CN107854431B - 一种靶向至肝星状细胞的透明质酸纳米胶束及其制备方法和应用 - Google Patents

一种靶向至肝星状细胞的透明质酸纳米胶束及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种可以靶向至肝星状细胞的透明质酸纳米胶束及其制备方法和应用。此纳米胶束可以包载抗纤维化药物，治疗因肝星状细胞病变而引起的肝脏疾病，如肝纤维化、肝硬化等，具有粒径小（<100nm）、特异性好、肝星状细胞靶向效率高和体内外抗肝纤维化作用明显等优势，有广阔的应用前景。

Description

一种靶向至肝星状细胞的透明质酸纳米胶束及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及一种可以靶向至肝星状细胞的透明质酸纳米胶束及其制备方法和应用，属于药剂领域。
背景技术
肝脏是人体非常重要的器官，由肝实质细胞（Hepatic parenchymal cells，HPCs，约占60-70%）和非实质细胞（约占30-40%）组成。其中，非实质细胞主要包括巨噬细胞、Kupffer细胞、肝星状细胞（Hepatic stellate cells, HSCs）、肝窦内皮细胞（Liversinusoidal endothelial cells，LSECs）、免疫细胞和其他非实质细胞。作为人体中最大的固体器官，肝脏有许多生理功能，如清除异物、代谢药物、过滤血液和产生蛋白质（如白蛋白）等。其中，非实质细胞在肝脏功能中起着关键性作用，尽管它们的数量是如此之少。例如，Kupffer细胞是一种巨噬细胞，具有很强的吞噬活性；LSECs与肝脏Disse间隙的构建和免疫耐受相关；HSCs在受到体内外刺激时可被激活，指示肝损伤的发生。肝脏疾病由多种因素引起，如细菌侵袭、病毒感染、物理及化学变化等。其中，肝纤维化是一种在世界范围内具有高发病率和死亡率的慢性疾病，主要发病原因有酒精滥用、慢性肝炎、脂肪性肝炎和胆汁异常等。如若患者得不到及时有效的治疗，肝纤维化将逐渐发展成肝硬化并最终成为肝癌。
肝纤维化的发生与HSCs的状态密切相关。HSCs是肝脏Disse间隙中的一种淋巴样细胞，紧贴HPCs和LSECs，其主要功能是储存脂肪、代谢维生素A、合成并分泌重要的酶和蛋白质。此外，HSCs是分泌胶原和细胞外基质（Extracellular matrix, ECM）的主要细胞，而这种功能与肝纤维化的发生直接相关。正常情况下的HSCs呈静止态，当肝脏遭受外源性损伤或内源性炎症时，HSCs将被激活并转化为激活态。活化的HSCs会分泌大量的胶原和ECM，并在Disse间隙中累积，最终导致肝纤维化。因此，抑制HSCs的活化是治疗肝纤维化最根本的途径。
令人欣慰的是，在过去的几年中，肝纤维化已被证实是一个可逆的过程。此外，许多抗肝纤维化药物已被证明可有效地逆转HSCs的活化，如水飞蓟宾（Silybin，SLB）、干扰素α-2a（IFN α-2a）和siRNA等。然而，目前对肝纤维化的治疗仍然非常困难，主要有以下几个原因：一是HSCs的数量较少且存在于与LSECs相邻的Disse间隙中。这种独特的生理位置为药物传递至HSCs提供了天然的屏障，而且许多药物在到达HSCs之前就已被Kupffer细胞和LSECs所吞噬。二是LSECs表面有许多平均直径约为100nm的小孔，药物载体的粒径必须足够小（<100nm）才能通过这些小孔并进一步到达HSCs。三是治疗肝脏疾病的许多药物传递系统特异性较差，无法保证药物有选择性地靶向至病变肝细胞。例如，有研究者制备了用乙肝病毒肽（HBVP）修饰的PEG化脂质体，用于靶向HPCs以治疗肝炎。但其结果表明，该脂质体同样也能被非实质细胞所捕获。药物不加选择地靶向不但会降低对病变细胞的治疗效果，还会损伤其他正常的细胞。迄今为止，大多数针对肝纤维化治疗的研究和专利都存在着或多或少的缺陷。例如，国内已有的大部分相关专利着重于发现有抗纤维化活性的新的药物或药物组合物，但即使药物有显著的抗肝纤维化效果，如果没有合适的递送载体，大部分药物根本无法到达HSCs，其疗效会大打折扣。专利文献CN200610043897.1提供了一种药物组合物，该组合物以甘草酸、水飞蓟宾、红景天等为主要成分，发现了其具有抗肝炎、抗肝纤维化等作用。但由于此组合物没有合适的靶向载体递送，其治疗效果势必会随着药物“无差别”地分布而受到影响，并可能对正常的组织、器官带来毒副作用。极少一部分专利以构建HSCs靶向载体为目标，并取得了一些研究成果，但这些专利构建的靶向载体没有充分考虑到HSCs独特的生理位置和体内外抗肝纤维化作用的差异。专利文献CN201610159833.1提供了一种靶向HSCs的脂质纳米囊泡，递送siRNA，治疗因HSCs病变而引起的相关疾病。但其发明的脂质纳米囊泡平均粒径在100nm以上，大部分囊泡根本无法通过LSECs上的小孔到达HSCs，因而此靶向递药载体存在着很大的缺陷。专利文献CN201610018293.5提供了一种靶向HSCs的聚合物纳米载体，该载体以叶酸为靶头，包载疏水性的抗肝纤维化药物，用以靶向治疗肝纤维化。但该发明仅仅进行了体外细胞学研究（如细胞摄取、细胞毒性等），没有进行更深层次的体内动物学研究，其体内抗纤维化作用尚未得到验证，应用价值受到很大限制。综上所述，设计一种粒径小、特异性好、靶向效率高的HSCs靶向药物传递载体，并对其进行体内外靶向性和药效的确证，对当前肝纤维化的治疗是非常重要的。
透明质酸（Hyaluronic acid, HA）是一种由N-乙酰基-D-葡萄糖胺（1-β-4）和D-葡萄糖醛酸（1-β-3）的二糖重复单元组成的阴离子多糖，是ECM的重要组成部分。作为一种天然大分子和人体内源性物质，HA因其出色的生物相容性、生物可降解性、低毒性及低免疫原性，已被广泛应用于化妆品和医学领域。近年来，人们发现HA是肿瘤细胞表面CD44蛋白的配体，与肿瘤的生长、浸润及转移密切相关，具有抗肿瘤、促进血管生成、免疫调节和创伤修复等作用，这也赋予了HA在药学领域的应用前景，许多以HA为载体的肿瘤靶向递药系统被开发出来。专利文献CN200810200452.9提供了一种HA修饰聚氰基丙烯酸烷基酯纳米粒及其制备方法和应用，该发明将聚氰基丙烯酸烷基酯修饰到HA侧链，使其自组装形成纳米粒，用于肿瘤靶向治疗。目前以HA作为载体的制剂主要应用于肿瘤治疗领域。
综上所述，目前市场上尚无一种疗效确切、安全性较好、利于工业化大生产的、用于治疗肝纤维化、肝硬化等肝脏疾病的HSCs靶向制剂。
发明内容
为了解决应用于肝脏疾病领域药物的上述缺陷，经过一系列的研究，本发明提供了一种以HA为基础的纳米胶束，包载抗纤维化药物，靶向至HSCs，治疗因HSCs病变而引起的肝脏疾病，如肝纤维化、肝硬化等，此纳米胶束具有粒径小（<100nm）、特异性好、HSCs靶向效率高等优势。
在前期研究中，本发明人发现，除肿瘤细胞可以表达CD44受体以外，肝脏中也有CD44表达，而HSCs是肝脏中表达CD44受体的主要细胞。特别是当肝脏发生纤维化时，CD44的表达会随着HSCs的增殖而显著增加。因此，这为HA作为HSCs的靶向药物载体治疗肝纤维化提供了理论依据。而且，目前国内尚未有研究将HA应用于HSCs靶向领域。
本发明的目的之一，提供一种以HA为基础的可以靶向至HSCs的纳米胶束。
本发明的目的之一，提供一种粒径小（<100nm）、特异性好、靶向效率高的HSCs靶向纳米胶束。
本发明的目的之一，提供一种可以靶向治疗因HSCs病变而引起的肝脏疾病的纳米胶束，如肝纤维化、肝硬化等。
本发明的目的之一，提供上述纳米胶束的制备方法。
本发明的目的之一，对上述纳米胶束的体内外靶向和治疗效果进行确证。
本发明人首先对HA进行了结构修饰，将疏水性的胆酸修饰至HA侧链，制备得到了HA-胆酸耦合物，使亲水性的HA变为两亲性。然后将HA-胆酸耦合物与磷脂、胆酸盐等联用，制备得到了HA纳米胶束，使HA-胆酸耦合物的疏水性侧链插入到纳米胶束的疏水内核中，亲水性的HA主链缠绕于胶束表面，发挥HSCs靶向作用。
所述的纳米胶束，其粒径优选为20nm~100nm。
所述的纳米胶束，其载药量为0.1%~15%，优选为2%~10%。
所述HA-胆酸耦合物在处方中所占的质量分数为1%~20%，优选为4%~15%。
所述磷脂在处方中所占的质量分数为10%~60%，优选为20%~50%。
所述胆酸盐在处方中所占的质量分数为30%~80%，优选为40%~70%。
其中，所述磷脂与胆酸盐的质量比为4:1~1:8，优选为2:1~1:4。
所述的HA，其分子量为5kDa~1000kDa，优选为6kDa~300kDa。
作为具体的实施方案之一，本发明的纳米胶束的制备方法如下：
（1）用二胺类化合物做连接桥，通过酰胺反应将疏水性的胆酸与HA侧链羧基相连，制备得到两亲性的HA-胆酸耦合物。
（2）将HA-胆酸耦合物、磷脂、胆酸盐和疏水性药物按照一定质量比例混合溶于有机溶剂，置于圆底烧瓶中。旋转蒸发成膜，加水水化，即得HA载药纳米胶束。
优选地，所述水包括去离子水、注射用水、生理盐水和5%葡萄糖溶液等。
步骤（1）中的二胺类化合物，优选为乙二胺、丁二胺等两端均为氨基的化合物。
步骤（1）中的胆酸，优选为胆酸、脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸等疏水性阴离子型表面活性剂。
步骤（1）中的胆酸修饰度为4%~25%，优选为7%~10%。
步骤（2）中的磷脂选自商业来源不同规格的天然大豆磷脂、天然蛋黄磷脂、氢化磷脂以及合成磷脂，可以选自德国Lipoid公司磷脂S45、S75、S100、SPC、E80、EPCS、EPG、SPC-3、DSPE、DPPA、DSPA、DMPC等，日本丘比株式会社磷脂PC98-T、PL-100M、HSPC、PGE、PGSH等，韩国斗山公司磷脂DS-PL95E等，优选磷脂E80、S100、PC98-T、EPCS等常用市售磷脂。
步骤（2）中的胆酸盐，优选为与步骤（1）中的胆酸相对应的盐的形式。
步骤（2）中的有机溶剂优选为乙醇、甲醇、二氯甲烷、氯仿、丙酮等及其混合溶剂。
步骤（2）中的疏水性药物，优选为水飞蓟宾、吡非尼酮、维生素E、硫腺苷甲硫氨酸等对肝纤维化、肝硬化有治疗效果的药物。
有益效果
（1）本发明的HA纳米胶束，以HA作为靶向HSCs的靶头，此种应用在国内尚属首次。其特异性强、HSCs靶向效果好，并有很好的安全性和生物相容性。
（2）本发明的HA纳米胶束的设计构思和制备方式在国内尚属首次。
（3）本发明的HA纳米胶束，粒径小（<100nm），可以保证其穿过LSECs上的小孔，到达HSCs。
（4）本发明的HA纳米胶束，包载抗纤维化药物后对肝纤维化、肝硬化有显著的治疗效果。
（5）本发明的HA纳米胶束，同样具有作为肝癌、脂肪肝等靶向治疗载体的潜力。
（6）本发明的HA纳米胶束，还具有一定的缓释效果，也可以用于缓控释领域，应用广泛。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为HA胶束的结构示意图。
图2为HA胶束的HSCs靶向策略图。
图3为HA和HA耦合物的氢谱结果。
图4为胶束的粒径和透射电镜图。
图5为胶束的体外释放实验结果。
图6为DiD标记胶束的肝脏细胞摄取实验结果。
图7为分离后的各种肝细胞的形态。
图8为各种肝细胞的CD44含量表达结果。
图9为胶束的细胞毒性实验结果。
图10为胶束的体内药代动力学实验结果。
图11为DiD标记胶束在正常大鼠和肝纤维化大鼠中的体内分布实验结果。
图12为胶束在各种肝细胞中的分布结果。
图13为胶束的免疫荧光共定位结果。
图14为经载药胶束治疗后的肝纤维化大鼠的肝脏外观和病理切片结果。
图15为经载药胶束治疗后的肝纤维化大鼠肝脏切片的Desmin染色结果。
图16为经载药胶束治疗后的肝纤维化大鼠肝脏切片的α-SMA染色结果。
图17为经载药胶束治疗后的肝纤维化大鼠的血清AST和ALT水平。
图18为胶束的安全性评价结果。
图19为PFD-HA胶束的细胞毒性研究结果。
图20为不同分子量的HA在肝脏中的分布结果。
图21为不同修饰度的HA耦合物在肝脏中的分布结果。
图22为不同粒径的HA胶束在HSCs中的分布结果。
图23为本发明胶束与已有胶束的细胞摄取对比结果。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，但绝不是对本发明范围的限制。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。
实施例1
用乙二胺做连接桥，通过酰胺反应将疏水性的脱氧胆酸与HA（分子量100kDa）侧链羧基相连，制备得到HA-脱氧胆酸耦合物，修饰度为9.4%。将23mg磷脂E80、31mg脱氧胆酸钠、7mg HA-脱氧胆酸耦合物和4mg水飞蓟宾溶于乙醇置于圆底烧瓶中，旋转蒸发成膜，加入生理盐水水化，即得HA载药纳米胶束，粒径42nm。
实施例2
用乙二胺做连接桥，通过酰胺反应将疏水性的脱氧胆酸与HA（分子量300kDa）侧链羧基相连，制备得到HA-脱氧胆酸耦合物，修饰度为10.1%。将25mg磷脂S100、25mg脱氧胆酸钠、6mg HA-脱氧胆酸耦合物和3mg吡非尼酮溶于丙酮置于圆底烧瓶中，旋转蒸发成膜，加入去离子水水化，即得HA载药纳米胶束，粒径35nm。
实施例3
用乙二胺做连接桥，通过酰胺反应将疏水性的脱氧胆酸与HA（分子量6kDa）侧链羧基相连，制备得到HA-脱氧胆酸耦合物，修饰度为7.0%。将25mg磷脂S45、75mg脱氧胆酸钠、5mg HA-脱氧胆酸耦合物和6mg维生素E溶于甲醇置于圆底烧瓶中，旋转蒸发成膜，加入5%葡萄糖溶液水化，即得HA载药纳米胶束，粒径80nm。
实施例4
用乙二胺做连接桥，通过酰胺反应将疏水性的脱氧胆酸与HA（分子量10kDa）侧链羧基相连，制备得到HA-脱氧胆酸耦合物，修饰度为7.6%。将30mg磷脂PC98-T、60mg脱氧胆酸钠、12mg HA-脱氧胆酸耦合物和7mg硫腺苷甲硫氨酸溶于乙醇置于圆底烧瓶中，旋转蒸发成膜，加入生理盐水水化，即得HA载药纳米胶束，粒径45nm。
实施例5
用丁二胺做连接桥，通过酰胺反应将疏水性的胆酸与HA（分子量100kDa）侧链羧基相连，制备得到HA-胆酸耦合物，修饰度为8.4%。将23mg磷脂EPCS、25mg胆酸钠、5mg HA-胆酸耦合物和3mg水飞蓟宾溶于乙醇置于圆底烧瓶中，旋转蒸发成膜，加入注射用水水化，即得HA载药纳米胶束，粒径36nm。
实施例6
用丁二胺做连接桥，通过酰胺反应将疏水性的甘氨胆酸与HA（分子量20kDa）侧链羧基相连，制备得到HA-甘氨胆酸耦合物，修饰度为9.2%。将20mg磷脂DSPE、50mg甘氨胆酸钠、8mg HA-甘氨胆酸耦合物和5mg吡非尼酮溶于甲醇与丙酮的混合溶剂（v/v, 1:1）置于圆底烧瓶中，旋转蒸发成膜，加入生理盐水水化，即得HA载药纳米胶束，粒径70nm。
实施例7
用丁二胺做连接桥，通过酰胺反应将疏水性的牛磺胆酸与HA（分子量300kDa）侧链羧基相连，制备得到HA-牛磺胆酸耦合物，修饰度为7.0%。将15mg磷脂E80、45mg牛磺胆酸钠、6mg HA-牛磺胆酸耦合物和4mg维生素E溶于甲醇置于圆底烧瓶中，旋转蒸发成膜，加入5%葡萄糖溶液水化，即得HA载药纳米胶束，粒径82nm。
实施例8
用丁二胺做连接桥，通过酰胺反应将疏水性的胆酸与HA（分子量100kDa）侧链羧基相连，制备得到HA-胆酸耦合物，修饰度为10.1%。将25mg磷脂S75、50mg胆酸钠、7mg HA-胆酸耦合物和6mg硫腺苷甲硫氨酸溶于乙醇置于圆底烧瓶中，旋转蒸发成膜，加入注射用水水化，即得HA载药纳米胶束，粒径46nm。
实施例9
用丁二胺做连接桥，通过酰胺反应将疏水性的脱氧胆酸与HA（分子量6kDa）侧链羧基相连，制备得到HA-脱氧胆酸耦合物，修饰度为8.5%。将30mg磷脂EPG、30mg脱氧胆酸钠、5mg HA-脱氧胆酸耦合物和5mg水飞蓟宾溶于乙醇置于圆底烧瓶中，旋转蒸发成膜，加入去离子水水化，即得HA载药纳米胶束，粒径38nm。
实施例10
用乙二胺做连接桥，通过酰胺反应将疏水性的胆酸与HA（分子量50kDa）侧链羧基相连，制备得到HA-胆酸耦合物，修饰度为9.4%。将20mg磷脂EPCS、30mg胆酸钠、4mg HA-胆酸耦合物和4mg吡非尼酮溶于丙酮置于圆底烧瓶中，旋转蒸发成膜，加入生理盐水水化，即得HA载药纳米胶束，粒径43nm。
实施例11
用乙二胺做连接桥，通过酰胺反应将疏水性的牛磺胆酸与HA（分子量10kDa）侧链羧基相连，制备得到HA-牛磺胆酸耦合物，修饰度为7.6%。将23mg磷脂S100、58mg牛磺胆酸钠、9mg HA-牛磺胆酸耦合物和7mg维生素E溶于甲醇置于圆底烧瓶中，旋转蒸发成膜，加入5%葡萄糖溶液水化，即得HA载药纳米胶束，粒径75nm。
实施例12
用乙二胺做连接桥，通过酰胺反应将疏水性的甘氨胆酸与HA（分子量20kDa）侧链羧基相连，制备得到HA-甘氨胆酸耦合物，修饰度为7.0%。将18mg磷脂PC98-T、50mg甘氨胆酸钠、6mg HA-甘氨胆酸耦合物和5mg硫腺苷甲硫氨酸溶于乙醇置于圆底烧瓶中，旋转蒸发成膜，加入注射用水水化，即得HA载药纳米胶束，粒径78nm。
实施例13
用乙二胺做连接桥，通过酰胺反应将疏水性的脱氧胆酸与HA（分子量8kDa）侧链羧基相连，制备得到HA-脱氧胆酸耦合物，修饰度为8.2%。将25mg磷脂E80、40mg脱氧胆酸钠、7mg HA-脱氧胆酸耦合物和6mg水飞蓟宾溶于乙醇置于圆底烧瓶中，旋转蒸发成膜，加入生理盐水水化，即得HA载药纳米胶束，粒径45nm。
实施例14
用丁二胺做连接桥，通过酰胺反应将疏水性的胆酸与HA（分子量200kDa）侧链羧基相连，制备得到HA-胆酸耦合物，修饰度为9.6%。将15mg磷脂S100、33mg胆酸钠、4mg HA-胆酸耦合物和5mg吡非尼酮溶于甲醇与丙酮的混合溶剂（v/v, 1:1）置于圆底烧瓶中，旋转蒸发成膜，加入去离子水水化，即得HA载药纳米胶束，粒径50nm。
实施例15
用乙二胺做连接桥，通过酰胺反应将疏水性的甘氨胆酸与HA（分子量80kDa）侧链羧基相连，制备得到HA-甘氨胆酸耦合物，修饰度为10.1%。将23mg磷脂EPCS、28mg甘氨胆酸钠、5mg HA-甘氨胆酸耦合物和5mg维生素E溶于甲醇置于圆底烧瓶中，旋转蒸发成膜，加入生理盐水水化，即得HA载药纳米胶束，粒径40nm。
实施例16
用乙二胺做连接桥，通过酰胺反应将疏水性的脱氧胆酸与HA（分子量100kDa）侧链羧基相连，制备得到HA-脱氧胆酸耦合物，修饰度为9.0%。将23mg磷脂E80、31mg脱氧胆酸钠、7mg HA-脱氧胆酸耦合物和4mg吡非尼酮溶于丙酮置于圆底烧瓶中，旋转蒸发成膜，加入生理盐水水化，即得HA载药纳米胶束，粒径44nm。
本发明选择实施例1中的水飞蓟宾-HA（SLB-HA）胶束作为模型，研究此纳米胶束的体内外HSCs靶向性和抗肝纤维化作用，同时设置了SLB原药组和不含HA耦合物的SLB普通胶束组作为实验对照。其中不含HA耦合物的SLB普通胶束组制备方法同实施例1，仅是不含加入HA耦合物的步骤。
实验例1HA-脱氧胆酸耦合物（HA-DOCA）的结构确认
用1H NMR对最终合成的产物进行结构确认。HA溶于D2O，HA-DOCA溶于氘代DMSO，HA-DOCA的修饰度用积分法进行计算。
图3为HA（a）和HA-DOCA（b）的氢谱结果。可以看出，HA的特征峰出现在了2.00ppm（-COCH3-）和3.30-4.80ppm（糖环）。而对于HA-DOCA，除了含有HA的特征峰以外，在0.20-1.50ppm出现了DOCA的特征峰，表明DOCA耦合到了HA上，从而成功制备了HA-DOCA。HA-DOCA的修饰度用HA中的乙酰基峰（2.00ppm, 3H, -COCH3-）和DOCA中的甲基峰（0.80ppm, 3H, -CH3）之间的积分比进行定量，修饰度为9.4%。
实验例2胶束的理化性质
将SLB胶束与SLB-HA胶束混悬液稀释后，用激光粒度仪测定粒径和Zeta电位，并用芘荧光法测定临界胶束浓度（Critical micelle concentration，CMC），如表1所示。并将样品滴加在铜载网上，用2%磷钨酸染液负染，于透射电镜下观察胶束的粒径与外观。
表1. SLB胶束和SLB-HA胶束的理化表征
Figure 286660DEST_PATH_IMAGE002
图4为胶束的粒径和透射电镜图（a、b分别为SLB胶束的粒径和电镜结果；c、d分别为SLB-HA胶束的粒径和电镜结果）。结果表明，SLB-HA胶束的外观圆整，呈类球形，粒径在45nm左右。较小的粒径可以保证胶束不被肝脏的RES系统所清除，并能穿过LSECs上的小孔，到达HSCs发挥靶向作用。SLB-HA胶束的Zeta电位为负值，此负电特性可以保护胶束不被血浆中的大部分蛋白质所清除。胶束的CMC约为21mg/L，如此低的CMC值可以保证胶束在体内的结构完整性，避免其在到达HSCs前被破坏掉。综上所述，本发明的SLB-HA胶束有着粒径小、CMC低和带负电性等特点，具有作为HSCs靶向药物载体的潜力。
实验例3胶束的体外释放
使用透析法来研究SLB从胶束中的释放行为。将1.0mL SLB原药、SLB胶束和SLB-HA胶束分别置于透析袋中（分子截留量为3500Da，n=3）。然后将透析袋浸于装有100mL含有0.2%（w/v）吐温-80的PBS（pH 7.4）的棕色小瓶中，于37°C恒温摇床中振摇（100 rpm）。每隔一段时间取5.0mL透析液，并补加5.0mL新鲜释放介质。取出的透析液经过稀释后用HPLC测定SLB的含量和累积释放度。
图5为胶束的体外释放结果。结果表明，本发明的SLB-HA胶束在体外比SLB原药和普通的SLB胶束有更好的缓释效果，可以用于药物缓释。
实验例4细胞摄取研究
用亲脂性荧光染料DiD标记胶束，对胶束进行示踪，制备方法与本发明实施例1相似，将其处方中的4mg SLB替换为0.5mg DiD即可，制备得到DiD-HA胶束。同理，处方中不添加HA耦合物，制得普通的DiD胶束。
细胞摄取考察是通过激光共聚焦显微镜（CLSM）来实现的。将人肝星状细胞株HSCs（CD44高表达）、人肝癌细胞株HepG2（CD44高表达）和人正常肝细胞株LO2（CD44不表达）按1×105个/孔的浓度分别置于共聚焦小皿中培养。24h后弃掉初始培养基，加入1.0mL分别含有DiD、DiD胶束和DiD-HA胶束的培养基，给药浓度按DiD量计算为100ng/mL。继续培养4h后弃掉培养液，PBS洗三次，用4%多聚甲醛固定15min。加入100μL FITC标记的鬼笔环肽（5μg/mL），37°C下避光孵育30min，标记细胞骨架。PBS洗净后，加入0.5mL DAPI染色液（1μg/mL）避光孵育5min，标记细胞核。PBS洗净后，于CLSM下观察药物的摄取情况。
图6为胶束的细胞摄取结果（刻度代表100μm）。结果表明，CD44高表达的HSCs和HepG2对DiD-HA胶束的摄取明显高于DiD原药和DiD胶束。而在无CD44表达的LO2中，三种制剂的摄取量无明显差异。因此，本发明的HA胶束可以选择性地被HSCs所摄取，同时避免了其在正常肝细胞中的分布，具有作为HSCs靶向载体的巨大潜力。此外，HA胶束在同样有CD44表达的HepG2细胞中呈现出了与HSCs相同的摄取行为，表明HA胶束也能够用作肝癌靶向治疗的载体。
实验例5肝纤维化大鼠模型的建立和各种肝细胞的分离
对正常大鼠腹腔注射CCl4的大豆油溶液（2:3，v/v），注射剂量为0.5mL/kg，每周注射两次，持续注射8周，即可得到肝纤维化大鼠。
肝脏中的细胞由肝实质细胞（Hepatic parenchymal cells, HPCs）和非实质细胞构成。而非实质细胞又分为HSCs和其他非实质细胞（如巨噬细胞、Kupffer细胞、LSECs等）。通过肝门静脉插管原位灌流法可以分离正常肝脏和纤维化肝脏中的HPCs、HSCs和其他非实质细胞，为后续研究奠定基础。具体过程为：将正常大鼠或肝纤维化大鼠用戊巴比妥钠麻醉并固定，沿腹腔中间线纵行切口，暴露门静脉。用留置针对门静脉进行插管，并用Hank’s平衡液（HBS）灌流，流速为5mL/min。5min后，用37ºC含有3mM CaCl2、0.05%胶原酶IV和0.01%DNA酶的HBS灌流，流速为5mL/min。5min后，迅速将肝脏取出并剪碎，用37ºC含有0.05%胶原酶IV和0.01% DNA酶的HBS重悬，并用100μm的细胞筛网过滤。收集滤液，600rpm离心8min，沉淀即为HPCs。上清液继续2000rpm离心10min，沉淀即为其他非实质细胞，上清即为HSCs。
图7为灌流后和离心后的肝细胞形态（刻度代表100μm）。可以看出，灌流后HPCs、HSCs和其他非实质细胞在组织液中混合存在，并呈单细胞状态（图a），表明灌流成功且消化完全。经过第一次离心后，体积最大的HPCs被沉淀到离心管底部（图b），较小的非实质细胞留在上清。研究表明，HSCs的密度约为1.047-1.061g/mL，其他非实质细胞的密度约为1.083-1.095g/mL，HSCs密度稍小。因此，经过第二次离心后，体积稍大的其他非实质细胞被沉淀到离心管底部（图d），较小的HSCs留在上清（图c）。光镜下观察新分离的HSCs细胞呈圆形，边界清楚、透亮，其体积要略小于其他非实质细胞。由于含有丰富的脂滴，HSCs透光度增加。这些现象均与文献报道相吻合。此外，经过离心后的三种细胞形态单一、区分明显，没有其他细胞的掺杂，表明分离效果较为彻底。
实验例6各种肝细胞表面CD44的表达
HSCs能够特异性表达CD44受体，是HA胶束实现HSCs体内靶向的基础。为了研究CD44在HPCs、HSCs和其他非实质细胞中表达量的差异，以及CD44在正常肝脏和纤维化肝脏中表达量的差异，发明人用FITC标记的CD44抗体，通过流式细胞仪检测各细胞中的CD44含量。具体过程为：将正常肝脏和纤维化肝脏中的HPCs、HSCs以及其他非实质细胞按照实验例5中的方法进行分离，3000rpm离心5min，弃去上清液，细胞用PBS洗三次。每管加入100μLFITC标记的CD44抗体（1:100，用PBS稀释），4°C避光孵育30min。孵育完成后3000rpm离心5min，弃去上清液，PBS洗三次。用0.5mL PBS重悬细胞后，使用流式细胞仪测量细胞的荧光值，以表征各细胞的CD44表达量。
图8为各种肝细胞的CD44表达结果（**：p<0.01；n=3）。可以看出，无论是在正常肝脏还是在纤维化肝脏中，HPCs均没有CD44受体表达。在正常肝脏中，其他非实质细胞有极少的CD44表达。HSCs的CD44表达量是其他非实质细胞的两倍。在纤维化肝脏中，其他非实质细胞的CD44表达量与正常肝脏相比没有明显变化；而HSCs的CD44表达量显著增加，约为正常肝脏的8倍。上述结果表明，HSCs是肝脏中表达CD44受体的主要细胞，当肝脏发生纤维化病变后，HSCs的CD44表达量明显增加。CD44在HSCs中的特异性表达，可以降低HA胶束在其他肝脏细胞中的分布，增加HA胶束的HSCs靶向性，增强HA载药胶束的疗效，并减少对其他正常细胞的毒副作用。
实验例7细胞毒性研究
肝脏发生纤维化的根本原因是HSCs的活化并大量增殖。因此，逆转HSCs的激活、降低活化的HSCs的数量是治疗肝纤维化的最根本途径。发明人利用MTT实验，研究了SLB-HA胶束对未活化的HSCs、活化的HSCs以及正常肝细胞（LO2）的杀伤作用。未活化的HSCs和LO2细胞购自生物公司；活化的HSCs按照本发明实验例5中的肝细胞分离方法取自肝纤维化大鼠。
将细胞以每孔1×104个的细胞密度接种于96孔板中，在37°C、5% CO2的条件下培养过夜。分别加入不同浓度的SLB原药、SLB胶束和SLB-HA胶束，浓度梯度为1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0μg/mL。同时设置HA空白胶束组（不载药），以排除胶束本身毒性的干扰。共同孵育48h后，每孔加入20μL MTT溶液（5mg/mL，pH 7.4）。继续孵育4h后，移去培养基，每孔加入150μL DMSO。于37°C下振摇30min，用酶标仪测定各孔在490nm处的吸光度A。每组每个浓度设置3个复孔，并设置不加药物的对照组。按照下列公式计算细胞存活率：存活率（%）=（A实验/A对照）×100%，A实验和A对照分别代表实验孔和对照孔的吸光度。
图9为细胞毒性研究结果（n=3）。可以看出，SLB-HA胶束对活化的HSCs的杀伤作用明显强于SLB原药和SLB胶束，而对未活化的HSCs的细胞毒性明显降低，对正常肝细胞几乎没有毒性。因此，本发明的SLB-HA胶束可以选择性地促进活化的HSCs的凋亡，而不会对肝脏中其他正常的细胞产生明显毒性，有利于其对肝纤维化的治疗，并降低制剂的毒副作用。
实验例8药代动力学研究
将15只健康SD大鼠随机分为三组，每组5只。每组分别尾静脉注射SLB原药、SLB胶束和SLB-HA胶束，给药剂量按SLB计算为10mg/kg。分别于给药后5、15、30、60、120、240、480和720min后眼眶取血300μL于肝素化的离心管中，6000r/min离心5min分离血浆。取100μL血浆，置于1.5mL离心管中，加入400μL甲醇沉淀蛋白，涡旋5min混匀，12000r/min离心10min。经0.22µm有机滤头过滤后，吸取20µL上清液进行HPLC分析，测定各时间点的药物浓度，并绘制药动曲线。
图10为药代动力学结果（n=5）。可以看出，SLB-HA胶束血液循环时间长达12h，而SLB原药和SLB胶束分别在2h和8h内就已降低到了基线水平，其血液循环时间明显低于SLB-HA胶束。结果表明，本发明的HA胶束在血液循环中不易被清除，有着优秀的长循环效果，为HSCs靶向性的实现奠定了基础。
实验例9体内分布研究
为了验证HA胶束的肝靶向性以及研究HA胶束在正常大鼠和肝纤维化大鼠中分布行为的差异，发明人使用DiD标记的胶束分别在这两种大鼠中进行了组织分布研究。
将正常大鼠随机分为三组，每组15只。分别尾静脉注射DiD原药、DiD胶束和DiD-HA胶束，给药剂量按DiD计算为10μg/kg。每组分别在给药15min、1h和2h后选择5只大鼠处死，解剖分离出心、肝、脾、肺、肾等主要器官，用生理盐水洗净，并用滤纸干燥器官表面，最后使用小动物活体成像系统观察各器官的荧光，结果如图11（A）所示（a： DiD原药组；b：DiD胶束组；c：DiD-HA胶束组）。
将肝纤维化大鼠随机分为三组，每组15只。分别尾静脉注射DiD原药、DiD胶束和DiD-HA胶束。与此同时，为了研究HA在胶束分布中所扮演的角色，另增加了HA+DiD胶束组和HA+DiD-HA胶束组。其中，HA+DiD胶束组的给药方式为先静脉注射HA溶液（100kDa, 10mg/mL）以饱和肝脏中的CD44受体，15min后再给予DiD胶束。同理，HA+DiD-HA胶束组的给药方式为先静脉注射HA溶液，15min后再给予DiD-HA胶束。五组动物的给药剂量均按DiD计算为10μg/kg。每组分别在给药15min、1h和2h后选择5只大鼠处死，解剖分离出心、肝、脾、肺、肾等主要器官，用生理盐水洗净，并用滤纸干燥器官表面，最后使用小动物活体成像系统观察各器官的荧光，结果如图11（B）所示（a：DiD原药组；b：DiD胶束组；c：DiD-HA胶束组；d：HA+DiD胶束组；e：HA+DiD-HA胶束组）。
图11（A）显示，在正常大鼠中，DiD原药组在肝脏、脾和肺中有较强的荧光，表明DiD主要被这些器官进行清除和代谢。与DiD原药相比，DiD胶束在肝脏的分布明显增多，这可能是由于肝脏RES的清除作用所致。与DiD胶束相比，DiD-HA胶束在肝脏的分布进一步增多，这是因为肝脏中的HSCs表达有CD44受体，增加了HA胶束的主动靶向性。
图11（B）显示，在肝纤维化大鼠中，DiD原药和DiD胶束的分布行为与在正常大鼠中没有明显差异，而DiD-HA胶束在肝脏的蓄集明显增加。这是因为当肝脏发生纤维化后，HSCs的CD44表达量明显上升，从而使HA胶束在肝脏中的分布进一步增加。提前注射HA溶液时，DiD胶束的分布行为几乎没有受到影响，而DiD-HA胶束在肝脏中的分布明显降低。这是因为提前给予的HA溶液已经将肝脏的大部分CD44受体饱和掉，降低了HA胶束的靶向效率，而没有HA包裹的普通胶束却不会受到影响。上述结果表明，本发明的HA胶束有显著的肝靶向性，此靶向性在肝纤维化发生后进一步增强。HA在HA胶束的肝靶向过程中扮演着关键角色。
实验例10肝脏细胞分布研究
分别将正常大鼠和肝纤维化大鼠分为三组，每组5只。分别尾静脉注射DiD原药、DiD胶束和DiD-HA胶束，给药剂量按DiD计算为10μg/kg。给药15min后，将肝脏中的HPCs、HSCs和其他非实质细胞分离，用流式细胞仪检测各细胞的荧光强度，研究HA胶束在不同肝细胞中的分布。
图12为各组制剂在各种肝细胞中的分布结果（**：p<0.01 vs HPCs；n=3）。可以看出，DiD原药主要分布在HPCs中，这是因为HPCs在肝细胞中的比例超过了60%。当肝脏发生纤维化时，HPCs的数量不会有明显变化，因此DiD原药在纤维化肝脏中的分布也没有明显改变。在正常肝脏和纤维化肝脏中，DiD胶束在其他非实质细胞中的分布均明显增加，这是由于其他非实质细胞（如Kupffer细胞）对胶束有一定的吞噬作用。与DiD原药和DiD胶束不同，DiD-HA胶束主要分布在HSCs中。这是由于HA胶束可以与HSCs表面的CD44受体特异性结合，增加了HSCs对HA胶束的摄取。在肝脏发生纤维化后，由于HSCs的大量增殖和CD44受体表达量的增加，DiD-HA胶束在HSCs中的分布明显多于正常肝脏（约为正常肝脏的5倍）。上述结果表明，本发明的HA胶束具有出色的体内HSCs靶向性，此靶向性在肝脏发生纤维化时更为显著。
实验例11HA胶束与HSCs的体内共定位研究
发明人通过免疫荧光染色，进一步证明了HA胶束的体内HSCs靶向性。由于标记HSCs表面CD44受体的抗体带有红色荧光，与DiD的红色荧光会互相干扰，因此发明人使用带有绿色荧光的香豆素6（C6）来标记胶束。C6胶束和C6-HA胶束的制备方法与DiD胶束和DiD-HA胶束相同，参见本发明实验例4。分别将正常大鼠和肝纤维化大鼠分为三组，每组5只。分别尾静脉注射C6原药、C6胶束和C6-HA胶束，给药剂量按C6计算为200μg/kg。给药15min后，处死大鼠并分离肝脏。切取小块肝脏组织，包埋，做冰冻切片（厚度为8μm），置于载玻片上。将切片用4°C预冷的4%多聚甲醛固定5min，PBS洗三次，每次3min。用0.5wt% Triton X-100（PBS稀释）室温下孵育5min，PBS洗两次。再用2wt%胎牛血清（PBS稀释）室温下孵育1h，PBS洗两次。然后用一抗（CD44高亲和性纯化IgG，1:100，用PBS稀释）4°C孵育过夜，PBS洗三次，每次10min。用二抗（Alexa 557标记的抗IgG，1:500，用PBS稀释）室温下孵育1h，PBS洗三次。DAPI染色5min，PBS洗三次，用滤纸吸干切片周围的水分。最后向切片表面滴加抗荧光淬灭剂，盖上盖玻片，并用无色指甲油封片，于CLSM下观察切片的荧光。
图13为免疫荧光共定位结果。其中DAPI标记细胞核，用蓝光示踪；二抗标记CD44抗体，定位HSCs，用红光示踪；C6标记胶束，用绿光示踪；刻度代表100μm。
可以看出，无论是在正常大鼠（图a）还是在肝纤维化大鼠（图b）中，代表着HA胶束的绿光和代表着CD44的红光几乎完全重合到了一起，并且绿光没有分布到红光以外的区域，表明HA胶束具有出色的HSCs靶向性，而且几乎不会分布到其他肝细胞，特异性强。与之相比，C6原药和C6胶束分布到了除HSCs以外的其他部位，表明二者没有HSCs靶向性。除此之外，由图中还可以看出，正常大鼠肝脏中的HSCs呈点状分布，数量较少，表达的CD44也较少；当大鼠发生肝纤维化后，肝脏中的HSCs呈片状聚集分布，数量明显增多，CD44表达量也增加。此结果与本发明实验例6中的“肝脏细胞CD44表达量的检测”结果相一致。综上所述，本发明的HA胶束具有出色的体内HSCs靶向性，可作为一种优秀的HSCs靶向载体，有治疗肝纤维化的巨大潜力。
实验例12体内药效学研究
将健康SD大鼠随机分为正常组、生理盐水组、SLB溶液组、SLB胶束组和SLB-HA胶束组5组，每组5只。正常组不做处理，正常喂养，其余四组均腹腔注射CCl4，每周两次，诱导肝纤维化。诱导4周后，此四组在继续造模的同时，分别静脉注射生理盐水、SLB溶液、SLB胶束和SLB-HA胶束，给药剂量按SLB计算为5mg/kg，每周给药两次，造模8周后，将大鼠处死。通过各项指标测定各组的肝纤维化程度，探究各组药物的治疗效果。
图14为造模8周后各组大鼠的肝脏外观和病理切片结果（刻度代表200μm；三角符号指示纤维化病变区域）。由肝脏外观可以看出，正常组肝脏颜色鲜红、表面光滑，而生理盐水组肝脏颜色变暗，有许多白色条带，表明肝脏发生了严重病变。SLB溶液组和SLB胶束组的病变程度有所减轻，但仍然有较多白色条带，说明SLB和SLB胶束对肝纤维化有一定治疗作用，但疗效并不显著。SLB-HA胶束组的肝脏表面光滑、颜色鲜亮，没有出现明显病变，其外观与正常组相似，表明本发明的SLB-HA胶束可以显著降低肝纤维化程度，治疗效果显著。
图15为造模8周后各组大鼠肝脏切片的Desmin染色结果（刻度代表200μm；三角符号指示HSCs的分布）。肝脏发生纤维化后，HSCs由静止态变为激活态，并且大量增殖，导致HSCs的数量明显增加。因此，HSCs的数量可以体现出肝纤维化的程度，进而反映药物的治疗效果。HSCs有肌细胞特征，胞浆中含有Desmin（结蛋白），用Desmin染色可以定位HSCs。可以看出，生理盐水组的HSCs数量远远超过正常组，表明其发生了严重的纤维化。与之相比，SLB溶液组的HSCs数量有所降低，说明SLB有一定的抗肝纤维化效果。将SLB制备成胶束后，治疗效果更为明显。SLB-HA胶束组的HSCs数量明显低于其他三个造模组，接近于正常水平，表明本发明的SLB-HA胶束能够抑制HSCs的增殖，具有显著的抗肝纤维化作用。
图16为造模8周后各组大鼠肝脏切片的α-SMA染色结果（刻度代表200μm）。肝纤维化经药物治疗后，活化的HSCs重新变为静止态。换言之，活化的HSCs数量才是肝纤维化程度最直观的反映。因此从本质上来说，逆转HSCs的激活，降低活化的HSCs数量，是治疗肝纤维化的基础。HSCs活化后会表达α-SMA（平滑肌肌动蛋白），可以用免疫荧光染色标记α-SMA，进而反映出活化的HSCs数量。与Desmin染色相比，α-SMA染色的优点在于可以直观的反映出活化的HSCs数量，而静止态的HSCs不会表达α-SMA，因而用α-SMA表征肝纤维化的程度更加准确。可以看出，正常组没有α-SMA表达，说明在健康状态下，HSCs不会被激活。而生理盐水组有明显的α-SMA表达，表明肝脏发生纤维化时有大量HSCs被激活。而SLB-HA胶束组活化的HSCs数量极少，明显低于其他三个造模组，表明本发明的SLB-HA胶束能够抑制HSCs的活化，逆转HSCs的激活，具有出色的抗肝纤维化作用。
图17为造模8周后各组大鼠的血清AST和ALT水平（*: p<0.01 vs SLB溶液；&: p<0.01 vs SLB胶束）。谷丙转氨酶（Alanine transaminase，ALT）和谷草转氨酶（Aspartatetransaminase，AST）是评价肝功能的重要指标。当肝脏受损或病变时（如发生肝炎、肝纤维化等），血清中的ALT和AST水平会明显升高[2]。各组大鼠处死之前，取0.5mL全血置于不含肝素的离心管中。放置一段时间，待其分层后，5000rpm离心10min，取0.2mL上层血清，测定ALT和AST水平。可以看出，与正常组相比，生理盐水组的ALT和AST水平显著升高，表明肝脏发生了明显的病变；与生理盐水组相比，SLB溶液组的ALT和AST水平有一定程度下降但依然较高，表明SLB对肝纤维化有一定的治疗作用，但药效不明显；SLB胶束组的ALT和AST水平进一步下降；而对于SLB-HA胶束组，其ALT和AST水平显著低于其他造模组，接近于正常水平。因此，这进一步表明本发明的SLB-HA胶束有着出色的抗肝纤维化能力。
实验例13安全性评价
靶向递药系统的安全性是其能被开发应用的重要因素，考察HA胶束的安全性对评价其临床应用价值至关重要。将健康SD雄性大鼠随机分为2组，每组5只。分别静脉注射生理盐水和HA胶束（不载药，50mg/kg），每2天给药一次，连续给药4周。在末次给药24h后，取全血测定血液学指标。血液学指标包括红细胞计数（RBC）、白细胞计数（WBC）、血小板数（Plt）、红细胞压积（HCT）、血红蛋白浓度（HGB）、平均红细胞容积（MCV）、平均血红蛋白含量（MCH）和平均血红蛋白浓度（MCHC），如表2所示。结果表明，生理盐水组和HA胶束组的血液学指标没有显著差异（P>0.05）。
表2. 生理盐水组和HA胶束组的血液学参数（n=5）
Figure 992448DEST_PATH_IMAGE004
在末次给药24h后，取血清测定生化指标。生化指标包括肌酸激酶（CK）、天门冬氨酸氨基转换酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、丙氨酸氨基转换酶（ALT）、尿素氮（BUN）、碱性磷酸酶（ALP）、肌酐（CREA）和总胆红素（TBIL），如表3所示。
表3. 生理盐水组和HA胶束组的生化指标（n=5）
Figure 389931DEST_PATH_IMAGE006
作为肝靶向递药载体，HA胶束对肝脏的毒性需要重点考察，其中ALT、ALP和AST是评价肝脏功能的代表性生化指标。大鼠连续注射HA胶束4周后，其ALT、ALP和AST水平与生理盐水组没有明显差异，表明HA胶束不会对肝脏产生明显毒性。其余生化指标也与生理盐水组相近（P>0.05），证明HA胶束有很好的安全性。
给药结束后处死大鼠，取心、肝、脾、肺、肾各主要器官，4%多聚甲醛固定后，经石蜡包埋切片做H&E染色，于光学显微镜下观察大鼠各器官的病变情况，如图18所示（刻度代表200μm）。可以看出，与生理盐水组相比，HA胶束组各器官均没有出现明显病变和损伤，表明HA胶束不会产生明显的器官毒性。
综上所述，本发明的HA胶束有着出色的安全性。
随后，发明人选择实施例16中的吡非尼酮-HA（PFD-HA）胶束作为模型，研究此纳米胶束包载不同药物时的抗肝纤维化作用，同时设置了PFD原药组和不含HA耦合物的PFD普通胶束组作为实验对照。其中不含HA耦合物的PFD普通胶束组制备方法同实施例16，仅是不含加入HA耦合物的步骤。
实验例14PFD-HA胶束的体外抗肝纤维化作用
发明人利用MTT实验，研究了PFD-HA胶束对活化的HSCs的杀伤作用，用以评价其体外抗肝纤维化效果。活化的HSCs按照本发明实验例5中的肝细胞分离方法取自肝纤维化大鼠。
将细胞以每孔1×104个的细胞密度接种于96孔板中，在37°C、5% CO2的条件下培养过夜。分别加入不同浓度的PFD原药、PFD胶束和PFD-HA胶束，浓度梯度为1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0μg/mL。同时设置HA空白胶束组（不载药），以排除胶束本身毒性的干扰。共同孵育48h后，每孔加入20μL MTT溶液（5mg/mL，pH 7.4）。继续孵育4h后，移去培养基，每孔加入150μL DMSO。于37°C下振摇30min，用酶标仪测定各孔在490nm处的吸光度A。每组每个浓度设置3个复孔，并设置不加药物的对照组。按照下列公式计算细胞存活率：存活率（%）=（A实验/A对照）×100%，A实验和A对照分别代表实验孔和对照孔的吸光度。
图19为PFD-HA胶束的细胞毒性研究结果（n=3）。可以看出，PFD-HA胶束对活化的HSCs同样具有明显的杀伤作用，且显著强于PFD原药和PFD胶束。因此，本发明的HA胶束包载不同的抗肝纤维化药物均有显著的抗肝纤维化作用。
对比实验1 不同分子量的HA的肝靶向性
发明人用异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）对不同分子量的HA进行荧光标记，然后通过体内组织分布实验，研究不同分子量HA的肝靶向性。具体过程如下：用FITC标记乙二胺一端的氨基，合成FITC-NH2。然后选择分子量为6、20、100、300kDa的HA，将FITC-NH2与HA连接到一起，合成FITC标记的不同分子量的HA（FITC-HA）。选取12只体重相近的雄性昆明小鼠，平均分为4组，每组3只。每组分别静脉注射不同分子量的FITC-HA，给药剂量按FITC量计算为1mg/kg。给药15min后，处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾、脑等主要器官，生理盐水洗净并干燥，用活体成像系统观察FITC在各器官的分布情况。
图20为不同分子量的HA在肝脏中的分布情况。可以看出，各分子量的HA在肝脏中均有明显分布。因此，本发明中HA的分子量优选为6kDa~300kDa。
对比实验2 不同修饰度的HA耦合物的肝靶向性
发明人合成了不同修饰度的HA耦合物，然后通过体内组织分布实验，研究不同修饰度HA的肝靶向性。具体过程如下：用FITC标记乙二胺一端的氨基，合成FITC-NH2。然后控制FITC-NH2和HA之间的投料比，将FITC-NH2与HA（100kDa）连接到一起，合成FITC标记的不同修饰度的HA（FITC-HA）。选取9只体重相近的雄性昆明小鼠，平均分为3组，每组3只。每组分别静脉注射不同修饰度（7.6%，9.4%和10.1%）的FITC-HA，给药剂量按FITC量计算为1mg/kg。给药15min后，处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾、脑等主要器官，生理盐水洗净并干燥，用活体成像系统观察FITC在各器官的分布情况。
图21为不同修饰度的HA耦合物在肝脏中的分布情况。可以看出，各修饰度的HA耦合物在肝脏中均有明显分布。因此，本发明中HA耦合物的修饰度优选为7%~10%。
对比实验3 磷脂与胆酸盐的质量比对胶束粒径的影响
改变处方中磷脂与胆酸盐的投料比，会得到不同粒径的载药胶束。分别按照实施例1、2、3、4的制备方式，仅按照下表改变磷脂与胆酸盐的质量比，考察其对粒径的影响，结果如表4所示：
表4. 磷脂与胆酸盐的质量比对胶束粒径的影响
Figure 118853DEST_PATH_IMAGE008
注：“—”表示形成的不是胶束结构。
可以看出，随着胆酸盐比例的增加，胶束的粒径也逐渐增大。当磷脂与胆酸盐的质量比达到1:4时，继续增加胆酸盐的比例会使胶束的粒径超过100nm，使其很难通过LSECs上的小孔到达HSCs。反之，增加磷脂的比例会使胶束的粒径逐渐降低。当磷脂与胆酸盐的质量比达到2:1时，继续增加磷脂的比例会使胶束的粒径低于20nm。如此低的粒径会使胶束在肾脏、脾脏等其它器官中大量分布，降低胶束的肝靶向性。此外，磷脂的比例过大更容易形成脂质体，而非胶束结构。因此，本发明中的磷脂与胆酸盐的质量比优选为2:1~1:4。
对比实验4粒径对HA胶束体内HSCs靶向性的影响
按照对比实验3中的方法，改变磷脂与胆酸盐的质量比，制备不同粒径的、包载荧光染料DiD的HA胶束。将肝纤维化大鼠随机分为7组，分别尾静脉注射不同粒径（10、20、35、45、80、100、150nm）的DiD-HA胶束（n=3），给药剂量按DiD计算为10μg/kg。给药15min后，将肝脏中的HSCs分离，用流式细胞仪检测其荧光强度，研究不同粒径的HA胶束在HSCs中的分布情况。
图22为不同粒径的HA胶束在HSCs中的分布结果（n=3）。当HA胶束的粒径小于20nm或大于100nm时，其在HSCs中的分布极少；当HA胶束的粒径在20~100nm时，其在HSCs中有明显分布。因此，本发明中的HA胶束，其粒径优选为20nm~100nm。
对比实验5 本发明的HA胶束与其他专利中HSCs靶向制剂的对比
为了进一步体现本发明的纳米胶束相比于目前已报道的纳米胶束的在HSCs特异性靶向和抗肝纤维化作用上的优越性，发明人设置了对比实验。专利文献CN200610018293.5供了一种靶向HSCs的聚合物纳米胶束，该胶束以叶酸为靶头，包载疏水性的抗肝纤维化药物，用以靶向治疗肝纤维化，符合我们的对比需求。因此，本发明人以专利文献CN200610018293.5中的聚合物纳米胶束作为对比制剂。
细胞摄取对比
本发明的纳米胶束选择DiD-HA胶束，制备方法参见本发明实验例4。对比纳米胶束按照专利文献CN200610018293.5实施例11下的方法进行制备，将其处方中的尼罗红替换为DiD即可，制备得到DiD标记的叶酸（FA）修饰PEG化胶束（DiD-FA-PEG胶束）。活化的HSCs按照本发明实验例5中的肝细胞分离方法取自肝纤维化大鼠。
将活化的HSCs按1×105个/孔的浓度分别置于12孔板中培养。24h后弃掉初始培养基，加入1.0mL分别含有DiD原药、DiD-FA-PEG胶束和DiD-HA胶束的培养基，给药浓度按DiD量计算为2μg/mL，每种制剂设置3个复孔。继续培养4h后弃掉培养液，PBS洗三次，经胰酶消化后，用完全培养基终止消化并分散细胞，3000r/min 离心3min，弃去上清，PBS洗2次。用0.5mL PBS重悬细胞后，使用流式细胞仪测量细胞的荧光值，以表征细胞对各制剂的摄取量，实验结果如图23所示（**：p<0.01；n=3）。
可以看出，HSCs对DiD-HA胶束的摄取量明显多于DiD-FA-PEG胶束，表明本发明的纳米胶束有更出色的HSCs靶向性。
细胞毒性对比
本发明的纳米胶束选择HA载药胶束，制备方法参见本发明实施例1-4。对比纳米胶束按照专利文献CN200610018293.5实施例11下的方法进行制备，将其处方中的尼罗红替换为相对应的药物即可，制备得到FA-PEG载药胶束。活化的HSCs按照本发明实验例5中的肝细胞分离方法取自肝纤维化大鼠。
将活化的HSCs以每孔1×104个的细胞密度接种于96孔板中，在37°C、5% CO2的条件下培养过夜。分别加入不同浓度的原药、FA-PEG载药胶束和HA载药胶束，浓度梯度为1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0μg/mL。共同孵育48h后，每孔加入20μL MTT溶液（5mg/mL，pH7.4）。继续孵育4h后，移去培养基，每孔加入150μL DMSO。于37°C下振摇30min，用酶标仪测定各孔在490nm处的吸光度A。每组每个浓度设置3个复孔，并设置不加药物的对照组。按照下列公式计算细胞存活率：存活率（%）=（A实验/A对照）×100%，A实验和A对照分别代表实验孔和对照孔的吸光度。
表5为细胞毒性对比结果（n=3）。可以看出，HA载药胶束对活化的HSCs的杀伤作用明显强于FA-PEG载药胶束，表明本发明的包载抗肝纤维化药物的HA胶束有更出色的抗肝纤维化能力。
表5. HA载药胶束与FA-PEG载药胶束对活化HSCs的细胞毒性对比
Figure DEST_PATH_IMAGE009
缩写：SLB，水飞蓟宾；PFD，吡非尼酮；VE，维生素E；SAM，硫腺苷甲硫氨酸。

Claims (11)

1.一种靶向至肝星状细胞（HSCs）的纳米胶束：其特征在于，包含磷脂、胆酸盐、透明质酸（HA）-胆酸耦合物、疏水性药物，所述HA-胆酸耦合物的质量分数为1%~20%，其载药量为0.1%~15%，磷脂在处方中的质量分数为10%~60%，胆酸盐在处方中的质量分数为30%~80%，所述磷脂与胆酸盐的质量比为2:1~1:4；所述胶束的粒径为20nm~100nm；HA的分子量为6kDa~300kDa。
2.根据权利要求1所述的纳米胶束，其特征在于，所述HA-胆酸耦合物使用两端均为氨基的二胺类化合物作为连接桥，通过酰胺反应将疏水性的胆酸与HA侧链羧基相连，制备得到两亲性的HA-胆酸耦合物。
3.根据权利要求1所述的纳米胶束，其特征在于，所述HA-胆酸耦合物的质量分数为4%~15%；其载药量为2%~10%；磷脂的质量分数为20%~50%；胆酸盐的质量分数为40%~70%；磷脂与胆酸盐的质量比为2:1~1:4。
4.根据权利要求1所述的纳米胶束，其特征在于，所述疏水性药物，选自水飞蓟宾、吡非尼酮、维生素E、硫腺苷甲硫氨酸中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的纳米胶束，其特征在于，所述磷脂选自大豆磷脂、蛋黄磷脂、氢化磷脂以及合成磷脂。
6.根据权利要求5所述的纳米胶束，其特征在于，所述磷脂选自德国Lipoid公司磷脂S45、S75、S100、SPC、E80、EPCS、EPG、SPC-3、DSPE、DPPA、DSPA、DMPC，日本丘比株式会社磷脂PC98-T、PL-100M、HSPC、PGE、PGSH，韩国斗山公司磷脂DS-PL95E。
7.根据权利要求6所述的纳米胶束，其特征在于，所述磷脂选自磷脂E80、S100、PC98-T、EPCS。
8.一种权利要求1-7任一项所述的纳米胶束的制备方法，其特征在于，将HA-胆酸耦合物、磷脂、胆酸盐和疏水性药物按照质量比例混合溶于有机溶剂，置于圆底烧瓶中，旋转蒸发成膜，加水水化即得。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述水选自去离子水、注射用水、生理盐水和5%葡萄糖溶液；所述有机溶剂选自乙醇、甲醇、二氯甲烷、氯仿、丙酮中的一种或几种混合。
10.权利要求1-7任一项所述的纳米胶束在制备治疗肝纤维化、肝硬化的药物组合物的用途，其特征在于所述疏水性药物选自水飞蓟宾、吡非尼酮、维生素E、硫腺苷甲硫氨酸中的一种或几种。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于所述HA-胆酸耦合物使用乙二胺两端均为氨基的二胺类化合物作为连接桥，通过酰胺反应将疏水性的胆酸与HA侧链羧基相连，制备得到两亲性的HA-胆酸耦合物。
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