CN101318013B - Il-4在制备治疗慢性肝纤维化的药物组合物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，本发明所要解决的技术问题是提供IL-4的一种新用途。具体来讲，是提供了IL-4在制备治疗慢性肝纤维化的药物组合物中的用途。在用量为0.1ug/kg/d～5ug/kg/d时治疗述慢性肝纤维化具有好的效果。为慢性肝纤维化的治疗提供了一种新的选择。

Description

IL-4在制备治疗慢性肝纤维化的药物组合物中的用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及白细胞介素-4(IL-4)在治制备治疗慢性肝纤维化的药物组合物中的用途。

背景技术

肝纤维化是各种慢性肝病进一步发展的共同病理基础，其特征性改变是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的形成与降解失衡，以致ECM过度沉积而形成纤维化，进而引起肝小叶改建，假小叶和结节形成，进入肝硬化阶段[1，2]。多数慢性肝病人都有不同程度的纤维化，其中25％～40％最终发展成肝硬化乃至肝癌。由于肝纤维化是由可逆性病理变化到不可逆性病理变化的最后环节，阻断肝纤维化就成为慢性肝病治疗中的一个关键问题。

在肝纤维化的过程中，自身免疫反应发挥了重要的作用。近年来，有人发现刀豆球蛋白A(concanavalin A，ConA)可以造成肝细胞损伤从而导致肝纤维化。ConA是一种促有丝分裂剂，具有促进T细胞增殖的能力。体外试验表明，ConA能加速T细胞分裂。同时，ConA无法诱导重度联合免疫缺陷症的模型小鼠产生肝损伤，环孢霉素A、他克莫司、皮质激素等免疫调节剂也能抑制ConA诱导的肝损伤。这些说明，ConA诱导的肝损伤是在T细胞，尤其是CD4⁺T细胞的介导下完成的，这与慢性肝纤维化的形成机制一致。且与其它肝纤维化动物模型相比较，ConA诱导的肝纤维化特征更接近于人类肝纤维化疾病病变特征。Con A诱导的肝纤维化模型符合如下原则：1、应建立于免疫机制上；2、肝纤维化应该由持续的肝脏损伤诱导；3、诱导肝纤维化不能建立在直接肝脏毒性机制上，这是目前本领域公认的筛选治疗慢性肝纤维化药物的动物模型。

Kiminori Kimura等利用Con A反复注射建立的小鼠免疫性肝纤维化模型发现，这种免疫性肝纤维化的主要机理就是由于ConA的诱导作用使γ干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)，肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)异常增高，导致肝组织反复损伤，肝纤维化形成。而且利用抗体的中和试验发现IFN-γ和TNF-α在这种模型的发病中发挥关键的作用[3，4]。其中IFN-γ主要通过释放TNF-α、白细胞介素(interleukin，IL)-1、6和-12以及产生反应性氧基和一氧化氮(nitrogen monoxidum，NO)来介导巨噬细胞控制的炎症反应，造成肝组织损伤。在此过程中IFN-γ/IL-4的比值上升。T.Knittel等的研究还发现，肝纤维化的形成的起始是通过TNF-α刺激肝星状细胞(hepatic s tellate cell，HSC)中间质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)-3，-9，-10，-13，和-14的表达来完成的[5]。

目前治疗肝纤维化的方式有：干扰素类(具有很好的抗纤维化效果)、姜黄，白藜芦醇、水飞蓟素、和沙利度胺和秋水仙素[6]。Rao等[7]经临床实验证明，干扰素β-1α(interferon beta-1a，INFβ-1α)对抑制肝纤维化有良好的治疗效果。H.L.Weng等[8]通过临床研究发现IFN-γ对于慢性乙肝有良好的治疗作用，且在临床实验中没有病人出现严重的副反应。姜黄[9]、白藜芦醇和沙利度胺是新发现的对肝纤维化有一定治疗作用的药物，它们是通过下调核转录因子(nuclear factor of kappa B，NF-kB)和各种致炎、致纤维化的细胞因子来实现的，但现在还缺少相关的临床实验。另外秋水仙素[10]对于减轻肝脏炎症，降低肝纤维化程度有一定的效果。国内也研制出了不少治疗肝纤维化的中药制剂，有一定效果，如扶正化瘀胶囊[11]，现已获准在美国进入二期临床研究。安珐特[12]对于抗肝纤维化也有一定的治疗作用。另外甘草皂苷[6]对于保肝降酶有很好的疗效，但其对各种肝炎病毒的杀灭作用还有待于进一步的临床实验。这些中药制剂的副作用较小，但在制作方面大都采用传统的生产工艺加工生产，质量控制和疗效判定受到局限。

IL-4是一种主要由Th2细胞分泌的细胞因子，它具有促进Th细胞O型(T helper0，Th0)细胞发育、分化为Th2细胞的功能，被认为是Th2转化的必需因子。目前IL-4主要用于肿瘤的临床治疗，它能诱导肿瘤免疫并排斥已形成的恶性肿瘤：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)与IL-4联合用药可以治疗癌症[13]。用量为2.5mg/kg/d GM-CSF加上0-6.0mg/kg/d IL-4，给药方式为全身给药，治疗周期为14天。其中IL-4的最大耐受剂量为6.0mg/kg/d，最适剂量为4.0mg/kg/d。IL-4的假单胞菌外毒素融合蛋白(NBI-3001)能治疗恶性胶质瘤[14]，剂量为6mg/ml*40mlNBI-3001，给药方式为瘤内点滴注射，治疗周期为26周。IL-4对Th1诱导的器官特异性自身免疫病具有普遍的治疗作用。此外，还有研究发现，对于严重的顽固性银屑病患者，应用重组人类白细胞介素-4(Recombinant Human IL-4，rhIL-4)具有明显的临床治疗作用[15]。IL-4对于软骨降解有直接的保护作用，动物实验表明：用IL-18结合蛋白和IL-4融合基因治疗能使胶原性关节炎(collagen induced arthritis，CIA)病情显著好转[16]，IL-18结合蛋白和IL-4融合基因的用药剂量为107pfu/6ml，给药方式为关节内注射，治疗周期为四周。S.H.Ho等所做的一项小鼠模型实验[17]表明：用电脉冲介导IL-4基因转入脾内对于抑制实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)的发生方面也有非常重要的作用。IL-4基因的用药剂量为25mg，给药方式为用电脉冲介导IL-4基因转入脾内。目前，并没有IL-4能有效治疗慢性肝纤维化的相关报道。

参考文献

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发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供白细胞介素-4的一种新用途。IL-4的这种新用途是用于制备治疗慢性肝纤维化的药物组合物。

其中，上述用途中，IL-4的制备的治疗慢性肝纤维化的药物中的IL-4的用量为0.1ug/kg/d～5ug/kg/d。优选的，IL-4的用量为0.2ug/kg/d～1ug/kg/d。

其中，上述治疗慢性肝纤维化的药物的给药途径为：皮下注射

其中，上述治疗慢性肝纤维化的药物的使用时间为1个月。

其中，上述IL-4具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种治疗慢性肝纤维化的药物组合物。该治疗慢性肝纤维化的药物组合物是由IL-4添加药学上可接受的辅助性成分制备而成。

其中，上述IL-4的用量为0.1ug/kg/d～5ug/kg/d。优选的IL-4的用量为0.2ug/kg/d～1ug/kg/d。

其中，上述治疗慢性肝纤维化的药物组合物的给药途径为：皮下注射给药，使用时间为1个月。

进一步的，上述IL-4具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

IL-4是一种抗炎性Th2型细胞因子，可下调抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)、抑制Th1增生，抑制IL-1、TNF-α和其他一些炎症性细胞因子(如IL-6，IL-8)的功能和生成，同时促进Th2细胞的分化，增进免疫反应，使CTL细胞活性减弱。IL-4临床上主要用于某些肿瘤的治疗。

本发明实施例表明现，虽然IL-4在高剂量使用时，会导致Con A的引起肝细胞纤维化进一步加剧甚至会出现钙化，但是，在合适的低剂量使用时候，却意想不到的具有抑制纤维化形成的良好作用，并能够降低疾病模型组的血清丙氨酸转氨酶(alanineaminotransferase，ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)水平。同时小鼠肝脏病理切片也显示：低剂量IL-4治疗组的小鼠肝脏反而无纤维条束形成，其血管壁上仅有少量炎症细胞浸润；而未治疗组的小鼠肝脏有纤维条束形成，大量炎症细胞浸润。这说明IL-4能减轻非特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicity T lymphocyte，CTL)造成的肝细胞损伤，减轻肝脏的炎症、坏死，从而减少肝纤维化的发生，具有制备治疗肝纤维化的药物的用途。本发明以IL-4为主要活性成分的药物为慢性肝纤维化的治疗提供了一种新的选择，具有很好的应用前景。

附图说明

图1实验完成后各处理组的小鼠血清ALT值。

图2实验完成后各处理组的小鼠血清AST值。

具体实施方式

实施例一IL-4的制备

1、实验动物：Balb/c小鼠30只，(购自四川大学实验动物中心)雌性体重18-22g昼夜节律，自由进食、饮水。

2、主要试剂：ConA(Sigma公司，TypeIV，编号066K7031)。IL-4自制。

3、IL-4的制备：

(1)工程菌的构建：

设计一对PCR引物，在目的基因的5’端引入msc1位点，3’端引入xho1位点，便于克隆到PET32a(+)载体的msc1和xho1位点之间。用Taq DNA聚合酶(Pyrobest，购自TaKaRa公司)对载体porf-mil4(Invitrogen公司)进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增得到mil-4序列，PCR产物经限制性内切酶msc1和xho1(Invitrogen公司)酶切后，连接到pET32a(+)载体(Invitrogen公司)的msc1和xho1位点之间，构建重组质粒，重组质粒进行DNA序列测定(上海英骏生物技术有限公司)确认。将构建正确的质粒转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，从而获得重组小鼠IL-4(Recombinant Murine IL-4，rmIL-4)基因的表达工程菌。

(2)rmIL-4的表达及表达形式的确定：

挑选单克隆BL21(DE3)pET32a(+)rmIL-4于LB培养基(含氨卞青霉素(Amp)，)，37℃培养至OD600约为0.6-1.0时，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG)至终浓度1mM诱导表达，SDS-PAGE检测并分析重组蛋白表达量。收集诱导后的菌液离心，沉淀重悬于破菌缓冲液(50mM Tris·Cl，500mMNaCl，pH8.0)，高压破菌，离心，收集上清和沉淀，SDS-PAGE检测出重组蛋白的表达形式为包涵体。

(3)用洗涤液(3M盐酸胍，50mM Tris·Cl，500mMNaCl，pH8.0)洗涤沉淀2次，再溶于变性液(7M盐酸胍，50mM Tris·Cl  ，500mMNaCl，780ul/Lβ-巯基乙醇H8.0)中，4℃过夜后离心，取上清复性，，镍柱纯化。将纯化后的蛋白经凝血酶酶切后用离子交换柱除去标签，得到rmIL-4，具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

(4)对制备的rmIL-4进行免疫原性和活性检测：通过免疫印迹法(Anti-mouse IL-4Antibody，购自R&D，AF-404-NA)和CTLL-2细胞增殖应答实验对rmIL-4进行检测。其结果显示，本室制备的rmIL-4能够用作重组白细胞介素-4小鼠药效学实验。

实施例二用IL-4治疗慢性肝纤维化

A、实验造模与实验处理

25只雌性Balb/c小鼠(体重18-22g)随机分成五组，每组5只：正常组、疾病模型组和治疗组(0.2ug/只组，1ug/只组，5ug/只组)，

正常组小鼠，不进行任何处理；

疾病模型组小鼠皮下注射ConA 0.25mg/只(12.5mg/kg)，每周一次；

连续注射六周后，眼眶取血，分离血清，留取血清用酶联免疫吸附测定(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)法检测，测量血清酶学指标ALT、AST；取血后拉颈处死小鼠，并留取肝组织进行行苏木素-伊红(hematoxylin-eosin HE)染色和天狼星红染色观察炎症活动度和肝纤维化程度。

B、结果与分析

1.各组小鼠血清ALT，AST比较：

表1

组别	例数	ALT (U/L)	AST (U/L)
				正常组	5	76±9.27	22.7±3.54
conA模型组	5	168.76±69.58	69.04±29.23
				0.2ug/只治疗组	5	107.24±20.13	27.9±2.55
1ug/只治疗组	5	101.98±20.33	40.64±30.53
				5ug/只治疗组	3	106.33±19.70	32.93±8.20

对实验数据采用SPSS11.0统计分析软件进行数据处理。所有计量资料以means±SD表示，利用单因素方差分析(ANOVA)和最小有意义差异法(LSD)检验进行统计学分析，各治疗组与模型组数据的p＜0.05，有统计学意义，具有明显差距。ALT和AST是反映肝细胞坏死程度，衡量肝功的两个重要参数，ALT和AST在治疗组中的降低表明IL-4有减轻肝细胞损伤并保护肝功的作用。

2、HE染色后的肝组织观测结果为(20×10)：

A：正常组小鼠，肝细胞无坏死，无炎症细胞浸润

B：conA模型组小鼠，有纤维条束形成，大量炎症细胞浸润；

C：0.2ug/只IL-4治疗组小鼠，血管壁上有少量炎症细胞浸润，无纤维条束形成；

D：1ug/只IL-4治疗组小鼠，血管壁上有炎症细胞浸润，无纤维条束形成；

E：5ug/只IL-4治疗组小鼠，肝组织有纤维条束形成，大量炎症细胞浸润，大片组织钙化。

3、天狼星红染色的肝组织观测结果为(20×10)：

A：正常组小鼠，无纤维条束形成；

B：conA模型组小鼠，肝组织有纤维条束形成；

C：0.2ug/只IL-4治疗组小鼠，血管壁上有少量胶原形成，肝组织无纤维条束形成；

D：1ug/只IL-4治疗组小鼠，血管壁上有胶原形成，肝组织有少量纤维条束形成；

E：5ug/只IL-4治疗组小鼠，肝组织有大量纤维条束形成。

从上述的结果可以看出，适量的IL-4对小鼠肝纤维化有明显的抑制作用。这可能是由于IL-4具有抑制Th1增生的能力，能抑制IL-1、TNF-α和其他一些炎症性细胞因子(如IL-6，IL-8)的功能和生成，从而使减弱CTL细胞活性，降低肝损伤，同时IL-4能上调decorin的浓度，从而延迟纤维化初期的进程，并减小纤维的直径，防止并减少ECM沉积最终达到发挥抗纤维化的目的。但是，过量的IL-4却会加重肝的损伤，加重肝的纤维化程度。由于人和小鼠的IL-4高度同源，从此实验结果本领域技术人员均可知使用人IL-4(氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示)能够治疗人的慢性肝纤维化。

通过一般公知的人和动物药物剂量换算关系(换算方法参见施新猷编著的《医用实验动物学》第十一章第二节中的实验动物用药量的确定及计算方法，由西安陕西科学技术出版社1989年出版)，当使用重组人IL-4制备成药物组合物用于治疗慢性肝纤维化的时候(如乙肝、丙肝引起的慢性肝纤维化)用药方案为每剂1ug/kg/d左右最好，在0.1ug/kg/d～5ug/kg/d范围内均能有效，每天一次，皮下注射给药，连续治疗1月。

由上述实例可知，IL-4在低于常规使用的剂量下具有好的制备治疗肝纤维化的作用，以其为活性成分制备治疗肝纤维化的药物，具有很好的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110>四川大学

<120>IL-4在制备治疗慢性肝纤维化的药物组合物中的用途

<130>A080197K

<160>2

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>129

<212>PRT

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>1

His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser

1               5                   10                  15

Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile

            20                  25                  30

Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala

        35                  40                  45

Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg

    50                  55                  60

Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile

65                  70                  75                  80

Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu

                85                  90                  95

Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe

            100                 105                 110

Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser

        115                 120                 125

Ser

<210>2

<211>120

<212>PRT

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>2

His Ile His Gly Cys Asp Lys Asn His Leu Arg Glu Ile Ile Gly Ile

1               5                   10                  15

Leu Asn Glu Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Cys Thr Glu Met Asp Val

            20                  25                  30

Pro Asn Val Leu Thr Ala Thr Lys Asn Thr Thr Glu Ser Glu Leu Val

        35                  40                  45

Cys Arg Ala Ser Lys Val Leu Arg Ile Phe Tyr Leu Lys His Gly Lys

    50                  55                  60

Thr Pro Cys Leu Lys Lys Asn Ser Ser Val Leu Met Glu Leu Gln Arg

65                  70                  75                  80

Leu Phe Arg Ala Phe Arg Cys Leu Asp Ser Ser Ile Ser Cys Thr Met

                85                  90                  95

Asn Glu Ser Lys Ser Thr Ser Leu Lys Asp Phe Leu Glu Ser Leu Lys

    100                 105                 110

Ser Ile Met Gln Met Asp Tyr Ser

        115                 120

Claims (10)

1.IL-4在制备抗慢性肝纤维化的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于在所述IL-4的用量为0.1ug/kg/d～5ug/kg/d。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于在所述IL-4的用量为0.2ug/kg/d～1ug/kg/d。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述药物的给药途径为：皮下注射给药。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述IL-4的使用时间为1个月。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述IL-4具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

7.抗慢性肝纤维化的药物组合物，其特征在于是由IL-4添加药学上可接受的辅助性成分制备而成，IL-4的用量为0.1ug/kg/d～5ug/kg/d。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于在所述IL-4的用量为0.2ug/kg/d～1ug/kg/d。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物的给药途径为：皮下注射给药，使用时间为1个月。

10.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于所述IL-4具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。 

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