CN102757555B - 地喹氯铵-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺共轭化合物及其修饰的白藜芦醇脂质体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE共轭化合物及其修饰的白藜芦醇脂质体。该化合物的结构式如式I所示。所述白藜芦醇脂质体，其组成包括：白藜芦醇和脂材，所述白藜芦醇和脂材的质量比为1∶20至1∶40；所述脂材由蛋黄卵磷脂、胆固醇和式I所示的化合物组成，三者的摩尔比依次为(63-67)∶(18-22)∶(2-4.35)。经药效试验证明，线粒体靶向性白藜芦醇脂质体在人肺腺癌A549细胞及其耐药A549/cDDP细胞的体外细胞实验、肿瘤球模型及体内移植瘤模型中都具有很强的细胞毒作用，可以穿透到肿瘤球的核心。将其与长春瑞滨脂质体联用可显著提高长春瑞滨脂质体对耐药性A549/cDDP细胞的抗肿瘤效果。

Description

地喹氯铵-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺共轭化合物及其修饰的白藜芦醇脂质体

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种地喹氯铵-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺共轭化合物及其制备方法，以及以该共轭化合物修饰的白藜芦醇脂质体

背景技术

肿瘤的多药耐药性是化疗失败的主要原因，可导致肿瘤细胞对治疗的耐药、复发及转移，尤其是内源性的多药耐药。肿瘤细胞可通过改变前凋亡及凋亡基因编码的蛋白质(如Bcl-2家族蛋白、凋亡信号通路中的Caspase蛋白等)的功能来引起遗传及表观遗传的改变，从而造成内源性的多药耐药。

癌症的化疗主要采取两种基本方式来消除肿瘤细胞：一是通过将化疗药直接作用于肿瘤细胞将其杀死，二是通过激活肿瘤细胞的凋亡基因，从而展开程序化杀伤肿瘤细胞。

线粒体是一种绝大多数真核细胞中都存在的膜封闭的细胞器，是细胞的能量工厂。线粒体除了可以供应细胞能量，也是细胞命运的调控中心，参与着细胞分化、细胞死亡，控制着细胞的周期和生长。肿瘤细胞的线粒体在结构和功能上都与正常细胞有所不同，其表现出更广泛的代谢能力，对作用于线粒体的药物也更加敏感。

抗癌药物诱导肿瘤细胞凋亡效应主要包括两种独立的上游起始通路：一，通过与死亡受体的配体交联，从而激活上游的Caspase；二，通过触发各种形式的细胞应激，释放凋亡因子。这两种通路都集中于在线粒体水平，继而诱导细胞凋亡。因此，直接作用于肿瘤细胞的线粒体并诱导其凋亡为克服化疗中的内源性耐药问题提供了策略。综上，线粒体靶向性治疗是一种选择性消除肿瘤细胞的有效手段。

越来越多的线粒体作用的药物被开发用来诱导肿瘤细胞的凋亡，例如葡萄糖转运抑制剂、线粒体通透性转换调节剂、线粒体外膜渗透性调节剂等。但是这些药物常因不利的药动学性质不能达到预期的治疗效果，增大了药物的毒性。人们已经开发了许多线粒体药物递送系统来解决这一问题，如将线粒体靶向性分子磷酸三甲苯酯(TPP)、地喹氯铵(DQA)或线粒体靶向性信号蛋白(MTSs)修饰到脂质载体上，从而达到将药物靶向线粒体的目的。

白藜芦醇是一种多酚化合物，在植物类食物中普遍存在。白藜芦醇是一种很有潜力的抗癌剂，可抑制癌变的三个主要阶段：启动、促进和演进，并启动线粒体凋亡通路，诱导多种癌症细胞凋亡。但是，由于白藜芦醇的水溶性低、稳定性差及治疗指数差，在临床中的应用十分有限。

发明内容

本发明的目的是提供一种地喹氯铵-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE)共轭化合物及其制备方法。

本发明所提供的DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE共轭化合物的结构式如式I所示：

(式I)

式I所示的化合物的制备方法，包括下述步骤：使式II所示的地喹氯铵与式III所示的羧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺进行酰胺缩合反应，得到式I所示化合物；

(式II)

(式III)。

所述酰胺缩合反应中所用的反应缩合剂为二环己基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑；所述酰胺缩合反应中所用的催化剂为4-二甲氨基吡啶。所述酰胺缩合反应在乙腈与水的混合溶剂中进行，两者的体积比可为1∶1。

所述酰胺缩合反应中地喹氯铵∶4-二甲氨基吡啶∶二环己基碳二亚胺∶1-羟基苯并三唑∶羧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺＝5∶24.6∶10∶10∶1(摩尔比)。

所述方法还包括将含式I所示化合物的反应液在水中进行透析纯化，并将透析后的液体冻干的步骤。

所述透析中使用的是截留分子量为2000Da的透析袋。

本发明的再一个目的是提供一种线粒体靶向性白藜芦醇脂质体及其制备方法。

本发明所提供的线粒体靶向性白藜芦醇脂质体，其组成包括：白藜芦醇和脂材，所述白藜芦醇和脂材的质量比为1∶20至1∶40，优选为1∶20；所述脂材由蛋黄卵磷脂、胆固醇和式I所示的化合物组成，三者的摩尔比依次为(63-67)∶(18-22)∶(2-4.35)，优选为65∶20∶4.35。

所述线粒体靶向性白藜芦醇脂质体的制备方法，包括下述步骤：

将组成脂质体的白藜芦醇和脂材溶于有机溶剂中，旋转蒸发除去所述有机溶剂，得到脂膜；将所述脂膜用甘露醇溶液水化，再将得到的悬液用超声或高压匀质处理，最后用微孔滤膜过滤，即得到所述线粒体靶向性白藜芦醇脂质体。

所述甘露醇溶液具体可为质量浓度为5％的甘露醇水溶液。

本发明另一个目的是提供上述线粒体靶向性白藜芦醇脂质体的应用。

本发明的线粒体靶向性白藜芦醇脂质体可用于制备真核生物肿瘤细胞增殖的抑制剂；或制备真核生物肿瘤细胞凋亡诱导剂；制备真核生物肿瘤细胞的线粒体内细胞色素C释放诱导剂；以及制备真核生物肿瘤细胞内caspase 9和/或caspase 3活化诱导剂。

所述真核生物为哺乳动物；所述肿瘤细胞为癌细胞；所述癌细胞为肺癌细胞，优选人肺腺癌A549细胞或多药耐药肺癌A549/cDDP细胞。

本发明的线粒体靶向性白藜芦醇脂质体也可用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物。

所述肿瘤为癌，所述癌优选为肺癌，更优选为内源性耐药肺癌。

本发明还保护一种具有协同增效的抗肿瘤药物组合物。

本发明所保护的具有协同增效的抗肿瘤药物组合物，含有所述的线粒体靶向性白藜芦醇脂质体和重酒石酸长春瑞滨脂质体。

本发明合成了一种地喹氯铵-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE)共轭化合物，并将其作为线粒体导向性分子修饰到线粒体靶向性白藜芦醇脂质体表面来克服肿瘤细胞的耐药性。利用人肺腺癌A549细胞及其耐药A549/cDDP细胞、A549及A549/cDDP肿瘤球、耐药性A549/cDDP细胞裸鼠移植瘤模型进行药效实验。DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE的收率约为87％，线粒体靶向性白藜芦醇脂质体粒径约为70nm。线粒体靶向性脂质体显著提高了细胞对药物的摄取，并将药物选择性的蓄积在线粒体中。线粒体靶向性白藜芦醇脂质体可通过降低线粒体膜电位、诱导线粒体释放细胞色素C及激活Caspase9和Caspase3诱导敏感及耐药性癌细胞凋亡。线粒体靶向性白藜芦醇脂质体在两种细胞系的体外细胞实验、肿瘤球模型及体内移植瘤模型中都具有很强的细胞毒作用，可以穿透到肿瘤球的核心。将其与长春瑞滨脂质体联用可显著提高长春瑞滨脂质体对耐药性A549/cDDP细胞的抗肿瘤效果。总之，本发明中线粒体靶向性白藜芦醇脂质体在内源性耐药肺癌治疗领域将有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE共轭化合物的合成路线。

图2DQA及反应产物(COOH-PEG₂₀₀₀-DSPE和DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE的混合物)的MALDI-TOF-MS图谱。

图3DQA、COOH-PEG₂₀₀₀-DSPE及反应产物(COOH-PEG₂₀₀₀-DSPE和DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE的混合物)的¹H NMR图谱；彩色阴影所示的质子峰即为相同颜色的箭头所指示的质子(或连在箭头所示的碳原子上的质子)的信号，其中：粉色，DQA分子上的芳香氢；黄色，COOH-PEG₂₀₀₀-DSPE分子上的聚乙二醇；蓝色，DQA分子上的甲基氢。

图4载药脂质体药物的累计释放量(％)，释放介质为含有10％胎牛血清的pH7.4PBS溶液。

图5给药后96hA549细胞(A)及A549/cDDP细胞(B)的存活率(％)及给药后48hA549细胞(C)及A549/cDDP细胞(D)的存活率(％)。

图6为A549细胞(A)和A549/cDDP细胞(B)给药处理后细胞摄取的结果。

图7A549细胞(A)和A549/cDDP细胞(B)中药物与线粒体的共定位，其中细胞的线粒体用线粒体红荧光探针标记；以及A549细胞(C)和A549/cDDP细胞(D)的线粒体中用流式细胞仪测定的药物浓度。

图8各白藜芦醇制剂组、长春瑞滨脂质体单独给药或长春瑞滨脂质体与线粒体靶向性白藜芦醇脂质体联合应用对A549肿瘤球(A，C)及A549/cDDP肿瘤球(B，D)的抑制效应。

图9不同制剂组的A549/cDDP肿瘤球的激光共聚焦显微层切图像，即对线粒体靶向性脂质体肿瘤球穿透能力的研究。

图10各白藜芦醇制剂组、长春瑞滨脂质体单独应用或长春瑞滨脂质体与线粒体靶向性白藜芦醇脂质体联合应用给药后对移植瘤模型的治疗效果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均从商业途径获得。

实施例所用的材料如下：

羧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(COOH-PEG₂₀₀₀-DSPE)购自美国Avanti公司，产品目录号为880125P。

地喹氯铵(DQA)购自浙江洪波化工有限公司，产品批号为100402。

1-羟基苯并三唑(HOBt)购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为54802。

二环己基碳二亚胺(DCC)购自国药集团化学试剂北京有限公司，产品编码为30056326。

4-二甲氨基吡啶(DMAP)购自国药集团化学试剂北京有限公司，产品编码为A52280501。

白藜芦醇购自上海金禾天然产物有限公司。

蛋黄卵磷脂(EPC)购自日本油脂株式会社，产品目录号为108057-3。

胆固醇购自北京市海淀区微生物培养基制品厂，批号20020106。

PEG₂₀₀₀-DSPE购自日本油脂株式会社，产品目录号M86563。

甘露醇购自国药集团化学试剂北京有限公司，产品编码为63008816。

地喹氯铵的分子式为C₃₀H₄₀C₁₂N₄，分子结构式：

羧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的分子式为C₁₃₈H₂₆₇N₂O₅₆P，分子结构式：

二环己基碳二亚胺的分子式为C₁₃H₂₂N₂，结构式：

1-羟基苯并三唑的分子式为C₆H₇N₃O₂，结构式：

4-二甲氨基吡啶的分子式为C₇H₁₀N₂，分子结构式：

聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的分子式为C₁₃₅H₂₆₈NO₅₆P，分子结构式：

白藜芦醇的分子式为C₁₄H₁₂O₃，分子结构式：

实施例1、地喹氯铵-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE)共轭化合物的合成与表征

DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE由DQA上的氨基和COOH-PEG₂₀₀₀-DSPE上的羧基通过酰化缩合，用DCC和HOBt作为反应缩合剂。将10μmolDQA、49.2μmolDMAP、20μmolDCC、20μmolHOBt和2μmol COOH-PEG₂₀₀₀-DSPE溶解在2ml 50％(v/v)的乙腈-水溶液中，将反应液混合物在室温下用磁力搅拌器轻轻搅拌12h得到粗产物，继而将粗产物转移到再生纤维素透析袋(截留分子量2000)，在去离子水中透析48h，除去未反应的DQA，DMAP，DCC，HOBt和乙腈。接下来将反应液冻干，得到干燥的产物混合物白色粉末，并使用核磁共振氢谱(¹H NMR)、激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行检测。

使用氢谱标准添加法对产物混合物中的DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE进行半定量。由于反应后DQA上的芳香氢会保留在产物DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE上，因此其氢谱信号可用作定量使用。将一系列已知量的DQA添加到定量的反应产物中，分别进行氢谱测量DQA上的芳香氢(～6.8ppm)的峰高，得到一条随DQA的添加量线性递增的信号强度曲线。通过这条斜线对反应产物中的DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE进行定量。

DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE的表征：

图2为DQA和DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE(含有COOH-PEG₂₀₀₀-DSPE)的MALDI-TOF-MS图谱。图谱中显示，反应产物中DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE的平均分子质量为3289.62(图2B)，DQA显示一个独立尖锐的峰，其分子质量为455.70(图2A)，DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE与DQA之间的质量差约为2800Da，与COOH-PEG₂₀₀₀-DSPE的分子质量相吻合。

图3为DQA、COOH-PEG₂₀₀₀-DSPE和DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE分子的¹H NMR谱图。如图所示，DQA及COOH-PEG₂₀₀₀-DSPE分子的特征峰都可在反应产物DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE的¹H NMR谱图中找到。向一定量的样品中加入已知量的DQA可提供一种将反应产物中的DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE进行半定量的方法。共轭反应后，DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE分子保留了DQA上的芳香氢信号(～6.8ppm，用粉色箭头标记)，因此该信号可用来对反应产物进行半定量，根据¹H NMR光谱的结果，DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE分子的收率约为87％。定量方法如下：首先用氢谱测量定量的反应产物中DQA上的芳香氢(～6.8ppm)的峰高，再将一系列已知量的DQA添加到定量的反应产物中，分别测量这一系列混合物中芳香氢的峰高，得到一条DQA浓度依赖的信号强度曲线，将一开始测定的反应产物中的芳香氢峰高带入信号强度曲线，从而得到其中的DQA-PEG2000-DSPE的量。

实施例2、脂质体的制备与表征

1)脂质体的制备：

通过薄膜分散法和挤压过膜制备线粒体靶向性白藜芦醇脂质体，此外，未载药的线粒体靶向性脂质体、白藜芦醇脂质体、长春瑞滨脂质体、香豆素脂质体及线粒体靶向性香豆素脂质体分别作为对照、细胞毒药物及荧光探针。

以蛋黄卵磷脂(EPC)、胆固醇和DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE作为脂材，三者摩尔比为65∶20∶4.35。脂材和白藜芦醇(脂材∶药＝20∶1，质量/质量)置茄形瓶中用甲醇溶解后，旋转蒸发除去甲醇，脂膜用质量浓度5％甘露醇(国药集团化学试剂北京有限公司，产品编码为63008816)溶液水化，水浴超声10min。然后，细胞粉碎仪中进一步超声，设置超声工作时间为10s，间歇时间为10s，全程时间为6.8min(200W)，白色浑浊溶液逐渐形成带有蓝色荧光透明液体。挤压分别通过400nm和200nm的聚碳酸酯膜三次，制得线粒体靶向性白藜芦醇脂质体。

白藜芦醇脂质体通过相同方法制备，其脂材中的DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE用PEG₂₀₀₀-DSPE代替。

重酒石酸长春瑞宾脂质体制备采用硫酸铵梯度法制备；具体方法如下：精密称取卵磷脂、胆固醇和PEG2000-DSPE(55/40/5，μmol/μmol/μmol)适量，溶解于适当体积的甲醇中，通过旋转蒸发40℃真空干燥除去甲醇，在茄形瓶底部及内壁形成一层薄薄的均匀脂膜。加入若干毫升250mM硫酸铵水溶液(pH 5.1)水化，先在冰浴中超声5min，细胞粉碎仪中进一步超声，设置超声工作时间为10s，间歇时间为10s，全程时间为6.8min(200W)，白色浑浊溶液逐渐形成带有蓝色荧光透明液体。依次挤压通过孔径为400nm，200nm聚碳酯膜3次，然后将过膜后的空白脂质体封装到透析膜袋中，在十倍体积的生理盐水(0.9％NaCl)中透析48h，每12h更换一次新的透析液。具有硫酸铵梯度的空白脂质体制备完成。重酒石酸长春瑞宾(购自北京嘉瑞时代科技有限公司，CAS号：125317-39-7)以一定的浓度溶解在蒸馏水中。药物溶液与空白脂质体都在60℃水浴中预热，然后以1∶5的药脂比混合，在60℃浴振摇20min，即得重酒石酸长春瑞宾脂质体(长春瑞滨脂质体)。

线粒体靶向性香豆素脂质体及香豆素脂质体的制备方法与上述方法相同，其中脂材与香豆素的比例为300∶1(质量/质量)。

2)脂质体的表征：

将制备的线粒体靶向性白藜芦醇脂质体、白藜芦醇脂质体、香豆素脂质体、线粒体靶向性香豆素脂质体及长春瑞滨脂质体分别过Sephadex G-50柱，分离游离的药物，流动相为磷酸盐缓冲液(137mM NaCl，2.7mM KCl，8mM Na₂HPO₄，and 2mMKH₂PO₄，PBS pH 7.4)。过柱前后的脂质体悬液分别用9倍甲醇破坏，白藜芦醇及长春瑞滨用紫外检测器的高效液相色谱测定包封率，香豆素用荧光检测器。白藜芦醇的测定条件：ODS C18柱(Phenomenex，5μm，250×4.6mm)；30℃；检测波长306nm；流速1.0ml/min；流动相乙腈/0.5M KH₂PO₄(pH4.0)/三乙胺(34/66/0.3，体积比)。长春瑞滨的测定条件：ODS C18柱(Phenomenex，5μm，250×4.6mm)；30℃；检测波长215nm；流速1.0ml/min；流动相乙腈/0.5M KH₂PO₄(pH4.0)/三乙胺(34/66/0.3，体积比)。香豆素的检测条件：ODS C18柱(Phenomenex，5μm，250×4.6mm)；30℃；激发和发射波长分别为467nm和502nm；流速1.0ml/min；流动相甲醇/水(95/5，体积比)。白藜芦醇、长春瑞滨、香豆素的包封率(EE)按以下公式计算：EE＝(W_i/W_total)×100％，其中，W_i是过Sephadex G-50柱后被甲醇破坏的脂质体中药物的质量。W_total是与过柱的脂质体体积相同的过柱前的经甲醇破坏的脂质体中的药物质量。

脂质体的粒径和Zeta电位用Nano Series Zen 4003 Zeta Sizer测定。

体外脂质体释放实验在含血清的释放液(含10％胎牛血清的PH7.4的PBS)中进行。4ml脂质体与释放介质混合液(1∶1，体积比)密封在透析袋中，透析袋浸没在20ml释放液中，立即置于振荡器中，37℃，100次/分钟条件下持续震荡24小时。分别在0.25，0.5，1，2，4，6，8，12和24小时取0.2ml释放液，并马上补加相同体积的新鲜释放液。释放液中白藜芦醇浓度的测定方法同包封率的测定。释放率(RR，％)的计算公式：RR＝(W_i/W_total)×100％，其中W_i是在i时间点取出的释放液中白藜芦醇的质量，W_total是与透析体积相同的脂质体在透析前白藜芦醇的质量。长春瑞滨及香豆素的体外释放实验通过相同方法进行。每项实验平行重复三次。

为了对每个线粒体靶向性白藜芦醇脂质体上的DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE分子数量进行定量，假定每个脂质体的密度为1.2g/cm³，并利用下述公式进行计算：

N_{DQA-PEG2000-DSPE}＝(N_total x MOL_{DQA-PEG2000-DSPE}％)/(M_total/m)

其中，N_{DQA-PEG2000-DsPE}表示每个脂质体中DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE分子的数量，N_total表示在一定量的样品中总的脂材分子数量，MOL_{DQA-PEG2000-DSPE}％表示DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE分子占总脂材量的摩尔百分数，M_total表示一定量的样品中脂材的总质量，m表示由脂质体粒径与密度推算出的每个脂质体的平均质量。

3)结果

表1脂质体的表征

“*”表示线粒体靶向性白藜芦醇脂质体包封率与白藜芦醇脂质体相比有显著性提高。

表1所示为白藜芦醇脂质体、线粒体靶向性白藜芦醇脂质体、未载药线粒体靶向性脂质体、香豆素脂质体、线粒体靶向性香豆素脂质体的包封率、平均粒径、粒径的多分散指数，Zeta电位。结果显示，上述脂质体的平均粒径在70nm左右，分布均一。白藜芦醇及香豆素在线粒体靶向性脂质体中的包封率均大于95％，在普通脂质体中包封率大于80％，其中白藜芦醇及香豆素的浓度分别为1mg/ml及0.001mg/ml。此外，长春瑞滨脂质体的平均粒径接近90nm，包封率大于95％。所有脂质体都带有轻微的负电性。

图4为白藜芦醇、香豆素及长春瑞滨从脂质体中的释放率，在最初的2h内，释放率分别低于25％、5％及10％，在第24小时，累积释放率分别约为75％、25％及30％。

经计算，每个线粒体靶向性脂质体上的DQA-PEG₂₀₀₀-DSPE分子个数为7.95x10³。

实施例3、线粒体靶向性白藜芦醇脂质体的药效实验

(一)细胞培养

人肺腺癌A549细胞(购自中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所)用含10％胎牛血清及1％双抗(100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)的F-12培养液培养；多药耐药肺癌A549/cDDP细胞(购自中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所)用含10％胎牛血清及1％双抗(100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)的RPMI-1640培养液培养，为了保持细胞耐药性，培养液中加入终浓度4μM的顺铂，并在实验前一周用不含顺铂的上述培养基培养。两种细胞的培养条件均为为5％CO₂，37℃。

(二)细胞毒作用

将A549细胞或A549/cDDP细胞以5.4×10³个/孔的浓度接种于96孔细胞培养板中，在5％CO²、37℃的条件下培养24h后，将培养液吸出，分别加入含有不同浓度梯度的游离白藜芦醇、白藜芦醇脂质体、未载药线粒体靶向性脂质体或线粒体靶向性白藜芦醇脂质体的新鲜培养液。白藜芦醇的终浓度为0-50μM，未载药线粒体靶向性脂质体的浓度与载药脂质体浓度相同。用空白培养基培养作为对照组。给药孵育96h后，用乙酰罗丹明B染色法评价细胞毒作用，酶标仪的吸收波长为540nm，抑制率使用以下公式计算：抑制率％＝100％-(加药组在540nm处的吸光度值/空白对照组在540nm处的吸光度值)×100％。每个实验重复三次，每个浓度设五个复孔，所得结果绘制药效曲线。

为了进一步评估联合应用长春瑞滨脂质体与线粒体靶向性白藜芦醇脂质体的细胞毒作用，将A549细胞或A549/cDDP细胞按上述方法培养，之后将培养液换成含有各浓度的长春瑞滨脂质体(长春瑞滨浓度分别为0.01，0.1或1μM)加各浓度的线粒体靶向性白藜芦醇脂质体(1，5或10μM)培养液，用空白培养基培养作为对照组。5％CO₂、37℃的条件下培养48h后用乙酰罗丹明B染色法评价细胞毒作用，方法如上所述。

图5为线粒体靶向性白藜芦醇脂质体及其他对照制剂组对A549细胞及A549/cDDP细胞的抑制作用。结果显示，在各个给药浓度下，线粒体靶向性白藜芦醇脂质体都具有最强的抑制A549细胞增值的作用。此外，白藜芦醇脂质体对A549细胞的细胞毒作用大于游离药。未载药线粒体靶向性脂质体对于A549细胞同样具有一定的细胞毒作用(图5A)。而A549/cDDP细胞对于游离白藜芦醇及白藜芦醇脂质体具有一定的抗性，线粒体靶向性白藜芦醇脂质体对其具有最显著的抑制能力(图5B)。

作为阳性对照药，长春瑞滨脂质体对于A549细胞具有很强的抑制能力，当给药浓度≥0.1μM时，A549细胞的存活率即下降到40％以下。为了观察线粒体靶向性白藜芦醇脂质体增强长春瑞滨脂质体药效的现象，在联合给药实验中，我们选择低浓度的长春瑞滨脂质体。结果显示，线粒体靶向性白藜芦醇脂质体可以显著提高长春瑞滨脂质体的细胞毒作用，有白藜芦醇浓度依赖效果(图5C)。

A549/cDDP细胞对于长春瑞滨脂质体单独给药组体现了一定的抗性，当与线粒体靶向性白藜芦醇脂质体联合给药时，对肿瘤细胞的抑制效果有显著提高，同样具有白藜芦醇浓度依赖效果，尤其是当长春瑞滨脂质体浓度为0.01μM时，单独给药的肿瘤细胞存活率大于90％，而与线粒体靶向性白藜芦醇脂质体(5μM)联合给药组存活率不到40％(图5D)。

(三)细胞内摄取

利用流式细胞仪测量A549细胞或A549/cDDP细胞对药物的摄取。将A549细胞或A549/cDDP细胞以4×10⁵个/孔的浓度接种到6孔细胞培养板中，培养液体积为2ml，并在5％CO₂at 37℃的条件下培养24h。接下来，用游离香豆素、香豆素脂质体和线粒体靶向性香豆素脂质体孵育细胞4h，香豆素终浓度为10μM，用空白培养基培养作为对照组。给药孵育后，将细胞用0.25％胰蛋白酶收集，并用冷的PBS洗两次，用1％(体积比)的多聚甲醛在室温下将细胞固定。细胞摄取量用流式细胞仪测定，收集数为每个样品1×10⁴个细胞，荧光强度表示细胞摄取量的大小。每个实验重复三次。

图6为A549细胞(6-A)及A549/cDDP细胞(6-B)给药处理后细胞摄取的荧光强度结果，给药组分别为空白对照组、游离香豆素、香豆素脂质体及线粒体靶向性香豆素脂质体。各制剂组的吸收峰用标有A₁-A₄或B₁-B₄的箭头表示，相应的数值在柱形图中体现。给药孵育4h后，空白对照组、游离香豆素组、香豆素脂质体组及线粒体靶向性香豆素脂质体组A549细胞的几何平均荧光强度分别为6.23±0.45、628.33±4.03、748.96±66.44及1017.80±10.72，相应对于A549/cDDP细胞分别为4.80±0.29、552.16±5.69、659.62±16.12及1047.13±19.56。

(四)线粒体靶向性

A、线粒体共定位

利用激光共聚焦显微镜观察线粒体靶向性脂质体靶向线粒体的作用。将A549细胞或A549/cDDP细胞以3×10⁴个/孔的浓度接种到玻底皿中，培养液体积为2ml，并在5％CO₂、37℃的条件下培养24h。接下来，用游离香豆素、香豆素脂质体和线粒体靶向性香豆素脂质体孵育细胞4h，香豆素终浓度为10μM，用空白培养基培养作为对照组。接下来将细胞用PBS漂洗，用线粒体红荧光探针标记细胞线粒体，在5％CO₂、37℃的条件下孵育30min，孵育A549细胞的线粒体红浓度为0.5μM，A549/cDDP细胞的线粒体红浓度为2μM，用激光共聚焦显微镜进行图像分析。

B、线粒体内药物浓度

用流式细胞仪进一步对线粒体内药物浓度进行定量。将A549细胞或A549/cDDP细胞用游离香豆素、香豆素脂质体和线粒体靶向性香豆素脂质体在5％CO₂、37℃的条件下孵育4h，香豆素终浓度为10μM，用空白培养基培养作为对照组。接下来将细胞收集并用冷的PBS漂洗两次，提取线粒体，其步骤根据细胞线粒体提取试剂盒的说明书进行操作。将细胞加入线粒体提取试剂中，用玻璃匀浆器搅拌，得到的悬液用离心力600g离心10min，收集上清，再次以离心力3500g离心10min，其沉淀即为细胞线粒体。线粒体的药物摄取量用流式细胞仪测定，收集数为每个样品1×10⁴个线粒体，荧光强度表示摄取量的大小。每个实验重复三次。

图7A和B为各制剂组在A549细胞及A549/cDDP细胞中的亚细胞定位激光共聚焦显微图像。细胞线粒体通过线粒体红荧光探针染成红色，绿色的香豆素作为各制剂组的荧光探针，显示其亚细胞定位，图中的黄色荧光为绿色和红色荧光的组合，表示制剂与线粒体的共定位。如图所示，线粒体靶向性香豆素脂质体具有特定的分布，选择性集中在线粒体上，具有最明显的黄色荧光。然而，游离香豆素组及香豆素脂质体组的细胞中没有显示黄色荧光。

图7C和D为流式细胞仪测定给药后A549细胞及A549/cDDP细胞提取的线粒体的荧光强度。各制剂组的荧光强度峰分别用标有C₁-C₄或D₁-D₄的箭头表示，相应的数值在柱形图中体现。其中，线粒体靶向性香豆素脂质体组的线粒体就有最强的荧光强度。给药孵育4h后，空白对照组、游离香豆素组、香豆素脂质体组及线粒体靶向性香豆素脂质体组A549细胞的几何平均荧光强度分别为15.52±0.37、191.27±6.78、252.7±3.67及507.76±37.96，相应对于A549/cDDP细胞分别为17.53±0.21、181.01±10.42、634.51±9.80及854.89±89.21，其结果与激光共聚焦显微图像相一致。

(五)诱导线粒体去极化

线粒体膜电位(ΔΨ_m)用阳离子亲脂性荧光染料JC-1测量，由红色及绿色荧光的强度指示。将A549细胞或A549/cDDP细胞以4×10⁵个/孔的浓度接种到6孔细胞培养板中，培养液体积为2ml，并在5％CO₂、37℃的条件下培养24h。接下来，用游离白藜芦醇、白藜芦醇脂质体、未载药线粒体靶向性脂质体和线粒体靶向性白藜芦醇脂质体孵育细胞6h，白藜芦醇终浓度为20μM，未载药线粒体靶向性脂质体的浓度与载药脂质体浓度相同，空白培养基培养作为对照组。接下来将细胞用冷的PBS漂洗两次，加入5μg/ml的JC-1在5％CO₂at 37℃的条件下染色20min，保持避光。再用PBS漂洗细胞一次，立刻用流式细胞仪分析，收集数为每个样品1×10⁴个细胞，绿色荧光信号强度表示细胞线粒体膜电位下降程度。

为了评估由线粒体靶向性白藜芦醇脂质体诱导的线粒体膜电位下降是否是通过作用于线粒体通透性转换孔(MPTP)引起的，将细胞在给药前用MPTP阻滞剂环孢菌素A(1μM)预先孵育30min。接下来将MPTP阻滞剂移除，加入含有线粒体靶向性白藜芦醇脂质体(20μM)的培养基孵育6h，用上述方法染色并测量线粒体膜电位。每个实验重复三次。

结果见表2。表2A为各制剂组诱导A549细胞及A549/cDDP细胞线粒体膜电位(ΔΨ_m)下降的结果。ΔΨ_m的下降通过JC-1指示剂的荧光从红色向绿色转变程度表示。对于A549细胞，给予游离白藜芦醇、白藜芦醇脂质体、未载药线粒体靶向性脂质体或线粒体靶向性白藜芦醇脂质体后，ΔΨ_m下降的细胞百分比分别为24.62±0.75％、24.57±1.84％、27.23±3.63％和49.24±17.25％，相应对于A549/cDDP细胞分别为30.16±6.63％、32.80±5.23％、35.09±3.68％及41.67±7.36％。由此可知，线粒体靶向性白藜芦醇脂质体具有最强诱导ΔΨ_m下降的能力。

在MPTP阻滞剂环孢菌素A(1μM)预处理30min的组中，线粒体靶向性白藜芦醇脂质体诱导的细胞ΔΨ_m下降的效果被抑制，对于A549细胞及A549/cDDP细胞，ΔΨ_m下降的细胞百分比分别为28.87±12.92％和36.85±4.52％。由此可证明，线粒体靶向性白藜芦醇脂质体诱导的ΔΨ_m下降是由于作用于MPTP引起。

(六)凋亡诱导效应

细胞的凋亡用Annexin V-FITC凋亡探针试剂盒染色，流式细胞仪进行检测。将A549细胞或A549/cDDP细胞以4×10⁵个/孔的浓度接种到6孔细胞培养板中，培养液体积为2ml，并在5％CO₂ at 37℃的条件下培养24h。接下来，用游离白藜芦醇、白藜芦醇脂质体、未载药线粒体靶向性脂质体和线粒体靶向性白藜芦醇脂质体孵育细胞48h，白藜芦醇终浓度为20μM，未载药线粒体靶向性脂质体的浓度与载药脂质体浓度相同，空白培养基培养作为对照组。接下来将细胞收集，重悬在试剂盒中提供的缓冲液中，加入5μl Annexin V-FITC探针，混匀，室温下避光孵育15min，之后加入5μl PI，立即用流式细胞仪分析，收集数为每个样品1×10⁴个细胞。每个实验重复三次。

为了进一步测量联合给药的凋亡诱导效率，将A549细胞或A549/cDDP细胞按上述方法培养，加入长春瑞滨脂质体(0.05μM)或长春瑞滨脂质体(0.05μM)加线粒体靶向性白藜芦醇脂质体(5μM)，孵育48h。细胞凋亡情况按上述方法测量。每个实验重复三次。

结果见表2。表2B为各制剂组诱导A549细胞及A549/cDDP细胞凋亡的结果。结果显示，与游离白藜芦醇及白藜芦醇脂质体相比，线粒体靶向性白藜芦醇脂质体在两种细胞系中都具有最显著的凋亡诱导效应。

在联合给药实验中，联合应用长春瑞滨脂质体及线粒体靶向性白藜芦醇脂质体的凋亡诱导效应显著高于长春瑞滨脂质体单独给药组：对于A549细胞，其凋亡诱导率分别为74.50±2.91％和32.36±5.04％；对于A549/cDDP细胞，分别为44.72±0.79％和17.58±3.01％。

(七)诱导线粒体内细胞色素C释放效应

细胞给药处理后线粒体及细胞质中细胞色素C的浓度用人细胞色素C酶联反应免疫吸附测定试剂盒(美国R&D systems，产品目录号709-CCH-010)测定，细胞质及线粒体蛋白利用胞浆-线粒体蛋白提取试剂盒(加拿大BioBasic Inc.，产品目录号BSP051)分别提取。将A549细胞或A549/cDDP细胞孵育24h，用游离白藜芦醇、白藜芦醇脂质体、未载药线粒体靶向性脂质体和线粒体靶向性白藜芦醇脂质体孵育细胞24h，白藜芦醇终浓度为20μM，未载药线粒体靶向性脂质体的浓度与载药脂质体浓度相同，空白培养基培养作为对照组。将细胞收集，用冷的PBS漂洗两次，加入细胞胞质提取缓冲液(0.1％蛋白酶抑制剂，0.1％DTT(二硫苏糖醇)，体积比)涡旋15s，用玻璃匀浆器搅拌30-35次。将悬液在4℃下3000转/分钟离心10min，保留上清液为胞质部分。将沉淀用线粒体提取液(含有20mmol/l Tris-Cl pH7.5，2mmol/l EGTA，1％Tritonx-100，0.1％蛋白酶抑制剂，体积比，1mM DTT)重悬，涡旋后4℃下13000转/分钟离心10min，保留上清为线粒体部分。

将蛋白样品加入样品测试孔中，37℃下孵育30min，继而用洗涤缓冲液漂洗5次，每孔加入HRP-结合反应液按上述方法孵育、漂洗，再加入色原体溶液A及色原体溶液B 37℃下避光孵育15min。最后，每孔加入终止液，在10min内用酶标仪测量450nm下的吸光度值即为细胞色素C的浓度，给药后的细胞色素C浓度比为与空白对照组的浓度的比例。每个实验重复三次。

结果见表2。表2C为给药处理后A549细胞及A549/cDDP细胞的细胞质及线粒体内细胞色素C浓度与空白对照组的比例。给予线粒体靶向性白藜芦醇脂质体后，两种肿瘤细胞线粒体内的细胞色素C浓度都下降，而细胞质内浓度上升，说明，线粒体内的细胞色素C被药物诱导释放到了细胞质内。同样，游离白藜芦醇及白藜芦醇脂质体同样可诱导细胞色素C的释放，诱导效应低于线粒体靶向性白藜芦醇脂质体。对于A549细胞，给予未载药线粒体靶向性脂质体、游离白藜芦醇、白藜芦醇脂质体或线粒体靶向性白藜芦醇脂质体后，线粒体内的细胞色素C浓度为空白对照组的0.59±0.11、0.59±0.13、0.52±0.11及0.36±0.04倍，细胞质内的细胞色素C浓度为空白对照组的1.22±0.09、1.04±0.13、1.32±0.22及1.87±0.41倍。对于A549/cDDP细胞，线粒体内的细胞色素C浓度为空白对照组的0.67±0.16、0.62±0.05、0.56±0.04和0.39±0.03倍，细胞质内的细胞色素C浓度为空白对照组的1.07±0.05、0.92±0.16、1.12±0.22和1.43±0.34倍。

(八)Caspase活性检测

给药后的Caspase 3和Caspase 9的活性通过经特异的蛋白酶裂解后释放荧光的蛋白底物试剂盒(Caspase 3分光光度法检测试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司，产品目录号KGA202)，(Caspase 9分光光度法检测试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司，产品目录号KGA402)。进行测量。将A549细胞或A549/cDDP细胞孵育24h，用游离白藜芦醇、白藜芦醇脂质体、未载药线粒体靶向性脂质体和线粒体靶向性白藜芦醇脂质体孵育细胞24h，白藜芦醇终浓度为20μM，未载药线粒体靶向性脂质体的浓度与载药脂质体浓度相同，空白培养基培养作为对照组。将细胞收集、裂解，细胞裂解液在4℃下10000转/分钟离心1min，保留上清液，分别用Caspase 3和Caspase 9的特异性底物孵育，再用酶标仪测定其在405nm下的吸光度值，即为Caspase 3和Caspase 9的浓度，并通过试剂盒中所示方法计算其活性比例。每个实验重复三次。

结果见表2。表2D和E分别为给药后A549细胞及A549/cDDP细胞中caspase 9和caspase 3的活性与空白对照组的比例。对于A549细胞，给予未载药线粒体靶向性脂质体、游离白藜芦醇、白藜芦醇脂质体或线粒体靶向性白藜芦醇脂质体后，细胞内caspase 3的活性比分别为1.001±0.07、1.11±0.16、1.30±0.23和2.44±0.63，caspase9的活性比分别为1.12±0.14、1.16±0.25、1.11±0.15和2.45±0.59。同样对于A549/cDDP细胞，细胞内caspase 3的活性比分别为1.12±0.10、1.99±0.94、1.54±0.15和5.09±1.17，caspase 9的活性比分别为1.12±0.10、1.14±0.11、1.08±0.02及1.81±0.30。由结果可知，在两种肿瘤细胞中，线粒体靶向性白藜芦醇脂质体都具有最显著的诱导caspase 9和caspase 3活化的效果。

(九)对肿瘤球抑制作用

A、对肿瘤球生长的抑制

A549及A549/cDDP无血管肿瘤球用琼脂糖凝胶水溶液进行体外培养。将琼脂糖加入无血清RPMI-1640培养基，80℃加热30min，配置成2％(质量/体积)的琼脂糖凝胶溶液。将50μl/孔的琼脂糖凝胶溶液加入到96孔细胞培养板中，冷却至室温，将A549细胞或A549/cDDP细胞1×10³个/孔的浓度接种到96孔细胞培养板中，培养液体积为100μl，缓慢摇动细胞培养板5min，后在5％CO₂、37℃的条件下培养48h，每个孔内可形成一个肿瘤球。肿瘤球形成后，用游离白藜芦醇、白藜芦醇脂质体、未载药线粒体靶向性脂质体和线粒体靶向性白藜芦醇脂质体孵育，白藜芦醇终浓度为20μM，未载药线粒体靶向性脂质体的浓度与载药脂质体浓度相同，空白培养基培养作为对照组。在联合给药实验中，向肿瘤球中加入长春瑞滨脂质体或长春瑞滨脂质体加线粒体靶向性白藜芦醇脂质体，其中，长春瑞滨浓度为0.05μM，白藜芦醇浓度为5μM。各制剂组的肿瘤球生长抑制效果通过用显微镜观察给药后肿瘤球体积变化来测量，记录给药后第0、1、2、3、4、5天肿瘤球的直径，并按如下方程式计算：体积＝(π×最长径×最短径)/6。A549及A549/cDDP肿瘤球体积变化率计算方式：体积变化率＝(肿瘤球第i天的体积/第0天的体积)×100％(i＝1，2，3，4，5)。每项实验重复三次，每次每个制剂组设置5个副孔。

B、穿透实验

为了观测线粒体靶向性脂质体的穿透能力，用游离香豆素、香豆素脂质体和线粒体靶向性香豆素脂质体孵育A549/cDDP肿瘤球12h，香豆素的终浓度为10μM，之后用PBS漂洗肿瘤球，用激光共聚焦显微镜自上而下观测肿瘤球每一层的荧光强度，从而得知药物可以进入肿瘤球的深度。

图8A和B各制剂组对A549及A549/cDDP肿瘤球的抑制作用。对于A549肿瘤球，给予空白培养液对照、游离白藜芦醇、白藜芦醇脂质体、未载药线粒体靶向性脂质体或线粒体靶向性白藜芦醇脂质体后，第5天肿瘤球体积变化率分别为181.27±19.12％、74.10±13.62％、87.98±9.09％、52.63±7.85％和40.93±5.76％。对于A549/cDDP肿瘤球，体积变化率分别为179.86±11.78％、96.34±10.20％、99.32±10.01％、74.25±9.16％和53.33±18.75％。

图8C和D为长春瑞滨脂质体单独给药或长春瑞滨脂质体加线粒体靶向性白藜芦醇脂质体联合给药后A549及A549/cDDP肿瘤球的生长抑制效果。长春瑞滨脂质体脂质体给药后第5天，A549肿瘤球体积变化率为98.13±9.89％，A549/cDDP肿瘤球体积变化率为110.55±13.84％，联合给药组中，给药后第5天，A549肿瘤球体积变化率为70.33±5.02％，A549/cDDP肿瘤球体积变化率为64.65±6.56％。

图9为利用激光共聚焦显微镜观察的线粒体靶向性脂质体对于A549/cDDP肿瘤球的穿透实验照片。在给予游离香豆素、香豆素脂质体及线粒体靶向性香豆素脂质体后，用共聚焦显微镜对肿瘤球进行自上而下的层切拍照。其结果显示，游离香豆素组的荧光强度最弱，香豆素脂质体组荧光强度更强，但是香豆素无法到达肿瘤球的核心，而线粒体靶向性香豆素脂质体组不仅荧光最显著，而且可以穿透到肿瘤球的核心。

(十)体内抗耐药性肺癌移植瘤效应

雌性BALB/c裸鼠(体重16-18g)购自北京大学医学部实验动物中心，动物在无菌条件下饲养，无菌条件下操作。将1×10⁷A549/cDDP细胞混悬于200μl无血清培养基中，皮下注射到裸鼠腋下。每天观察裸鼠的腋下肿瘤生长情况，并记录肿瘤的体积。当肿瘤体积达到200-220mm³时，将裸鼠随机分成6组，每组6只进行给药治疗。在给裸鼠接种A549/cDDP细胞后的第13、16、19和22天，分别通过尾静脉注射生理盐水、游离白藜芦醇、白藜芦醇脂质体、线粒体靶向性白藜芦醇脂质体、长春瑞滨脂质体及长春瑞滨脂质体加线粒体靶向性白藜芦醇脂质体，其中白藜芦醇剂量为20mg/kg，长春瑞滨剂量为5mg/kg，生理盐水组为空白对照组。每天测量肿瘤的大小。肿瘤体积(V)用下面公式计算：V＝长×宽²/2(mm³)。各处理组的荷瘤裸鼠在肿瘤接种后第27天后处死，测量肿瘤的长和宽，采用下式计算给药后的肿瘤抑制率：肿瘤抑制率(％)＝100％-(给药组肿瘤体积/空白组肿瘤体积)×100％。

图10为药物的体内抗耐药性肺癌A549/cDDP移植瘤效应。结果显示，与游离白藜芦醇及白藜芦醇脂质体相比，线粒体靶向性白藜芦醇脂质体具有最为显著的体内抗肿瘤效果，在接种后第27天，肿瘤体积抑制率分别为49.87±6.48％、68.26±5.35％及85.81±1.79％。作为阳性对照药，长春瑞滨脂质体抑制肿瘤效果也较明显，第27天抑制率为72.06±5.79％，但与线粒体靶向性白藜芦醇脂质体联合应用后肿瘤抑制效果更显著，抑制率为97.95±0.24％。

表2各制剂组对A549细胞和A549/cDDP细胞的线粒体膜电位、凋亡率、细胞色素C浓度、caspase 9和caspase 3活性的作用

说明：Mito.¹为线粒体；Cyto.²为细胞质。

Claims (12)

1.式Ⅰ所示的化合物：

2.式Ⅰ所示的化合物的制备方法，包括下述步骤：使式Ⅱ所示的地喹氯铵与式Ⅲ所示的羧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺进行酰胺缩合反应，得到式Ⅰ所示化合物；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述酰胺缩合反应中所用的反应缩合剂为二环己基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑；所述酰胺缩合反应中所用的催化剂为4-二甲氨基吡啶。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将式Ⅰ所示化合物在水中进行透析纯化，并将透析后的液体冻干的步骤。

5.一种线粒体靶向性白藜芦醇脂质体，其组成包括：白藜芦醇和脂材，所述白藜芦醇和脂材的质量比为1:20至1:40；所述脂材由蛋黄卵磷脂、胆固醇和式Ⅰ所示的化合物组成，三者的摩尔比依次为(63-67):（18-22）:（2-4.35）。

6.根据权利要求5所述的线粒体靶向性白藜芦醇脂质体，其特征在于：所述线粒体靶向性白藜芦醇脂质体中所述白藜芦醇和脂材的质量比为1:20；所述脂材中蛋黄卵磷脂、胆固醇和式Ⅰ所示的化合物的摩尔比依次为65：20：4.35；

所述线粒体靶向性白藜芦醇脂质体的平均粒径为68.82±0.43nm，包封率为96.79±0.26%。

7.制备权利要求5或6所述线粒体靶向性白藜芦醇脂质体的方法，包括下述步骤：将权利要求5或6中所述白藜芦醇和脂材溶于有机溶剂中，旋转蒸发除去所述有机溶剂，得到脂膜；将所述脂膜用甘露醇溶液水化，再将得到的悬液用超声或高压匀质处理，最后用微孔滤膜过滤，即得到所述线粒体靶向性白藜芦醇脂质体。

8.权利要求5或6所述的线粒体靶向性白藜芦醇脂质体在下述1）-5）中的应用：1）制备预防和/或治疗肿瘤药物；2）制备真核生物肿瘤细胞增殖的抑制剂；3）制备真核生物肿瘤细胞凋亡诱导剂；4）制备真核生物肿瘤细胞的线粒体内细胞色素C释放诱导剂；5）制备真核生物肿瘤细胞内caspase9和/或caspase3活化诱导剂。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为癌；

所述真核生物为哺乳动物；所述肿瘤细胞为癌细胞。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述癌为肺癌；所述癌细胞为肺癌细胞。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述癌为内源性耐药肺癌；

所述肺癌细胞为人肺腺癌A549细胞或多药耐药肺癌A549/cDDP细胞。

12.一种抗肿瘤药物组合物，含有权利要求5或6所述的线粒体靶向性白藜芦醇脂质体和重酒石酸长春瑞宾脂质体。

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