CN103655477A - 一种恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂及其制备方法和用途 - Google Patents
一种恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂及其制备方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂及其制备方法和用途。所述恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂含有恩替卡韦（Entecavir），磷脂，胆固醇，和载脂蛋白A1（ApoA1）；恩替卡韦、磷脂、胆固醇和载脂蛋白A1的重量比为5∶7∶3∶5-20。
Description
技术领域
本发明涉及药物脂质体领域，尤其涉及一种恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂及其制备方法和用途。
背景技术
目前,已有12种以上的纳米材料载药系统(nanoparticle drug deliverysystem)获得FDA的临床批文而上市,所有这些已上市的纳米材料载药系统都不具备器官靶向性(organ-specific targeting)。
世界上共有7种已上市(FDA)的抗乙肝药物,两种是干扰素和PEG化的干扰素,另外5种是核苷酸的类似物,其中PEG化的干扰素,tenofovir,恩替卡韦（entecavir）这三种药将在未来占主导作用。entecavir在中国的抗乙肝药物场销售额每年递增,2008年我国恩替卡韦(entecavir)销售行业年销售额达到了8.56亿元，同比增加了19.1%,2009年1-11月,我国恩替卡韦行业销售额达到了11.24亿元，同比增长了31.3%,2010年，研制抗乙肝药物entecavir的美国制药公司百时美施贵宝公布了恩替卡韦的年全球销售额,为9.31亿美元,2011年,恩替卡韦的年全球销售额为12亿美元,由此可见,抗乙肝药物市场发展潜力大,远未饱和。
然而现在已上市的口服抗乙肝药物entecavir在人体中60%-70%经肾脏排除,造成了entecavir肾毒性的药物副作用,小于1%的entecavir由感染乙肝病毒的器官肝脏吸收,因此,99%左右的entecavir到了不该去的人体器官。
因此，本领域迫切需要提供一种可有效达至肝靶向部位的抗乙肝药物entecavir。
发明内容
本发明旨在提供一种恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂。
本发明的另一个目的是提供所述恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂的制备方法。
本发明的再一个目的是提供所述恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂，所述恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂含有恩替卡韦（Entecavir），磷脂，胆固醇，和载脂蛋白A1（ApoA1）；
恩替卡韦、磷脂、胆固醇和载脂蛋白A1的重量比为5∶7∶3∶5-20。
在另一优选例中，所述恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂的粒径为30-50nm；优选30-40nm。
在另一优选例中，恩替卡韦、磷脂、胆固醇和载脂蛋白A1的重量比为5∶7∶3∶8-10。
在另一优选例中，所述的磷脂是氢化大豆磷脂。
在另一优选例中，所述恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂的包封率为85－99％；优选90－99％。
在本发明的第二方面，提供了一种如上所述的本发明提供的恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂的制备方法，所述方法包括步骤：
（1）将胆固醇、磷脂和缓冲液1混合，通过超临界流体反应釜得到装载缓冲液1的高密度脂蛋白颗粒前体；
（2）将装载缓冲液1的高密度脂蛋白颗粒前体和载脂蛋白A1混合，超声处理使高密度脂蛋白颗粒粒径为30-50nm；
（3）步骤（2）得到的高密度脂蛋白颗粒过分子筛，用缓冲液2洗脱得到溶液，其中磷脂的内相是缓冲液1，外相是缓冲液2；和
（4）将恩替卡韦和步骤（3）得到的溶液混合，在50-60℃孵育得到如上所述的本发明提供的恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂。
在另一优选例中，所述的缓冲液1是铵盐缓冲液，所述的缓冲液2是磷酸缓冲液，缓冲液2的pH值高于缓冲液1的pH值,差值大于等于3。
在另一优选例中，步骤（1）中超临界流体反应釜压力为200-240bar；优选200-220bar。
在另一优选例中，步骤（1）中，以混合物的总体积计，其中磷脂浓度为0.28g/ml-0.35g/ml；优选0.30g/ml-0.32g/ml。
在本发明的第三方面，提供了一种如上所述的本发明提供的恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂的用途，用于制备治疗乙肝的药物。
据此，本发明提供了一种可有效达至肝靶向部位的抗乙肝药物entecavir的制剂。
附图说明
图1显示了本发明得到的恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂中恩替卡韦在纳米材料载药系统中形成的独特的复合物结晶。
图2显示了制备实施例1和2分别得到的恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂和包封于脂质体中的恩替卡韦的体外释放情况；其中，
曲线A是恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂的释放曲线，
曲线B是包封于脂质体中的恩替卡韦的释放曲线。
图3显示了游离的荧光标记药物恩替卡韦口服(1小时)后在小鼠的各种器官的分布情况。
图4显示了本发明得到的恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂中荧光标记药物恩替卡韦静脉注射(1小时)后在小鼠的各种器官的分布情况。
图5显示了注射制备实施例1得到的恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂和口服游离恩替卡韦的抑制乙肝病毒DNA复制曲线；其中，
曲线A是注射恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂(0.005mg/kg)的抑制乙肝病毒DNA复制曲线，
曲线B是口服游离的恩替卡韦(0.05mg/kg)的抑制乙肝病毒DNA复制曲线。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，使用高密度脂蛋白（HDL）包封恩替卡韦获得一种纳米级恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂，包封工艺中将超临界流体技术、利用pH梯度差的主动载药方式和超声处理有机结合，获得的恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂包封率高，并且大幅度提高了恩替卡韦的安全性和有效性。
如本文所用，“恩替卡韦”的结构如式Ⅰ所示：
如本文所用，“氢化大豆磷脂”(英文名称Hydro SoyPC，L-α-phosphatidylcholine，hydrogenated(Soy))分子式：C44H88NO8P，分子量：783.774，CAS编号Cas Numher 97281-48-6，结构如式II所示，可以使用本领域常规的方法制备得到，例如但不限于，提取纯化氢化反应；也可以通过商业渠道获得，例如但不限于，Lipoid公司等。
II
如本文所用，“胆固醇”(英文名称cholesterol)又称5-胆烯-3-β-醇，在类固醇核的C-3上连接一羟基，而在C-17位上接有一条八碳或更多碳原子的脂族侧链，可由乙酰辅酶A通过异戊二烯单位的缩合反应而合成。分子式为C27H46O，CAS：57-88-5，结构如式III所示：
如本文所用，“载脂蛋白A1”是一由243个氨基酸组成的蛋白质，结构上可分为10个α螺旋，可以使用本领域常规的方法制备得到，例如但不限于，通过基因工程在大肠杆菌中表达；也可以通过商业渠道获得，例如但不限于，TheMedicines公司等。
如本文所用，“磷脂(phospholipid，PL)”是指具有由磷酸相连的取代基团(含氨碱或醇类)构成的亲水头(hydrophilic head)和由脂肪酸链构成的疏水尾(hydrophobic tail)的物质。可以含有一种或一种以上所述结构的物质。优选磷脂酰胆碱（Phosphatidylcholine）。
恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂
本发明提供的恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂中含有的恩替卡韦、氢化大豆磷脂、胆固醇和载脂蛋白A1的重量比为5∶7∶3∶5-20，优选5∶7∶3∶5-12，更优选5∶7∶3∶8-10；其粒径为30-50nm，优选30-40nm。
本发明提供的恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂的包封率为85－99％；较佳地，为90－99％。
如本文所用，“包封率（encapsulation rate;entrapment efficiency）”是指载药系统能包裹活性物质（或称药物）的程度，载药系统是药物载体,包封于其中的药量与载药系统（或称系统）中总药量之百分比称为包封率。可以通过本领域熟知的方法进行测定，例如但不限于，凝胶柱层析、离心超滤法、和透析法等,通过分离和测定未包封药物的量，并测定载药系统中总药量,通过如下公式计算包封率。
制备方法
本发明提供恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
第一步，通过超临界流体技术获得装载内相缓冲液的高密度脂蛋白颗粒前体：将胆固醇、氢化大豆磷脂和铵盐缓冲液混合，通过超临界流体反应釜得到装载内相缓冲液的高密度脂蛋白颗粒前体；
第二步，使高密度脂蛋白颗粒前体粒径至纳米级：将装载内相缓冲液的高密度脂蛋白颗粒前体和载脂蛋白A1混合，超声处理使高密度脂蛋白颗粒粒径为30-50nm，优选30-40nm；
第三步，通过分子筛置换外相缓冲液为磷酸盐缓冲液，其内外相缓冲液pH梯度≥3：将第二步得到粒径小于50nm的高密度脂蛋白颗粒过分子筛得到溶液,其中脂质体的内相是铵盐缓冲液，外相是磷酸盐缓冲液，外相缓冲液pH值比内相缓冲液pH值高3或3以上；
第四步，将恩替卡韦和第三步得到的溶液混合，在50-60℃孵育得到本发明提供的恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂。
第一步得到一种溶液，其中含有铵盐、胆固醇和磷脂，磷脂的内外相都是铵盐缓冲液，所述的铵盐缓冲液pH 5.0，优选EDTA铵盐，例如0.3M(NH4)2EDTA。0.3M的铵盐存在于通过超临界流体反应釜得到的高密度脂蛋白颗粒前体的内外相中,既是指加入其中的铵盐，又是最后形成的溶液中铵盐的浓度,包封特定的0.3M(NH4)2EDTA缓冲液在高密度脂蛋白颗粒前体的内相(高密度脂蛋白颗粒前体的外相的0.3M(NH4)2EDTA缓冲液随后将被置换成pH值更高的缓冲液)的目的是为随后的氢离子梯度主动装载方法做准备。
如本文所用，“EDTA”是指乙二胺四乙酸。
如本文所用，“脂质体”或“高密度脂蛋白颗粒前体”是指其中没有加ApoAI的,也就是指通常的没有器官靶向性的脂质体，其粒径一般大于100纳米。
如本文所用，“高密度脂蛋白颗粒”是指加入了ApoA I蛋白或多肽的其粒径一般小于50纳米的纳米颗粒。
第一步中所述超临界流体反应釜压力为200-240bar，优选200-220bar；以混合物的总体积计，其中氢化大豆磷脂浓度为0.28g/ml-0.35g/ml；优选0.30g/ml-0.32g/ml。
第二步中所述超声处理（60－100KHZ，0.07－0.14W/cm2）5－15分钟。
第三步中是将第二步超声处理得到的高密度脂蛋白颗粒
过分子筛，用磷酸盐缓冲液洗脱,洗脱得到一种溶液，其溶质是高密度脂蛋白颗粒，溶剂是PBS缓冲液,其中高密度脂蛋白颗粒的内相含铵盐缓冲液，外相是磷酸盐缓冲液外相缓冲液pH值比内相缓冲液pH值差别(pH梯度)大于等于3，例如内相缓冲液为pH=5.0的0.3M(NH4)2EDTA缓冲液,外相缓冲液为pH=8.5的PBS缓冲液。
所述分子筛可以装填在柱中，所述分子筛填料为Sephadex G-50beads材料，颗粒粒径为50-150μm；所述分子筛或分子筛柱用pH=8.5的磷酸盐缓冲液进行洗脱，得到的溶液中所含磷脂的内外相缓冲液pH梯度≥3。
第四步是利用磷脂内外相缓冲液的pH梯度进行的主动载药过程。
上述制备方法中恩替卡韦，氢化大豆磷脂，胆固醇，和载脂蛋白A1（ApoA1）的用量（重量）之比为5∶7∶3∶5-20，优选5∶7∶3∶5-12，更优选5∶7∶3∶8-10。
用途
本发明提供的恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂可用于治疗乙肝，可以将有效量的本发明提供的恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂和药学上可接受的载体混合得到药物组合物。
如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。
如本文所用，术语“基本上由……构成”指在组合物中，除了含有必要成分或必要组份之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或杂质。例如，可以含有抗氧化剂以防止氧化，以及其他本领域常用的添加剂。
如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。
本发明优选的药物组合物是注射剂。使用药物组合物时，是将安全有效量的恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约5mg/kg，而且在大多数情况下不超过约0.5mg/kg，较佳地该剂量是约?0.001mg/kg-0.01mg/kg。当然，具体剂量还应考虑病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
1、本发明提供的制剂使抗乙肝药物恩替卡韦用药剂量可能几十倍地减少,大部分抗乙肝药物恩替卡韦不经肾脏排除,减少肾毒性，提高抗乙肝药物的安全性。
2、本发明提供的制剂使30%-60%的药物在肝脏中富集,可能几十倍地提高抗乙肝药物恩替卡韦的有效性。
3、本发明提供的制剂扩大抗乙肝药物entecavir的患者适用范围，例如可能适用于肾病与肾功能弱的患者。
4、由于我国乙肝患者众多，本发明提供的制剂可以预期的市场利润将非常可观。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
下述实例中，恩替卡韦购自宏慈药业公司，胆固醇购自NOF公司，氢化大豆磷脂购自Lipoid公司，ApoA1蛋白购自PeproTech公司,或ApoA1多肽源于人工多肽固相合成；多肽固相合成是一非常成熟的人工合成多肽的方法,目前全球有几十家公司可提供多肽固相合成的商业服务,如中国的杭州中肽公司.
关于人工合成需提供方法，恐怕对贵方的其它专利不利，请关注。谢谢！
下述实例中，包封率的测定方法为：通过分光光度计测定254nm的特异的恩替卡韦的紫外吸光值而得知包封于HDL纳米颗粒中的恩替卡韦,用包封于HD纳米颗粒中的恩替卡韦的量除以总的恩替卡韦的加入量,即为恩替卡韦的包封率。
下述实例中，室温是25℃。
制备实施例1
制备恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂1
1.利用超临界流体技术(投入反应原料为50克0.3M(NH4)2EDTA(pH=5.0)缓冲液,5.5克氢化大豆磷脂HSPC和2.4克胆固醇,反应釜温度为60°C,反应釜压力为200bar)制备装载0.3M(NH4)2EDTA缓冲液的高密度脂蛋白颗粒前体,反应平衡40分钟；
2.将制备的高密度脂蛋白颗粒前体通过加入9.5克ApoAI多肽和超声处理(80KHZ,0.07-0.14W/cm2,10分钟),缩小高密度脂蛋白颗粒前体粒径至约30-50nm(纳米),得到高密度脂蛋白颗粒，过G-50分子筛柱置换高密度脂蛋白颗粒外相缓冲液为pH=8.5的磷酸盐缓冲液(PBS),置换外相缓冲液后,高密度展开部颗粒的内相缓冲液为0.3M(NH4)2EDTA(pH=5.0)缓冲液,外相缓冲液为pH=8.5的磷酸盐缓冲液,内外氢离子浓度梯度(pH梯度)差别大于3,有利于下一步的抗乙肝药物恩替卡韦主动装载入纳米材料载药系统(HDL)中；
3.在50-60°C之间将4克抗乙肝药物恩替卡韦加入到第2步制备得到的高密度脂蛋白颗粒外相pH=8.5的磷酸盐缓冲液中,50-60°C之间温育1小时,抗乙肝药物恩替卡韦因脂质体前体的内外氢离子浓度梯度差而主动装载入纳米材料载药系统(HDL)中,未被包封的恩替卡韦可透析收集,通过紫外分光光度计测定恩替卡韦在254nm的特异吸收峰而测定它的包封率。
包封率为90-97%（将制备的装载有抗乙肝药物恩替卡韦的HDL纳米颗粒放在乙醇(终体积浓度为80%)中裂解,HDL纳米颗粒解聚,显微镜下可拍摄恩替卡韦复合物的结晶图象(图1)）。
制备实施例2
制备包封于脂质体中的恩替卡韦
制备包封于脂质体中的恩替卡韦,除了没有加ApoA I蛋白外,与制备包封于高密度脂蛋白中的恩替卡韦的过程相同。
试验实施例1
恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂的体外释放特征
包封于高密度脂蛋白中的恩替卡韦（制备实施例1所得）,和包封于脂质体中的恩替卡韦（制备实施例2所得）分别在体外(4°C,10%FBS胎牛血清)中放置0天,10天,20天,30天,而后测量释放于包封材料纳米系统(高密度脂蛋白或脂质体)之外的恩替卡韦,结果见图2。
结果表明，恩替卡韦在不同的包封材料纳米系统(高密度脂蛋白或脂质体)的释放曲线而看,包封于高密度脂蛋白中的恩替卡韦在体外(10%FBS)比包封于脂质体中的恩替卡韦更稳定(更不易泄漏)。
试验说明的是包封于高密度脂蛋白中的恩替卡韦相对于包封于脂质体中的恩替卡韦的在体外密封性上的优越性,Apo A Ⅰ是高密度脂蛋白区别于脂质体的关键因素.如果没有本发明独特的将超临界流体技术(适用于工业化制备脂质体),主动装载方法,超声处理三者有机地整合在一起的工艺方法,不可能将疏水性弱,有一定亲水性(XlogP=-0.8)的恩替卡韦通过主动装载方法高效率(包封率>90%)地包封于高密度脂蛋白纳米载药系统中。因而,本发明提供的独特的包封恩替卡韦药物于HDL纳米载药系统中的方法(而不是采用普遍采用的薄膜法)是实现高效率包封恩替卡韦药物于HDL纳米载药系统中及其将来医药工业化大规模应用的关键。本发明提供了将超临界流体技术(适用于工业化制备脂质体),主动装载方法,超声处理三者有机地整合在一起的可主动地(而不是被动地)包封疏水性弱,有一定亲水性的化合物(例如,恩替卡韦)于HDL纳米载药系统中的适用于大规模工业化制备HDL纳米颗粒的独一无二的工艺方法。
试验实施例2
恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂的体内器官分布特征
将根据制备实施例1的方法得到的包封有Alexa
488Dye荧光标记药物恩替卡韦的高密度脂蛋白HDL纳米颗粒（恩替卡韦、磷脂、胆固醇和载脂蛋白A1的重量比为5∶7∶3∶20）通过小鼠(Taconic公司的C57BL小鼠)尾静脉注射,或通过口服游离的荧光标记药物恩替卡韦,1小时后,解剖小鼠,获得各种器官,制备各种器官组织切片,观察检测切片的荧光强度,从而得知荧光标记药物恩替卡韦在小鼠各种器官组织的体内分布。
结果见图3和图4。
结果表明，口服游离的荧光标记药物恩替卡韦主要经过小鼠的器官–肾脏而代谢；
高密度脂蛋白HDL纳米材料载药系统将荧光标记药物恩替卡韦主要运载到小鼠的特定器官-肝脏。
试验实施例3
恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂的抗乙肝病毒效果
乙肝病毒HBV鸭动物模型来源于农场出售的北京鸭(Pekin duckings),如Metzer农场,常约20-30%的北京鸭天然含有乙肝病毒(DHBV),它们可以作为乙肝病毒HBV鸭动物模型,也可以用鸭乙肝病毒(DHBV)感染的鸭可以作为乙肝病毒HBV鸭动物模型。
将制备实施例1的方法得到的包封有药物恩替卡韦的高密度脂蛋白HDL纳米颗粒（恩替卡韦、磷脂、胆固醇和载脂蛋白A1的重量比为5∶7∶3∶5）通过北京鸭颈静脉注射,或通过口服游离的恩替卡韦,每隔5-6天通过PCR反应测定鸭血清中的乙肝病毒DNA水平,从而得知药物抑制乙肝病毒DNA复制的效率。
结果见图5。
结果表明，在乙肝病毒HBV鸭动物模型上,恩替卡韦可将鸭动物模型血清中的乙肝病毒DNA水平降低至原有水平的1/100-1/1000,发明人在乙肝病毒HBV鸭动物模型上的小试表明,注射1/10量(0.005mg/kg)的包封于高密度脂蛋白中的恩替卡韦比口服(0.05mg/kg)的游离的恩替卡韦在降低鸭血清中的乙肝病毒DNA水平上至少提高了10倍。
恩替卡韦、磷脂、胆固醇和载脂蛋白A1的重量比为5∶7∶3∶5-20,载脂蛋白A1与恩替卡韦、磷脂、胆固醇的重量比介于5-20之间,如果载脂蛋白A1与恩替卡韦、磷脂、胆固醇的重量比小于5,那么制备的高密度脂蛋白包封制剂的粒径接近脂质体的粒径(一般大于100纳米),因为缺乏载脂蛋白A1,实际上制备的纳米颗粒更类似于脂质体(一般大于100纳米),而不是高密度脂蛋白纳米颗粒(一般小于50纳米),脂质体包封的恩替卡韦(制备实施例2)比较容易泄漏,放置保存时也比较容易聚集沉淀,不稳定,如试验实施例1中的释放曲线B(包封于脂质体中的恩替卡韦的释放曲线)；如果载脂蛋白A1与恩替卡韦、磷脂、胆固醇的重量比大于20,投入的载脂蛋白A1已超过饱和状态,没有必要加入过量的载脂蛋白A1,(载脂蛋白A1与恩替卡韦、磷脂、胆固醇的重量比小于20就可形成高密度脂蛋白纳米颗粒),载脂蛋白A1的来源有限,价值很高。制备实施例1是根据恩替卡韦、磷脂、胆固醇和载脂蛋白A1的重量比为5∶7∶3∶5-20制备的恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂,试验实施例2中的图4显示了根据恩替卡韦、磷脂、胆固醇和载脂蛋白A1的重量比为5∶7∶3∶20制备的恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂中荧光标记药物恩替卡韦静脉注射(1小时)后在小鼠的各种器官的分布情况,试验实施例3中的图5显示了根据恩替卡韦、磷脂、胆固醇和载脂蛋白A1的重量比为5∶7∶3∶5制备的恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂抑制乙肝病毒DNA复制的效率远高于口服的游离的恩替卡韦。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
Claims (10)
1.一种恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂，其特征在于，所述恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂含有恩替卡韦（Entecavir），磷脂，胆固醇，和载脂蛋白A1（ApoA1）；
恩替卡韦、磷脂、胆固醇和载脂蛋白A1的重量比为5∶7∶3∶5-20。
2.如权利要求1所述的恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂，其特征在于，所述恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂的粒径为30-50nm；优选30-40nm。
3.如权利要求1所述的恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂，其特征在于，恩替卡韦、磷脂、胆固醇和载脂蛋白A1的重量比为5∶7∶3∶8-10。
4.如权利要求1-3任一所述的恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂，其特征在于，所述的磷脂是氢化大豆磷脂。
5.如权利要求1所述的恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂，其特征在于，所述恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂的包封率为85－99％；优选90－99％。
6.一种如权利要求1-5任一所述的恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
（1）将胆固醇、磷脂和缓冲液1混合，通过超临界流体反应釜得到装载缓冲液1的高密度脂蛋白颗粒前体；
（2）将装载缓冲液1的高密度脂蛋白颗粒前体和载脂蛋白A1混合，超声处理使高密度脂蛋白颗粒粒径为30-50nm；
（3）步骤（2）得到的高密度脂蛋白颗粒过分子筛，用缓冲液2洗脱得到溶液，其中磷脂的内相是缓冲液1，外相是缓冲液2；
（4）将恩替卡韦和步骤（3）得到的溶液混合，在50-60℃孵育得到如权利要求1-5任一所述的恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的缓冲液1是铵盐缓冲液，所述的缓冲液2是磷酸缓冲液，缓冲液2的pH值高于缓冲液1的pH值,差值大于等于3。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中超临界流体反应釜压力为200-240bar；优选200-220bar。
9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，以混合物的总体积计，其中磷脂浓度为0.28g/ml-0.35g/ml；优选0.30g/ml-0.32g/ml。
10.一种如权利要求1-7任一所述的恩替卡韦高密度脂蛋白包封制剂的用途，其特征在于，用于制备治疗乙肝的药物。
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| CN103908431A (zh) * | 2014-04-26 | 2014-07-09 | 山东世博金都药业有限公司 | 一种恩替卡韦纳米复合制剂及其制备方法 |
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