CN108315305A - 携带嵌合抗原受体的免疫细胞外泌体的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体是一种利用分离获得携带CAR的免疫细胞外泌体的制备方法及其应用。具体是将CAR免疫细胞以特异性的抗原活化后，产生的外泌体进行进一步的分析、分离、纯化、富集，最终得到携带CAR的免疫细胞外泌体。本发明制备的外泌体能用于各种疾病的治疗，如癌症，重型传染病等，且这种外泌体具克服CAR细胞治疗的免疫炎症风暴等不良反应，增强了CAR的组织浸透能力，还具有保存和运输方便的优势，为相关疾病的治疗提供了新的策略。

Description

携带嵌合抗原受体的免疫细胞外泌体的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是一种利用分离获得含嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)外泌体的制备方法及其治疗疾病的应用。
背景技术
以手术治疗、放射治疗及化学治疗为主，辅以新型的靶向治疗方案是近年来对恶性肿瘤治疗的基本策略，且已经在临床实践中取得重要的进展。但恶性肿瘤的复发、转移和治疗性耐受依然是一直困扰临床和科研工作者的难题。近年来，基因修饰各种免疫细胞用于治疗疾病的方法已经提出，如通过嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)在T细胞上的表达，使得基因修饰的T细胞靶向肿瘤细胞上表达的抗原，以治疗癌症类疾病。这类的治疗方式已经获得一定程度上的成功，第一个类似的产品也与2017年或FDA批准(Brentjens R,et al.Treatment of chronic lymphocytic leukemia with geneticallytargeted autologous T cells:case report of an unforeseen adverse event in aphase I clinical trial，Molecular Therapy,2010,18(4):666-668.)随着目前技术的发展，目前嵌合抗原受体细胞技术中嵌合抗原受体基因构建的方式主要划分以下三代。第一代CAR的基因工程技术由胞外结合区-单链抗体(Single-chain fragment variable，scFv)、跨膜区(Transmembrane Region，TM)和胞内信号区-免疫受体酪氨酸活化基序(immuno-receptor tyrosine-based activation motif，ITAM)组成，其中嵌合抗原受体CAR部分按照如下形式连接：svFv-TM-CD3ζ(Zhang T,Barber A,Sentman C L.ChimericNKG2D–Modified T Cells Inhibit Systemic T-Cell Lymphoma Growth in a MannerInvolving Multiple Cytokines and Cytotoxic Pathways[J].Cancer research,2007,67(22):11029-11036.)。随后发展的第二代CAR基因工程策略在一代的基础上增加了CD28或CD137(又名4-1BB)的胞内信号区，其中嵌合抗原受体各部分按照如下形式连接：scFv-TM-CD28-ITAM或scFv-TM-CD137-ITAM。胞内信号区发生的B7/CD28或4-1BBL/CD137共刺激作用引起T细胞等免疫细胞的持续增殖，并能够提高T细胞分泌IL-2等细胞因子的水平(Savoldo B,et al.CD28 costimulation improves expansion and persistence ofchimeric antigen receptor–modified T cells in lymphoma patients.The Journalof clinical investigation,2011,121(5):1822.)。近年来发展的第三代CAR基因工程连接如下：scFv-TM-CD28-CD137-ITAM或scFv-TM-28-CD134-ITAM，进一步提高CAR-T在体内的存活周期和效果(Carpenito C,et al.Control of large,established tumorxenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28andCD137domains.Proceedings of the National Academy of Sciences,2009,106(9):3360-3365.)。除了最常用的T细胞，近年来也涌现出利用CAR技术制备其他免疫细胞类型的治疗方法，如CAR-NK[Chu J,et al.CS1-specific chimeric antigen receptor(CAR)-engineered natural killer cells enhance in vitro and in vivo antitumoractivity against human multiple myeloma.Leukemia,2014,28(4):917-927.]等。
CAR细胞在肿瘤免疫治疗等临床应用中具有诱人的前景。但目前有如下的显著问题：如利用自体的免疫细胞，1)患者采血后需要10-14天才能完成细胞回输，这段时间可能错过病人治疗的最佳时机。2)患者往往经过多重治疗如放化疗等，身体状况差，免疫细胞本身活性低，无法保证回输细胞的有效性。3)晚期恶性疾病病人采集血液可能不适宜。4)大规模应用免疫细胞回输及免疫细胞的大量增殖有可能造成炎性风暴，成为凶险的临床治疗并发症。5)而利用供体来源的CAR免疫细胞容易造成免疫排斥反应。
值得关注的是，免疫细胞能分泌大量的外泌体(exosome)，这些外泌体的特点是：直径在30-150nm之间；密度在1.13-1.19g/mL之间；表达特异性的蛋白，携带了免疫细胞的重要信号分子，包括蛋白质、脂质和RNA等；保持着与亲代免疫细胞相似的生活学活性。在免疫细胞激活时，具有一定的细胞杀伤潜能。
非专利文献综述Tang X J,et al.Therapeutic potential of CAR-T cell-derived exosomes:a cell-free modality for targeted cancer therapy.Oncotarget,2015,6(42):44179。在叙述中提出利用CAR-T细胞外泌体治疗癌症的可能性。但后续的研究CAR-T细胞分泌的外泌体成分复杂，无特异靶向性，也无切实的肿瘤杀伤力。使用直接分离获得CAR-T细胞的外泌体治疗肿瘤在体内实验中并未观察到明显的肿瘤抑制效果(附图4-5)。且目前尚未见到任何CAR免疫细胞来源的外泌体治疗疾病有效的报道。CAR-T细胞产生的外泌体作为无细胞治疗疾病的新方法又面临巨大挑战。
最近，发明人针对CAR免疫细胞所分泌的外泌体成分进行了深入研究，结果发现虽然CAR免疫细胞分泌体肿瘤治疗效果差，如果使用特定抗原刺激CAR-T细胞，使其对特定的抗原活化，再对其分泌的外泌体进行纯化、富集，以制备特定的携带有CAR蛋白的外泌体。该种外泌体有非常强的抗肿瘤作用。且由于外泌体的膜性结构，可以进一步对其进行工程改造，如包裹毒素、包裹放射粒子等。可以实现肿瘤等疾病的治疗。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)免疫细胞来源的携带CAR的免疫细胞外泌体(后述为“CAR外泌体”)的制备方法及其治疗疾病的应用。
本发明的第一方面，提供上述的CAR外泌体的制备方法，包括以下步骤：
A)制备CAR免疫细胞
需要说明的是，本步骤所述的CAR免疫细胞的制备方法在多种文献中提及，如Johnson L A,,et al.Rational development and characterization of humanizedanti–EGFR variant III chimeric antigen receptor T cells forglioblastoma.Science translational medicine,2015,7(275):275ra22-275ra22；ParkS,et al.Micromolar affinity CAR T cells to ICAM-1 achieves rapid tumorelimination while avoiding systemic toxicity.Scientific reports,2017,7(1):14366.；Li N,et al.Therapeutically targeting glypican-2 via single-domainantibody-based chimeric antigen receptors and immunotoxins in neuroblastomaProceedings of the National Academy of Sciences,2017,114(32):E6623-E6631.ChuJ,et al.CS1-specific chimeric antigen receptor(CAR)-engineered natural killercells enhance in vitro and in vivo antitumor activity against human multiplemyeloma.Leukemia,2014,28(4):917-927.等方法。本发明采用的制备方法和上述方法并无本质区别，利用上述文献中报道的以及通用的生物工程手段制备的CAR免疫细胞均可以用于本发明中。其中免疫细胞可以是T细胞、NK细胞等。免疫细胞的来源可以是患者自身，或健康志愿者。
在本发明的一个具体实施例中，免疫细胞为健康志愿者来源的T细胞，按照以下步骤实施：
(1)获得细胞样本并分离和激活，所述样本为T细胞或T细胞的祖细胞；
(2)构建scFv-CD8hinge and TM-4-1BB-CD3的病毒载体；
(3)制作重组质粒并包装病毒；
(4)病毒感染T细胞；
(5)体外培养扩增CAR-T细胞群体。
在本发明的另一个具体实施例中，免疫细胞为NK细胞，构建scFv-hinge-TM-CD28-CD3，制作重组质粒并包装病毒后感染NK细胞；体外扩增CAR-NK细胞群体。在本发明的另一个具体实施例中，免疫细胞为CAR-T细胞，构建scFv-hinge-CD28-4-1BB-CD3的病毒载体。
B)对CAR免疫细胞进行抗原特异性活化：
获得大量CAR免疫细胞后，需进行CAR免疫细胞的抗原特异性活化。
在此步骤中，采用的活化剂可以是特异性靶点的可溶性重组蛋白、表达特异性靶点的工程细胞、或直接使用表达特异性靶点肿瘤细胞等。所述的特异性靶点指的是CAR免疫细胞中的scFv针对的抗原靶点，即CAR免疫细胞靶向的特异性靶点。值得注意的是，利用固定化的溶性重组蛋白抗原可以获得相比可溶性重组蛋白抗原更好的激活效果，如重组抗原包被的磁珠等。另一个注意要点是，来源于活细胞的活化剂常需要灭活处理。
CAR免疫细胞中的scFv针对的抗原靶点，可以是EGFR，HER2，CD20等目前靶向疗法中常用靶标[Caruso H G,et al.Tuning sensitivity of CAR to EGFR density limitsrecognition of normal tissue while maintaining potent antitumor activity[J].Cancer research,2015,75(17):3505-3518.][Ahmed N,et al.Human Epidermal GrowthFactor Receptor 2(HER2)-Specific Chimeric Antigen Receptor–Modified T Cellsfor the Immunotherapy of HER2-Positive Sarcoma.Journal of Clinical Oncology,2015,33(15):1688-1696.]，也可以为CD19，Mesothelin等肿瘤抗原(Turtle C J,etal.CD19CAR–T cells of defined CD4+:CD8+composition in adult B cell ALLpatients.The Journal of clinical investigation,2016,126(6):2123.)。原则上来讲，针对任何靶点的CAR免疫细胞均可以在本步骤中使用。
在本发明的一个具体实施例中，采用的CAR免疫细胞为CAR-T细胞。其scFv针对的靶点为EGFR。
在本发明的另一个具体实施例中，采用的CAR免疫细胞为CAR-NK细胞。其scFv针对的靶点为HER2。
活化的方法可以为在体外的培养体系中加入抗原蛋白或固化的抗原蛋白、直接共培育CAR免疫细胞及和表达特异性靶点的灭活后工程细胞、直接共培育CAR免疫细胞和表达特异性靶点的灭活后肿瘤细胞等。
所述的活化剂具体可为：表皮生长因子EGFR胞外段重组蛋白、磁珠交联的EGFR胞外段重组蛋白，表达EGFR的CHO细胞、表达EGFR的MDA-MB-231细胞；磁珠交联的HER2胞外段重组蛋白、表达HER2的BT474细胞等。
在本发明的一个具体实施例中，所述的活化剂为磁珠偶联的EGFR胞外段重组蛋白或高表达EGFR的灭活MDA-MB-231细胞。在该实施例中，所述的活化方法具体为：将CAR-T细胞培养于含有磁珠偶联的EGFR胞外段融合蛋白的培养基中或与高表达EGFR的灭活MDA-MB-231细胞共培育。
在本发明的另一个具体的实施例中，所述的活化剂为磁珠偶联的HER2胞外段重组蛋白或HER2高表达的BT474细胞。所述的活化方法具体为：将CAR-NK细胞培养于含有磁珠偶联的HER2胞外段融合蛋白的培养基中或与高表达HER2的灭活后BT474细胞进行共培育。
值得说明的是，直接跳过本步骤B基本无法获得CAR的外泌体。即不经过特异性抗原活化CAR免疫细胞而直接获取外泌体，再进行分离纯化。这种方式纯化后得到的CAR外泌体含量十分少，基本无法用于疾病治疗或科学研究。但不排除可以应用大规模培养的方法富集纯化，但从经济性考虑并无应用价值。
C)收集制备CAR免疫细胞外泌体：
根据活化方式的不同，采集培养上清。按照通用的外泌体分离方法进行收集制备。外泌体收集的方法在多种文献中提及，如Théry C,et al.Isolation andcharacterization of exosomes from cell culture supernatants and biologicalfluids.Current protocols in cell biology,2006:3.22.1-3.22.29；Coumans F AW,etal.Methodological Guidelines to Study Extracellular Vesicles.Circulationresearch,2017,120(10):1632-1648.Li L,et al.Human bile contains MicroRNA‐ladenextracellular vesicles that can be used for cholangiocarcinomadiagnosis.Hepatology,2014,60(3):896-907.Li L,Piontek K,Ishida M,etal.Extracellular vesicles carry microRNA‐195to intrahepaticcholangiocarcinoma and improve survival in a rat model.Hepatology,2017,65(2):501-514.分离外泌体的技术手段在本步骤中与上述文献并无本质区别。
在本发明的一个具体实施例中，所述的外泌体按以下方法制备：将收集的培养上清于4℃、2000g离心10分钟，以去除死细胞和大的碎片；小心将上清液转移到新的无菌离心管中，于4℃、10000g离心30分钟，以去除细胞器及小颗粒；小心将上清液转移到无菌超速离心管中，于4℃，110000g超速离心70分钟，小心弃去上清，再加PBS清洗一次，于4℃，110000g超速离心70分钟，得到的沉淀即为外泌体。
D)CAR外泌体的纯化和富集：
在该步骤中，利用CAR受体与抗原的特异性结合能力以纯化和富集CAR外泌体。为了增加纯度，在某些具体应用实施例中可以利用蛋白质L与免疫球蛋白轻链的结合力对免疫细胞分泌的外泌体进行初步纯化。值得注意的是，该方法不能替代利用抗原纯化的步骤。步骤可以如下：
向步骤C中制得的外泌体重悬液中加入特异性抗原包被的磁性体，即CAR捕获磁体，所述磁性体上含有能够CAR的重组靶点蛋白抗原；孵育后将重悬液置于磁场中，除去上清液后加入缓冲液，加入分选柱，利用缓冲液洗脱分选柱上滞留的外泌体；将上清液加入分选柱后，先流出的是无抗原结合能力的外泌体，然后采用缓冲液洗脱分选柱，流出的即为具有抗原结合能力、携带CAR的外泌体。根据最初收集的培养基的体积不同，酌情加入PBS重悬，用Bradford试剂盒检测总蛋白浓度，-80℃分装保存。
在本发明的一个具体的实施例中，采用EGFR重组蛋白包被的磁珠，其磁珠为Dynabeads。向含有外泌体的重悬液加入该磁珠，将试管置于磁场中，与磁珠特异性结合的外泌体被磁场吸附；磁珠被吸附后，吸去上清，将试管移出磁场；用PBS缓冲液悬浮重悬，加入分选柱中，收集先行流出的未结合组分，并用缓冲液冲洗分选柱，洗下来的为无抗原结合能力的外泌体囊泡。将分选柱移出磁场，用缓冲液快速将分选柱上滞留的外泌体洗脱下来并平衡至生理pH，此时获得CAR外泌体。
在本发明的另一个具体实施例中，该步骤为首先利用包被有蛋白L的磁珠与含有外泌体的PBS溶液4℃孵育60min，磁珠通过蛋白L与免疫球蛋白轻链的特异性结合力结合对应的外泌体。将试管置于磁场中，与磁珠结合的外泌体被磁场吸附；磁珠被吸附后，吸去上清，将试管移出磁场；用PBS缓冲液悬浮重悬，加入分选柱中，收集先行流出的未结合组分，并用缓冲液冲洗分选柱，洗下来的为不携带有免疫球蛋白的外泌体囊泡。将分选柱移出磁场，用缓冲液快速将分选柱上滞留的外泌体洗脱下来后。然后立即恢复pH值后与重组HER2蛋白包被的磁珠在4℃孵育30min；将上清液置于磁场中。与磁珠结合的外泌体再次被磁场吸附；磁珠被吸附后，吸去上清，将试管移出磁场；用PBS缓冲液悬浮重悬，加入分选柱中，收集先行流出的未结合组分，用缓冲液冲洗分选柱，洗下来的为不携带有CAR的外泌体囊泡。将分选柱移出磁场，用缓冲液快速将分选柱上滞留的携带有CAR的外泌体洗脱下来并平衡至生理pH，洗脱下来的即为目的外泌体。
本发明的第二方面，提供一种采用如上所述的制备方法制备得到的CAR外泌体。
本发明对上述CAR外泌体进行生物学活性的检测，所述的外泌体携带CAR蛋白，平均直径在30-150nm左右，透射电镜下观察到的形态都符合外泌体的特征。进一步的研究显示，上述携带CAR的免疫细胞外泌体可以很好地靶向目标靶点表达的细胞及组织，并且可以抑制肿瘤细胞增殖和体内肿瘤生长。
本发明的第三方面，提供一种如上所述的CAR外泌体及其组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明所指的肿瘤，包括腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤，肿瘤组织的来源包括但不限于肾上腺、胆囊、骨、骨髓、脑、乳腺、胆管、胃肠道、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲状旁腺、阴茎、前列腺、皮肤、唾液腺、脾脏、睾丸、胸腺、甲状腺和子宫。除了上述的肿瘤外，还可用于中枢神经系统的肿瘤如胶质细胞多样性瘤、星细胞瘤等，此外眼部的肿瘤包括基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤等，还包括内分泌腺肿瘤、神经内分泌系统肿瘤、胃肠道胰腺内分泌系统肿瘤，生殖系统肿瘤及头颈部肿瘤等。这里不再一一列举。
进一步的，所述的肿瘤为非小细胞肺癌或乳腺癌。在本发明的一个具体实施例中，所述的CAR外泌体抑制MDA-MB-231和HCC827的细胞活力和肿瘤生长速度，尤其是对cetuximab天然耐药的MDA-MB-231。在本发明的另一个具体实施例中，所述的CAR外泌体抑制BT474的细胞活力。
进一步的，所述的CAR外泌体是一种纳米膜性囊泡，可以进一步和脂质体相关的工程改造方法结合，或包裹化疗药物、放射离子等。
在一个具体的实施例中，CAR外泌体进一步工程化用于负载阿霉素化疗药物并对乳腺癌细胞显示出细胞毒性作用。
本发明所称的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还也减少或防止转移。
进一步的，所述的CAR外泌体和抗肿瘤药联用。
本发明公开的所述的CAR外泌体及其组合物还可以和其他的抗肿瘤药联合给药或放射治疗，用于肿瘤的治疗，这些抗肿瘤药包括：1、细胞毒类药物(1)作用于DNA化学结构的药物：烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类；铂类化合物如顺铂、卡铂和草酸铂等；丝裂霉素(MMC)；(2)影响核酸合成的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等；胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类(5FU、FT－207、卡培他滨)等；嘌呤核苷合成酶抑制剂如6－巯基嘌呤(6－MP)和6－TG等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲(HU)等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷(Ara-C)和健择(Gemz)等；(3)作用于核酸转录的药物：选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制RNA合成的药物如：放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等；(4)主要作用于微管蛋白合成的药物：紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱；(5)其他细胞毒药：门冬酰胺酶主要抑制蛋白质的合成；2、激素类抗雌激素：三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制剂：氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素：氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等；3、生物反应调节剂：主要通过机体免疫功能抑制肿瘤干扰素；白细胞介素-2；胸腺肽类；4、单克隆抗体：美罗华(MabThera)；赫赛汀(Trastuzumab)；Bevacizumab(Avastin)；5、各种放射疗法；6、其他包括一些目前机制不明和有待进一步研究的药物；细胞分化诱导剂如维甲类；细胞凋亡诱导剂。本发明公开的携带CAR的免疫细胞外泌体及其组合物可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合联合用药。
本发明的第四方面，提供一种如上所述的CAR外泌体及其组合物在制备重症感染疾病或自身免疫性疾病治疗药物中的应用。
本发明的第五方面，提供一种制剂，所述的制剂为包含如上所述的CAR外泌体的组合物。
所述的制剂为包含CAR外泌体的组合物，在对包括人在内的动物给注射或以其他方式给药后，抗肿瘤效果明显。具体来讲，对肿瘤的预防和/或治疗有效，可以作为抗肿瘤药物使用。另外由于免疫细胞的性质，该种外泌体及外泌体组合物也可以对抗其他疾病，如重症感染疾病及自身免疫性疾病等。
本发明的第六方面，提供一种通过向患者给予治疗有效量的CAR外泌体来延长准备接受、正在接受或者已经接受癌症治疗(如利用化疗、放疗、靶向治疗及/或外科手术等)的癌症患者无复发生存期的方法。由于外泌体的组织穿透性，相比CAR免疫细胞的治疗方式，在实体瘤的治疗中应更具优势。
本发明中CAR外泌体及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。
本发明优点在于：
本发明将CAR细胞(如CAR-T细胞等)以特异性的抗原活化后，产生的外泌体进行进一步的分析、分离、纯化、富集，最终得到携带CAR的免疫细胞外泌体。所述外泌体能用于各种疾病的治疗，如癌症，重型传染病等，且这种外泌体具克服CAR细胞治疗的免疫炎症风暴等不良反应能力，增强了CAR的组织浸透能力，还具有保存和运输方便的优势，为相关疾病的治疗提供了新的策略。
附图说明
图1.CAR外泌体抗原竞争性Elisa检测。
图2.CAR外泌体抗体竞争性Elisa检测。
图3.电子显微镜下重组EGFR蛋白活化的CAR-T来源的CAR外泌体形态。
图4.CAR-T来源的CAR外泌体抑制MDA-MB-231与HCC827细胞体外细胞生长。
图5.CAR-T来源的CAR外泌体抑制MDA-MB-231与HCC827细胞肿瘤生成曲线。
图6.电子显微镜下重组HER2蛋白活化的CAR-NK来源的CAR外泌体形态。
图7.CAR-NK来源的CAR外泌体及组合物抑制BT474与SK-BR-3细胞体外细胞生长。
图8.CAR-T来源的CAR外泌体对细胞的凋亡作用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
以下实施例、实验例对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法、或包装病毒的方法；利用病毒感染免疫细胞以获得目的蛋白表达的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndedition，Coldspring Harbor Laboratory Press；Buchschacher,G.L.,Jr.,and Wong-Staal,F.(2000)Development of Lentiviral Vectors for Gene Therapy for Human Diseases.Blood95,2499-2504；Yee,J.-K.,Miyanohara,A.,LaPorte,P.,Bouic,K.,Burns,J.C.,andFriedmann,T.(1994)A General Method for the Generation of High-Titer,PantropicRetroviral Vectors:Highly Efficient Infection of PrimaryHepatocytes.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,9564-9568；Yee,J.K.(1999)in TheDevelopment of Human Gene Therapy(Friedmann,T.,ed),pp.21-45,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Yee,J.K.,Moores,J.C.,Jolly,D.J.,Wolff,J.A.,Respess,J.G.,and Friedmann,T.(1987)Gene Expression fromTranscriptionally Disabled Retroviral Vectors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,5197-5201；等。
实施例1.CAR-T细胞来源的CAR外泌体制备
1)全基因合成包含抗EGFR单链抗体的CAR序列(委托苏州金唯智生物科技有限公司合成)，其中单链抗体序列来源于抗EGFR抗体cetuximab(Li et al.,2005,Structuralbasis for inhibition of the epidermal growth factor receptor by cetuximab，Cancer Cell,7:301-311)，CAR的具体结构包括：抗EGFR单链抗体scFv-CD8α铰链区及跨膜区域-4-1BB共激活结构域以及CD3ζ信号分子胞内段。具体序列与文献Johnson L A,etal.Science translational medicine,2015,7(275)报道的大体一致(除scFv)。为了方便检测，在scFv与铰链区之间插入Myc标签，标签的位置与文献Chu J,et al.CS1-specificchimeric antigen receptor(CAR)-engineered natural killer cells enhance invitro and in vivo antitumor activity against human multiple myeloma.Leukemia,2014,28(4):917-927.相同。整个序列以同源重组的方式克隆进入含有CMV启动子的pLenti6.3/v5慢病毒载体(Invitrogen)中。
2)利用HEK293T细胞制备慢病毒。由于制备慢病毒是对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，故不在此详述。简要的步骤包括取合适数量的HEK-293T细胞共转染构建好的慢病毒载体以及病毒包装质粒(Mission viral packaging plasmids，Sigma-Aldrich)。在转染72小时后收集病毒并浓缩(Lenti-X concentrator，Clontech)纯化病毒。
3)T细胞分离培养与CAR-T制备。通过密度梯度离心分离新鲜的外周血单核细胞(PBMC，peripheral blood mononuclear cell)；利用偶联anti-CD3和anti-CD28抗体的paramagnetic beads(Dynabeads ClinExVivo CD3/CD28,Invitrogen,Camarillo,CA,USA)刺激并富集，磁珠与细胞比例为2-3:1；细胞稀释到浓度为5-8×l06/mL，在添加IL-2的培养基中共培育24小时；获得的T细胞以慢病毒多次感染。隔天计数细胞并更换培养基。当T细胞表现出静止态时进行下一步实验。所谓静止态指的是在细胞计数中增殖系数下降，细胞大小停止变化。此时收集转染前和转染后的细胞上清液提取外泌体作为对照使用。提取的方法后述。
4)T细胞特异性抗原激活。本步骤中使用两种方法进行CAR-T细胞特异性抗原激活，方法一是在T细胞培养基中加入磁珠偶联的EGFR胞外段重组蛋白。蛋白浓度为5ug/mL到1mg/mL之间分梯度进行实验。24小时候收集培养上清。上清中的重组蛋白通过磁场除去。方法二为CAR-T细胞与高表达EGFR的肿瘤细胞MDA-MB-231进行共培育。在培育前，MDA-MB-231细胞以100Gy的γ射线灭活。培育比例为2:1，4:1及8:1，24小时后收集培养上清。
5)外泌体制备。将3)和4)中描述的培养上清液按照如下步骤提取外泌体：将培养上清于500ml无菌离心瓶或50ml聚丙烯离心管中(购于Beckman公司)，于4℃、2000g离心10分钟，以去除死细胞和大的碎片。小心将上清液转移到新的无菌离心管中，于4℃、10000g离心30分钟，以去除细胞器及小颗粒。小心将上清液转移到无菌超速离心管中，于4℃、110000g(Beckman超速离心机)超速离心70分钟，小心弃去上清，再加注射用生理盐水清洗一次，于4℃、110，000g超速离心70分钟，得到的沉淀即为外泌体。根据最初收集的培养基的体积不同，酌情加入PBS重悬。
6)携带CAR外泌体制备
将获得的外泌体按照以下步骤纯化富集携带CAR的外泌体：向含有外泌体的生理盐水溶液中加入有EGFR胞外段重组蛋白包被的磁珠，4℃孵育30min，磁珠通过特异性抗原抗体相互作用与带有相应svFv的CAR外泌体结合；将试管置于磁场中，与磁珠连接的外泌体被磁场吸附；磁珠被吸附后，吸去上清，将试管移出磁场；用PBS缓冲液悬浮重悬，加入分选柱中，收集先行流出的未结合组分，并用缓冲液冲洗分选柱，洗下来的为不携带有CAR的外泌体囊泡。将分选柱移出磁场，用缓冲液快速将分选柱上滞留的携带有CAR的外泌体洗脱下来，洗脱下来的即为目的外泌体。用Bradford试剂盒(购于Thermo公司)检测总蛋白浓度后，可以在-80摄氏度分装长期保存。
值得说明的是，利用未经特异性抗原刺激的CAR-T细胞分泌的外泌体进行纯化富集无法获得可用于后续实现的CAR外泌体。即未经特异性抗原刺激的CAR-T细胞分泌的外泌体中的携带CAR的外泌体含量是极少的。
7)携带CAR外泌体检测。
由于ELISA实验为本领域的常见实验，为一般的技术人员所熟知，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议试剂盒步骤操作。按照如下步骤检测外泌体的CAR表达：按照一定的稀释比例的CAR外泌体加入到包裹有EGFR抗原的封闭完成的96孔板中，37℃孵育1h。洗涤后按照竞争的方式加入EGFR重组蛋白，共孵育。TBST洗涤3次，后加入HRP标记的Anti-Myc抗体。37℃孵育1h。TBST洗涤后，加入显色底物。酶标仪检测后计算分析，结果如图1。与Cetuximab的竞争ELISA如下：按照一定的稀释比例的CAR外泌体和biotin标记的Cetuximab加入到包裹有EGFR抗原的封闭完成的96孔板中，37℃孵育1h。TBST洗涤3次，后加入HRP标记的亲和素(Thermo)。37℃孵育1h。TBST洗涤后，加入显色底物。酶标仪检测后计算分析，结果如图2。
透射电镜观察获得的CAR外泌体的形态:将外泌体充分重悬，吸取10μ1滴到载样铜网上，室温静置5分钟，用滤纸小心吸掉多余液体。滴加醋酸双氧铀负染2分钟，用滤纸吸掉多余液体，在白炽灯下烘干；透射电镜80-120kv成像并拍照。结果如图所示，可见直径为30-150nm左右的圆形囊泡状结构，结果如图3。
该实施例结果说明，成功获取免疫细胞来源的携带有CAR的外泌体，它们都表达CAR蛋白，能结合特异性的抗原，平均直径在80nm左右，透射电镜下观察到的形态都符合外泌体的特征。
实施例2:CAR外泌体抑制EGFR阳性的MDA-MB-231及HCC827细胞活力实验
取生长状态良好的MDA-MB-231及HCC827细胞(ATCC)，调整细胞浓度为5×103/ml，接种于96孔细胞培养板，200μl/孔，于37℃、5％CO2孵箱中培养24h后，在培养液中加入终浓度为5nmol的EGF和不同浓度梯度的外泌体，另用cetuximab抗体药物做对照(Cetuximab购自默克公司)，4天后，细胞活力用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay试剂盒(Promega,Madison,WI)检测。实验结果如图3所示。实验结果表明，CAR外泌体可以显著抑制的MDA-MB-231和HCC827细胞活力(P<0.01,Tukey检验)，尤其是对cetuximab天然耐药的MDA-MB-231细胞。(图4)。
实施例3：CAR外泌体体内抑制肿瘤生长实验
为检测CAR外泌体体内抑瘤活性，首先用HCC827和MDA-231细胞，接种于到BALB/c裸鼠(中科院实验动物中心)右胁侧皮下，成瘤后尾静脉注射3500mg/kg的CAR外泌体及抗体药物cetuximab(10mg/kg)，每周注射1次，持续至小鼠肿瘤过大处死。每天测量肿瘤的长宽，计算肿瘤体积。
肿瘤生长曲线如图5所示。结果表明激活型CAR外泌体治疗组肿瘤生长速度显著小于cetuximab治疗组(40天后，P<0.01，Bonferroni检验)。
实施例4：靶向HER2的CAR-NK细胞来源的CAR外泌体制备
1)全基因合成包含抗HER2单链抗体的CAR序列(委托苏州金唯智生物科技有限公司合成)，其中单链抗体序列来源于抗HER2抗体trastuzumab(Cho H S,et al.Structureof the extracellular region of HER2alone and in complex with the HerceptinFab.Nature,2003,421(6924):756-760.)，CAR的具体结构包括：抗HER2单链抗体scFv-CD28铰链区及跨膜区域CD28以及CD3ζ信号分子胞内段。具体序列同文献Chu J,et al.CS1-specific chimeric antigen receptor(CAR)-engineered natural killer cellsenhance in vitro and in vivo antitumor activity against human multiplemyeloma.Leukemia,2014,28(4):917-927.(除ScFv段)。整个序列以同源重组的方式克隆进入含有CMV启动子的PCDH慢病毒载体(System Biosciences)中。
2)利用HEK293T细胞制备慢病毒。由于制备慢病毒是对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，故不在此详述。简要的步骤包括取合适数量的HEK-293T细胞共转染构建好的慢病毒载体以及病毒包装质粒pCMV-VSVG和pCMV-dr9。在转染72小时后收集病毒并浓缩(Lenti-X concentrator，Clontech)纯化病毒。
3)CAR-NK制备。
将NK-92细胞稀释到1×106/mL并在添加IL-2的培养基中培养过夜，然后以慢病毒反复连续感染。在第三次感染后，将细胞培养至含有20％FBS的1640培养基中。该培养基添加150单位/ml的IL-2。经过两次流式细胞术分选(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)绿色荧光蛋白表达的细胞。该绿色荧光蛋白为PCDH载体基因所编码。另外在实验中收集感染前后的细胞上清液提取外泌体作为对照使用。提取的方法后述。
4)NK细胞特异性抗原激活。本步骤中使用两种种方法进行NK细胞特异性抗原激活，方法一是在NK细胞培养基中加入磁珠偶联的HER2胞外段重组蛋白。蛋白浓度为5ug/mL到1mg/mL之间分梯度进行实验。12-24小时候收集培养上清。方法二为NK细胞与高表达HER2的灭活后BT474细胞进行共培育。培育比例为2:1，4:1及8:1，12-24小时后收集培养上清。
5)外泌体制备。将3)和4)中描述的培养上清液按照如下步骤提取外泌体：将培养上清于500ml无菌离心瓶或50ml聚丙烯离心管中(购于Beckman公司)，于4℃、2000g离心10分钟，以去除死细胞和大的碎片。小心将上清液转移到新的无菌离心管中，于4℃、10000g离心30分钟，以去除细胞器及小颗粒。小心将上清液转移到无菌超速离心管中，于4℃、110000g(Beckman超速离心机)超速离心70分钟，小心弃去上清，再加注射用生理盐水清洗一次，于4℃、110，000g超速离心70分钟，得到的沉淀即为外泌体。根据最初收集的培养基的体积不同，酌情加入PBS重悬。
6)携带CAR外泌体制备
将获得的外泌体按照以下步骤纯化富集携带CAR的外泌体：首先向含有外泌体的生理盐水溶液中加入包被有蛋白L的磁珠，4℃孵育60min，磁珠通过蛋白L与免疫球蛋白轻链的特异性结合力与CAR外泌体或含有免疫球蛋白的外泌体结合；将试管置于磁场中，与磁珠连接的外泌体被磁场吸附；磁珠被吸附后，吸去上清，将试管移出磁场；用PBS缓冲液悬浮重悬，加入分选柱中，收集先行流出的未结合组分，并用缓冲液冲洗分选柱，洗下来的为不携带有免疫球蛋白的外泌体囊泡。将分选柱移出磁场，用缓冲液快速将分选柱上滞留的外泌体洗脱下来后立即与重组HER2蛋白包被的磁珠，4℃孵育30min，磁珠通过特异性抗原抗体相互作用与带有相应svFv的CAR外泌体结合；将试管置于磁场中，与磁珠连接的外泌体被磁场吸附；磁珠被吸附后，吸去上清，将试管移出磁场；用PBS缓冲液悬浮重悬，加入分选柱中，收集先行流出的未结合组分，并用缓冲液冲洗分选柱，洗下来的为不携带有CAR的外泌体囊泡。将分选柱移出磁场，用缓冲液快速将分选柱上滞留的携带有CAR的外泌体洗脱下来并平衡至生理pH，洗脱下来的即为目的外泌体。用Bradford试剂盒(购于Thermo公司)检测总蛋白浓度后，可以在-80摄氏度分装长期保存。
7)携带CAR外泌体检测。
透射电镜观察获得的CAR外泌体的形态:将外泌体充分重悬，吸取10ul滴到载样铜网上，室温静置5分钟，用滤纸小心吸掉多余液体。滴加醋酸双氧铀负染2分钟，用滤纸吸掉多余液体，在白炽灯下烘干；透射电镜80-120kv成像并拍照。结果如图所示，可见直径为30-150nm左右的圆形囊泡状结构，结果如图6。
实施例5:NK来源的CAR外泌体抑制乳腺癌细胞活力实验
取生长状态良好的HER2高表达乳腺癌细胞系BT474及HER2低表达MCF-7细胞(ATCC)，调整细胞浓度为4×103/ml，接种于96孔细胞培养板，200μl/孔，于37℃、5％CO2孵箱中培养24h后，在培养液中加入不同浓度梯度的外泌体，另用trastuzumab抗体药物做对照，4天后，细胞活力用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay试剂盒(Promega,Madison,WI)检测。实验结果如图7所示。实验结果表明，NK细胞来源CAR外泌体可以显著抑制BT474细胞活力(P<0.01,Tukey检验)，但对HER2低表达的MCF-7细胞抑制作用较弱。(图7)。
实施例6:负载阿霉素的NK来源的CAR外泌体制备及其抗肿瘤效果
将实施例4和5中获取的CAR外泌体与等质量的阿霉素化疗药物混合。通过电转的方法制备化合物负载CAR外泌体。电击条件为电压420V，电容150μF，于4mm电转杯进行电转。随后用倒置离心超滤膜过滤，去除未转染进外泌体内的游离化合物。
也可以通过脂质体转染法将化合物导入外泌体实现对外泌体的负载。取生长状态良好的HER2高表达乳腺癌细胞系BT474及HER2低表达MCF-7细胞(ATCC)，调整细胞浓度为4×103/ml，接种于96孔细胞培养板，200μl/孔，于37℃、5％CO2孵箱中培养24h后，在培养液中加入不同浓度梯度的外泌体，，4天后，细胞活力用CellTiter-Glo Luminescent CellViability Assay试剂盒(Promega,Madison,WI)检测。实验结果如图7所示。实验结果表明，负载阿霉素的CAR外泌体可以更加显著抑制肿瘤细胞活力(P<0.01,Tukey检验)。
实施例7：靶向CD20的CAR-T来源的CAR外泌体对淋巴瘤细胞凋亡作用。
1)全基因合成包含抗CD20单链抗体的CAR序列(委托苏州金唯智生物科技有限公司成)，其中单链抗体序列来源于抗CD抗体Rituximab(Du J,et al.Structural basis forrecognition of CD20by therapeutic antibody Rituximab.Journal of BiologicalChemistry,2007,282(20):15073-15080.)。CAR的具体结构包括：抗CD20单链抗体scFv-铰链区及CD28跨膜区域CD28、4-1BB以及CD3ζ信号分子胞内段。具体序列同文献Chu J,etal.CS1-specific chimeric antigen receptor(CAR)-engineered natural killercells enhance in vitro and in vivo antitumor activity against human multiplemyeloma.Leukemia,2014,28(4):917-927.(除ScFv、4-1BB)。整个序列以同源重组的方式克隆进入含有CMV启动子的PCDH慢病毒载体(System Biosciences)中。
利用HEK293T细胞制备慢病毒的方法、制备CAR-T细胞的方法、CAR-T细胞特异性抗原激活刺激的方法、外泌体制备及携带CAR外泌体的纯化方法同上述实施例，故在此不再赘述。其中，CAR-T细胞的特异性抗原活化剂为表达CD20的灭活Raji细胞。
取生长状态良好的Burkitt淋巴瘤细胞系Raji(ATCC)，调整细胞浓度为1×105/孔。于37℃、5％CO2孵箱中培养24小时后后，在培养液中加入不同浓度梯度的外泌体，另用Rituximab抗体药物做对照，培养16小时候对细胞进行漂洗，然后用annexin V-FITC(BDBiosciences)染色后行流式细胞术计算凋亡细胞比率。实验结果如图8所示。实验结果表明，CAR-T细胞来源CAR外泌体可以明显诱导Raji细胞及Daudi细胞凋亡(P<0.01,Tukey检验)。(图8)。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (10)

1.一种携带CAR的免疫细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A)制备CAR免疫细胞：
按照通用的生物工程手段制备CAR免疫细胞；
B)对CAR免疫细胞进行抗原特异性活化：
采用的活化剂是特异性靶点的可溶性重组蛋白、表达特异性靶点的工程细胞、或直接使用表达特异性靶点肿瘤细胞；所述的特异性靶点指的是CAR免疫细胞中的scFv针对的抗原靶点，即CAR免疫细胞靶向的特异性靶点；活化的方法为在体外的培养体系中加入抗原蛋白或固化的抗原蛋白、直接共培育CAR免疫细胞及和表达特异性靶点的灭活后工程细胞、直接共培育CAR免疫细胞和表达特异性靶点的灭活后肿瘤细胞；
C)收集制备CAR免疫细胞外泌体：
采集培养上清，按照通用的外泌体分离方法进行收集制备；
D)CAR外泌体的纯化和富集：
向步骤C中制得的外泌体重悬液中加入特异性抗原包被的磁性体，即CAR捕获磁体，所述磁性体上含有与CAR蛋白特异性结合的重组靶点蛋白抗原；孵育后将重悬液置于磁场中，除去上清液后加入缓冲液，加入分选柱，利用缓冲液洗脱分选柱上滞留的外泌体；将上清液加入分选柱后，先流出的是无抗原结合能力的外泌体，然后采用缓冲液洗脱分选柱，流出的即为具有抗原结合能力、携带CAR的免疫细胞外泌体；根据最初收集的培养基的体积不同，酌情加入PBS重悬，用Bradford试剂盒检测总蛋白浓度，-80℃分装保存。
2.根据权利要求1所述的携带CAR的免疫细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述的步骤A的免疫细胞是T细胞或NK细胞；所述的免疫细胞的来源是患者自身，或健康志愿者。
3.根据权利要求1所述的携带CAR的免疫细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述的步骤A的免疫细胞为健康志愿者来源的T细胞，CAR免疫细胞的制备方法按照以下步骤实施：
(a)获得细胞样本并分离和激活，所述样本为T细胞或T细胞的祖细胞；
(b)构建scFv-CD8hinge and TM-4-1BB-CD3、scFv-hinge-TM-CD28-CD3、scFv-hinge-CD28-4-1BB-CD3的病毒载体；
(c)制作重组质粒并包装病毒；
(d)病毒感染T细胞、NK细胞；
(e)体外培养扩增CAR-T、CAR-NK细胞群体。
4.根据权利要求1所述的携带CAR的免疫细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述的步骤B中CAR免疫细胞中的scFv针对的抗原靶点是EGFR，HER2，CD20。
5.根据权利要求1所述的携带CAR的免疫细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述的步骤B采用的活化剂为表皮生长因子EGFR胞外段重组蛋白、磁珠交联的EGFR胞外段重组蛋白，表达EGFR的CHO细胞、表达EGFR的MDA-MB-231细胞；磁珠交联的HER2胞外段重组蛋白、表达HER2的BT474细胞、表达CD20的Raji细胞。
6.根据权利要求1所述的携带CAR的免疫细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述的步骤C收集制备CAR免疫细胞外泌体的方法为：将收集的培养上清于4℃、2000g离心10分钟，以去除死细胞和大的碎片；小心将上清液转移到新的无菌离心管中，于4℃、10000g离心30分钟，以去除细胞器及小颗粒；小心将上清液转移到无菌超速离心管中，于4℃，110000g超速离心70分钟，小心弃去上清，再加PBS清洗一次，于4℃，110000g超速离心70分钟，得到的沉淀即为外泌体。
7.一种采用如权利要求1-6任一所述的制备方法制备得到的携带CAR的免疫细胞外泌体，所述的外泌体携带CAR蛋白，平均直径在30-150nm左右。
8.一种如权利要求7所述的携带CAR的免疫细胞外泌体及其组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.一种如权利要求7所述的携带CAR的免疫细胞外泌体及其组合物在制备重症感染疾病或自身免疫性疾病治疗药物中的应用。
10.一种制剂，所述的制剂为包含如权利要求7所述的携带CAR的免疫细胞外泌体的组合物。
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