CN104357466B - 一种单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，公开了包含该核苷酸序列的重组载体、重组菌，以及SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列编码的单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体及其制备方法和用途。本发明单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体可以有效治疗实体瘤，安全性好，临床应用前景良好。

Description

一种单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体及其制备方法和用途。

背景技术

肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一，人类全身肿瘤中90％以上常见的恶性肿瘤都是实体瘤；随着环境污染的加剧，其发病率逐年上升。实体瘤的传统治疗方法以手术、化疗及放疗为主，但肿瘤的转移率和治疗后的复发率都较高，生存率仍不理想。因此，结合最新的肿瘤生理学和医学分子生物学研究成果，进一步研究开发新型高效的实体瘤治疗方法，具有重要的社会经济意义。

利用自杀基因治疗实体瘤是近年来肿瘤基因治疗的研究热点。所谓自杀基因治疗肿瘤就是用基因工程技术将特定的外源基因导入肿瘤宿主细胞或肿瘤组织中，该外源基因表达的蛋白质能够将无毒的前体药物分解成对肿瘤细胞有毒性的药物成分，直接杀死肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。然而，目前基因治疗面临的关键问题是如何解决载体的安全性和靶向性问题，选择一个高效、安全、特异性强的载体，是实现目的基因在肿瘤细胞中特异表达的前提。

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-TK)/更昔洛韦(ganciclovir,GCV)是目前研究最早最彻底的，安全性较高，广泛用于肿瘤基因治疗的自杀基因系统之一。目前研究认为该自杀基因治疗肿瘤的机制有两个：一是自杀效应，即HSV-TK编码由376个氨基酸组成的胸甘激酶，导入肿瘤细胞后,这种胸苷激酶将无毒的更昔洛韦(GCV)磷酸化成单磷酸更昔洛韦,再进一步磷酸化为三磷酸更昔洛韦后,掺合到新合成的肿瘤细胞DNA链中,使DNA链断裂且抑制DNA聚合酶活性,从而干扰DNA合成导致肿瘤细胞死亡。另外一种是TK-GCV系统引发的“旁观者效应”，所谓“旁观者效应”即是转导的肿瘤细胞被敏感药物杀死的同时,周围未被转导的肿瘤细胞也被杀死的现象。HSV-TK/GCV系统通过这种独特的自杀效应或“旁观者效应”能选择性地杀死肿瘤细胞，保护正常组织细胞，从而避免传统的化疗等治疗方法对人体带来的伤害。自1986年Moolten首先报道腺病毒介导的HSV-TK基因可使肿瘤获得对某些药物的敏感性以来,国内外学者陆续将腺病毒介导的HSV-TK基因应用于肝癌、胃癌、舌癌、前列腺癌、黑色素瘤等实体瘤的基因治疗的实验研究,并取得了可喜进展。

然而，HSV-TK的天然底物是细胞中广泛存在的胸腺嘧啶核苷酸和尿嘧啶核苷酸。因此，利用天然的tk基因作为肿瘤靶向基因治疗的候选基因，在实际应用中必然存在细胞内丰富的天然的胸腺嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸与GCV相互竞争TK活性部位的弊端。从而在实际应用中会减小GCV与TK的作用几率而减弱其治疗效果，或者为了达到预期的治疗效果而不得不增加GCV的剂量，增加治疗成本和药物的副作用。

因此，采用天然的单纯疱疹病毒胸苷激酶治疗肿瘤，存在疗效不佳、副作用大的弊端。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种单纯疱疹病毒胸苷激酶的突变体及其制备方法和用途。

本发明提供了一种如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

还提供了一种重组载体，它包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。优选地，所述的重组载体是重组pET32质粒或者重组pBES载体。

pBES载体，记载于专利号为ZL200710092976.6的专利文件中。

还提供了一种重组菌，它包含前述的重组载体。优选地，所述的重组菌为重组大肠杆菌或者重组双歧杆菌。

本发明单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体，它由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列编码。它的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供了一种制备前述单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体的方法，包含如下步骤：

ⅰ、取权利要求5所述的重组大肠杆菌组菌，接种到添加有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基上，37℃、250r/min摇床培养12h；

ⅱ、取步骤ⅰ的菌液按1：100的接种量转接至LA培养基中，37℃、200r/min摇床中培养，至OD₆₀₀值达到0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，37℃诱导表达5h；

ⅲ、离心，得菌体，裂解，取上清，分离纯化，即得。

步骤ⅲ中，所述分离纯化采用His-tag磁珠纯化试剂盒分离纯化。

本发明还提供了前述核苷酸序列重组载体、重组菌、单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体在制备治疗抗肿瘤药物中的用途。

本发明还提供了前述重组双歧杆菌与更昔洛韦在制备联合用药物中的用途。

本发明还提供了一种联合用药物，它包含不同规格的单位制剂，用于同时、分别或者依次给重组双歧杆菌与更昔洛韦，以及药学上可接受的载体。

与天然的单纯疱疹病毒胸苷激酶相比，本发明单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体(mTK)，对GCV的代谢活性不变，而对天然胸腺嘧啶核苷酸代谢活性大幅度降低，用于肿瘤治疗时，一方面，减小了天然胸腺嘧啶核苷酸对mTK的竞争性干扰，增强了mTK与GCV的作用机会，另一方面，其结果必然是在不增加GCV剂量的前提下，达到增强GCV杀伤癌细胞的作用效果,减少药物剂量和副作用，安全性好；本发明含有单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体mtk1608基因片段的重组双歧杆菌(双歧杆菌-mTK1608)，与含有天然单纯疱疹病毒胸苷激酶基因片段的重组双歧杆菌相比，抑制肿瘤的效果更佳，临床应用前景良好。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1本发明中TK及其突变体蛋白的SDS-PAGE检测结果。说明：1、蛋白质Marker；2、pET32-TK全菌蛋白；3、纯化的mTK1608；

图2本发明的mTK1608突变体对天然底物和GCV的代谢活性检测结果。

图3本发明中制作的裸鼠直结肠癌(colo320)移植模型，说明1、首次注射PBS的裸鼠；2、首次注射双歧杆菌-TK的裸鼠；3、首次注射双歧杆菌-mTK1608的裸鼠。

图4本发明中mTK1608作用实体瘤模型后凋亡标志物的Western blot检测结果。

图5本发明双歧杆菌pBES-mtk1608/GCV治疗系统治疗裸鼠实体瘤模型后的效果检测。

具体实施方式

实验材料和试剂：

pBEX-LTB质粒由重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室构建；原核表达载体pET32a，E.coli TOP10、E.coli BL21(DE3)由重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室保存；雄性裸鼠由重庆医科大学实验动物中心提供。T4连接酶，Taq普通酶，SalⅠ，BamHⅠ，蛋白质Marker，DNA Marker，Plasmid Mini kit I，Cycle-Pure Kit，胶回收试剂盒，IPTG，卡那霉素，氨苄青霉素，BCA蛋白浓度测定试剂盒，PMSF等试剂。

实施例1本发明单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体的制备

1、重组表达

1.1基因克隆

a、合成重组目的基因：

(1)天然tk基因：化学合成方法合成GenBank号为AB032875的HSV-1tk基因，其核苷酸序列如SEQ NO：1所示：

(2)tk基因变异体1：化学合成方法合成第160位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为亮氨酸(L)，第161位氨基酸由苯丙氨酸(F)突变为亮氨酸(L)，第167位由丙氨酸(A)突变为酪氨酸(Y)，第168位由丙氨酸(A)突变为酪氨酸(Y)4个氨基酸残基同时突变的突变体TK(I160L，F161L，A167Y，A168Y)，简写为mtk1608,其核苷酸序列如SEQ NO：2所示：

其氨基酸序列如SEQ NO：4所示：

(3)tk基因变异体2：化学合成方法合成第83位氨基酸由谷氨酸(E)突变为天冬酰胺(N),第160位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为亮氨酸(L)，第161位氨基酸由苯丙氨酸(F)突变为亮氨酸(L)，第167位由丙氨酸(A)突变为酪氨酸(Y)，第168位由丙氨酸(A)突变为酪氨酸(Y)5个氨基酸残基同时突变的突变体TK(E83N，I160L，F161L，A167Y，A168Y)，简写为mtk8360,其核苷酸序列如SEQ NO：3所示：

b、构建重组表达载体

分在在上述三个基因片段的其5-端添加BamHI酶切位点，3’端添加SalI酶切位点,然后将合成的mtk8360基因片段克隆到pET32载体中，分别命名为pET32-tk、pET32-mtk1608和pET32-mtk8360。

c、转化大肠杆菌，制备重组菌

(1)将20μl上述pET32-tk、pET32-mtk1608和pET32-mtk8360质粒DNA分别与50μlE.coli.Top10感受态细胞混合，冰上放置30分钟；

(2)42℃热休克90秒，立即冰浴1分钟；

(3)取50μl上述转化菌液混匀后均匀涂布于LB(100ug/mL Amp)培养板，在恒温培养箱中37℃倒置培养过夜。

(4)在LB培养板上挑选大小适中的菌落，通过菌落PCR初步筛选阳性克隆，之后提取重组质粒用BamHⅠ和SalⅠ做双酶切鉴定。

(5)鉴定正确的质粒公司测序。

1.2重组大肠杆菌的诱导表达

(1)接种上述重组菌的单克隆于LB培养基(100μg/ml Amp)，37℃250r/min摇床培养12h；

(2)将该菌液按1：100的接种量转接至新鲜的LA培养基，在37℃摇床中继续培养，转速为200r/min，用分光光度计进行实时检测，当菌液OD₆₀₀值达到0.6～0.8(细菌对数生长期)时加入IPTG，使其终浓度为0.5mmol/L，37℃诱导表达5h。

(3)诱导表达的菌液在13000g下离心10min，弃掉上清，用细菌裂解液充分重悬菌体，在室温下裂解处理30min。

(4)通过离心分别收集菌液上清和沉淀，裂解处理后的标本通过12％SDS-PAGE进行分析。

1.3分离纯化

(1)用His-tag磁珠纯化试剂盒(苏州海狸纳米科技公司)中的试剂分别裂解上述三个重组蛋白表达菌，2000rpm离心10min，上清液分别与1ml磁珠混合，室温下作用30min,置于磁性分离器分离，弃去上清液，用洗涤液洗磁珠10min,弃上清，用洗脱液洗涤磁珠5min,2000rpm离心10min，取上清(即纯化的蛋白质样品)，-20℃保存备用备用。

(2)将上述经磁珠纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE检测，确认分子量大小与理论预测一致后，调整所有样品的蛋白质浓度一致，加入蛋白酶抑制剂，-20℃保存备用。

2、测定

2.1突变体的活性检测：

(1)将纯化的TK，mTK1608，mTK8360各取200μg,分别与脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dTTP),脱氧尿嘧啶核苷酸(dUTP)和GCV各200μg混合，定容到1000μl，EP管用封口膜密封后置于37℃水浴作用1小时。100℃灭活10min，-80℃保存备用。

(2)将上述制备的样品经行离心处理(1200rpm,10min),取上清，-80℃保存备用。

(3)将上述制备的上清样品稀释为相当于0.5μg/μl、5.0μg/μl和50μg/μl三个稀释度，用Kromasil C18色谱柱，以甲醇-水(10:90)为流动相，流速0.8ml/min,检测波长252nm,柱温25℃。

(4)比较各样品的峰面积，以确定突变体蛋白与野生型TK对GCV和正常核苷酸的作用力(即酶活力)。

2.2SDS-PAGE电泳

(1)将诱导表达的重组菌分别离心，将细菌沉淀和上清液分别与适量的裂解液混合，煮沸处理5分钟；

(2)将处理好的样品滴加到SDS-PAGE的加样孔，120V电泳至溴酚蓝距离凝胶下端5cm左右，停止电泳。

(3)染色，洗脱，检测目的条带。

3、测定结果

3.1SDS-PAGE分析

如图1所示，重组蛋白mTK1608的分子量大小与野生型TK一致，载体和重组菌构建成功。

同时，泳道3可以见，凝胶中只显示一条蛋白带，表明分离纯化所获得的mmTK1608已得到纯化。

实验结果说明，本发明分离得到了纯品mmTK1608。

3.2活性

如下表1和图2所示：

表1TK及其突变体作用不同底物后的底物残留(峰面积)

与野生型TK相比，变异体mTK1608对天然dTTP底物的代谢活性显著减小，对dUTP的代谢活性几乎与TK相当，同时，对GCV的代谢活性有所提高(1.31倍)。而变异体mTK8360则对天然dUTP底物的代谢活性反而增强，对GCV的代谢活性几乎与TK相当。

因此，mTK1608变异体与野生型TK相比，对GCV代谢活性更高，对天然胸腺嘧啶核苷酸代谢活性更低，抑杀肿瘤的效果更佳，副作用更小。

实施例2pBES-mtk1608的构建

1、实验方法

(1)pBES载体的制备

第一步，用卡那霉素抗性基因替换pGEX-5x-1质粒1344-2220nt的Ampicillin抗性基因的序列区，即(a)先用PCR方法从GenBank号为EU233623的质粒pEASY-T1上扩增1203-2114nt片段，得到卡那霉素抗性基因，正向PCR引物为：agtagacgtcctggtaag gttgggaag，位置在1203-1219nt，5’端添加AatII酶切位点，反向引物为：acgtcagtggctgcaattcagaagaactcgtc，位置在2114-2085nt，5’端添加AlwN1酶切位点；PCR扩增条件为：95℃4min，经95℃40Sec、55℃30Sec、72℃1min循环扩增25次；(b)将上述PCR纯化产物和pGEX-5x-1质粒分别用Aat II和AlwN1双酶切，回收酶切后的PCR产物和pGEX-5x-1大片段按1∶2混合连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取在卡那霉素抗性平板上生长阳性单克隆，再一次在卡那霉素抗性平板上划线纯化，同时在青霉素平板上划线培养而不能生长的单菌落一定是阳性菌落，然后测序确认；第二步，以第一步所得到阳性菌落中的质粒为模板，用高保真Taq DNA聚合酶通过PCR扩增，以四环素tetO启动子替换pGEX-5x-1质粒183-932nt上的Ptac启动子，同时删除pGEX-5x-1质粒上3301-4420nt的LacIq片段，引物pF1为pGEX-5x-1上的多克隆位点序列，pR1为LacIq上游序列，引物序列如下：pF1：attaggatccccgaattcccg，5’端添加BamHI酶切位点；pR1：tcgaccgcggattcaccaccctg aattgac，5’端添加SacII酶切位点，PCR扩增条件为：95℃4min，经95℃40Sec、52℃30Sec、72℃1min循环扩增30次，PCR产物用BamHI和SacII双酶切备用；同时，用BamHI和SacII酶切切取由上海生物工程技术公司合成的tetO启动子序列，其序列如下：tcgaccgcggactggccgtcgttttactccctatcagtg atagagattgacatccctatcagtgatagagatactgagcacatcagcaggacgcactgacctgaggagggatccctag，其中ctggcc gtcgtttta为M13测序引物序列；然后将BamHI和SacII酶切后的质粒与tetO启动子的PCR酶切产物连接转化，在卡那霉素抗性平板上挑取单克隆，电泳鉴定后，测序确认后，同时制备AatII酶切产物备用；第三步，合成GenBank号为AF139129的长双歧杆菌KJ36质粒的复制蛋白B序列，其蛋白编码序列位置在4-1018nt，合成时在两端添加Aat II酶切位点，序列片段由上海生工合成，测序确认无误；用PCR大量扩增该序列，正向引物为：pR1：gcgacgtcgtacttagtacaaaagggga，5’端添加Aat II酶切位点，反向引物为：pR2：gcgacgtcatgatgttcgcggttgcg，5’端添加Aat II酶切位点，PCR扩增条件为：95℃3min，再经95℃50Sec、54℃40Sec、72℃1min的30次循环扩增；PCR产物经Aat II酶切后连接到第二步所得的质粒对应的AatII酶切位点，连接转化，在卡那霉素抗性平板上挑取单克隆，质粒用电泳检测后测序确认，并选择KJ36片段按顺时针方向连接的为标准序列报道的载体；至此，pBES载体构建成功，全长3016bp。

(2)构建重组pBES载体

将pET32-tk和pET32-mtk1608分别与pBES质粒转化大肠杆菌DH5α在37℃培养10小时后纯化质粒，将纯化的pET32-tk，pET32-mtk1608和pBES质粒分别用BamHI和SalI双酶切，电泳分离后用凝胶纯化试剂盒(北京鼎国生物)分离纯化tk，mtk1608基因片段和pBES载体DNA片段，用连接试剂盒(大连宝生物)在25℃连接30min,转化大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜后挑取阳性克隆，扩大培养后纯化质粒，PCR和酶切鉴定正确后，即得两种重组载体，分别命名为pBES-tk和pBES-mtk1608,-80℃保存备用。

(3)转化

a)将双歧杆菌培养至对数生长期即OD₆₀₀为0.6-0.7时，经去离子水配制的灭菌10％甘油洗涤处理后，以双歧杆菌为受体菌，用电转化法将纯化的pBES-tk质粒载体转化到受体菌中；转化条件为：15KV、200Ω、25μF。

b)再将转化处理后的双歧杆菌先在无抗菌素的MRS液体培养基中复苏60-120min，然后在含50μg/ml卡那霉素的MRS固体培养基上培养，选择抗性菌落，从而获得转tk基因的双歧杆菌，PCR和SDS-PAGE鉴定后的阳性克隆即为含有pBES-tk或pBES-mtk1608重组载体的重组双歧杆菌。

实施例3含有pBES-mtk1608重组载体的重组双歧杆菌的制剂

实施例2制备的pBES-mtk1608重组载体的重组双歧杆菌(又称双歧杆菌-mTK1608)，可以制备成真空安碚包装的常温保存和注射使用的针剂，按以下步骤构建：

a)实施例2制备的pBES-mtk1608重组载体的重组双歧杆菌(即双歧杆菌-mTK1608实体瘤基因治疗系统)，用20％的脱脂牛奶冷冻真空干燥后保藏，即为双歧杆菌-mTK1608实体瘤基因治疗系统的种子菌。

b)将上述a)中所述的种子菌，复苏，涂布于含卡那霉素的抗性MRS培养基上厌氧培养48小时，然后挑取单一的抗性菌落于抗性MRS液体培养基中增菌培养，经PCR证实双歧杆菌-mtk1608阳性的双歧杆菌单菌落再次涂布接种于含卡那霉素的抗性MRS培养基平板上厌氧培养48小时；然后再挑取单一菌落于含卡那霉素的液体培养基中培养，如此反复接种培养至继代培养不低于15代时，经PCR检测证实双歧杆菌-mtk1608仍然阳性的克隆，可以作为种子菌用于大规模液体接种扩增培养。

c)将作为种子菌的双歧杆菌-mtk1608接种在含卡那霉素的抗性MRS液体培养中，在接种后第4、8、10小时分别取样，培养物经离心浓缩后，进一步经SDS-PAGE检测mTK蛋白的表达情况，确证重组载体是能够表达mTK的实体瘤基因治疗系统。

d)将培养过夜的双歧杆菌-mTK1608用含有0.01％半胱氨酸盐酸的PBS洗涤菌体5-7次，完全除去培养基所含有的蛋白质等杂质，再用10％的甘油液调整菌液浓度为1×10¹⁰cell/ml，然后按照每安碚分装2ml含有10％甘油的菌液，冷冻真空干燥后常温保存，即为针剂。

以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：

实验例1本发明含有pBES-mtk1608重组载体的重组双歧杆菌安全性

以家兔为动物模型，在家兔静脉注射本发明实施例2制备的含有pBES-mtk1608重组载体的重组双歧杆菌(又称双歧杆菌-mTK1608)，检测其安全性：

a)从重庆医科大学实验动物中心领取体重为2Kg的健康雄性家兔6只。

b)将实施例2制备的双歧杆菌-mTK1608培养12小时使OD₆₀₀为1.2-1.5时，双歧杆菌菌液用PBS buffer(含0.01％的半胱氨酸盐)洗涤3次，最后用PBS调整细菌浓度为1.0×10⁴cell/ml。

c)将2.0ml浓度1.0×10⁴cell/ml的双歧杆菌(没有进行外源性内毒素检测和处理)经耳静脉注射到上述a)所述的家兔体内，3日内观察实验兔与对照之间的体征差异(如活动能力、取食能力、是否有震颤、竖毛、粪便拉稀等)，和存活情况，3日内共进行3次注射。

结果发现，注射后5小时内实验兔没有发现活动能力和取食能力的变化，也没有震颤、竖毛和粪便拉稀等其他体征差异和变化，更没有死亡个体。

d)将上述c)中所取的血样进行血象分析，主要测量红、白细胞和血小板的变化。

经统计学分析发现，除了白细胞数量在初次注射后有较明显的升高外，红细胞和血小板未见有统计学意义的变化，第3次注射后，白细胞数量恢复到初次注射前的基本状态，不再有明显的升高现象。

e)将第3次注射后的动物8小时后麻醉处死，取心脏、肝脏、脾脏、肾脏进行病理学检测，同时以正常家兔的上述组织做对照。

结果发现，该受体菌进入动物体内后对心脏等主要的脏器无病理损害。

实验结果说明，本发明双歧杆菌-mTK1608用于体内使用是安全的。

实验例2本发明含有pBES-mtk1608重组载体的重组双歧杆菌治疗原发性实体瘤

1、试验方法

用实施例2制备的含有pBES-mtk1608重组载体的重组双歧杆菌(又称双歧杆菌-mTK1608)治疗实体瘤(直结肠癌colo320)：

a)在重庆医科大学动物试验中心购买裸鼠20只(雌性)，经皮下注射colo320细胞成瘤后待用(4周),结果见说明书附图3。

b)分别将实施例2制备的含有pBES-tk或pBES-mtk1608重组载体的重组双歧杆菌(实体瘤基因治疗系统)培养过夜，使OD₆₀₀为1.2-1.5时，双歧杆菌菌液用PBS buffer(含0.01％的半胱氨酸盐)洗涤3次，最后用PBS调整细菌浓度为1.0×10¹⁰cell/ml。

c)将上述a)中确认的肿瘤模型裸鼠随机分为A、B、C 3组，每组6只，其中A组每只经尾静脉注射1ml浓度4.0×10⁸cell/ml的双歧杆菌-tk工程菌；B组注射同样浓度的双歧杆菌pBES-mtk1608工程菌；C组注射同样体积的PBS，逐日观察动物的体征，并称量体重，记录食量。注射双歧杆菌-tk和pBES-mtk1608工程菌后的第二天开始经腹腔注射GCV(50mg/Kg)，随后按照分组分别注射双歧杆菌pBES-tk，pBES-mtk1608工程菌及PBS，每周注射一次，连续注射4周；次日对上述大鼠经腹腔注射GCV(50mg/Kg)，每天一次，注射4周。

2、试验结果

如图4所示：

1、与阴性对照组相比，注射本发明双歧杆菌-mTK1608的B组动物与阳性对照A组动物(注射双歧杆菌-TK)，Caspase3，Caspase8这两个促凋亡基因的表达显著增加；

2、与阳性对照A组动物(注射双歧杆菌-TK)相比，注射本发明双歧杆菌-mTK1608的B组动物的Caspase3，Caspase8这两个促凋亡基因的表达更高。

实验结果说明，本发明含有pBES-mtk1608重组载体的重组双歧杆菌可以促进肿瘤细胞凋亡，可以治疗原发性实体瘤，且效果优于含有天然tk基因的重组双歧杆菌(双歧杆菌-TK)。

实验例3本发明含有pBES-mtk1608重组载体的重组双歧杆菌治疗移植瘤

1、试验方法

用实施例2制备的含有pBES-tk或pBES-mtk1608重组载体的重组双歧杆菌(又称双歧杆菌-TK和双歧杆菌-mTK1608)治疗转移实体瘤(宫颈癌Caski细胞)：

a)在重庆医科大学动物试验中心购买裸鼠10只(雌雄不限)，经尾静脉注射1ml浓度1.0×10⁶cell/ml的人CaSki细胞，20天后随机检测肿瘤形成情况。

b)将实施例2制备的含有pBES-tk或pBES-mtk1608重组载体的重组双歧杆菌(实体瘤基因治疗系统)培养过夜，使OD₆₀₀为1.2-1.5时，双歧杆菌菌液用PBS buffer(含0.01％的半胱氨酸盐)洗涤3次，最后用PBS调整细菌浓度为1.0×10⁴cell/ml。

c)将上述a)中确认的肿瘤模型裸鼠随机分为A、B、C 3组，每组3只，其中A组每只经尾静脉注射1ml浓度1.0×10⁴cell/ml的双歧杆菌-tk工程菌；B组注射同样浓度的双歧杆菌-mtk1608；C组注射同样体积的PBS，逐日观察动物的体征，并称量体重，记录食量。注射双歧杆菌-tk，双歧杆菌-mtk1608工程菌后的第二天开始经腹腔注射GCV(50mg/Kg)，随后按照ABC组分组分别注射双歧杆菌-tk，双歧杆菌-mtk1608工程菌及其相应的对照物，每周注射一次，连续注射4周；次日对上述大鼠经腹腔注射GCV(50mg/Kg)，每天一次，注射4周。

2、试验结果

如图5所示：

1、与阴性对照组相比，注射本发明双歧杆菌-mTK1608的B组动物与阳性对照A组动物(注射双歧杆菌-TK)，它们肿瘤体积明显缩小，重量减轻；

2、与阳性对照A组动物(注射双歧杆菌-TK)相比，注射本发明双歧杆菌-mTK1608的B组动物肿瘤体积更小，重量更轻。

实验结果说明，本发明含有pBES-mtk1608重组载体的重组双歧杆菌对原发性实体瘤的治疗是有效的，且效果优于含有天然tk基因的重组双歧杆菌(pBES-tk)。

综上，与天然单纯疱疹病毒胸苷激酶相比，本发明单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体mtk1608对GCV代谢活性更高，对天然胸腺嘧啶核苷酸代谢活性更低，临床使用副作用更小，用于抑杀肿瘤的效果更佳；本发明含有单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体mtk1608基因片段的重组双歧杆菌(双歧杆菌-mTK1608)，与含有天然单纯疱疹病毒胸苷激酶基因片段的重组双歧杆菌相比，抑制肿瘤的效果更佳，临床应用前景良好。

Claims (10)

1.一种如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

2.一种重组载体，其特征在于：包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述的重组载体是重组pET32质粒或者重组pBES载体。

4.一种重组菌，其特征在于：它包含权利要求2或者3所述的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述的重组菌为重组大肠杆菌或者重组双歧杆菌。

6.一种单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体，其特征在于：它由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列编码。

7.根据权利要求6所述的单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

8.一种制备权利要求6或7所述单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体的方法，其特征在于：包含如下步骤：

ⅰ、取权利要求5中的重组大肠杆菌，接种到添加有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基上，37℃、250r/min摇床培养12h；

ⅱ、取步骤ⅰ的菌液按1：100的接种量转接至LA培养基中，37℃、200r/min摇床中培养，至OD₆₀₀值达到0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，37℃诱导表达5h；

ⅲ、离心，得菌体，裂解，取上清，分离纯化，即得。

9.权利要求1所述核苷酸序列、权利要求2或3所述重组载体、权利要求4或5所述重组菌、权利要求6或7所述单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体在制备治疗抗肿瘤药物中的用途。

10.一种抗肿瘤药物，其特征在于：它是以权利要求5中的重组双歧杆菌为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。