CN108893484A - 抗EpCAM嵌合抗原受体的编码基因、制备方法、具有该基因的质粒、免疫细胞及其应用 - Google Patents

抗EpCAM嵌合抗原受体的编码基因、制备方法、具有该基因的质粒、免疫细胞及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了抗EpCAM嵌合抗原受体的编码基因、制备方法、具有该基因的质粒、免疫细胞及其应用，其中，至少包含了EpCAM结合区和CTLA4结合区，且同时包含了位于两者之间的T2A核酸人工序列，所述抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因中，还包含有跨膜‑刺激结构域，所述跨膜‑刺激结构域选自CD8、CD27、CD28、CD226、4‑1BB、OX40、ICOS分子的全部或部分片段。本发明提供的抗EpCAM嵌合抗原受体的编码基因增强了T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。

Description

抗EpCAM嵌合抗原受体的编码基因、制备方法、具有该基因的 质粒、免疫细胞及其应用
技术领域
本发明涉及基因技术领域，尤其涉及抗EpCAM嵌合抗原受体的编码基因、制备方法、具有该基因的质粒、免疫细胞及其应用。
背景技术
EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule)是表达于人类部分正常上皮细胞和大多数恶性上皮肿瘤细胞表面的糖蛋白，具有很强的抗原表位。EpCAM基因能够调节细胞增殖、分化与迁移的功能，另一方面，可以促进Th2分化和肿瘤免疫逃逸功能，能够阻断树突状细胞主要组织相容性复合体II限制性抗原呈递，促成肿瘤发生。在癌症中，EpCAM可以在两种功能之间切换，在第一种情况下，EpCAM可以防止强烈的细胞粘附，从而促进细胞迁移和转移。在第二种情况下，EpCAM介导细胞粘附，从而阻止正常细胞中的细胞迁移。
免疫疗法是治疗各种疾病的有效方法，特别是用于癌症治疗，嵌合抗原受体(CAR)修饰的免疫细胞被认为是癌症治疗最有效的方法之一。由于肿瘤微环境的抑制作用，提高CAR-T细胞治疗效能仍然是一个艰巨的任务。目前位于免疫疗法尖端的"免疫检查点阻断剂"对于很多癌症，尤其是恶性且化学药物耐受性癌症的治疗中有着明显的效果。其中，效果最显著的是CTLA-4及PD-1两类免疫检查点阻断剂。目前有几种CAR-T被批准用于治疗液体恶性肿瘤，但对于实体瘤来说，很难找到一种有效的方法来解决患者发生的问题，特别是消化系统肿瘤。
因此，开发一种抗EpCAM嵌合抗原受体、制备方法及其应用，不但具有迫切的研究价值，也具有良好的经济效益和工业应用潜力，这正是本发明得以完成的动力所在和基础。
发明内容
为了克服上述所指出的现有技术的缺陷，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，从而完成了本发明。
具体而言，本发明所要解决的技术问题是：提供抗EpCAM嵌合抗原受体的编码基因、制备方法、具有该基因的质粒、免疫细胞及其应用，以提高免疫细胞对消化系统肿瘤的治疗效果。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
第一方面，本发明提供了抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因，其中，至少包含了EpCAM结合区和CTLA4结合区，且同时包含了位于两者之间的T2A核酸人工序列。
本发明中，作为优选的技术方案，所述抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因中，还包含有跨膜-刺激结构域。
本发明中，作为优选的技术方案，所述跨膜-刺激结构域选自CD8、CD27、CD28、CD226、4-1BB、OX40、ICOS分子的全部或部分片段。
本发明中，作为优选的技术方案，所述抗EpCAM嵌合抗原受体包括顺序连接的
Leader核酸人工序列(SEQ ID NO.2)，
EpCAM结合区核酸人工序列(SEQ ID NO.3)，
CD8 Hinge区核酸人工序列(SEQ ID NO.5)，
CD8跨膜区核酸人工序列(SEQ ID NO.6)，
跨膜-刺激结构域，
CD3ζ胞内区核酸人工序列(SEQ ID NO.9)，
T2A核酸人工序列(SEQ ID NO.4)，
Leader核酸人工序列(SEQ ID NO.2)，
CTLA4结合区核酸人工序列(SEQ ID NO.10)，
CD8 Hinge区核酸人工序列(SEQ ID NO.5)，
CD8跨膜区核酸人工序列(SEQ ID NO.6)，
CD3ζ胞内区核酸人工序列(SEQ ID NO.9)。
本发明中，作为优选的技术方案，跨膜-刺激结构域采用CD226与4-1BB核酸人工序列，其中，
CD226胞内区核酸人工序列(SEQ ID NO.7)，
4-1BB胞内区核酸人工序列(SEQ ID NO.8)。
本发明中，作为优选的技术方案，所述抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因如SEQ IDNO.1所述。
第二方面，本发明提供了抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因的制备方法，包括如下步骤：
分别按融合基因片段Leader-scFv(EpCAM)-CD8-CD226-4-1BB-CD3ζ-T2A-Leader-scFv(CTLA4)-CD8-CD3ζ的顺序委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框，插入T载体pUC57中，得到pUC57-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)。
(2)将pUC57-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)进行双酶切，利用琼胶电泳将含有scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)DNA片段琼胶部位切下，通过溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)DNA片段，即为所述的抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因。
更详细的说，步骤为：
分别按融合基因片段Leader-scFv(EpCAM)-CD8-CD226-4-1BB-CD3ζ-T2A-Leader-scFv(CTLA4)-CD8-CD3ζ的顺序委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框，并插入T载体pUC57中，得到pUC57-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)；
将pUC57-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)进行Fast Digest AsiSI和Fast DigestNotI双酶切，37℃，酶切20min，100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积；
利用琼胶电泳把含有scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)的DNA片段的琼胶部位切下，放在离心管中；
采用DNA extraction kit将DNA从琼胶中溶出，首先往上述离心管加入500μl DFbuffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解；
再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube，8000rpm离心处理DFColumn 1分钟，将过滤液倒掉；
再向DF Column加入500μl Wash Buffer，8000rpm离心处理DF Column 1分钟，过滤液倒掉；12000rpm离心处理DF Column 2分钟确保乙醇被去除；
最后将DF Column转移至上另一干净的微量离心管，加入30μl Elution Buffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心微量离心管2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)DNA片段。
第三方面，本发明提供了具有抗EpCAM嵌合抗原受体的质粒，包括如下步骤：分别按融合基因片段Leader-scFv(EpCAM)-CD8-CD226-4-1BB-CD3ζ-T2A-Leader-scFv(CTLA4)-CD8-CD3ζ的顺序插入pLent-C-GFP载体NotI-AsiSI位点，转化到E.coli Top10，通过菌液PCR鉴定后，使用质粒提取试剂盒提取质粒，质粒经测序正确后，将测序结果正确的重组质粒命名为pLent-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)。
更详细的说，步骤为：
分别按融合基因片段Leader-scFv(EpCAM)-CD8-CD226-4-1BB-CD3ζ-T2A-Leader-scFv(CTLA4)-CD8-CD3ζ的顺序插入pLent-C-GFP载体NotI-AsiSI位点，并命名为pLent-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)，
同时将pUC57-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)和pLent-C-GFP载体进行FastDigest AsiSI(购自ThermoFisher公司)和Fast Digest NotI(购自ThermoFisher公司)双酶切，37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积。利用琼胶电泳将分别把含有scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中。采用DNAextraction kit(购自ThermoFisher公司)将DNA从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入500μl DF buffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube(收集过滤液)。8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500μl Wash Buffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将DF Column转移至另一干净的微量离心管，加入25μl ElutionBuffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段。
将上述两种DNA片段在16℃进行过夜连接形成pLent-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)质粒。连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)的DNA：4μl；线性化的pLent-C-GFPDNA：4μl。
将上述pLent-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)转化到E.coli Top10。
具体步骤如下：将质粒和感受态细胞混匀在冰上孵育半小时，再42度热激90秒，再冰上放置2min，最后加液体LB培养基缓摇1个小时左右再3000rpm离心5min，将100μl菌液涂布在含有氨苄LB固体平板。次日挑取单菌落进行过夜培养，采用质粒提取纯化试剂盒(购自Omega公司)提取pLent-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)质粒，具体步骤如下：(1)取1.5ml菌液室温10000×g离心1min。(2)去上清，加250μl溶液Ⅰ(含RNase A)，涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。(3)加入250μl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4～6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min。(4)加350μl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温10000×g离心10min。(5)特别小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱。(6)弃滤过液，加500μl Buffer HBC，10000×g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度。(7)弃滤过液，再用100％乙醇稀释的750μl Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g离心1min。(8)弃滤过液，再加750μl Wash Buffer清洗吸收柱。(9)必须将吸收柱10000×g离心2min确保乙醇被去除。(10)将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加50-100μl(取决于需要的终浓度)无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上，10000×g离心5min，收集质粒DNA。(11)和已知浓度DNA样品(Marker)一起做琼脂糖凝胶电泳，对比结果，得出pLent-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)质粒浓度为328ng/μl。
将上述的pLent-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)质粒委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序，经测序正确后备用。
第四方面，本发明提供了具有抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因的免疫细胞，所述免疫细胞选自自体的或转基因的T细胞、CIK细胞、T细胞、NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞或调节T细胞，记忆性T细胞的任意一种。
本发明中，优选为CIK细胞。
本发明中，作为优选的技术方案，所述免疫细胞采用如下的制备方法得到：
将pLent-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)质粒转染细胞系293T，然后用上述重组慢病毒感染CIK细胞，将感染后的细胞37℃，5％CO2培养箱中培养8小时后，收集细胞，重新加入病毒液，1000g，32℃，再次离心90分钟后，37℃，5％CO2培养箱中继续培养，如此反复进行多重感染，提高CIK细胞的感染效率；吸弃2ml培养上清，加入2ml的新鲜培养基，继续扩大培养，培养17天至细胞扩增至足够的用量。
第五方面，本发明提供了抗EpCAM嵌合抗原受体在杀伤和抑制消化系统肿瘤细胞方面的应用，尤其是在胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌方面的应用。
本发明中，作为优选的技术方案，应用的药物形式包括试剂盒。
采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：
发明人在长期的研究中发现，EpCAM作为肿瘤标志物，在消化系统肿瘤中研究较多，如肝癌、直结肠癌、胃癌等，而仅仅具有抗EpCAM的CAR细胞，在发挥杀伤肿瘤细胞的作用时，同时会被被肿瘤微环境抑制，这也导致整个免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤活性大大降低。
而发明人则创新性的构建具有抗EpCAM的CAR以靶向在大多数胃肠肿瘤(例如胃癌，结肠癌和直肠癌)，保证CAR-T细胞具有良好治疗效果，其设计的编码基因，至少包含了EpCAM结合区和CTLA4结合区，且同时包含了位于两者之间的T2A核酸人工序列，这样，抗EpCAM安全型嵌合抗原受体在转入免疫细胞翻译成蛋白后，T2A通过自切可以使受体分裂成两部分，一部分为EpCAM抗原结合区的CAR，另一部分为CTLA4抗原结合区的CAR。所述抗EpCAM安全型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，在保证疗效的同时避免被肿瘤微环境抑制，增强了CAR-T细胞的杀伤活性。
更详细的说，本发明加入了免疫检查点抑制剂——抗CTLA4结合区，其与抗EpCAM结合区构建成双特异性嵌合抗原受体。抗CTLA4结合区的加入，可解除肿瘤细胞的免疫逃逸作用，让免疫细胞重新激活工作，消灭癌细胞；还能够清除体内肿瘤微环境中的调节性T细胞(Treg)，由于肿瘤微环境中的Treg细胞能够抑制肿瘤抗原特异性T细胞免疫反应，而且其表面表达大量的CTLA-4蛋白，因此抗CTLA4结合区的加入能够有效激活肿瘤微环境中的T细胞免疫反应，从而提高机体对肿瘤细胞的清除能力。双特异性嵌合抗原受体不但可以识别肿瘤细胞，而且可以在一定程度上增加了效应T细胞密度。因此，本发明提供的抗EpCAM嵌合抗原受体的编码基因增强了T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。
附图说明
图1为本发明所述的嵌合抗原受体Leader-scFv(EpCAM)-CD8-CD226-4-1BB-CD3ζ-T2A-Leader-scFv(CTLA4)-CD8-CD3ζ的融合基因片段的设计图。
图2为本发明所述的慢病毒pLent-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)表达质粒的示意图。
图3为本发明EpCAM特异性CIK细胞的表达CAR的效率图。
图4为本发明EpCAM特异性CIK细胞体外杀伤能力结果图。
图5为本发明CAR-CIK抑制肿瘤生长曲线图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
实施例1
抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因，其中，至少包含了EpCAM结合区和CTLA4结合区，且同时包含了位于两者之间的T2A核酸人工序列；还包含有跨膜-刺激结构域；所述跨膜-刺激结构域选自CD8、CD27、CD28、CD226、4-1BB(CD137)、CD134(OX40)、ICOS分子的全部或部分片段。
本实施例，跨膜-刺激结构域以CD226与4-1BB为例进行描述。
如图1所示，本实施例的抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因，包括顺序连接的Leader核酸人工序列(SEQ ID NO.2)，EpCAM结合区核酸人工序列(SEQ ID NO.3)，CD8 Hinge区核酸人工序列(SEQ ID NO.5)，CD8跨膜区核酸人工序列(SEQ ID NO.6)，CD226胞内区核酸人工序列(SEQ ID NO.7)；4-1BB胞内区核酸人工序列(SEQ ID NO.8)；CD3ζ胞内区核酸人工序列(SEQ ID NO.9)，T2A核酸人工序列(SEQ ID NO.4)，Leader核酸人工序列(SEQ ID NO.2)，CTLA4结合区核酸人工序列(SEQ ID NO.10)，CD8 Hinge区核酸人工序列(SEQ ID NO.5)，CD8跨膜区核酸人工序列(SEQ ID NO.6)，CD3ζ胞内区核酸人工序列(SEQ ID NO.9)。
实施例2
抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因的制备实施例。
本实施例的抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因的制备方法，包括如下步骤：
分别按融合基因片段Leader-scFv(EpCAM)-CD8-CD226-4-1BB-CD3ζ-T2A-Leader-scFv(CTLA4)-CD8-CD3ζ的顺序委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框，插入T载体pUC57中，得到pUC57-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)。
(2)将pUC57-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)进行双酶切，利用琼胶电泳将含有scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)DNA片段琼胶部位切下，通过溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)DNA片段，即为所述的抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因。
本实施例中，详细的步骤为：
分别按融合基因片段Leader-scFv(EpCAM)-CD8-CD226-4-1BB-CD3ζ-T2A-Leader-scFv(CTLA4)-CD8-CD3ζ的顺序委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框，并插入T载体pUC57中，得到pUC57-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)；
将pUC57-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)进行Fast Digest AsiSI和Fast DigestNotI双酶切，37℃，酶切20min，100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积；
利用琼胶电泳把含有scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)的DNA片段的琼胶部位切下，放在离心管中；
采用DNA extraction kit将DNA从琼胶中溶出，首先往上述离心管加入500μl DFbuffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解；
再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube，8000rpm离心处理DFColumn 1分钟，将过滤液倒掉；
再向DF Column加入500μl Wash Buffer，8000rpm离心处理DF Column 1分钟，过滤液倒掉；12000rpm离心处理DF Column 2分钟确保乙醇被去除；
最后将DF Column转移至上另一干净的微量离心管，加入30μl Elution Buffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心微量离心管2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)DNA片段。
实施例3
具有抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因的质粒的实施例。
具有抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因的质粒，采用包括如下步骤的方法制备得到：分别按融合基因片段Leader-scFv(EpCAM)-CD8-CD226-4-1BB-CD3ζ-T2A-Leader-scFv(CTLA4)-CD8-CD3ζ的顺序插入pLent-C-GFP载体NotI-AsiSI位点，转化到E.coli Top10，通过菌液PCR鉴定后，使用质粒提取试剂盒提取质粒，质粒经测序正确后，将测序结果正确的重组质粒命名为pLent-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)，如图2所示。
本实施例中，更详细的步骤为：
分别按融合基因片段Leader-scFv(EpCAM)-CD8-CD226-4-1BB-CD3ζ-T2A-Leader-scFv(CTLA4)-CD8-CD3ζ的顺序插入pLent-C-GFP载体NotI-AsiSI位点，并命名为pLent-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)，
同时将pUC57-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)和pLent-C-GFP载体进行FastDigest AsiSI(购自ThermoFisher公司)和Fast Digest NotI(购自ThermoFisher公司)双酶切，37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积。利用琼胶电泳将分别把含有scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中。采用DNAextraction kit(购自ThermoFisher公司)将DNA从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入500μl DF buffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube(收集过滤液)。8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500μl Wash Buffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将DF Column转移至另一干净的微量离心管，加入25μlElution Buffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段。
将上述两种DNA片段在16℃进行过夜连接形成pLent-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)质粒。连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)的DNA：4μl；线性化的pLent-C-GFP DNA：4μl。
将上述pLent-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)转化到E.coli Top10。
具体步骤如下：将质粒和感受态细胞混匀在冰上孵育半小时，再42度热激90秒，再冰上放置2min，最后加液体LB培养基缓摇1个小时左右再3000rpm离心5min，将100μl菌液涂布在含有氨苄LB固体平板。次日挑取单菌落进行过夜培养，采用质粒提取纯化试剂盒(购自Omega公司)提取pLent-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)质粒，具体步骤如下：(1)取1.5ml菌液室温10000×g离心1min。(2)去上清，加250μl溶液Ⅰ(含RNase A)，涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。(3)加入250μl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4～6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min。(4)加350μl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温10000×g离心10min。(5)特别小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱。(6)弃滤过液，加500μl BufferHBC，10000×g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度。(7)弃滤过液，再用100％乙醇稀释的750μl Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g离心1min。(8)弃滤过液，再加750μl Wash Buffer清洗吸收柱。(9)必须将吸收柱10000×g离心2min确保乙醇被去除。(10)将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加50-100μl(取决于需要的终浓度)无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上，10000×g离心5min，收集质粒DNA。(11)和已知浓度DNA样品(Marker)一起做琼脂糖凝胶电泳，对比结果，得出pLent-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)质粒浓度为328ng/μl。
将上述的pLent-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)质粒委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序。经测序正确后备用。
实施例4
具有抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因的免疫细胞实施例。
具有抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因的免疫细胞，所述免疫细胞选自自体的或转基因的T细胞、CIK细胞、T细胞、NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞或调节T细胞，记忆性T细胞的任意一种。
本实施例中，选择CIK细胞作为免疫细胞。
一般而言，免疫细胞采用如下的制备方法得到：将pLent-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)质粒转染细胞系293T，然后用上述重组慢病毒感染CIK细胞，将感染后的细胞37℃，5％CO2培养箱中培养8小时后，收集细胞，重新加入病毒液，1000g，32℃，再次离心90分钟后，37℃，5％CO2培养箱中继续培养，如此反复进行多重感染，提高CIK细胞的感染效率；吸弃2ml培养上清，加入2ml的新鲜培养基，继续扩大培养，培养17天至细胞扩增至足够的用量。
更详细的说，本实施例采用如下详细步骤：
(1)质粒的制备
分别按融合基因片段Leader-scFv(EpCAM)-CD8-CD226-4-1BB-CD3ζ-T2A-Leader-scFv(CTLA4)-CD8-CD3ζ的顺序插入pLent-C-GFP载体NotI-AsiSI位点，并命名为pLent-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)，
同时将pUC57-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)和pLent-C-GFP载体进行FastDigest AsiSI(购自ThermoFisher公司)和Fast Digest NotI(购自ThermoFisher公司)双酶切，37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积。利用琼胶电泳将分别把含有scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中。采用DNAextraction kit(购自ThermoFisher公司)将DNA从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入500μl DF buffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube(收集过滤液)。8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500μl Wash Buffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将DF Column转移至另一干净的微量离心管，加入25μl ElutionBuffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段。
将上述两种DNA片段在16℃进行过夜连接形成pLent-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)质粒。连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)的DNA：4μl；线性化的pLent-C-GFP DNA：4μl。
将上述pLent-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)转化到E.coli Top10。
具体步骤如下：将质粒和感受态细胞混匀在冰上孵育半小时，再42度热激90秒，再冰上放置2min，最后加液体LB培养基缓摇1个小时左右再3000rpm离心5min，将100μl菌液涂布在含有氨苄LB固体平板。次日挑取单菌落进行过夜培养，采用质粒提取纯化试剂盒(购自Omega公司)提取pLent-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)质粒，具体步骤如下：(1)取1.5ml菌液室温10000×g离心1min。(2)去上清，加250μl溶液Ⅰ(含RNase A)，涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。(3)加入250μl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4～6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min。(4)加350μl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温10000×g离心10min。(5)特别小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱。(6)弃滤过液，加500μl Buffer HBC，10000×g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度。(7)弃滤过液，再用100％乙醇稀释的750μl Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g离心1min。(8)弃滤过液，再加750μl Wash Buffer清洗吸收柱。(9)必须将吸收柱10000×g离心2min确保乙醇被去除。(10)将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加50-100μl(取决于需要的终浓度)无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上，10000×g离心5min，收集质粒DNA。(11)和已知浓度DNA样品(Marker)一起做琼脂糖凝胶电泳，对比结果，得出pLent-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)质粒浓度为328ng/μl。
将上述的pLent-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)质粒委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序。经测序正确后备用。
利用同样的工艺制备pLent-scFv(EpCAM)质粒。
(2)慢病毒包装，病毒滴度检测
将细胞系293T接种于含有DMEM+10％FBS 10cm培养皿中，在37℃，5％的CO2条件下培养，贴壁率为70％-80％后用于慢病毒的转染。
重组质粒pLent-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)和对照重组质粒pLent-scFv(EpCAM)及空载质粒分别与慢病毒包装质粒采用磷酸钙转染法共转染293T细胞，具体方法参考分子克隆。
转染后24h后，细胞明显增大、呈球形，细胞核变大，变圆，贴壁能力下降而易脱落。48h后在倒置荧光显微镜下观察到细胞内有绿色荧光蛋白表达。72h后，收集上清至EP管中，2000g离心10min，转移至新的EP管中，4.5μm滤器过滤后-80℃保存病毒液。
根据Lenti-XTMGo StixTM试剂盒(北京华夏远洋科技有限公司产品)测定病毒滴度，结果表明，重组病毒A的滴度2.56×106pfu/mL，重组慢病毒B的滴度2.48×106pfu/mL。
(4)慢病毒感染CIK细胞及感染后CIK细胞的扩增培养
取50ml患者自体外周血，用TBD样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，分离外周血单个核细胞。用含有1000IU/ml的重组干扰素α2a(购自沈阳三生制药)的培养基(购自CORNING公司，88-551-CM)诱导培养24小时后，加入1000IU/ml的重组白细胞介素2(购自沈阳三生制药)、50ng/ml的OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养24小时。每隔两天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测CIK细胞中的CD3+、CD56+的阳性表达率(CD3-FITC，CD16/CD56-PE抗体购自BECKMAN公司，A07735)。CD3+阳性率>80％，CD3+CD56+双阳性率>20％，视为CIK诱导成功，并留取该CIK待病毒感染。
用步骤(2)的质粒感染CIK细胞，将感染后的细胞37℃，5％CO2培养箱中培养8小时后，收集细胞，重新加入病毒液，1000g，32℃，再次离心90分钟后，37℃，5％CO2培养箱中继续培养，如此反复进行多重感染，提高CIK细胞的感染效率。吸弃2ml培养上清，加入2ml的新鲜培养基，继续扩大培养，培养17天至细胞扩增至足够的用量。通过FC500流式细胞仪的FLTC(异硫氰酸盐)通道检测嵌合抗原受体表达。以未感染的CIK淋巴细胞作为阴性对照，重组慢病毒感染CIK细胞其阳性率26.8％(图3)。
实施例5
抗EpCAM嵌合抗原受体在杀伤和抑制应用消化系统肿瘤细胞方面的应用，尤其是在胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌方面的应用。
抗EpCAM嵌合抗原受体修饰的免疫细胞体外杀伤活性研究
EpCAM特异性CIK细胞特异性杀伤加载EpCAM的胃癌细胞SGC-7901毒性试验采用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl amino ester，CFSE)/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)试验测定。
实验组分别为：
试验一组：靶细胞为加载EpCAM胃癌细胞且效应细胞为转染空载体的CIK细胞；
试验二组：靶细胞为加载EpCAM胃癌细胞且效应细胞为转染重组载体A的CIK细胞(含有CTLA4靶点)；
试验三组：靶细胞为未加载EpCAM胃癌细胞且效应细胞为转染重组载体A的CIK细胞(含有CTLA4靶点)；
试验四组：靶细胞为加载EpCAM胃癌细胞且效应细胞为转染重组载体B的CIK细胞(不含有CTLA4靶点)；
一组-四组加入EpCAM多肽共培养2h，之后分别加入CFSE，使CFSE终浓度达到2μmol/L，37℃染色30min，PBS洗3次。再与EpCAM特异性CIK细胞特异性混合培养，37℃作用4～6h，E∶T分别为1∶1、5∶1、10∶1、20∶1。然后，洗涤2次，PI工作液5μL，避光30min后上流式细胞仪检测。CFSE、PI双阳性的细胞为被杀伤的靶细胞，除以靶细胞总数，即为杀伤率，结果见图4。
EpCAM特异性CIK细胞对EpCAM多肽加载的胃癌细胞株SGC-7901产生明显的杀伤效应，而对EpCAM多肽未加载的胃癌细胞株SGC-7901的细胞毒效应不明显；双靶点EpCAM特异性CIK细胞对胃癌细胞SGC-7901细胞杀伤率高于单靶点EpCAM特异性CIK细胞和CIK细胞。
说明本发明设计加入了免疫检查点抑制剂--抗CTLA4结合区的双靶点EpCAM特异性CIK细胞提高了CIK免疫细胞对肿瘤细胞杀伤作用。
实施例6
CAR-CIK细胞对胃癌KM小鼠肿瘤生长抑制作用
18-22g雌性KM小鼠(购自广州中医药大学)于动物房饲养(室温23±2℃，湿度50％±10％)，收集对数期的乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至2×105个/mL。无菌条件下，小鼠左腋下接种0.2mL MDA-MB-231细胞悬浮液，观察3-5d，待腋下出现米粒大小较硬的结节作为建模成功的标准。
KM乳腺癌移植瘤模型小鼠(游标卡尺量取皮下肿瘤组织块的大小为90-100mm3)随机分成4组，每组20只，开始注射治疗实验。实验组分别为：
a.对照组，尾部静脉注射同等体积的生理盐水，持续观察14d；
b.治疗一组，尾部静脉注射2×106个细胞/只CIK细胞，首次注射后2天再进行第二次同剂量注射，持续观察14d；
c.治疗二组，尾部静脉注射2×106个细胞/只CAR-CIK细胞，首次注射后2天再进行第二次同剂量注射，持续观察14d；
每天通过游标卡尺量取各个实验组小鼠皮下肿瘤组织块大，并记录，用肿块均值绘制肿瘤生长曲线图，结果如图5所示。注射CAR-CIK细胞后第2天，50％小鼠的肿瘤开始变小，在10天时，80％小鼠触摸不到肿瘤。在14天时，95％小鼠触摸不到肿瘤。说明本发明设计的CAR-CIK细胞对KM小鼠肿瘤生长有明显的抑制作用。
应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。

Claims (10)

1.抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因，其特征在于：其至少包含了EpCAM结合区和CTLA4结合区，且同时包含了位于两者之间的T2A核酸人工序列。
2.如权利要求1所述的抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因，其特征在于：还包含有跨膜-刺激结构域。
3.如权利要求2所述的抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因，其特征在于：所述跨膜-刺激结构域选自CD8、CD27、CD28、CD226、4-1BB、OX40、ICOS分子的全部或部分片段。
4.如权利要求3所述的抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因，其特征在于：包括顺序连接的
Leader核酸人工序列，如SEQ ID NO.2所述，
EpCAM结合区核酸人工序列，如SEQ ID NO.3所述，
CD8 Hinge区核酸人工序列，如SEQ ID NO.5所述，
CD8跨膜区核酸人工序列，如SEQ ID NO.6所述，
跨膜-刺激结构域，
CD3ζ胞内区核酸人工序列，如SEQ ID NO.9所述，
T2A核酸人工序列，如SEQ ID NO.4所述，
Leader核酸人工序列，如SEQ ID NO.2所述，
CTLA4结合区核酸人工序列，如SEQ ID NO.10所述，
CD8 Hinge区核酸人工序列，如SEQ ID NO.5所述，
CD8跨膜区核酸人工序列，如SEQ ID NO.6所述，
CD3ζ胞内区核酸人工序列，如SEQ ID NO.9所述。
5.如权利要求4所述的抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因，其特征在于：所述跨膜-刺激结构域采用CD226与4-1BB核酸人工序列，其中，
CD226胞内区核酸人工序列，如SEQ ID NO.7所述，
4-1BB胞内区核酸人工序列，如SEQ ID NO.8所述。
6.制备如权利要求5所述抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因的方法，其特征在于：包括如下步骤：
分别按融合基因片段Leader-scFv(EpCAM)-CD8-CD226-4-1BB-CD3ζ-T2A-Leader-scFv(CTLA4)-CD8-CD3ζ的顺序委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框，插入T载体pUC57中，得到pUC57-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)。
将pUC57-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)进行双酶切，利用琼胶电泳将含有scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)DNA片段琼胶部位切下，通过溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)DNA片段，即为所述的抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因。
7.质粒，其特征在于：具有如权利要求5所述的抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因，且采用包括如下步骤的方法制备得到：
分别按融合基因片段Leader-scFv(EpCAM)-CD8-CD226-4-1BB-CD3ζ-T2A-Leader-scFv(CTLA4)-CD8-CD3ζ的顺序插入pLent-C-GFP载体NotI-AsiSI位点，转化到E.coli Top10，通过菌液PCR鉴定后，使用质粒提取试剂盒提取质粒，质粒经测序正确后，将测序结果正确的重组质粒命名为pLent-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)。
8.免疫细胞，其特征在于：具有如权利要求5所述的抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因，且所述免疫细胞选自自体的或转基因的T细胞、CIK细胞、T细胞、NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞或调节T细胞，记忆性T细胞的任意一种。
9.如权利要求8所述的免疫细胞，其特征在于：采用如下的制备方法得到：
将pLent-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)质粒转染细胞系293T，然后用上述重组慢病毒感染CIK细胞，将感染后的细胞37℃，5％CO2培养箱中培养8小时后，收集细胞，重新加入病毒液，1000g，32℃，再次离心90分钟后，37℃，5％CO2培养箱中继续培养，如此反复进行多重感染，提高CIK细胞的感染效率；吸弃2ml培养上清，加入2ml的新鲜培养基，继续扩大培养，培养17天至细胞扩增至足够的用量。
10.抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因在杀伤和抑制消化系统肿瘤细胞方面的应用。
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