CN112618491A - 麦角甾醇联合阿法替尼脂质体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种麦角甾醇联合阿法替尼脂质体的制备方法，属于药物制剂技术领域。麦角甾醇联合阿法替尼脂质体的制备方法，包括以下步骤：称取卵磷脂SPC、胆固醇Chole、麦角甾醇ERG，用氯仿溶解后旋转蒸发成薄膜，水化后经探头超声和高压挤出，透析后加入阿法替尼Afa柠檬酸溶液在45~60℃下，孵育5~15 min，制备得到麦角甾醇联合阿法替尼脂质体ERG/Afa‑LIP。本发明在对第一代分子靶向药物吉非替尼与麦角甾醇联合应用的基础上，将Afa和ERG联合，共同载于脂质体中制备成双载药脂质体进行研究，优势在于：（1）可以通过协同作用或相加作用增强抗肿瘤作用；（2）可以共同递送至肿瘤部位与肿瘤细胞内发挥药效；（3）减少毒副作用的发生。
Description
技术领域
本发明涉及一种脂质体的制备方法，尤其涉及一种麦角甾醇联合阿法替尼脂质体的制备方法，属于药物制剂技术领域。
背景技术
肺恶性肿瘤是当今世界非良性肿瘤相关死亡的主要原因，对人类健康构成严重威胁。《2018年全球癌症发病率和死亡率估计》报道，预计2018年将有1810万新癌症病例和960万癌症死亡病例，其中非小细胞肺癌（non -small cell lung cancer，NSCLC）约占肺癌的85%，但75%的患者发现时已处于癌症中晚期，错过了手术治疗的最佳时期。
由于顺铂、紫杉醇类药物较长时间投入临床应用，但并没有改善患者的生存效益，出现耐药性、毒副反应，甚至危害患者的健康和生命。分子靶向药物治疗以其针对性强，副作用少的特点，应用越来越广泛。2004年，研究发现，NSCLC与表皮生长因子受体（epidermalgrowth factor receptor, EGFR）突变有关，自此肺癌的治疗进入分子靶向研究的阶段。
吉非替尼（Gefitinib）是第一代表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor, TKI），对EGFR突变的患者疗效优于化疗药物，但是患者在用药10-14个月后出现TKI耐药现象，最终导致药物的疗效降低。相关研究表明这种TKI耐药主要是由于EGFR外显子的苏氨酸-790突变为蛋氨酸，亦称T790M突变，c-Met基因扩增等引起。在前期实验研究中，本实验室采用了针对第一代分子靶向药物吉非替尼敏感的PC-9细胞以及对其耐药的A549细胞进行体外机理的研究。研究发现，不同给药时间下联合给药组对A549，PC-9细胞的抑制率相较于麦角甾醇和吉非替尼两单用组均有不同程度的提高，表明麦角甾醇与吉非替尼联用明显增强了GEF对A549与PC-9细胞的敏感性。
阿法替尼（Afatinib）是第二代不可逆EGFR酪氨酸激酶抑制剂，是德国勃林格殷格翰公司研发的EGFR和HER2双重多靶点药物，即是针对TKI继发性耐药开发所研制的，它携带一个反应性的丙烯酰胺基，是ATP竞争苯胺基衍生物，能够阻止EGFR、HER2和HER4激酶，形成共价键和不可逆价键。然而第二代靶向药物阿法替尼使用约9-13个月后也会产生耐药，失去抗肿瘤作用，严重影响了治疗效果。
目前市售阿法替尼为片剂，口服给药生物利用度较低，且不良反应较多，最常见的是胃肠道的不良反应，不降反应较严重者需要采取中断给药或减少剂量的措施。为提高患者的生命质量，减小耐药现象的发生，使其更好的发挥药效，开发一种具有靶向性、生物利用度高、不良反应少的阿法替尼新型制剂势在必行。
考虑到药物的不同物理化学和药代动力学特性，如溶解度，半衰期等，简单的独立给药不能达到预期的效果。因此，需要药物共同递送系统来解决这些问题。
发明内容
本发明要解决上述问题，从而提供一种麦角甾醇联合阿法替尼脂质体的制备方法。脂质体是Afa与ERG的有效载体，所以选择脂质体作为药物递送系统。本发明在对第一代分子靶向药物吉非替尼与麦角甾醇联合应用的基础上，为了能够针对肺癌有进一步的研究，考虑将Afa和ERG联合，共同载于脂质体中制备成双载药脂质体进行研究，优势在于：（1）可以通过协同作用或相加作用增强抗肿瘤作用；（2）可以共同递送至肿瘤部位与肿瘤细胞内发挥药效；（3）减少毒副作用的发生。
本发明解决上述问题的技术方案如下：
麦角甾醇联合阿法替尼脂质体的制备方法，包括以下步骤：称取卵磷脂SPC、胆固醇Chole、麦角甾醇ERG，用氯仿溶解后旋转蒸发成薄膜，水化后经探头超声和高压挤出，透析后加入阿法替尼Afa柠檬酸溶液在45~60℃下，孵育5~15 min，制备得到麦角甾醇联合阿法替尼脂质体ERG/Afa-LIP。
作为优选，所述的麦角甾醇联合阿法替尼脂质体的制备方法，包括以下步骤：
S1：SPC与Chole摩尔比5:1，ERG载药10 %、探头超声20 min；精密称取 SPC 98 mg，Chole 10 mg，ERG 12mg，加入10 mL氯仿充分溶解，40℃旋转蒸发成薄膜后，加入10 mL的194.63 mM硫酸铵溶液置于水平摇床上水化30 min，转速140 rpm·mL-1；水化完毕，探头超声20 min，超声2 s，停1 s；依次用0.8 μm、0.4 μm、0.2 μm、0.1 μm的聚碳酸酯膜高压挤出，即得ERG-LIP；
S2：将制备好的ERG-LIP转移到截留分子量为8000~14000的透析袋中，两端用透析夹夹紧，投入100倍量超纯水中，透析2.5 h后更换透析液，继续透析2.5 h，透析2次；透析结束后，在ERG-LIP中加入等体积的浓度为0.238mg·mL-1的Afa柠檬酸溶液，在54.2℃水浴下孵育59.06 min，即得ERG/Afa-LIP。
Cyclo[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys ( Ac-CH2-SH) ]简称 RGD 环肽，是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的多肽，相对分子质量为 691.8，结构稳定，不易引起免疫反应。肿瘤细胞和新生血管内皮细胞中含高表达整合素αvβ3，RGD 环肽为整合素αvβ3 受体的识别配体，能主动靶向肿瘤部位。高效的穿肽膜 R8(RRRRRRRR)可以有效地将脂质体递送至肿瘤细胞内部，但是穿肽膜 R8 缺乏组织选择性，能够穿透所有细胞膜。鉴于穿肽膜 R8和 RGD 的优劣，利用 RGD靶向肿瘤部位的能力和穿肽膜的高效入胞能力，将两者结合共同联结于脂质体表面。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明在对第一代分子靶向药物吉非替尼与麦角甾醇联合应用的基础上，为了能够针对肺癌有进一步的研究，本发明考虑将Afa和ERG联合，共同载于脂质体中制备成双载药脂质体进行研究，优势在于：（1）可以通过协同作用或相加作用增强抗肿瘤作用；（2）可以共同递送至肿瘤部位与肿瘤细胞内发挥药效；（3）减少毒副作用的发生。
2、为了增加脂质体的靶向性，将RGD环肽与R8肽通过PEG连接在DSPE 上，修饰肽作为磷脂材料直接修饰在脂质体表面，避免其在进入人体循环系统后脱离脂质体表面，增加其对肿瘤细胞的靶向性。
附图说明
图1为ERG最大吸收波长扫描结果；
图2为阴性样品、对照品和供试品的色谱峰；
图3为ERG标准曲线；
图4为Afa最大吸收波长扫描结果；
图5为阴性样品、对照品和供试品的色谱峰；
图6为Afa标准曲线；
图7为紫外吸收检测图谱；
图8为凝胶微柱对空白脂质体与 Afa 物理混合物的分离；
图9为不同浓度的(NH4)2SO4对ERG/Afa-LIP包封率的影响；
图10为孵育时间对Afa包封率的影响；
图11为孵育温度对Afa包封率的影响；
图12为不同ERG/Afa浓度比对Afa包封率的影响；
图13为两两交互因素对Afa包封率影响的响应面图；
图14为ERG/Afa-LIP显微形态；
图15为各脂质体粒径分布；
图16为各脂质体Zeta电位；
图17为Afa和ERG/Afa-LIP在不同pH释放介质下的累积释放度；
图18为不同药物作用时间对PC-9肺癌细胞的抑制率；
图19为ERG/Afa-LIP作用于PC-9细胞的增殖抑制试验结果。
具体实施方式
以下结合附图对本发明进行进一步的解释说明。
麦角甾醇联合阿法替尼脂质体的处方优化及其质量评价
实验室前期，进行了ERG-LIP最佳制备工艺的考察。最优制备工艺如下：精密称取卵磷脂SPC 98 mg与胆固醇Chole 10 mg（摩尔比5:1），麦角甾醇ERG 12 mg（载药量为10%），用10 mL氯仿充分溶解，置40℃水浴的旋转蒸发仪上旋干，真空干燥至无氯仿味，加入10mL纯水置于水平摇床上水化30 min，转速140 rpm·mL-1。水化后，将脂质体置冰浴下，探头超声20 min，超声2 s，停1 s。依次用0.8 μm、0.4 μm、0.2 μm、0.1 μm的聚碳酸酯膜高压挤出，即得ERG-LIP。
在此基础上，考虑到药物的不同物理化学和药代动力学特性，如溶解度，半衰期等，简单的独立给药不能达到预期的效果。因此，需要药物共同递送系统来解决这些问题。本课题以硫酸铵梯度法包载Afa，制备ERG联合Afa双载药脂质体（ERG/Afa-LIP），以Afa包封率为指标，通过单因素及响应面设计优化出ERG/Afa-LIP的最佳制备工艺，并通过对ERG/Afa-LIP外观与显微形态、粒径分布、Zeta电位、体外累积释放度、过氧化值等的考察，制备出外观均一乳白色、粒径较小且分布均匀，体外释放度符合《中国药典》要求的脂质体，并通过体外实验采用PC-9细胞进行抗肺癌初步研究。
一、实验材料
（一）细胞系
人肺癌细胞PC-9购自上海名劲生物科技有限公司。
（二）实验药品与试剂
阿法替尼原料药（爱必信生物科技有限公司，批号：abs47020632）
麦角甾醇对照品（≥95%，上海院也生物科技有限公司，批号：J26M6K1）
麦角甾醇原料药（≥95%，美国SIGMA公司，批号：BCBN4049V）
卵磷脂（大豆，>98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：G1813018）
高纯胆固醇（注射级，上海艾伟特医药科技有限公司，批号：B01221）
硫酸铵（上海凌峰化学试剂有限公司，批号：20120313）
柠檬酸（上海凌峰化学试剂有限公司，批号：20110725）
三氯甲烷（上海凌峰化学试剂有限公司，批号：20171017）
甲醇（色谱级，美国天地有限公司，批号：MS1922-801）
氢氧化钠（永华化学科技有限公司，批号：20170104）
聚碳酸酯径迹蚀刻膜（型号:0.8、0.4、0.2、0.1 μm，英国Whatman公司）
葡聚糖凝胶G50（源叶生物科技有限公司，批号S14032-25g）
（三）实验器材
TS-1水平摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）
JA203H分析电子天平（常州市幸运电子设备有限公司）
XS105DU分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）
DK-450B电热恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司）
Scientz-ⅡD超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）
RE-52A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）
WH-861漩涡混合器（太仓华利达实验设备有限公司）
KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）
Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）
PHS-3C型精密数显酸度计（杭州雷磁分析仪器厂）
HOMOEX-25高压膜挤出器（上海赫默仕机电科技有限公司）
Zetasizer Nano ZS90激光粒度仪/Zeta电位仪（英国马尔文仪器有限公司）
H-7650透射扫描电子显微镜（日本HITACHI公司）
1300 SERIES A2生物安全柜（美国赛默飞世尔公司）
ECLIPSE TS100/100-F倒置生物显微镜（日本尼康公司）
Thermo 3111型CO2培养箱（美国赛默飞世尔公司）
Eppendorf 5427R台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）
Eppendorf 5702台式离心机（德国Eppendorf公司）
HH-2数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）
SX-500高压灭菌锅（日本TOMY公司）
冷藏冷冻箱（青岛海尔股份有限公司）
Thermo 905超低温冰箱（美国赛默飞世尔公司）
Cryosystem 750液氮罐（美国MVE公司）
微量移液枪（德国Eppendorf 公司）
Synergy H1MFD多功能酶标仪（美国BioTek公司）
二、方法与结果
（一）ERG含量测定方法学考察
1.色谱条件
色谱柱：Agilent C18柱 (4.6 mm×150 mm，5 μm)
保护柱：通用型保护柱
流动相：100%甲醇
流速：1.0 mL·min-1
检测波长：282 nm
柱温：30℃
进样量：20 μL
2.溶液配制
2.1 对照品溶液的制备
精密称取ERG对照品25.40 mg，甲醇定容至50 mL容量瓶中，得到浓度为508.0 μg·mL-1对照品储备液。
2.2 脂质体的制备
称取一定比例的SPC、Chole、ERG，用氯仿溶解后旋转蒸发成薄膜，水化后经探头超声和高压挤出，透析后加入Afa柠檬酸溶液在50℃孵育10 min，制备ERG/Afa-LIP。称取一定比例的SPC、Chole，用氯仿溶解后旋转蒸发成薄膜，水化后经探头超声和高压挤出，透析后加入Afa溶液在50℃孵育10 min，制成空白脂质体。
2.3 供试品溶液的制备
分别量取空白脂质体和ERG/Afa-LIP脂质体1 mL置于10 mL容量瓶中，加入甲醇2mL破膜，甲醇溶液定容，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，分别作为阴性样品和供试品储备液。
3.最大吸收波长的选择
精密称取ERG对照品适量，加甲醇溶液超声溶解作为对照品溶液，以甲醇溶液为空白溶剂，在200~500 nm波长范围内进行扫描，结果对照品溶液在272nm 与281 nm波长附近处均有较大吸收，其中在281nm 处有最大吸收，故选择测定波长为281nm。结果见图1。
4.方法学考察
4.1专属性考察
精密移取对照品储备液1.00 mL置于10 mL容量瓶中，甲醇溶液定容，作为稀释后的对照品溶液；取2.3项下阴性样品和供试品溶液，进样20 μL，按上述色谱条件进行测定。结果表明，在此色谱条件下，溶剂不干扰药物的测定。结果见图2。
4.2标准曲线的绘制
取上述对照品储备液0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、2.00、2.50 mL于10 mL容量瓶中，甲醇溶液定容至刻度，0.45 μm滤膜过滤，进样20 μL。以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，ERG的线性回归方程为：Y=26.303X-17.057，R 2 =1，表明ERG在2.54～127.0 μg.mL-1的范围内，峰面积与浓度的线性关系良好，结果见图3。
4.3精密度试验
精密移取上述对照品储备液0.2、1.0、2.5 mL置于10 mL容量瓶中，甲醇溶液定容，作为高、中、低浓度，0.45 μm微孔滤膜过滤，在1 d内每个浓度重复进样5针，每次进样量为20 μL，得到日内RSD。连续测定3 d，得到日间RSD。结果见下表。
结果显示：ERG高、中、低浓度对照品峰面积的日内与日间的相对标准偏差（RSD）分别为0.07%与0.28%，均小于3 %，表明仪器的精密度良好。
4.4重复性试验
取ERG/Afa-LIP，按2.3项下供试品制备方法制备，平行测定6份，所得样品按选定色谱条件连续进样6次，测定ERG的含量。结果见下表。
结果显示：ERG浓度的RSD值为0.89%，小于3 %，表明该方法重复性良好。
4.5稳定性试验
取ERG/Afa-LIP，按2.3项下供试品制备方法制备，加入10 mL容量瓶中，甲醇溶液定容至刻度线，0.45 μm微孔滤膜过滤，分别于0、1、2、4、6、8、12、24 h进样20 μL。测定供试品溶液中ERG含量，考察其稳定性。结果见下表。
结果显示：ERG浓度的RSD值为0.79%，小于3 %，表明供试品溶液在24 h内稳定。
4.6加样回收率试验
按2.2项下脂质体的制备和2.3下供试品溶液的制备，按照样品含ERG量的约50%，100%和150%，分别精密加入2.1项中ERG对照品储备液0.26，0.53，0.79 mL，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇2 mL破膜，甲醇溶液定容至刻度线，0.45 μm微孔滤膜过滤，在以上色谱条件下，进样20 μL，测定ERG的含量，计算加样回收率；
加样回收率（%）=（测得量-样品量）/标准品加入量*100%。结果见下表。
结果显示：ERG的加样回收率均在95 %~105 %之间，平均加样回收率为100.99%，且各浓度的相对标准偏差RSD小于3 %，表明该方法准确性良好。
（二）Afa含量测定方法学考察
1 色谱条件
色谱柱：Agilent C18柱 (4.6 mm×150 mm，5 μm)
保护柱：通用型保护柱
流动相：甲醇-30 mmol·L-1乙酸铵水溶液（体积比75: 25）
流速：1.0 mL·min-1
检测波长：253 nm
柱温：30℃
进样量：20 μL
2 溶液配制
2.1对照品溶液的制备
精密称取Afa对照品29.61mg，甲醇定容至50 mL容量瓶中，得到浓度为592.2 μg·mL-1对照品储备液。
2.2 脂质体的制备
称取一定比例的SPC、Chole、ERG，用氯仿溶解后旋转蒸发成薄膜，水化后经探头超声和高压挤出，透析后加入Afa溶液在50℃孵育10 min，制备ERG/Afa-LIP。称取一定比例的SPC、Chole、ERG，用氯仿溶解后旋转蒸发成薄膜，水化后经探头超声和高压挤出，透析后制成空白脂质体。
2.3 供试品溶液的制备
分别量取空白脂质体和ERG/Afa-LIP脂质体溶液1 mL置于10 mL容量瓶中，加入甲醇2 mL破膜，甲醇溶液定容至刻度线，0.45 μm微孔滤膜过滤，分别作为阴性样品和供试品储备液。
3最大吸收波长的选择
精密称取Afa对照品适量，加甲醇溶液超声溶解，制备对照品溶液，以甲醇溶液为空白溶剂，在200~500 nm波长范围内进行扫描，结果对照品溶液在253 nm波长附近处有最大吸收，故选择测定波长为253 nm。结果见图4。
4 方法学考察
4.1专属性考察
精密移取对照品储备液1.0 mL置于10 mL容量瓶中，甲醇溶液定容，作为稀释后的对照品溶液；取2.3项下阴性样品和供试品溶液，每次进样20 μL，按上述色谱条件测定。结果显示，在此色谱条件下，溶剂不干扰药物的测定。结果见图5。
4.2标准曲线的绘制
取上述对照品储备液0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.00、1.60、2.00、2.50 mL于10mL容量瓶中，甲醇溶液定容至刻度，0.45 μm滤膜过滤，进样20 μL。以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。Afa的线性回归方程为：Y=71.961X-56.929，R 2 =0.9998，表明Afa在2.96~148.05 μg.mL-1的范围内，峰面积与浓度的线性关系良好，结果见图6。
4.3精密度试验
精密移取上述对照品储备液0.1、1.0、2.0 mL置于10 mL容量瓶中，甲醇溶液定容，作为高、中、低浓度，0.45 μm微孔滤膜过滤，在1 d内每个浓度重复进样5针，每次进样量为20 μL，得到日内RSD。连续测定3 d，得到日间RSD。结果见下表。
结果显示：Afa高、中、低浓度对照品峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为0.13%与1.86%，均小于3 %，表明仪器的精密度良好。
4.4 重复性试验
取ERG/Afa-LIP，按2.3项下供试品制备方法制备，平行6份，所得样品按选定色谱条件连续进样6次，测定Afa的含量。结果见下表。
结果显示：Afa浓度的RSD值为2.63%，小于3 %，表明该方法重复性良好。
4.5 稳定性试验
取ERG/Afa-LIP，按2.3项下供试品制备方法制备，加入10 mL容量瓶中，甲醇溶液定容至刻度线，0.45 μm微孔滤膜过滤，分别于0、1、2、4、6、8、12、24 h进样20 μL。测定供试品溶液中Afa含量，考察其稳定性。结果见下表。
结果显示：Afa浓度的RSD值为2.18%，小于3 %，表明供试品溶液在24 h内稳定
4.6 加样回收率试验
按2.2项下脂质体的制备和2.3下供试品溶液的制备，按照样品含Afa量的约50%，100%和150%，分别精密加入2.1项中Afa对照品储备液0.096，0.194，0.290mL，置于10mL容量瓶中, 加入甲醇2mL破膜，甲醇溶液定容，0.45μm微孔滤膜过滤，在以上色谱条件下，进样20μL，测定Afa的含量，计算加样回收率；
加样回收率（%）=（测得量-样品量）/标准品加入量*100%。结果见下表。
结果显示：Afa的加样回收率均在95 %~105 %之间，平均加样回收率为97.97 %，且各浓度的相对标准偏差值为2.11%，小于3 %，表明该方法准确性良好。
（三）ERG/Afa-LIP最佳制备工艺优选及其质量评价
1 不同载药方法选择
ERG为脂溶性药物，ERG-LIP采用薄膜分散法制备[33-34]，文献中关于阿法替尼的包载有薄膜分散法，逆向蒸发法，乙醇注入法与硫酸铵梯度法等[35]。考虑到ERG药物采用了薄膜分散法，将ERG作为脂质膜材的一部分包载于磷脂双分子层中，如果Afa也采用薄膜分散法，将会导致ERG和Afa药物不能最大程度的包载在脂质体内。逆向蒸发法和乙醇注入法所制备的脂质体粒径较大且不均匀[36]，不适合用作静脉给药。
文献报道，弱碱性药物可与 SO4 2- 形成低溶解性的盐类物质，药物在脂质体内部聚集，能够增加药物滞留能力，在一定程度上提高了药物的包封率[37-39]。Afa为弱碱性药物，我们猜想，将Afa的柠檬酸溶液与硫酸铵溶液按其在脂质体内水相中的浓度进行混合，能在一定程度上增加 Afa在水中的溶解度，因此采用硫酸铵梯度法制备的ERG/Afa-LIP可能具有较高的包封率。
本实验前期采用电导率仪监测ERG-LIP脂质体透析液中硫酸铵浓度，确定最终透析方案，使用截留分子量为8000~14000的透析袋，1:100透析介质（超纯水），每150 min更换一次透析介质，透析2次，既得。
2 Sephadex-G50微柱离心法测定ERG/Afa-LIP的包封率
凝胶微柱离心法是将葡聚糖凝胶柱与离心分离方法结合在一起的测定包封率的方法之一[40-41]，它是利用分子筛原理，在洗脱过程中，脂质体由于粒径较大的特点首先被洗脱出来，从而达到脂质体与游离药物分离的目的。本实验Afa属游离药物，它的分子量小，与脂质体的分子量相差较大，所以可用此法来进行Afa与脂质体的分离，测定脂质体的包封率。
2.1 微型凝胶柱的制备
称取适量的 Sephadex G-50 ，置于烧杯内，加入一定体积的超纯水加热煮沸 2 h冷却后即可使用。取2.5 mL 的注射器，去掉内塞，在底部放入直径约为6 mm 的圆形滤纸（使用打孔器），吸取溶胀好的 Sephadex G-50至注射器内，柱高大约1.8-2.0 cm，在此过程中不得产生气泡，将微柱放置在10 mL透明离心管内，以 500 r·min -1离心 2 min除去多余的水，得微柱，备用。
2.2 微型凝胶柱对ERG-LIP的吸附
取空ERG-LIP 0.1 mL ，从上注射器顶端慢慢滴加到微柱的内，在500 r·min -1条件下离心2 min，使ERG-LIP进入微柱内部，往微柱内继续加入0.2 mL 的超纯水，1500 r·min-1离心2 min，收集洗脱液于10 mL容量瓶内，超纯水洗脱 3次，用甲醇超声破乳，甲醇定容至刻度线。于 203.4 nm 处测定吸光度(A n )；另取 0.1 mL ERG-LIP体于 10 mL 量瓶中，用甲醇破乳，甲醇定容至刻度线，于203.4 nm 处测定吸光度(A 0 )；按照A n /A 0 ×100%计算微柱对ERG-LIP的平均回收率为96.26%，表明微柱几乎可以将ERG-LIP全部洗脱下来。结果见下表，和图7。
2.3 微型凝胶柱对Afa的吸附作用考察
配置浓度分别为200、400、800 μg/ml的Afa溶液。精密吸取各浓度的溶液。0.1mL，慢慢滴加Afa溶液于微柱内部，按“2.2”项下条件离心洗脱，合并收集的洗脱液置于10ml容量瓶中，用甲醇至刻度。按阿法替尼色谱条件分别进样测定，记录峰面积为A 1 。精密量取各浓度的阿法替尼溶液0.1ml置于10ml容量瓶中甲醇定容至刻度，按阿法替尼色谱条件分别进样测定，记录峰面积为A 0 。用峰面积来计算微柱对游离药物的吸附率=[(A 0 -A 1 )/A 0 ] ×100%。结果 3 种不同浓度药物的吸附率分别为98.99%，98.83%，99.34%，说明在洗脱范围内微柱几乎可以将游离药物完全吸附。结果见下表。
2.4 微柱对ERG-LIP与Afa混合物的吸附作用的考察
精密取 0.1 mL 的ERG-LIP 3 份置于10 mL 的量瓶中，分别加入适量的阿法替尼溶液，并用超纯水定容至刻度线，制成浓度分别为 200，400，800 μg·mL-1的混合物样品。按Afa色谱条件进行测定。取以上制备好的混合物样品 0.1 mL 加入到微柱的顶端，按“2.2”项下离心条件和方法来分离Afa与ERG-LIP，按“2.3.1”项下色谱条件进行 HPLC 测定Afa的含量，根据 HPLC 测定的Afa的峰面积与收集管数绘制Afa洗脱曲线。1~3 管洗脱液为ERG-LIP混悬液，4~10 管洗脱液为游离 Afa 溶液，SephadexG-50 微型凝胶柱可较好地将脂质体与游离 Afa 溶液分离，结果见图8。
2.5 脂质体包封率测定方法
精密量取0.1 mL ERG/Afa-LIP 3份，慢慢上样于微柱内部，按“2.2”项下方法分离Afa和ERG-LIP，收集滤液，用甲醇破乳，甲醇定容至 10 mL 量瓶中，按Afa色谱条件测定包封于ERG-LIP中的Afa药物浓度C 1 。再量取ERG/Afa脂质体溶液 0.1 mL 于 10 mL 的量瓶中，甲醇破乳，甲醇定容至刻度，按Afa色谱条件测定总药物Afa的浓度C 0 ，计算包封率：EE%=C 1 /C 0 ×100%。
3 ERG/Afa-LIP最佳工艺考察
3.1 单因素
3.1.1 硫酸铵浓度的考察
考察不同浓度的硫酸铵溶液对包封率的影响，采用最佳工艺制备ERG-LIP后，分别加入100，150，200， 250 mM 4个不同浓度的(NH4)2SO4进行水化，ERG-LIP制备结束后，透析袋透析2次，每次2.5 h，然后加入等体积Afa溶液在50℃水浴中进行孵育，结果见图1-13。结果显示，随着(NH4)2SO4浓度的增加，ERG/Afa-LIP的包封率增大。当(NH4)2SO4浓度为250 mM时，包封率达到最大，数值为57.3%。
3.1.2 孵育时间的考察
本实验考察Afa柠檬酸溶液与ERG-LIP在20，30，40，50，60 min孵育时间下的包封率，结果见图1-14。结果显示，随着孵育时间的增加，ERG/Afa-LIP的包封率增大。当孵育时间为50 min时，包封率达到最大，数值为65.30%，随着孵育时间的继续增加，包封率下降。
3.1.3 孵育温度的考察
考察Afa柠檬酸溶液与ERG-LIP在30，40，50，60，70℃孵育温度下的包封率，结果见图1-15。结果显示，30~60℃之间，随着温度升高，包封率增大，当孵育温度为60℃时，包封率达到最大，数值为66.28%。随着孵育温度的继续增高，包封率下降。3.1.4 Afa柠檬酸溶液浓度的考察
在ERG-LIP中等体积加入不同浓度的Afa柠檬酸溶液进行孵育，设二者的浓度比为1.2:1、1.5:1、2:1、3:1、6:1，考察ERG/Afa不同浓度下ERG/Afa-LIP的包封率，结果见图1-16。结果显示，当ERG/Afa的浓度比为3:1时，Afa的包封率达到最大，数值为93.17%。
3.2 响应面试验
3.2.1 响应面试验设计
以单因素试验结果为基础，依据Box-Behnken试验设计的原理，选取(NH4)2SO4浓度，孵育温度℃，孵育时间t（min），ERG/Afa浓度比作为自变量，以ERG/Afa-LIP 中Afa的包封率为响应值，并以-1、0、1分别代表变量的因素编码，基于 Box-Behnken响应曲面设计试验方案按下表进行试验，共29次试验。用Design- Expert 10.0.7软件设计四因素三水平的试验。结果见下表。
3.2.2 模型的建立与方差分析
运用Design-Expert. V 10.0.7软件对上表中数据进行二次多元回归拟合，计算回归系数，得自变量与因变量间的回归方程Y =94.38+0.89A－0.16B+1.50C+6.64D－0.50AB－3.20AC－1.02AD－0.42BC+0.49BD+5.44CD－3.76A2－0.78B2－1.91C2－7.59D2。
由下表中分析结果可知，回归方程模型P=0.0474<0.05，表明模型具有显著性。失拟项P=0.0796＞0.05，说明失拟项不显著，表明回归模型是合适的，可以用来分析和预测ERG/Afa-LIP的最佳制备工艺。在影响Afa包封率的四个因素中，影响Afa包封率程度顺序为D>C>A>B，其中D（ERG/Afa浓度比）因素对Afa包封率的影响极显著（P<0.01）。
通过Design-Expert.V 10.0.7软件对此模型做响应面。见图13。响应面为响应值对两两交互因素所构成的三维空间曲线图，效应面曲线越陡峭，说明各自变量对响应值的影响越明显。取回归模型最大值点，对应的实测值为孵育温度54.2℃，孵育时间59.06 min，Afa浓度0.238 mg·mL-1，硫酸铵浓度194.63 mM。
3.2.4 验证试验
为验证模型方程的可靠性，首先制备ERG-LIP，SPC与Chole摩尔比5:1，ERG载药10%、探头超声20 min。精密称取 SPC 98 mg，Chole 10 mg，ERG 12mg，加入10 mL氯仿充分溶解，40℃旋转蒸发成薄膜后，加入10 mL的194.63 mM硫酸铵溶液置于水平摇床上水化30min，转速140 rpm·mL-1。水化完毕，探头超声20 min，超声2 s，停1 s。依次用0.8 μm、0.4 μm、0.2 μm、0.1 μm的聚碳酸酯膜高压挤出，即得ERG-LIP。
将制备好的ERG-LIP转移到截留分子量为8000~14000的透析袋中，两端用透析夹夹紧，投入100倍量超纯水中，透析2.5 h后更换透析液，继续透析2.5 h，透析2次。透析结束后，在ERG-LIP中加入等体积的浓度为0.238mg·mL-1的Afa柠檬酸溶液，在54.2℃水浴下孵育59.06 min，即得ERG/Afa-LIP。
按优选的制备工艺进行验证试验，结果见下表，3批ERG/Afa-LIP包封率的平均值为96.92%，RSD值为0.58%，与模型的预测值98.16%偏差1.24%，表明建立的数学模型预测性良好，优化的制备工艺重复性良好。
4.1.1 外观形态
制备空白LIP（既不含ERG，也不含Afa），ERG-LIP（只含ERG），ERG/Afa-LIP空白LIP，ERG-LIP，ERG/Afa-LIP呈乳白色，色泽均匀透亮，无沉淀。
4.1.2 显微形态
采用透射电镜观察ERG/Afa-LIP。采用负染法制备样品。结果见图14。透射电镜结果表明脂质体形态呈圆形，粒径分布大小均匀，大约在100 nm左右。
4.2 粒径及其分布
取LIP，ERG-LIP，ERG/Afa-LIP样品，采用激光粒度仪测定平均粒径及其分布，结果见图15。结果表明，LIP的平均粒径为107.6±0.2nm，多分散系数PDI为0.259±0.012，小于0.3；ERG-LIP的平均粒径为103.8±0.41nm，PDI为0.278±0.007，小于0.3，ERG/Afa-LIP的平均粒径为103.03±0.61nm，PDI为0.261±0.003，小于0.3。各组脂质体粒径分布较集中。4.3 Zeta电位测定
取LIP，ERG-LIP，ERG/Afa-LIP样品，用纯水稀释后，采用Zeta电位仪测定其电位，结果见图16。结果显示LIP的Zeta电位为-7.23±0.32 mV，ERG-LIP的Zeta电位为-4.43±0.11 mV，ERG/Afa-LIP的Zeta电位为+2.48±0.45 mV，LIP与ERG-LIP带负电，ERG/Afa-LIP带正电。
4.4 pH测定
取3批ERG/Afa-LIP样品，稀释后在常温下用pH计计测定其pH值。测定的3批样品的pH均值为3.78±0.02，说明ERG/Afa-LIP显酸性。
5.5 脂质体过氧化值的测定
采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定脂质体中脂质过氧化物丙二醛（MDA）含量，以评估脂质体中脂质成分的氧化程度。
试剂一：液体20 mL×1瓶，室温保存。
试剂二：液体12 mL×1瓶，用时每瓶加340 mL蒸馏水混匀，4℃冷藏。
试剂三：粉剂×1支，用时将粉剂加蒸馏水60mL，加热到90℃～100℃充分溶解后用蒸馏水补足至60mL，混匀，配好的试剂避光冷藏。
标准品：10nmol/mL四乙氧基丙烷5 mL×1瓶，4℃冷藏。
分别设空白管，标准管，测定管。空白管加0.2 mL无水乙醇，0.2 mL试剂一，3 mL试剂二，1mL试剂三。标准管加0.2 mL标准品，0.2 mL试剂一，3 mL试剂二，1 mL试剂三。测定管测三批脂质体，分别加0.2 mL脂质体，0.2 mL试剂一，3 mL试剂二，1 mL试剂三。离心管盖上盖，用针在盖上扎一小孔，旋涡混匀器混匀，95℃水浴40 min，取出后流水冷却，然后4000转/分，离心10分钟。取上清200 μL于96孔板中，酶标仪532nm处测定各管吸光度。结果见下表，3批ERG/Afa-LIP MDA含量为6.71±0.11nnmol/mL。
测定3批ERG/Afa-LIP样品，其中Afa的平均包封率为96.92±0.58%，载药量为2.92±0.23%。ERG的平均包封率为93.90±1.84%，载药量为7.46±0.55%。
4.7 释放度
本实验考察在不同pH条件下Afa药物的体外释放情况。分别精密吸ERG/Afa-LIP 4mL，及Afa的柠檬酸溶液4 mL于透析袋（截留分子量8000-14000）中，两端用透析夹夹紧，放入100 mL pH 分别为7.4和6.5的含有40%甲醇的磷酸盐缓冲液中，置恒温水浴振荡器（振摇速率100 rpm·min-1，释放温度37℃）中，于0.25，0.5，0.75，1，2，4，6，8，10，12，24 h吸取透析液1 mL，并补充1 mL 新鲜透析介质。0.45 μm的微孔滤膜过滤后，通过HPLC进样，进样20μL测定其峰面积，代入线性回归方程计算各取样点下的Afa的释药浓度。计为c1，Afa总药量记为M0。按照如下公式进行计算：
其中，c1为各取样点中Afa释放的浓度，V0为释放介质体积，V为取样体积，M0为Afa总药量。
由图17（17-a）结果表明，Afa的体外释放具有显著的pH依赖性。在 pH6.5下的含40%甲醇的磷酸盐缓冲液中，24 h内Afa原料药累积释放百分率为97.98%，几乎完全释放。在pH7.4下的含40%甲醇的磷酸盐缓冲液中，24 h内Afa原料药累积释放百分率为82.68%。图17（17-b）表明在 pH 6.5下的含40%甲醇的磷酸盐缓冲液中，24 h内ERG/Afa-LIP的累积释放百分率为95.66%。在 pH7.4下的含40%甲醇的磷酸盐缓冲液中，24 h内ERG/Afa-LIP的累积释放百分率为87.17%。在 pH6.5下的含40%甲醇的磷酸盐缓冲液中，0.5 h内ERG/Afa-LIP的累积释放百分率为22.03%<40%，6 h内ERG/GEF-LIP的累积释放百分率为87.32%>80%，直至24 h，ERG/GEF-LIP的累积释放百分率为95.66%。2015版《中国药典》中关于脂质体突释效应的要求：开始0.5 h的释放量应≤40%[44]，且24 h的累积释放百分率超过80 %。在释放介质为pH 6.5的含40%甲醇的磷酸盐缓冲液下，ERG/Afa-LIP符合该要求。说明ERG/Afa-LIP在弱酸性环境下更易释放，肿瘤部位显酸性，为ERG/Afa-LIP中药物的释放提供了一定的条件。4.8 ERG/Afa-LIP细胞增殖抑制作用研究
4.8.1 最优处方中ERG与Afa联用性质探讨
ERG/Afa-LIP最优工艺中，ERG:Afa=1.28:1。分组为：正常对照组，ERG组（7.68μM，5.12μM，2.56μM，1.28μM，0.64μM，0.32μM）；Afa组（6μM，4μM，2μM，1μM，0.5μM，0.25μM）；ERG+Afa组（7.68+6μM，5.12+4μM，2.56+2μM，1.28+1μM，0.64+0.5μM，0.32+0.25μM）。调整对数生长期PC-9细胞悬液浓度为5×104个·mL-1。800 rpm·min-1离心5 min后，吹打混匀成单细胞悬液，每孔加入100 μL于96孔培养板，于37℃，5 % CO2培养箱中培养至细胞融合80% 后给药处理。其中各个给药组加入100 μL不同浓度不含FBS的药物溶液，正常对照组加入100 μL不含FBS培养液。每个浓度各设5个复孔，分别于加药后第24、48、72 h 后进行MTT检测。每孔加入MTT（5 mg· mL-1）溶液20 μL，37℃孵育4 h 后，采用酶标仪于490 nm处测定各孔吸光度OD值，在570 nm处验证。计算各组各浓度下的抑制率（IR）值，采用 q 值判断脂质体中ERG和Afa联用的性质。本实验重复3次进行。
式中E A 和E B 为各药单用抑制率，E AB 为两药合用抑制率。q>1.15为协同作用，0.85-1.15为相加作用，<0.85为拮抗作用。
结果如下表所示。实验按照ERG/Afa-LIP最佳制备工艺中ERG与Afa的比例，考察了ERG组，Afa组以及ERG+Afa组在不同的时间点下的细胞抑制率。两药联用的抑制率均要高于单用组，且呈现一定的浓度依赖性。当孵育时间为24 h，48h，72h，ERG+Afa两药联用组的q值均小于1.15，表明两药联用具有相加作用。
4.8.2 两单负载药脂质体联用与双载药脂质体对PC-9细胞的增殖抑制作用
按实验室前期研究制备ERG-LIP与Control-LIP（不含ERG），将Control-LIP中加入等体积的浓度为0.238mg·mL-1的Afa溶液，在54.2℃下孵育59.06 min，即得Afa-LIP。按照最佳工艺制备ERG/Afa-LIP。分别设置：正常对照组， ERG-LIP组（含ERG 9.62μM，6.41μM，3.205μM，1.603μM，0.801μM，0.400μM）；Afa-LIP组（含Afa 6μM，4μM，2μM，1μM，0.5μM，0.25μM）；ERG-LIP+Afa-LIP组（9.62+6μM，6.41+4μM，3.205+2μM，1.063+1μM，0.400+0.5μM，0.200+0.25μM）。调整对数生长期PC-9细胞悬液浓度为5×104个·mL-1。800 rpm·min-1离心5 min后，吹打混匀成单细胞悬液，每孔加入100 μL于96孔培养板，于37℃、5 % CO2培养箱中培养至细胞融合80%后加药处理。其中各个给药组加入100 μL不同浓度不含FBS的药物溶液，正常对照组加入100 μL不含FBS培养液。每个浓度各设5个复孔，分别于加药后第24、48、72 h后进行MTT检测。每孔加入MTT（5 mg· mL-1）溶液20 μL，37℃孵育4 h 后，采用酶标仪于490nm处测定各孔吸光度OD值，在570 nm处验证。计算各组各浓度下的抑制率（IR）值。结果见下表，和图18。结果显示，在24h，48h，72h下，相同浓度的双载药脂质体对PC-9细胞的抑制率均高于两单药脂质体的抑制率，说明双载药脂质体比两单药脂质体联用效果好。
采用体外培养PC-9细胞，给予ERG、Afa、ERG+Afa，空白脂质体（LIP），ERG-LIP，ERG/Afa-LIP刺激24 h后，测定不同浓度给药后的细胞增殖抑制率。本实验平行3次测定，结果见图19。药物作用24 h时，Control-LIP组各浓度下的抑制率均小于20%，表明在该浓度范围内，辅料对PC-9细胞几乎无抑制作用。在相同给药浓度下，ERG/Afa-LIP组与其他组别相比，抑制率均明显升高，差异有极显著性（P< 0.01）。结果表明，将ERG与Afa制备成脂质体后，能够显著增加其体外抗PC-9细胞的增殖抑制作用。
三、分析与讨论
本部分实验实在前期研究的基础上制备了ERG/Afa-LIP脂质体。首先按照前期优化的处方通过薄膜分散法制备ERG-LIP，通过硫酸铵梯度法包载Afa，制备ERG/Afa-LIP。测定包封率、载药量以及药物含量，建立的ERG含量测定方法[46]与Afa含量测定方法[47]。Afa为弱碱性药物，将Afa的柠檬酸溶液与硫酸铵溶液按其在脂质体内水相中的浓度进行混合，能在一定程度上降低 Afa在水中的溶解度，使其具有较高的包封率。
本实验前期采用电导率仪监测ERG-LIP脂质体透析液中硫酸铵浓度，确定最终透析方案如下：截留分子量为8000~14000的透析袋，1:100透析介质，每2.5 h更换一次透析介质，透析2次。
常用的测定脂质体包封率的方法有：柱过滤法、超滤法、离心法等，本课题考察过超滤法，但原料药的回收率为70%，说明超滤管的膜材对阿法替尼有吸附作用，导致游离的阿法替尼吸附在超滤管上，使得测定的包封率偏小。凝胶微柱离心法是将葡聚糖凝胶柱与离心分离方法结合在一起的测定包封率的方法之一，它是利用分子筛原理，在洗脱过程中，脂质体由于粒径较大的特点首先被洗脱出来，从而达到脂质体与游离药物分离的目的。所以本实验采用Sephadex-G50微柱离心法测定ERG/Afa-LIP中Afa的包封率。
本实验以Afa的包封率作为考察的指标，进行了4个单因素试验的考察：硫酸铵浓度、孵育时间、孵育温度、Afa的浓度，以单因素试验结果为基础，依据Box-Behnken试验设计的原理，选取硫酸铵浓度，孵育温度，孵育时间，ERG/Afa浓度比为自变量，以Afa包封率为响应值进行了响应面实验，确定硫酸铵梯度法包载Afa的最佳处方工艺为：孵育温度54.2℃，孵育时间59.06 min，Afa浓度0.238 mg·mL-1，硫酸铵浓度194.63 mM。
质量评价部分中， ERG/Afa-LIP的粒径在100 nm左右，有利于在肿瘤部位的渗透与滞留。pH值显酸性，在使用过程当中应该避免与碱性药物联合使用。ERG与Afa都具有较高的包封率。在体外药效试验中，考察了三个重点内容。首先，两药联用的增敏作用主要体现在协同或相加作用上，ERG/Afa-LIP最优处方中ERG与Afa的联用性质为何。ERG/Afa-LIP最优工艺中，ERG:Afa=1.28:1，按此药物比例孵育PC-9细胞，结果显示ERG/Afa-LIP最优处方中ERG与Afa的联用性质为相加作用。第二，制备ERG/Afa-LIP双载药脂质体的优势之处，它与制备成ERG-LIP与Afa-LIP两个单脂质体联用有何区别，结果显示，相同浓度的双载药脂质体对PC-9细胞的抑制率均高于两单药脂质体的抑制率，说明双载药脂质体比两单药脂质体联用效果好。最后，比较了ERG+Afa两原料药与ERG/Afa-LIP药效，结果显示，在相同给药浓度下，ERG/Afa-LIP组与ERG+Afa两原料药组相比，抑制率均明显升高。
四、小结
ERG/Afa-LIP的最优处方为：孵育温度54.2℃，孵育时间59.06 min，Afa浓度0.238mg·mL-1，硫酸铵浓度194.63 mM。其外观形态圆整、粒径分布均匀，包封率较高，有关物质符合要求。作用于PC-9细胞，药效比ERG+Afa两原料药联用与ERG-LIP与Afa-LIP两脂质体联用，抑制率均升高。
Claims (3)
1.麦角甾醇联合阿法替尼脂质体的制备方法，包括以下步骤：称取卵磷脂SPC、胆固醇Chole、麦角甾醇ERG，用氯仿溶解后旋转蒸发成薄膜，水化后经探头超声和高压挤出，透析后加入阿法替尼Afa柠檬酸溶液在45~60℃ 下，孵育5~15 min，制备得到麦角甾醇联合阿法替尼脂质体ERG/Afa-LIP。
2.根据权利要求1所述的麦角甾醇联合阿法替尼脂质体的制备方法，包括以下步骤：
S1：SPC与Chole摩尔比5:1，ERG载药10 %、探头超声20 min；精密称取 SPC 98 mg，Chole 10 mg，ERG 12mg，加入10 mL氯仿充分溶解，40℃ 旋转蒸发成薄膜后，加入10 mL的194.63 mM硫酸铵溶液置于水平摇床上水化30 min，转速140 rpm·mL-1；水化完毕，探头超声20 min，超声2 s，停1 s；依次用0.8 μm、0.4 μm、0.2 μm、0.1 μm的聚碳酸酯膜高压挤出，即得ERG-LIP；
S2：将制备好的ERG-LIP转移到截留分子量为8000~14000的透析袋中，两端用透析夹夹紧，投入100倍量超纯水中，透析2.5 h后更换透析液，继续透析2.5 h，透析2次；透析结束后，在ERG-LIP中加入等体积的浓度为0.238mg·mL-1的Afa柠檬酸溶液，在54.2℃水浴下孵育59.06 min，即得ERG/Afa-LIP。
3.权利要求2所述的麦角甾醇联合阿法替尼脂质体在体外抑制PC-9细胞增殖方面的用途。
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