CN110101843A - 一种抗肿瘤蛋白质及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤药物组合物，其技术方案要点是包括有蛋白IL12、GMCSF和IL2，达到了对各个阶段肿瘤均有良好抑制作用且不良反应轻微的技术效果。

Description

一种抗肿瘤蛋白质及其应用
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物技术领域，特别涉及一种抗肿瘤蛋白组合物及其应用。
背景技术
肿瘤(tumor)是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物(neogrowth)，因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物(neoplasm)。
近年来，肿瘤治疗又出现了很多新方法，目前通用的有效治疗手段为放疗、化疗、手术治疗、免疫治疗等。但仍然存在放疗化疗不良反应严重，手术治疗风险大，免疫治疗对实体瘤效果不佳等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗肿瘤蛋白质组合物，具有以下优点：1)不良反应轻微；2) 对各种实体瘤都有较好的抑制作用，能缩小肿瘤，甚至使之消退；3)能较好地抑制恶性肿瘤的转移；4)通过现有技术水平能顺利实现。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种抗肿瘤药物组合物，包括有蛋白IL12、GMCSF和IL2。
通过上述技术方案，对多种实体瘤病患起到了很好的病情控制作用，部分病患甚至能达到完全缓解，治疗过程中对病患身体刺激小，不良反应轻微，大幅改善了病患生存质量。
较佳的，所述组合物中，IL12蛋白质：GMCSF蛋白质：IL2蛋白质的质量比 0.1-10:0.1-10:0.1-10。
较佳的，所述组合物中，IL12蛋白质：GMCSF蛋白质：IL2蛋白质的质量比 0.6-6:0.6-6:0.6-6。
较佳的，所述组合物中，IL12蛋白质：GMCSF蛋白质：IL2蛋白质的质量比为1:6:2。
本发明的目的二：一种多核苷酸组合，所述多核苷酸组合包括选自下列中的一种：
(a)编码具有权利要求1中所述蛋白质IL12、GMCSF和IL2；
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸组合。
本发明的目的三：一种重组载体组合，它是由权利要求5中所述多核苷酸组合中的每种多核苷酸分别与质粒、病毒、表达载体构建而成的重组载体。
本发明的目的四：一种遗传工程化宿主细胞组合，所述宿主细胞组合中的宿主细胞是选自于下列中的一种：(a)用权利要求6所述的重组载体转化或转导的宿主细胞；(b)用权利要求5所述多核苷酸组合转化或转导的宿主细胞。
本发明的目的五：一种抗肿瘤药物，包括如权利要求1-4任意一项所述的抗肿瘤药物组合物、或如权利要求5所述的多核苷酸组合、或如权利要求6所述的重组载体组合、或如权利要求7所述的宿主细胞组合以及药学上可接受的载体或缓冲液或添加剂或赋形剂或佐剂。
本发明的目的六:一种如权利要求1-4任意一项所述的抗肿瘤药物组合物、或如权利要求5所述的多核苷酸组合、或如权利要求6所述的重组载体组合、或如权利要求7所述的宿主细胞组合、或如权利要求8所述的抗肿瘤药物在治疗哺乳动物肿瘤药物领域的应用。
较佳的，所述哺乳动物包括有除人类之外的灵长目、袋鼠目、食肉目、奇蹄目、偶蹄目、啮齿目、兔形目。
较佳的，所述肿瘤包括有黑素瘤、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、口腔癌、鼻咽癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统的赘生物、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤。
本发明的目的七：一种如权利要求1-4任意一项所述的抗肿瘤药物组合物、或如权利要求5所述的多核苷酸组合、或如权利要求6所述的重组载体组合、或如权利要求7所述的宿主细胞组合、或如权利要求8所述的抗肿瘤药物，将所述物质注射入动物患处或通过靶向载体经静脉注射导入肿瘤患处。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1)不良反应轻微，常见为一过性发热；
2)对各种实体瘤都有较好的抑制作用，能缩小肿瘤，甚至使之消退；
3)能较好地抑制恶性肿瘤的转移；
4)很大程度上改善病患的生存质量。
具体实施方式
以下对本发明作进一步详细说明。
试剂：DMEM培养基，1640培养基，胎牛血清购自lifetechnologies公司；CDM4HEK293 无血清培养基购于Thermo公司；细胞培养瓶，培养板购自Corning公司；Puromycin购自Chemicon公司；限制性内切酶购自Takara和NEB公司；连接酶购自NEB公司；DNA聚合酶购自Takara公司；质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒购自OmegaBiotech公司；引物合成由上海生工生物工程有限公司完成；基因合成和测序由lifetechnologies公司完成。IL12，IL2 ELISA试剂盒购于Thermo公司；GMCSFELISA试剂盒购于Sigma公司；壳聚糖(ProtosanG 213)购于NovaMatrix公司。重组犬IL12,GMCSF,IL2蛋白，重组猫IL12,GMCSF,IL2蛋白购于NovusBiologicals公司。
实施例1IL12表达细胞构建
合成犬IL12基因的编码区，包含IL12α(Genbank编号：NM_001003293)和IL12β(Genbank编号：NM_001003292)两个亚基，中间用T2A序列进行连接，合成的基因两端分别带有BamHI和XhoI酶切位点，然后用BamHI和XhoI进行酶切，体系如下：IL12质粒5μg，酶切缓冲液4μL，BamHI1μL，XhoI1μL，加水至总体积40μL，37℃静置12小时。取出EP管，加入 4.4μL10×上样缓冲液，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收IL12基因片段，待用。
酶切表达载体pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO，体系如下：质粒2μg，酶切缓冲液3μL，BamHI1μL，XhoI1μL，加水至总体积30μL，37℃静置12小时。取出EP管，加入3.3μL10 ×上样缓冲液，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收载体片段，待用。
连接pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO和IL12，体系如下： pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO2μL，IL122μL，连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶0.5μL，水4.5μL。置于室温连接4小时。然后将连接体系进行大肠杆菌感受态的转化。第二天从转化的平板上挑取菌落，置于LB培养基中37度摇床内过夜培养，使用质粒提取试剂盒从培养的细菌中提取质粒，通过酶切鉴定片段是否成功连入载体中，然后将正确的载体送测序，确定构建成功，表达载体为pLentis-CMV-IL12-PGK-PURO。
制备调控载体的病毒，方法如下：1.消化培养的293FT细胞，计数后将3×106细胞/孔铺入10-cm培养皿中，培养液体积为10ml。2.第二天晚上，观察细胞状态，如果细胞状态好，进行转染。在培养板中加入氯喹至终浓度25μm，取一只试管，加入灭菌水及以下质粒(pMD2.G5μg+pSPAX215μg+pLentis-CMV-IL12-PGK-PURO20μg)，总体积为1045μL，然后加入2MCaCl2155μL，混匀，最后再加入1200μL2×HBS，边滴加边振荡，滴加完毕后，迅速将混合物加入到细胞培养孔中，轻轻摇晃混匀。3.第三天早上，观察细胞状态，将培养基换为10ml新鲜DMEM培养基。4.第五天早上，观察细胞状态，并收集培养皿中的上清，用0.45μm滤器过滤，然后置于高速离心管中，50000g离心2小时，小心弃去上清，尽量用吸水纸吸干液体，然后用500μLHBSS重悬沉淀，溶解2小时后分装成小管，-70℃保存。
使用病毒转染293细胞，方法如下：消化培养的293细胞，按105细胞/孔接种到6孔板中，培养体积为1ml，24小时后，加入调控载体病毒10μL，在培养箱内继续培养24小时后，弃去上清，换为新鲜的培养基继续培养，待细胞长满后，将其传出到培养瓶中，按适合此细胞的浓度加入puromycin，继续培养，每两天更换一次培养基，并保持puromycin的浓度为3μg/ml，筛选一周后，存活的细胞即为稳定表达调控蛋白的细胞，命名为293(IL12)。
实施例2GMCSF表达细胞构建
合成犬GMCSF(Genbank编号：NM_001003245)基因的编码区，合成的基因两端分别带有BamHI和XhoI酶切位点，然后用BamHI和XhoI进行酶切，体系如下：GMCSF质粒5μg，酶切缓冲液4μL，BamHI1μL，XhoI1μL，加水至总体积40μL，37℃静置12小时。取出EP 管，加入4.4μL10×上样缓冲液，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收GMCSF基因片段，待用。
酶切表达载体pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO，体系如下：质粒2μg，酶切缓冲液3μL，BamHI1μL，XhoI1μL，加水至总体积30μL，37℃静置12小时。取出EP管，加入3.3μL10 ×上样缓冲液，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收载体片段，待用。
连接pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO和GMCSF，体系如下： pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO2μL，GMCSF2μL，连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶 0.5μL，水4.5μL。置于室温连接4小时。然后将连接体系进行大肠杆菌感受态的转化。第二天从转化的平板上挑取菌落，置于LB培养基中37度摇床内过夜培养，使用质粒提取试剂盒从培养的细菌中提取质粒，通过酶切鉴定片段是否成功连入载体中，然后将正确的载体送测序，确定构建成功，表达载体为pLentis-CMV-GMCSF-PGK-PURO。
制备调控载体的病毒，方法如下：1.消化培养的293FT细胞，计数后将3×106细胞/孔铺入10-cm培养皿中，培养液体积为10ml。2.第二天晚上，观察细胞状态，如果细胞状态好，进行转染。在培养板中加入氯喹至终浓度25μm，取一只试管，加入灭菌水及以下质粒(pMD2.G5μg+pSPAX215μg+pLentis-CMV-GMCSF-PGK-PURO20μg)，总体积为1045 μL，然后加入2MCaCl2155μL，混匀，最后再加入1200μL2×HBS，边滴加边振荡，滴加完毕后，迅速将混合物加入到细胞培养孔中，轻轻摇晃混匀。3.第三天早上，观察细胞状态，将培养基换为10ml新鲜DMEM培养基。4.第五天早上，观察细胞状态，并收集培养皿中的上清，用0.45μm滤器过滤，然后置于高速离心管中，50000g离心2小时，小心弃去上清，尽量用吸水纸吸干液体，然后用500μLHBSS重悬沉淀，溶解2小时后分装成小管，-70℃保存。
使用病毒转染293细胞，方法如下：消化培养的293细胞，按105细胞/孔接种到6孔板中，培养体积为1ml，24小时后，加入调控载体病毒10μL，在培养箱内继续培养24小时后，弃去上清，换为新鲜的培养基继续培养，待细胞长满后，将其传出到培养瓶中，按适合此细胞的浓度加入puromycin，继续培养，每两天更换一次培养基，并保持puromycin的浓度为3μg/ml，筛选一周后，存活的细胞即为稳定表达调控蛋白的细胞，命名为293(GMCSF)。
实施例3IL2表达细胞构建
合成犬IL2(Genbank编号：NM_001003305)基因的编码区，合成的基因两端分别带有BamHI 和XhoI酶切位点，然后用BamHI和XhoI进行酶切，体系如下：IL2质粒5μg，酶切缓冲液4μL，BamHI1μL，XhoI1μL，加水至总体积40μL，37℃静置12小时。取出EP管，加入4.4 μL10×上样缓冲液，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收IL2基因片段，待用。
酶切表达载体pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO，体系如下：质粒2μg，酶切缓冲液3μL，BamHI1μL，XhoI1μL，加水至总体积30μL，37℃静置12小时。取出EP管，加入3.3μL10 ×上样缓冲液，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收载体片段，待用。
连接pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO和IL2，体系如下：pLentis-CMV-MCS-IRES-PURO2μL，IL22μL，连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶0.5μL，水4.5μL。置于室温连接4小时。然后将连接体系进行大肠杆菌感受态的转化。第二天从转化的平板上挑取菌落，置于LB 培养基中37度摇床内过夜培养，使用质粒提取试剂盒从培养的细菌中提取质粒，通过酶切鉴定片段是否成功连入载体中，然后将正确的载体送测序，确定构建成功，表达载体为 pLentis-CMV-IL2-PGK-PURO。
制备调控载体的病毒，方法如下：1.消化培养的293FT细胞，计数后将3×106细胞/孔铺入10-cm培养皿中，培养液体积为10ml。2.第二天晚上，观察细胞状态，如果细胞状态好，进行转染。在培养板中加入氯喹至终浓度25μm，取一只试管，加入灭菌水及以下质粒(pMD2.G5μg+pSPAX215μg+pLentis-CMV-IL2-PGK-PURO20μg)，总体积为1045μL，然后加入2MCaCl2155μL，混匀，最后再加入1200μL2×HBS，边滴加边振荡，滴加完毕后，迅速将混合物加入到细胞培养孔中，轻轻摇晃混匀。3.第三天早上，观察细胞状态，将培养基换为10ml新鲜DMEM培养基。4.第五天早上，观察细胞状态，并收集培养皿中的上清，用0.45μm滤器过滤，然后置于高速离心管中，50000g离心2小时，小心弃去上清，尽量用吸水纸吸干液体，然后用500μLHBSS重悬沉淀，溶解2小时后分装成小管，-70℃保存。
使用病毒转染293细胞，方法如下：消化培养的293细胞，按105细胞/孔接种到6孔板中，培养体积为1ml，24小时后，加入调控载体病毒10μL，在培养箱内继续培养24小时后，弃去上清，换为新鲜的培养基继续培养，待细胞长满后，将其传出到培养瓶中，按适合此细胞的浓度加入puromycin，继续培养，每两天更换一次培养基，并保持puromycin的浓度为3μg/ml，筛选一周后，存活的细胞即为稳定表达调控蛋白的细胞，命名为293(IL2)。
实施例4蛋白溶液制备
将培养的293(IL12)，293(GMCSF)和293(IL2)细胞分别传到15cm培养皿中，培养体积25ml完全培养基，待细胞密度达到90％以上，将培养基换为25mlCDM4HEK293无血清培养基，继续培养96小时。收集上清，1000rpm离心10分钟以后，用0.22μm滤器过滤，过滤后的溶液用AmiconμLtra-15超滤管进行浓缩，浓缩体积20倍。浓缩后的溶液用ELISA试剂盒检测溶液中目的蛋白浓度，IL12为100ng/μL，GMCSF为600ng/μL，IL2为200ng/μL。
实施例5犬肿瘤治疗1
雄性混种犬，9岁，左侧口腔上颚牙龈外侧肉瘤2个，靠前肿瘤为25mm*15mm，靠后的肿瘤为30mm*20mm。如表1所示，经一次用药后，靠前瘤体消退，靠后瘤体面积减小70％；用药后8小时出现一过性发热，体温升高1℃，3小时后体温回复正常，之后一切体征正常。
预先配置3％的无菌壳聚糖溶液，备用。按肿瘤面积大小准备注射药物用量，总用量为1μL/mm2肿瘤。对于约900mm2的肿瘤，注射量为900μL，其中包括1/6体积的IL12溶液，1/6体积的GMCSF溶液，1/6体积的IL2溶液和1/2体积的3％壳聚糖溶液。配制时，取 150μLIL12溶液，150μLGMCSF溶液和150μLIL2溶液，混匀，然后加入450μL3％壳聚糖溶液，缓慢吹打混匀，避免气泡。将犬麻醉以后，缓慢注射配置的药物溶液到肿瘤内部，注意监测犬的生理状态。
表1为实施例5中注射药物后的肿瘤尺寸表。
时间(天) 0 7 14 21 28 35
前端肿瘤(mm) 25*15 10*6 0 0 0 0
后端肿瘤(mm) 30*20 25*15 20*15 15*10 15*10 15*10
实施例6犬肿瘤治疗2
犬类，松狮，11岁，雄性，口腔黑色素瘤，2处病灶，下颌牙龈内侧40*30mm，下颌牙龈外侧30*25mm。如表2所示，牙龈内外两侧的瘤体分别注射一次药物组合后，内侧瘤体消退，外侧瘤体从根部脱落。用药后未发现发热或其它不良反应。
将IL12和IL2溶液进一步超滤浓缩到300ng/μL，将GMCSF溶液稀释到300ng/μL。然后按IL12:GMCSF:IL2:3％壳聚糖＝1:1:1:3配置注射药物，注射总量为1μL/mm2肿瘤。对于约900mm2的肿瘤，注射量为900μL，包含IL1245μg，GMCSF45μg和IL245μg。将犬麻醉以后，缓慢注射配置的药物溶液到肿瘤内部，注意监测犬的生理状态。
表2为实施例6中注射药物后的肿瘤尺寸表。
实施例7犬肿瘤治疗3
雌性混种犬，15岁，左侧第三乳区乳腺癌，瘤体尺寸55mm*43mm。如表3所示，经一次瘤内注射后，瘤体面积减小60％。用药后8小时出现发热，体温最高升高2℃，发热持续18小时，之后体温恢复正常，生活及体征正常，未观察到其它不良反应。
将购买的重组犬IL12用无菌去离子水稀释到60ng/μL，将购买的重组犬GMCSF用无菌去离子水稀释到600ng/μL，将购买的重组犬IL2用无菌去离子水稀释到600ng/μL，然后按IL12:GMCSF:IL2:3％壳聚糖＝1:1:1:3配置注射药物，注射总量为1μL/mm2肿瘤。对于约900mm2的肿瘤，注射量为900μL，包含IL129μg，GMCSF90μg和IL290μg。将犬麻醉以后，缓慢注射配置的药物溶液到肿瘤内部，注意监测犬的生理状态。记录肿瘤大小变化情况，评估疗效。
表3为实施例7中注射药物后的肿瘤尺寸表。
实施例8犬肿瘤治疗4
混种雌性犬，10岁，左前腿间质肉瘤，35mm*35mm*40mm。如表4所示，经一次瘤内注射后，瘤体面积减小60％。瘤体体积减小约50％。用药后10小时出现体温升高，最高升高1.5℃，持续8小时后体温恢复正常。未观察到其它不良反应。
将购买的重组犬IL12用无菌去离子水稀释到300ng/μL，将购买的重组犬GMCSF用无菌去离子水稀释到60ng/μL，将购买的重组犬IL2用无菌去离子水稀释到6000ng/μL，然后按IL12:GMCSF:IL2:3％壳聚糖＝1:1:1:3配置注射药物，注射总量为1μL/mm2肿瘤。对于约900 mm2的肿瘤，注射量为900μL，包含IL1245μg，GMCSF9μg和IL2900μg。将犬麻醉以后，缓慢注射配置的药物溶液到肿瘤内部，注意监测犬的生理状态。记录肿瘤大小变化情况，评估疗效。
表4为实施例8中注射药物后的肿瘤尺寸表。
实施例9猫肿瘤治疗1
雌性中国狸花猫，9岁，乳腺癌，长径21mm。如表5所示，经一次瘤内注射后，瘤体消退。用药后未观察到发热或其它不良反应。
将购买的重组猫IL12,GMCSF和IL2用无菌去离子水稀释到200ng/μL，然后按IL12:GMCSF:IL2:3％壳聚糖＝1:1:1:3配置注射药物，注射总量为1μL/mm2肿瘤。对于约900mm2的肿瘤，注射量为900μL，包含IL1230μg，GMCSF30μg和IL230μg。将猫麻醉以后，缓慢注射配置的药物溶液到肿瘤内部，注意监测猫的生理状态。记录肿瘤大小变化情况，评估疗效。
表5为实施例9中注射药物后的肿瘤尺寸表。
通过动物实验观察，经过注射后的动物肿瘤患处会发生充血现象，继而产生化脓反应，并最终让肿瘤组织从动物身体上脱落或缩小。这是由于本药物组合物激发了患病动物免疫系统对肿瘤细胞的识别和杀伤活性，使恶性肿瘤得到抑制，进而使瘤体缩小甚至消退。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
序列表
<110> 北京科诺科服生物科技有限公司
<120> 一种抗肿瘤蛋白及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 197
<212> PRT
<213> 犬(Canis familiaris)
<400> 1
Arg Ser Leu Pro Thr Ala Ser Pro Ser Pro Gly Ile Phe Gln Cys Leu
1 5 10 15
Asn His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Thr Leu Gln Lys
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Ala Arg Gln Thr Leu Glu Leu Tyr Ser Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp
35 40 45
His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu
50 55 60
Pro Leu Glu Leu Thr Met Asn Glu Ser Cys Leu Ala Ser Arg Glu Ile
65 70 75 80
Ser Leu Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Gly Lys Ala Ser Phe
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Met Thr Val Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr
100 105 110
Gln Met Glu Phe Lys Ala Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys
115 120 125
Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Thr Ala Ile Asp Glu Leu
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Leu Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Val Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser
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Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu
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Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Met Met Ser
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<210> 2
<211> 307
<212> PRT
<213> 犬(Canis familiaris)
<400> 2
Ile Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp His
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Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys His Thr Pro Glu
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Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Ala Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly
35 40 45
Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly
50 55 60
Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Lys Val Leu Ser Arg Ser Leu Leu
65 70 75 80
Leu Ile His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys
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Glu Gln Lys Glu Ser Lys Asn Lys Ile Phe Leu Lys Cys Glu Ala Lys
100 105 110
Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Ala Ile Ser Thr
115 120 125
Asp Leu Lys Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Phe Ser Asp Pro Gln
130 135 140
Gly Val Thr Cys Gly Ala Val Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Val
145 150 155 160
Asp Asn Arg Asp Tyr Lys Lys Tyr Thr Val Glu Cys Gln Glu Gly Ser
165 170 175
Ala Cys Pro Ser Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Val Val Asp
180 185 190
Ala Ile His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile
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Leu Lys Asn Ser Arg His Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr
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Ala Arg Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Asp Trp Ala Ser Val
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<210> 3
<211> 127
<212> PRT
<213> 犬(Canis familiaris)
<400> 3
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Asp Ala Ile Gln Glu Ala Leu Ser Leu Leu Asn Asn Ser Asn Asp Val
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Thr Ala Val Met Asn Lys Ala Val Lys Val Val Ser Glu Val Phe Asp
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<210> 4
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<212> PRT
<213> 犬(Canis familiaris)
<400> 4
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Gln Leu Leu Leu Asp Leu Gln Leu Leu Leu Asn Gly Val Asn Asn Tyr
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Lys Lys Ala Thr Glu Phe Thr His Leu Gln Cys Leu Ala Glu Glu Leu
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<212> PRT
<213> 猫(Felis catus)
<400> 5
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<212> PRT
<213> 猫(Felis catus)
<400> 6
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Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Gly Val Gln Val
245 250 255
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260 265 270
Thr Ser Ala Lys Val Val Cys His Lys Asp Ala Lys Ile Arg Val Gln
275 280 285
Ala Arg Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Asn Trp Ala Ser Val
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305
<210> 7
<211> 127
<212> PRT
<213> 猫(Felis catus)
<400> 7
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<210> 8
<211> 134
<212> PRT
<213> 猫(Felis catus)
<400> 8
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Leu Leu Leu Asp Leu Arg Leu Leu Leu Asn Gly Val Asn Asn Pro Glu
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Lys Ala Thr Glu Leu Thr His Leu Gln Cys Leu Val Glu Glu Leu Lys
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Asn His Ile Lys Glu Leu Met Ser Asn Ile Asn Val Thr Val Leu Lys
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Leu Lys Gly Ser Glu Thr Arg Phe Thr Cys Asn Tyr Asp Asp Glu Thr
100 105 110
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Lys Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser
115 120 125
Ile Phe Ser Thr Leu Thr
130

Claims (12)

1.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于：包括有蛋白IL12、GMCSF和IL2。
2.根据如权利要求1所述的一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于：
所述组合物中，IL12蛋白质：GMCSF蛋白质：IL2蛋白质的质量比0.1-10:0.1-10:0.1-10。
3.根据如权利要求2所述的一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于：
所述组合物中，IL12蛋白质：GMCSF蛋白质：IL2蛋白质的质量比0.6-6:0.6-6:0.6-6。
4.根据如权利要求3所述的一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于：
所述组合物中，IL12蛋白质：GMCSF蛋白质：IL2蛋白质的质量比为1:6:2。
5.一种多核苷酸组合，其特征在于：所述多核苷酸组合包括选自下列中的一种：
（a）编码具有权利要求1中所述蛋白质IL12、GMCSF和IL2；
（b）与多核苷酸（a）互补的多核苷酸组合。
6.一种重组载体组合，其特征在于：它是由权利要求5中所述多核苷酸组合中的每种多核苷酸分别与质粒、病毒、表达载体构建而成的重组载体。
7.一种遗传工程化宿主细胞组合，其特征在于：所述宿主细胞组合中的宿主细胞是选自于下列中的一种：(a)用权利要求6所述的重组载体转化或转导的宿主细胞；(b)用权利要求5所述多核苷酸组合转化或转导的宿主细胞。
8.一种抗肿瘤药物，其特征在于：包括如权利要求1-4任意一项所述的抗肿瘤药物组合物、或如权利要求5所述的多核苷酸组合、或如权利要求6所述的重组载体组合、或如权利要求7所述的宿主细胞组合以及药学上可接受的载体或缓冲液或添加剂或赋形剂或佐剂。
9.一种如权利要求1-4任意一项所述的抗肿瘤药物组合物、或如权利要求5所述的多核苷酸组合、或如权利要求6所述的重组载体组合、或如权利要求7所述的宿主细胞组合、或如权利要求8所述的抗肿瘤药物在治疗哺乳动物肿瘤药物领域的应用。
10.根据权利要求9所述的一种如权利要求1-4任意一项所述的抗肿瘤药物组合物、或如权利要求5所述的多核苷酸组合、或如权利要求6所述的重组载体组合、或如权利要求7所述的宿主细胞组合、或如权利要求8所述的抗肿瘤药物在治疗哺乳动物肿瘤药物领域的应用，其特征在于：所述哺乳动物包括有袋鼠目、食肉目、奇蹄目、偶蹄目、啮齿目、兔形目。
11.根据权利要求10所述的一种如权利要求1-4任意一项所述的抗肿瘤药物组合物、或如权利要求5所述的多核苷酸组合、或如权利要求6所述的重组载体组合、或如权利要求7所述的宿主细胞组合、或如权利要求8所述的抗肿瘤药物在治疗哺乳动物肿瘤药物领域的应用，其特征在于：所述肿瘤包括有黑素瘤、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、口腔癌、鼻咽癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统的赘生物、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤。
12.一种如权利要求1-4任意一项所述的抗肿瘤药物组合物、或如权利要求5所述的多核苷酸组合、或如权利要求6所述的重组载体组合、或如权利要求7所述的宿主细胞组合、或如权利要求8所述的抗肿瘤药物，其特征在于：将所述物质注射入动物患处或通过靶向载体经静脉注射导入肿瘤患处。
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