CN112076157B

CN112076157B - 拉帕醇纳米脂质体制剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112076157B
Application number: CN201910515728.0A
Authority: CN
Inventors: 薛明; 陈群英; 白露; 徐平湘; 李晓蓉; 周雪林
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2019-06-14
Filing date: 2019-06-14
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2039-06-14
Also published as: CN112076157A

Abstract

本发明采用薄膜水合法结合超声制备拉帕醇纳米脂质体。本方法采用脂质体作为载体，以二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇2000对此脂质体进行修饰进一步合成制备了拉帕醇脂质体。本申请方法反应简单快速，无需苛刻的反应条件，原材料结构简单，便宜且方便易得，所得拉帕醇脂质体粒径小，包封率高，具有显著的肝组织和脑组织的靶向性，本发明的脂质体可运用于抗脑胶质瘤和抗肝损伤的生物医药科学领域。

Description

拉帕醇纳米脂质体制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种拉帕醇脂质体的合成方法及其在抗脑胶质瘤与抗肝损伤方面的应用，属于材料和生物医药科学领域。

背景技术

拉帕醇，黄色晶体，属于α(1,4-)型萘醌类化合物。其独特的α-萘醌环决定了其物理化学性质和生物药效作用。研究表明，拉帕醇具有多种药理学作用：抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒和抗肿瘤作用等。然而药动学研究显示，拉帕醇具有半衰期短，生物利用度低、脑组织靶向性差和存留时间短等药动学特点，这在很大程度上限制了拉帕醇的临床应用。因此研发一种能够高效靶向目标组织，延长体循环时间，降低对正常组织毒性的新剂型是拉帕醇研发的新策略。

脂质体(liposomes)是由磷脂和胆固醇构成的人工双层膜微型泡囊体，因其与细胞膜结构相似，具有很好的生物相容性。实验证明，脂质体可促使药物大分子顺利通过细胞膜，促进药物的渗透吸收，适当的表面修饰使它对特定器官或病灶具有明显的靶向作用，故脂质体是一种良好的纳米载药递送系统。文献报导，经聚乙二醇(PEG)修饰的脂质体可以极大地延长药物在体内的存留时间，明显提高药物的生物利用度，降低对正常组织的暴露，进而提高药物临床疗效，减少毒副作用。

发明内容

本发明实验证明，拉帕醇对恶性胶质瘤有增殖抑制作用，对肝脏损伤模型具有保护作用，且具有作用确切、毒副作用低、价格适宜等特点。

本发明的目的是采用薄膜水化法结合超声制备拉帕醇纳米脂质体，并在抗恶性胶质瘤的增殖抑制作用和抗肝损伤方面的应用。实验证明，拉帕醇脂质体对恶性胶质瘤有增殖抑制作用，对乙酰氨基酚引起肝脏损伤具有保护作用，且具有作用确切、毒副作用低、价格适宜等特点。

为实现上述目的，本试验采用的技术方案是将卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000-Mal以及拉帕醇溶于二氯甲烷中混合，薄膜水化法结合探头超声，然后采用过滤膜的方法纯化样品，除去反应体系中未包裹进脂质体的拉帕醇，得到最终产物。所得拉帕醇脂质体的粒径小，Zeta 电位较大，体系稳定，包封率高，具有良好的缓释能力，已显著地提高了拉帕醇的血浆半衰期和生物利用度；可显著地靶向肝组织和脑组织，可用于肝损伤和脑胶质瘤疾病的预防治疗。

具体实施方法

1.本发明的一个目的是提供一种制备拉帕醇脂质体的方法，包括以下步骤：将卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG₂₀₀₀-Mal以及拉帕醇溶于二氯甲烷中混合，薄膜水化法结合探头超声。

具体的，所述卵磷脂为大豆来源的；

具体的，所述合成的时间为20分钟；所述加热的温度为40℃；

具体的，所述卵磷脂与所述拉帕醇的摩尔比为20:1-100:1；优选100:1；

具体的，所述卵磷脂与所述胆固醇的摩尔比为8:1-32:1；优选16:1；

具体的，所述卵磷脂与所述DSPE-PEG₂₀₀₀-Mal的摩尔比为34:1-102:1；优选34:1；

具体的，所述探头超声时间为5-15分钟；优选15分钟；

具体的，所述滤膜孔径为100-450nm；优选220nm。

2.本发明的另一个目的是提供所述方法制备得到的得到一种粒径小于100nm，包封率大于 90％的拉帕醇脂质体。

具体的，所述拉帕醇脂质体的粒径范围为85.92±2.35nm；Zeta为-40.70±9.20mV；包封率为92.52±1.81％。

3.本发明的再一个目的是提供所述的拉帕醇脂质体在抗脑胶质瘤和抗肝损伤方面的应用。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

具体实施方式

下面通过具体实例对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于此。

实施例1、拉帕醇脂质体的合成和表征

称取910mg卵磷脂、67.2mg胆固醇、227.5mgDSPE-PEG₂₀₀₀-Mal和7mg拉帕醇溶于适量二氯甲烷中混匀，转速为120r/min，在40℃下减压旋蒸20分钟后，加入生理盐水进行水化，待水化完全后探头超声15分钟，所得澄清透亮的脂质体溶液过220nm滤膜进行纯化，然后得到拉帕醇脂质体。

取适量浓度拉帕醇脂质体，用纯水稀释到20μg/mL左右，Nano S90测定其粒径的大小、PdI、 Zeta电势，每个平行3份。另取适量拉帕醇脂质体溶液进行稀释，滴至带有碳支持膜的铜网片上，置于真空干燥箱干燥7天。应用JEM-2010透射电子显微镜(加速电压为80kV)观察拉帕醇脂质体的形貌和尺寸。

实施例2、拉帕醇脂质体抗肝损伤的作用

取小鼠肝原代细胞以8*10³个/ml的密度培养于96孔板中，培养12h，然后将培养基换为含有不同浓度拉帕醇和拉帕醇脂质体的新鲜培养基，继续培养2h，然后加入17mM的对乙酰氨基酚刺激，22h后将培养基换位5mg/mL的MTT溶液孵育3h，弃去旧液加入150mL 的DMSO，低速震荡10分钟后570nm下检测吸光度以检测细胞活性。

1.材料和方法

1.1试剂配制

标准品拉帕醇由Sigma公司提供。拉帕醇为浅黄色针状结晶，精密称取拉帕醇4.84mg置于1mL容量瓶中，以DMSO充分溶解配制成10mM的母液。给药浓度为用DMEM培养基将母液稀释而成，所需浓度为2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.080和0μM。制备拉帕醇脂质体，用PBS水化过200nm滤膜制成母液，给药浓度为用DMEM培养基将母液稀释而成，所需浓度为2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.080和0μM。

1.2方法

取ICR小鼠，20％乌拉坦麻醉，腹部向上将小鼠固定于工作平台上，75％酒精消毒腹部和胸部。下腹部开口，剪开表皮和肌层，避免刺伤任何脏器，开腹至膈肌，充分暴露肝门静脉和下腔静脉，取肝门静脉穿刺，先取I液灌流，流速适当，灌流7min后换II液，稍降低流速，灌流23min，至肝脏质软可折叠，剪下，撕下被膜，抖落细胞，空白DEME重悬，过70 目细胞筛，细胞400rpm离心3min。弃上清，加入空白DEME，400rpm离心2min，重复2 次。完全培养基重悬，即得小鼠肝实质细胞(HPCs)，以8000个细胞/孔的密度种板于鼠尾胶原预先铺板的96孔板中置于培养箱中在37℃、5％CO₂条件下全湿培养。

3h后取出HPCs细胞，弃去旧液，加入用DMEM培养基稀释为所需给药浓度梯度：2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.080、0μM的拉帕醇和拉帕醇脂质体；每孔加入药100μL。给药后继续在37℃、5％CO2条件下培养2h后，加入17mM对乙酰氨基酚100μL刺激肝细胞，22h后弃去旧液，每个细胞的每个浓度设3个复孔，同时设置空白对照组；每孔100μL DMEM培养基加入20μL MTT(5mg/mL)溶液，37℃、5％CO2孵育3h后，弃去旧液，每孔加入150μLDMSO溶解甲瓒，使用酶联免疫检测仪在570nm下检测吸光度OD值。

2.数据统计学处理

所有数据用mean±SD表示，统计学分析采用SPSS19.0分析软件。以空白对照组吸光度 OD值为100％，以给药组吸光度OD值与空白对照组吸光度OD值之间的比率反映药物对细胞的存活率。所有数据均通过正态性检验，P＜0.05表示有显著性差异。细胞存活率的计算公式为：

实施例3、拉帕醇脂质体对恶性胶质瘤C6细胞的增殖抑制作用

将C6胶质瘤细胞以4*10³个/ml的密度培养于96孔板中，培养8h，然后将培养基换为含有不同浓度拉帕醇和拉帕醇脂质体的新鲜培养基，继续培养48h，然后将培养基换位5mg/mL的MTT溶液孵育继续3h，弃去旧液加入150mL的DMSO，低速震荡10分钟后570nm 下检测吸光度以检测细胞活性。

1.材料和方法

1.1试剂配制

标准品拉帕醇由西格玛公司提供。拉帕醇为浅黄色针状结晶，精密称取拉帕醇4.84mg置于1mL容量瓶中，以DMSO充分溶解配制成10mM的母液，给药浓度为用DMEM培养基将母液稀释而成，所需浓度为20、10、5、2、1和0.5μM。制备拉帕醇脂质体，用PBS水化过200nm滤膜制成母液，给药浓度为用DMEM培养基将母液稀释而成，所需浓度为20、10、5、2、1和 0.5μM。

1.2方法

从协和细胞中心购买胶质瘤C6细胞，用含有完全DMEM培养液在37℃、5％CO2条件下培养，隔天换液。细胞融合程度达70％以上时可进行传代。弃去旧液，用PBS洗1-2遍，加入0.25％胰蛋白酶-EDTA消化。镜下观察细胞变圆后加入完全DMEM终止消化，吹打细胞成悬液，1000rpm离心3min。弃上清，加完全DMEM重悬，调整细胞密度为3×107个/mL，接种于新的培养瓶中，37℃、5％CO₂孵箱中培养。本实验统一采用生长状态良好的胶质瘤C6细胞。

将C6细胞传代消化，离心后制成细胞悬液，调整细胞密度为4×104个/mL，每孔100μL 接种于96孔板中，在37℃、5％CO₂条件下培养。拉帕醇用DMSO溶解为100mM的储备液。 96孔板培养24h后取出，弃去旧液。用DMEM培养基稀释为所需给药浓度梯度：20、10、5、 2、1和0.5μM；每种细胞的每个浓度设3个复孔，同时设置空白对照组；每孔加入药100μL。给药后继续在37℃、5％CO₂条件下培养48h后弃去旧液，每孔100μL完全DMEM加入20μL MTT溶液，37℃、5％CO2孵育3h后，弃去旧液，每孔加入150μL的DMSO溶解甲瓒，使用酶联免疫检测仪在570nm下检测吸光度OD值。

2.数据统计学处理

【说明书附图】

图1为实施例1合成得到的拉帕醇脂质体的粒径强度分布图。

图2为实施例1合成得到的拉帕醇脂质体的Zeta电位分布图。

图3为实施例1合成得到的拉帕醇脂质体的透射电镜扫描图。

图4为实施例2所得拉帕醇脂质体抗肝损伤的作用效果。

图5为实施例3所得拉帕醇脂质体对C6胶质瘤细胞的抑制效果。

实施例1拉帕醇脂质体的合成和表征

1、Nano S90检测

如图1所示。所得拉帕醇脂质体分布均匀，粒径范围为85.92±2.35nm。

如图2所示。所得拉帕醇脂质体电势分布均匀，Zeta potential为-40.70±9.20mV。

2、透射电镜扫描

如图3所示。所得拉帕醇脂质体为球体，双层膜结构，大小分布均匀，20nm左右。

拉帕醇脂质体的生物学用途

实施例2拉帕醇脂质体抗肝损伤的作用

如图4所示。拉帕醇及其脂质体对对乙酰氨基酚诱导的肝细胞损伤有明显的抑制作用。与正常组相比，拉帕醇和拉帕醇脂质体对对乙酰氨基酚引起的肝细胞损伤均有一定程度的抑制保护作用。通过Two-way ANOVA并以Bonferroni作后检验，当拉帕醇的浓度≥0.31μM时，拉帕醇脂质体给药组的肝细胞活性明显高于拉帕醇溶液组，结果具有统计学差异(P<0.05)。说明与拉帕醇原料药相比，拉帕醇脂质体能够更好的起到抑制由对乙酰氨基酚引起的肝细胞损伤的效果。

实施例3拉帕醇脂质体对恶性胶质瘤C6细胞的增殖抑制作用

如图5所示。拉帕醇对C6细胞的增殖有抑制作用，且拉帕醇脂质体对C6细胞的增殖抑制效果更为显著(P<0.01)。经计算拉帕醇和拉帕醇脂质体对C6细胞的IC50 是分别为6.40和3.30μM，有明显的剂量依赖效应，提示拉帕醇脂质体对C6细胞的增殖抑制效果强于拉帕醇原料药(P<0.001)。说明与拉帕醇原料药相比，拉帕醇脂质体能够更好地抑制C6细胞的增殖。

Claims

1.拉帕醇脂质体的制备方法,其特征在于，包括如下步骤：将卵磷脂和胆固醇溶液混合通过薄膜水化法结合超声合成的脂质体作为载体，将拉帕醇包裹进脂质体中，用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG₂₀₀₀-Mal)对拉帕醇脂质体进行修饰，生理盐水进行水化后过滤膜，得到一种粒径小于100nm的拉帕醇脂质体。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述卵磷脂为大豆来源的。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述溶液的溶剂为二氯甲烷。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述卵磷脂和胆固醇、卵磷脂和拉帕醇之间的摩尔比具有一定的范围，卵磷脂和胆固醇摩尔比范围是8:1～32:1，卵磷脂和拉帕醇摩尔比范围是20:1～100:1。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述卵磷脂和DSPE-PEG₂₀₀₀-Mal之间的摩尔比具有一定的范围，摩尔比范围是34:1～102:1。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述超声方法为在冰水浴中的探头超声，时间为5-15分钟，功率为200W。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述滤膜孔径为0.22μm。

8.权利要求1-7任一项所述的制备方法制备的拉帕醇纳米脂质体在制备防治恶性胶质瘤的药物中的应用。

9.权利要求1-7任一项所述的制备方法制备的拉帕醇纳米脂质体在制备防治肝损伤的药物中的应用。