝혀진 것은 IL-4 mRNA 발현이 병변 형성 부위에서 더 철저하게 조절되는 한편, IL-13 mRNA의 유도는 시간에 따라 더욱 더 억제된다는 것이다30. 그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 감염된 동물에서 IL-4 및 IL-13 mRNA 발현의 역학은 조사하지 않았으며, 그래서 본 본 발명자들은 유사한 패턴이 육아종성 간에서 유지되는가 여부에 대해서는 말할 수 없다.
또한, IL-13은 최근 장 네마토드에 대한 내성에 있어서 중요한 것으로 밝혀졌다27,37-39. IL-439 및 IL-13-결핍 마우스37,38에서의 연구는 IL-4와는 대조적으로 IL-13은 엔. 브라실리엔시스(N. brasiliensis) 및 티. 무리스(T. muris)의 배제에 필수적인 역할을 수행하는 것을 시사하고 있다. 표피 세포 및 장 생리학에서 IL-4 및 IL-13-유도된 변화가 가능한 표적으로 제시되고 있음에도 불구하고50,51, 유충 배제의 특정 기작은 아직 밝혀진바 없다. 또한, IL-13은 쥐과동물 천식 모델에서 중추적인 역할을 수행한다. 이들 연구에서, IL-13은 알러지성 천식의 발현을 위해 필요하고, 충분한 것으로 확인되었다40.41. 하부표피 섬유증 및 기도 평활근 비대증은 만성적인 심한 천식5의 통상적인 특징이며, 만성적인 폐 섬유증은 이 질병의 초기 및 후기 단계에서 각각 III형 콜라겐과 I형 콜라겐의 생성과 관련되어 있다. 따라서, 본 연구에서 확인된 IL-13과 섬유증의 관련은 몇몇 중요한 인간 질병의 병인학을 규명하며, 일반적으로 섬유증의 치료에 더 효과적인 방식을 제공한다.
본 발명자들의 이전 연구를 통해, 난 특이성 IL-12-유도된 Th1 기억 반응은 후속적으로 감염된 마우스19에서 간 섬유증을 효율적으로 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 병리학에서 감소는 Th1-유형 시토킨에 의해 지배되는 것에 대한 정상적인 Th2 반응에서 스위치에 의해 수행하였다. 본 연구를 통한 발견은 이 IL-12 기초한 백신화 프로토콜의 항-병리 활성이 IL-13의 억제에 의해 설명될 수 있음을 시사하 고 있다. 흥미롭게도, 육아종 발생의 Th2-우세기중에 상이한 프로토콜을 이용하여 6 내지 8주에서 반복된 rIL-12 주입은 육아종 형성 및 섬유증을 차단하는 데는 완전히 비효과적이었다52. 관련 연구는 IL-12는 밝혀진 Th2-유형 반응53을 덜 조절할 수 있음을 시사하고 있는데, 이는 후속 연구52에서 병리를 조절하지 못한 이유를 설명할 것이다. 이들 발견과는 대조적으로, sIL-13Rα2-Fc는 감염의 후기 중에만 투여하는 경우에서 조차도 간 섬유증을 감소시키는데 매우 효과적이었다. 이들 발견은 IL-13 길항작용이 병원선 Th2-유형 면역 반응이 이미 밝혀진 상황에서 섬유증을 감소시키는 더욱 더 효과적인 치료법임을 시사하고 있다. 요약하면, 본 발명자들의 발견은 IL-13 억제제, 예를 들어 sIL-13Rα2-Fc가 만성 염증성 질병과 관련된 섬유증을 예방하는데 일반적인 치료적 잇점을 보유하며, 이는 주형흡충증의 병인에서 IL-13의 중요하며 비잉여성 역할을 입증하는 것이다.
방법
동물, 기생충 및 Ag 제조
6 내지 8주된 암컷 C57BL/6 및 IL-4-결핍성 마우스(C57BL/6 백그라운드, 10th 역교배)는 타코닉 팜스, 인크(뉴욕, 저만타운)에서 구입하였다. 모든 마우스는 멸균 필터가 상부에 장착된 우리내의 실험실 동물 보호 승인을 위한 국립보건원 미국 위원회가 승인한 동물 시설에서 사육하고, 멸균수로 유지시켰다. 쉬스토소마 만소니(NMRI)의 푸에르토 라이칸 균주의 유미유충은 감염된 바이옴팔라리아 글라브라타(Biomphalaria glabrata) 달팽이(미국 메릴랜드 록빌의 바이오메티칼 리서치 인 스티튜트)로부터 얻었다. 가용성 난 항원(SEA)는 이미 기술한 바와 같이15, 균질화된 난으로부터 정제하였다.
시약
가용성 IL-13 수용체 α2-Fc 융합 단백질(sIL-13Rα2-Fc)는 이미 기술한 바와 같이35 제조하였으며, 미국 메사추세츠 캠브리지에 소재하는 제네틱스 인스티튜트에 의해 제공되었다. 내독성 감염은 카페 코드 어소시에이츠(Cape Cod Associates) LAL 분석법(미국 메사추세츠 우즈 홀, 리물러스 아메보사이트 라이세이트)에 따라 측정하였다. B9 증식 분석에서 쥐과동물 IL-13 3 ng/ml를 중화할 수 있는 능력으로 측정된 바와 같이 시험관내 ID50은 약 10 ng/ml 였다. sIL-13Rα2-Fc에 대한 대조용으로 사용되는 인간 IgG(대조용-Fc)는 재조합 단백질 A-세파로즈 크로마토그래피에 의해 친화성 정제하였다35. 이미 기술한 바와 같이, 대조용-Fc는 감염된 마우스에서 병리학이나 시토킨 발현에 검출할만한 영향을 미치지않았다30.
감염 및 치료
마우스는 20 내지 25개의 유미유충을 함유하는 물 내에서 40분 동안 꼬리 피부의 경피 초회항원자극에 의해 감염시켰다. 동물은 난 생성 개시후(5주) 격일로 0.5 ml PBS내의 인간 대조용-Fc 또는 sIL-13Rα2-Fc를 복강내 주입하여 치료하였다. 생체내 사용을 위한 최적 농도(200 ㎍/마우스/일)은 역학 분석에 기초하여 선택하였으며, 감작되고/정맥내 난-주입한 마우스에서 투여량 응답 실험을 수행하였 다30. 마우스를 희생시키고, 혈청을 수집하였다. 모든 동물은 8주째에 나트륨 펜토바르비탈(18 mg/마우스 미국 미주리 세인트 루이스 소재의 시그마)를 복강내 주입하여 희생시켰으며, 시트레이트 첨가된 염수로 관류하여 유충 버던을 측정하였다15. 치료한 임의의 군에서 사망은 관찰되지 않았다.
조직병리학 및 섬유증 측정
육아종의 측정을 위해, 간의 약 1/2을 부인-홀란드 고정제(Bouin-Hollande fixative)로 고정하고, 이미 기술한 바와 같이15 처리하였다. 간 육아종의 크기는 라이트 지엠사 염료(미국 메릴랜드 클린톤에 소재하는 히스토패스 오즈 아메리카)로 염색한 조직학적 절편에서 측정하였다. 생존가능한 단일 난을 함유하는 각각의 육아종의 직경은 접안 마이크로미터로 측정하였으며, 각각의 육아종의 부피는 공 모양으로 가정하고 계산하였다. 가장 긴 직경과 그것에 수직하는 직경의 평균을 사용하였다. 호산구, 매스트 세포 및 기타 세포 유형의 백분율은 동일한 절편에서 평가하였다. 실질 괴사는 0 내지 4의 스케일로 측정하였는데, 이때 0은 최저 괴사를, 4는 가장 광범위한 괴사를 의미한다. 또한, 매스트 세포의 빈도는 0 내지 4의 범위를 이용하여 동일한 스케일로 할당하였다. 간 및 장에서 주혈흡충 난의 수와 히드록시프롤린으로 측정한 간의 콜라겐 함량은 이전에 기술한 바와 같이15 측정하였다. 또한, 섬유증은 피크로시리우스 레드로 염색한 절편을 이용하여 조직학적으로 평가하였다. 피크로시리우스 시약은 콜라겐을 특이적으로 염색하며, 절편을 편광하에서 보는 경우, 콜라겐이 침착된 밝은 부위가 밝아진다. 각 절편내의 모든 육아종은 스케일 1 내지 4에 기초하여 피크로시리우스(레드) "밀도"로 측정하였으며, "관련된 부위"에 대한 2차 측정은 동일한 스케일을 이용하여 측정하였다. 전체적인 섬유증 스코어는 각각의 육아종에 대해 밀도와 부위를 곱하여 측정하였다(즉, 16 스코어가 최대임). 마우스 한 마리당 30 육아종의 평균은 모든 분석에 포함되었다. 일관성에 대한 조절을 위해, 동일한 개체에 대해 모든 조직학적 특징을 평가하였으며, 실험적 구성에 대한 지식은 보유하지 않았다.
RNA의 분리 및 정제
각 동물의 간으로부터 취한 2 부분을 연합하고, RNA-STAT 60(Tel-테스트) 1 ml내에 위치시키고, 드라이 아이스에 냉동시키고, 사용시까지 -70℃로 유지시켰다. 조직은 조직 폴리트론(코네티컷 워터버리 소재의 옴니 인터내쇼날 인크.)을 이용하여 균질화하였으며, 총 RNA는 제조사의 추천에 따라 추출하였다. RNA는 DEPC-처리수내에 재현탁시켰으며, 분광학적으로 정량하였다.
시토킨 mRNA의 RT-PCR 검출
RT-PCR 과정을 이용하여 IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IFN-γ, 콜라겐 I, 콜라겐 III, TGFβ1, TGFβ2 및 HPRT(하이포잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제)에 대한 mRNA의 상대량을 측정하였다. cDNA는 기재된 바와 같이14 역전사후 RNA 1 ㎍을 얻었다. 모든 유전자에 대한 프라이머 및 프로브는 이미 공개되어 있다14,19,54. 각 시토킨에 대해 사용된 PCR 사이클은 다음과 같다: IL-4(33), IL-5(31), IFN-γ(29), 콜라겐 I(26), 콜라겐 III(22), TGFβ1(34), TGFβ2(34) 및 HPRT(23).
PCR 생성물의 분석 및 정량화
증폭된 DNA는 이미 기술한 바와 같이14 전기영동, 서던 블로팅 및 비방사능 시토킨 특이성 프로브와의 혼성화에 의해 분석하였다. PCR 생성물은 ECL 검출 시스템(아메르샴)을 이용하여 검출하였다. 화학발광성 신호는 플랫-베드 스캐너(마이크로텍 모델 600 ZS, 캘리포니아 토랜스)를 이용하여 정량하였다. PCR 생성물의 양은 개개의 샘플에서 시토킨-특이성 신호 밀도 대 HPRT-특이성 신호 밀도의 비를 비교함으로써 측정하였다. 개개의 샘플에 대한 임의 밀도 단위는 후속적으로 100을 곱한 것이다.
시험관내 배양
장간막 림프 결절(MLN) 세포 및 비장을 마우스로부터 추출하고, 단일 세포 현탁액을 제조하였다. ACK 용해 완충액(메릴랜드 록빌 소재의 바이오플루이즈, 인크.)으로 삼투 처리하여 적혈구를 용해시켰다. 세포는 37℃ 및 5% CO2 내에서 10% FCS, 2 mM 글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 25 mM HEPES, 1 mM 나트륨 피루베이트, 0.1 mM 비필수 아미노산 및 50 μM 2-ME로 보충된 RPMI 1640 배지 내에 위치시켰다. 세포는 24웰 평판에서 평판배양하고(3 x 106/ml, 1 ml), SEA(20 ㎍/ml)로 자극하고, 72 시간후에 상청액을 수집하여 IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 및 IFN-γ의 수준을 측정하였다. 또한, 추가의 SEA-자극된 배양물은 항-CD4 mAb(GK 1.5) 50 ㎍/ml로 처리하였다. 단지 항-CD4 mAb 만으로 처리된 배양물은 배지 대조용 배양물에서 관찰된 것(데이타는 나타내지 않음)과 비교시 시토킨 발현에서 변화를 나타내지 않았다. IL-5, IL-10 및 IFN-γ는 특이성 샌드위치 ELISA15를 이용하여 측정하였다. IL-13 수준은 쥐과동물 IL-13 ELISA 키트(미네소타, 미니아폴리스 소재의 R&D 시스템즈)를 이용하여 측정하였다. 시토킨 수준은 재조합 시토킨을 이용하여 그린 곡선으로부터 계산하였다. IL-4는 IL-4 민감성 세포주 CT.4S를이용하여 측정하였다. 이들 세포의 증식은 (3H)TdR 혼입에 의해 정량하였으며, 시토킨의 양은 재조합 IL-4의 공지된 양과 비교하여 결정하였다.
콜라겐 I의 웨스턴 블롯 검출
3T3 섬유아세포는 37℃ 및 5% CO2 내에서 10% FCS, 2 mM 글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 25 mM HEPES, 1 mM 나트륨 피루베이트, 0.1 mM 비필수 아미노산 및 50 μM 2-ME로 보충된 RPMI 1640 배지 내에서 배양하였다. 융합성 세포는 24웰 평판에서 평판배양하고(500,000 세포/ml), IL-4(1000 U/ml) 또는 rIL-13(미네소타 미니아폴리스 R&D 시스템즈)(20 ng/ml)를 이용하여 6 시간, 24 시간 및 48 시간 동안 자극하였다. 배양 상청액을 수집하여 분비된 콜라겐 I을 분석하였다. 세포는 인산염 완충 염수로 1회 세척하고, SDS-PAGE 샘플 완충제로 용해시켰다. 세포 용해물 및 배양 상청액은 6% 트리스-글리신 젤(캘리포니아 샌디에고 노벨 익스페리멘탈 테크놀러지) 내에서 환원 조건을 이용하여 전기영동에 의한 분리를 수행하고, 니트로셀룰로즈 막(뉴햄프셔 킨 소재의 쉴레이쳐 및 스쿠엘)에 이전하였다. 블롯은 토끼 IgG 항-마우스 I형 콜라겐(메인 케넨벙크 소재의 바이오디 자인 인터내쇼날)르로 탐침하고, 퍼옥시다제 표지된 항-토끼 IgG(뉴저지, 피스카타웨이 소재의 아메르샴 파마시아 바이오테크, 인크.)는 제2 Ab로 사용하였다. 밴드는 웨스턴 블롯 화학발광 시약(메사추세츠 보스톤 소재의 NEN 라이프 사이언스 프로덕츠)을 이용하여 가시화하였다. 콜라겐 밴드의 실체를 확인하기 위해, 세포 용해물은 1 mM CaCl2 및 1% FCS로 보충된 PBS 내의 콜라게나제(인디아나 인디아나폴리스 소재의 뵈링거 만하임) 0.5 mg/ml를 이용하여 37℃에서 1 시간 동안 처리하였다. 또한, 정제된 래트 콜라게나제 I 제제는 대조용으로 사용하였다.
통계
주혈흡충 유충 및 난의 수, 시토킨 mRNA의 변화 및 분비된 시토킨 단백질에 대한 수치는 스튜던트 2-테일드(two tailed) t 테스트를 이용하여 비교하였다. 간 섬유증은 공변량으로서 총 간 난의 로그값 및 난 하나당 히드록시프롤린의 로그값을 이용하는 공분산 분석에 의해 비교하였다. p<0.05는 의미가 있는 것으로 고려하였다.
참고문헌
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본원에 인용된 모든 특허 및 문헌은 전적으로 참고 인용된 것이다.
[서열 목록]
(1) 일반 정보
(i) 출원인: 윈, 토마스; 치아라몽트, 모니카; 콜린스, 마리; 도날드슨 데브라; 피츠, 로리; 네벤 탐린; 위터스, 매튜; 우드 클리브.
(ii) 발명의 명칭: IL-13 및 IL-13 수용체 사슬의 길항작용에 의한 섬유증의 치료방법
(iii) 서열의 수: 9
(iv) 통신선
(A) 수신인: 제네틱스 인스티튜트, 인코포레이티드
(B) 거리: 캠브리지파크 드라이브 87
(C) 도시: 캠브리지
(D) 주 : 메사추세츠
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호: 02140
(v) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 운영 체계: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: 페이턴트인 릴리즈 #1.0, 버젼 #1.25
(vi) 현 출원 자료
(A) 출원 번호:
(B) 출원일:
(C) 분류:
(viii) 대리인 정보
(A) 성명: 브라운, 스캇 에이.
(B) 등록 번호: 32,724
(C) 참조 번호: GI5268A2
(iX) 통신 정보
(A) 전화: (617) 498-8224
(B) 팩스: (617) 876-5851
(2) 서열 번호 1에 대한 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이: 1525 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 이본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(ix) 특징:
(A) 명칭/기호: CDS
(B) 위치: 256..1404
(xi) 서열: 서열 번호 1
Figure 112001027827742-pct00008
Figure 112001027827742-pct00009
(2) 서열 번호 2에 대한 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이: 383 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열: 서열 번호 2
Figure 112001027827742-pct00010
Figure 112001027827742-pct00011
(2) 서열 번호 3에 대한 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이: 1369 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 이본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA
(iii) 가설: 없슴
(ix) 특징:
(A) 명칭/기호: CDS
(B) 위치: 103..1245
(xi) 서열: 서열 번호 3
Figure 112001027827742-pct00012
Figure 112001027827742-pct00013
Figure 112001027827742-pct00014
(2) 서열 번호 4에 대한 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이: 380 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열: 서열 번호 4
Figure 112001027827742-pct00015
Figure 112001027827742-pct00016
(2) 서열 번호 5에 대한 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이: 17 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 올리고뉴클레오티드
(xi) 서열: 서열 번호 5
Figure 112001027827742-pct00017
(2) 서열 번호 6에 대한 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 올리고뉴클레오티드
(xi) 서열: 서열 번호 6
Figure 112001027827742-pct00018
(2) 서열 번호 7에 대한 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 올리고뉴클레오티드
(xi) 서열: 서열 번호 7
Figure 112001027827742-pct00019
(2) 서열 번호 8에 대한 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 올리고뉴클레오티드
(xi) 서열: 서열 번호 8
Figure 112001027827742-pct00020
(2) 서열 번호 9에 대한 정보
(i) 서열 특성
(A) 길이: 22 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 올리고뉴클레오티드
(xi) 서열: 서열 번호 9
Figure 112001027827742-pct00021
SEQUENCE LISTING <110> Wynn, Thomas Chiaramonte, Monica Collins, Mary Donaldson, Debra Fitz, Lora Neben, Tamlyn Whitters, Matthew Wood, Clive <120> TITLE OF INVENTION: TREATMENT OF FIBROSIS BY ANTAGONISM OF IL-13 AND IL-13 RECEPTOR CHAINS <130> 22058-519-034 <140> 2001-7013820 <141> 2000-04-28 <150> PCT/US00/11612 <151> 2000-04-28 <150> 09/301,808 <151> 1999-04-28 <150> 08/841,751 <151> 1997-04-30 <150> 08/609,572 <151> 1996-03-01 <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1525 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (256)..(1404) <400> 1 gaattcggca cgagggagag gaggagggaa agatagaaag agagagagaa agattgcttg 60 ctacccctga acagtgacct ctctcaagac agtgctttgc tcttcacgta taaggaagga 120 aaacagtaga gattcaattt agtgtctaat gtggaaagga ggacaaagag gtcttgtgat 180 aactgcctgt gataatacat ttcttgagaa accatattat tgagtagagc tttcagcaca 240 ctaaatcctg gagaa atg gct ttt gtg cat atc aga tgc ttg tgt ttc att 291 Met Ala Phe Val His Ile Arg Cys Leu Cys Phe Ile 1 5 10 ctt ctt tgt aca ata act ggc tat tct ttg gag ata aaa gtt aat cct 339 Leu Leu Cys Thr Ile Thr Gly Tyr Ser Leu Glu Ile Lys Val Asn Pro 15 20 25 cct cag gat ttt gaa ata ttg gat cct gga tta ctt ggt tat ctc tat 387 Pro Gln Asp Phe Glu Ile Leu Asp Pro Gly Leu Leu Gly Tyr Leu Tyr 30 35 40 ttg caa tgg aaa cct cct gtg gtt ata gaa aaa ttt aag ggc tgt aca 435 Leu Gln Trp Lys Pro Pro Val Val Ile Glu Lys Phe Lys Gly Cys Thr 45 50 55 60 cta gaa tat gag tta aaa tac cga aat gtt gat agc gac agc tgg aag 483 Leu Glu Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn Val Asp Ser Asp Ser Trp Lys 65 70 75 act ata att act agg aat cta att tac aag gat ggg ttt gat ctt aat 531 Thr Ile Ile Thr Arg Asn Leu Ile Tyr Lys Asp Gly Phe Asp Leu Asn 80 85 90 aaa ggc att gaa gga aag ata cgt acg cat ttg tca gag cat tgt aca 579 Lys Gly Ile Glu Gly Lys Ile Arg Thr His Leu Ser Glu His Cys Thr 95 100 105 aat gga tca gaa gta caa agt cca tgg ata gaa gct tct tat ggg ata 627 Asn Gly Ser Glu Val Gln Ser Pro Trp Ile Glu Ala Ser Tyr Gly Ile 110 115 120 tca gat gaa gga agt ttg gaa act aaa att cag gac atg aag tgt ata 675 Ser Asp Glu Gly Ser Leu Glu Thr Lys Ile Gln Asp Met Lys Cys Ile 125 130 135 140 tat tat aac tgg cag tat ttg gtc tgc tct tgg aaa cct ggc aag aca 723 Tyr Tyr Asn Trp Gln Tyr Leu Val Cys Ser Trp Lys Pro Gly Lys Thr 145 150 155 gta tat tct gat acc aac tat acc atg ttt ttc tgg tat gag ggc ttg 771 Val Tyr Ser Asp Thr Asn Tyr Thr Met Phe Phe Trp Tyr Glu Gly Leu 160 165 170 gat cat gcc tta cag tgt gct gat tac ctc cag cat gat gaa aaa aat 819 Asp His Ala Leu Gln Cys Ala Asp Tyr Leu Gln His Asp Glu Lys Asn 175 180 185 gtt gga tgc aaa ctg tcc aac ttg gac tca tca gac tat aaa gat ttt 867 Val Gly Cys Lys Leu Ser Asn Leu Asp Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Phe 190 195 200 ttt atc tgt gtt aat gga tct tca aag ttg gaa ccc atc aga tcc agc 915 Phe Ile Cys Val Asn Gly Ser Ser Lys Leu Glu Pro Ile Arg Ser Ser 205 210 215 220 tat aca gtt ttt caa ctt caa aat ata gtt aaa cca ttg cca cca gaa 963 Tyr Thr Val Phe Gln Leu Gln Asn Ile Val Lys Pro Leu Pro Pro Glu 225 230 235 ttc ctt cat att agt gtg gag aat tcc att gat att aga atg aaa tgg 1011 Phe Leu His Ile Ser Val Glu Asn Ser Ile Asp Ile Arg Met Lys Trp 240 245 250 agc aca cct gga gga ccc att cca cca agg tgt tac act tat gaa att 1059 Ser Thr Pro Gly Gly Pro Ile Pro Pro Arg Cys Tyr Thr Tyr Glu Ile 255 260 265 gtg atc cga gaa gac gat att tcc tgg gag tct gcc aca gac aaa aac 1107 Val Ile Arg Glu Asp Asp Ile Ser Trp Glu Ser Ala Thr Asp Lys Asn 270 275 280 gat atg aag ttg aag agg aga gca aat gaa agt gaa gac cta tgc ttt 1155 Asp Met Lys Leu Lys Arg Arg Ala Asn Glu Ser Glu Asp Leu Cys Phe 285 290 295 300 ttt gta aga tgt aag gtc aat ata tat tgt gca gat gat gga att tgg 1203 Phe Val Arg Cys Lys Val Asn Ile Tyr Cys Ala Asp Asp Gly Ile Trp 305 310 315 agc gaa tgg agt gaa gag gaa tgt tgg gaa ggt tac aca ggg cca gac 1251 Ser Glu Trp Ser Glu Glu Glu Cys Trp Glu Gly Tyr Thr Gly Pro Asp 320 325 330 tca aag att att ttc ata gta cca gtt tgt ctt ttc ttt ata ttc ctt 1299 Ser Lys Ile Ile Phe Ile Val Pro Val Cys Leu Phe Phe Ile Phe Leu 335 340 345 ttg tta ctt ctt tgc ctt att gtg gag aag gaa gaa cct gaa ccc aca 1347 Leu Leu Leu Leu Cys Leu Ile Val Glu Lys Glu Glu Pro Glu Pro Thr 350 355 360 ttg agc ctc cat gtg gat ctg aac aaa gaa gtg tgt gct tat gaa gat 1395 Leu Ser Leu His Val Asp Leu Asn Lys Glu Val Cys Ala Tyr Glu Asp 365 370 375 380 acc ctc tgt taaaccacca atttcttgac atagagccag ccagcaggag 1444 Thr Leu Cys tcatattaaa ctcaatttct cttaaaattt cgaatacatc ttcttgaaaa tccaaaaaaa 1504 aaaaaaaaaa aaaaactcga g 1525 <210> 2 <211> 383 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Ala Phe Val His Ile Arg Cys Leu Cys Phe Ile Leu Leu Cys Thr 1 5 10 15 Ile Thr Gly Tyr Ser Leu Glu Ile Lys Val Asn Pro Pro Gln Asp Phe 20 25 30 Glu Ile Leu Asp Pro Gly Leu Leu Gly Tyr Leu Tyr Leu Gln Trp Lys 35 40 45 Pro Pro Val Val Ile Glu Lys Phe Lys Gly Cys Thr Leu Glu Tyr Glu 50 55 60 Leu Lys Tyr Arg Asn Val Asp Ser Asp Ser Trp Lys Thr Ile Ile Thr 65 70 75 80 Arg Asn Leu Ile Tyr Lys Asp Gly Phe Asp Leu Asn Lys Gly Ile Glu 85 90 95 Gly Lys Ile Arg Thr His Leu Ser Glu His Cys Thr Asn Gly Ser Glu 100 105 110 Val Gln Ser Pro Trp Ile Glu Ala Ser Tyr Gly Ile Ser Asp Glu Gly 115 120 125 Ser Leu Glu Thr Lys Ile Gln Asp Met Lys Cys Ile Tyr Tyr Asn Trp 130 135 140 Gln Tyr Leu Val Cys Ser Trp Lys Pro Gly Lys Thr Val Tyr Ser Asp 145 150 155 160 Thr Asn Tyr Thr Met Phe Phe Trp Tyr Glu Gly Leu Asp His Ala Leu 165 170 175 Gln Cys Ala Asp Tyr Leu Gln His Asp Glu Lys Asn Val Gly Cys Lys 180 185 190 Leu Ser Asn Leu Asp Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Phe Phe Ile Cys Val 195 200 205 Asn Gly Ser Ser Lys Leu Glu Pro Ile Arg Ser Ser Tyr Thr Val Phe 210 215 220 Gln Leu Gln Asn Ile Val Lys Pro Leu Pro Pro Glu Phe Leu His Ile 225 230 235 240 Ser Val Glu Asn Ser Ile Asp Ile Arg Met Lys Trp Ser Thr Pro Gly 245 250 255 Gly Pro Ile Pro Pro Arg Cys Tyr Thr Tyr Glu Ile Val Ile Arg Glu 260 265 270 Asp Asp Ile Ser Trp Glu Ser Ala Thr Asp Lys Asn Asp Met Lys Leu 275 280 285 Lys Arg Arg Ala Asn Glu Ser Glu Asp Leu Cys Phe Phe Val Arg Cys 290 295 300 Lys Val Asn Ile Tyr Cys Ala Asp Asp Gly Ile Trp Ser Glu Trp Ser 305 310 315 320 Glu Glu Glu Cys Trp Glu Gly Tyr Thr Gly Pro Asp Ser Lys Ile Ile 325 330 335 Phe Ile Val Pro Val Cys Leu Phe Phe Ile Phe Leu Leu Leu Leu Leu 340 345 350 Cys Leu Ile Val Glu Lys Glu Glu Pro Glu Pro Thr Leu Ser Leu His 355 360 365 Val Asp Leu Asn Lys Glu Val Cys Ala Tyr Glu Asp Thr Leu Cys 370 375 380 <210> 3 <211> 1369 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (103)..(1245) <400> 3 ggatccgcgc ggatgaaggc tatttgaagt cgccataacc tggtcagaag tgtgcctgtc 60 ggcggggaga gaggcaatat caaggtttta aatctcggag aa atg gct ttc gtt 114 Met Ala Phe Val 1 tgc ttg gct atc gga tgc tta tat acc ttt ctg ata agc aca aca ttt 162 Cys Leu Ala Ile Gly Cys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile Ser Thr Thr Phe 5 10 15 20 ggc tgt act tca tct tca gac acc gag ata aaa gtt aac cct cct cag 210 Gly Cys Thr Ser Ser Ser Asp Thr Glu Ile Lys Val Asn Pro Pro Gln 25 30 35 gat ttt gag ata gtg gat ccc gga tac tta ggt tat ctc tat ttg caa 258 Asp Phe Glu Ile Val Asp Pro Gly Tyr Leu Gly Tyr Leu Tyr Leu Gln 40 45 50 tgg caa ccc cca ctg tct ctg gat cat ttt aag gaa tgc aca gtg gaa 306 Trp Gln Pro Pro Leu Ser Leu Asp His Phe Lys Glu Cys Thr Val Glu 55 60 65 tat gaa cta aaa tac cga aac att ggt agt gaa aca tgg aag acc atc 354 Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Glu Thr Trp Lys Thr Ile 70 75 80 att act aag aat cta cat tac aaa gat ggg ttt gat ctt aac aag ggc 402 Ile Thr Lys Asn Leu His Tyr Lys Asp Gly Phe Asp Leu Asn Lys Gly 85 90 95 100 att gaa gcg aag ata cac acg ctt tta cca tgg caa tgc aca aat gga 450 Ile Glu Ala Lys Ile His Thr Leu Leu Pro Trp Gln Cys Thr Asn Gly 105 110 115 tca gaa gtt caa agt tcc tgg gca gaa act act tat tgg ata tca cca 498 Ser Glu Val Gln Ser Ser Trp Ala Glu Thr Thr Tyr Trp Ile Ser Pro 120 125 130 caa gga att cca gaa act aaa gtt cag gat atg gat tgc gta tat tac 546 Gln Gly Ile Pro Glu Thr Lys Val Gln Asp Met Asp Cys Val Tyr Tyr 135 140 145 aat tgg caa tat tta ctc tgt tct tgg aaa cct ggc ata ggt gta ctt 594 Asn Trp Gln Tyr Leu Leu Cys Ser Trp Lys Pro Gly Ile Gly Val Leu 150 155 160 ctt gat acc aat tac aac ttg ttt tac tgg tat gag ggc ttg gat cat 642 Leu Asp Thr Asn Tyr Asn Leu Phe Tyr Trp Tyr Glu Gly Leu Asp His 165 170 175 180 gca tta cag tgt gtt gat tac atc aag gct gat gga caa aat ata gga 690 Ala Leu Gln Cys Val Asp Tyr Ile Lys Ala Asp Gly Gln Asn Ile Gly 185 190 195 tgc aga ttt ccc tat ttg gag gca tca gac tat aaa gat ttc tat att 738 Cys Arg Phe Pro Tyr Leu Glu Ala Ser Asp Tyr Lys Asp Phe Tyr Ile 200 205 210 tgt gtt aat gga tca tca gag aac aag cct atc aga tcc agt tat ttc 786 Cys Val Asn Gly Ser Ser Glu Asn Lys Pro Ile Arg Ser Ser Tyr Phe 215 220 225 act ttt cag ctt caa aat ata gtt aaa cct ttg ccg cca gtc tat ctt 834 Thr Phe Gln Leu Gln Asn Ile Val Lys Pro Leu Pro Pro Val Tyr Leu 230 235 240 act ttt act cgg gag agt tca tgt gaa att aag ctg aaa tgg agc ata 882 Thr Phe Thr Arg Glu Ser Ser Cys Glu Ile Lys Leu Lys Trp Ser Ile 245 250 255 260 cct ttg gga cct att cca gca agg tgt ttt gat tat gaa att gag atc 930 Pro Leu Gly Pro Ile Pro Ala Arg Cys Phe Asp Tyr Glu Ile Glu Ile 265 270 275 aga gaa gat gat act acc ttg gtg act gct aca gtt gaa aat gaa aca 978 Arg Glu Asp Asp Thr Thr Leu Val Thr Ala Thr Val Glu Asn Glu Thr 280 285 290 tac acc ttg aaa aca aca aat gaa acc cga caa tta tgc ttt gta gta 1026 Tyr Thr Leu Lys Thr Thr Asn Glu Thr Arg Gln Leu Cys Phe Val Val 295 300 305 aga agc aaa gtg aat att tat tgc tca gat gac gga att tgg agt gag 1074 Arg Ser Lys Val Asn Ile Tyr Cys Ser Asp Asp Gly Ile Trp Ser Glu 310 315 320 tgg agt gat aaa caa tgc tgg gaa ggt gaa gac cta tcg aag aaa act 1122 Trp Ser Asp Lys Gln Cys Trp Glu Gly Glu Asp Leu Ser Lys Lys Thr 325 330 335 340 ttg cta cgt ttc tgg cta cca ttt ggt ttc atc tta ata tta gtt ata 1170 Leu Leu Arg Phe Trp Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu Ile Leu Val Ile 345 350 355 ttt gta acc ggt ctg ctt ttg cgt aag cca aac acc tac cca aaa atg 1218 Phe Val Thr Gly Leu Leu Leu Arg Lys Pro Asn Thr Tyr Pro Lys Met 360 365 370 att cca gaa ttt ttc tgt gat aca tga agactttcca tatcaagaga 1265 Ile Pro Glu Phe Phe Cys Asp Thr 375 380 catggtattg actcaacagt ttccagtcat ggccaaatgt tcaatatgag tctcaataaa 1325 ctgaattttt cttgcgaaaa aaaaaaaaaa aaatccgcgg atcc 1369 <210> 4 <211> 380 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Phe Val Cys Leu Ala Ile Gly Cys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile 1 5 10 15 Ser Thr Thr Phe Gly Cys Thr Ser Ser Ser Asp Thr Glu Ile Lys Val 20 25 30 Asn Pro Pro Gln Asp Phe Glu Ile Val Asp Pro Gly Tyr Leu Gly Tyr 35 40 45 Leu Tyr Leu Gln Trp Gln Pro Pro Leu Ser Leu Asp His Phe Lys Glu 50 55 60 Cys Thr Val Glu Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Glu Thr 65 70 75 80 Trp Lys Thr Ile Ile Thr Lys Asn Leu His Tyr Lys Asp Gly Phe Asp 85 90 95 Leu Asn Lys Gly Ile Glu Ala Lys Ile His Thr Leu Leu Pro Trp Gln 100 105 110 Cys Thr Asn Gly Ser Glu Val Gln Ser Ser Trp Ala Glu Thr Thr Tyr 115 120 125 Trp Ile Ser Pro Gln Gly Ile Pro Glu Thr Lys Val Gln Asp Met Asp 130 135 140 Cys Val Tyr Tyr Asn Trp Gln Tyr Leu Leu Cys Ser Trp Lys Pro Gly 145 150 155 160 Ile Gly Val Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn Leu Phe Tyr Trp Tyr Glu 165 170 175 Gly Leu Asp His Ala Leu Gln Cys Val Asp Tyr Ile Lys Ala Asp Gly 180 185 190 Gln Asn Ile Gly Cys Arg Phe Pro Tyr Leu Glu Ala Ser Asp Tyr Lys 195 200 205 Asp Phe Tyr Ile Cys Val Asn Gly Ser Ser Glu Asn Lys Pro Ile Arg 210 215 220 Ser Ser Tyr Phe Thr Phe Gln Leu Gln Asn Ile Val Lys Pro Leu Pro 225 230 235 240 Pro Val Tyr Leu Thr Phe Thr Arg Glu Ser Ser Cys Glu Ile Lys Leu 245 250 255 Lys Trp Ser Ile Pro Leu Gly Pro Ile Pro Ala Arg Cys Phe Asp Tyr 260 265 270 Glu Ile Glu Ile Arg Glu Asp Asp Thr Thr Leu Val Thr Ala Thr Val 275 280 285 Glu Asn Glu Thr Tyr Thr Leu Lys Thr Thr Asn Glu Thr Arg Gln Leu 290 295 300 Cys Phe Val Val Arg Ser Lys Val Asn Ile Tyr Cys Ser Asp Asp Gly 305 310 315 320 Ile Trp Ser Glu Trp Ser Asp Lys Gln Cys Trp Glu Gly Glu Asp Leu 325 330 335 Ser Lys Lys Thr Leu Leu Arg Phe Trp Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu 340 345 350 Ile Leu Val Ile Phe Val Thr Gly Leu Leu Leu Arg Lys Pro Asn Thr 355 360 365 Tyr Pro Lys Met Ile Pro Glu Phe Phe Cys Asp Thr 370 375 380 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 5 ksrctccabk crctcca 17 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 6 atagttaaac cattgccacc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 7 ctccattcgc tccaaattcc 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 8 agtctatctt acttttactc g 21 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 9 catctgagca ataaatattc ac 22

Claims (72)

  1. IL-13과 결합하며, 또 서열 번호 4의 아미노산 서열 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열 중 26번 내지 341번 아미노산을 포함하는 단백질과 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조직 섬유증이 간, 피부 표피, 피부 내피, 근육, 건, 연골, 심장 조직, 췌장 조직, 폐 조직, 자궁 조직, 신경 조직, 고환, 난소, 부신, 동맥, 정맥, 결장, 소장, 담즙관 및 장으로 구성되는 군으로부터 선택되는 조직에 영향을 미치는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 조직이 간인 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 섬유증이 주혈흡충(schistosoma)의 감염에 기인하는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 섬유증이 상처 치료에 기인한 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  6. IL-13과 결합하며, 또 서열 번호 4의 아미노산 서열 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열 중 26번 내지 341번 아미노산을 포함하는 단백질과 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 조직 섬유증이 간, 피부 표피, 피부 내피, 근육, 건, 연골, 심장 조직, 췌장 조직, 폐 조직, 자궁 조직, 신경 조직, 고환, 난소, 부신, 동맥, 정맥, 결장, 소장, 담즙관 및 장으로 구성되는 군으로부터 선택되는 조직에 영향을 미치는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 조직이 간인 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 섬유증이 주혈흡충의 감염에 기인하는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  10. 제6항에 있어서, 상기 섬유증이 상처 치료에 기인하는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 상처가 외과적 절개인 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  12. 제5항에 있어서, 상기 상처가 외과적 절개인 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  13. (a) 서열 번호 4의 아미노산 서열 중 26번 내지 341번 아미노산의 IL-13 결합 가용 형태 아미노산을 포함하는 IL-13 길항물질 폴리펩티드 및 (b) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제13항에 있어서, 상기 조직 섬유증이 간, 피부 표피, 피부 내피, 근육, 건, 연골, 심장 조직, 췌장 조직, 폐 조직, 자궁 조직, 신경 조직, 고환, 난소, 부신, 동맥, 정맥, 결장, 소장, 담즙관 및 장으로 구성되는 군으로부터 선택되는 조직에 영향을 미치는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 조직이 간인 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 섬유증이 주혈흡충의 감염에 기인하는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  19. 제13항에 있어서, 상기 섬유증이 상처 치료에 기인하는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 상처가 외과적 절개인 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  21. (a) 서열 번호 4의 아미노산 서열 중 26번 내지 341번 아미노산의 IL-13 결합 가용 형태 아미노산을 포함하는 IL-13 길항물질 폴리펩티드 및 (b) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 제21항에 있어서, 상기 조직 섬유증이 간, 피부 표피, 피부 내피, 근육, 건, 연골, 심장 조직, 췌장 조직, 폐 조직, 자궁 조직, 신경 조직, 고환, 난소, 부신, 동맥, 정맥, 결장, 소장, 담즙관 및 장으로 구성되는 군으로부터 선택되는 조직에 영향을 미치는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 조직이 간인 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 섬유증이 주혈흡충의 감염에 기인하는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  27. 제21항에 있어서, 상기 섬유증이 상처 치유에 기인하는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 상처가 외과적 절개인 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 제1항에 있어서, 상기 단백질이 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  32. 제1항에 있어서, 상기 단백질이 서열 번호 4의 아미노산 서열 중 26번 내지 341번 아미노산을 포함하는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  33. 제6항에 있어서, 상기 단백질이 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  34. 제6항에 있어서, 상기 단백질이 서열 번호 4의 아미노산 서열 중 26번 내지 341번 아미노산을 포함하는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  35. 제13항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  36. 삭제
  37. 제21항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  38. 삭제
  39. (a) IL-13에 대한 항체 또는 IL-13에 대한 항체의 IL-13 결합 단편과 (b) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 상기 조직 섬유증이 간, 피부 표피, 피부 내피, 근육, 건, 연골, 심장 조직, 췌장 조직, 폐 조직, 자궁 조직, 신경 조직, 고환, 난소, 부신, 동맥, 정맥, 결장, 소장, 담즙관 및 장으로 구성되는 군으로부터 선택되는 조직에 영향을 미치는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 상기 조직이 간인 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 섬유증이 주혈흡충(schistosoma)의 감염에 기인하는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  43. 제39항에 있어서, 상기 섬유증이 상처 치료에 기인한 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 상기 상처가 외과적 절개인 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  45. (a) IL-13에 대한 항체 또는 IL-13에 대한 항체의 IL-13 결합 단편과 (b) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 상기 조직 섬유증이 간, 피부 표피, 피부 내피, 근육, 건, 연골, 심장 조직, 췌장 조직, 폐 조직, 자궁 조직, 신경 조직, 고환, 난소, 부신, 동맥, 정맥, 결장, 소장, 담즙관 및 장으로 구성되는 군으로부터 선택되는 조직에 영향을 미치는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  47. 제45항에 있어서, 상기 조직이 간인 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  48. 제47항에 있어서, 상기 섬유증이 주혈흡충(schistosoma)의 감염에 기인하는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  49. 제45항에 있어서, 상기 섬유증이 상처 치료에 기인한 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 상기 상처가 외과적 절개인 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  51. 제39항에 있어서, IL-13에 대한 항체를 포함하는 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  52. 제39항에 있어서, IL-13에 대한 항체의 IL-13 결합 단편을 포함하는 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  53. 제39항에 있어서, 상기 항체는 인간 IL-13bc에 대한 IL-13의 결합에 대항하는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  54. 제51항에 있어서, 상기 항체는 인간 IL-13bc에 대한 IL-13의 결합에 대항하는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  55. 제52항에 있어서, 상기 항체는 인간 IL-13bc에 대한 IL-13의 결합에 대항하는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  56. 제39항에 있어서, 상기 조성물은 정맥, 피부, 피하 또는 정맥주사로 투여되는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  57. 제39항에 있어서, 상기 조성물은 정맥주사로 투여되는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  58. 제54항에 있어서, 상기 항체는 12 내지 24시간 동안 연속 투여법으로 투여되는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  59. 제39항에 있어서, 상기 조성물은 체중 kg당 0.1 ㎍ 내지 100 mg의 투여량으로 투여되는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  60. 제39항에 있어서, 상기 조성물은 체중 kg당 20 ㎍ 내지 500 ㎍의 투여량으로 투여되는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  61. 제45항에 있어서, IL-13에 대한 항체를 포함하는 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  62. 제45항에 있어서, IL-13에 대한 항체의 IL-13 결합 단편을 포함하는 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  63. 제45항에 있어서, 상기 항체는 인간 IL-13bc에 대한 IL-13의 결합에 대항하는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  64. 제61항에 있어서, 상기 항체는 인간 IL-13bc에 대한 IL-13의 결합에 대항하는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  65. 제62항에 있어서, 상기 항체는 인간 IL-13bc에 대한 IL-13의 결합에 대항하는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  66. 제45항에 있어서, 상기 조성물은 정맥, 피부, 피하 또는 정맥주사로 투여되는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  67. 제45항에 있어서, 상기 조성물은 정맥주사로 투여되는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  68. 제67항에 있어서, 상기 항체는 12 내지 24시간 동안 연속 투여법으로 투여되는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  69. 제61항에 있어서, 상기 조성물은 체중 kg당 0.1 ㎍ 내지 100 mg의 투여량으로 투여되는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  70. 제61항에 있어서, 상기 조성물은 체중 kg당 20 ㎍ 내지 500 ㎍의 투여량으로 투여되는 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
  71. 제39항에 있어서, 상기 항체는 단일 클론 항체인 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 치료용 약학 조성물.
  72. 제45항에 있어서, 상기 항체는 단일 클론 항체인 것인 포유류 개체의 조직 섬유증 형성 억제용 약학 조성물.
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