CN113493524A

CN113493524A - 双特异性嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN113493524A
Application number: CN202010260849.8A
Authority: CN
Inventors: 陈雪娇; 单娟娟; 赵永春; 沈俊杰; 张巍; 黄霞; 徐艳敏; 陈军; 赵文旭; 齐亚男
Original assignee: Chongqing Jingzhun Biological Industrial Technology Institute Co ltd; Chongqing Precision Biotech Co ltd
Current assignee: Chongqing Jingzhun Biological Industrial Technology Institute Co ltd; Chongqing Precision Biotech Co ltd
Priority date: 2020-04-03
Filing date: 2020-04-03
Publication date: 2021-10-12

Abstract

本发明属于免疫治疗技术领域，具体涉及一种可识别CD19和CD22肿瘤相关抗原的双特异性嵌合抗原受体，一种该嵌合抗原受体的表达载体、CAR‑T细胞及其应用。所述双特异性嵌合抗原受体可识别CD19和CD22双靶点，不仅可以有效的表达于T淋巴细胞，而且能够减少肿瘤免疫逃逸的几率，降低CAR‑T治疗后肿瘤复发率。

Description

双特异性嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明属于免疫治疗技术领域，具体涉及一种双特异性嵌合抗原受体，包含双特异性嵌合抗原受体的载体，一种表达双特异性嵌合抗原受体的CAR-T细胞及其应用。

背景技术

CAR-T（嵌合抗原受体T）细胞疗法在治疗血液系统恶性肿瘤中已取得了显著成果。但是由于肿瘤尤其是实体瘤的异质性，往往肿瘤细胞表面不止表达一个靶抗原，并且随着研究的进展研发人员还发现经CAR-T细胞治疗的少部分患者出现肿瘤细胞下调或突变其表面表达的CAR-T靶点抗原产生逃逸（Robbie G. Majzner et al. (2018) Tumor AntigenEscape from CAR T-cell Therapy），造成治疗效果较差以及复发等情况。因此设计针对多靶点的CAR结构十分有必要，简单的同时表达2个不同靶点的CAR涉及到不同的CAR结构感染能力不同，会产生多种CAR-T细胞亚群，不利于产品临床应用；如果仅是简单的两个不同靶点CAR结构串联于一个载体，这样CAR载体较大不易转导T细胞，不同的结构涉及到CAR载体病毒制备能力不同，CAR转导能力不同，对T细胞产生的刺激不同，疗效不同等多种因素。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于一种靶向CD19和CD22双靶点的双特异性嵌合抗原受体，所述双特异性嵌合抗体可以同时识别CD19和CD22双靶点，可以避免表达CD19肿瘤对CD19 CART的免疫逃逸，对经CD19 CART治疗后复发但CD19为阴性的患者也可以起到治疗作用。

随着CAR-T治疗临床数据的积累，研究者们发现在CAR-T治疗后复发的患者体内CAR-T针对的靶抗原被下调甚至“丢失”，本发明设计可同时识别两个肿瘤相关靶点的双特异性嵌合抗原受体来避免肿瘤表面其中之一抗原丢失，而导致的CAR-T细胞就失去“杀伤目标”。

为实现上述目的，本发明采用以下方案：

所述CAR结构为靶向CD19和CD22双抗原的双特异性嵌合抗原受体，并且双特异性嵌合抗原受体结构为靶向CD19的嵌合抗原受体与靶向CD22的嵌合抗原受体经自剪切肽连接串联；靶向CD19ScFv的氨基酸序列为SEQ ID NO.8，靶向CD22ScFv的氨基酸序列为SEQ IDNO.9。

进一步，所述的靶向CD19ScFv的氨基酸序列为SEQ ID NO.9，靶向CD22ScFv的氨基酸序列为SEQ ID NO.10。

进一步，所述靶向CD19ScFv的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，靶向CD22ScFv的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

进一步，所述的靶向双特异性位点的双CAR自剪切多肽选自T2A、P2A、E2A、F2A以及内部核糖体进入位点IRES。

优选的，所述的嵌合抗原受体包含如SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

优选的，所述的嵌合抗原受体连接胞外识别区与跨膜区域的hinge区核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；跨膜区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；胞内共刺激信号域为CD137，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；胞内信号活化区域为CD3ζ，核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示。

优选的，所述的嵌合抗原受体连接胞外识别区与跨膜区域的hinge区氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；跨膜区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；胞内共刺激信号域为CD137，氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；胞内信号活化区域为CD3ζ，氨基酸序列如SEQ IDNO.13所示。

某些实施例中，所述嵌合抗原受体结构中的铰链区序列可以来源于：IgG、CD8、CD7、CD4；所述嵌合抗原受体中跨膜区可以来源于：CD8、CD28、CD3ε、CD4、CD16、CD137、CD80以及CD86；所述嵌合抗原受体中胞内信号区可来源于：CD3、CD137、CD28、CD27、OX40、ICOS、GITR、CD2、CD40、PD-1、PD1L、B7-H3、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、ICAM-1、CD7、NKG2C、CD83、CD86以及CD127。

本发明的目的之二在于提供一种包含靶向双特异性抗原的嵌合抗原受体的载体。

进一步，所述的嵌合抗原受体的CAR表达载体可以为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、DNA载体，RNA载体、质粒中的任一种。

优选的，所述的CAR表达载体为慢病毒表达载体。

进一步，所述的CAR表达载体包含如SEQ ID NO:1示的核苷酸序列。

在某些实施例中，所述慢病毒载体选自基本上由以下组成的群组：人免疫缺陷病毒1(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2(HIV-2)、维斯纳-梅迪病毒(visna-maedi virus，VMV)病毒、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。

在某些实施例中，载体包含左(5')逆转录病毒LTR、Psi(Ψ)包装信号、中心多嘌呤段/DNA瓣(cPPT/FLAP)、逆转录病毒导出元件、可操作地连接到编码本文所涵盖的CAR的多核苷酸的启动子和右(3')逆转录病毒LTR。

在某些实施例中，CAR包含乙型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)或土拔鼠转录后调节元件(WPRE)以及优化的土拔鼠转录后调节元件（oPRE）。

在某些实施例中，CAR表达载体的启动子可以是缺氧诱导调控的启动子。

在某些实施例中，可操作地连接到编码本文所涵盖的CAR的多核苷酸的所述启动子选自由以下组成的群组：WTPGK、截短的PGK启动子、巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV)、延伸因子1α启动子(EF1-α)、磷酸甘油酸激酶-1启动子(PGK)、泛素-C启动子(UBQ-C)、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)、多瘤病毒增强子/单纯疱疹胸苷激酶启动子(MC1)、β肌动蛋白启动子(β-ACT)、猿猴病毒40启动子(SV40)和骨髓增生肉瘤病毒增强子，阴性对照区缺失的、dl587rev引物结合位点取代的(MND)启动子。

本发明的目的之三在于提供一种CAR-T细胞，所述CART细胞可以同时识别CD19和CD22两个肿瘤相关抗原。

进一步，所述的CAR-T细胞可以应用于表达CD19和CD22抗原的肿瘤治疗。

本发明的目的之四在于提供的嵌合抗原受体结构和/或CAR表达载体和/或CAR-T细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

具体的，所述细胞可以与其他可增强CAR表达活性的活性剂和/或治疗组合使用。

具体的，所述活性剂和/或治疗可以是手术、化疗、放射、免疫抑制剂，例如环孢素(cyclosporin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、霉酚酸酯(mycophenolate)和FK506、抗体或其它免疫清除剂(immunoablativeagents) 例如CAMPATH、抗CD3抗体或其它抗体治疗、环磷酰胺(cytoxan)、氟达拉滨(fludarabine)、环孢素(cyclosporin)、FK506、雷帕霉素(rapamycin)、霉酚酸(mycophenolicacid)、类固醇(steroids)、FR901228、细胞因子和辐射。

在某些实施例中，所述细胞可以表达其它活性剂，例如，增强CAR表达细胞的活性的活性剂。活性剂可以是抑制抑制性分子的活性剂。抑制性分子如PD1可以在一些实施方案中降低CAR表达细胞发动免疫效应子反应的能力。抑制性分子包括 PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT,LAIR1、CD160、2B4、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3、 CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIG、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、TGFR(TGFRβ)和TGFRβ。所述抑制性分子的胞外结构域可以融合到跨膜结构域和胞内信号传导结构域，比如PD1CAR。

进一步，所述肿瘤共表达CD19和CD22抗原。

本发明的有益效果在于：

1）本发明提供了一种可同时识别CD19和CD22的嵌合抗原受体，可降低肿瘤免疫逃逸的风险，降低CAR-T治疗后肿瘤复发；

2）本发明提供的双特异性嵌合抗原受体，可以有效的表达于T淋巴细胞，增强CAR-T有效性，提高CAR-T细胞针对肿瘤靶细胞的杀伤，能够用于肿瘤的靶向治疗；

3）本发明提供包含嵌合抗原受体的表达载体制备病毒容易，CAR转导效率高，适合工业化生产。

附图说明

图1：CAR结构图。

图2：双CAR结构在CHO细胞表达检测。

图3：靶细胞抗原表达。

图4：双CAR结构在T淋巴细胞中表达检测。

图5：双CAR体外杀伤结果。

图6：小鼠荷瘤靶细胞表型检测。

图7：双CAR体内杀伤结果。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著) 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1：质粒构建

设计如图1所示的CAR结构，利用靶向CD19和CD22双靶点CAR进行验证，如图1所示双CAR结构，核酸序列如SEQ ID NO:1所示，利用双酶切分别切割并回收片段，基因片段进行连接、转化并挑单克隆，获得载体编号分别为14。CAR结构原件包含：核苷酸序列如SEQ ID NO:2，氨基酸序列如SEQ ID NO:8的靶向CD19的ScFv；核苷酸序列如SEQ ID NO:3，氨基酸序列如SEQ ID NO:9的靶向CD22的ScFv;核苷酸序列如SEQ ID NO:4，氨基酸序列如SEQ ID NO:10的铰链结构；核苷酸序列如SEQ ID NO:5，氨基酸序列如SEQ ID NO:11的跨膜结构；核苷酸序列如SEQ ID NO:6，氨基酸序列如SEQ ID NO:12的胞内共刺激结构域，核苷酸序列如SEQID NO:7，氨基酸序列如SEQ ID NO:13的胞内活化信号；双靶向CAR的氨基酸序列如SEQ IDNO: 14。

CAR结构如图1所示。

实施例2：制备慢病毒及感染T淋巴细胞

本实施例包装慢病毒采用磷酸钙法，具体为：用含10% FBS(w/v)的DMEM培养基培养293T细胞至较佳状态，包装质粒(RRE:REV:2G)和表达质粒按一定比列加入到1.5的离心管中，加入CaCl2和2× HBS，混匀后室温静置后加入到处理好的293T细胞培养液中，3-5h后再次换液至10mL含10%FBS的DMEM培养基，48h或72h后收集细胞上清，纯化病毒，滴度测定。

滴度表：

制备的慢病毒感染CHO细胞，分别将感染CHO细胞后的CD19CART、CD22CAR-T、双CART19和双CART20采用CD19-FC，CD22-His（Acro，2028b-81XF1-KY）流式标记试剂标记后检测双CAR结构中靶向CD19 CAR和靶向CD22 CAR的表达，用Protein-L检测总的CAR表达，结果如图2所示：CD19CAR-T仅能识别CD19-FC，CD22CART仅能识别CD22-His，而双CART14可以识别CD19-FC和CD22-His双靶点，并且CAR阳性率大于50%。

利用梯度离心法进行淋巴细胞分离；离心后，取第二层白色淋巴细胞层，生理盐水洗涤，加入含有10％FBS的RPMI 1640完全培养基培养，获得人PBMC细胞。获得的PBMC细胞经抗CD3、CD28单克隆抗体活化24h后，按一定的感染复数（MOI）感染已活化的PBMC，在病毒感染的第12天检测CAR-T的阳性率，检测方法为流式检测，抗体为：Protein-L-PE，Protein-L可识别抗体轻链，CAR抗原识别区的ScFv序列的轻链可被Protein-L识别，因此利用Protein-L可检测CAR阳性率和CAR表达强度。

结果如图4所示：在PBMC细胞CAR表达效率大于20%。

实施例3：靶细胞制备和靶抗原检测

以K562-Luc为模式细胞分别构建外源高表达CD19、CD22、共表达CD19和CD22的靶细胞，并采用抗CD19抗体和抗CD22抗体（Acro，2028b-81XF1-KY）检测靶细胞表面抗原表达。结果见图3所示：K562-CD19为仅CD19阳性细胞，K562-CD22为仅CD22阳性细胞，K562-CD19-CD22为CD19和CD22双阳性细胞。

实施例4：双靶点CAR-T有效性验证

分别以CD19单阳性的K562-CD19细胞、CD22单阳性的K562-CD22细胞，CD19和CD22双阳性的K562-CD19-CD22细胞作为靶细胞验证双靶点CAR-T有效性功能，证明双靶点CAR结构的有效性。将效应细胞（CAR-T细胞）按照一定的效靶比铺于靶细胞中，使用Steady-Glo®Luciferase Assay System （Promega Cat. #E2520）试剂盒提供的标准方法检测杀伤效果，杀伤率用下列公式计算：

杀伤结果如图5所示：我们设计的双CAR结构表达的CAR-T细胞不仅对CD19靶点有杀伤效果还对CD22靶点同样具有杀伤效果，还可以对CD19和CD22双阳性的K562-CD19-CD22细胞进行杀伤，并且杀伤效果不亚于单靶点CART对单靶点肿瘤细胞的杀伤。

实施例5、双靶点CAR-T细胞在动物模型中的抗肿瘤效果验证

使用CD19阳性的K562-CD19细胞和CD22阳性的K562-CD22细胞采用1:1混合的方式进行尾静脉回输，构建双靶点小鼠动物模型。图6为靶细胞K562-CD19：K562-CD22=1:1混合后表型检测结果，混合后的靶细胞分别具有CD19和CD22的表达。

体内验证使用小鼠为NOD.Cg-PrkdcscidII2rgtm1Sug/JicCrl，简称NOG小鼠，由日本实验动物研究所（CIEA）的Mamoru Ito培育而成，为国际上CAR-T体内相关成瘤实验最常见品系。体内验证使用的成瘤靶细胞为K562-CD19：K562-CD22=1:1。选择6-8周鼠龄雌性NOD/SCID小鼠，标记耳号后，尾静脉注射K562-CD19：K562-CD22=1:1混合细胞1×106/只细胞量。成瘤第3天测量小鼠肿瘤荧光强度，根据肿瘤体积随机分为生理盐水组、Control T组、CD19 CAR-T组、CD22 CAR-T组以及双CAR 19结构、双CAR 20结构。成瘤第3天向不同分组小鼠尾静脉注射对应的CAR-T细胞3*10^6 CAR-T细胞/只；Control T组于第3天回输总数相同的T淋巴细胞，生理盐水组回输对应体积的生理盐水。

结果如图7所示：与Control T细胞相比，双靶点CAR-T 12和13具有优异的体内杀伤效果，并且双靶点CART14的杀伤细胞优于CD19或CD22单靶点CART体内效果。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 重庆精准生物技术有限公司

<120> 双特异性嵌合抗原受体及其应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3033

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcactgc cagtgaccgc cctgctgctg cctctggccc tgctgctgca cgcagcacgc 60

ccagacatcc agatgacaca gtcccccagc tccctgtctg ccagcgtggg cgaccgggtg 120

accatcacat gcagagcctc tcaggatatc agcaagtatc tgaactggta ccagcagaag 180

ccaggcaagg cccccaggct gctgatctat cacacctccc gcctgcactc tggagtgcca 240

agccggttct ccggatctgg aagcggaacc gactacaccc tgacaatctc tagcctgcag 300

cctgaggatt tcgccacata ctattgccag cagggcaata ccctgccata tacatttggc 360

ggaggaacca ggctggagat caagggatcc acatctggaa gcggcaagcc aggatccgga 420

gagggatcta ccaagggaca ggtgcagctg caggagtccg gacctggact ggtgaagcca 480

agccagacac tgtccctgac ctgtacagtg agcggcgtgt ccctgcctga ttacggcgtg 540

tcctggatca gacagccacc tggcaaggcc ctggagtggc tgggcgtgat ctggggctct 600

gagaccacat actattccac ctctctgaag accaggctga caatctctaa ggacaacagc 660

aagaatcagg tggtgctgac catgacaaac atggaccctg tggataccgc cacatactat 720

tgtgccaagc actactatta cggcggcagc tatgccatgg attactgggg ccagggctcc 780

tctgtgaccg tgagctccct cgagaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840

cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900

ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 960

gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg caaacggggc 1020

agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 1080

gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 1140

gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtacaagc agggccagaa ccagctctat 1200

aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1260

gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1320

ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1380

aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1440

gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgcgaattcg gaagcggagc tactaacttc 1500

agcctgctga agcaggctgg agacgtggag gagaaccctg gacctatggc actgcctgtg 1560

accgccctgc tgctgccact ggccctgctg ctgcacgcag caaggccaca ggtgcagctg 1620

cagcagagcg gaccaggact ggtgaagcca tcccagaccc tgtctctgac atgcgccatc 1680

tccggcgatt ctgtgagctc caacagcgcc gcctggaatt ggatccggca gtcccccagc 1740

cggggcctgg agtggctggg acggacatac tatagatcca agtggtacaa cgattatgcc 1800

gtgagcgtga agtcccggat caccatcaac cccgacacat ctaagaatca gttcagcctg 1860

cagctgaaca gcgtgacccc tgaggacaca gccgtgtact attgtgccag agaggtgacc 1920

ggcgacctgg aggatgcctt tgacatctgg ggccagggca ccatggtgac agtgtctagc 1980

ggcagcacat ccggatctgg caagccagga agcggagagg gctccaccaa gggcgatatc 2040

cagatgacac agtccccctc ctctctgagc gcctccgtgg gcgacagggt gaccatcaca 2100

tgccgcgcct ctcagaccat ctggagctac ctgaactggt atcagcagag gccaggcaag 2160

gcacctaatc tgctgatcta cgcagccagc tccctgcagt ccggagtgcc ttctaggttc 2220

agcggaaggg gatctggaac cgacttcacc ctgacaatct ctagcctgca ggccgaggac 2280

ttcgccacat actattgtca gcagtcttat agcatcccac agacctttgg ccagggcaca 2340

aagctggaga tcaagctcga gaccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 2400

accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 2460

gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc 2520

gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga 2580

aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 2640

gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg 2700

aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg tacaagcagg gccagaacca gctctataac 2760

gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 2820

cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 2880

cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 2940

ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 3000

gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc taa 3033

<210> 2

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gacatccaga tgacacagtc ccccagctcc ctgtctgcca gcgtgggcga ccgggtgacc 60

atcacatgca gagcctctca ggatatcagc aagtatctga actggtacca gcagaagcca 120

ggcaaggccc ccaggctgct gatctatcac acctcccgcc tgcactctgg agtgccaagc 180

cggttctccg gatctggaag cggaaccgac tacaccctga caatctctag cctgcagcct 240

gaggatttcg ccacatacta ttgccagcag ggcaataccc tgccatatac atttggcgga 300

ggaaccaggc tggagatcaa gggatccaca tctggaagcg gcaagccagg atccggagag 360

ggatctacca agggacaggt gcagctgcag gagtccggac ctggactggt gaagccaagc 420

cagacactgt ccctgacctg tacagtgagc ggcgtgtccc tgcctgatta cggcgtgtcc 480

tggatcagac agccacctgg caaggccctg gagtggctgg gcgtgatctg gggctctgag 540

accacatact attccacctc tctgaagacc aggctgacaa tctctaagga caacagcaag 600

aatcaggtgg tgctgaccat gacaaacatg gaccctgtgg ataccgccac atactattgt 660

gccaagcact actattacgg cggcagctat gccatggatt actggggcca gggctcctct 720

gtgaccgtga gctcc 735

<210> 3

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caggtgcagc tgcagcagag cggaccagga ctggtgaagc catcccagac cctgtctctg 60

acatgcgcca tctccggcga ttctgtgagc tccaacagcg ccgcctggaa ttggatccgg 120

cagtccccca gccggggcct ggagtggctg ggacggacat actatagatc caagtggtac 180

aacgattatg ccgtgagcgt gaagtcccgg atcaccatca accccgacac atctaagaat 240

cagttcagcc tgcagctgaa cagcgtgacc cctgaggaca cagccgtgta ctattgtgcc 300

agagaggtga ccggcgacct ggaggatgcc tttgacatct ggggccaggg caccatggtg 360

acagtgtcta gcggcagcac atccggatct ggcaagccag gaagcggaga gggctccacc 420

aagggcgata tccagatgac acagtccccc tcctctctga gcgcctccgt gggcgacagg 480

gtgaccatca catgccgcgc ctctcagacc atctggagct acctgaactg gtatcagcag 540

aggccaggca aggcacctaa tctgctgatc tacgcagcca gctccctgca gtccggagtg 600

ccttctaggt tcagcggaag gggatctgga accgacttca ccctgacaat ctctagcctg 660

caggccgagg acttcgccac atactattgt cagcagtctt atagcatccc acagaccttt 720

ggccagggca caaagctgga gatcaag 747

<210> 4

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 5

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gc 72

<210> 6

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 7

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 8

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln

115 120 125

Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser

145 150 155 160

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile

165 170 175

Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Thr Ser Leu Lys Thr Arg Leu

180 185 190

Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr

195 200 205

Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr

210 215 220

Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Ser

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 9

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala

50 55 60

Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn

65 70 75 80

Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser

115 120 125

Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile

130 135 140

Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg

145 150 155 160

Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr Leu Asn

165 170 175

Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala

180 185 190

Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Arg Gly

195 200 205

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp

210 215 220

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln Thr Phe

225 230 235 240

Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

245

<210> 10

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr

1 5 10 15

Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala

20 25 30

Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 11

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 12

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

1 5 10 15

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg

20 25 30

Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

35 40

<210> 13

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln

1 5 10 15

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

20 25 30

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

35 40 45

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

50 55 60

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

65 70 75 80

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

85 90 95

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 14

<211> 1010

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

50 55 60

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

115 120 125

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

130 135 140

Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro

145 150 155 160

Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro

165 170 175

Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

180 185 190

Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Thr Ser

195 200 205

Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val

210 215 220

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

245 250 255

Gly Gln Gly Ser Ser Val Thr Val Ser Ser Leu Glu Thr Thr Thr Pro

260 265 270

Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu

275 280 285

Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His

290 295 300

Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu

305 310 315 320

Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr

325 330 335

Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

340 345 350

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg

355 360 365

Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser

370 375 380

Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

385 390 395 400

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

405 410 415

Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn

420 425 430

Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

435 440 445

Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

450 455 460

His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr

465 470 475 480

Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Ser Gly

485 490 495

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

500 505 510

Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala

515 520 525

Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly

530 535 540

Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile

545 550 555 560

Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg

565 570 575

Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg

580 585 590

Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr

595 600 605

Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser

610 615 620

Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr

625 630 635 640

Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

645 650 655

Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly

660 665 670

Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

675 680 685

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

690 695 700

Gln Thr Ile Trp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys

705 710 715 720

Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val

725 730 735

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

740 745 750

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

755 760 765

Ser Tyr Ser Ile Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

770 775 780

Lys Leu Glu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

785 790 795 800

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

805 810 815

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

820 825 830

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

835 840 845

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

850 855 860

Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

865 870 875 880

Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys

885 890 895

Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys

900 905 910

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

915 920 925

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

930 935 940

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

945 950 955 960

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

965 970 975

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

980 985 990

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

995 1000 1005

Pro Arg

1010

Claims

1.靶向CD19和CD22双抗原的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于，双特异性嵌合抗原受体结构为靶向CD19的嵌合抗原受体与靶向CD22的嵌合抗原受体经自剪切肽连接串联；靶向CD19ScFv的氨基酸序列为SEQ ID NO.8，靶向CD22ScFv的氨基酸序列为SEQ ID NO.9。

2.权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，靶向CD19ScFv的核苷酸序列为SEQ IDNO.2，靶向CD22ScFv的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

3.权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

4.权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，连接胞外识别区与跨膜区域的hinge区氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；跨膜区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；胞内共刺激信号域为CD137，氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；胞内信号活化区域为CD3ζ，氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

5.权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，连接胞外识别区与跨膜区域的hinge区核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；跨膜区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；胞内共刺激信号域为CD137，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；胞内信号活化区域为CD3ζ，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

6.包含权利要求1-5任一项所述的嵌合抗原受体的CAR表达载体，其特征在于，所述表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、DNA载体，RNA载体、质粒中的任一种。

7.权利要求6所述的CAR表达载体，其特征在于，所述载体包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

8.表达权利要求7所述的嵌合抗原受体的CAR-T细胞。

9.权利要求1所述的CAR结构和/或权利要求6所述的表达载体和/或权利要求8所述的CAR-T细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤共表达CD19和CD22抗原。