CN104324007A - 一种天然重组纳米脂质载体制备技术与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属生物药物制剂领域，涉及一种天然重组纳米脂质载体制备技术与应用，具体涉及的纳米粒为天然重组脂蛋白载药纳米粒，以从血浆组分IV中提取纯化而得载脂蛋白混合物、脂质和药物体外重组而成，重组工艺通过薄膜分散法、乳化蒸发法或乳化蒸发改良法实现。本发明所要解决的技术问题是载脂蛋白、脂质混合物提取纯化方法及天然重组脂蛋白载药纳米粒制备工艺，制备条件温和、成本低廉。本发明提供的重组天然脂蛋白纳米粒具有类球形结构、高度仿生性、极强穿透性、高效运载性以及肿瘤靶向性等显著优点。本发明提供上述天然重组脂蛋白纳米粒的性质评价及应用，该纳米粒加生理盐水、或磷酸盐缓冲液、或5％葡萄糖溶液溶解，以静脉注射、或肌肉注射、或口服给药、或透皮给药方式，可用于疾病的治疗。该方法工艺简单、成本低，易工业化大生产。

Description

一种天然重组纳米脂质载体制备技术与应用

技术领域

本发明涉及生物药物制剂领域，具体涉及肿瘤靶向及治疗的天然重组脂蛋白纳米粒及其制备工艺。

背景技术

脂蛋白是一类在颗粒大小、脂质成分、载脂蛋白种类均有差异的不均一颗粒，由包含载脂蛋白和游离胆固醇的磷脂单层以及非极性的脂质核心组成的生物大分子，在体内脂质转运过程中发挥关键作用。根据密度大小不同，通过密度超速离心法可将血浆脂蛋白(表1)分成四种：乳糜微粒(Chylomicrons，CM)、极低密度脂蛋白(Very low-density lipoprotein，VLDL)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein，LDL)和高密度脂蛋白(High-density lipoprotein，HDL)。由于脂蛋白结构中具有一个脂核，并且LDL和HDL能被特定组织通过受体途径内吞吸收，如果将疏水性药物掺入到脂蛋白脂核部位，取代其核心脂质而不改变天然脂蛋白的完整性，则脂蛋白可作为载体将药物特异性传递到病灶部位。研究表明脂蛋白脂核中的脂质能被疏水性药物取代，不影响其细胞识别结合特性，且脂蛋白具有独特的亲水性-疏水性结构，内源性可完全降解，以及不被网状内皮系统识别、清除等特性，使脂蛋白纳米药物传输系统越来越受到重视。以脂蛋白为基础构建的仿生型纳米给药系统以其良好的体内相容性，天然的靶向性引起人们的广泛兴趣。Masuelier等在上世纪80年代报道了采用LDL与疏水化合物结合制备重组纳米粒；Lacko等通过体外重组将紫杉醇(PTX)载入重组高密度脂蛋白(rHDL)形成rHDL-PTX纳米粒，该纳米粒能够与癌细胞有效结合，使药物化疗过程中的毒副作用显著降低。专利US6514523B1公开了一种载药rHDL的制备方法，用于改善药效、降低毒性和减少网状内皮系统的吞噬，并将药物靶向传输至特定的组织或细胞；CN1307906A公开一种新型药物载体，利用rHDL载药提高药物向肝或肿瘤组织的靶向转运。虽然重组单一脂蛋白纳米粒的研究较广泛，作为抗肿瘤药物的载体已见文献和专利报道，但是如何制备体内稳定性较高的天然重组脂蛋白纳米粒尚未有报道，且载脂蛋白的来源受限，单一脂蛋白纳米粒靶向效果有待提高。本发明通过先拆分-后组装的方式体外还原天然脂蛋白，作为抗肿瘤药物载体，可有效的改善重组单一脂蛋白纳米粒存在的稳定性小、靶向性低等问题。

CN102977180A公开了一种从血浆组分IV中提取人血清白蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白、结合珠蛋白、α2-巨球蛋白、α1-抗胰蛋白酶、铜蓝蛋白、抗凝血酶III、载脂蛋白A-1(apoA-I)等、C1酯酶抑制剂等蛋白的方法。该发明中所述方法虽然蛋白收率高，但蛋白总类杂且多不利于血浆生产中废弃物的利用。

CN102127165B公开了一种从血浆组分IV中纯化得到高纯apoA-I的方法，通过如下步骤：血浆组分IV沉淀溶解，离心除去硅藻土及杂质，收集上清液；上清液加入氯化钠溶液离心获得apoA-I沉淀；复溶沉淀并过滤；滤液先后经阴离子柱层析及疏水柱层析，分离获得高纯的apoA-I溶液，但是该发明操作过程复杂，经济价值低。

本发明利用血浆生产中的废弃物组分IV，采取有机溶剂结合等电点沉淀法提取纯化载脂蛋白混合物，同时脱脂得天然重组高密蛋白纳米粒的脂质组分。通过乳化蒸发法、薄膜分散法及乳化蒸发改良法体外重组载抗肿瘤药物的天然重组脂蛋白纳米给药系统，可有效的改善重组单一脂蛋白来源有限，纳米粒肿瘤靶向低，肿瘤治疗效果弱等问题，其具备以下优势。

(1)高度仿生性：通过先拆分-后组装的方式体外还原天然脂蛋白为载体的给药系统具有高度仿生性的特点。体外利用有机溶剂结合等电点沉淀法从人血浆组分IV中提取载脂蛋白混合物，即将脂蛋白进行拆分，提纯载脂蛋白分离脂质；采用内源性脂蛋白的天然组分体外组装脂蛋白纳米粒，避免了外源性物质的介入；

(2)极强穿透性：颗粒粒径在纳米级范围，易从血管内扩散至血管外；

(3)高效运载性：核(亲脂)-壳(亲水)结构不仅有利于亲脂性药物的高效荷载，且可有效避免所载药物与血浆中成分相互作用而分解破坏；

(4)高度安全性：内源性纳米颗粒，具有良好的生物相容性、可生物降解、无免疫原性，避免被体内网状内皮系统(reticuloendothelial system，RES)识别而快速清除；

(5)肿瘤靶向性：重组天然脂蛋白纳米载体表面主要有apoA-I、载脂蛋白B-100(apoB-100)等载脂蛋白，可通过受体介导途径高效靶向于脂蛋白受体，转运大量脂蛋白纳米粒到达肿瘤部位，提高肿瘤部位对药物的摄取能力。

本发明目的是提供一种重组天然脂蛋白纳米粒的制备工艺，保留了天然脂蛋白的生理活性，发挥其靶向脂蛋白受体高表达肿瘤细胞的作用并产生抗肿瘤药效。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)本发明采用血浆组分IV采用有机溶剂结合等电点沉淀法提取纯化，脂蛋白产量高，成本降低，充分利用血浆资源；

2)本发明提供的天然载脂蛋白混合物可与肿瘤细胞表面的多种脂蛋白受体特异性结合，对脂蛋白受体高表达的肿瘤细胞具有特异性的靶向作用；

3)本发明提供的天然重组脂蛋白纳米载体原料取自人内源性血浆组分IV，稳定性、安全性极高，具备极大的临床应用潜力；

4)本发明提供的天然载脂蛋白纳米粒可完成抗肿瘤药物(化疗药物、光敏剂及治疗基因等)的体内递送，为肿瘤的高效靶向、治疗提供一种新思路。

表1 血浆脂蛋白的性质

发明内容

本发明提供了一种具有肿瘤高靶向的天然重组脂蛋白纳米粒，它主要是由如下组分所制成：当固体质量为mg时，液体质量以ml计，载脂蛋白5-10份、脂质5-10份和药物1-1.5份。

作为优选，所述载脂蛋白为内源提取混合物，且主要包括载脂蛋白ApoA-I、A-II、E、C和B-100。

作为优选，所述脂质为内源提取混合物，主要包括胆固醇、胆固醇酯、甘油三酯和磷脂。

作为优选，所述载脂蛋白和脂质的提取纯化方法如下：

(1)称取血浆组分IV沉淀，初溶于磷酸盐缓冲液，加入乙醇充分溶解，离心；

(2)取步骤(1)离心所得沉淀，初溶于磷酸盐缓冲液，加入乙醇充分溶解，离心；

(3)取步骤(2)上清液，稀盐酸调节pH，加入乙醇充分溶解，离心；

(4)取步骤(3)离心所得沉淀，溶于三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，加无水乙醇脱脂；

(5)取步骤(4)离心所得沉淀，即所述载脂蛋白，上清液即所述脂质。

作为优选，所述药物为脂溶性药物。所载药物药学活性或药理活性分子选白紫杉烷类、喜树碱类、长春碱类、阿霉素类、环孢菌素类、黄酮类、二氢吡啶类、维A酸类、蒽醌类、挥发油类、鬼臼毒素类、嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂、叶酸拮抗剂、藤黄酸类、光敏剂类、治疗基因中的任一物质或其衍生物等，但并不局限于这些所列药物。

作为优选，所述纳米粒粒径为20-210nm。

本发明还提供了上述的天然重组脂蛋白纳米粒制备工艺，主要包括如下三种方法：

乳化蒸发法制备天然重组脂蛋白纳米粒，薄膜分散法制备天然重组脂蛋白纳米粒，乳化蒸发法改良工艺制备天然重组脂蛋白纳米粒(详见实施例二)。

本发明涉及天然重组脂蛋白纳米粒及其制备工艺，具体涉及血浆组分IV提取纯化的载脂蛋白混合物及脂质通过体外重组且无任何外源性成分(例如制备纳米粒常用表面活性剂等成分)的加入而形成。基于天然脂蛋白的高度安全性、极强穿透性、肿瘤靶向性以及高效运载性等优势，设计的天然重组脂蛋白给药系统，具有“仿生智能型”肿瘤识别能力，更符合当今肿瘤治疗的趋势，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例1.1中天然重组脂蛋白-PTX纳米粒的制备过程及结构示意图；

图2为实施例2.1中天然重组脂蛋白-PTX纳米粒的透射电镜图；

图3为实施例2.2中天然重组脂蛋白-PTX纳米粒的体外释放曲线；

图4为实施例2.3.1中天然重组脂蛋白-PTX纳米粒的血清稳定性考察；

图5为实施例2.3.2中天然重组脂蛋白-PTX纳米粒的贮存稳定性考察；

图6为实施例2.6.1中天然重组脂蛋白-PTX纳米粒的细胞毒性考察；

图7为实施例2.6.2中天然重组脂蛋白-PTX纳米粒的细胞凋亡考察。

具体实施方式

通过以下实施例进一步对本发明进行进一步阐述。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：血浆组分IV中天然载脂蛋白及脂质的提取纯化工艺

本发明提供天然载脂蛋白提取纯化工艺，包括如下步骤：

利用有机溶剂结合等电点沉淀法，从人血浆组分IV中提取载脂蛋白混合物的步骤如下：

步骤1)称取血浆组分IV，初溶于50ml pH 5.25的磷酸盐缓冲液，加入16.6ml 25％乙醇溶液继续溶解适当时间，12000r/min离心15min。

步骤2)取沉淀，初溶于50ml pH 6.6的磷酸盐缓冲液，加入4.4ml 8％乙醇溶液继续溶解适当时间，12000r/min离心15min。

步骤3)取上清液，稀盐酸调节pH至5.25，加入12.5ml 25％乙醇溶液继续溶解适当时间，12000r/min离心15min。

步骤4)取沉淀，三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液溶解后加50ml无水乙醇脱脂12h。

步骤5)脱脂12h后12000r/min得湿载脂蛋白混合物沉淀，同时保留脱脂的脂质部分。

步骤6)用玻璃棒将湿沉淀搅拌均匀，真空冷冻干燥机预冻0.5h，抽真空1h，即得载脂蛋白白色干燥粉末。

实施例二：载PTX天然重组脂蛋白(天然重组脂蛋白-PTX)纳米粒的制备工艺

1.1 乳化蒸发法制备天然重组脂蛋白-PTX纳米粒

通过有机溶剂结合等电点沉淀法得到天然脂蛋白混合物及脂质，于室温磁力搅拌作用下用注射器逐滴缓慢滴加溶解有PTX的天然脂质乙醇溶液至载脂蛋白的磷酸盐缓冲液中，滴加结束后，继续磁力搅拌50min；于37℃旋蒸除去乙醇，并在冰浴条件下进行探头超声后过0.22μm滤膜，冷冻干燥即得天然重组脂蛋白-PTX纳米粒。

1.2 薄膜分散法制备天然重组脂蛋白-PTX纳米粒

通过有机溶剂结合等电点沉淀法得到天然脂蛋白混合物及脂质，取处方量的脂质成分，加入PTX，于37℃下旋转蒸发挥干有机溶剂，置于真空干燥器中过夜以除去残留溶剂。加入含有载脂蛋白的磷酸盐缓冲液，水合形成混悬液，冰浴下探头超声20min，即得载药的纳米粒混悬液。过0.22μm滤膜，冷冻干燥即得天然重组脂蛋白-PTX纳米粒。

1.3 乳化蒸发法改良工艺制备天然重组脂蛋白-PTX纳米粒

称取处方血浆组分IV沉淀，加磷酸盐缓冲液，充分溶解后，离心，取上清液用乙醇溶解得脂质与蛋白混悬液，之后继续离心，将处方量PTX置于脂质溶液，于磁力搅拌作用下用注射器逐滴滴加上述脂质溶液至水合介质溶液中。滴加结束后，继续磁力搅拌50min。磁力搅拌结束后，于37℃旋蒸除去乙醇，并于冰浴条件下探头超声。过0.22μm滤膜，冷冻干燥即得天然重组脂蛋白-PTX纳米粒。

实施例三：天然重组脂蛋白的性质研究

2.1 天然重组脂蛋白-PTX纳米粒的粒径及形态

采用激光粒度仪测定天然重组脂蛋白-PTX纳米粒的平均粒径为(160.4±20)nm。透射电镜结果如图1所示，所制备的天然重组脂蛋白-PTX纳米粒均为圆整度较好的球形粒子，外观光滑，且与激光粒度仪测得的粒径一致。

2.2 天然重组脂蛋白-PTX纳米粒中PTX的包封率

取100μl的天然重组脂蛋白-PTX纳米粒，甲醇定容至5ml，水浴超声20min，12000r/min离心10min，取上清液用0.22μm的有机滤膜过滤，高效液相色谱法测定其含量，并计算其包封率：

实验结果表明，PTX的包封率可达到98.72％。

2.3 天然重组脂蛋白-PTX纳米粒的体外释放

采用透析法考察样品的体外释药特性。取PTX混悬液、天然脂质纳米粒(Lipos-PTX)、天然重组脂蛋白-PTX各5ml，加入透析袋(分子量3500)中，置于100ml含0.2％Tween80的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中。37℃，100rpm水浴振荡。分别于1、2、4、6、8、12、24h取1ml透析介质，同时补充新鲜的透析介质。各时间点的样品用0.22μm微孔滤膜过滤，高效液相色谱法测定PTX浓度计算各时间点的释放量。结果如图2所示，由图可知，载药的天然重组脂蛋白纳米粒24h累计释放率远小于PTX混悬液及天然脂质载药纳米粒的释放率，可见纳米粒对药物的释放起到缓释作用。

2.4 天然重组脂蛋白-PTX纳米粒的稳定性

2.4.1 天然重组脂蛋白-PTX纳米粒的血清稳定性

取天然重组脂蛋白-PTX、Lipos-PTX，加入20％(体积比)的FBS，置于37℃水浴锅中水浴，分别放置1h、2h、4h、8h、12h和24h之后，取出样品测定其粒径。结果如图3所示。由图可知，与血清作用之后，天然重组脂蛋白-PTX纳米粒、Lipos-PTX的粒径变化都不是太大，说明天然重组脂蛋白-PTX、Lipos-PTX均具有一定的抗血清成分降解的能力。并且，相比于Lipos-PTX，天然重组脂蛋白-PTX的粒径变化更小，稳定性更好，说明天然重组脂蛋白纳米粒具有更好的血清稳定性。

2.4.2 天然重组脂蛋白-PTX纳米粒的长期贮存稳定性

将制得的天然重组脂蛋白-PTX纳米粒置于4℃冰箱不同天数后，测定样品的粒径、多分散系数及包封率变化。天然重组脂蛋白-PTX在4℃下能够稳定放置40天，在40天内，粒径、多分散系数及包封率没有显著变化，而第50天，粒径稍有增加。在40天的储存时间内，天然重组脂蛋白-PTX保持相对的结构稳定性。

2.5 溶血实验

2.5.1 2％兔红细胞悬液的制备

从健康家兔心脏取血10ml，置于三角烧瓶中，用玻璃棒不停同向搅拌，除去纤维蛋白，使其成为脱纤维血液；然后将血移入刻度离心管内，加入10倍量的0.9％的氯化钠溶液，摇匀，1500rpm离心10min，弃上清液，将沉淀的红细胞再用10倍量的0.9％氯化钠溶液按上述方法洗涤2～3次，直至上清液不显红色为止。取离心至上清液无色后的红细胞2ml，加0.9％氯化钠溶液至100ml，配制成2％的红细胞混悬液，4℃冰箱中冷藏备用。

2.5.2 体外试管观察法

取干净试管9支，按照1～9顺序编号，1～7号管为供试品管，8号管为阴性对照管(0％溶血)，9号管为阳性对照管(100％溶血)。按表2所示依次加入天然重组脂蛋白纳米粒，2％红细胞悬液、0.9％氯化钠溶液，混匀后，于37℃恒温箱放置30min，然后分别加入不同量的供试品溶液，配制药物终浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.4mg/ml的天然重组脂蛋白纳米粒制剂样品溶液摇匀后，立即置(37.0±0.2)℃的恒温箱中进行温育，分别于第15min、30min、45min、1h、2h、3h和4h观察各试管是否有溶血或凝集现象。

表2 溶血性实验设计

溶血判断标准如下：

若试验中的溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或有少量红细胞残留，表明全溶血(+++)；

若试管中的溶液呈澄明红色或棕色，管底有少量红细胞残留。镜检红细胞稀少或变形，表明部分溶血(+)；

若红细胞全部下沉，上清液体无色澄明，表明无溶血发生(-)；

若溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，振摇后不分散，表明有红细胞凝聚发生。如有红细胞凝聚的现象，应进一步判定是真凝聚还是假凝聚。可按下法进一步判定是真凝聚还是假凝聚：将凝聚物放在载玻片上，在盖玻片边缘滴加2滴0.9％氯化钠溶液，置显微镜下观察，凝聚红细胞能被冲散者为假凝聚，若凝聚物在玻片上不被冲散者为真凝聚。有真凝聚现象者不可供临床注射用，有假凝聚者可结合局部刺激试验结果，考虑谨慎使用。

阴性对照管无溶血和凝集发生，阳性对照管有溶血发生时，若受试物管中的溶液在3h内不发生溶血和凝集，则受试物可以注射使用；若受试物管中的溶液在3h内发生溶血和(或)凝集，则受试物不宜注射使用。

表3 天然重组脂蛋白纳米粒溶血实验结果

“-”无溶血；“+++”溶血

根据体外试管观察结果，1～8号管溶液中红细胞全部下沉，上层液体无色澄明，表明天然重组脂蛋白纳米粒和生理盐水无溶血及红细胞凝集现象，而9号管内液体红色澄明，管底无细胞残留，表明全部溶血，结果详见表3。结果显示，不同浓度的天然重组脂蛋白纳米粒在4h内无明显溶血作用。

2.5.3 溶血度检测法

以0.9％氯化钠溶液为空白对照，采用分光光度法测定各样品的吸收度。各样品在1500rpm离心10min，小心抽取上清液，于545nm测定其吸收值，阳性对照管吸收值在(0.8±0.5)范围内，阴性对照管吸收值应小于0.03。由于样品溶液本身可能在545nm处有吸收，因此将样品母液直接以0.9％氯化钠溶液稀释相同的倍数，按上述方法测定样品本身的吸收值，以上两者吸收值之差即为A_sample，按下列公式计算溶血百分数。

$\mathrm{Hemolysis}(\%)=\frac{A_{\mathrm{sample}}-A_{0\%}}{A_{100\%}-A_{0\%}}\×100$

表4 不同浓度天然重组脂蛋白纳米粒溶血实验结果

将温育后的样品按照溶血度的测定方法项下的方法处理样品，测定各管溶液的吸收度，结果详见表4。结果表明，不同浓度的天然重组脂蛋白纳米粒在4h内溶血率均小于5％，结果与体外试管观察法一致。两种方法共同说明天然重组脂蛋白纳米粒在体外无明显溶血作用，静脉注射安全性高。

2.6 天然重组脂蛋白纳米粒靶向性考察

2.6.1 MTT法考察重组脂蛋白-PTX纳米粒的体外细胞毒性

采用MTT法考察重组脂蛋白-PTX纳米粒的体外细胞毒性，以评价纳米粒对体外肿瘤细胞的杀伤作用。取对数生长期的HepG2细胞以5×10³及1×10⁴个/孔接种于96孔板中，完全培养液37℃培养24h，移去培养液，分别加入100μl用不含血清的培养液稀释的天然重组脂蛋白-PTX，rHDL-PTX和Lipos-PTX，其中PTX浓度范围为0.1～30μg/ml，于37℃孵育24h，弃去含制剂的培养基，磷酸盐缓冲液洗两次。加入10μl的5mg/ml的MTT磷酸盐溶液，37℃孵育4h后，弃去上清液，加入150μl DMSO溶解蓝紫色的甲瓒结晶，采用酶标仪于570nm测定吸光度。按照以下计算细胞存活率(Cell viability)。

Cell viability/％＝(OD_sample-OD_blank)/(OD_control-OD_blank)×100％

其中，OD_sample是供试液处理的供试液孔的吸光度，OD_control是仅用空白培养液处理的对照孔的吸光度，OD_blank以完全培养液为空白调零孔的吸光度。

结果如图5所示，天然重组脂蛋白-PTX、rHDL-PTX、Lipos-PTX及泰素各给药系统的细胞毒作用具有浓度依赖性，且对肿瘤细胞有明显的抑制作用。浓度为0.1～10μg/ml时，各组细胞存活率无明显差异；随PTX浓度的增加，重组脂蛋白-PTX组的细胞存活率显著降低；当PTX浓度达30μg/ml时，天然重组脂蛋白-PTX对肿瘤细胞的抑制率显著高于rHDL-PTX、Lipos-PTX组，对肿瘤细胞的抑制率分别约为rHDL-PTX的2倍、Lipos-PTX的3倍。可解释为，天然重组脂蛋白纳米粒内含混合载脂蛋白，具备肿瘤多受体识别能力，增加PTX细胞内蓄积，促进对肿瘤细胞的杀伤作用。^*，^**，^***代表不同组别相比的显著性差异，其中^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001。

2.6.2 Annexin V-FITC考察天然重组脂蛋白-PTX纳米粒的细胞凋亡

取对数生长期的HepG2细胞，0.25％的胰蛋白酶消化，并反复吹打成单细胞悬液。用细胞计数板计算细胞数，以1×10⁵个/孔接种于6孔板中，完全培养液37℃培养24h，移去培养液，每孔加入100μl用不含血清的培养液稀释成的制剂，以PTX为标准，各制剂浓度均为15μg/ml，重组脂蛋白-PTX，rHDL-PTX，Lipos-PTX，泰素，于37℃孵育24h，弃去含制剂的培养基，磷酸盐缓冲液洗两次，胰蛋白酶消化后，完全培养液终止消化，收集细胞，与前收集培养液混合，1000g离心4min，弃去上清液，4℃磷酸盐缓冲液洗两遍，重悬于0.3ml Annexin V-FITC结合液，加入5μl PI染色液，轻轻混匀，室温避光孵育15min，采用流式细胞仪检测。

结果如图6所示，不同PTX制剂对HepG2细胞凋亡程度不同：对照组细胞凋亡较少，基本都为正常细胞，正常细胞所占比例为95.78％；当细胞孵育rHDL-PTX、Lipos-PTX、泰素24h后，正常细胞所占比例分别为88.47％、88.42％及87.18％；当细胞孵育天然重组脂蛋白-PTX 24h后，促进HepG2细胞的凋亡，凋亡细胞的比例达26.45％，所产生的全部细胞凋亡率显著高于其它对照组。说明以天然重组脂蛋白-PTX纳米递送系统能够显著地增强PTX对肿瘤细胞靶向的特异性，促进肿瘤细胞的凋亡。

Claims (10)

1.一种天然重组脂蛋白纳米粒，其特征在于，它主要是由如下组分所制成：当固体质量为mg时，液体质量以ml计，载脂蛋白8-10份、脂质1-3份和药物1-1.5份。

2.根据权利要求1中所述的天然重组脂蛋白纳米粒，其特征在于，所述载脂蛋白为内源提取混合物，且主要包括ApoA-I、A-II、E、C和B-100等。

3.根据权利要求1-2所述的天然重组脂蛋白纳米粒，其特征在于，所述脂质为内源脱脂混合物，且主要包括胆固醇、胆固醇酯、甘油三酯和磷脂。

4.根据权利要求1-3所述的天然重组脂蛋白纳米粒，其特征在于，所载药物药学活性或药理活性分子选自紫杉烷类、喜树碱类、长春碱类、阿霉素类、环孢菌素类、黄酮类、二氢吡啶类、维A酸类、蒽醌类、挥发油类、鬼臼毒素类、嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂、叶酸拮抗剂、藤黄酸类、光敏剂类、治疗基因中的任一物质或其衍生物。

5.根据权利要求1-4所述的天然重组脂蛋白纳米粒，其特征在于，所述纳米粒粒径为20-210nm。

6.根据权利要求1-5所述的天然重组脂蛋白纳米粒，其特征在于，所述载脂蛋白和脂质的提取纯化方法如下：

(1)称取血浆组分IV沉淀初溶于磷酸盐缓冲液(pH5～6)，加入浓度为(5～25)％乙醇充分溶解，离心；

(2)取步骤(1)所得沉淀初溶于磷酸盐缓冲液(pH6～7)，加入浓度为(5～15)％乙醇充分溶解，离心；

(3)取上清液，稀盐酸调节pH至5～6，加入浓度为(10～30)％乙醇充分溶解，离心；

(4)取步骤(3)离心所得沉淀，用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液溶解后加无水乙醇脱脂；

(5)取步骤(4)离心所得沉淀，即所述载脂蛋白，上清液即所述脂质。

7.根据权利要求1-6所述的天然重组脂蛋白纳米粒制备工艺，其特征在于，主要包括如下步骤：

(1)称取所述载脂蛋白，磷酸盐缓冲液溶解得蛋白溶液；

(2)量取处方量的脂质成分，加入处方量药物，于磁力搅拌作用下将脂质逐滴滴加至上述蛋白溶液中，滴加结束后，继续磁力搅拌30～80min；

(3)磁力搅拌结束后，于34～40℃真空旋转蒸发除去乙醇，并于冰浴条件下超声，过0.22μm滤膜，冷冻干燥即得。

8.根据权利要求1-6所述的天然重组脂蛋白纳米粒制备工艺，其特征在于，主要包括如下步骤：

(1)称取所述载脂蛋白，磷酸盐缓冲液溶解得蛋白溶液；

(2)量取处方量的脂质成分，加入处方量药物，于37℃下旋转蒸发挥干有机溶剂，置于真空干燥器中过夜以除去残留溶剂；

(3)加入含有载脂蛋白的磷酸盐缓冲液，水合至形成混悬液，冰浴下探头超声20min，即得载药的纳米粒混悬液，过0.22μm滤膜，冷冻干燥即得。

9.根据权利要求1-5所述的天然重组脂蛋白纳米粒制备工艺，其特征在于，主要包括如下步骤：

(1)称取处方量血浆组分IV沉淀，加磷酸盐缓冲液，充分溶解后，离心，取上清液用乙醇溶解得脂质与载脂蛋白混悬液，继续离心；

(2)称取处方量药物置于上清液，于磁力搅拌作用下用注射器逐滴滴加混悬液(溶解药物)至水合介质溶液中，滴加结束后，继续磁力搅拌50～80min；

(3)磁力搅拌结束后，于37℃旋蒸除去乙醇，并于冰浴条件下探头超声，过0.22μm滤膜，冷冻干燥即得。

10.根据权利要求1-9所述的天然重组脂蛋白纳米粒，加生理盐水、或磷酸盐缓冲液、或5％葡萄糖溶液溶解，以静脉注射、或肌肉注射、或口服给药、或透皮给药方式，用于疾病的治疗。