CN115137701B - 一种脂质体，其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，具体讲，涉及一种脂质体，其制备方法及应用。本发明的脂质体包括磷脂双分子层和由磷脂双分子层构成的亲水囊，磷脂双分子层内包载有Toll样受体激动剂，亲水囊内包载有精氨酸、也可同时包载有精氨酸和碳酸钙颗粒。本发明提出的脂质体克服了Toll样受体激动剂单独用于肿瘤治疗效果有限的缺陷，同时提供底物精氨酸，促进肿瘤部位血管正常化，达到辅助增加肿瘤治疗的效果。在脂质体内同时包载碳酸钙颗粒，可在弱酸性的溶酶体中被酸降解产生二氧化碳，促进药物溶酶体逃逸，实现药物控制释放。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体讲，涉及一种脂质体，其制备方法及应用。
背景技术
在肿瘤引起的死亡中，其中85％以上是由实体瘤引起的。实体瘤由肿瘤细胞和免疫抑制的肿瘤微环境组成。肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)是构成肿瘤免疫抑制微环境的主要成分，主要表现为促肿瘤作用的M2型，抑制免疫系统发挥抗肿瘤的作用，促进肿瘤进展，其高表达精氨酸酶(Arginase-1，ARG1)。但TAMs具有相当大的可塑性，使用Toll样受体激动剂将M2型TAMs重塑至具有抗肿瘤作用的M1型，可以解除免疫抑制，使TAMs重新发挥抗肿瘤作用。
为了满足肿瘤细胞的生长和转移的需求，在这些肿瘤部位生长出许多新生血管。但这些新生血管与正常血管不同，由不连续的内皮细胞组成，周细胞覆盖不完全，导致了新生的肿瘤血管功能不完全。这不仅阻碍了药物递送至肿瘤内部，血管周细胞覆盖的不完全会导致肿瘤的转移。因此调节肿瘤血管正常化，可以改善药物的递送，减少肿瘤细胞的转移。一氧化氮(nitric oxide，NO)是一种常用的血管调节剂，可以促进血管正常化。然而，现有NO释放供体半衰期短，递送的困难。而且大部分现有的NO供体需要紫外、可见光、近红外、X光等促进NO供体释放NO，这极大地限制了NO供体的应用。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一发明目的在于提出一种脂质体，用于Toll样受体激动剂和精氨酸的协同给药。
本发明的第二发明目的在于提出一种酸响应脂质体，用于Toll样受体激动剂和精氨酸的协同给药以及控制释放。
本发明的第三发明目的在于提出上述脂质体和酸响应脂质体的制备方法。
本发明的第四发明目的在于提出上述脂质体和酸响应脂质体的应用。
为了实现本发明的发明目的，采用的技术方案为：
本发明提出一种脂质体，包括磷脂双分子层和由所述磷脂双分子层构成的亲水囊，所述磷脂双分子层由磷脂和胆固醇构成；
所述磷脂双分子层内包载有Toll样受体激动剂，所述亲水囊内包载有精氨酸；
优选地，所述脂质体的平均粒径为50～200nm。
本发明还提出该脂质体的制备方法，至少包括以下步骤：
S1、将磷脂、胆固醇和Toll样受体激动剂加入有机溶剂中溶解，除去所述有机溶剂；优选在42～48℃水浴下减压旋转蒸发除去所述有机溶剂；
S2、加入精氨酸水溶液，使用涡旋仪使S1中获得的磷脂膜水化，均质后过滤，获得所述脂质体。
本发明还提出一种酸响应脂质体，所述脂质体包括磷脂双分子层和由所述磷脂双分子层构成的亲水囊，所述磷脂双分子层由磷脂和胆固醇构成；
所述磷脂双分子层内包载有Toll样受体激动剂，所述亲水囊内包载有精氨酸和碳酸钙颗粒；
优选地，所述碳酸钙颗粒的粒径为10～200nm；
更优选地，所述脂质体的平均粒径为50～200nm。
本发明还提出该酸响应脂质体的制备方法，至少包括以下步骤：
S1、将磷脂、胆固醇、Toll样受体激动剂和钙的可溶性盐加入有机溶剂中溶解，除去所述有机溶剂；优选在42～48℃水浴下减压旋转蒸发除去所述有机溶剂；
S2、加入精氨酸水溶液，使用涡旋仪使S1中获得的磷脂膜水化，均质后过滤，
S3、将S2中获得的产物中通入二氧化碳气体，获得所述脂质体。
本发明还提出上述脂质体在用于制备抗肿瘤药物中的应用；优选地，所述应用为制备靶向抗肿瘤药物中的应用；所述应用选自：制备用于促进肿瘤部位血管正常化的药物中的应用、制备用于递送NO的药物中的应用；所述抗肿瘤药优选进一步包含选自卡博替尼、乐伐替尼、瑞戈非尼、索拉非尼、帕唑帕尼、舒尼替尼、阿昔替尼、阿帕替尼、贝伐单抗、雷莫芦单抗中的一种或多种。
本发明的技术方案至少能达到以下技术效果：
本发明提出的共载Toll样受体激动剂和精氨酸的脂质体可以克服Toll样受体激动剂单独用于肿瘤治疗效果有限的缺陷，同时利用精氨酸为底物，利用Toll样受体激动剂调节后巨噬细胞表达的iNOS，在肿瘤部位产生一氧化氮，解决了一氧化氮递送的问题，进而促进肿瘤部位血管正常化，使药物更容易递送至肿瘤部位，达到辅助增加肿瘤治疗的效果。
同时，由于精氨酸的胍基具有碱性，pKa值为12.48，可以与水和二氧化碳反应，生成精氨酸的碳酸氢盐。精氨酸的碳酸氢盐与钙的可溶性盐反应生成碳酸钙，碳酸钙在酸性条件下被分解产生二氧化碳。在脂质体内包载的碳酸钙颗粒，能够在弱酸性的溶酶体中被酸降解产生二氧化碳，促进药物溶酶体逃逸，从而实现药物控制释放。
附图说明
图1为实施例1和实施例2的脂质体的粒径分布图(左图为实施例1的脂质体的粒径分布图，右图为实施例2的脂质体的粒径分布图)；
图2为脂质体的透射电镜图(左图为实施例1的脂质体的透射电镜图，右图为实施例2的脂质体的透射电镜图)；
图3为脂质体的粒径和PDI随时间变化情况(A图为实施例1的脂质体的粒径和PDI随时间变化情况，B图为实施例2的脂质体的粒径和PDI随时间变化情况)；
图4为脂质体的体外释药曲线(左图为实施例1的脂质体的体外释药曲线，右图为实施例2的脂质体的体外释药曲线)；
图5为脂质体的细胞摄取情况；
图6为脂质体在小鼠体内分布情况；
图7为脂质体在小鼠体内一氧化氮产生情况评价；
图8为脂质体血管正常化相关指标；
图9为脂质体免疫应答评价(A图为M1型巨噬细胞比例的变化，B图为M2型巨噬细胞比例的变化)；
图10为脂质体药效学评价。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
脂质体是常用的药物载体，具有良好的生物相容性。本发明提出一种脂质体，包括磷脂双分子层和由磷脂双分子层构成的亲水囊，磷脂双分子层由磷脂和胆固醇构成；其中，磷脂双分子层内包载有Toll样受体激动剂，所述亲水囊内包载有精氨酸。本发明中，脂质体的磷脂双分子层可以包载疏水性的Toll样受体激动剂，亲水囊可以包载精氨酸，能够将两种药物同时递送到肿瘤部位，实现协同给药，从而可调节后巨噬细胞表达的iNOS，在肿瘤部位产生一氧化氮，解决了一氧化氮递送的问题，进而促进肿瘤部位血管正常化，达到辅助增加肿瘤治疗的效果。
在某些实施方式中，采用粒度仪分析脂质体粒径及多分散系数(PDI)，脂质体的平均粒径为50～200nm，优选为100～150nm，PDI为0.1～0.2。该尺寸的颗粒可以利用肿瘤组织的高通透性和滞留(EPR)效应，实现在肿瘤组织的被动靶向作用。
本发明还提出一种酸响应脂质体，包括磷脂双分子层和由磷脂双分子层构成的亲水囊，磷脂双分子层由磷脂和胆固醇构成；磷脂双分子层内包载有Toll样受体激动剂，亲水囊内包载有精氨酸和碳酸钙颗粒。由于精氨酸的胍基具有碱性，pKa值为12.48，可以与水和二氧化碳反应，生成精氨酸的碳酸氢盐。精氨酸的碳酸氢盐与钙的可溶性盐反应生成碳酸钙，碳酸钙在酸性条件下被分解产生二氧化碳。在脂质体内包载的碳酸钙颗粒，能够在弱酸性的溶酶体中被酸降解产生二氧化碳，促进药物溶酶体逃逸，从而实现药物控制释放。
在某些实施方式中，采用粒度仪分析脂质体粒径及PDI，酸响应脂质体的平均粒径为50～200nm，优选为100～150nm，PDI在0.1～0.2。该尺寸的颗粒可以利用肿瘤组织的EPR效应，实现在肿瘤组织的被动靶向作用。
在某些实施方式中，通过图2右图透射电镜图片可观察到脂质体呈圆整的球形，说明亲水囊内包载有碳酸钙颗粒支撑，其粒径为10～200nm；钙的可溶性盐预先包载于脂质体内部，磷脂隔离了钙离子，形成了纳米尺寸的碳酸钙，不影响脂质体对肿瘤组织的被动靶向作用，而且该粒径的碳酸钙颗粒还可以赋予脂质体酸敏感性。
在某些实施方式中，磷脂选自氢化大豆磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱和二棕榈酰基卵磷脂中的一种或几种，并不限于此。
在某些实施方式中，胆固醇与磷脂的质量比为1：5～1：50；添加胆固醇可增加脂质体的刚性和稳定性，但胆固醇添加超过该比例会造成脂质体破裂。
在某些实施方式中，Toll样受体激动剂选自咪喹莫特、雷西莫特和维沙莫德中的一种或多种，并不限于此。
在某些实施方式中，精氨酸选自L-精氨酸、L-精氨酸盐酸盐、聚L-精氨酸和聚L-精氨酸盐酸盐中的一种或多种。其中，聚L-精氨酸的分子量为3～40kDa，聚L-精氨酸盐酸盐的分子量为3～40kDa。
本发明实施例还涉及该脂质体的制备方法，至少包括以下步骤：
S1、将磷脂、胆固醇和Toll样受体激动剂加入有机溶剂中溶解，除去有机溶剂；
S2、加入精氨酸水溶液，使用涡旋仪使S1中获得的磷脂膜水化，均质后过滤，获得脂质体。
本发明实施例还涉及该酸响应脂质体的制备方法，至少包括以下步骤：
S1、将磷脂、胆固醇、Toll样受体激动剂和钙的可溶性盐加入有机溶剂中溶解，除去所述有机溶剂；
S2、加入精氨酸水溶液，使用涡旋仪使S1中获得的磷脂膜水化，均质后过滤，
S3、将S2中获得的产物中通入二氧化碳气体，获得所述脂质体。
在某些实施方式中，在S1中，旋干可采用本领域常用的旋干手段，并优选采用42～48℃水浴下减压旋转除去有机溶剂。
在脂质体制备方法的某些实施方式中，在S1中，将磷脂、胆固醇和Toll样受体激动剂加入有机溶剂中进行溶解，有机溶剂选自可溶解上述物质的有机溶剂，优选三氯甲烷、二氯甲烷、丙酮的一种或几种。
在酸响应脂质体制备方法的某些实施方式中，在S1中，有机溶剂包括有机溶剂A和有机溶剂B；有机溶剂A用于溶解磷脂、胆固醇和Toll样受体激动剂，有机溶剂B用于溶解钙的可溶性盐。可将磷脂、胆固醇和Toll样受体激动剂加入有机溶剂A中进行溶剂，将钙的可溶性盐加入有机溶剂B中溶解；再将两种溶剂混合再一起。也可采用先将有机溶剂A和有机溶剂B混合，再同时加入磷脂、胆固醇、Toll样受体激动剂和钙的可溶性盐同时进行溶解的方式。优选分别溶解的方式。有机溶剂A选自可溶解上述物质、且可与有机溶剂B互溶的有机溶剂，优选选自三氯甲烷、二氯甲烷、丙酮中的一种或几种；有机溶剂B选自醇类有机溶剂，并优选选自正丙醇、正丁醇、正戊醇、乙二醇、乙醇、甲醇中的一种或两种。
在脂质体和酸响应脂质体的制备方法的实例中，在S1中，Toll样受体激动剂与磷脂的质量比为1：5～1：20；该技术优势为：Toll样受体激动剂添加过少会导致脂质体的包载量过少，达不到治疗浓度；添加过多会导致包封率下降，造成原料的浪费。
在脂质体和酸响应脂质体的制备方法的实例中，在S1中，Toll样受体激动剂与精氨酸的质量比为1：10～40，优选1：10～20，最优选1：15。
在酸响应脂质体的制备方法的实例中，在S1中，钙的可溶性盐选自氯化钙、葡萄酸钙、乳酸钙、醋酸钙、枸橼酸钙和苏糖酸钙中的一种或几种；钙的可溶性盐在有机溶剂B中的浓度为10mg/mL～100mg/mL，钙的可溶性盐的浓度与脂质体内碳酸钙的包载量相关，如果钙的可溶性盐的浓度过低，会造成碳酸钙形成过少，导致脂质体的酸敏感度不足；如果钙的可溶性盐的浓度过高，会造成钙的可溶性盐的包载率过低，同时也会导致脂质体的不稳定。
在酸响应脂质体的制备方法的实例中，在S1中，钙的可溶性盐与精氨酸的质量比为1：10～40。
在脂质体和酸响应脂质体的制备方法的实例中，在S2中，精氨酸水溶液的浓度为5～50mg/mL；如果精氨酸浓度过低，会造成精氨酸包载量降低的趋势；如果精氨酸浓度过高，会造成原材料的浪费。
在脂质体和酸响应脂质体的制备方法的实例中，在S2中，均质采用高压均质机，均质后采用孔径为100～400nm滤膜过滤；滤膜优选为聚碳酸酯膜，聚碳酸酯膜的孔径为100nm、200nm或400nm；过滤优选采用超滤柱，优选中空纤维柱，中空纤维柱截留分子量优选为100kDa。
在酸响应脂质体的制备方法的实例中，在S3中，通入二氧化碳气体的流量为50mL/min～500mL/min，通入时间为2min～-20min。
本发明实施例还涉及上述脂质体和酸响应脂质体在用于制备抗肿瘤药物中的应用；优选为制备靶向抗肿瘤药物中的应用。其中，抗肿瘤药可进一步包含选自卡博替尼、乐伐替尼、瑞戈非尼、索拉非尼、帕唑帕尼、舒尼替尼、阿昔替尼、阿帕替尼、贝伐单抗和雷莫芦单抗中的一种或多种。
进一步的，本发明实施例中提出的制备用于促进肿瘤部位血管正常化的药物中的应用、制备用于递送NO的药物中的应用。现有用于递送NO的药物包括硝酸甘油、有机硝酸酯、有机亚硝酸酯、吗多明等吸入式的药物，目前还没有针对肿瘤的递送NO的药物。因此，本发明的脂质体的提出具有重要意义，填补了肿瘤治疗药物的空白。
实施例
实施例中所用的氢化大豆磷脂(HSPC)和胆固醇(Chol)均购自艾伟拓(上海)医药科技有限公司。Toll样受体激动剂咪喹莫特(R837)购自Selleck化学科技有限公司。L-精氨酸(L-Arg)购自上海百灵威化学科技有限公司。RAW264.7细胞和CT26细胞购自中国科学院上海细胞库。荧光染料DiR，细胞核染料DAPI和多聚甲醛均购自大连美仑生物技术有限公司。一氧化氮探针DAF-FM DA购自上海碧云天生物技术有限公司。吉西他滨购自美国Sigma公司。DNA酶，透明质酸酶，胶原酶，Cy5标记和Alexa647标记的荧光二抗均购自上海翊圣生物科技有限公司。Anti-F4/80-FITC，anti-CD80-PE和anti-CD206-PE的流式抗体购自英国eBioscience公司。Anti-CD31抗体购自英国Abcam公司。NG2抗体购自美国AffinityBioscience公司。在本申请中，如无特殊说明，其余所用试剂和溶剂均购自国药集团(上海)化学试剂有限公司。
实施例中使用旋转蒸发仪(B-480，Buchi)减压去除有机溶剂。使用涡旋仪(MX-F，SCILOGEX)对磷脂膜进行水化。使用高压均质机(M-110EH-30，Microfluidizer)对脂质体进行均质。使用粒度分析仪(ZS90，Malvern)检测脂质体的粒径和PDI。使用透射电镜(TalosL120C，FEI)拍摄脂质体透射电镜照片。使用HPLC(Ultimate 3000，Thermo)检测L-Arg的浓度。使用激光共聚焦显微镜(TCS-SP8 STED，Leica)考查脂质体对肿瘤血管正常化的影响。使用流式细胞仪(BD Calibur，USA)考查脂质体细胞摄取和免疫应答情况。使用小动物活体成像仪(PE IVIS SPECTRUM，PERKIN ELMER)考查脂质体在小鼠体内的分布情况。
实施例1：Toll样受体激动剂和精氨酸共载脂质体的制备
脂质体处方：
HSPC，12.6mg；Chol，3.4mg；R837，2mg；三氯甲烷，5mL；L-Arg水溶液，15mg/mL。
制备工艺为：
S1、将HSPC、Chol和R837溶解于三氯甲烷中，充分溶解，45℃水浴下减压旋转蒸发除去三氯甲烷，
S2、加入2mL L-Arg水溶液，涡旋水化，使用高压均质机经孔径为100nm的聚碳酸酯膜均质后，然后使用截留分子量为100kDa的中空纤维柱过滤除去游离的L-Arg。
载药量测定方法：取S2中制备的脂质体，使用HPLC测定脂质体内R837和L-Arg浓度，并通过上层体积计算上层R837和L-Arg总量，对脂质体进行冻干并称重，计算R837和L-Arg的载药量。
测定所制备的脂质体中R837载药量为10.5％，L-Arg载药量为4.2％。
实施例2：Toll样受体激动剂和精氨酸共载脂质体的制备
脂质体处方：
HSPC，12.6mg；Chol，3.4mg；R837，2mg；三氯甲烷，5mL；氯化钙，2.5mg；乙醇，0.1mL；L-Arg水溶液，15mg/mL。
制备工艺为：
S1、将HSPC、Chol和R837溶解于三氯甲烷中，氯化钙溶于乙醇中，使两种溶液充分溶解，45℃水浴下减压旋转蒸发除去三氯甲烷和乙醇；
S2、加入2mL L-Arg水溶液涡旋水化，使用高压均质机经孔径为100nm的聚碳酸酯膜均质后，然后使用截留分子量为100kDa的中空纤维柱过滤除去游离的氯化钙和L-Arg；
S3、将S2中获得的产物中通入二氧化碳气体。
载药量测定方法：取S2中制备的脂质体，使用HPLC测定脂质体内R837和L-Arg浓度，并通过上层体积计算上层R837和L-Arg总量，对脂质体进行冻干并称重，计算R837和L-Arg的载药量。
测定所制备的脂质体中R837载药量为10.0％，L-Arg载药量为4.0％。
实施例3：Toll样受体激动剂和精氨酸共载脂质体的粒度及PDI的测定
采用粒度仪分析实施例1和实施例2脂质体粒径及PDI，结果如图1所示，左图为实施例1的脂质体的粒径分布图，右图为实施例2的脂质体的粒径分布图。实施例1和实施例2的脂质体的平均粒径在120nm左右，PDI在0.1左右。
实施例4：Toll样受体激动剂和精氨酸共载脂质体透射电镜检测
对实施例1和实施例2的脂质体样品进行透射电镜检测，结果如图2所示，左图为实施例1的脂质体的透射电镜图，右图为实施例2的脂质体的透射电镜图，实施例1的脂质体和实施例2的脂质体粒径大约为100～120nm，实施例1的脂质体在透射电镜下呈囊泡状，实施例2的脂质体由于内部碳酸钙的支撑在透射电镜下呈圆整球形。
实施例5：Toll样受体激动剂和精氨酸共载脂质体体外稳定性考察
将实施例1和实施例2的脂质体保存在4℃，考察其粒径和PDI的变化情况。取样点：1、2、3、4、5、6、7天。
结果如图3所示，其中A图为实施例1的脂质体的粒径和PDI，B图为实施例2的脂质体的粒径和PDI。七天内脂质体的粒径和PDI没有明显变化，说明实施例1和实施例2的脂质体在4℃下保存稳定性较好。
实施例6：L-Arg水溶液筛选试验
按照实施例2制备脂质体，区别在于：L-Arg水溶液的浓度和添加体积如表1所示：
表1
使用上述不同浓度的L-Arg水溶液进行水化制备脂质体，并计算L-Arg的载药量。由表1可知，L-Arg浓度为15mg/mL时，L-Arg的载药量最高；继续提高L-Arg溶液浓度，不能明显提高L-Arg的载药量，过高的L-Arg浓度还会造成原材料的浪费，因此优选15mg/mLL-Arg水溶液作为L-Arg水化浓度。
实施例7：氯化钙溶液筛选试验
按照实施例2制备脂质体，区别在于：氯化钙浓度及添加量如表2所示：
表2
| 氯化钙溶液浓度mg/mL | 氯化钙溶液体积μL | 粒径nm | |
| L8 | 10 | 100 | 120.1 |
| L9 | 25 | 100 | 118.0 |
| L10 | 50 | 100 | 120.6 |
| L12 | 100 | 100 | 150.6 |
| L13 | 150 | 100 | 196.5 |
由表2可知，按上述不同浓度加入氯化钙溶液，氯化钙溶液浓度提升至25mg/mL时，脂质体的粒径没有明显变化；继续提高氯化钙溶液浓度，过多的氯化钙会导致形成的脂质体粒径过大，从而会导致脂质体不稳定，因此优选25mg/mL的为氯化钙溶液浓度。
实施例8：Toll样受体激动剂和精氨酸共载脂质体体外释药情况的评价
采用HPLC考察脂质体体外释放行为。将实施例1和实施例2制备的脂质体装入透析袋(截留分子量，8kDa)，分别放入不同的体外释放介质(pH 7.4PBS，pH 5.0PBS)，取样点：0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，12h，24h，48h，使用HPLC检测释放液中L-Arg的浓度。
结果如图4所示，左图为实施例1的脂质体的体外释药曲线，右图为实施例2的脂质体的体外释药曲线。实施例1中的脂质体在pH 7.4和pH 5.0的释放介质中释放速率没有明显区别，这是因为实施例1中的脂质体不具有酸敏感性；实施例2中的脂质体在pH 5.0的释放介质中，脂质体的释放明显快于在pH 7.4的释放介质中，这是由于在中性条件下，脂质体包载的碳酸钙基本不反应，在酸性条件下脂质体包载的碳酸钙反应生成二氧化碳，促进了药物释放。
实施例9：Toll样受体激动剂和精氨酸共载脂质体细胞摄取情况的评价
细胞摄取实验中使用DiR标记脂质体，具体制备工艺见实施例2，其中不同的是，在S1中三氯甲烷中增加0.4mg DiR。
RAW264.7细胞以1×105/孔的密度接种于12孔板，37℃培养24h后，弃去培养基，加入含DiR标记脂质体的培养基，37℃培养4h后，去除培养基，PBS清洗三次，收集细胞，流式细胞仪检测DiR标记脂质体的细胞摄取情况。结果如图5所示。
由图5可知，DiR标记的脂质体呈红色荧光，发光强弱取决于RAW264.7细胞摄取量的多少。流式细胞分析中，脂质体组RAW264.7细胞的荧光强度明显高于与PBS组，说明脂质体能够有效被RAW264.7细胞摄取。
实施例10：Toll样受体激动剂和精氨酸共载脂质体在小鼠体内分布情况的评价
将对数生长期的CT26细胞以2×106/只接种至BALB/C小鼠的右侧背部皮下，待肿瘤达到一定体积，小鼠尾静脉注射DiR标记的脂质体，具体制备工艺见实施例9。注射6h后，使用小动物活体成像仪拍摄小鼠体内荧光分布情况。DiR激发波长Ex＝740nm，发射波长Em＝780nm。结果如图6所示。
由图6可知，相比于其他部位，小鼠肿瘤部位荧光强度较大，说明脂质体能够靶向肿瘤部位。
实施例11：脂质体对小鼠肿瘤部位一氧化氮产生情况和血管正常化相关指标的影响
Toll样受体激动剂和精氨酸共载脂质体对一氧化氮产生情况的影响
将对数生长期的CT26细胞以2×106/只接种至BALB/C小鼠的右侧背部皮下，待肿瘤达到一定体积，将小鼠分为两组，分别尾静脉注射给药：PBS、实施例2脂质体。实验第1、3、5天分别给药一次，其中R837的给药剂量为5mg/kg，L-Arg的给药剂量为2mg/kg。第5天给药后在瘤内注射一氧化氮探针DAF-FM DA，12h后处死小鼠，剖下肿瘤，进行冷冻切片，获得10μm厚的肿瘤切片。使用多聚甲醛固定肿瘤切片样品，使用DAPI对细胞核进行染色，使用激光共聚焦显微镜对一氧化氮表达情况进行考察。结果如图7所示。
由图7可知，相比于PBS组，Lipo组绿色荧光强度较大，说明Lipo组产生的一氧化氮产生较多。验证了脂质体能够将TAMs重塑至高表达iNOS的M1亚型，同时利用脂质体包载的L-Arg合成一氧化氮。
实施例12：Toll样受体激动剂和精氨酸共载脂质体对血管正常化相关指标的影响
将实施例11获得的肿瘤切片使用多聚甲醛进行固定，室温孵育标记血管的CD31大鼠来源的单克隆抗体和标记血管周细胞的NG2兔来源的单克隆抗体2h，CD31抗体和NG2抗体以1：100的比例进行稀释。随后室温孵育Cy5标记的兔抗鼠的荧光二抗和Alexa647标记的山羊抗兔的荧光二抗2h，Cy5标记的荧光二抗和Alexa647标记的荧光二抗以1：100的比例进行稀释。使用DAPI对细胞核进行染色，使用激光共聚焦显微镜对肿瘤组织CD31和NG2的表达情况进行考察。结果如图8所示。
由图8可知，相比于PBS组，Lipo组在表达CD31的区域同时表达NG2，说明Lipo组的血管周细胞较完整，进一步说明了共载脂质体诱导肿瘤区域产生一氧化氮的促进肿瘤区域血管正常化。
实施例13：Toll样受体激动剂和精氨酸共载脂质体免疫应答的研究
将对数生长期的CT26细胞以2×106/只接种至BALB/C小鼠的右侧背部皮下，待肿瘤达到一定体积，将小鼠分为两组，尾静脉注射给药：PBS，实施例2脂质体。实验第1、3、5天分别给药一次，其中R837的给药剂量为5mg/kg，L-Arg的给药剂量为2mg/kg。第5天给药后处死小鼠，剖下肿瘤并剪碎至2-3mm的小块，使用DNA酶，透明质酸酶和胶原酶将肿瘤组织消化成单细胞悬液。然后用Anti-F4/80-FITC，Anti-CD80-PE，Anti-CD45-PerCP-Cy5.5和Anti-CD11b-APC对M1型巨噬细胞进行染色。Anti-F4/80-FITC，Anti-CD206-PE，Anti-CD45-PerCP-Cy5.5和Anti-CD11b-APC对M1型巨噬细胞进行染色。用流式细胞仪检测小鼠肿瘤部位M2型巨噬细胞比例的变化。结果如图9所示，其中A图为M1型巨噬细胞比例的变化，B图为M2型巨噬细胞比例的变化。
由图9可知，与PBS组相比，脂质体组M1型巨噬细胞的比例上调了10％左右。
实施例14：Toll样受体激动剂和精氨酸共载脂质体抗结肠癌生长的研究
将对数生长期的CT26细胞以2×106/只接种至BALB/C小鼠的右侧背部皮下，待肿瘤体积约50mm3时，将小鼠分为四组，尾静脉注射给药：PBS，吉西他滨，实施例2脂质体，实施例2脂质体与吉西他滨联用。实验第1、4、7、10、13天分别给药一次，其中R837的给药剂量为5mg/kg，L-Arg的给药剂量为2mg/kg，每两天对小鼠肿瘤体积进行监测。瘤体积按照公式，瘤体积＝1/2(长径×短径×短径)计算。结果如图10所示。
由图10可知，与PBS组相比，实施例2脂质体能够显著抑制小鼠结肠癌的生长。同时，与吉西他滨组相比，实施例2脂质体与吉西他滨联用组对小鼠结肠癌的生长抑制显著提升，说明实施例2脂质体能辅助增强吉西他滨的肿瘤治疗效果。
Claims (23)
1.一种脂质体的制备方法，其中，所述脂质体包括磷脂双分子层和由所述磷脂双分子层构成的亲水囊，所述磷脂双分子层由磷脂和胆固醇构成；所述磷脂双分子层内包载有Toll样受体激动剂，所述亲水囊内包载有精氨酸和碳酸钙颗粒；所述精氨酸为选自L-精氨酸、L-精氨酸盐酸盐、聚L-精氨酸和聚L-精氨酸盐酸盐中的一种或多种，
其中，所述制备方法至少包括以下步骤：
S1、将磷脂、胆固醇、Toll样受体激动剂和钙的可溶性盐加入有机溶剂中溶解，除去所述有机溶剂；
S2、加入精氨酸水溶液，使用涡旋仪使S1中获得的磷脂膜水化，均质后过滤；
S3、将S2中获得的产物中通入二氧化碳气体，获得所述脂质体，
其中，Toll样受体激动剂与磷脂的质量比为1：5～1：20，所述精氨酸水溶液的浓度为5～50mg/mL，Toll样受体激动剂与精氨酸的质量比为1：10～40，所述钙的可溶性盐与精氨酸的质量比为1：10～40。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，S1中，在42～48℃水浴下减压旋转蒸发除去所述有机溶剂。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述钙的可溶性盐为选自氯化钙、葡萄酸钙、乳酸钙、醋酸钙、枸橼酸钙和苏糖酸钙中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述磷脂为选自氢化大豆磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱和二棕榈酰基卵磷脂中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述胆固醇与磷脂的质量比为1：5～1：50。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述Toll样受体激动剂为选自咪喹莫特、雷西莫特和维沙莫德中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述聚L-精氨酸的分子量为3～40kDa，所述聚L-精氨酸盐酸盐的分子量为3～40kDa。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述有机溶剂包括有机溶剂A和有机溶剂B；所述有机溶剂A用于溶解磷脂、胆固醇和Toll样受体激动剂，所述有机溶剂B用于溶解所述钙的可溶性盐；
所述有机溶剂A为选自三氯甲烷、二氯甲烷、丙酮的一种或几种；
所述有机溶剂B选自醇类溶剂。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其中，所述醇类溶剂为选自乙醇、甲醇、正丙醇、正丁醇、正戊醇和乙二醇中的一种或几种。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其中，所述钙的可溶性盐在所述有机溶剂B中的浓度为10～100mg/mL。
11.根据权利要求1所述的制备方法，其中，在S3中，通入二氧化碳气体的流量为50～500mL/min，通入的时间为2～20min。
12.根据权利要求1所述的制备方法，其中，在S2中，所述均质采用高压均质机，均质后采用孔径为100～400nm滤膜过滤。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其中，所述滤膜为聚碳酸酯膜，所述聚碳酸酯膜的孔径为100nm、200nm或400nm。
14.根据权利要求12所述的制备方法，其中，所述过滤采用超滤柱。
15.根据权利要求14所述的制备方法，其中，所述超滤柱为中空纤维柱。
16.根据权利要求15所述的制备方法，其中，所述中空纤维柱截留分子量为100kDa。
17.一种脂质体，其由如权利要求1-16中任一项所述的脂质体的制备方法而得到。
18.根据权利要求17所述的脂质体，其中，所述碳酸钙颗粒的粒径为10～200nm。
19.根据权利要求17所述的脂质体，其中，所述脂质体的平均粒径为50～200nm。
20.如权利要求17-19中任一项所述的脂质体在用于制备抗肿瘤药物中的应用。
21.根据权利要求20所述的应用，其中，所述应用为制备靶向抗肿瘤药物中的应用。
22.根据权利要求20所述的应用，其中，所述应用选自：制备用于促进肿瘤部位血管正常化的药物中的应用、制备用于递送NO的药物中的应用。
23.根据权利要求20所述的应用，其中，所述抗肿瘤药物包含选自卡博替尼、乐伐替尼、瑞戈非尼、索拉非尼、帕唑帕尼、舒尼替尼、阿昔替尼、阿帕替尼、贝伐单抗、雷莫芦单抗的一种或多种。
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| Belhadj et al. | A combined “eat me/don’t eat me” strategy based on extracellular vesicles for anticancer nanomedicine | |
| Yu et al. | Sequentially responsive biomimetic nanoparticles with optimal size in combination with checkpoint blockade for cascade synergetic treatment of breast cancer and lung metastasis | |
| Kong et al. | Biodegradable hollow mesoporous silica nanoparticles for regulating tumor microenvironment and enhancing antitumor efficiency | |
| Wang et al. | Selective targeting of tumor cells and tumor associated macrophages separately by twin-like core–shell nanoparticles for enhanced tumor-localized chemoimmunotherapy | |
| Wang et al. | Strategies for liposome drug delivery systems to improve tumor treatment efficacy | |
| Chen et al. | Lipid insertion enables targeted functionalization of paclitaxel-loaded erythrocyte membrane nanosystem by tumor-penetrating bispecific recombinant protein | |
| Ding et al. | Tumor targeted nanostructured lipid carrier co-delivering paclitaxel and indocyanine green for laser triggered synergetic therapy of cancer | |
| Chen et al. | Redox dual-responsive and o2‑evolving theranostic nanosystem for highly selective chemotherapy against hypoxic tumors | |
| Yu et al. | Near-infrared photoactivatable semiconducting polymer nanocomplexes with bispecific metabolism interventions for enhanced cancer immunotherapy | |
| Qu et al. | Targeted delivery of doxorubicin via CD147-mediated ROS/pH dual-sensitive nanomicelles for the efficient therapy of hepatocellular carcinoma | |
| EP3834844A1 (en) | AMYLOID ß SHORT PEPTIDE MEDIATED BRAIN TARGETED DELIVERY SYSTEM, PREPARATION METHOD THEREFOR AND USE THEREOF | |
| Liu et al. | Inhibition of growth and metastasis of breast cancer by targeted delivery of 17-hydroxy-jolkinolide B via hyaluronic acid-coated liposomes | |
| Zhang et al. | Tumor cell membrane-derived nano-Trojan horses encapsulating phototherapy and chemotherapy are accepted by homologous tumor cells | |
| Wei et al. | Paclitaxel targeting to lungs by way of liposomes prepared by the effervescent dispersion technique | |
| Dong et al. | “Hook&Loop” multivalent interactions based on disk-shaped nanoparticles strengthen active targeting | |
| CN115137701B (zh) | 一种脂质体，其制备方法及应用 | |
| Luo et al. | Self-anti-angiogenesis nanoparticles enhance anti-metastatic-tumor efficacy of chemotherapeutics | |
| Ao et al. | Enhanced tumor accumulation and therapeutic efficacy of liposomal drugs through over-threshold dosing | |
| Wang et al. | Single-ligand dual-targeting irinotecan liposomes: Control of targeting ligand display by pH-responsive PEG-shedding strategy to enhance tumor-specific therapy and attenuate toxicity | |
| Le et al. | Biomimetic polyphenol-coated nanoparticles by Co-assembly of mTOR inhibitor and photosensitizer for synergistic chemo-photothermal therapy | |
| EP3616726B1 (en) | Protein particle wrapped with medicine insoluble in water and preparation method therefor | |
| CN112957480B (zh) | 一种双靶向聚合物药物纳米载体及其制备方法和应用 | |
| Zhu et al. | Multi-targeting liposomal codelivery of cisplatin and rapamycin inhibits pancreatic cancer growth and metastasis through stromal modulation | |
| CN108498485B (zh) | 二氢青蒿素修饰的药物传递载体及其在药学中的应用 | |
| Fu et al. | Gas-blasting nanocapsules to accelerate carboplatin lysosome release and nucleus delivery for prostate cancer treatment |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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