CN107226867B - 抗人cd19抗原的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及抗人CD19抗原的嵌合抗原受体及其应用。本发明的抗人CD19抗原的嵌合抗原受体，由识别人CD19抗原的多肽(scFv)，铰链区，跨膜区和胞内信号域依次连接组成；所述识别人CD19抗原的多肽(scFv)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。本发明提供的嵌合抗原受体能够更稳定的表达于T淋巴细胞，具有更好的清除肿瘤细胞的能力，不仅可以维持靶向CD19的嵌合抗原受体在病人细胞培养过程中的阳性率并且能够加强CAR‑T的增殖和杀伤肿瘤的能力，对抗原阴性的细胞无毒副作用，能够用于肿瘤的靶向治疗。

Description

抗人CD19抗原的嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及抗人CD19抗原的嵌合抗原受体及其应用，还涉及包含抗人CD19的嵌合抗原受体的慢病毒载体和应用。
背景技术
单克隆抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体；细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质联合，利用单克隆抗体的导向作用，将药物或放疗物质携带至靶器官，直接杀伤靶细胞，称为肿瘤导向治疗。另外，将放射性标记物与单克隆抗体连接，注入患者体内可进行放射免疫显像，协助肿瘤的诊断。以小鼠来源单克隆抗体用于疾病治疗，直接使用小鼠抗体进行人体治疗时，因为鼠抗的异质性会引起人抗鼠抗体反应(Human anti-mouse antibody reaction，HAMA)，导致抗体半衰期短，在循环系统中被很快清除，失去疗效。因此，治疗用鼠源单抗需要进行人源化修饰以提高抗体的人源化程度、减弱HAMA。人源化抗体就是指抗体的可变区部分(即VH和VL区)或抗体全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应，人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为人源化抗体。
抗体是免疫系统中最重要的分子之一，体内体液免疫产生的抗体其稳定性是自然进化筛选的结果。但是利用细胞工程和基因工程产生的鼠源或人源化抗体，是一种重组蛋白，在生产、运输、储存以及体内使用过程中，容易发生多种降解；在体内应用于肿瘤治疗时，抗体的亲和力，特异性以及不同PH条件下耐受能力尤其是肿瘤内部为弱酸性环境均影响抗体稳定性和生物学活性。可见提高抗体药物稳定性对抗体成药性至关重要，此外优化抗体效应功能也对抗体临床应用具有重要作用。但是抗体的稳定性和可靠性仍然长久以来困扰着抗体产业，也是整个生物学研究领域需要突破的大的瓶颈。而我们针对鼠源抗体的人源化以及稳定性、特异性和亲和性改造是很有必要的。
CAR是模拟TCR功能的人工受体，由抗原识别域、铰链区和跨膜区及胞内信号域依次连接组成，肿瘤细胞表面的抗原(受体)与嵌合抗原受体的抗体(配体)结合时，通过铰链区和跨膜区将信号传递至胞内，胞内信号域再将信号转化为活化信号，激活效应细胞，效应细胞通过分泌穿孔素或者产生细胞因子杀伤肿瘤细胞，同时效应细胞本身也发生扩增，进一步扩大免疫杀伤作用。
CD19是B细胞表面的跨膜蛋白(Cluster of differentiation 19 protein，CD19)，它与B细胞活化、信号传导及生长调节密切相关，是B淋巴细胞表面的一种功能受体分子，在B细胞抗原受体(BCR)识别抗原时构成B细胞双重抗原结合模型，参与B细胞内Ca2+的转运，调节B细胞的活化与增殖。CDl9作为重要标记物可被用于白血病、淋巴瘤及免疫系统疾病的诊断和预后判断。
但是，虽然有较多临床应用抗体出现，但是还远不能满足临床应用的需求，技术上也还存在不少问题：人源化程度、CAR的优化组合与特异性、稳定性和具有更好的清除肿瘤细胞的能力的综合考虑，使用非人单克隆抗体(例如，鼠单克隆抗体)一方面鼠源抗体通常不能介导补体依赖性溶解或通过抗体依赖性细胞毒性或Fc受体介导的吞噬作用而溶解人靶细胞。另一方面，人宿主会将非人单克隆抗体识别为外源性蛋白质诱发引起有害过敏反应的免疫应答：人抗小鼠抗体(HAMA)反应。因此有必要进一步研究更优化CD19抗体。
目前CAR技术在多种血液瘤和实体瘤均有研究，尤其是在血液病肿瘤中进展迅速，但是如何选择特异性强稳定性好的scFV序列并形成最优的CAR组合仍然还需探索。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗人CD19抗原的嵌合抗原受体，本发明的抗人CD19抗原的嵌合抗原受体能够更稳定的表达于T淋巴细胞，且特异性高，具有更好的清除肿瘤细胞的能力。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
抗人CD19抗原的嵌合抗原受体，由识别人CD19抗原的单链抗体(scFv)，铰链区，跨膜区和胞内信号域依次连接组成；所述识别人CD19抗原的单链抗体(scFv)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
所述的嵌合抗原受体需要逾越两个技术障碍，一是寻找更稳定有效的识别CD19抗原的人源化单克隆抗体(scFV)，二是获得最佳的CAR的组合方式。
本发明所述识别人CD19抗原的单链抗体(scFv)的氨基酸序列是通过人源化改造得到的，为什么要进行改造？因为我们目前使用的识别CD19抗原的嵌合抗原受体在应用时不能够稳定表达于T淋巴细胞尤其是病人来源的T淋巴细胞，转染后随着培养时间的延长T细胞表面的嵌合抗原受体表达显著降低。人源化程度越高的scFV可以有效地降低CAR的免疫原性，增强CAR-T在体内的持续和安全性。
通过随机突变的方式我们获得了15组能够和CD19抗原结合的人源化抗CD19单克隆抗体，但是其它的11组因为纯化、亲和力测试和特异性检测综合实验结果不合格，惨遭淘汰。而仅仅由本发明所保护的这几组，具有预料不到的技术效果。比再次改造前表达更稳定，且特异性高，具有更好的清除肿瘤细胞的能力。
如何改造识别CD19抗原的抗体，使之能够较好地保留对抗原的亲和活性，并且组合为最佳的抗人CD19抗原的嵌合抗原受体，是一个难题。发明人团队在未有更有效的技术提示的情况下通过排除法将筛选出4组识别人CD19抗原的人源化单链抗体(scFv)并通过不同的组合方式构建CAR(嵌合抗原受体)进行筛选。
改造多肽的方法，是对申请人已获得的抗CD19抗体的scFV进行随机单点或多点突变。方法的结果存在随机性，只有在突变得当的情况下，其才能发挥功能获得特异性更好或者亲和力和原有小鼠抗体的亲和力相当的抗体。CAR的组合方式多样，我们将12组不同的CAR组合方式与我们优选的4株人源化单克隆抗体进行随机组合，本部分保护的CAR的组合方式，经过测试之后，可以起到稳定表达于病人来源的T淋巴细胞，并且具有更好的清除肿瘤细胞的能力，用于针对表达CD19的肿瘤的过继细胞治疗。
进一步，所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
进一步，所述跨膜区为CD8TM或CD28TM；所述CD8TM的氨基酸序列如SEQ ID NO:6，所述CD28TM的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
进一步，所述胞内信号域为CD28和/或CD137和/或CD3；所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:8，所述CD137的氨基酸序列如SEQ ID NO:9，所述CD3的氨基酸序列如SEQ IDNO:10。
作为一种优选，所述胞内信号域依次为CD28、CD3。
作为一种优选，所述胞内信号依次为CD137、CD3。
肿瘤细胞表面的抗原(受体)与所述的嵌合抗原受体的抗体(配体)结合时，通过铰链区和跨膜区将信号传递至胞内，胞内信号域将信号转化为活化信号，激活效应细胞，效应细胞增殖、产生细胞因子从而杀伤肿瘤细胞。嵌合抗原受体较TCR改造更具优势：(1)特异性：抗体(配体)特异性识别抗原(受体)；(2)效率高：不会出现转基因TCR与患者内源性TCR发生错配；(3)非MHC-Ⅰ限制性：不需要与MHC-Ⅰ分子结合，可克服肿瘤细胞、肿瘤微环境下调MHC-Ⅰ分子造成的免疫逃逸；(4)抗原选择范围广：抗原可以是糖类、脂类、蛋白。
进一步，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12或SEQID NO.13或SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16或SEQ ID NO.17或SEQ IDNO.18所示。
本发明的目的之二在于提供一种所述的嵌合抗原受体的慢病毒载体的制备方法，包括以下步骤：
1)合成抗人CD19抗原的嵌合抗原受体的基因序列：合成依次含前导肽、抗人CD19抗原的不同的单链抗体(ScFv)、铰链区、跨膜区和胞内信号域；所述前导肽核酸序列如SEQID NO.31所示；
2)构建表达嵌合抗原受体的慢病毒载体：设计引物，正向引物的核苷酸序列如SEQID NO:33所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示，以所述嵌合抗原受体的基因序列为模板进行PCR扩增，得DNA片段；
将所述DNA片段的基因序列用限制性内切酶NheI和XhoI双酶切，同时用限制性内切酶NheI和XhoI酶切慢病毒表达载体pRRLSIN.cPPT.EF1a-GFP.WPRE，然后将酶切后的目的片段和慢病毒表达载体片段通过T4连接酶进行连接，获得表达嵌合抗原受体的慢病毒载体。
进一步，步骤1)所述嵌合抗原受体的基因序列如SEQ ID NO.23或SEQ ID NO.24或SEQ ID NO.25或SEQ ID NO.26或SEQ ID NO.27或SEQ ID NO.28或SEQ ID NO.29或SEQ IDNO.30所示。
进一步，在步骤2)之后，包装并纯化所述慢病毒载体。
本发明的目的之三在于提供一种所述的制备方法所得的慢病毒载体。
在所述的方法下得到所述的慢病毒载体，这样的慢病毒载体的阳性表达率高，在病人细胞培养过程中很稳定，并且不会随着时间的推移会导致CAR阳性率下降。于是，用所述慢病毒载体感染的T细胞，这样的T细胞具备杀伤靶细胞的功能。
本发明的目的还在于提供一种所述的慢病毒载体感染的T细胞。
本发明的目的还在于提供一种所述的T细胞在用于制备B细胞恶性肿瘤的药物中的应用。
进一步，所述B细胞恶性肿瘤的细胞或组织能够表达CD19。CD19是正常和恶性B淋巴细胞特异性表面蛋白，在B细胞的发育、增殖和分化以及恶性转化中发挥重要作用。因CD19在B淋巴细胞表达的特异性和恶性肿瘤表达的广泛性，使其成为一个颇具潜力的B淋巴细胞恶性肿瘤免疫治疗的分子靶点。
进一步，所述B细胞恶性肿瘤包括急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、慢性B-淋巴细胞白血病(B-CLL)，B细胞霍奇金氏淋巴瘤(B-HL)和非霍奇金氏淋巴瘤(B-NHL)。。
本发明的目的还在于提供一种所述识别人CD19抗原的多肽(scFv)的氨基酸序列在用于制备治疗B细胞恶性肿瘤的药物中的应用。进一步，所述的B细胞恶性肿瘤的细胞能够表达CD19。
另外，回到发明的起源端，本发明的目的还在于提供一种所述识别人CD19抗原的单链抗体(scFv)的氨基酸序列在用于制备精准捕获能够表达CD19的B细胞恶性肿瘤细胞的载体中的应用。所述识别人CD19抗原的单链抗体(scFv)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。所述改造的多肽片段，其相对于被改造前，更具有更稳定、特异性更好的特性。
本发明的目的还在于提供一种SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQID NO.4所示的氨基酸序列在制备CAR-T骨架中的抗原识别域的应用。
总的来说，本发明所述的scFV-CAR嵌合抗原受体在免疫细胞中表达后，不仅可以维持靶向CD19的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)在病人细胞培养过程中的阳性率并且能够加强CAR-T的增殖和杀伤肿瘤的能力，并且对抗原阴性的细胞无毒副作用，能够用于肿瘤的靶向治疗。
本发明的有益效果在于：
1)本发明提供的嵌合抗原受体识别抗人CD19抗原，能够更稳定的表达于T淋巴细胞，具有更好的清除肿瘤细胞的能力，不仅可以维持靶向CD19的嵌合抗原受体在病人细胞培养过程中的阳性率并且能够加强CAR-T的增殖和杀伤肿瘤的能力，对抗原阴性的细胞无毒副作用，能够用于肿瘤的靶向治疗。
2)本发明提供的通过改造的嵌合抗原受体人源化程度高，可以有效地降低CAR的免疫原性，增强CAR-T在体内的持续和安全性。
3)本发明提供的嵌合抗原受体能够稳定表达于T淋巴细胞尤其是病人来源的T淋巴细胞，可以用于制备治疗血液系统肿瘤的药物中针对肿瘤的过继细胞治疗。
附图说明
图1是抗人CD19抗原的人源化单克隆抗体纯化图。
图2是人源化单克隆抗体亲和力检测图。
图3是人源化单克隆抗体半衰期检测图。
图4是靶向CD19的嵌合抗原受体的结构示意图。
图5是表达靶向CD19嵌合抗原受体的T细胞经过12天培养，细胞表型检测结果。
图6是表达靶向CD19嵌合抗原受体的T细胞对CD19阳性和阴性肿瘤细胞的杀伤情况。
图7是靶向CD19嵌合抗原受体的T细胞在经CD19阳性细胞刺激激活后的细胞因子释放。
图8是靶向CD19嵌合抗原受体的T细胞在小鼠血液移植瘤模型中对CD19阳性移植瘤的治疗情况。
图9是不同刺激信号下靶向CD19嵌合抗原受体的T细胞对荷载人Raji-Luc肿瘤细胞的小鼠体内治疗实验。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
对比实施例
设计抗人CD19抗原的人源化单克隆抗体
(1)将鼠抗人CD19抗原的单克隆抗体株FMC63轻、重链可变区的CDR区氨基酸序列经过IMGT/BLAST数据库经序列分析及比对，选择同源性最高人抗体序列作为改造模板。
(2)经过分子对接模拟，与抗原抗体对接关系最为密切的抗体氨基酸残基如下所示，
对关键残基以外的骨架序列参考人源抗体骨架区序列进行人源化修饰改造，而后对人源化抗体进行随机突变，再以抗原抗体亲和力筛选和分子对接模拟的方法进行亲和力评估预测，优选得到抗人CD19抗原的人源化单链抗体(ScFv)氨基酸序列如1、2、3所示，此为申请人前期实验成果，专利201710301492.1。
为了更进一步的获得稳定性更好，特异性强，在人体内不会失控增殖安全性好的CART细胞，获得具有更好的清除肿瘤细胞能力的嵌合抗原受体，申请人团队对已申报专利201710301492.1的人源化序列进行了随机点突变，通过再改造的方式获得稳定性好，特异性强的人源化单克隆抗体来用于CAR的组合优化，进行临床的肿瘤靶向治疗。
本发明实施例
实施例1、筛选抗人CD19抗原的人源化单克隆抗体
对鼠源抗CD19抗体FMC635人源化骨架替换通过筛选获得已申报专利201710301492.1的人源化序列(第一部分)，通过对其进行随机突变设计人源化IgG抗体分子，如表1所展示的单克隆抗体随机突变结果。
表1
实施例2、靶向人CD19抗原的人源化单克隆抗体纯化
构建稳定表达人源化抗体的稳转细胞株，将细胞上清收获液过0.45um滤膜，取滤液。用等体积的平衡缓冲液稀释，测PH值。用AKTAPrime纯化具体步骤见GE产品手册，超滤浓缩，完毕后用0.22μm针头滤器除菌过滤，分装，做好标识放入-80℃冰箱中保存。取样，检测。利用SDS和Westernblot检测，具体步骤见GE抗体纯化手册。检测结果如图1所示优选到四株单克隆抗体得到纯度较高的抗体，分别为ScFv-humanized4氨基酸序列SEQ ID NO.1，ScFv-humanized5氨基酸序列SEQ ID NO.2,ScFv-humanized9氨基酸序列SEQ ID NO.3，ScFv-humanized11氨基酸序列SEQ ID NO.4。
实施例3、靶向人CD19抗原的人源化单克隆抗体特异性检测
单克隆抗体scFV标记有His标签后克隆进质粒载体并转染HEK293细胞，将细胞上清收获液过0.45um滤膜，取滤液。用等体积的平衡缓冲液稀释，测PH值。超滤浓缩后用0.22μm针头滤器除菌过滤，分装，做好标识放入-80℃冰箱中保存。分别取不同的人源化抗体与CD19阳性细胞Raji和CD19阴性细胞K562共孵育30min后洗去多余抗体，加入FITC-His抗体染色30min后洗去未标记抗体，进行流式检测，检测结果如表2所示有四株单克隆抗体能够识别阳性细胞Raji并且不识别阴性细胞K562，分别为ScFv-humanized4氨基酸序列SEQ IDNO.1，阳性细胞检测率90.82％，阴性细胞检测率0.7％；ScFv-humanized5氨基酸序列SEQID NO.2,阳性细胞检测率84.04％，阴性细胞检测率0.5％；ScFv-humanized9氨基酸序列SEQ ID NO.3，阳性细胞检测率87.75％，阴性细胞检测率0.4％；ScFv-humanized11氨基酸序列SEQ ID NO.4，阳性细胞检测率80.60％，阴性细胞检测率0.19％。对照为商业化抗体，阳性细胞检测率91.47％，阴性细胞检测率0.88％。
表2
实施例4、靶向CD19人源化单克隆抗体稳定性测定
1)室温条件下抗体亲和力检测
优选的单克隆抗体scFV标记有His标签后克隆进质粒载体并转染HEK293细胞，纯化scFV-His，scFV-His和阴性对照用PBS稀释6个梯度，分别孵育CD19表达阳性的Raji细胞，流式检测浓度梯度下Raji CD19检测的阳性率，进行流式阳性率及MFI统计，对不同scFV于CD19的亲和力进行分析。实验进行了三个独立重复，结果如图2和表3所示，其中Kd(nM)越大亲和力越小。
表3
humanized4 humanized5 humanized9 humanized11
Affinity 1.993ug/mL 6.216ug/mL 4.757ug/mL 18.496ug/mL
WM(KDa) 27.29 27.32 27.31 27.30
Kd(nM) 73.0304 227.5256 174.1853 677.2794
2)抗体半衰期检测：
表达CD19的肿瘤细胞分为4组分别加入获得的4种scFV，每组设置5个梯度浓度，分别4℃孵育1小时离心去除未结合抗体，37℃进行抗体解离，检测解离15分钟、30分钟、45分钟以及60分钟后抗体的活性。结果如图3和表4所示，其中解离率反应抗体半衰期，解离率绝对值越小抗体半衰期越长。
表4
humanized4 humanized5 humanized9 humanized11
解离率(MFI) -4.138±0.2746 -2.744±0.2476 -0.593±0.0809 -0.976±0.2076
实施例5、表达靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体的慢病毒制备(1)制备靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体的基因序列
合成依次含前导肽(又称信号肽)、抗人CD19抗原的单链抗体ScFv，hFc铰链区、跨膜区和胞内信号段的嵌合抗原受体序列，其结构如图4所示。其中前导肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；抗人CD19抗原的人源化单链抗体核苷酸序列如SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示；hFc铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5；跨膜区CD8TM或CD28TM氨基酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示；胞内信号段CD28、CD137及CD3的氨基酸序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示。最终合成的人源化抗CD19嵌合抗原受体核苷酸序列如SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ IDNO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30所示，氨基酸序列如SEQID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQID NO.17、SEQ ID NO.18、所示；未做人源化的鼠抗对照抗体命名为mCD19。
PCR扩增，反应体系按KOD FX NEO DNA聚合酶(购自TOYOBO公司)说明书操作。然后用回收试剂盒(Promega公司)进行DNA片段回收，具体方法见说明书，回收获得嵌合抗原受体，将DNA回收片段送南京金斯瑞生物科技公司测序。
(2)构建表达嵌合抗原受体的慢病毒载体
根据装载ScFv的不同，将嵌合抗原受体表达载体分别简称为PCAR M19、PCAR M20、PCAR 011、PCAR 012、PCAR 013、PCAR 014、PCAR 015、PCAR 016、PCAR 017、PCAR 018、PCAR019、PCAR 020、PCAR 021、PCAR 022、PCAR 023、PCAR 024、PCAR 025、PCAR 026慢病毒载体。其中PCAR M19和PCAR M20为鼠源对照，PCAR 003氨基酸序列如SEQ ID NO.32为申请人已有人源化抗体组合的CAR T细胞作为对照。
酶切反应按说明书进行。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后用琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒进行DNA片段回收，然后将目的片段和载体片段通过T4连接酶(购自Promega公司)进行连接，获得表达嵌合抗原受体的慢病毒载体，结构如图4所示4种CAR结构与4种人源化抗体组合共计16种组合。质粒抽提试剂盒(Invitrogen公司)抽提质粒，具体方法见说明书。
实施例6、CD19抗原的嵌合抗原受体修饰T细胞的制备
(1)慢病毒的包装
本实施例包装慢病毒采用磷酸钙法，具体步骤见分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)。
(2)慢病毒的纯化
收集病毒上清，离心过滤后转移至新的离心管；根据病毒上清量，分别加入50％PEG6000(w/v)、4M NaCl，再用医用盐水定容到PEG6000终浓度为8.5％、NaCl终浓度为0.3M，4℃冰箱静置；样品于4℃、5000r/min条件下离心30min，弃尽上清，用200μL含10％FBS的DMEM培养基重悬病毒，1.5mL EP管分装，-80℃保存备用。
(3)慢病毒滴度测定
病毒感染293T细胞，感染72h后于1000r/min条件下离心5min以收集细胞，用QIAamp DNABloodMini Kit购于Qiagen公司(货号511004)基因组抽提试剂盒抽提基因组。按试剂盒说明书操作。qRT-PCR测定病毒滴度用分析软件分析数据，根据标准曲线计算病毒滴度，结果用TU/mL表示。
(4)慢病毒感染T细胞
1)人外周血单核细胞的分离
用加有抗凝剂的采血管采集外周血约60ml，分装于50ml离心管各30ml，加入7.5ml羟乙基淀粉稀释；室温(18～25℃)自然沉降约30min，收集上层血浆，离心15min；然后用生理盐水重悬沉淀，按体积比为1:1加到淋巴细胞分离液上，梯度离心，离心20min；离心后，取第二层白色淋巴细胞层，并用生理盐水洗涤2次，生理盐水重悬细胞，加入含有10％FBS的RPMI 1640完全培养基培养，得人外周血单核细胞。
2)慢病毒载体感染T淋巴细胞
用含10％FBS的RPMI 1640完全培养基培养新制备的单个核细胞PBMC，抗CD3单克隆抗体活化后进行慢病毒感染；分别加入慢病毒载体，未感染的外周血淋巴细胞(PBMC)作为空白对照；24h后将培养基更换为含有500IU/mL重组人IL-2的RPMI 1640完全培养基，继续培养10-20天。获得的嵌合抗原受体T细胞命名PCAR M19、PCAR M20、PCAR 011、PCAR 012、PCAR 013、PCAR 014、PCAR 015、PCAR 016、PCAR 017、PCAR 018、PCAR 019、PCAR 020、PCAR021、PCAR 022、PCAR 023、PCAR 024、PCAR 025、PCAR 026、PCAR 003。
3)靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体(CAR)表达检测
在培养过程中对培养至10天的已感染病毒的T细胞，300g/min，离心5min，弃尽上清以收集细胞；将细胞调整密度为1×106个/ml；将收集的细胞分别分装利用流式细胞术检测Protein-L阳性率，为了方便随时监控CAR在T细胞表面表达的阳性率，CAR基因前启动子后设计有Protein-L共表达，检测结果即表示培养第4天、10天不同CD19-CAR组合在T淋巴细胞表达阳性率。结果如表2所示不同病毒感染T细胞后CAR阳性率，其中PCAR 019、PCAR 020、PCAR 021、PCAR 022、PCAR 023、PCAR 024、PCAR 025、PCAR 026感染效率高，进一步以PCARM19、PCAR M20为对照对培养至4天、10天的已感染PCAR 019、PCAR 020、PCAR 021、PCAR022、PCAR 023、PCAR 024、PCAR 025、PCAR 026病毒的T细胞进行阳性率检测，结果如图5和表5所示，T细胞PCAR021、PCAR022、PCAR025感染效率好并且随着培养时间CAR阳性率稳定自激活概率小。
表5
实施例7、表达靶向CD19的嵌合抗原受体的T淋巴细胞抗肿瘤效果验证
以稳定表达萤火虫荧光素酶的CD19阳性Raji细胞(简称为Raji-luc)以及稳定表达萤火虫荧光素酶及人CD19抗原的K562细胞(简称为K562-hCD19-luc)作为靶细胞，按照1:1效靶比铺效应细胞。使用Luciferase Assay System(Promega Cat.#E2520)试剂盒提供的标准方法检测杀伤效果，杀伤率用下列公式计算：
杀伤结果如图6A/B和表6所示，结果表明优选的人源化单克隆抗体scFV组合的CART淋巴细胞对CD19阳性肿瘤细胞具有显著杀伤作用。
表6
实施例8、表达靶向CD19的嵌合抗原受体的T淋巴细胞细胞因子分泌能力检测
细胞因子IFN-γ检测采用Elisa的方法，使用BD公司试剂盒进行。检测试剂盒货号：555142，生产批号6266958，具体步骤见试剂盒说明书。
测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，测定应在加终止液后15分钟以内进行。
结果如图7和表7所示，显示效靶比为1:1CAR-T细胞杀伤靶细胞24小时后IFN-γ的分泌。优选的人源化单克隆抗体scFV组合的CART共刺激信号均能正常工作，分泌IFN-γ。
通过比较不同CAR-T细胞的杀伤效果，发现优选的单克隆抗体ScFv组合的CAR T细胞PCAR 019、PCAR 020、PCAR 021、PCAR 022、PCAR 023、PCAR 024、PCAR 025、PCAR 026杀伤活性强于位选择的8种CART组合，对于CD19阳性细胞杀伤效果显著。
表7
实施例9、表达靶向CD19的嵌合抗原受体的T淋巴细胞在动物模型中的抗肿瘤效果验证
建立人CD19阳性肿瘤细胞系的小鼠移植瘤模型用于验证表达靶向CD19的嵌合抗原受体的T淋巴细胞在动物模型中的抗肿瘤效果。
体内验证使用小鼠为NOD.Cg-PrkdcscidII2rgtm1Sug/JicCrl，简称NOG小鼠，由日本实验动物研究所(CIEA)的Mamoru Ito培育而成，为国际上CAR-T体内相关成瘤实验的最常见品系。体内验证使用的成瘤靶向细胞为前期体外验证使用的稳定表达萤火虫荧光素酶的CD19阳性细胞系Raji(简称Raji-luc)。治疗注射的效应细胞为慢病毒载体PCAR 019、PCAR 020、PCAR 021、PCAR 022、PCAR 023、PCAR 024、PCAR 025、PCAR 026感染的CAR-T细胞，对照为生理盐水组、未感染病毒的PBMC细胞以及未改造的FMC635抗体scFV组合的CAR-T细胞PCAR M19和PCAR M20；已申报专利201710301492.1中获得的单克隆抗体改造的CAR命名为PCAR 003作为体内杀伤效果对照。
成瘤后3d尾静脉注射效应CAR-T细胞5*10^5细胞/只鼠。注射CAR T细胞后每隔7天通过PerkinElmer公司的IVS活体成像系统拍照成像，显示肿瘤生长情况。期间每天观察小鼠存活情况并记录，结果见表8和表9所示PCAR 021、PCAR 022、PCAR 023、PCAR 025、PCAR026相较于鼠源对照PCAR M19、PCAR M20和改造前抗体组合的CAR PCAR003显示了更好的治疗效果，荧光值越小存活小鼠越多治疗效果越好。
表8
平均值 2d 9d 16d 23d 30d 37d 44d
分组 存活 2 9 16 23 30 37 44
Salin 0/6 3.27E+06 1.23E+09 1.32E+10
ControlT 0/7 2.78E+06 9.51E+08 8.15E+09
PCARM19 0/7 7.74E+05 1.84E+08 5.04E+09 5.03E+09
PCAR003 1/7 3.14E+06 1.59E+07 2.72E+08 3.36E+09 4.77E+09 4.56E+08
PCAR019 1/7 2.87E+06 1.14E+07 1.95E+08 1.03E+09 5.97E+09 3.94E+09
PCAR020 1/7 2.84E+06 3.19E+06 1.86E+07 3.05E+08 6.67E+08 2.04E+09
PCAR021 4/7 3.12E+06 2.48E+06 8.32E+06 2.01E+07 1.56E+09 6.64E+08 2.05E+09
PCAR022 2/5 3.40E+06 4.88E+06 3.67E+07 2.91E+07 2.12E+09 2.20E+09 3.40E+09
表9
平均值 7d 21d 35d 49d 63d 77d
分组 存活 7 21 35 49 63 77
Salin 0/7 1.30E+06 1.49E+08 4.98E+09 2.08E+08
PCARM20 1/7 1.29E+06 8.15E+08 4.28E+09 1.51E+10 5.13E+08 1.42E+09
PCAR023 5/7 9.19E+05 6.66E+06 5.35E+07 2.24E+08 9.13E+08 3.98E+09
PCAR024 1/7 1.44E+06 1.42E+08 3.77E+09 7.85E+09 1.37E+10 4.70E+07
PCAR025 6/7 7.97E+05 2.70E+06 7.21E+07 3.39E+09 1.28E+10 2.94E+09
PCAR026 3/6 1.35E+06 1.52E+08 2.07E+09 6.01E+08 3.35E+09 6.47E+09
成像结果及小鼠生存曲线如图8和图9所示，结果显示PCAR 021、PCAR 022、PCAR023和PCAR 025显示出优于其他组别的良好抗肿瘤效果，实验小鼠在30d时全部存活。
综合以上结果，相对未做人源化改造的鼠抗人CD19嵌合抗原受体T细胞，应用本发明所述的人源化改造方案得到的抗人CD19抗原的嵌合抗原受体T细胞在体外细胞实验中杀伤特异性更好，而在体内动物实验中呈现出更好的治疗效果，尤其是第二次优化后获得的人源化抗体ScFv-humanized4氨基酸序列SEQ ID NO.1，ScFv-humanized9氨基酸序列SEQID NO.3和ScFv-humanized11氨基酸序列SEQ ID NO.4组合的PCAR 021、PCAR 022、PCAR023、PCAR 025和PCAR 026氨基酸序列分别为SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14或SEQ IDNO.15或SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18所示在动物体内具有很好地治疗效果，我们的PCAR系列嵌合抗原受体具有临床上治疗儿童和成人复发B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，和B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)等CD19阳性血液系统肿瘤的应用价值。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (17)

1.抗人CD19抗原的嵌合抗原受体，其特征在于，由识别人CD19抗原的单链抗体(scFv)，铰链区，跨膜区和胞内信号域依次连接组成；所述识别人CD19抗原的单链抗体(scFv)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链区的氨基酸序列如SEQID NO:5所示。
3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜区为CD8TM或CD28TM；所述CD8TM的氨基酸序列如SEQ ID NO:6，所述CD28TM的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号域为CD28和/或CD137和/或CD3；所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:8，所述CD137的氨基酸序列如SEQ IDNO:9，所述CD3的氨基酸序列如SEQ ID NO:10。
5.根据权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14或SEQ IDNO.15或SEQ ID NO.16或SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18所示。
6.权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体的慢病毒载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)合成抗人CD19抗原的嵌合抗原受体的基因序列：合成依次含前导肽、抗人CD19抗原的不同的单链抗体(ScFv)、铰链区、跨膜区和胞内信号域；所述前导肽核酸序列如SEQ IDNO.31所示；
2)构建表达嵌合抗原受体的慢病毒载体：设计引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:33所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示，以所述嵌合抗原受体的基因序列为模板进行PCR扩增，得DNA片段；
将所述DNA片段的基因序列用限制性内切酶NheI和XhoI双酶切，同时用限制性内切酶NheI和XhoI酶切慢病毒表达载体pRRLSIN.cPPT.EF1a-GFP.WPRE，然后将酶切后的目的片段和慢病毒表达载体片段通过T4连接酶进行连接，获得表达嵌合抗原受体的慢病毒载体。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述嵌合抗原受体的基因序列如SEQ ID NO.23或SEQ ID NO.24或SEQ ID NO.25或SEQ ID NO.26或SEQ ID NO.27或SEQID NO.28或SEQ ID NO.29或SEQ ID NO.30所示。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)之后，包装并纯化所述慢病毒载体。
9.权利要求8所述的制备方法所得的慢病毒载体。
10.权利要求9所述的慢病毒载体感染的T细胞。
11.权利要求10所述的T细胞在用于制备B细胞恶性肿瘤的药物中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述B细胞恶性肿瘤的细胞或组织能够表达CD19。
13.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述B细胞恶性肿瘤包括急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、慢性B-淋巴细胞白血病(B-CLL)，B细胞霍奇金氏淋巴瘤(B-HL)和非霍奇金氏淋巴瘤(B-NHL)。
14.权利要求1所述识别人CD19抗原的单链抗体(scFv)的氨基酸序列在用于制备治疗B细胞恶性肿瘤的药物中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述的B细胞恶性肿瘤的细胞能够表达CD19。
16.权利要求1所述识别人CD19抗原的单链抗体(scFv)的氨基酸序列在用于制备精准捕获能够表达CD19的B细胞恶性肿瘤细胞的载体中的应用。
17.SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列在制备CAR-T骨架中的抗原识别域的应用。
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