CN108330135A - 修饰间充质干细胞的融合基因、具有该融合基因的质粒、慢病毒颗粒、干细胞及应用 - Google Patents

修饰间充质干细胞的融合基因、具有该融合基因的质粒、慢病毒颗粒、干细胞及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了修饰间充质干细胞的融合基因、具有该融合基因的质粒、慢病毒颗粒、干细胞及应用，该融合基因包含编码分泌信号蛋白的核酸人工序列，编码肺表面活性物质蛋白D的核酸人工序列，编码人源化肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的核酸人工序列，编码自剪切多肽的核酸人工序列，编码Tat蛋白的核酸人工序列，编码单纯疱疹病毒胸苷激酶的核酸人工序列；且以上核酸人工序列顺序依次串联。本发明构建了共同表达TRAIL和HSV‑TK的载体，产生双重的杀伤肿瘤效果。

Description

修饰间充质干细胞的融合基因、具有该融合基因的质粒、慢病 毒颗粒、干细胞及应用
技术领域
本发明涉及基因技术领域，尤其涉及一种修饰间充质干细胞的融合基因、质粒、干细胞及应用。
背景技术
当今癌症成为一种常见的疾病，生存期通常少于5年。手术、放疗和化疗是目前肿瘤治疗的主要手段。能深入瘤内杀伤肿瘤细胞且对正常细胞损伤较小的药物是理想的化疗药物。然而大多数传统的化疗药物对细胞的杀伤缺乏选择性，对机体的毒副作用大。随着对肿瘤发生、发展分子机制的深入研究，开发一种新型的高效药物成为必然。
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)存在于几乎所有的组织中，并且已从骨髓、脂肪组织、脐带、胎盘和羊膜液中分离出来。MSCs不仅具有强大的自我更新能力和多向分化潜能，还具有免疫调控能力和低的免疫原性等特性，被广泛应用于治疗各种类型的疾病，促进组织再生。此外，间充质干细胞具有专门跟踪和迁移到体内肿瘤部位的特性，最近已经成为抗癌药物的靶向载体(Aboody et al,PNAS,97；12846,2000)。根据干细胞的这一特性，许多研究都针对转移瘤进行了靶向治疗。
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor–related apoptosisinducing ligand，TRAIL)是肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)超家族的成员，是Ⅱ型跨膜蛋白。众所周知，TRAIL可以诱导肿瘤细胞的选择性凋亡(Wiley et al,Immu,3(6)；673-682,1995)。TRAIL可以在不同的癌细胞株中产生细胞毒性而不损伤健康组织(Ashkenazi et al,J,Clinical Investigation；104:155-162,1999)。正常细胞表面高表达TRAIL诱骗受体DcR1和DcR2，低表达死亡受体DR4和DR5，TRAIL能与诱骗受体DcR1和DcR2结合，但不传递死亡信号(Sheridan et al.,Science,277:818-821,1997)。死亡受体DR4和DR5在肿瘤细胞表面高表达，TRAIL与死亡受体DR4和DR5结合传递死亡信号，诱导肿瘤细胞凋亡。因此，TRAIL在高效杀伤肿瘤细胞的同时，对多数正常细胞表现无毒或低毒，具有较强的肿瘤细胞杀伤选择性，是极具潜力的新型抗肿瘤药物。
单独的TRAIL在诱导肿瘤细胞凋亡能力被认为是温和的，在治疗癌症上取得了有限的临床成功(Loe-binger et al.,cancer research,69；4134,2009；Miletic et al,Molecular ther,15；1373,2007)。但是，TRAIL蛋白要分泌到细胞表面才能发挥作用，由于它自身缺乏分泌信号序列，所以需要寻找合适的分泌信号肽。HSV-TK自杀基因是在细胞内部发挥作用，如何连接TRAIL与HSV-TK不影响抗癌效果，如何提高基因的转录效率等问题需要解决，寻找高效的抗癌药物成为本发明得以完成的动力。
发明内容
为了克服上述所指出的现有技术的缺陷，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，从而完成了本发明。
具体而言，本发明所要解决的技术问题是：提供修饰间充质干细胞的融合基因、质粒、干细胞及应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
第一方面，本发明提供了修饰间充质干细胞的融合基因，包含
编码分泌信号蛋白的核酸人工序列，
编码肺表面活性物质蛋白D(pulmonary surfactant protein–D,SPD)的核酸人工序列，
编码人源化肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(homo sapiens tumor necrosisfactor–related apoptosis inducing ligand,hTRAIL)的核酸人工序列，
编码自剪切多肽(cleavable peptide,T2A)的核酸人工序列，
编码Tat蛋白(HIV-1Tat,penetratin)的核酸人工序列，
编码单纯疱疹病毒胸苷激酶(Herpes simplex virus-thymidine kinase,HSV-TK)的核酸人工序列，
且以上核酸人工序列顺序依次串联。
本发明中，由于hTRAIL自身缺乏分泌信号序列，本发明中添加分泌信号序列帮助hTRAIL分泌到细胞外，使hTRAIL在细胞表面发挥作用。作为一种优选的技术方案，所述编码分泌信号蛋白的基因序列选自编码tPA、HSV、SEC分子其中之一的核酸人工序列。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述编码tPA信号肽的核酸人工序列为SEQID NO.2；
编码肺表面活性物质蛋白D(pulmonary surfactant protein–D,SPD)的核酸人工序列为SEQ ID NO.3；
编码人源化肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(homo sapiens tumor necrosisfactor–related apoptosis inducing ligand,hTRAIL)的核酸人工序列为SEQ ID NO.4；
编码自剪切多肽(cleavable peptide,T2A)的核酸人工序列为SEQ ID NO.5；
编码Tat蛋白(HIV-1Tat,penetratin)的核酸人工序列为SEQ ID NO.6；
编码单纯疱疹病毒胸苷激酶(Herpes simplex virus-thymidine kinase,HSV-TK)的核酸人工序列为SEQ ID NO.7。
编码HSV信号肽的核酸人工序列为SEQ ID NO.8；
编码SEC信号肽的核酸人工序列为SEQ ID NO.9；
编码IRES蛋白(Internal ribosome entry site，IRES)的核酸人工序列为SEQ IDNO.10。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述融合基因的核酸序列为SEQ ID NO.1。
第二方面，本发明提供了质粒，该质粒具有如上所述的修饰间充质干细胞的融合基因。
作为一种优选的技术方案，所述质粒是将如上所述的融合基因插入pLent-C-GFP载体内，转化到E.coli，经测序正确后，提取并纯化得到的重组表达载体质粒。
第三方面，本发明提供了慢病毒颗粒，该慢病毒颗粒具有如上所述的融合基因。
作为一种优选的技术方案，所述慢病毒颗粒采用包括如下步骤的制备方法得到：
将LipoFiterTM脂质体转染试剂混匀，将LipoFiterTM溶于DMEM培养基中，静置半小时；
pLent-hTRAIL-HSV-TK(如上得到的重组表达载体质粒)和辅助质粒psPAX2、pMDNA2G三种质粒以4:3:1的比例混合，将混合质粒溶解于DMEM培养基中，静置半小时；
将以上两步中含有混合质粒DNA和LipoFiterTM的DMEM培养基混匀，得到LipoFiterTM-DNA混合培养基，静置半个小时；
复苏293T细胞，在细胞培养皿上培养，待状态良好时进行如下操作：将LipoFiterTM-DNA混合培养基加入细胞培养皿上，孵育6h，去除LipoFiterTM-DNA培养基，加入DMEM新鲜培养基继续培养；
将含有病毒的细胞培养上清液吸入EP管中，离心，转移至新的EP管中，过滤后-80℃保存，得到慢病毒颗粒。
第四方面，本发明提供了干细胞，所述干细胞包含如上所述的修饰间充质干细胞的融合基因。
作为一种优选的技术方案，所述干细胞为从新生儿的脐带中分离的华氏胶组织，经过UltraCULTURE培养基培养，得到的P4代细胞。
作为一种优选的技术方案，所述干细胞采用包括如下步骤的制备方法得到：
用上述的含有hTRAIL-HSV-TK融合基因的慢病毒颗粒加入终浓度为8μg/ml的聚凝胺，用该病毒液重悬传代收获的间充质干细胞，感染得到具有如上所述融合基因的间充质干细胞。
第五方面，本发明提供的修饰间充质干细胞的融合基因hTRAIL-HSV-TK，能够应用于制备治疗肿瘤药物。尤其是该药物用于治疗实体瘤。
其药物形式包括将含有融合基因hTRAIL-HSV-TK的间充质干细胞制备成静脉注射液。
本发明中经基因修饰后的脐带间充质干细胞，每次所用间充质干细胞的数量为5×105～10×105/Kg。每次间隔2周以上，可以连续使用3次。输注间充质干细胞24h后给药更昔洛韦，使用药量为每天5-15mg/kg，持续2-3周。前2-3天使用更昔洛韦时可以每天两次5-15mg/kg的药量，后面每天一次。
采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：
hTRAIL蛋白发挥作用需要有其必备的空间结构，本发明中添加了SPD蛋白保证空间结构的完善。SPD蛋白发现于肺表面活性剂，它可以防御任何侵害肺的病原物。它可以形成类似三螺旋的卷曲螺旋结构，帮助蛋白折叠形成三聚体。
hTRAIL和HSV-TK两者发挥作用的地点不同，hTRAIL在细胞表面发挥作用，而HSV-TK在细胞内部发挥作用。利用自剪切多肽T2A连接hTRAIL和HSV-TK，在转入干细胞后正常表达，且表达水平不受影响，同时不影响HSV-TK和hTRAIL分别在细胞内外发挥作用。也可以用IRES蛋白代替T2A。Tat蛋白是由HIV-1的tat基因编码的，包含一个细胞穿梭肽的蛋白转导结构域，可极大的提高转录效率。Tat结合了高亲和性的磷脂酰肌醇二磷酸，可横穿细胞膜内外。
本发明所用的宿主细胞为脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)。MSC是属于中胚层的一类多能干细胞，主要来源于结缔组织。本发明中主要是从脐带中获取，成为脐带间充质干细胞。MSC具有以下优势：(1)具有自我更新和复制能力(2)具有跨胚层分化能力(3)具有免疫调节功能(4)能够分泌多种细胞因子(5)能够体外扩增(6)具有组织损伤趋向性。
本发明同时添加了自杀基因HSV-TK(herpes simplex virus-thymidinekinase)。HSV-TK可使更昔洛韦三磷酸化，从而阻断DNA合成，导致细胞凋亡。HSV-TK的添加既可以增加肿瘤细胞的凋亡，也对MSC自身起到预防作用；在此基础上，本发明构建了共同表达TRAIL和HSV-TK的载体，产生双重的杀伤肿瘤效果。
附图说明
图1为本发明所述的hTRAIL-HSV-TK融合基因结构示意图；
图2为本发明中hTRAIL-HSV-TK DNA片段(左)和线性化的pLent-C-GFP DNA(右)片段电泳图；
图3是本发明脐带间充质干细胞显微镜下视野图；
图4是本发明流式细胞术检测pLent-hTRAIL-HSV-TK感染间充质干细胞的效率图(左为散点图，右为峰值图)；
图5是本发明中pLent-hTRAIL-HSV-TK修饰的间充质干细胞联合更昔洛韦的杀伤实验结果图。在E：T为1：1时，hTRAIL-HSV-TK融合基因修饰的间充质干细胞联合更昔洛韦对OVCAR3细胞的杀伤效率为93.12±5.34％高于未加更昔洛韦TRAIL-HSV-TK融合基因修饰的间充质干细胞，明显高于pLent-C-GFP修饰的间充质干细胞和正常的间充质干细胞。
图6为本发明不同信号肽修饰的间充质干细胞的杀伤实验结果图。在E：T为1：1时，tPA-hTRAIL-HSV-TK修饰的间充质干细胞对OVCAR3细胞的杀伤效率为77.21±4.23％明显高于HSV-hTRAIL-HSV-TK和SEC-hTRAIL-HSV-TK分别修饰的间充质干细胞。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
实施例1
一种修饰间充质干细胞的融合基因hTRAIL-HSV-TK，包含编码分泌信号蛋白的核酸人工序列，编码肺表面活性物质蛋白D(pulmonary surfactant protein–D,SPD)的核酸人工序列，编码人源化肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(homo sapiens tumor necrosisfactor–related apoptosis inducing ligand,hTRAIL)的核酸人工序列，编码自剪切多肽(cleavable peptide,T2A)的核酸人工序列，编码Tat蛋白(HIV-1Tat,penetratin)的核酸人工序列，编码单纯疱疹病毒胸苷激酶(Herpes simplex virus-thymidine kinase,HSV-TK)的核酸人工序列；且以上核酸人工序列顺序依次串联。其中，所述编码分泌信号蛋白的基因序列选自编码tPA、HSV、SEC分子其中之一的核酸人工序列。
本实施例中，选择tPA作为编码分泌信号蛋白的基因序列。
该融合基因的核酸序列为SEQ ID NO.1。如图1所示，所述融合基因由tPA、SPD、hTRAIL、T2A、Tat、HSV-TK依次串联构成；其中，所述tPA的核酸人工序列为SEQ ID NO.2；所述SPD的核酸人工序列为SEQ ID NO.3；所述hTRAIL核酸人工序列为SEQ ID NO.4；所述自剪切多肽T2A核酸人工序列为SEQ ID NO.5；所述Tat核酸人工序列为SEQ ID NO.6；所述HSV-TK核酸人工序列为SEQ ID NO.7；所述HSV核酸人工序列为SEQ ID NO.8；所述SEC核酸人工序列为SEQ ID NO.9；所述IRES蛋白的核酸人工序列为SEQ ID NO.10。
实施例2
本实施例也是以tPA分泌信号肽为例进行说明，当采用HSV、SEC中其他的任一个时，其制备方法基本相同，在此不做过多赘述。
修饰间充质干细胞的融合基因hTRAIL-HSV-TK的制备方法，包括如下步骤：
(1)分别按tPA核酸人工序列、SPD核酸人工序列、hTRAIL核酸人工序列、T2A核酸人工序列、Tat核酸人工序列、HSV-TK核酸人工序列合成其整个表达框并插入标准载体pUC57上得到pUC57-hTRAIL-HSV-TK；
(2)将pUC57-hTRAIL-HSV-TK进行双酶切，利用琼胶电泳将含有hTRAIL-HSV-TKDNA片段琼胶部位切下，利用DNA extraction kit溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的hTRAIL-HSV-TK DNA片段，即本发明所述的修饰间充质干细胞的融合基因hTRAIL-HSV-TK。
更详细的来讲，本实施例提供的修饰间充质干细胞的融合基因hTRAIL-HSV-TK的制备方法，包括如下步骤：
分别按tPA核酸人工序列、SPD核酸人工序列、hTRAIL核酸人工序列、T2A核酸人工序列、Tat核酸人工序列、HSV-TK核酸人工序列合成其整个表达框并插入标准载体pUC57上得到pUC57-hTRAIL-HSV-TK；
将pUC57-hTRAIL-HSV-TK进行Fast Digest AsiSI(购自ThermoFisher公司)和Fast Digest NotI(购自ThermoFisher公司)双酶切，37℃，酶切4h。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积。
利用琼胶电泳将把含有hTRAIL-HSV-TK DNA片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中。采用DNA extraction kit(购自ThermoFisher公司)将DNA从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入400μl DF buffer，55℃作用10min，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上收集管。12000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入600μl Wash Buffer，12000rpm离心1分钟，过滤液倒掉，重复一次。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将DF Column转移至另一干净的1.5mL离心管中，加入25μlElution Buffer，室温静置2分钟后，12000rpm离心2分钟，1.5mL离心管内的液体即为纯化的hTRAIL-HSV-TK DNA片段(见图2)。
实施例3
重组表达载体质粒，含有如实施例1所述的融合基因。该质粒是将如上所述的融合基因插入pLent-C-GFP载体内，转化到E.coli，经测序正确后，提取并纯化得到的重组表达载体质粒。
以下为重组表达载体质粒(pLent-hTRAIL-HSV-TK质粒)的连接纯化实施例。
按照实施例2的双酶切方法同样获得pLent-C-GFP的DNA线性片段。
将上述两种DNA片段在16℃进行过夜连接形成pLent-hTRAIL-HSV-TK质粒。连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；hTRAIL-HSV-TK DNA：4μl；线性化的pLent-C-GFPDNA：4μl。
将上述pLent-hTRAIL-HSV-TK转化到E.coli(DH5α)。具体步骤如下：将质粒和感受态细胞混匀，冰上孵育半小时，再42℃热激90s，再冰上放置3min，最后加400uL液体LB培养基缓摇1个小时，3000rpm离心5min，将100μl菌液涂布在含有30ng/uL的氨苄LB固体平板上。
次日挑取单菌落进行过夜培养，采用质粒提取纯化试剂盒(购自Qiagen公司)提取pLent-hTRAIL-HSV-TK质粒，具体步骤如下：(1)取1.5ml菌液室温12000rpm离心1min。(2)去上清，加250μl溶液Ⅰ(含RNase A)，涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。(3)加入250μl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4～6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min。(4)加350μl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温12000rpm离心10min。(5)特别小心吸取上清，转移至洁净的装配好容积2ml收集管的吸收柱中。要保证没有吸入白色沉淀。4℃冰箱静置2min，12000rpm离心1min，至裂解物完全通过吸收柱。(6)弃滤过液，加500μl Buffer HBC，12000rpm离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度。(7)弃滤过液，加入600μlWash Buffer清洗吸收柱，12000rpm离心1min，重复一次。(8)必须将吸收柱12000rpm离心2min确保乙醇被去除。(9)将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加50-100μl(取决于需要的终浓度)无菌去离子水或Elution Buffer在滤膜上，12000rpm离心5min，收集质粒DNA。(10)和预知浓度DNA样品(Marker)一起做琼脂糖凝胶电泳，对比结果，得出pLent-hTRAIL-HSV-TK质粒浓度为651ng/μl。
将上述的pLent-hTRAIL-HSV-TK质粒委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序。经测序正确后备用。
实施例4
脐带间充质干细胞的制备
取新生儿的脐带，经过消毒浸泡后，在超净工作台中分离出脐带中的华氏胶组织，剪碎至0.5mm2大小的小块，用UltraCULTURE培养基培养，每天用显微镜观察，直至爬出的间充质干细胞铺满瓶底，进行传代，传代后细胞生长速度加快，每2-3天传一代，传至P4代用于实验(见图3)。
实施例5
慢病毒转染293T细胞，测定滴度
从液氮罐中取出冻存的293T细胞，迅速丢入37℃水浴锅中并快速晃动，尽量在1～2min内使细胞溶液完全溶解。将细胞溶液转移到50mL离心管中，并在其中加上5mL新鲜的完全培养基，混匀后离心，1500rpm，5min。去掉上清，加入1mL新鲜的完全培养基重悬细胞沉淀后，转入六孔板中，每个孔中补足到3mL培养基。将六孔板平稳放入37℃、5％CO2和95％相对湿度的培养箱中培养。第二天观察细胞存活率，并更换培养基。以后每天观察细胞生长情况，细胞状态良好时用于实验。
取状态良好的6×105个293T细胞在六孔板中培养，为第二天的转染做准备。转染前将六孔板换成新鲜DMEM培养液(购自Gibco公司)，37℃温箱中培养1h。
将LipoFiterTM脂质体转染试剂(购自汉恒生物)混匀，pLent-hTRAIL-HSV-TK和辅助质粒psPAX2、pMDNA2G三种质粒以4:3:1的比例混合，将4.0μg的混合质粒溶解于100μL的DMEM培养基中，同时12μL的LipoFiterTM溶于88μL的DMEM培养基中，各自室温静置半小时。将以上两步中的DNA和LipoFiterTM混匀，室温孵育半小时。
将LipoFiterTM-DNA混合物加入六孔板的一个孔中，培养6h后，去除LipoFiterTM-DNA培养液，加入新鲜DMEM培养基继续培养。48h后，显微镜下观察293T细胞转染后的形态变化，并用流式细胞技术检测GFP的表达率，表达率为89.5％。将含有病毒的细胞培养上清吸入EP管中，4℃，2000g离心10min，转移至新的EP管中，4.5μm滤器过滤后-80℃保存。
将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×105/mL，加入96孔板，100μL/孔，为每个病毒准备6个孔。放入37℃，5％CO2培养箱中培养。第二天，准备6个1.5mL EP管，第一个EP管中加入10μL病毒液，然后做3倍梯度稀释，共6个稀释度。第三天，有需要加puro筛选的孔，先吸弃100μL含病毒培养基，加入100μL含1.5μg/mL puro的10％FBS完全培养基。第五天，在荧光显微镜下观察结果，在观察结果前6h需更换新鲜培养基，从孔中吸出80μL培养基，然后加入80μL新鲜10％FBS完全培养基，放入37℃，5％CO2培养箱中培养。6h后荧光显微镜下观察结果，荧光百分比在10～30％的孔计算病毒滴度。根据公式：滴度(TU/mL)＝细胞数×荧光百分比×MOI(1)×病毒稀释倍数×103计算病毒滴度，本发明中获得的病毒滴度为3×107TU/mL。
实施例6
慢病毒感染脐带间充质干细胞及感染后脐带间充质干细胞的扩增培养
从-80℃拿出2ml病毒液，加入终浓度为8μg/ml的聚凝胺(购自Sigma公司)，用该病毒液重悬传代收获的P4代间充质干细胞，使病毒颗粒数与间充质干细胞数比例约为3:1，37℃，5％的CO2培养箱中培养48h。将感染的细胞进行传代，37℃，5％的CO2培养箱中继续培养48h，收集细胞，流式细胞技术检测病毒的感染效率为48.8％(见图4)。
实施例7
hTRAIL-HSV-TK融合基因修饰的间充质干细胞的杀伤活性分析
人卵巢癌细胞株OVCAR-3作为靶细胞，效应细胞分别为hTRAIL-HSV-TK融合基因修饰的间充质干细胞、pLent-C-GFP修饰的间充质干细胞和正常的间充质干细胞。
按E：T为1：1，加入1×106个OVCAR-3细胞，待细胞完全贴壁后，收集hTRAIL-HSV-TK融合基因修饰的间充质干细胞、pLent-C-GFP修饰的间充质干细胞和正常的间充质干细胞，分别调整细胞浓度为1×107/ml，每孔加入100μL，37℃，5％的CO2条件下培养12h。弃上清加入20μL稀释的CCK8(购自MCE公司)，孵育4～6小时，酶标仪检测OD450的吸光值。杀伤率＝[1-(效应细胞+靶细胞孔OD值-单独效应细胞的OD值)/单独靶细胞的OD值]×100％。hTRAIL-HSV-TK融合基因修饰的间充质干细胞对OVCAR-3细胞的杀伤效率为75.65±5.34％明显高于pLent-C-GFP修饰的间充质干细胞和正常的间充质干细胞。
同时另外准备一组上述实验，加入不同的细胞培养12h后，再加入5mg的更昔洛韦，继续培养12h。检测效应细胞对靶细胞的杀伤效率。hTRAIL-HSV-TK融合基因修饰的间充质干细胞对OVCAR3细胞的杀伤效率为93.12±3.45％高于未加更昔洛韦TRAIL-HSV-TK融合基因修饰的间充质干细胞，明显高于pLent-C-GFP修饰的间充质干细胞和正常的间充质干细胞(见图5)。
实施例8
不同信号肽的融合基因修饰的间充质干细胞的杀伤活性分析
人卵巢癌细胞株OVCAR-3作为靶细胞，效应细胞分别为tPA-hTRAIL-HSV-TK修饰的间充质干细胞、HSV-hTRAIL-HSV-TK修饰的间充质干细胞和SEC-hTRAIL-HSV-TK修饰的间充质干细胞。
按E：T为1：1，加入1×106个OVCAR-3细胞，待细胞完全贴壁后，收集tPA-hTRAIL-HSV-TK修饰的间充质干细胞、HSV-hTRAIL-HSV-TK修饰的间充质干细胞和SEC-hTRAIL-HSV-TK修饰的间充质干细胞，分别调整细胞浓度为1×107/ml，每孔加入100μL，37℃，5％的CO2条件下培养12h。弃上清加入20μL稀释的CCK8(购自MCE公司)，孵育4～6小时，酶标仪检测OD450的吸光值。杀伤率＝[1-(效应细胞+靶细胞孔OD值-单独效应细胞的OD值)/单独靶细胞的OD值]×100％。tPA-hTRAIL-HSV-TK修饰的间充质干细胞对OVCAR-3细胞的杀伤效率为77.21±4.23％明显高于HSV-hTRAIL-HSV-TK修饰的间充质干细胞和SEC-hTRAIL-HSV-TK修饰的间充质干细胞(见图6)。
实施例9
本发明提供的修饰间充质干细胞的融合基因hTRAIL-HSV-TK，能够应用于制备治疗肿瘤药物。尤其是该药物用于治疗实体瘤。其药物形式包括将含有融合基因hTRAIL-HSV-TK的间充质干细胞制备成静脉注射液。
(一)治疗前相关工作：
病人在进行治疗前，一定要进行全身身体检查，尤其是心、肺、肝、肾功能及血液检测，以确保病人治疗安全，具体检查如下：
1：心脏功能检查：
治疗前，对病人心脏功能进行评级，如果病人心脏功能在三级或三级以上，则病人不适宜进行此治疗。
2：肺功能检查：
肺功能检查通常包括肺通气试验和血液中血氧饱和度检查，如果用力吹气试验(FEV1)小于50％或小于200毫升，血氧饱和度低于90％，则病人不适宜进行治疗，需要进行相应的治疗后，然后考虑进行嵌合抗原受体T细胞治疗。
3：血液常规检查：
在治疗前，对病人进行血液常规检查，检查结果要求病人中性白细胞要大于1500个/mm3,血小板大于100000个/mm3,血红蛋白大于8g/dl,如果病人不能满足要求，则需要进行相应治疗以满足上述要求。
4：肝肾功能检查：
血生化检查中，谷丙转氨酶、天门冬氨酸氨基转移酶不能超出正常值上限的两倍，总胆红素不能超出正常值上限的1.5倍，肌酐要小于或等于1.6mg/ml,或肌酐清除率要大于70ml/(min·1.73m2)。
5：传染性疾病检查：
同时，对病人进行HIV，乙肝、丙肝等检查，以排除病人可能的医院传染。
6：同时要对适龄已婚妇女进行相关检查，排除病人已经怀孕可能。
7：与病人家属签署知情同意书。
(二)治疗前用药：
通过上述检查，病人符合治疗要求，安排病人进行间充质干细胞回输。
回输前30分钟，给予病人苯海拉明20mg,im，同时给予地塞米松5mg，iv。
(三)回输治疗：
本发明中，干细胞回输的剂量为5×105个/次。可以连续3次回输，每隔两周回输一次。
在回输过程中，要求静脉滴注速度在5-10ml/min，如果病人因为身体原因不能耐受，可以把滴注速度适当放缓，以满足病人要求。
同时，在回输过程中，用心电检测仪对病人生命体征进行持续监测至回输完成后3小时。
(四)回输后跟踪随访：
病人回输完成后，要密切观察病人的生命体征及可能出现的副作用。
常见的副作用有：
1：皮肤发红、瘙痒
2：病人出现心慌、胸闷、呼吸困难
3：腹泻
4：皮下出血、皮疹
5：持续高热
6：谵妄，臆语等神经系统症状
如果出现上述症状，说明病人可能出现了细胞因子综合征，或者是移植物抗宿主病反应，应给予病人激素及对应治疗，这些症状一般持续一周左右后消失。
对于治疗效果的观察，一般表现为病人临床症状的改善。对于实体瘤来说，在回输后的一个月、三个月及半年、一年用影像跟踪观察瘤体大小的变化进行评价治疗效果。血液肿瘤要通过骨髓穿刺来确定骨髓造血细胞中肿瘤细胞的变化，一般在回输治疗后的一个月、三个月、半年及一年进行疗效的评估。
应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。

Claims (10)

1.修饰间充质干细胞的融合基因，其特征在于：包含
编码分泌信号蛋白的核酸人工序列，
编码肺表面活性物质蛋白D的核酸人工序列，
编码人源化肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的核酸人工序列，
编码自剪切多肽的核酸人工序列，
编码Tat蛋白的核酸人工序列，
编码单纯疱疹病毒胸苷激酶的核酸人工序列；
且以上核酸人工序列顺序依次串联。
2.如权利要求1所述的修饰间充质干细胞的融合基因，其特征在于：所述编码分泌信号蛋白的基因序列选自编码tPA、HSV、SEC分子其中之一的核酸人工序列。
3.如权利要求2所述的修饰间充质干细胞的融合基因，其特征在于：所述编码tPA信号肽的核酸人工序列为SEQ ID NO.2；
所述编码肺表面活性物质蛋白D的核酸人工序列为SEQ ID NO.3；
所述编码人源化肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的核酸人工序列为SEQ ID NO.4；
所述编码自剪切多肽的核酸人工序列为SEQ ID NO.5；
所述编码Tat蛋白的核酸人工序列为SEQ ID NO.6；
所述编码单纯疱疹病毒胸苷激酶的核酸人工序列为SEQ ID NO.7。
所述编码HSV信号肽的核酸人工序列为SEQ ID NO.8；
所述编码SEC信号肽的核酸人工序列为SEQ ID NO.9；
所述编码IRES蛋白的核酸人工序列为SEQ ID NO.10。
4.如权利要求3所述的修饰间充质干细胞的融合基因，其特征在于：所述融合基因的核酸序列为SEQ ID NO.1。
5.质粒，其特征在于：所述质粒具有如权利要求1-4任一项所述的修饰间充质干细胞的融合基因。
6.如权利要求5所述质粒，其特征在于：所述质粒是将如上所述的融合基因插入pLent-C-GFP载体内，转化到E.coli，经测序正确后，提取并纯化得到的重组表达载体质粒。
7.慢病毒颗粒，其特征在于：该慢病毒颗粒具有如权利要求1-4任一项所述的修饰间充质干细胞的融合基因。
8.干细胞，其特征在于：所述干细胞包含如权利要求1-4任一项所述的修饰间充质干细胞的融合基因。
9.如权利要求1-4任一项所述的修饰间充质干细胞的融合基因在制备治疗肿瘤药物方面的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：药物形式包括将含有融合基因的间充质干细胞制备成静脉注射液。
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