CN102846551A

CN102846551A - 一种肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN102846551A
Application number: CN2012102041666A
Authority: CN
Inventors: 冯美卿; 袁媛; 王维娜; 叶丽; 周佩
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2011-06-28
Filing date: 2012-06-19
Publication date: 2013-01-02

Abstract

本发明属生物药物制剂领域，涉及高密度脂蛋白类似物纳米粒，具体涉及一种肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒及其制备方法。本发明以重组人源载脂蛋白为靶向载体，与被载药物按1～10∶10∶1～5质量比制成肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒，制得的类似物纳米粒，具有肝靶向性，与现有技术比较，其药物复合物包封率为80.5%，载药率为2.8%，其药物释放明显低于游离药物和无载脂蛋白的药物卵磷脂复合物，本发明的类似物纳米粒可进一步制备肝靶向治疗药物。该纳米粒可提高药物在肝组织的浓度，降低药物对其他组织的损伤，延长药物半衰期，降低用药量或延长给药间隔。较好的克服了HDL来源困难及血液污染问题。

Description

一种肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物药物制剂领域,涉及高密度脂蛋白类似物纳米粒，具体涉及一种肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒及其制备方法和用途。

背景技术:

靶向给药是目前药剂学领域的研究热点之一，但多年来转化为产品的研究成果极为少见，其中关键问题之一就是遭遇的药物载体材料的研究瓶颈。因此研究开发新型给药系统载体材料显得尤为重要，其中，脂蛋白由于自身的结构及生理特性成为目前载体材料的研究热点。

现有技术公开了脂蛋白是内源性物质，可彻底生物降解，不引起免疫反应，也不被网状内皮系统快速清除，因此其作为药物载体有诸多优势：1）内源性主动靶向，通过受体介导被细胞吸收与内吞；2)是天然成分并具有相对较长的半衰期；3)颗粒体积小，直径在纳米级范围，易从血管内扩散到血管外；4)大容量脂核可作为疏水性药物储存的场所，避免所在药物与血浆中成分相互作用而分解破坏。其中由于高密度脂蛋白（high-density lipoprotein HDL）的特殊功能，有望成为新型靶向载体材料。

高密度脂蛋白作为肝靶向载体，高密度脂蛋白（high-density lipoprotein HDL）是血浆中的重要脂蛋白，其生理作用是摄取肝外细胞多余胆固醇并转变成胆固醇酯（CE）贮存于脂核，通过血液运送到肝脏，这个过程称为“胆固醇逆向转运”。该途径是通过肝细胞膜上的特异性受体完成的，Krieger等发现的B族I型清道夫受体（scavenger receptorclass B type I,SR-BI）是目前已阐明一级结构的脂蛋白受体中唯一能真正介导细胞与HDL的受体。HDL颗粒通过肝受体途径内吞入肝细胞内，载脂蛋白与核心胆固醇酯分离，胆固醇酯被肝细胞选择性摄取留在胞内，载脂蛋白通过逆向胞饮分泌到胞外。可见HDL胆固醇（酯）吸收的途径是非溶酶体途径，这样可防止被包裹的药物受到溶酶体酶破坏。有关研究表明，HDL组成成分为载脂蛋白AI(apoA-I,约占70％），且HDL“胆固醇逆向转运”功能主要是载脂蛋白与肝细胞膜上受体作用，使肝细胞选择性摄取HDL中胆固醇酯来完成的，对HDL特异性受体SR-BI进一步研究表明：SR-BI与HDL2,HDL3,apoA/phospholiod圆盘状颗粒和无脂载脂蛋白有相同结合力，说明SR-BI是和载脂蛋白结合而不是与HDL中的脂质结合，那么理论上说载脂蛋白可作为肝靶向载体材料。以载脂蛋白作为载体，除了具有脂蛋白作为载体的优势外，还具备其独特的优势：载脂蛋白受体主要存在于肝细胞膜上，主动靶向性更明确；载脂蛋白本身为血液中成分，生物相容性好；载药系统被内吞至肝细胞内而不是经溶酶体途径，避免了药物被溶酶体破坏；在肝细胞内载脂蛋白与药物分离，药物被肝细胞选择性摄取留在胞内，载脂蛋白通过逆向胞饮分泌到胞外，参与胆固醇代谢，降低心血管疾病风险。因此载脂蛋白作为肝靶向载体将对肝脏疾病的靶向治疗提供有力武器。

但目前从人血浆中获得HDL还存在以下主要问题：1）血浆来源困难及血液污染问题；2）超速离心分离HDL成本高。以载脂蛋白作为载体，其来源同样面临HDL来源及血缘污染问题的困扰。

发明内容

本发明的目的是提供一种高密度脂蛋白类似物纳米粒，尤其涉及一种肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒及其制备方法和用途。本发明的高密度脂蛋白类似物纳米粒能提高药物在肝组织的浓度，降低药物对其他组织的损伤，延长药物半衰期，降低用药量或延长给药间隔。

本发明采用基因工程技术利用毕赤酵母表达的重组人源载脂蛋白作为靶向载体，模拟体内HDL组成及形成过程，与药物、卵磷脂利用硫酸铵梯度法制备成高密度脂蛋白（HDL）类似物纳米粒。所述的纳米粒是以人源载脂蛋白为靶向载体的肝靶向纳米粒。

本发明进一步将毕赤酵母表达的人源载脂蛋白分离纯化后，与抗肿瘤药物/抗乙肝药物、卵磷脂制备成类似HDL的复合物。

具体而言，本发明的肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒，其特征在于，由重组人源载脂蛋白与卵磷脂、药物按1~10：10：1~5质量比组成肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒，其中，所述的重组人源载脂蛋白为靶向载体，纳米粒中不含胆固醇。

所述的高密度脂蛋白类似物纳米粒粒径为20-150nm。

本发明中，所述的重组人源载脂蛋白包括apoAI、apoAII及apoE（选自本领域技术人员知悉的重组人源载脂蛋白）；

所述的药物为水溶性、脂溶性且具有抗肝癌、肝炎、肝纤维化的药物。

本发明的高密度脂蛋白（HDL）类似物纳米粒复合物可加入保护剂，冷冻干燥制成干粉制剂。本发明的高密度脂蛋白（HDL）类似物纳米粒复合物可进一步制备肝靶向治疗药物。

所述的冻干保护剂包括蔗糖、甘露醇；

所述的纳米粒与冻干保护剂的质量比为100：1~20%。

本发明的高密度脂蛋白（HDL）类似物纳米粒通过下述方法制备：

将卵磷脂溶于有机溶剂中，37℃旋转蒸发成膜后，加入硫酸铵溶液，孵育，超声，将所得混悬液过葡聚糖G-50柱，用磷酸盐缓冲液(pH=7.4)溶液洗脱，收集白色部分，将溶解的药物溶液缓缓加入，保持30min后取出。室温下加入载脂蛋白A-Ⅰ，混合均匀，恒温水浴孵育，探头超声。透析过夜；加入蔗糖溶液，﹣70℃预冻过夜，冷冻真空干燥机冻干，得冻干的肝靶向纳米粒。用粒径分析仪测其粒径，平均密度径为100nm，平均数目径20nm左右，透射电镜照射显示与数目径显示大小相符。

本发明方法中，采用模拟体内HDL形成过程，经硫酸铵梯度法将卵磷脂薄膜分散，然后将药物注入，最后再加入载脂蛋白孵育，利用载脂蛋白盘状的螺旋结构将所述复合物包裹。

本发明方法中，所述的有机溶剂为氯仿或二氯乙烷、甲醇的混合物，其比例为1∶1-3。

本发明的方法中，硫酸铵的浓度为100-300mM，加药方式为水溶液。

本发明方法中，所述的药物与卵磷脂孵育温度为25-37℃，孵育时间为6-18小时。

本发明制得的高密度脂蛋白类似物纳米粒，具有肝靶向性，与现有技术比较，具有如下特点：其药物复合物包封率为80.5%，载药率为2.8%，其药物释放明显低于游离药物和无载脂蛋白的药物卵磷脂复合物，

该纳米粒可提高药物在肝组织的浓度，降低药物对其他组织的损伤，延长药物半衰期，降低用药量或延长给药间隔。较好的克服了HDL来源困难及血液污染问题。

附图说明

图1显示了本发明中磷脂与apoAI比例对粒径的影响。

图2为本发明的透射电镜图。

图3显示了本发明中的体外释放率。

图4显示了本发明中的血浆稳定性。

图5显示了本发明中载脂蛋白AI对巨噬细胞的影响。

图6显示了本发明中组织分布情况。

具体实施方式

实施例1HDL类似物的制备

1.1空白复合物的制备

将卵磷脂40mg置于圆底烧瓶中，用二氯乙烷与甲醇5ml(V∶V=1∶1)溶解，37℃旋转蒸发成膜后，加入2ml 250mmol硫酸铵溶液，水溶超声10min，再于28℃孵育1h，探头超声10min。最后将混悬液过葡聚糖G-50柱，洗脱液为50mM pH=7.4的PBS溶液，收集白色部分得空白HDL复合物。

1.2药物复合物的制备

将4mg盐酸阿霉素溶于1ml去离子水中，在50℃水浴温度下缓缓加入空白复合物中，保持30min后取出。室温下加入溶有2mg载脂蛋白A-Ⅰ的2ml PBS，混合均匀，37℃孵育12h后，水浴与探头超声各10min,即得。

1.3药物复合物冷冻干燥

将药物复合物置于PBS中透析过夜后，向加入质量分数为5％的蔗糖，﹣70℃预冻过夜，冷冻真空干燥机冻干，即得冻干药物复合物，为橘红色粉末。

实施例2HDL类似物表征

2.1HDL类似物粒径及形态考察。

用粒径分析仪测其粒径，结果如图1和图2所示，平均密度径为100nm，平均数目径20nm左右，透射电镜照射显示与数目径显示大小相符。

2.2HDL类似物的包封率考察

取500ul实例2.1的粒子溶液于10ml容量瓶中，加入100ul TritonX-100，定容，然后于紫外分光光度计480nm波长下以同样方法处理实例2.2制备的空白HDL复合物作为对照测其吸收值。包封率和载药率以公式（1）和（2）计算

结果表明，药物复合物包封率为80.5%，载药率为2.8%。

2.3释放率实验

取实施例1制备的药物复合物、不加apoA-I的复合物以及游离的盐酸阿霉素各5ml放入透析袋中，两端扎紧，置于200ml PBS中,37℃，1500rpm振荡，分别于10min,30min,1h,2h,4h,6h,8h,12h,24h,36h,48h取样，并用等量PBS溶液补充，测量各个时间点释放药物量，如图3所示，结果表明，HDL类似物药物释放明显低于游离药物和无载脂蛋白的药物卵磷脂复合物。

2.4血浆稳定性实验。

取制备的HDL类似物各1ml放入3个透析袋中，加入不同量的血浆使每个透析袋中类似物体积分数分别为10%，20%，50%，两端扎紧，置于50mlPBS中,37℃，1500rpm振荡，分别于一定时间点取样，并用等量PBS溶液补充，测量各个时间点释放药物量。结果如图4所示。

2.5溶血性实验

取6根15ml试管，分别加入2.5ml新鲜血浆，按下表分别加入不同体积生理盐水，再加入不同体积分数的的样品，结果如表1所示，制备的HDL类似物无溶血现象。

表1为HDL类似物溶血性实验

”表示与阴性对照管一致，无溶血、无红细胞凝集现象；

↓(-)表示底部有少许血丝状物，振摇后消失。

2.6生物相容性

巨噬细胞是免疫系统中的重要细胞，由骨髓造血干细胞分化发育而来，具有强大而迅速的吞噬和清除异体颗粒或某些可溶性异物的能力，同时刺激成纤维细胞生长促进伤口的愈合，在人体免疫系统中起着重要的作用；且载药系统为静脉注射给药，因此本实施例选择单核巨噬细胞作评价肝靶向载体apoAI生物相容性的实验细胞。人单核细胞株THP-1细胞经PMA诱导可以变为贴壁的巨噬细胞。

人单核细胞株THP-1是悬浮细胞，用含10%灭活胎牛血清的新鲜RPMI1640培养基，置于37℃、饱和湿度、5%CO₂细胞培养箱中培养。取对数生长期的THP-1悬浮细胞，换用含有100ng/ml佛波酯得全培养基，以细胞数1х10⁶/ML、200μL/孔接种于96孔板中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱内培养。大约8小时后细胞形态开始发生变化，细胞扁平伸长，似阿米巴形态，贴壁于培养板底部；培养到24小时，90%左右的德细胞呈贴壁生长，不易脱落，此细胞即为巨噬细胞。用无血清培养液将药物配制成不同浓度的含药培养液。MTT法检测ApoA-1对巨噬细胞活性的影响，结果如图5所示，apoAI对巨噬细胞的活性几乎没有影响。

2.7组织分布

健康雄性SD大鼠48只，体重200±20g，随机分为A、B三组，按100mg/kg（以DOX计）尾静脉注射给药，A组为rHDL-DOX组，B组为游离阿霉素（free dox）组。分别在15，30min，1，2，4，8，12，18，24h颈椎脱臼处死，取心、肝、脾、肺、肾，用生理盐水冲洗表面并用滤纸吸干水分后称重，置于－70℃保存备用。

实施例3HDL类似物抗肿瘤活性

实验动物：雄性BALB/c nu/nu雄性裸鼠（中国科学院上海药物所实验动物部），周龄：6周龄，平均15-20克。饲养在25℃恒温SPF级层流室,12小时光照和12小时黑暗交替,自由进食标准颗粒饲料及饮水。

裸鼠人肝癌原位种植模型的建立：

取肝癌研究所建立的高转移潜能人肝癌模型MHC97L瘤源，浸入生理盐水，剪切成2mm×1mm×1mm大小备用。以2.5mg/kg戊巴比妥腹腔注射麻醉裸鼠，手术野消毒，左肋缘下斜切口约8mm进腹，将肝叶从切口取出，斜形切开肝表面，植入癌组织块，缝合肝切缘和皮肤。干预原发肿瘤生长实验：肿瘤接种后2周开始给药，分为5组，每组7-8个。

药物治疗方案：分组情况

1.对照组（n=7）[A]:等体积溶剂由尾静脉注入，每周1次。

2.药物组5mg(阿霉素+脂质体)（n=8）[B]:

3.药物组10mg(阿霉素+脂质体)（n=8）[C]:

4.药物组5mg(阿霉素+脂质体+纳米材质)（n=8）[D]:

5.药物组10mg(阿霉素+脂质体+纳米材质)（n=8）[E]:

表2治疗5周肿瘤重量的变化

应用方差分析，发现5组的瘤重差异有统计学意义(F=6.16，p=0.0010)；进一步分析，发现E组与其它A组，C组，D组的差异有统计学意义，而其它4组之间的差异没有统计学意义。

Claims

1.一种肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒，其特征在于，由重组人源载脂蛋白与卵磷脂、被载药物按1～10：10：1～5质量比组成肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒，其中，所述的重组人源载脂蛋白为靶向载体。

2.按权利要求1所述的肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒，其特征在于，所述的纳米粒粒径为50-150nm。

3.按权利要求1所述的肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒，其特征在于，所述的重组人源载脂蛋白选自apoAI、apoAII或apoE。

4.按权利要求1所述的肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒，其特征在于，所述的被载药物为水溶性、脂溶性的抗肝癌、肝炎或肝纤维化药物。

5.制备权利要求1所述的肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒的方法，其特征在于，其包括步骤：

将卵磷脂溶于有机溶剂中，37℃旋转蒸发成膜后，加入硫酸铵溶液，孵育，超声，将所得混悬液过葡聚糖G-50柱，用磷酸盐缓冲液pH=7.4溶液洗脱，收集白色部分，将溶解的药物溶液缓缓加入，保持30min后取出，室温下加入载脂蛋白A-Ⅰ，混合均匀，恒温水浴孵育，探头超声，透析过夜，加入冻干保护剂，﹣70℃预冻过夜，冷冻真空干燥机冻干，得肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒。

6.按权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的冻干保护剂制选自蔗糖或甘露醇，与所述的类似物纳米粒的质量比例为1-20％。

7.按权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的有机溶剂为氯仿/二氯乙烷、甲醇的混合物，其比例为1∶1-3。

8.按权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的药物与卵磷脂孵育温度为25-37℃，孵育时间为6-18小时。

9.权利要求1的肝靶向高密度脂蛋白类似物纳米粒在制备肝靶向治疗药物中的用途。