CN113134097B - 一种生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒及其制备方法和应用，所述多功能仿生型脂蛋白纳米粒是由生物肽修饰的脂蛋白仿生纳米载体外壳和纳米形式的药物内核组成，所述载体外壳由载脂蛋白仿生肽、生物肽与天然磷脂替代物共同构成。其制备方法包括薄膜分散法和乳化蒸发法。本发明制备方法条件简单温和、成本低廉，制得的生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒具有高载药能力、高度仿生型、强穿透性、生物安全性、病变部位靶向性和载药模式多样性等优点。该纳米药物递送平台能够实现“诊疗一体化”以及“多模式联合治疗”，能够实现对于复杂的进行性疾病例如肿瘤、神经退行性疾病等的及时诊断以及高效治疗。

Description

一种生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒及其制备方法 和应用
技术领域
本发明属于纳米制剂技术领域，具体涉及一种生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒及其制备方法和应用法。
背景技术
脂蛋白是一类由富含固醇脂、甘油三酯的疏水性内核和由载脂蛋白、磷脂、胆固醇等组成的外壳构成的球状微粒，对于体内脂质转运过程起着重要的作用。根据密度不同，脂蛋白可分为4类，包括乳糜微粒(Chylomicrons，CM)、极低密度脂蛋白(Very low-densitylipoprotein，VLDL)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein，LDL)以及高密度脂蛋白(High-density lipoprotein，HDL)。载脂蛋白是脂蛋白中的重要组成成分，主要包括A、B、C、D、E五类。载脂蛋白A族(ApoA)是HDL中主要的载脂蛋白成分，其中ApoA-I为ApoA的主要亚型。由于脂蛋白具有一个疏水性质的脂质内核，且LDL和HDL能够凭借载脂蛋白组分被特定组织表达的受体特异性识别穿透组织并进入细胞中，因此如果将脂蛋白内核中的脂质替换为疏水性性质的药物，那么就可以在不改变脂蛋白完整性的情况下将药物递送到特定部位，例如受体高表达的病灶部位。研究表明脂蛋白脂核中的脂质能够被疏水性药物取代，且不会影响其细胞的受体识别特性。但是在不断研究中发现，直接提取人源性脂蛋白进行脂质的替换成本较高，提取难度大，且不易储存。因此人们逐渐选择某些成分明确的化合物代替脂蛋白颗粒中对应组分形成“合成型脂蛋白颗粒”，例如用胆甾烯基亚油酸酯替换合成LDL的胆固醇酯核心；用DMPC或DOPE代替磷脂制备得两亲性外壳等等。Masuelier等在上世纪80年代报道了采用LDL与疏水化合物结合制备重组纳米粒；Lacko等通过体外重组将紫杉醇(PTX)载入重组高密度脂蛋白(rHDL)形成rHDL-PTX纳米粒，该纳米粒能够与癌细胞有效有效结合，使药物化疗过程中的毒副作用显著降低。但是脂蛋白的核心成分——载脂蛋白仍存在部分问题，包括不易提取、难以获得；合成时间较长、操作繁琐复杂；纯化过程耗时费力、存储成本较高，严重制约了大批量脂蛋白颗粒的开发与应用。为了克服这一难题，研究者根据载脂蛋白的结构与功能特点，开发出与原生载脂蛋白具有极高生物学相似度且几乎完整保留生物学功能的肽段，称之为“载脂蛋白仿生肽”。这种仿生肽的最大优势在于，在基本完整保留原生载脂蛋白功能及性质的基础上，能够克服其在生产、加工、保留过程中存在的种种问题，且与全长的原生载脂蛋白相比，仿生肽的分子量更小，更易于合成与使用，同时由于生产过程全程可控，因此具有更高的安全性。研究表明载脂蛋白仿生肽能够与天然磷脂的替代物重新组装形成“仿生型脂蛋白颗粒”，不仅能够完全保留原生脂蛋白亲水性—疏水性结构以及受体特异性识别、内吞的生物过程，具有极高的生物相容性以及生物安全性，能够被完全降解；同时，能够实现多模式药物负载，例如：①通过范德华力等弱相互作用的非共价键作用力，将药物嵌入脂蛋白表面；②通过共价修饰，将治疗药物或肽与磷脂或载脂蛋白缀合；③疏水药物直接封装于内核当中。虽然有关仿生型制脂蛋白纳米粒的研究以见文献和专利报道，但是如何制备稳定性更高鲜有报道。且单一的仿生型脂蛋白纳米粒靶向性以及特定病灶部位的穿透力与累积性仍较为有限。
恶性肿瘤是全球主要的死亡原因之一，是威胁人类健康和生命的主要疾病。预防和治疗肿瘤已成为世界密切关注的问题。肿瘤在中医病症中为“症瘕积聚”。临床观察显示大部分肿瘤患者存在有形肿块固定不移、舌体瘀点及舌下脉络迂曲等中医血瘀证表现。《医林改错》中认为，“积聚一症，……，结块者必有形之血也”。中药单体，例如紫杉醇、喜树碱、三氧化二砷已经显示出良好的肿瘤杀伤能力，能够抑制肿瘤细胞的生长与增殖。但是，由于毒副作用较大、易产生耐药性等问题，单一的化疗性药物很难达到良好的疾病治疗效果，同时也难以确定复杂疾病的具体进程，因此人们开始将化疗药物与光敏剂以及成像剂相结合，并同时包载于纳米载体中，实现病灶部位的精准靶向以及深部渗透，光敏剂的引入能够拓展治疗模式，实现化疗与光疗多模式联合，成像剂或造影剂能够在明确疾病进程，显示出肿瘤的具体位置、形态以及大小。虽然有关中药单体与造影剂联用已有一定的报道，但是针对弥漫性肿瘤的应用以及如何实现高效、靶向的特异性递送仍然存在相当多的空白亟待填补。此外，如何将药物以纳米形式高效包载至疏水性载体之中，充分利用仿生型载脂蛋白纳米粒的内部疏水性的载药空间至今仍未有明确报道。
发明内容
发明目的：针对上述技术问题，本发明目的是提供一种生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒，另一目的是提供一种生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米制剂的制备工艺，保留的原生脂蛋白的理化特征，同时将药物活性成分进行纳米化处理并进行疏水性修饰，充分利用载体内部的疏水性空间，同时发挥其靶向脂蛋白受体高表达的肿瘤细胞的作用并产生肿瘤诊断、治疗一体化的功效。
技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒，所述仿生型多功能脂蛋白纳米粒是由生物肽修饰的多功能脂蛋白仿生纳米载体外壳和纳米形式的药物内核组成，所述载体外壳由载脂蛋白仿生肽、生物肽与天然磷脂替代物共同构成。
作为优选：
所述纳米形式的药物内核为经过疏水性修饰的药物内核，其中，纳米形式优选自共沉淀形式，但不局限于该形式；疏水性修饰采用的物质优选自1，2-油酰基磷脂酸钠盐、1-硬脂酰-2-亚油酰基磷脂酸钠盐、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸钠盐中的一种或几种，但不局限于这些物质。
所述纳米形式的药物内核，其中包括抗肿瘤活性成分、治疗神经退行性疾病活性成分、成像剂和/或光敏剂。
进一步优选，所述抗肿瘤活性成分选自紫杉醇、喜树碱、三氧化二砷、二氢丹参酮中的一种或几种，但不局限于这些药物；所述治疗神经性退行性疾病活性成分选自多酚醛合剂(α-锰酸蛋白)、多奈哌齐、左旋多巴中的一种或几种，但不局限于这些药物；所述成像剂选自锰、钆、稀土复合物、氧化铁、姜黄素、吲哚菁绿中的一种或几种，但不局限于这些物质；所述光敏剂选自姜黄素、氧化铁、IR-780、IR-792、IR-1048、CR-780中的一种或几种，但不局限于这些药物。
所述载脂蛋白仿生肽选自载脂蛋白ApoA-I仿生肽、ApoE仿生肽D-4F、R-4F、L-4F、COG133或其衍生物中的一种或几种，但不局限于这些物质；所述生物肽选自Mel、iRGD、NAP、Angiopep-2、Tf中的一种或几种，但不局限于这些物质；所述天然磷脂替代物选自DPPC、DMPC、DOPE、DOPC、SM中的一种或几种，但不局限于这些物质。
所述生物肽修饰的仿生型脂蛋白纳米粒的粒径为80-120nm。
本发明还提供了上述的生物肽修饰的仿生的多功能脂蛋白纳米粒制备工艺，主要包括以下两种方法：乳化蒸发法和薄膜分散法。
所述的生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备纳米形式的药物内核；
(2)分别制备含有载脂蛋白仿生肽的磷酸盐缓冲溶液A和含有生物肽的磷酸盐缓冲溶液B；
(3)将天然磷脂替代物和步骤(1)所得药物内核混合，滴加入上述溶液A中，乳化，然后再将溶液B滴加进去，乳化，结束后，超声破碎，旋蒸除去有机溶剂；
或者，将天然磷脂替代物和步骤(1)所得药物内核混合，除去有机溶剂，然后加入上述溶液A和溶液B，水合至形成混悬液，超声；
(4)过滤，超滤除去游离药物，即得。
作为优选：
步骤(3)中，当固体质量为mg时，液体质量以mL计，所述药物内核中的药物1份，天然磷脂替代物2～4份，载脂蛋白仿生肽1～2份、生物肽1～2份。
步骤(3)中，所述滴加入上述溶液A中，乳化100-140min；所述再将溶液B滴加进去，乳化100-140min。
本发明还提供了所述的生物肽修饰的仿生型脂蛋白纳米粒在制备肿瘤诊断试剂或神经退行性疾病诊断试剂中的应用。应用时，或加生理盐水、或磷酸盐缓冲液、或5％葡萄糖溶液溶解，以静脉注射、或肌肉注射、或口服给药，其具有MRI成像能力，用于肿瘤位置、形态、大小的确定或者神经退行性疾病的诊断。
以及，所述的生物肽修饰的仿生型脂蛋白纳米粒在制备抗肿瘤药物或治疗神经退行性疾病药物中的应用。应用时，或加生理盐水、或磷酸盐缓冲液、或5％葡萄糖溶液溶解，以静脉注射、或肌肉注射、或口服给药，该纳米粒能够显著提高内核中活性成分的生物利用度，具有抗肿瘤或治疗神经退行性疾病的疗效。
本发明将药物活性成分以纳米粒的形式包载于载体内部，并对其进行了疏水性修饰，相较于非纳米形式以及现存的非修饰直接载药方式而言，充分利用了仿生型脂蛋白纳米粒内部的疏水性空间，显著提高了药物的包封率，与包载非纳米粒形式药物内核或未经疏水性修饰的纳米粒形式药物内核的普通脂质体相比，包封率大大提高。此外，还可以同时将药物活性成分与成像剂/光敏剂有效链接在一起，使其在正常内环境中极为稳定(稳定性考察可见实施例三1.6)而在酸性的肿瘤微环境中能够有效分解并释放，实现了肿瘤微环境pH响应；其次，纳米级别的药物形式提高了药物活性成分在病变部位的渗透性，提高了药物的生物利用度，并有效降低了药物的毒副作用，避免了潜在生物安全性问题的发生；再者，不同功能的药物成分以纳米形式共递送，能够实现各成分的分级释放或外环境响应释放的目的，进一步提高了整个药物对于疾病微环境的针对性以及药物的靶向性。
本发明通过薄膜分散法、乳化蒸发法的方式制备出生物肽修饰的仿生型脂蛋白纳米粒，作为抗肿瘤药物载体，除凭借脂蛋白颗粒与对应受体的结合介导内吞外，生物肽的加入同时开辟了其他摄取途径并提高了摄取效率。例如，修饰具有穿膜功能的生物肽能够通过穿透肿瘤细胞膜进入其中；修饰有靶向性的生物肽能够同时靶向其他靶点增强病变细胞的内化与累积；修饰有治疗功能的生物肽能够提高疾病的治疗效果等。综上，生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒能够有效的改善单一仿生型脂蛋白纳米粒治疗效果欠佳，组织穿透性、病变细胞靶向性有限的问题。
本发明利用载脂蛋白模拟肽、天然磷脂替代物、生物肽，通过薄膜分散法以及乳化蒸发法负载中药单体与造影剂共沉淀物，可有效改善单一仿生型脂蛋白载体穿透力弱、靶向性低、药物生物利用度有限、治疗安全窗窄等问题。其具备以下优势：
(1)高度仿生性：利用载脂蛋白仿生肽以及天然磷脂替代物代替原生型载脂蛋白和磷脂，能够完全保留脂蛋白原本的化学性质以及生物特性，具有高度仿生性；通过薄膜分散发、乳化蒸发法制备的仿生型脂蛋白纳米粒能够完全保留脂蛋白原本的亲水性—疏水性结构；
(2)极强穿透性：颗粒粒径在纳米级范围内，易从血管内扩散至血管外；功能肽的修饰进一步增强其细胞以及组织的穿透能力；
(3)肿瘤多重靶向性：载脂蛋白模拟肽能够保留原生载脂蛋白的生物功能，能够被肿瘤部位高表达的脂蛋白受体识别，包括LDL受体、SR-BI受体，通过受体介导的方式高效、特异地聚集至病变部位；生物肽的修饰也可以靶向肿瘤部位其他高表达的受体，进一步提高制剂的靶向聚集能力；
(4)高生物安全性：具有良好的生物相容性，可生物降解、无免疫源性，避免被体内网状内皮系统(reticuloendothelial system，RES)识别而被快速清除；
(5)载药模式多样性：仿生型多功能脂蛋白纳米载体可以实现多模式、多部位载药：①通过范德华力等弱相互作用的非共价键作用力，将药物嵌入脂蛋白表面；②通过共价修饰，将治疗药物或肽与磷脂或载脂蛋白缀合；③疏水药物直接封装于内核当中。
(6)高效药物负载能力：对所载药物进行了纳米化处理，并再次进行疏水性修饰，提高了药物的疏水性，使药物更易被包载入仿生型多功能脂蛋白载体之中，充分利用了载体的载药空间，提高了包封率与载药量，并充分保证了药物活性成分的稳定性，在常规条件下能够实现5天内药物粒径基本无变化(参见实施例三1.6)。
(6)治疗手段多元化：选择具有治疗功能的肽段，例如免疫功能、神经保护功能，通过共价修饰直接与载脂蛋白模拟肽缀合，与天然磷脂替代物共组装形成仿生型脂蛋白纳米粒；内部包载中药单体与造影剂结合的疏水性内核，实现“诊疗一体化”模式。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：
(1)本发明采用共价修饰的方法直接将生物肽与载脂蛋白模拟肽缀合，并通过薄膜分散法以及乳化蒸发法进行纳米粒的制备，方法简单、成本低廉、治疗可控，易于工业化生产；
(2)本发明提供的生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒可与肿瘤组织及细胞上多种脂蛋白受体特异性结合，对脂蛋白受体高表达的肿瘤组织与细胞具有特异性的靶向作用；
(3)本发明提供的生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒能够通过选择不同功能的肽段(如穿透肽可加强病变组织聚集、治疗性肽段可以增强治疗功能)以实现不同目的，为肿瘤的高效治疗提供一种新思路；
(4)本发明提供的生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒实现了药物活性成分以纳米级形式的包载与递送，并对其进行疏水性修饰，显著提高了包封率和载药量，并实现了药物在病变部位的外环境响应释放，提高了整个制剂与疾病的适应性与匹配性。
本发明提供的生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒可以完成单个抗肿瘤中药单体(如紫杉醇、喜树碱、三氧化二砷等)或肿瘤单体与成像剂结合物的体内递送，该纳米制剂具有高度仿生性、极强穿透性、肿瘤靶向性、高度安全性，同时生物肽的再修饰以及成像剂的包载又进一步充分应用了此类纳米粒载药方式多重性的优势，并成功构建了“诊疗一体化”仿生型多功能脂蛋白药物递送系统，符合肿瘤治疗的发展趋势，满足肿瘤治疗的临床需要，为肿瘤的高效靶向治疗以及诊疗一体化平台的一体化构建提供了范本，具有广阔的应用前景以及临床转化潜力。
附图说明
图1为实施例一中生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒药物内核样品实物图，其中图A是纳米粒内核中ATO浓度考察示意图，图B是疏水性修饰后纳米内核示意图；
图2为实施例三1.1中生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒形态表征图，包括投射电镜图(A)、EDX能谱点扫图(B)；EDX能谱mapping图(C)；
图3为实施例三1.3中生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒的体外pH相应释放曲线；
图4为实施例三1.4中生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒的体外MRI成像能力(A)与T1弛豫时间(B)；
图5为实施例三1.5中生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒的体外溶血性考察；
图6为实施例三1.6中生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒的储存稳定性考察；
图7为实施例三1.7.1中生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒的细胞毒性考察；
图8为实施例三1.7.2中生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒的细胞凋亡考察。
图9为实施例三1.8中功能肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒的细胞摄取考察。
具体实施方式
通过以下实施例进一步对本发明进行进一步阐述。这些实施例完全是例证性的，他们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。下面结合附图及实施例对发明作进一步描述：
实施例一：制备MnAs共沉淀内核并进行疏水性修饰
吸取环己烷7.5mL、曲拉通1.5mL、正己醇1mL，磁力搅拌混合10min，形成透明稳定的反相微乳体系。称取适量四水合氯化锰，加入超纯水1mL，涡旋溶解配制为氯化锰溶液。称取适量ATO，加入浓度为1M的NaOH溶液1mL，涡旋溶解，加入浓盐酸，调节pH为7.4，配制为ATO溶液。氯化锰溶液100μL逐滴加入至反相微乳体系中，磁力搅拌15min。相同摩尔浓度的ATO溶液100μL逐滴加入，磁力搅拌2h，生成淡黄色的MnAs共沉淀。
向已生成MnAs共沉淀的反相微乳体系中逐滴加入20mmol/L的1，2-油酰基磷脂酸钠盐(DOPA)氯仿溶液100μL，磁力搅拌2h。通过DOPA的修饰赋予MnAs内核疏水性特质，使其能顺利进入仿生型脂蛋白纳米载体内部从而实现药物的成功包载。加入等量的无水乙醇至已疏水性修饰的MnAs共沉淀的反相微乳体系中，12000G，离心15min，去除有机溶剂和表面活性剂。无水乙醇洗涤2～3次，即得DOPA疏水性修饰后的MnAs共沉淀。氯仿溶解，4℃冷藏备用。结果如图1所示。选用反相微乳法进行内核的制备能够有效的控制粒径大小，并可根据实际情况进行各组分比例的调整，操作简单，易实现工业化生产。
实施例二：载MnAs并修饰功能肽Mel仿生型脂蛋白纳米粒(Mel-LNPs/MnAs)的制备工艺
称取DMPC 1.5mg，加入“实施例一”项下制备的MnAs共沉淀溶液0.5mL溶解，逐滴加入至D4F溶液(0.75mg，1.5mL)中搅拌乳化2h，后加入α-Mel溶液(0.5mg，0.5mL)搅拌乳化2h。超声破碎(195W)10min，旋转蒸发除去有机溶剂。过0.8μm滤膜，30k Da超滤管离心超滤(5000r/min、10min)，除去游离药物，PBS缓冲液重悬，即得Mel-LNPs/MnAs。
选择D4F多肽与磷脂的质量比为0.5：1，进一步考察Mel-LNPs/MnAs制备所用的磷脂(DMPC/PC)及磷脂的用量，具体考察处方见表1-1，取适量的制剂，超纯水稀释，以马尔文激光粒度仪测定制剂的粒径大小、多分散系数(PDI)及Zeta电位。
表1-1磷脂类型及用量考察处方。
Figure GDA0003835531560000081
如表1-1所示，选用DMPC作为磷脂所制备得的Mel-LNPs/MnAs在3个处方中均比以PC制备的Mel-LNPs/MnAs粒径小，因而选择DMPC作为后续制备的磷脂。在以DMPC制备得的Mel-LNPs/MnAs中，DMPC用量为1.5mg时，粒径最小，为(119.33±4.8)nm；PDI为(0.41±0.04)，粒径分布较为均匀；Zeta电位为(-2.83±0.41)mV。因而选择以DMPC作为磷脂，用量为1.5mg作为后续处方。
表1-2磷脂类型及用量考察结果(mean±SD，n＝3)。
Figure GDA0003835531560000082
表1-3Mel-LNPs/MnAs的粒径和PDI(mean±SD，n＝3)。
Figure GDA0003835531560000091
综上，筛选出最优处方：选择DMPC作为天然磷脂替代物，确定DMPC用量1.5mg，确定D4F多肽质量为0.75mg，确定α-Mel质量为0.5mg进行纳米粒的制备。制备方法如前所示。
实施例三：生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒性质考察
选取最优处方进行Mel-LNPs/MnAs的制备，并进行如下考察。
1.1Mel-LNPs/MnAs的形态
用高分辨透射电镜观察，结果如图2A所示，可见Mel-LNPs/MnAs粒子形状均为规整的球形，粒子之间粘连和聚集的现象较少。放大后观察可见，在粒子中间分布有一定数量的黑色的晶格，说明MnAs共沉淀较好的负载于LNPs当中。
在相同视野下，对Mn、As两种元素进行扫描，进行能谱点扫描测试，结果如图2B所示，在所选扫描点处具有较高的Mn及As元素响应。
后续进行该视野下的能谱面扫，结果如图2C所示，可见在Mel-LNPs/MnAs中，较均匀的有Mn及As元素的响应，说明制备得的Mel-LNPs/MnAs对MnAs共沉淀有较好的负载。
1.2Mel-LNPs/MnAs中Mn和As的含量
使用超滤法测定制备得到的Mel-LNPs/MnAs中Mn及As的浓度，并计算包封率。对照组脂质体中Mn的浓度仅为1086.97±1022.28mM，As的包封率为(48.32±5.95)％，而最终制剂Mel-LNPs/MnAs中，Mn的浓度可达到3402.12±275.46mM，As包封率为(68.89±6.29)％。
表1-4ICP-MS测定内核及制剂中Mn、As含量(mean±SD，n＝3)。
Figure GDA0003835531560000092
1.3Mel-LNPs/MnAs的体外pH响应性释放考察
透析袋(8000-14000)剪成合适长度的小段，置于2％(w/v)的NaHCO3和1mMEDTANa2中煮沸10min进行前处理，后使用超纯水洗净。分别吸取0.7mL Lipos/MnAs、LNPs/MnAs、Mel-LNPs/MnAs，加入处理好的透析袋中。释放介质分别为磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.4)，柠檬酸盐缓冲液(0.1M，pH5.4)，漏槽条件。温度37±0.5℃，转速150rpm。分别在0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24h时取0.35mL溶液，并立即补充0.35mL新鲜的相应释放介质。样品加入2％硝酸溶液稀释至5mL，放置过夜，经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液以ICP-MS测定其中As的含量，计算累积释药率(Accumulative Realease)，并绘制释药曲线。结果如图3所示。由图可知，Lipos/MnAs、LNPs/MnAs及Mel-LNPs在pH7.4条件下释放较为缓慢，其中Mel-LNPs/MnAs在24h时累计释药率为(33.04±5.69)％。当pH值为5.4时，Mel-LNPs/MnAs释放速率明显加快，且24h时累计释药率为(82.03±5.88)％，接近释放完全。说明Mel-LNPs/MnAs具有pH响应性释放的特性，为MnAs共沉淀在酸性pH条件下响应性解离。
1.4Mel-LNPs/MnAs的体外MRI成像能力考察
将Mel-LNPs/MnAs稀释为Mn2+浓度含量分别为0.4、0.2、0.1、0.05mM，加入适量的柠檬酸盐缓冲液，于(37±0.5)℃孵育4h。对未孵育及37℃孵育4h的Mel-LNPs/MnAs进行体外MRI成像能力测试。结果如图4所示。由图可知，Mel-LNPs/MnAs的体外MRI成像能力呈现浓度依赖性，Mn2+浓度越高，T1成像效果越好(图像越亮)。酸性条件下，时间越长，Mn2+解离越多，浓度越高，T1成像效果越好(图像越亮)。
1.5Mel-LNPs/MnAs体外溶血性考察
Mel和α-Mel溶液以超纯水溶解，配制最大浓度为50μM的溶液。将制备好的Mel-LNPs/MnAs以PBS缓冲液稀释，使最大浓度中α-Mel浓度为50μM。三组样品溶液倍比稀释7个浓度，即为50μM、25μM、12.5μM、7.5μM、3.75μM、1.875μM、0.9375μM、0.46875μM。
取新鲜小鼠血液，5000rpm离心6min除去血浆，生理盐水轻摇重悬下层血细胞。重复操作，直至上层液体不显红色。将血细胞稀释为2％浓度后加入至含药的EP管中，37℃孵育3h。5000rpm/min离心6min。取上清，加入至96孔板中。540nm检测吸光度。
Figure GDA0003835531560000111
As为实验孔吸光度值平均值，Ac为Triton孔吸光度平均值，Ab为生理盐水孔吸光度值。
实验结果如图5所示。由图可知，构建Mel-LNPs后，α-Mel被深埋于磷脂层中，屏蔽了其正电荷，降低了其溶血性，证明了其溶血安全性。
1.6Mel-LNPs/MnAs的放置稳定性考察
以优选出的工艺制备Mel-LNPs，放置在4℃避光保存，在制备完成后每天进行粒径、PDI及Zeta电位，考察其放置稳定性。结果如图6所示。实验结果证明Mel-LNPs/MnAs在4℃避光条件下保存，在5天内稳定性较好。
1.7Mel-LNPs/MnAs的靶向性考察
1.7.1MTT法考察Mel-LNPs/MnAs的体外细胞毒性
取对数生长期的GL261细胞，完全培养基重悬(5×103个/孔)接种于96孔板中，每孔100μL。置于37℃，5％CO2的恒温孵育箱中培养过夜。待细胞贴壁后，吸除培养基，空白孔加入无血清培养基100μL，给药孔加入不同浓度的ATO、ATO+α-Mel、Lipos/MnAs、LNPs/MnAs及Mel-LNPs/MnAs。培养24h，吸除培养基，加入MTT(5mg/mL，PBS溶解)10μL，37℃，5％CO2孵育4h。吸除每孔溶液，加入DMSO 100μL，37℃恒温摇床中振荡5min，酶标仪490nm下测定吸光度(A)，计算细胞存活率。
细胞存活率(cell viability)＝(A给药-A空白)/(A对照-A空白)，并计算半数抑制浓度(IC50)值。
结果如图7所示。不同浓度的游离ATO、游离ATO+α-Mel、Lipos/MnAs、LNPs/MnAs及Mel-LNPs/MnAs对GL261细胞的增殖均有一定的抑制作用，且随浓度的增加，抑制作用明显增加。Mel-LNPs/MnAs对胶质瘤细胞GL261细胞的抑制作用优于游离ATO。游离ATO处理GL261的IC50值为4.74μmol/L，制备为Mel-LNPs/MnAs后，IC50值下降为2.99μmol/L。说明制备为Mel-LNPs/MnAs后，IC50值更低，具有更强的抑制胶质瘤细胞活力的能力。
1.7.2Annexin V-FITC考察Mel-LNPs/MnAs的细胞凋亡
采用Annexin V-FITC/PI双染试剂标记，流式细胞仪进行检测。取对数生长期的GL261细胞，完全培养基重悬(3×105个/孔)，接种于12孔板，37℃，5％CO2培养12h后，吸除培养基，加入以无血清培养基配制稀释的游离ATO溶液、Lipos/MnAs、LNPs/MnAs及Mel-LNPs/MnAs(As3+浓度为6.25μmol/L)的含药培养基，不加药物处理的细胞作为空白对照。37℃，5％CO2培养12h后，PBS缓冲液洗涤细胞一次，以不含EDTA的0.25％胰酶进行消化，离心弃去上清液，加入结合缓冲液0.5mL重悬细胞，300目尼龙筛网过滤除去细胞团块，加入5μLAnnexin V-FITC染液和5μL PI染液轻轻混合均匀，室温避光孵育10min，置于流式管中，流式细胞仪进行凋亡检测，Kaluza软件进行结果分析。
结果如图8所示。空白对照组在不给药的情况下，几乎没有凋亡细胞。细胞给予不同药物处理后，细胞凋亡率上升。其中Mel-LNPs/MnAs处理后细胞凋亡率体现出最强的诱导细胞凋亡的结果，细胞凋亡率为(40.21±7.59)％，显著高于游离ATO处理后的细胞凋亡率(14.87±3.15)％(p＜0.05)，可能原因是Mel-LNPs增加了GL261细胞对As的摄取；此外Mel-LNPs/MnAs较LNPs/MnAs也有更高的细胞凋亡率，可能是α-Mel的穿膜作用发挥了一定的细胞凋亡作用。
1.8Mel-LNPs/MnAs的细胞摄取考察
称取适量C6以三氯甲烷溶解，配制为1mg/mL的母液。称取DMPC 1.5mg，以三氯甲烷溶解，吸取C6溶液10μL至DMPC三氯甲烷溶液中涡旋混匀，按“实施例二”项下方法制备Lipos/C6、LNPs/C6及Mel-LNPs/C6。取对数生长期的GL261细胞以完全培养基重悬(3×105个/mL)，接种于12孔板中，每孔1mL，置于37℃，5％CO2孵育过夜。待细胞贴壁后，吸除培养基，给药孔分别加入Lipos/C6、LNPs/C6和Mel-LNPs/C6(C6浓度为1μg/mL)1mL，空白对照孔加入无血清培养基1mL，37℃培养12h。将细胞以0.25％胰蛋白酶消化，PBS缓冲液重悬为细胞悬液，放置于流式管中，流式细胞仪进行细胞摄取荧光检测(C6：λEx/λEm＝466nm/504nm)，Kaluza软件进行细胞摄取的结果分析。
结果如图9所示，GL261细胞与Lipos/C6、LNPs/C6及Mel-LNPs/C6共孵育12h后，细胞内均有较强的荧光响应，与不给药的空白组相比，具有极显著性差异(***p＜0.001)，说明3种制剂均能被GL261细胞摄取。Mel-LNPs/C6与Lipos/C6和LNPs/C6相比，具有更强的被GL261细胞摄取能力(***p＜0.001)。原因在于该制剂所选用的蜂毒肽具有细胞膜穿透作用，提高了细胞对于药物的摄取量。

Claims (6)

1.一种生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒，其特征在于，所述仿生型多功能脂蛋白纳米粒是由生物肽修饰的脂蛋白仿生纳米载体外壳和纳米形式的药物内核组成，所述载体外壳由载脂蛋白仿生肽、生物肽与天然磷脂替代物共同构成；所述纳米形式的药物内核为1，2-油酰基磷脂酸钠盐疏水性修饰后的MnAs共沉淀；所述载脂蛋白仿生肽选自载脂蛋白ApoA-I仿生肽、ApoE仿生肽D-4F、R-4F、L-4F、COG133中的一种或几种；所述生物肽为Mel；所述天然磷脂替代物选自DPPC、DMPC、DOPE、DOPC、SM中的一种或几种。
2.权利要求1所述的生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备纳米形式的药物内核；
(2)分别制备含有载脂蛋白仿生肽的磷酸盐缓冲溶液A和含有生物肽的磷酸盐缓冲溶液B；
(3)将天然磷脂替代物和步骤(1)所得药物内核混合，滴加入上述溶液A中，乳化，然后再将溶液B滴加进去，乳化，结束后，超声破碎，旋蒸除去有机溶剂；
或者，将天然磷脂替代物和步骤(1)所得药物内核混合，除去有机溶剂，然后加入上述溶液A和溶液B，水合至形成混悬液，超声；
(4)过滤，超滤除去游离药物，即得。
3.根据权利要求2所述的生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，当固体质量为mg时，液体质量以mL计，所述药物内核中的药物1份，天然磷脂替代物2～4份，载脂蛋白仿生肽1～2份，生物肽1～2份。
4.根据权利要求2所述的生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述滴加入上述溶液A中，乳化100-140min；所述再将溶液B滴加进去，乳化100-140min。
5.权利要求1所述的生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒在制备肿瘤诊断试剂中的应用。
6.权利要求1所述的生物肽修饰的仿生型多功能脂蛋白纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
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