CN116650673A - 细胞膜包覆的药脂颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术、药物制剂技术领域，具体涉及一种细胞膜包覆的药脂颗粒及其制备方法和应用。所述细胞膜包覆的药脂颗粒具有核壳结构；内核为含有化疗药物的脂质颗粒；外壳为表面修饰IR780碘化物的细胞膜；所述表面修饰IR780碘化物的细胞膜中，含有DSPE‑PEG‑IR780；所述DSPE‑PEG‑IR780与细胞膜嵌合；所述DSPE‑PEG‑IR780结构式如式(I)所示；

Description

细胞膜包覆的药脂颗粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术、药物制剂技术领域，具体涉及一种细胞膜包覆的药脂颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤是目前影响人类生存和健康的最主要疾病之一，手术切除、放疗和化疗是目前临床是治疗恶性肿瘤的三种最主要手段。但是手术治疗无法切除微小的肿瘤病灶；化疗是常用的术后辅助疗法，但是化疗存在严重的毒副作用，易产生耐药性，从而导致治疗的失败；放疗在杀死肿瘤细胞同时，易损伤外周组织，副作用较大。因此，寻找安全、高效的靶向治疗手段，延长患者存活时间，同时最大限度减轻治疗副反应是肿瘤科医生亟需解决的科学问题。
细胞膜包被是近些年来新兴起的一种增加药物或药物载体靶向性的一种手段，经过细胞膜包被的药物或药物载体，能够将药物更加准确地递送到给药组织，极大提高药物的治疗效果，增加药物或药物载体的组织相容性，减少排斥反应。肿瘤细胞体外增殖快、易获取，将肿瘤细胞膜修饰在纳米给药系统表面可赋予其多种细胞膜所特有的优势，包括良好的生物相容性、低免疫原性、病灶同源靶向性等。利用同源性肿瘤细胞膜包被纳米药物，靶向并递送治疗药物至肿瘤病灶，可能是值得探索的肿瘤靶向治疗新策略。已经进入体内的细胞膜膜包被给药系统，亦可借助肿瘤组织特殊的微环境，通过同源靶向机制聚集于肿瘤病灶组织和细胞，完成靶向过程，增强药物疗效。
线粒体是调控细胞凋亡重要的亚细胞器，可作为诱导肿瘤细胞凋亡的重要靶点。肿瘤细胞的线粒体膜电位为150～180mV，电性内负外正，远高于正常细胞。因此，肿瘤细胞线粒体可富集阳离子透膜物质，研究发现电子移位亲脂性阳离子(Delocalizedlipophilic cations,DLCs)能够穿过细胞膜和线粒体膜的疏水屏障，且在细胞跨膜电位的推动下，进入细胞质及线粒体内。为降低脱靶效应，有效抑制肿瘤细胞增长，靶向肿瘤细胞线粒体成为肿瘤治疗的重要切入点。
IR780碘化物(IR780)是一种七甲川花菁荧光小分子，具有良好的亲脂性阳离子特性。由于肿瘤细胞过表达的有机阴离子转运体多肽(Organic anion transporterpeptides,OATPs)以及较高的线粒体膜电位，IR780能够优先聚集于肿瘤细胞内部，因此可用作线粒体靶向修饰，进一步增强化疗药物的肿瘤细胞内的靶向作用，提高抗肿瘤疗效。但是，游离IR780存在水溶性低、毒性强，体内清除速度快。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的化疗药物缺乏肿瘤病灶部位靶向分布及肿瘤细胞线粒体靶向聚集性的问题，以及外源性载体引起的生物安全性问题，提供一种细胞膜包覆的药脂颗粒及其制备方法和应用，该细胞膜包覆的药脂颗粒能够在肿瘤细胞及肿瘤细胞线粒体靶向递送化疗药物，可实现对肿瘤细胞的靶向治疗作用。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种细胞膜包覆的药脂颗粒，该细胞膜包覆的药脂颗粒具有核壳结构；内核为含有化疗药物的脂质颗粒；外壳为表面修饰IR780碘化物的细胞膜；所述表面修饰IR780碘化物的细胞膜中，含有DSPE-PEG-IR780；所述DSPE-PEG-IR780与细胞膜嵌合；所述DSPE-PEG-IR780结构式如式(I)所示；
本发明第二方面提供一种本发明所述的药脂颗粒的制备方法，该方法包括：
(1)将二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇与含IR780碘化物和缚酸剂的混合物接触得到DSPE-PEG-IR780；
(2)将细胞膜与DSPE-PEG-IR780涡旋混合得到表面修饰IR780碘化物的细胞膜；
(3)将所述表面修饰IR780碘化物的细胞膜与脂质颗粒混合后，用聚碳酸酯滤膜挤压，得到所述药脂颗粒。
本发明第三方面提供一种本发明所述的细胞膜包覆的药脂颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用，优选地，所述细胞膜选自同源性肿瘤细胞膜。
本发明第四方面提供一种本发明所述的细胞膜包覆的药脂颗粒在制备肿瘤线粒体靶向治疗药物中的应用，优选地，所述细胞膜选自同源性肿瘤细胞膜。
通过上述技术方案，本发明提供的细胞膜包覆的药脂颗粒，能够提高化疗药物在肿瘤细胞及肿瘤细胞线粒体的靶向递送效果，实现化疗药物在肿瘤细胞及肿瘤细胞线粒体靶向递送，增强抗肿瘤疗效，同时能够避免外源性载体引起的生物安全性问题，减少化疗药物的毒副作用。
当所述细胞膜为同源性肿瘤细胞膜，尤其是所述肿瘤细胞为脑胶质瘤、骨肉瘤、黑色素瘤、肝癌、乳腺癌和胰腺癌等肿瘤细胞时，可利用肿瘤细胞膜的同源靶向性，以及肿瘤细胞过表达的有机阴离子转运体多肽(Organic anion transporter peptides,OATPs)和较高的线粒体膜电位，选择性聚集于肿瘤细胞线粒体，进一步提高化疗药物在肿瘤细胞及肿瘤细胞线粒体靶向递送，提高抗肿瘤疗效，同时有效避免外源性载体引起的生物安全性问题，减少化疗药物的毒副作用，在肿瘤靶向治疗领域具有重要的临床应用前景。
附图说明
图1是制备例9制备的细胞膜测试结果图；
图2是制备例10制备的细胞膜测试结果图；
图3是制备例11制备的细胞膜测试结果图；
图4是实施例2中，U87 MG细胞的荧光摄取图；
图5是对比例1、实施例3中，MG 63细胞的荧光摄取图；
图6是对比例1、实施例3中，D@SLNP/@OSM-IR780在MG 63细胞线粒体的靶向分布图；
图7是对比例1、实施例3中，细胞存活率统计图；
图8是实施例4中，D@SLNP/@Mem-IR780在K7M2细胞线粒体的靶向分布情况；
图9是实施例4中，小动物活体荧光成像系统观察各实验组肿瘤组织中的药物分布图。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明第一方面提供一种细胞膜包覆的药脂颗粒，该细胞膜包覆的药脂颗粒具有核壳结构；内核为含有化疗药物的脂质颗粒；外壳为表面修饰IR780碘化物的细胞膜；所述表面修饰IR780碘化物的细胞膜中，含有DSPE-PEG-IR780，以及不含细胞内容物、但保留细胞膜表面功能蛋白及分子的磷脂双分子结构的生物膜；所述DSPE-PEG-IR780与细胞膜嵌合；所述DSPE-PEG-IR780结构式如式(I)所示；
本发明中，表面修饰IR780碘化物的细胞膜中，不含细胞内容物但保留细胞膜表面功能蛋白及分子的磷脂双分子结构的生物膜。
本发明中，当所述细胞膜为同源性肿瘤细胞膜，可利用肿瘤细胞膜的同源靶向性，以及肿瘤细胞较高的膜电位及过表达的有机阴离子转运体多肽，选择性聚集于肿瘤细胞线粒体，提高化疗药物在肿瘤细胞及肿瘤细胞线粒体靶向递送，根据本发明的一种优选实施方式，所述细胞膜选自肿瘤细胞膜，优选所述细胞膜选自脑胶质瘤细胞膜、骨肉瘤细胞膜、黑色素瘤细胞膜、肝癌细胞膜、乳腺癌细胞膜和胰腺癌细胞膜中的至少一种；更优选所述细胞膜来自人源性肿瘤细胞或鼠源性肿瘤细胞。有利于进一步提高化疗药物在肿瘤细胞及肿瘤细胞线粒体靶向递送，提高抗肿瘤疗效。
本发明中，所述化疗药物可选的范围较宽，根据本发明的一种优选实施方式，所述化疗药物选自阿霉素、紫杉醇、雷公藤红素和多西他赛中的一种或多种。
本发明中，所述脂质颗粒中，脂类物质可选的范围较宽，根据本发明的一种优选实施方式，脂类物质选自单硬脂酸甘油酯、卵磷脂、大豆磷脂、双硬脂酸甘油酯和三硬脂酸甘油酯中的至少一种，优选为单硬脂酸甘油酯和卵磷脂，优选地，单硬脂酸甘油酯与卵磷脂的质量比为0.3-3。
根据本发明的一种优选实施方式，所述脂质颗粒的粒径不高于200nm，优选为50-200nm。
根据本发明的一种优选实施方式，所述脂质颗粒的包封率为40％-90％。
本发明中，包封率指的是被包裹的药脂颗粒在表面修饰IR780碘化物的细胞膜悬液中占药脂颗粒总量的百分量。
根据本发明的一种优选实施方式，本发明提供一种本发明所述脂质颗粒的制备方法，该方法包括：
(i)将脂类物质溶解在无水乙醇中作为油相，PEG-400为水相，化疗药物分散在油相中；
(ii)将水相、油相各自加热到50-80℃；
(iii)将水相、油相混合，保持50-80℃并搅拌；静置、冷却得到空白脂质颗粒；
(iv)将所述空白脂质颗粒加入含化疗药物的二甲基亚砜溶液中，50-80℃搅拌得到脂质颗粒。
根据本发明的一种优选实施方式，步骤(iii)和(iv)中，搅拌的转速为100-300rpm。
根据本发明的一种优选实施方式，步骤(iv)中，按照5％-20％的投药量加入空白脂质颗粒。
本发明中，所述脂质颗粒与表面修饰IR780碘化物的细胞膜的质量比可选的范围较宽，根据本发明的一种优选实施方式，所述脂质颗粒与表面修饰IR780碘化物的细胞膜的质量比不低于0.05，优选为0.05-0.5。
本发明中，具有前述特征的药脂颗粒均能够实现本发明的目的，本发明对所述药脂颗粒的制备方法没有特别的要求，根据本发明的一种优选实施方式，本发明第二方面提供一种本发明所述的药脂颗粒的制备方法，该方法包括：
(1)将二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇与含IR780碘化物和缚酸剂的混合物接触得到DSPE-PEG-IR780；
(2)将细胞膜与DSPE-PEG-IR780涡旋混合得到表面修饰IR780碘化物的细胞膜；
(3)将所述表面修饰IR780碘化物的细胞膜与脂质颗粒混合后，用聚碳酸酯滤膜挤压，得到所述药脂颗粒。
本发明所述的制备方法，以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)为桥链，三乙胺为缚酸剂，通过取代反应制备DSPE-PEG-IR780。采用脂质体插入法，将DSPE-PEG-IR780和细胞膜涡旋混合，DSPE-PEG-IR780中含有的二硬脂酰基磷脂基团与细胞膜具有很强的亲和性，可以通过脂质相互作用插入到细胞膜中，从而能够得到表面修饰IR780碘化物的细胞膜。
根据本发明的一种优选实施方式，步骤(1)中，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、IR780碘化物、缚酸剂的物质的质量比为1:(0.2-5):(0.01-1)。
根据本发明的一种优选实施方式，步骤(2)中，涡旋混合条件包括：温度为0-4℃；可以根据实际需求合理确定涡旋时间，优选地，时间30s-90s。
根据本发明的一种优选实施方式，步骤(2)中，细胞膜与DSPE-PEG-IR780的质量比为2-20。
根据本发明的一种优选实施方式，步骤(3)中，将所述表面修饰IR780碘化物的细胞膜与脂质颗粒质量比为1-5:1，优选为2-4:1。优选地，将所述表面修饰IR780碘化物的细胞膜与脂质颗粒等体积混合。
本发明中，步骤(1)中，所述缚酸剂可选的种类较宽，根据本发明的一种优选实施方式，所述缚酸剂选自三乙胺、吡啶和N,N-二异丙基乙胺中的至少一种。
本发明中，步骤(3)中，所述聚碳酸酯滤膜的孔径可选的范围较宽，根据本发明的一种优选实施方式，所述聚碳酸酯滤膜的孔径为100-400nm。
本发明中，对所述肿瘤细胞膜的提取方式没有特别的限定，根据本发明的一种优选实施方式，本发明提供一种所述肿瘤细胞膜的提取方法，该方法包括：
将肿瘤细胞沉淀后，用低渗缓冲溶液处理、零下80℃-零下20℃和室温反复冻融后，梯度离心收集得到肿瘤细胞膜。
本发明中，对所述低渗缓冲溶液的种类没有特别的限定，根据本发明的一种优选实施方式，所述低渗缓冲溶液选自20mM pH 7.5Tris-HCl、10mM KCl、2mM MgCl2组成的混合溶液。
本发明第三方面提供一种本发明所述的细胞膜包覆的药脂颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用，优选地，所述细胞膜选自同源性肿瘤细胞膜。
根据本发明的一种优选实施方式，所述的细胞膜包覆的药脂颗粒在制备抗脑胶质瘤、骨肉瘤、黑色素瘤、肝癌、乳腺癌和胰腺癌药物中的应用。
本发明第四方面提供一种本发明所述的细胞膜包覆的药脂颗粒在制备肿瘤线粒体靶向治疗药物中的应用，优选地，所述细胞膜选自同源性肿瘤细胞膜。
根据本发明的一种优选实施方式，所述的细胞膜包覆的药脂颗粒在制备抗脑胶质瘤、骨肉瘤、黑色素瘤、肝癌、乳腺癌和胰腺癌肿瘤线粒体靶向治疗药物中的应用。
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但是这些实施例无论如何都不对本发明的范围构成限制。
制备例1-5
(i)按照表1的质量比称取处方量的单硬脂酸甘油酯、卵磷脂共0.6g，溶解在60mL无水乙醇中制成油相；配制0.1wt％的聚乙二醇400(PEG400)水溶液作为水相；
(ii)分别将油相和水相加热到60℃；
(iii)将油相快速注入到水相中，保持60℃，200rpm继续搅拌5min，将制备好的混悬液静置，使其冷却至室温即得浓度为1mg/mL的空白脂质颗粒，采用动态光散射法测定空白脂质颗粒粒径见表1。
表1
编号 单硬脂酸甘油酯与卵磷脂质量比 空白脂质颗粒粒径mm
制备例1 3:1 172.0±2.8
制备例2 2:1 116.3±1.9
制备例3 1:1 105.9±2.1
制备例4 1:2 78.2±2.9
制备例5 1:3 56.5±1.2
制备例6-8
精密称取10mg阿霉素，将其溶解于二甲基亚砜中，配成5mg/mL的阿霉素储备液备用。按照表2的投药量，边搅拌边向按照制备例1制备的浓度为1mg/mL的空白脂质纳米粒溶液中加入阿霉素储备液，于60℃，200rpm继续搅拌30min，即可得载阿霉素药脂颗粒。
表2
编号 投药量％ 载药量％ 脂质颗粒粒径nm 包封率％
制备例6 5 4.06±0.01 63.9±1.6 84.56±0.09
制备例7 10 4.81±0.02 63.3±0.9 50.50±0.13
制备例8 20 7.81±0.01 78.2±8.3 42.34±0.11
表2中，投药量指的是制备载药脂颗粒时加入空白脂质纳米粒溶液中的药物含量。
表2中，载药量指的是单位重量空白脂质纳米粒溶液中所负载的药物的比例。
表2中，包封率指的是被包裹的药物在空白脂质纳米粒溶液中占药物总量的百分量。
制备例9-12
采用表3所示的肿瘤细胞，采用低渗缓冲溶液(20mM pH 7.5Tris-HCl、10mM KCl、2mM MgCl2组成的混合溶液)处理细胞，于-80℃和室温反复冻融细胞3次，梯度离心获取细胞膜。
表3
SDS-PAGE、Western Blot检测分析提取的细胞膜中生物膜蛋白保留情况。
制备例9制备的细胞膜测试结果如图1所示；提取的U87 MG细胞膜的蛋白条带与U87 MG细胞裂解液相似(图1A)，此外U87 MG细胞膜保留了膜特异性蛋白Na+/K+-ATPase，与U87 MG细胞相比，U87 MG细胞膜几乎没有GAPDH、Cytochrome C和Histone H3的表达(图1B)，表明U87 MG细胞膜较完整地保留了细胞膜蛋白。
制备例10制备的细胞膜测试结果如图2所示；提取的C6细胞膜的蛋白条带与C6细胞裂解液相似(图2A)，此外C6细胞膜保留了膜特异性蛋白Na+/K+-ATPase，与C6细胞相比，C6细胞膜几乎没有GAPDH、Cytochrome C和Histone H3的表达(图2B)，表明C6细胞膜较完整地保留了细胞膜蛋白。
制备例11制备的细胞膜测试结果如图3所示；提取的MG 63细胞膜的蛋白条带与MG63细胞裂解液相似(图3A)，此外MG 63细胞膜保留了膜特异性蛋白Na+/K+-ATPase，与MG 63细胞相比，MG 63细胞膜几乎没有GAPDH、Cytochrome C和Histone H3的表达(图3B)，表明MG63细胞膜较完整地保留了细胞膜蛋白。
实施例1
(1)将2.8g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇与0.67gIR780碘化物和0.20g缚酸剂混合反应得到DSPE-PEG-IR780；
(2)将DSPE-PEG-IR780与制备例9制备的U87 MG细胞膜按照质量比20％:1涡旋混合得到表面修饰IR780碘化物的细胞膜；
(3)将步骤(2)中所述表面修饰IR780碘化物的细胞膜(GBMM)与制备例6制备的脂质颗粒(D@SLNP)按照质量比2:1混合后，采用脂质体挤出器挤出，混合溶液先后通过400nm、200nm聚碳酸酯滤膜挤出，得到药脂颗粒D@SLNP@GBMM。
实施例2
按照实施例1的方法，不同之处在于，步骤(3)中，所述表面修饰IR780碘化物的细胞膜(GBMM)与制备例6制备的脂质颗粒(D@SLNP)质量比为4:1。
以U87 MG为模型细胞，将细胞以5×104/mL密度接种于24孔板，至细胞贴壁，分别加入含等量药物的D@SLNP和D@SLNP@GBMM溶液，37℃孵育6h，激光共聚焦显微镜观察U87 MG细胞的荧光摄取，结果如图4所示。D@SLNP@GBMM在U87 MG胞内的红色荧光信号明显强于D@SLNP，且GBMM和D@SLNP以质量比2:1混合时，细胞靶向摄取效果更明显，表明同源肿瘤细胞膜包被可增强药脂纳米粒在同源肿瘤细胞的靶向摄取。
实施例3
(1)将1.4g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇与0.33g IR780碘化物和0.10g缚酸剂混合反应得到DSPE-PEG-IR780；
(2)将DSPE-PEG-IR780与制备例11制备的人源性骨肉瘤MG 63细胞膜按照质量比20％:1涡旋混合得到表面修饰IR780碘化物的细胞膜；
(3)将步骤(2)中所述表面修饰IR780碘化物的细胞膜(OSM-IR780)与制备例6制备的脂质颗粒(D@SLNP)按照质量比2:1混合后，采用脂质体挤出器挤出，混合溶液先后通过400nm、200nm聚碳酸酯滤膜挤出，得到药脂颗粒D@SLNP@OSM-IR780，粒径为136.4±6.3nm。
对比例1
按照实施例3的方法，不同之处在于，未对人源性骨肉瘤MG 63细胞膜进行修饰；具体为：
(1)将人源性骨肉瘤MG 63细胞膜(OSM)与制备例6制备的脂质颗粒(D@SLNP)按照质量比2:1混合后，采用脂质体挤出器挤出，混合溶液先后通过400nm、200nm聚碳酸酯滤膜挤出得到药脂颗粒(D@SLNP@OSM)，粒径为180.9±5.8nm。
药脂颗粒在同源肿瘤细胞的靶向分布测试：
以人源性骨肉瘤MG 63为模型细胞，将细胞以5×104/mL密度接种于24孔板，至细胞贴壁，加入含药(阿霉素)量相等的DOX、D@SLNP、D@SLNP@OSM和D@SLNP@OSM-IR780，置于37℃、5％二氧化碳孵育12h。实验终止后，PBS冲洗细胞3次，4％甲醛溶液固定15min，激光共聚焦显微镜观察DOX、D@SLNP、D@SLNP@OSM和D@SLNP@OSM-IR780在细胞中的摄取情况，结果如图5所示。D@SLNP@OSM和D@SLNP@OSM-IR780在MG 63细胞内的荧光信号明显强于D@SLNP和DOX，D@SLNP@OSM-IR780在MG 63细胞摄取的荧光信号最强，表明同源肿瘤细胞膜包被可增强药脂纳米粒在同源肿瘤细胞的靶向摄取，IR780修饰可进一步增强同源肿瘤细胞膜包被的药脂颗粒在同源肿瘤细胞的靶向分布。
药脂颗粒在同源肿瘤细胞线粒体的靶向分布测试：
将MG 63细胞以5×104/mL密度接种于24孔板，至细胞贴壁，分别加入含等量药物的D@SLNP、D@SLNP/@OSM和D@SLNP/@OSM-IR780溶液，置于37℃、5％二氧化碳孵育12h。加入含有Mitotracker Green(100nM)的无血清培养液，染色30min。实验终止后，PBS冲洗细胞3次，4％甲醛溶液固定15min，甘油封片。激光共聚焦显微镜观察D@SLNP/@OSM-IR780在MG 63细胞线粒体的靶向分布情况，结果如图6所示，D@SLNP/@OSM-IR780在MG 63细胞内表现出最强的红色荧光分布，且与线粒体存在明显的共定位信号(黄色)，表明IR780修饰可显著增强同源性肿瘤细胞膜包被的药脂纳米粒的在同源肿瘤细胞线粒体的靶向分布。
细胞毒性测试：
以人源性骨肉瘤MG 63为模型细胞，采用四唑蓝比色法评价IR780修饰的同源性骨肉瘤MG 63肿瘤细胞膜包被的药脂颗粒(D@SLNP@OSM-IR780)对同源肿瘤细胞的生长抑制效果。
将MG 63细胞以5×103/mL密度接种于96孔板中，在37℃、5％二氧化碳条件下孵育至细胞贴壁。加入含有不同药物浓度(0-10μg/mL)的DOX、D@SLNP、D@SLNP@OSM和D@SLNP@OSM-IR780溶液，以未处理细胞作为空白对照，每组重复3次。孵育48h后，每孔加入5mg/mL噻唑蓝20μL，继续孵育4h，弃去培养基，向每孔加入200μL二甲基亚砜，将96孔板置于恒温振荡箱中振荡15分钟。酶标仪测量570nm处吸光度值。根据以下公式计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝(实验组的吸光度/对照组的吸光度值)×100％
结果如图7所示，D@SLNP@OSM-IR780对同源MG 63细胞表现出显著的细胞毒性，其对细胞的半数致死率IC50值为1.52μg/mL，DOX、D@SLNP、D@SLNP@OSM对MG 63细胞的IC50值分别为9.41μg/mL、13.23μg/mL、3.30μg/mL。表明D@SLNP@OSM-IR780可显著增强药脂颗粒对同源肿瘤细胞的细胞毒性。
实施例4
(1)将2.8g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇与0.67gIR780碘化物和0.20g缚酸剂混合反应得到DSPE-PEG-IR780；
(2)将DSPE-PEG-IR780与制备例12制备的鼠源性骨肉瘤K7M2细胞膜按照质量比20％:1涡旋混合得到表面修饰IR780碘化物的细胞膜；
(3)将步骤(2)中所述表面修饰IR780碘化物的细胞膜(Mem-IR780)与制备例6制备的脂质颗粒(D@SLNP)按照质量比2:1混合后，采用脂质体挤出器挤出，混合溶液先后通过400nm、200nm聚碳酸酯滤膜挤出，得到药脂颗粒D@SLNP@Mem-IR780，粒径为136.4±6.3nm。
药脂颗粒在同源肿瘤细胞的靶向分布测试：
将K7M2细胞以5×104/mL密度接种于24孔板，至细胞贴壁，分别加入含等量药物的D@SLNP、D@SLNP/@Mem和D@SLNP/@Mem-IR780溶液，置于37℃、5％二氧化碳孵育12h。加入含有Mitotracker Green(100nM)的无血清培养液，染色30min。实验终止后，PBS冲洗细胞3次，4％甲醛溶液固定15min，甘油封片。激光共聚焦显微镜观察D@SLNP/@Mem-IR780在K7M2细胞线粒体的靶向分布情况，结果如图8所示，D@SLNP/@Mem-IR780在K7M2细胞内表现出最强的红色荧光分布，且与线粒体存在明显的共定位信号(黄色)，表明IR780修饰可显著增强同源性肿瘤细胞膜包被的药脂颗粒的在同源肿瘤细胞线粒体的靶向分布。
选择雄性BABL/c小鼠(4-6w)为模型动物，按500万个细胞/100μL的密度将K7M2细胞皮下接种于小鼠后腿腋下，待肿瘤体积生长至适宜大小，尾静脉注射含药量相等的DOX、D@SLNP、D@SLNP/@Mem和D@SLNP/@Mem-IR780溶液。24h后，将小鼠安乐处死，剖取肿瘤组织，小动物活体荧光成像系统观察各实验组肿瘤组织中的药物分布，结果如图9所示。D@SLNP@Mem和D@SLNP@Mem-IR780在肿瘤组织的荧光信号明显强于D@SLNP和DOX，D@SLNP/@Mem-IR780在肿瘤组织中表现出最强的荧光分布，表明同源肿瘤细胞膜包被可增强药脂颗粒在同源肿瘤组织的靶向分布，IR780修饰可进一步增强同源肿瘤细胞膜包被的药脂颗粒在同源肿瘤组织的靶向性。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种细胞膜包覆的药脂颗粒，其特征在于，该细胞膜包覆的药脂颗粒具有核壳结构；内核为含有化疗药物的脂质颗粒；外壳为表面修饰IR780碘化物的细胞膜；所述表面修饰IR780碘化物的细胞膜中，含有DSPE-PEG-IR780，所述DSPE-PEG-IR780结构式如式(I)所示；
所述DSPE-PEG-IR780与细胞膜嵌合。
2.根据权利要求1所述的药脂颗粒，其中，所述细胞膜选自肿瘤细胞膜，优选所述细胞膜选自脑胶质瘤细胞膜、骨肉瘤细胞膜、黑色素瘤细胞膜、肝癌细胞膜、乳腺癌细胞膜和胰腺癌细胞膜中的至少一种；更优选所述细胞膜来自人源性肿瘤细胞或鼠源性肿瘤细胞。
3.根据权利要求1或2所述的药脂颗粒，其中，所述化疗药物选自阿霉素、紫杉醇、雷公藤红素和多西他赛中的一种或多种。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的药脂颗粒，其中，所述脂质颗粒中，脂类物质选自单硬脂酸甘油酯、卵磷脂、大豆磷脂、双硬脂酸甘油酯和三硬脂酸甘油酯中的至少一种，优选为单硬脂酸甘油酯和卵磷脂，优选地，单硬脂酸甘油酯与卵磷脂的质量比为0.3-3；和/或
所述脂质颗粒的粒径不高于200nm，优选为50-200nm；和/或
所述脂质颗粒的包封率为40％-90％。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的药脂颗粒，其中，所述脂质颗粒与表面修饰IR780碘化物的细胞膜的质量比为不低于0.05，优选为0.05-0.5。
6.权利要求1-5中任意一项所述的药脂颗粒的制备方法，其特征在于，该方法包括：
(1)将二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇与含IR780碘化物和缚酸剂的混合物接触得到DSPE-PEG-IR780；
(2)将细胞膜与DSPE-PEG-IR780涡旋混合得到表面修饰IR780碘化物的细胞膜；
(3)将所述表面修饰IR780碘化物的细胞膜与脂质颗粒混合后，用聚碳酸酯滤膜挤压，得到所述药脂颗粒。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其中，
步骤(1)中，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、IR780碘化物、缚酸剂的物质的量比为1:(0.2-5):(0.01-1)；和/或
步骤(2)中，涡旋混合条件包括：温度为0-4℃；和/或时间30s-90s；和/或
步骤(2)中，细胞膜与DSPE-PEG-IR780的质量比为2-20；和/或
步骤(3)中，将所述表面修饰IR780碘化物的细胞膜与脂质颗粒质量比为1-5:1。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其中，
步骤(1)中，所述缚酸剂选自三乙胺、吡啶和N,N-二异丙基乙胺中的至少一种；和/或
步骤(3)中，所述聚碳酸酯滤膜的孔径为100-400nm。
9.权利要求1-5中任意一项所述的细胞膜包覆的药脂颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用，优选地，所述细胞膜选自同源性肿瘤细胞膜。
10.权利要求1-5中任意一项所述的细胞膜包覆的药脂颗粒在制备肿瘤线粒体靶向治疗药物中的应用，优选地，所述细胞膜选自同源性肿瘤细胞膜。
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