CN114259568A - 外泌体在制备阿霉素和氯尼达明联合递送制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了外泌体在制备阿霉素和氯尼达明联合递送制剂中的应用，所述外泌体来自于A549细胞。本发明将氯尼达明(LND)作为阿霉素(DOX)的化疗增敏剂，共同负载于外泌体中，降低了DOX的用量，并且显著提高了抑癌效果。
Description
技术领域
本发明属于化疗药物递送技术领域，具体涉及外泌体在制备阿霉素和氯尼达明联合递送制剂中的应用。
背景技术
阿霉素是一种抗肿瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。主要适用于急性白血病，对急性淋巴细胞白血病及粒细胞白血病均有效，一般作为第二线药物，即在首选药物耐药时可考虑应用此药。恶性淋巴瘤，可作为交替使用的首先药物。乳腺癌、肉瘤、肺癌、膀胱癌等其他各种癌症都有一定疗效。阿霉素主要的毒性反应有，白细胞和血小板减少，约60％～80％的病人可发生；100％的病人有不同程度的毛发脱落，停药后可以恢复生长；心脏毒性，表现为心律失常，ST-T 改变，多出现在停药后的1～6个月，及早应用维生素B6和辅酶Q10可减低其对心脏的毒性；恶心、食欲减退；药物溢出血管外可引起组织溃疡及坏死。这些副作用以及伴随阿霉素大量使用所产生的耐药性都大大限制了阿霉素的临床应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供外泌体在制备阿霉素和氯尼达明联合递送制剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种阿霉素和氯尼达明联合递送制剂。
本发明的再一目的在于提供上述阿霉素和氯尼达明联合递送制剂的制备方法。
本发明的技术方案如下：
外泌体在制备阿霉素和氯尼达明联合递送制剂中的应用，所述外泌体来自于A549细胞。
在本发明的一个优选实施方案中，所述外泌体的粒径为40-100nm。
进一步优选的，所述外泌体的中位粒径为54-55nm。
更进一步优选的，所述外泌体的制备方法包括如下步骤：
(1)A549细胞解冻后离心处理，弃冻存液上清，用DMEM完全培养基重悬细胞，转移至培养皿中培养；待细胞传至2-3代后，将细胞按照适合的密度传至另一培养皿中培养以收集细胞上清液，待细胞长至80-90％的融合度后，吸走含有血清的培养基，并用 PBS洗涤，再加DMEM非完全培养基对细胞进行饥饿处理，刺激细胞分泌外泌体，获得含有外泌体的上清液；
(2)利用差速离心法提取含有外泌体的上清液中的外泌体，首先将该上清液于300g，4℃下离心10min，以除去死细胞沉淀；接着于3000g，4℃下离心20min，以去除小的细胞碎片沉淀物；然后于16000g，4℃下离心45min，以去除尺寸较大的微泡沉淀物，最后于120000g，4℃离心80min，获得沉淀，该沉淀即为所述外泌体，将该沉淀用50-100μL PBS分散，并置于-20℃保存备用。
本发明的另一技术方案如下：
一种阿霉素和氯尼达明联合递送制剂，由外泌体、DOX和LND经2-4℃共孵育 24-36h制成，其中，外泌体来自于A549细胞。
在本发明的一个优选实施方案中，所述外泌体的粒径为40-100nm。
进一步优选的，所述外泌体的中位粒径为54-55nm。
更进一步优选的，所述外泌体的制备方法包括如下步骤：
(1)A549细胞解冻后离心处理，弃冻存液上清，用DMEM完全培养基重悬细胞，转移至培养皿中培养；待细胞传至2-3代后，将细胞按照适合的密度传至另一培养皿中培养以收集细胞上清液，待细胞长至80-90％的融合度后，吸走含有血清的培养基，并用 PBS洗涤，再加DMEM非完全培养基对细胞进行饥饿处理，刺激细胞分泌外泌体，获得含有外泌体的上清液；
(2)利用差速离心法提取含有外泌体的上清液中的外泌体，首先将该上清液于300g，4℃下离心10min，以除去死细胞沉淀；接着于3000g，4℃下离心20min，以去除小的细胞碎片沉淀物；然后于16000g，4℃下离心45min，以去除尺寸较大的微泡沉淀物，最后于120000g，4℃离心80min，获得沉淀，该沉淀即为所述外泌体，将该沉淀用50-100μL PBS分散，并置于-20℃保存备用。
上述阿霉素和氯尼达明联合递送制剂的制备方法，包括：将分散于PBS中的所述外泌体与DOX、LND在2-4℃共10-15h，然后超速离心去除游离的DOX和LND，并用 PBS洗涤一遍以除去没有包载入外泌体中的DOX和LND。
本发明的有益效果是：本发明将氯尼达明(LND)作为阿霉素(DOX)的化疗增敏剂，共同负载于外泌体中，降低了DOX的用量，并且显著提高了抑癌效果。
附图说明
图1为本发明实施例1的实验结果图之一。
图2为本发明实施例1的实验结果图之二。
图3为本发明实施例1的实验结果图之三。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
(1)A549细胞解冻后1200rpm离心处理3min，弃冻存液上清，用DMEM完全培养基重悬细胞，转移至10cm培养皿中培养；待细胞传至2-3代后，将细胞按照适合的密度传至另一15cm培养皿中培养以收集细胞上清液，待细胞长至80-90％的融合度后，吸走含有血清的培养基，并用PBS洗涤2次，再加15mL DMEM非完全培养基对细胞进行饥饿处理，刺激细胞分泌外泌体，72h后收集上清，获得含有外泌体的上清液；
(2)利用差速离心法提取含有外泌体的上清液中的外泌体，首先将该上清液于300g，4℃下离心10min，以除去死细胞沉淀；接着于3000g，4℃下离心20min，以去除小的细胞碎片沉淀物；然后于16000g，4℃下离心45min，以去除尺寸较大的微泡沉淀物，最后于120000g，4℃离心80min，获得沉淀，该沉淀即为所述外泌体，将该沉淀用50-100μL PBS分散，并置于-20℃保存备用。
(3)将分散于PBS中的外泌体(Exo)分别与一定量的DOX、LND、DOX+LND 在4℃下过夜共孵育(10-15h)，然后超速离心去除游离的药物，并用PBS洗涤一遍以除去没有包载入细胞外囊泡中的游离药物，最终得到DOX-Exo、LND-Exo、DOX/LND- Exo三种载药囊泡。所有收集到的载药囊泡都用50-100μL培养基重悬，置于-80℃保存备用。
(4)载药囊泡(DOX/LND-Exo)抑癌效果的探究：
1)MTT细胞毒性实验：通过MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)法检测载药细胞外囊泡的体外细胞毒性作用。首先将A549细胞以5000个/孔接种到96孔板中，培养过夜，弃去旧的培养基，并用PBS洗两遍细胞，分别将不同浓度DOX 和LND以及以上三种载药囊泡与细胞共孵育36h，孵育结束后弃去含有药物的培养基，并用PBS洗涤细胞，以除去残留的药物，然后每孔加入200μL MTT溶液(0.5mg/mL)，继续孵育4h。最后将孔中的MTT溶液完全除去，往每孔中加入200μL DMSO，后将孔板放在37℃摇床上20min，然后用多功能酶标仪检测每孔在490nm处的吸光度，分析不同组别对A549细胞的杀伤效果。细胞存活率＝实验组OD值/对照组OD值×100％；药物对细胞活性的抑制率＝1-细胞存活率，并通过SPSS软件计算出药物经不同处理方式处理后的半抑制浓度(IC50)，通过比较IC50说明不同系统的抗癌效果。其中分别通过测DOX的荧光和LND在299nm处的吸光度对载药囊泡(DOX/LND-Exo)进行定量。
2)肿瘤抑制实验：为了进一步探究载药囊泡(DOX/LND-Exo)的体内抗肿瘤效果，建立了裸鼠的皮下瘤模型，按每只鼠5×106个A549细胞的量注射至裸鼠右腿皮下，待皮下瘤大小生长至近80mm3，按照每组5只鼠，将小鼠随机分成Control(PBS)，游离 DOX、游离DOX/LND、DOX-Exo、DOX/LND-Exo五组，并开始尾静脉给药，每三天给一次药，共给药五次；每两天记录一次小鼠的体重和肿瘤大小，第16天处死小鼠，并取出其肿瘤，称量并拍照。
图1a为以上制得的外泌体的透射电子显微镜(TEM)图，可以观察到利用差速离心法提取到的外泌体的形态主要为圆形或椭圆形，图1b为用纳米流式技术(nano-flowcytometry，nFCM)检测通过超速离心得到的Exo的粒径主要分布在40-100nm范围内，尺寸分布相对较集中，粒径较均一，中位粒径尺寸为54.25nm，图1c为Exo的蛋白表征，本实施例选用了能与细胞外囊泡上特定抗原特异性结合的CD 63抗体、TSG101抗体进行检测分析，在A549细胞裂解液和EVs 120k中均含有CD 63蛋白和TSG101蛋白， CD 63蛋白是Exo的标志性蛋白质，而TSG101蛋白是肿瘤易感基因表达蛋白，在肿瘤细胞和肿瘤细胞分泌的外泌体中均存在。这表明本实施例成功提取到了由肺腺癌细胞 A549分泌的Exo。图1d为DOX-Exo的荧光显微镜图像，在525nm绿光的激发下，样品发出了DOX的红色荧光，这表明通过共孵育的方法可以制备载药细胞外囊泡。
图2a-d分别为特定浓度的游离DOX、游离DOX/LND、DOX-Exo、LND-Exo、 DOX/LND-Exo的细胞杀伤效果，通过比较不同组的IC50，可以发现这些组的抑癌效果 DOX/LND-Exo＞DOX-Exo＞DOX/LND＞DOX，DOX的IC50为7.114μg/mL，为 DOX/LND组的2.9倍，为DOX-Exo组的27倍，为DOX/LND-Exo组的82.7倍， DOX/LND-Exo显示出优秀的体外抑癌效果。
图3a-b为对照组、特定浓度的游离DOX、游离DOX/LND、DOX-Exo、DOX/LND-Exo 六组的肿瘤抑制效果，图3a为小鼠的肿瘤生长曲线，图3b为小鼠的肿瘤重量图。其中DOX/LND-Exo组显示出最佳的抗肿瘤效果，DOX/LND-Exo组的相对肿瘤体积和相对肿瘤重量分别为对照组的53％和47％(p＜0.01)，DOX-Exo组分别为58％和62％， DOX/LND组分别为66％和72％，DOX组分别为95％和86％，可以发现这些组的体内抗肿瘤效果：DOX/LND-Exo＞DOX-Exo＞DOX/LND＞DOX。体内抗肿瘤数据再次验证了LND作为化疗增敏剂的抑癌效果，以及Exo展示出作为天然载体同时负载DOX和 LND实现的显著抗肿瘤效果。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (9)
1.外泌体在制备阿霉素和氯尼达明联合递送制剂中的应用，其特征在于：所述外泌体来自于A549细胞。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述外泌体的粒径为40-100nm。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述外泌体的中位粒径为54-55nm。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述外泌体的制备方法包括如下步骤：
(1)A549细胞解冻后离心处理，弃冻存液上清，用DMEM完全培养基重悬细胞，转移至培养皿中培养；待细胞传至2-3代后，将细胞按照适合的密度传至另一培养皿中培养以收集细胞上清液，待细胞长至80-90％的融合度后，吸走含有血清的培养基，并用PBS洗涤，再加DMEM非完全培养基对细胞进行饥饿处理，刺激细胞分泌外泌体，获得含有外泌体的上清液；
(2)利用差速离心法提取含有外泌体的上清液中的外泌体，首先将该上清液于300g，4℃下离心10min，以除去死细胞沉淀；接着于3000g，4℃下离心20min，以去除小的细胞碎片沉淀物；然后于16000g，4℃下离心45min，以去除尺寸较大的微泡沉淀物，最后于120000g，4℃离心80min，获得沉淀，该沉淀即为所述外泌体，将该沉淀用50-100μL PBS分散，并置于-20℃保存备用。
5.一种阿霉素和氯尼达明联合递送制剂，其特征在于：由外泌体、DOX和LND经2-4℃共孵育24-36h制成，其中，外泌体来自于A549细胞。
6.如权利要求5所述的一种阿霉素和氯尼达明联合递送制剂，其特征在于：所述外泌体的粒径为40-100nm。
7.如权利要求6所述的一种阿霉素和氯尼达明联合递送制剂，其特征在于：所述外泌体的中位粒径为54-55nm。
8.如权利要求7所述的一种阿霉素和氯尼达明联合递送制剂，其特征在于：所述外泌体的制备方法包括如下步骤：
(1)A549细胞解冻后离心处理，弃冻存液上清，用DMEM完全培养基重悬细胞，转移至培养皿中培养；待细胞传至2-3代后，将细胞按照适合的密度传至另一培养皿中培养以收集细胞上清液，待细胞长至80-90％的融合度后，吸走含有血清的培养基，并用PBS洗涤，再加DMEM非完全培养基对细胞进行饥饿处理，刺激细胞分泌外泌体，获得含有外泌体的上清液；
(2)利用差速离心法提取含有外泌体的上清液中的外泌体，首先将该上清液于300g，4℃下离心10min，以除去死细胞沉淀；接着于3000g，4℃下离心20min，以去除小的细胞碎片沉淀物；然后于16000g，4℃下离心45min，以去除尺寸较大的微泡沉淀物，最后于120000g，4℃离心80min，获得沉淀，该沉淀即为所述外泌体，将该沉淀用50-100μL PBS分散，并置于-20℃保存备用。
9.权利要求5至7中任一权利要求所述的一种阿霉素和氯尼达明联合递送制剂的制备方法，其特征在于：包括：将分散于PBS中的所述外泌体与DOX、LND在2-4℃共10-15h，然后超速离心去除游离的DOX和LND，并用PBS洗涤一遍以除去没有包载入外泌体中的DOX和LND。
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| CN110124058A (zh) * | 2019-06-06 | 2019-08-16 | 福建医科大学附属第一医院 | 一种来源于骨髓间充质干细胞外泌体-阿霉素纳米靶向药物的制备及体外抗骨肉瘤的研究 |
-
2021
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