CN105796593B - 一种rgd肽与穿膜肽r8共修饰麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种RGD肽与穿膜肽R8共修饰麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体，由麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体、RGD环肽及穿膜肽R8在水浴中孵育后制备而得；所述麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体，由麦角甾醇脂质体、顺铂溶液为原料制成；所述麦角甾醇脂质体由麦角甾醇8‑15wt％和脂质体85‑92％制成，所述脂质体由卵磷脂与胆固醇组成。本发明采用麦角甾醇部分代替顺铂发挥功效，在保证抗肺癌效果的同时，显著降低药物的毒副作用，对人体的伤害小，同时具有RGD肽与穿膜肽R8作为靶头，靶向性好，药物发挥效果好。

Description

一种RGD肽与穿膜肽R8共修饰麦角甾醇联合顺铂主动载药脂 质体
技术领域
本发明涉及一种治疗肺癌的药物，特别涉及一种RGD肽与穿膜肽R8共修饰麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体。
背景技术
牛樟芝中主要含有多糖、三萜类化合物、蛋白质、维生素、微量元素等化学成分，另外，还有超氧岐化酶(SOD)、腺苷、核酸、凝集素、氨基酸、固醇类、木质素、血压稳定物质等。三萜类化合物被认为是牛樟芝苦味的只要来源之一，存在于菌丝体和子实体中。到目前为止，发现了近30种三萜类化合物，主要为羊毛甾烷和麦角甾烷两大母体结构。
牛樟芝最早被人食用是用来缓解宿醉和治疗肝部疾病，近年来也被广泛研究，进一步对牛樟芝抗肝癌、保肝作用进行了确认。牛樟芝研究的另一个热点是牛樟芝的抗肿瘤作用，除了肝癌，还包括乳腺癌、结肠癌、口腔癌等。徐泰浩等人对1992-2010年台湾樟芝相关硕博论文进行了概括分析发现，对牛樟芝的生物活性研究可分为24类，研究最多的前5类依次排序为：(1)抗肿瘤，(2)保肝，(3)抗氧化，(4)免疫调节，(5)抗发炎，显示了牛樟芝主要的药理活性，另外，牛樟芝对心脑血管疾病、降血糖、降血脂等方面也显示了一定的药理活性。虽然现有技术报道了牛樟芝可以抗肝癌、乳腺癌、结肠癌、口腔癌等，但是并未发现其具有良好的抗肺癌作用，此外，虽然认知到牛樟芝具有抗癌作用，但是，由于牛樟芝成分复杂，人们并未清楚具体何种成分在发挥针对性的抗癌作用，这极大阻碍了抗癌药物的研究。
脂质体是一种类似生物膜结构的脂质双分子层微小囊泡。目前制备方法主要有被动载药法与主动载药法两大类，主动载药法因其对两亲性药物脂质体的包封率高、渗漏少，克服了被包裹药物的早期突释和泄露，特别具有临床价值。
顺铂(CDDP)是一种重金属铂的络合物，为双官能团烷化剂，化学名为：顺式-二氯二氨铂(II)，为黄色粉末状结晶，在水中微溶，不溶于乙醇等一般有机溶剂，溶于二甲基甲酰胺。它首次在1845年由M.Peyrone合成，1978年美国FDA批准其用于临床治疗癌症。顺铂的发现带动了金属配合物在医学领域的发展，对于癌症治疗具有革命性的意义。其抗癌作用特点有：(1)为高效广谱的抗肿瘤药，可与作用靶点DNA形成CDDP-DNA复合物而发挥作用，属细胞周期非特异性药物。对肿瘤抑制率为61％～98％，尤其对实体瘤和对一般化疗药不甚敏感的肿瘤疗效较为显著；(2)不仅能杀伤肿瘤细胞，抑制细胞修复，还具有较强的放疗增敏作用；(3)与多种抗肿瘤药物有协同作用，其毒性谱也与它们有不同，且无交叉耐药性，因此易与其它抗肿瘤药配伍，既有利于临床的联合用药，还可逆转联合化疗的毒性。因此，长期以来顺铂在抗癌药中地位显著。
但是，目前临床所用顺铂制剂，如中国药典2010版和欧洲药典2001收载的注射用顺铂，英国药典2000版收载的注射用顺铂和顺铂注射剂，均为对癌组织、癌细胞没有选择性的普通注射剂，药物的生物利用度低，毒副作用大。其存在的问题主要表现为：(1)严重毒副作用：顺铂及其代谢产物主要从肾脏排泄，故肾毒性大。另有胃肠道毒性、耳毒性及神经毒性等也不可忽视；(2)对某些癌细胞活性较低，如乳腺癌、结肠癌等；(3)易产生耐药性；(4)仅微溶于水，性质不稳定，见光分解，其水溶液在室温中放置后会发生水解而失效，并转变为有毒却无抑瘤作用的反铂。鉴于近年来肺癌发病率、死亡率均高居各类癌症之首，且比例仍在继续升高，如何减小顺铂的毒副作用成为亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种RGD肽与穿膜肽R8共修饰麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体，采用麦角甾醇部分代替顺铂发挥功效，在保证抗肺癌效果的同时，显著降低药物的毒副作用，对人体的伤害小，同时具有RGD肽与穿膜肽R8作为靶头，靶向性好，药物发挥效果好。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种RGD肽与穿膜肽R8共修饰麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体，由麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体、RGD环肽及穿膜肽R8在水浴中孵育后制备而得；所述麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体，由麦角甾醇脂质体、顺铂溶液为原料制成，其中，麦角甾醇与顺铂的质量比控制为1:1-4:1；所述麦角甾醇脂质体由麦角甾醇8-15wt％和脂质体85-92％制成，所述脂质体由卵磷脂与胆固醇组成，卵磷脂与胆固醇的摩尔比为3:1-6:1；RGD环肽及穿膜肽R8用量控制为RGD环肽：穿膜肽R8：胆固醇的摩尔比为0.07:0.07:1。
发明人经过长期研究，意外发现麦角甾醇具有明显的抗肺癌作用，且细胞毒性低，对人体的伤害小。而单纯的麦角甾醇在进入人体后并不能有效直达病灶，因此，将麦角甾醇包封于脂质体，使其能到达病灶发挥功效，脂质体的靶向性，使得麦角甾醇能更好发挥抗肺癌作用。顺铂虽然抗癌效果较好，但是其存在极大的毒副作用，这大大限制了顺铂的应用，麦角甾醇为植物中天然存在的化合物，细胞毒性小，本发明采用新发现具有较好抗癌效果且低毒性的麦角甾醇部分代替顺铂，联合顺铂协同发挥作用，在保证抗肺癌效果的同时，显著降低药物的毒副作用，对人体的伤害小，且具有靶向性。
为了更好地发挥药物的效果，使其靶向性更佳，更准确的直达病灶，本发明在麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体上再进行修饰，接上了RGD肽与穿膜肽R8靶头，使得药物具有优异的靶向性，发挥效果好。
作为优选，所述RGD环肽具体为DSPE(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)-PEG3400-c；所述穿膜肽R8具体为DSPE-PEG1000-R8。RGD环肽、穿膜肽R8可市售或自制，市售的厂商为上海强耀生物科技有限公司。
作为优选，所述RGD肽与穿膜肽R8共修饰麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体由麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体、RGD环肽及穿膜肽R8在55℃水浴中孵育1h后制备而得。
作为优选，所述麦角甾醇脂质体由麦角甾醇和脂质体制成，所述麦角甾醇脂质体中麦角甾醇的含量为10wt％，所述脂质体由卵磷脂与胆固醇组成，卵磷脂与胆固醇的摩尔比为5:1
作为优选，所述顺铂溶液的浓度为0.03-0.3mg/mL。
作为优选，所述顺铂溶液的浓度为0.15mg/mL。
作为优选，所述麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体的具体制备方法为：
(1)麦角甾醇脂质体制备：称取卵磷脂、胆固醇、麦角甾醇，加入氯仿溶解，旋转蒸发成薄膜，真空干燥，以氯化铵溶液为水化液进行水化，超声脱膜，冰浴下探头超声处理，过滤，高压挤出得麦角甾醇脂质体；
(2)氯化铵梯度形成：将麦角甾醇脂质体加入截留分子量为8000-14000Da的透析袋中，封闭透析袋，投入蒸馏水中透析2h，更换一次蒸馏水，继续透析2h；
(3)载药：顺铂与水混合制成顺铂溶液，将上一步透析后的麦角甾醇脂质体加入顺铂溶液进行孵育，麦角甾醇脂质体的加入量以满足麦角甾醇与顺铂的质量比为1:1-4:1计算，孵育温度40-60℃，孵育时间5-40min，孵育结束后得到产品。
当顺铂溶液作为水化液通过水化进行包封，发现其包封率低于10％，说明薄膜分散法不适合包封顺铂这一药物。顺铂为弱碱性药物，本发明采用氯化铵梯度法制备，包封率可达到50％以上。
氯化铵梯度法制备主动载药脂质体，主要过程为：麦角甾醇脂质体制备及氯化铵梯度形成、载药。其中，氯化铵梯度形成至为重要。其基本原理是，一定浓度的氯化铵包于脂质体内水相，通过透析除去外水相的氯化铵。在内外浓度差的推动下，由于氨分子的扩散系数远大于氯化铵，随着氨分子的扩散，脂质体内逐步质子化，从而由氯化铵梯度间接形成pH梯度。在此梯度下，顺铂在外水相以分子状态存在，跨膜能力强，内水相中以离子化状态存在，难以扩散，从而形成稳定的包封状态。
作为优选，步骤(1)中探头超声处理的参数为：超声时间20min，超声2s，停1s，超声功率900W，高压挤出的压力为400-500psi。
作为优选，步骤(3)中麦角甾醇脂质体的加入量以满足麦角甾醇与顺铂的质量比为2.5:1计算，孵育温度50℃，孵育时间10min。
作为优选，步骤(1)中氯化铵溶液的浓度为0.1-1.5mmol·L-1。
本发明的有益效果是：采用麦角甾醇部分代替顺铂发挥功效，在保证抗肺癌效果的同时，显著降低药物的毒副作用，对人体的伤害小，同时具有RGD肽与穿膜肽R8作为靶头，靶向性好，药物发挥效果好。
附图说明
图1是各脂质体透射电镜图。
图2是麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体累积释放度。
图3是原料药及脂质体的24h MTT试验结果，与相同稀释倍数的麦角甾醇顺铂脂质体组相比，**P<0.01。
图4是修饰及未修饰的脂质体的TEM图。
图5是不同pH下共修饰脂质体对肿瘤球的穿透。
图6是不同细胞摄取抑制剂的摄取抑制率，与对照组相比，**P<0.01,(n＝3)。
图7是各靶向脂质体的2h MTT试验结果。
图8是各靶向脂质体的24h MTT试验结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例：
一种RGD肽与穿膜肽R8共修饰麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体，由麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体、RGD环肽(DSPE-PEG3400-c，市售)及穿膜肽R8(DSPE-PEG1000-R8，市售)在55℃水浴中孵育1h后制备而得；所述麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体，由麦角甾醇脂质体、顺铂溶液为原料制成，其中，麦角甾醇与顺铂的质量比控制为1:1-4:1；所述麦角甾醇脂质体由麦角甾醇8-15wt％和脂质体85-92％制成，所述脂质体由卵磷脂与胆固醇组成，卵磷脂与胆固醇的摩尔比为3:1-6:1；RGD环肽及穿膜肽R8用量控制为RGD环肽：穿膜肽R8：胆固醇的摩尔比为0.07:0.07:1。所述顺铂溶液的浓度为0.03-0.3mg/mL。
麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体的制备方法，包括以下步骤：
(1)麦角甾醇脂质体制备：称取卵磷脂、胆固醇、麦角甾醇，加入氯仿溶解，旋转蒸发成薄膜，真空干燥，以氯化铵溶液(浓度为0.1-1.5mmol·L-1)为水化液进行水化，超声脱膜，冰浴下探头超声处理，过滤，高压挤出得麦角甾醇脂质体；麦角甾醇脂质体的原料组分以总和100％计配比如下：麦角甾醇5-20wt％，余量为卵磷脂和胆固醇，卵磷脂与胆固醇的摩尔比为1:1-7:1。探头超声处理的参数为：超声时间20min，超声2s，停1s，超声功率900W，高压挤出的压力为400-500psi。
(2)氯化铵梯度形成：将麦角甾醇脂质体加入截留分子量为8000-14000Da的透析袋中，封闭透析袋，投入蒸馏水中透析2h，更换一次蒸馏水，继续透析2h；
(3)载药：顺铂与水混合制成顺铂溶液，顺铂溶液的浓度为0.03-0.3mg/mL，将上一步透析后的麦角甾醇脂质体加入顺铂溶液进行孵育，麦角甾醇脂质体的加入量以满足麦角甾醇与顺铂的质量比为1:1-4:1计算，孵育温度40-60℃，孵育时间5-40min，孵育结束后得到产品。
一、麦角甾醇脂质体最佳制备工艺
1.1、单因素考察
1.1.1卵磷脂与胆固醇摩尔比考察
本实验考察了麦角甾醇载药5％时，卵磷脂与胆固醇的比例(摩尔比)，设置二者比例为1:1、3:1、5:1、7:1，其包封率分别为71.59％、89.15％、92.58％、96.62％。二者比例为1:1时，由于胆固醇的比例较高，脂质体的刚性增强，而二者为7:1时，放置后容易出现沉淀。
1.1.2探头超声时间考察
薄膜分散法制备脂质体后(称取卵磷脂、胆固醇、麦角甾醇，加入氯仿溶解，旋转蒸发成薄膜，真空干燥，水化，超声脱膜)，通过探头超声将大粒径的脂质体整粒成小粒径脂质体。本实验考察了不同探头超声时间对于麦角甾醇脂质体包封率的影响。设置探头超声时间为10min、20min、30min、40min，其包封率分别为79.45％、91.73％、95.86％、95.94％。随着时间增加，包封率随之增大，30min时包封率不再变化，且探头超声时间过长，容易导致脂质体破裂。
1.1.3麦角甾醇载药量考察
本实验考察了不同麦角甾醇载药量对包封率的影响。麦角甾醇载药量为5％、10％、15％、20％，其包封率分别为90.76％、85.81％、69.79％、73.09％。
1.2响应面试验
1.2.1星点设计
单因素试验结果表明卵磷脂与胆固醇比例、探头超声时间和载药量3个因素对麦角甾醇包封率具有显著影响。根据星点设计原理，选择卵磷脂与胆固醇比例、探头超声时间和载药量为自变量，每个自变量确定3个水平，分别用代码－1，0，1表示，共15个试验点(3个中心点)。每个试验平行3次进行。以麦角甾醇脂质体包封率为评价指标，采用星点设计(表1)优选制备工艺条件。
表1麦角甾醇脂质体制备工艺星点试验安排(n＝3)
1.2.2模型的建立与方差分析
运用Design-Expert.V 8.0.6.1软件对表中数据进行二次多元回归拟合，得自变量与因变量间的回归方程Y＝90.40+17.87X1－2.58X2+4.14X3－7.62X1X2+6.28X1X3+3.03X2X3－21.95X1 2－4.29X2 2－2.44X3 2。对该回归模型进行显著性检验。表2结果表明X1，X1 2对响应值的线性效应极显著，X2，X3，X2 2对响应值的曲面效应作用显著，交互项X1X2、X1X3作用显著。该模型的F＝82.84，P＜0.000 1，表明该二次多元回归模型极显著，回归方程相关系数(r)0.9967，说明模型能解释99.67％响应值的变化，拟合情况良好。
表2回归模型方差分析
1.2.3响应面分析
根据回归方程，在保持1个因素编码值为0时，运用Design-Expert.V8.0.6.1软件绘制另2个因素与麦角甾醇包封率关系的三维响应面图。响应面为响应值对两两交互因素所构成的三维空间曲线图，效应面曲线越陡峭，说明各自变量对响应值的影响越明显。取回归模型最大值点，对应的实测值为卵磷脂与胆固醇比例为5:1，探头超声时间为20min，麦角甾醇载药量为10％。
1.2.4验证试验
为验证模型方程的适用性，精密称取卵磷脂98mg，胆固醇10mg，麦角甾醇12mg，共3份，按以下最佳制备工艺条件进行验证试验，结果3批脂质体包封率的平均值为90.49％，RSD 2.64％，与预测值90.40％的偏差0.10％，表明建立的数学模型具有良好的预测性，优选的工艺条件重复性好。
麦角甾醇脂质体最佳制备工艺为：卵磷脂与胆固醇摩尔比5:1，麦角甾醇载药10％、探头超声20min。
具体工艺条件：卵磷脂98mg、胆固醇10mg以及麦角甾醇12mg，用10mL氯仿充分溶解后，置于40℃水浴的旋转蒸发仪上旋干，真空干燥2h，加入10mL氯化铵溶液(0.5mmol·L-1)于室温下置于水平摇床上水化30min，转速140rpm·mL-1。水化后，超声脱膜，将脂质体放置于冰浴下，探头超声20min，超声2s，停1s，超声功率900W。依次采用0.8μm、0.45μm、0.22μm微孔滤膜过滤，最后用0.1μm的聚碳酸酯膜高压挤出(压力为400-500psi)，即得。
二、麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体最佳制备工艺考察
2.1单因素试验
2.1.1麦角甾醇/顺铂质量比的考察
本实验考察了麦角甾醇与顺铂的质量比，相当于顺铂在脂质体中的载药量，按1.2.4制备最佳工艺麦角甾醇脂质体后，将麦角甾醇脂质体加入截留分子量为8000-14000Da的透析袋中，封闭透析袋，投入蒸馏水中透析2h，更换一次透析液(蒸馏水)，继续透析2h。按麦角甾醇脂质体与不同浓度顺铂溶液混合进行孵育，设置二者的质量比为0.313:1、0.625:1、1.25:1、2.5:1、5:1，结果显示当麦角甾醇与顺铂的质量比为2.5:1时，顺铂的包封率最大，达到35.33％。
2.1.2孵育时间的考察
本实验考察了顺铂溶液孵育时间分别为5、10、20、40min时的包封率，结果显示当孵育时间为20min时，顺铂包封率为最大，31.07％。
2.1.3孵育温度的考察
本实验考察了40、50、60、80℃温度对于顺铂包封率的影响，结果显示50℃与80℃时的包封率最大，但是过高的温度会导致卵磷脂发生氧化而产生溶血性。
2.2正交试验
在单因素试验考察的基础上，采用三因素三水平正交设计优化麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体，选用L9(34)正交表安排试验。选择孵育时间、孵育温度、顺铂浓度3个因素作为考察因素确定最佳麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体制备工艺。正交设计因素水平表见，正交设计试验方案及实验结果分析见表3，表4。
表3L9(34)正交表
表4L9(34)实验计划表
采用单指标正交设计试验结果的极差分析法。结果表明：各因素对顺铂包封率的影响程度为C>A>B，最佳组合为麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体最佳工艺为A1B3C1，即顺铂浓度为0.150mg·mL-1，孵育温度70℃，孵育时间10min。考虑到70℃位于大豆卵磷脂的相变温度以上，且孵育温度这一因素对包封率的影响不大，因此将最佳工艺调整为顺铂浓度为0.150mg·mL-1，孵育温度50℃，孵育时间10min，对调整前后的最佳工艺进行验证。
2.3正交试验验证
按正交试验最佳工艺及调整后最佳工艺分别制备3批麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体，通过超滤法对顺铂包封率、平均粒径、Zeta电位进行测定。3批脂质体平均包封率结果分别为49.04％及52.24％。表5、表6结果表明，最佳工艺及调整后最佳工艺的包封率、平均粒径、Zeta电位均无显著性差异，因此，后续实验采用调整后最佳工艺，即顺铂浓度0.150mg·mL-1，孵育温度50℃，孵育时间10min进行麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体的制备。
表5最佳工艺验证结果
表6调整后最佳工艺验证结果
三、麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体质量评价
3.1形态观察
3.1.1外观形态
麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体溶液呈乳白色，色泽均匀。
3.1.2显微形态
采用负染法制备样品。在室温条件下，取麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体，蒸馏水稀释至略显浑浊，滴至专用230目铜网上，滤纸吸干多余脂质体，静置1min。用1％磷钨酸负染，静置40s，使粒子在铜网上沉积，用滤纸吸取铜网边缘多余染液，自然挥干，电镜观察并照相。图1的结果表明，各脂质体形态圆整，粒径分布均匀。
3.1.3包封率与载药量
3批麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体中，其中麦角甾醇的平均包封率为90.49％，载药量为0.1401mg·mL-1；顺铂的平均包封率为52.24％，载药量为0.1382mg·mL-1。
3.1.4粒径及其分布
室温条件下，取麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体，稀释20倍，注入样品池，激光粒度仪测定平均粒径及其分布。结果表明，空白脂质体的平均粒径为145.8nm，多分散系数PDI为0.168，小于0.3，麦角甾醇脂质体的平均粒径为131.4nm，PDI为0.152，小于0.3，麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体的平均粒径为112.5，PDI为0.208，小于0.3，可见两者的粒径分布较集中。
3.1.5Zeta电位测定
室温条件下，取麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体，稀释20倍，Zeta电位仪测定Zeta电位。结果空白脂质体的Zeta电位为-18.6mV，麦角甾醇脂质体的Zeta电位为-23.4mV，麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体的Zeta电位为-5.42mV，脂质体带负电。
3.1.6pH值测定
室温条件下，取麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体，稀释后，用酸度计测定pH值。测定3批样品的平均pH值为6.64。
3.1.7麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体过氧化值(POV)的测定
磷脂分子中含有不饱和脂肪酸链，化学性质不稳定，易氧化水解，使膜流动性降低，药物渗漏加快，生成过氧化产物，如丙二醛、脂肪酸等，会对人体产生毒性。丙二醛(MDA)在酸性条件下可与硫代巴比妥酸反应，生成的红色产物(TBA-pigment)，在535nm处有吸收，测定其吸收值即可得出丙二醛含量，从而可以考察磷脂的氧化程度。本实验采用丙二醛测定法考察脂质体的氧化程度。
精密吸取脂质体1mL，置于10mL离心管中，加入TTH试液(三氯醋酸30g，2-硫代巴比妥酸0.75g，加入0.25mol·L-1盐酸200mL，温热至溶解，放冷后滤过)5mL，混匀，置100℃水浴加热30min，冷却至室温，加入4.0mL TTH试液，混匀后以4000rpm·min-1离心10min。吸取上清液，以TTH试液为空白对照，于535nm波长处测定吸光度值，记作过氧化值。平行测定3批样品，平均过氧化值为0.1095(表7)。
表7脂质体过氧化值结果(POV)
3.1.8释放度试验
由于麦角甾醇的脂溶性较强，在释放介质中的溶解度很小，因此本实验仅考察水溶性药物顺铂的释放度。分别精密吸取麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体1mL，及顺铂原料药溶液1mL，置于透析袋中，两端用透析夹夹紧。由于顺铂在无钠或低钠的溶液中不稳定，易水解成无抗癌作用成分反铂，因此释放介质选择100倍0.9％NaCl溶液，置于恒温水浴振荡器中，振摇速率为100rpm·min-1，释放温度为37℃，分别于第0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24h吸取透析液1mL，并补充1mL 37℃的0.9％NaCl新鲜透析介质。将各取样点样品采用0.45μm的微孔滤膜过滤后进样分析。通过HPLC进样，测定峰面积，代入线性回归方程计算各取样点下顺铂的释药浓度，计为c1，顺铂总药量记为M0。
按照如下公式进行计算：累积释放百分率(％)
其中，c1为各取样点中顺铂释放的浓度，V0为释放介质体积，V为取样体积，M0为麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体中含有的顺铂总量。《中国药典附录制剂通则》关于脂质体突释效应的要求：开始0.5h的释放量应≤40％，该麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体符合该要求，且24h的累积释放百分率超过80％，符合要求(图2)。
四、麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体细胞摄取试验
定量将所制备的FITC标记的pH为7.4共修饰脂质体1640培养基混合，使得最终的稀释倍数为64、96、128。将A549细胞(市售，中国科学院生命科学研究院细胞库)接种在6孔板内，待细胞融合至80％时，将吸出旧培养基后，麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体与培养基的混合液。在37℃、5％CO2培养箱中孵育2h后将培养基吸出，用PBS漂洗3次，胰酶消化收集细胞，加入PBS洗3遍，离心去除上清，最后加入0.5mL PBS重悬细胞，采用BD流式细胞仪检测细胞对不同给药浓度的共修饰脂质体的摄取强度。结果见表8，由结果表明，给予麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体，随着稀释倍数的增加，细胞摄取率随之降低。
表8麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体细胞摄取
五、麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体体外细胞增殖抑制试验
本实验为了验证麦角甾醇、顺铂原料药制备成脂质体制剂后能够增强其抗肿瘤活性，采用体外培养A549肺癌细胞，给予麦角甾醇、顺铂、麦角甾醇联合顺铂原料药以及麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体制剂刺激后，测定不同浓度给药后的细胞增殖抑制率，并计算脂质体制剂对A549细胞的半数抑制率IC50值。
取对数生长期A549细胞，胰酶消化后调整细胞为1×105个·mL-1。以每孔加入100μL接种于96孔培养板，于37℃、5％CO2培养箱中培养，当细胞融合至80％后加药处理。加入不同稀释倍数的麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体及相应的麦角甾醇、顺铂、麦角甾醇联合顺铂原料药溶液，同时设置正常对照组。每个浓度各设置5个复孔，于加药后第24h后进行MTT检测。每孔加入MTT(5mg·mL-1)溶液20μL，37℃、5％CO2培养箱中孵育4h后，用酶标仪于492nm处测出各孔吸光度(OD)值。本实验平行3次测定。
图3看出，药物作用24h时，当稀释倍数为64、128、256倍时，相同稀释倍数下麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体组与其他三组相比，抑制率均明显升高，差异有极显著性，**P<0.01(n＝3)。麦角甾醇顺铂脂质体给药的IC50值为2.178+0.544μg·mL-1。说明，将麦角甾醇及顺铂制备成脂质体制剂后，能够显著得增加其体外抗肺癌作用。
六、RGD肽与穿膜肽R8共修饰麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体制备
按照麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体最佳制备工艺制备麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体，采用后插入法按照穿膜肽R8(DSPE-PEG1000-R8，上海强耀生物科技有限公司合成)：胆固醇的摩尔比为0.07:1，在55℃水浴中孵育1h后制备单纯穿膜肽R8修饰的脂质体(R8-Lip)；按照RGD环肽(DSPE-PEG3400-c，上海强耀生物科技有限公司合成)：胆固醇的摩尔比为0.07:1，在55℃水浴中孵育1h后制备单纯RGD修饰的脂质体(RGD-Lip)；按照RGD环肽(DSPE-PEG3400-c，上海强耀生物科技有限公司合成)：穿膜肽R8(DSPE-PEG1000-R8，上海强耀生物科技有限公司合成)：胆固醇的摩尔比为0.07:0.07:1，在55℃水浴中孵育1h后制备共修饰脂质体(RGD with R8-Lip)。对于FITC标记的脂质体，将适量的FITC甲醇溶液加入至脂质材料中共同旋蒸形成薄膜，通过荧光分光光度计测定不同荧光物质FITC的浓度对细胞摄取率的影响，结果见表9。确定脂质体中FITC终质量浓度为25μg·mL-1。
表9不同荧光物质FITC浓度对细胞摄取率的影响
**P<0.01,各组间均有显著性差异。
七、RGD肽与穿膜肽R8共修饰麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体的质量评价
7.1显微形态
采用负染法制备样品。在室温条件下，取麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体，蒸馏水稀释至略显浑浊，滴至专用230目铜网上，滤纸吸干多余脂质体，静置1min。用1％磷钨酸负染，静置40s，使粒子在铜网上沉积，用滤纸吸取铜网边缘多余染液，自然挥干，电镜观察并照相(图4)。结果表明，各脂质体形态较圆整，具有双层结构，粒径分布均匀。
7.2粒径及其电位考察
室温条件下，取无修饰、RGD修饰、R8修饰、RGD与R8共修饰脂质体，稀释20倍，注入样品池，激光粒度仪测定平均粒径及其分布。结果表明，无修饰脂质体的平均粒径为153.4nm，多分散系数PDI为0.156，小于0.3，RGD修饰脂质体的平均粒径为156.7nm，PDI为0.164，小于0.3，R8修饰脂质体的平均粒径为154.3nm，PDI为0.178，小于0.3，RGD与R8共修饰脂质体的平均粒径为155.2nm，PDI为0.102，小于0.3，可见各脂质体的粒径分布较集中。
八、共修饰脂质体的肿瘤球穿透能力考察
由于体内肿瘤部位组织为多层细胞，为了模拟其体内微环境，本发明考查了不同pH条件下共修饰脂质体对肿瘤球的穿透能力。在培养液中加入20μg·mL-1B27无血清培养基、20ng·mL-1EGF与bFGF(市售)，每隔3d半量换液。将pH 6.0及pH 7.4的共修饰脂质体与培养基的混合液加至含有肿瘤球的6孔板中，与肿瘤球共孵育2h后，吸出肿瘤球，离心收集肿瘤球，用PBS漂洗3次，加入终质量浓度为1μg·mL-1的Lyso-Tracker Red(市售)，使其与细胞共孵育30min后，离心弃去培养基，用PBS漂洗3次，4％多聚甲醛固定30min后，离心弃去上清，PBS漂洗3遍，加入1μg·mL-1的DAPI溶液(市售)染色5min，离心弃去上清，PBS漂洗3次，将肿瘤球加在多聚赖氨酸处理的载玻片上，10％甘油-PBS溶液封片。采用FV 1000激光共聚焦显微镜观察共修饰脂质体对肿瘤球的穿透能力。由图5可见，其对肿瘤球的穿透能力呈显著的pH依赖性。在pH 6.0的孵育条件下，相较于pH 7.4的孵育条件下共修饰脂质体对肿瘤球的穿透能力显著性增强。
九、A549细胞对共修饰脂质体摄取的考察
流式细胞仪测定摄取率
定量将所制备的FITC标记的pH为7.4共修饰脂质体与1640培养基(市售)混合，使得最终的稀释倍数为64、96、128。将A549细胞接种在6孔板内，待细胞融合至80％时，将吸出旧培养基后，加入未修饰、RGD修饰、R8修饰、共修饰脂质体与培养基的混合液。在37℃、5％CO2培养箱中孵育2h后将培养基吸出，用PBS漂洗3次，胰酶消化收集细胞，加入PBS洗3遍，离心去除上清，最后加入0.5mL PBS重悬细胞，采用BD流式细胞仪检测细胞对不同给药浓度的共修饰脂质体的摄取强度。结果见表10，由结果表明，给予共修饰脂质体，细胞摄取的荧光强度明显高于未修饰及仅采用RGD或R8修饰脂质体。
表10RGD、R8修饰麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体细胞摄取
十、共修饰脂质体摄取机制的考察
将A549接种于6孔板中，在37℃、5％CO2下培养至细胞融合80％左右，分别加500μg·mL-1的细胞摄取抑制剂氯氮平、秋水仙素和叠氮钠，其中氯氮平为陷穴蛋白介导的内吞途径抑制剂，秋水仙素为巨胞饮途径抑制剂，叠氮钠为能量依赖型的内吞途径抑制剂。与细胞共孵育30min后再将RGD与R8共修饰脂质体与培养基的混合液加至6孔板中，2h后吸出培养基，用PBS漂洗3次，胰酶消化，离心后用0.5mL PBS重悬细胞，采用流式细胞仪检测加入不同抑制剂后A549细胞对共修饰脂质体摄取的程度，从而考察共修饰脂质体的摄取入胞机制。图6结果表明，共修饰脂质体可通过多种途径入胞，其中主要为能量依赖型(叠氮钠)的内吞途径及巨胞饮途径(秋水仙素)。
十一、共修饰脂质体对A549细胞增殖抑制的影响
取对数生长期A549细胞，胰酶消化后调整细胞为1×105个·mL-1。以每孔加入100μL接种于96孔培养板，于37℃、5％CO2培养箱中培养，当细胞融合至80％后加药处理。加入不同稀释倍数的共修饰脂质体，同时设置正常对照组每个浓度各设置5个复孔，分别于加药后第2h及24h后进行MTT检测。每孔加入MTT(5mg·mL-1)溶液20μL，37℃、5％CO2培养箱中孵育4h后，用酶标仪于492nm处测出各孔吸光度(OD)值。药物作用2h时，R8修饰及RGD与R8共修饰脂质体在稀释2、4、8、16、32倍的药物浓度下的肿瘤细胞增殖抑制率高于未修饰及RGD修饰脂质体(图7)。当作用时间延长至24h时，稀释倍数为2、4、8倍时各组抑制率几乎无差别，均在90％以上。稀释倍数为16和32时，各组的抑制情况与2h时相同(图8)。
结果显示，穿膜肽R8和RGD肽可以高效的介导共修饰脂质体入胞释放麦角甾醇与顺铂药物，从而使共修饰脂质体具有更强的靶向性，使麦角甾醇与顺铂药物发挥更好的抑制肿瘤作用。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (10)

1.一种RGD肽与穿膜肽R8共修饰麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体，其特征在于：由麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体、RGD肽及穿膜肽R8在水浴中孵育后制备而得；所述麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体，由麦角甾醇脂质体、顺铂溶液为原料制成，其中，麦角甾醇与顺铂的质量比控制为1∶1-4∶1；所述麦角甾醇脂质体由麦角甾醇8-15wt％和脂质体85-92％制成，所述脂质体由卵磷脂与胆固醇组成，卵磷脂与胆固醇的摩尔比为3∶1-6∶1；RGD肽及穿膜肽R8用量控制为RGD肽∶穿膜肽R8∶胆固醇的摩尔比为0.07∶0.07∶1。
2.根据权利要求1所述的一种RGD肽与穿膜肽R8共修饰麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体，其特征在于：所述RGD肽具体为DSPE-PEG3400-c；所述穿膜肽R8具体为DSPE-PEG1000-R8。
3.根据权利要求1所述的一种RGD肽与穿膜肽R8共修饰麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体，其特征在于：所述RGD肽与穿膜肽R8共修饰麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体由麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体、RGD肽及穿膜肽R8在55℃水浴中孵育1h后制备而得。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种RGD肽与穿膜肽R8共修饰麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体，其特征在于：所述麦角甾醇脂质体由麦角甾醇和脂质体制成，所述麦角甾醇脂质体中麦角甾醇的含量为10wt％，所述脂质体由卵磷脂与胆固醇组成，卵磷脂与胆固醇的摩尔比为5∶1。
5.根据权利要求1或2或3所述的一种RGD肽与穿膜肽R8共修饰麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体，其特征在于：所述顺铂溶液的浓度为0.03-0.3mg/mL。
6.根据权利要求5所述的一种RGD肽与穿膜肽R8共修饰麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体，其特征在于：所述顺铂溶液的浓度为0.15mg/mL。
7.根据权利要求1或2或3所述的一种RGD肽与穿膜肽R8共修饰麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体，其特征在于：所述麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体的具体制备方法为：
(1)麦角甾醇脂质体制备：称取卵磷脂、胆固醇、麦角甾醇，加入氯仿溶解，旋转蒸发成薄膜，真空干燥，以氯化铵溶液为水化液进行水化，超声脱膜，冰浴下探头超声处理，过滤，高压挤出得麦角甾醇脂质体；
(2)氯化铵梯度形成：将麦角甾醇脂质体加入截留分子量为8000-14000Da的透析袋中，封闭透析袋，投入蒸馏水中透析2h，更换一次蒸馏水，继续透析2h；
(3)载药：顺铂与水混合制成顺铂溶液，将上一步透析后的麦角甾醇脂质体加入顺铂溶液进行孵育，麦角甾醇脂质体的加入量以满足麦角甾醇与顺铂的质量比为1∶1-4∶1计算，孵育温度40-60℃，孵育时间5-40min，孵育结束后得到产品。
8.根据权利要求7所述的一种RGD肽与穿膜肽R8共修饰麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体，其特征在于：步骤(1)中探头超声处理的参数为：超声时间20min，超声2s，停1s，超声功率900W，高压挤出的压力为400-500psi。
9.根据权利要求7所述的一种RGD肽与穿膜肽R8共修饰麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体，其特征在于：步骤(3)中麦角甾醇脂质体的加入量以满足麦角甾醇与顺铂的质量比为2.5∶1计算，孵育温度50℃，孵育时间10min。
10.根据权利要求7所述的一种RGD肽与穿膜肽R8共修饰麦角甾醇联合顺铂主动载药脂质体，其特征在于：步骤(1)中氯化铵溶液的浓度为0.1-1.5mmol·L-1。
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