CN110623928A - 一种麦角甾醇联合吉非替尼脂质体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种麦角甾醇联合吉非替尼脂质体的制备方法。该法以硫酸铵梯度法包载GEF，制备ERG联合GEF复方脂质体；具体制备工艺如下：SPC、Chole、ERG，用氯仿充分溶解，置于旋转蒸发仪上旋干，真空干燥至无味；加入纯水置于水平摇床上水化20~50min，得到中间品；将中间品放置于冰浴下，超声处理；最后依次采用多级微孔滤膜过滤，最后用0.1μm的聚碳酸酯膜高压挤出。本发明以GEF包封率为指标，通过单因素及响应面设计优化ERG/GEF‑LIP的制备工艺，并对其形态、粒径分布、Zeta电位、体外累积释放度、过氧化值进行初步考察，针对耐药细胞PC‑9/GR进行体外抗肺癌初步研究。

Description

一种麦角甾醇联合吉非替尼脂质体的制备方法

技术领域

本发明涉及一种脂质体的制备方法，尤其涉及一种麦角甾醇联合吉非替尼脂质体的制备方法。

背景技术

由于癌症发病率和死亡率的持续增高，目前仍然是世界上最关注的难题之一。据统计，2015年中国大约新增了约430万例癌症病例，以及有约281万例癌症患者死亡，其中肺癌占据首位。国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer）编制的《2018年全球癌症发病率和死亡率估计》提供了一份全球癌症负担状况报告，预计2018年将有1810万新癌症病例和960万癌症死亡病例。其中肺癌是最常见的癌症（占总病例的11.6%），也是癌症死亡的主要原因（占总癌症死亡人数的18.4%）。临床上发现，肺腺癌已经逐渐替代肺鱗癌成为肺癌发病率最高的病理类型，约占NSCLC的一半，而NSCLC约占全部肺癌的85％。

目前，临床一线化疗用药（铂类，阿霉素，紫杉醇等）在化疗过程中，均会出现多药耐药现象，最终导致疾病进一步进展。GEF是最早用于治疗NSCLC的分子靶向药物，目前常用于二线治疗药物应用于临床。GEF是一种表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂，针对EGFR靶点的NSCLC具有较好的临床治疗效果。其作用机制主要通过与三磷酸腺苷（ATP）竞争和EGFR的结合，通过AKT等途径阻断EGFR信号传导通路，抑制自身磷酸化以及活化，阻断表达EGFR的肿瘤细胞生长，阻断 PI3K-AKT等下游信号通路，诱导肿瘤细胞凋亡，起到抗肿瘤作用。对于发生EGFR突变的患者，GEF副作用的发生程度相较于化疗明显减轻。同时研究表明在女性患者、亚裔患者以及不吸烟患者中更多的观察到EGFR基因的突变。报道显示，东方国家的肺癌患者在临床上GEF的疗效往往都要好于西方国家。可见，GEF的深入研究对亚洲NSCLC患者有重要意义。

针对肺癌，寻找一种能够与GEF产生协同作用的药物，拓展GEF的应用范围，改善靶向药物在肺癌治疗方面的临床应用，具有重要价值。

发明内容

本发明要解决上述问题，在探讨了ERG与GEF联用具有协同抗肺癌的作用的基础上；针对ERG与GEF联用的药物制剂进行了脂质体的药物制剂开发。并对该药物制剂的制备方法以及药物制剂的质量进行了多方面的研究。

本发明解决上述问题的技术方案如下：

一种麦角甾醇联合吉非替尼脂质体的制备方法，以硫酸铵梯度法包载GEF，制备ERG联合GEF复方脂质体；具体制备工艺如下：摩尔比（3~7）:1的SPC与Chole、载药量5~15wt% 的ERG，用氯仿充分溶解，置于30~50℃水浴的旋转蒸发仪上旋干，真空干燥至无味；加入纯水置于水平摇床上水化20~50min，转速100~200rpm/mL，得到中间品；将中间品放置于冰浴下，探头超声10~30min，超声1~5s，停0.5~2s；依次采用多级微孔滤膜过滤，最后用0.1μm的聚碳酸酯膜高压挤出，即得。

作为上述技术方案的优选， SPC与Chole的摩尔比为5:1。

作为上述技术方案的优选， ERG的载药量10wt%。

作为上述技术方案的优选，转速为130~160rpm/mL。

作为上述技术方案的优选，所述多级微孔滤膜分别为0.8μm、0.45μm、0.22μm。

作为上述技术方案的优选，硫酸铵的浓度为150~250mM。

作为上述技术方案的优选，孵育温度为30~50℃。

作为上述技术方案的优选，ERG/GEF的浓度比为（1.5~6）:1。

本发明的另一个目的是提供上述方法制备得到的麦角甾醇联合吉非替尼脂质体。

作为上述技术方案的优选，该脂质体的平均粒径为145.2±1.0nm；多分散系数PDI为0.199±0.036；该脂质体的Zeta电位为-19.0±3.1mV；pH为5.05±0.12；平均过氧化氢值为0.0237±0.0018；包封率为95.33±0.21%，载药量为3.94±0.10%。

本发明具有以下有益效果：

本发明以硫酸铵梯度法包载GEF，制备ERG联合GEF复方脂质体（ERG/GEF-LIP），以GEF包封率为指标，通过单因素及响应面设计优化ERG/GEF-LIP的制备工艺，并对其形态、粒径分布、Zeta电位、体外累积释放度、过氧化值进行初步考察，针对耐药细胞PC-9/GR进行体外抗肺癌初步研究。

附图说明

图1为模型公式；

图2为药物累积释放率拟合结果及相关系数；

图3为PC-9/GR耐药指数；

图4为不同脂质体给药组对细胞摄取率的影响；

图5为各脂质体外观观察；

图6为各脂质体透射电镜图；

图7为各脂质体粒径变化分布；

图8为各脂质体Zeta电位；

图9为GEF和ERG/GEF-LIP在不同pH释放介质下的累积释放度；

图10为GEF对于敏感细胞和耐药细胞的增殖抑制情况；

图11为原料药及脂质体的24hMTT试验结果；

图12为ERG/GEF-LIP的流式细胞摄取图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明进行进一步的解释说明。

本具体实施方式仅仅是对本发明的解释，并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读了本发明的说明书之后所做的任何改变，只要在权利要求书的范围内，都将受到专利法的保护。

麦角甾醇联合吉非替尼脂质体的制备工艺及其质量评价

一、实验材料

人肺癌PC-9/GR细胞由人肺癌PC-9细胞逐步递增GEF浓度间歇作用的方法构建而成。

二、方法与结果

ERG/GEF-LIP质量评价

1.1 形态观察

1.1.1 外观形态

LIP，ERG-LIP，ERG/GEF-LIP溶液呈乳白色，色泽均匀。如图5所示。

1.1.2 显微形态（透射电镜观察脂质体）

采用负染法制备样品。在室温条件下，取LIP，ERG-LIP，ERG/GEF-LIP样品，滴至电镜专用铜网上，用滤纸吸干多余样品，静置1 min。后用1 %磷钨酸负染，静置30s后用滤纸吸取铜网多余染液，自然挥干后电镜观察并照相。透射电镜结果表明，各脂质体形态较圆整，粒径分布均匀。

1.2 粒径及其分布

取LIP，ERG-LIP，ERG/GEF-LIP样品，用纯水稀释20倍后采用激光粒度仪测定平均粒径及其分布，结果见图7。结果表明，LIP的平均粒径为131.4±2.3 nm，多分散系数PDI为0.176±0.002，小于0.3，ERG-LIP的平均粒径为139.0±2.8 nm，PDI为0.203±0.016，小于0.3，ERG/GEF-LIP的平均粒径为142.5±1.0 nm，PDI为0.199±0.036，小于0.3，各组脂质体粒径分布较集中。

1.3 Zeta电位测定

取LIP，ERG-LIP，ERG/GEF-LIP样品，用纯水稀释20倍，采用Zeta电位仪测定电位，结果见图8。结果显示LIP的Zeta电位为-25.7±0.7 mV，ERG-LIP的Zeta电位为-33.3±0.6 mV，ERG/GEF-LIP的Zeta电位为-19.0±3.1 mV，脂质体带负电。

1.4 pH测定

室温条件下，取3批ERG/GEF-LIP样品，稀释至一定浓度，用酸度计测定pH值。测定3批样品的平均pH值为5.05±0.12。

1.5 脂质体过氧化值(POV)的测定

本实验采用丙二醛测定法考察脂质体的氧化程度。其中TTH试液的制备如下：2-硫代巴比妥酸0.75 g，三氯醋酸30 g，加入0.25 mol·L^-1盐酸200 mL，温热至溶解，放冷后滤过。精密量取1 mL ERG/GEF-LIP置于10 mL离心管中，加入的5 mL 制备好的TTH试剂。混匀后在100℃下加热半小时。吸取上清液，以TTH试液为空白对照，于535 nm波长处测定吸光度值，记作过氧化值。平行测定3批样品，，平均过氧化值为0.0237±0.0018。

1.6 包封率与载药量

3批ERG/GEF-LIP样品，其中GEF的平均包封率为96.49±1.00%，载药量为5.73±0.62%。ERG的平均包封率为95.33±0.21%，载药量为3.94±0.10%。

1.7 释放度

由于ERG的脂溶性较强，在纯甲醇或者纯乙醇中可以溶解。但是脂质体在纯甲醇或者纯乙醇中会直接破膜，释放介质难以满足ERG的“漏槽”条件，因此本实验不考察ERG的体外释放情况。而GEF作为弱碱性药物，其溶解度具有pH依赖性，因此本实验考察在不同pH条件下GEF药物的体外释放情况。分别精密吸ERG/GEF-LIP 4 mL，及GEF的柠檬酸溶液4 mL，置于透析袋中，用透析夹夹紧后投入pH 7.4和pH 6.4的含40%甲醇的磷酸盐缓冲液各100 mL中，置于恒温水浴振荡器（振摇速率100 rpm·min^-1，释放温度37℃）中，分别于第0.25，0.5，0.75，1，2，4，6，8，10，12，24 h吸取透析液1 mL，并补充1 mL 新鲜透析介质。采用0.45 μm的微孔滤膜过滤各个样品，通过HPLC进样，测定峰面积，代入线性回归方程计算各取样点下GEF的释药浓度，计为c₁，GEF总药量记为M₀。按照如下公式进行计算：

其中，c₁为各取样点中GEF释放的浓度，V₀为释放介质体积，V为取样体积，M₀为GEF总药量。

由图9结果表明，GEF的体外释放具有显著的pH依赖性。在pH7.4下的含40%甲醇的磷酸盐缓冲液中，24 h内GEF原料药累积释放百分率为76.91%，ERG/GEF-LIP的累积释放百分率为68.26%。在pH6.4下的含40%甲醇的磷酸盐缓冲液中，24 h内GEF原料药累积释放百分率为98.91%，几乎完全释放。0.5 h内ERG/GEF-LIP的累积释放百分率为14.25%<40%，6 h内ERG/GEF-LIP的累积释放百分率为81.97%>80%，直至24 h，ERG/GEF-LIP的累积释放百分率为88.92%。2015版《中国药典》中关于脂质体突释效应的要求：开始0.5 h的释放量应≤40%^[49]，且24 h的累积释放百分率超过80 %。在释放介质为pH6.4的含40%甲醇的磷酸盐缓冲液下，ERG/GEF-LIP符合该要求。载药脂质体在弱酸性环境下更易释放，这将有利于脂质体选择性的在肿瘤酸性环境下释放出内容物。

利用一定的模型对释药过程进行拟合是释药机制研究的常用方法，主要有零级模型、一级模型、Higuchi模型等。本文分别对GEF溶液和ERG/GEF-LIP的体外累积释放百分率按零级、一级和Higuchi方程拟合，模型公式见图1，拟合结果和相关系数见图2。

图2拟合结果表明，在pH7.4的释放介质下，GEF柠檬酸溶液的体外释放更接近Higuchi方程，但是一级动力学方程的拟合相关系数也达到了0.9952。在pH6.4的释放介质下，GEF柠檬酸溶液的体外释放符合一级动力学方程。ERG/GEF-LIP的体外释放在不同pH的释放介质下均符合一级动力学方程。

1.8 非小细胞肺癌细胞GEF耐药株的诱导以及耐药指数（RI）的测定

采用逐步递增GEF浓度间歇作用的方法构建PC-9/GR^[50]：取对数生长期的PC-9细胞接种于含10%FBS的1640培养基中，采用浓度为10 μM GEF溶液作用48 h后弃去含药培养基，并且加入新鲜的培养液后继续培养。等待PC-9恢复正常生长速度后，消化传代后继续用浓度为10 μM的GEF浓度处理细胞48 h，重复以上操作，间歇诱导细胞约3~4周，命名为PC-9/GR。

取对数生长期PC-9/GR及PC-9 细胞，胰酶消化后调整细胞为5×10⁴个· mL^-1。每孔加入100 μL接种于96孔培养板，于37℃、5 % CO₂培养箱中培养。细胞长至80%左右，按浓度梯度分别加入GEF，每组5个复孔，同时设置正常对照组，给药24h后进行MTT检测。具体MTT操作详见第一部分中的“（四）ERG联合GEF对A549以及PC-9细胞的增殖抑制作用研究（MTT试验）”。本实验平行3次测定，结果见图10和图3。结果表明不同GEF对于PC-9细胞的抑制率均极显著高于PC-9/GR细胞（P<0.01），通过SPSS17.0软件分析得出PC-9/GR细胞耐药指数为13.90，细胞高度耐药。

1.9 ERG/GEF-LIP体外耐药细胞增殖抑制试验

采用体外培养PC-9/GR细胞，给予ERG、GEF、ERG+GEF，空白脂质体（LIP），ERG-LIP，ERG/GEF-LIP刺激24 h后，测定不同浓度给药后的细胞增殖抑制率。具体MTT操作详见第一部分中的“（四）ERG联合GEF对A549以及PC-9细胞的增殖抑制作用研究（MTT试验）”。本实验平行3次测定，结果见图11。药物作用24 h时，LIP组各浓度下的抑制率均小于10%，表明在该浓度范围内，辅料对耐药细胞无抑制作用。在相同给药浓度下，ERG/GEF-LIP组与其他组别相比，抑制率均明显升高，差异有极显著性（P< 0.01）。其中GEF组的抑制率除了LIP组外最低，也在一定程度上证明耐药细胞模型建立成功。整个实验结果表明，将ERG与GEF制备成脂质体后，能够显著增加其体外抗PC-9/GR细胞的增殖抑制作用。

1.10 ERG/GEF-LIP体外耐药细胞摄取试验

将FITC甲醇溶液与SPC，Chole，ERG共同旋蒸形成薄膜，LIP，ERG-LIP中的FITC浓度为275 μg· mL^-1，ERG/GEF-LIP中的FITC浓度为137.5 μg· mL^-1。定量将所制备的FITC标记的LIP，ERG-LIP，ERG/GEF-LIP用完全1640培养基稀释至FITC终浓度为25 μg· mL^-1。将PC-9/GR细胞接种在6孔板内，待细胞生长至80%时，弃去培养基后加入FITC终浓度为25 μg·mL^-1的各脂质体给药组。在培养箱中孵育2 h后弃去药物，用PBS清洗3次，胰酶消化收集细胞，加入PBS清洗3遍，离心去除上清后加入0.5 mL PBS重悬细胞，采用流式细胞仪检测细胞对不同脂质体给药组的摄取强度。结果见图4和图12。实验结果表明，相对比正常对照组，ERG/GEF-LIP组的摄取强度最高（P<0.01），达到97.14±0.93%，ERG-LIP组摄取率其次，达到73.25±0.95%，表明双载药脂质体相对于单载药脂质体对于细胞摄取的效果最佳，药物通过脂质体载体能更加顺利进入细胞内部发挥药效作用。LIP组的摄取率仅有13.81±1.78%，表明未载药的脂质体，对于细胞摄取并没有太大影响。

三、分析与讨论

本部分实验在ERG-LIP基础上，采用硫酸铵梯度法包载GEF，制备ERG/GEF-LIP。并以GEF包封率为指标，通过响应面设计，对孵育时间，孵育温度，硫酸铵浓度和吉非替尼浓度四个因素进行优化分析，确定硫酸铵梯度法包载GEF的最佳处方工艺为：孵育温度40℃，孵育时间50.35 min，GEF浓度0.22 mg·mL^-1，硫酸铵浓度195.81 mM。所得ERG/GEF-LIP为负电性脂质体。

体外释放度的考察中发现，GEF作为弱碱性药物，其溶解度具有pH依赖性。pH7.4的磷酸盐缓冲液下，脂质体出现白色浑浊现象，HPLC几乎测不到游离GEF的存在。在pH6.4的释放介质下，24 h的累积释放百分率大于80%，符合2015版国家药典要求。体外耐药细胞试验表明了空白脂质体对耐药细胞本身并无毒性作用，ERG/GEF-LIP在一定程度上增加PC-9/GR细胞的敏感性，其增殖抑制作用最好。

四、小结

本发明成功将ERG和GEF共同载于脂质体中，包封率均大于90%。体外耐药细胞试验证实ERG/GEF-LIP具有较强肿瘤细胞增殖抑制作用和较强的细胞摄取作用。

Claims (10)

1.一种麦角甾醇联合吉非替尼脂质体的制备方法，其特征在于：以硫酸铵梯度法包载GEF，制备ERG联合GEF复方脂质体；具体制备工艺如下：摩尔比（3~7）:1的SPC与Chole、载药量5~15wt% 的ERG，用氯仿充分溶解，置于30~50℃水浴的旋转蒸发仪上旋干，真空干燥至无味；加入纯水置于水平摇床上水化20~50min，转速100~200rpm/mL，得到中间品；将中间品放置于冰浴下，探头超声10~30min，超声1~5s，停0.5~2s；依次采用多级微孔滤膜过滤，最后用0.1μm的聚碳酸酯膜高压挤出，即得。

2.根据权利要求1所述的麦角甾醇联合吉非替尼脂质体的制备方法，其特征在于：SPC与Chole的摩尔比为5:1。

3.根据权利要求1所述的麦角甾醇联合吉非替尼脂质体的制备方法，其特征在于： ERG的载药量10wt%。

4.根据权利要求1所述的麦角甾醇联合吉非替尼脂质体的制备方法，其特征在于：转速为130~160rpm/mL。

5.根据权利要求1所述的麦角甾醇联合吉非替尼脂质体的制备方法，其特征在于：所述多级微孔滤膜分别为0.8μm、0.45μm、0.22μm。

6.根据权利要求1所述的麦角甾醇联合吉非替尼脂质体的制备方法，其特征在于：硫酸铵的浓度为150~250mM。

7.根据权利要求1所述的麦角甾醇联合吉非替尼脂质体的制备方法，其特征在于：孵育温度为30~50℃。

8.根据权利要求1所述的麦角甾醇联合吉非替尼脂质体的制备方法，其特征在于：ERG/GEF的浓度比为（1.5~6）:1。

9.依照权利要求1-5任一项所述方法制备得到的麦角甾醇联合吉非替尼脂质体。

10.根据权利要求9所述的脂质体，其特征在于：该脂质体的平均粒径为145.2±1.0nm；多分散系数PDI为0.199±0.036；该脂质体的Zeta电位为-19.0±3.1mV；pH为5.05±0.12；平均过氧化氢值为0.0237±0.0018；包封率为95.33±0.21%，载药量为3.94±0.10%。