WO2020162705A1 - 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체 및 그 용도 - Google Patents

톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체 및 그 용도 Download PDF

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toll
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임용택
신홍식
랜롱
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Definitions

  • the present invention relates to a conjugate of cholesterol with a Toll-like receptor 7 or 8 effector, and more specifically, cholesterol is an active site of a Toll-like receptor 7 or 8 effector and a cleavable site ) Chemically bonded to the conjugate, its use, and the like.
  • the immune response is a series of reactions caused by activated immune cells to foreign and endogenous substances, i.e., antigens.
  • the immune cells It is recognized and activated, and secretes factors such as cytokines to induce an inflammatory response.
  • TLRs Toll-like receptors
  • toll-like receptor 7 or 8 agonist-based substances are used as immune adjuvants that induce cellular immune responses, and Imiquimod, Resiquimod, and Dactolisib , Gardiquimod, Sumanirole, Motolimod, vesatolimod, loxoribine, SM360320, CL264, 3M-003, IMDQ, Compound 54, etc. It is known (US Patent Publication 2012-0294885).
  • These Toll-like receptors 7 or 8 agonists are known to effectively induce not only humoral immunity but also cellular immunity as agonists of Toll-like receptors 7 or 8 in endosomes.
  • Toll-like receptor 7 or 8 agonists are difficult to disperse in aqueous solutions due to their molecular structure.
  • it since it is soluble only in special organic solvents such as DMSO and methanol, and is not soluble in commonly used organic solvents, it has a limitation in preparing various formulations of immune-activating substances. Therefore, it is commercially available as a cream formulation (eg, Aldara® cream) mixed with various surfactants.
  • the Toll-like receptor 7 or 8 agonist prepared by this method still has the possibility of inducing toxicity by inducing a non-specific immune response in the body because its active site is still exposed to the outside.
  • Toll-like receptor 7 or 8 agonist that can be prepared in various formulations with suppressed non-specific immune response without being absorbed into blood vessels in the body is developed, it has low side effects as various immune activating agents and can be widely used. Is expected.
  • the present invention was devised to solve the problems of the prior art as described above, and the immune activation function of Toll-like receptors 7 or 8 is temporarily inhibited, and then immune activation in the tumor microenvironment or target cells. It is an object of the present invention to provide a conjugate of cholesterol with a toll-like receptor 7 or 8 agonist and a use thereof, which is designed to be recovered.
  • the present invention relates to a technology capable of minimizing a Toll-like receptor 7 or 8 effector as a variety of pharmacological formulations in order to be effectively used in actual clinical practice, inducing a non-specific immune response and minimizing cytokine storms in the body.
  • toll-like receptors 7 or 8 capable of kinetic activity control (kinetically controlled activity) capable of exhibiting immune activation efficacy by recovering activity in the tumor microenvironment and target immune cells after the immune activation function is inhibited. It relates to the design of the actor's structure.
  • the present invention relates to nanoliposomes, nanoemulsions, nanomicels, polymer nanoparticles, etc. comprising a conjugate of cholesterol with a Toll-like receptor 7 or 8 functioning agent.
  • the present invention relates to an immunoantigen adjuvant composition
  • an immunoantigen adjuvant composition comprising a cholesterol-tol-like receptor 7 or 8 agonist conjugate.
  • the present invention comprises a cholesterol-toll-like receptor 7 or 8 agonist conjugates comprising an adjuvant composition; And a vaccine composition containing an antigen.
  • the present invention relates to a composition for activating immune cells and the like comprising a cholesterol-tol-like receptor 7 or 8 effector conjugate.
  • the present invention relates to an immunosuppressive cell function control composition
  • an immunosuppressive cell function control composition comprising a cholesterol-tol-like receptor 7 or 8 effector conjugate.
  • the present invention relates to an anticancer immunotherapy composition and the like comprising a cholesterol-tol-like receptor 7 or 8 agonist conjugate.
  • the present invention is a cholesterol-tol-like receptor 7 or 8 agonist conjugate; And it relates to a composition for anticancer treatment, etc. further comprising an anticancer agent, an immune checkpoint inhibitor, and the like.
  • the present invention provides a conjugate of cholesterol with a toll-like receptor 7 or 8 agonist, wherein the conjugate is a conjugate in which cholesterol is bound to an activation site of a toll-like receptor 7 or 8 agonist.
  • the bond is in a form that can be separated, preferably carbamate, disulfide, ester, peptide, azide, etc. It is not limited thereto as long as it is a chemical bond in a form that can be cleaved or a chemical bond in a form capable of cleavage in response to the enzyme and pH of endosomes and lysosomes in the tumor microenvironment or cells. .
  • the activation site of the Toll-like receptor 7 or 8 effector is exposed, and the function is kineticly restored within 4 days.
  • the toll-like receptor 7 or 8 agonist is preferably imidazoquinoloine series, hydroxyadenine series, pteridone series, aminopyrrole.
  • Midine (2-aminopyrimidine) series, benzoazepine (benzoazepine) series, thiaoxoguanosine (7-thia-8-oxoguanosine) series, their analogs (derivative), may be made of a combination thereof, and more preferably For instance, Imiquimod, Resiquimod, Dactolisib, Gardiquimod, Sumanirole, Motolimod, Vesatolimod , Loxoribine, SM360320, CL264, 3M-003, IMDQ, Compound 54, etc., but limited to Toll-like receptor 7 or 8 agonists that can represent an inactivated form by chemically binding cholesterol to the activation site. It doesn't work.
  • the present invention provides a nanoparticle composition comprising the conjugate.
  • the nanoparticles are characterized by increasing the efficacy of activating immune cells, and preferably nanoliposomes, nanomicels, solid nanoparticles, nanoemulsions, polymers containing the conjugate of the present invention Nanoparticles, etc., but are not limited thereto.
  • the inclusion may be a form that is contained regardless of the bond, or may be a form attached to the surface of the nanoparticles, or may be a form that is interposed between the nanoparticle structures, but contains the conjugate of the present invention. If it is a form, it is not limited thereto.
  • the present invention provides an immunoantigen adjuvant composition comprising the conjugate.
  • the present invention provides a vaccine composition comprising the adjuvant composition and an antigen.
  • the antigen is preferably a protein, recombinant protein, glycoprotein, gene, peptide, polysaccharide, lipopolysaccharide, polynucleotide, cell, cell lysate, bacteria, virus, etc. Any antigen known as is not limited thereto.
  • the present invention provides a composition for immune function control comprising the conjugate as an active ingredient.
  • the composition for controlling immune function may induce activation of immune cells in a tumor microenvironment or control functions of immunosuppressive cells, preferably antigen presenting cells (dendritic cells, macrophage, etc.), natural killer cells (NK cells), T cells, etc., immune cells (Treg; regulatory T cells), MDSC (myeoloid derived suppressor cells), M2 macrophages, etc. )
  • immunosuppressive cells preferably antigen presenting cells (dendritic cells, macrophage, etc.), natural killer cells (NK cells), T cells, etc., immune cells (Treg; regulatory T cells), MDSC (myeoloid derived suppressor cells), M2 macrophages, etc.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the conjugate as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition may further include substances generally used for the treatment of cancer, and preferably may further include a chemical anticancer agent, an immune checkpoint inhibitor, and the like. Since the pharmaceutical composition can effectively activate the immune function in the body by including the conjugate of the present invention, it is possible to enhance the efficacy of existing chemical anticancer agents and immune checkpoint inhibitors.
  • the pharmaceutical composition is characterized in that it suppresses the proliferation, metastasis, recurrence, etc. of cancer, or resistance to anticancer therapy, but if it is part of a generally used cancer treatment method , Is not limited thereto.
  • the cancer is preferably breast cancer, colon cancer, rectal cancer, lung cancer, colon cancer, thyroid cancer, oral cancer, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, cervical cancer, brain cancer, ovarian cancer, bladder cancer, kidney cancer, liver cancer, It may be pancreatic cancer, prostate cancer, skin cancer, tongue cancer, uterine cancer, gastric cancer, bone cancer, blood cancer, etc., but is not limited thereto.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer comprising administering a composition containing the conjugate as an active ingredient to an individual.
  • the present invention provides a use of a composition comprising the conjugate as an active ingredient for preventing or treating cancer.
  • the present invention provides a use of a composition comprising the conjugate as an active ingredient for preventing or treating infectious diseases.
  • the present invention provides a use of the conjugate for producing a drug used for the prevention or treatment of cancer.
  • the present invention provides a method for preparing a conjugate of cholesterol with a toll-like receptor 7 or 8 effector comprising the step of chemically binding cholesterol to an activation site of a toll-like receptor 7 or 8 effector using a cleavable linker. to provide.
  • the preparation method may include mixing and reacting a Toll-like receptor 7 or 8 effector, cholesteryl chloroformate, and pyridine in dichloromethane.
  • the preparation method comprises (a) dissolving 2-hydroxyethyl disulfide in tetrahydrofuran, adding and dissolving in a toluene solution, and then adding N-hydrosuccinimide and triethylamine. Adding and dissolving to prepare a disulfide cross-linking group; (b) mixing and reacting the disulfide cross-linking group and cholesterol to prepare a disulfide-cholesterol cross-linking linker; And (c) mixing and reacting the disulfide-cholesterol cross-linking group and the Toll-like receptor 7 or 8 effector.
  • the mixing in step (b) may include mixing the disulfide cross-linking group and cholesterol in a mass ratio of 3: 1 to 1: 1, and mixing in step (c) Silver disulfide-cholesterol cross-linking linkers and toll-like receptor 7 or 8 effectors can be mixed in a mass ratio of 4:1 to 1:1.
  • Toll-like receptor 7 or 8 agonists conjugates of cholesterol-toll-like receptors 7 or 8 agonists chemically bound to cholesterol according to the present invention increase lipophilicity, thereby preventing penetration into the blood.
  • the immune activation function is inhibited, and side effects and cytotoxicity of existing Toll-like receptor 7 or 8 agonists can be significantly reduced.
  • the activation site of the toll-like receptor 7 or 8 effector is kinetic immune modulation.
  • the persistence of immune activation of immune cells is increased compared to when the Toll-like receptor agonist is used alone, and the therapeutic effect can be significantly increased.
  • cholesterol-tol-like receptor 7 or 8 agonist conjugate can induce immune activation of antigen presenting cells (dendritic cells, macrophages, etc.), natural killer cells (NK cells), T cells, etc. tumor microenvironment), immune cells (regulatory T cells (Tregs), myeoloid derived suppressor cells (MDSC), M2 macrophages, etc.) , Immune checkpoint inhibitors, chemical anticancer drugs, etc. may be administered in combination, and the anticancer effect may be remarkably increased by synergistic effect.
  • antigen presenting cells dendritic cells, macrophages, etc.
  • NK cells natural killer cells
  • T cells etc. tumor microenvironment
  • immune cells regulatory T cells (Tregs), myeoloid derived suppressor cells (MDSC), M2 macrophages, etc.)
  • Immune checkpoint inhibitors may be administered in combination, and the anticancer effect may be remarkably increased by synergistic effect.
  • the present invention can be prepared not only in various formulations of the cholesterol-toll-like receptor 7 or 8 agonist conjugate, but also in various pharmaceutical compositions to induce immune activation to various diseases. It is expected to be able to significantly increase the therapeutic effect of
  • FIG. 1 is a schematic diagram of the structure and activation/inactivation mechanism of a conjugate of cholesterol with a Toll-like receptor 7 or 8 effector.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of verifying the structure of a Toll-like receptor 7 or 8 effector according to an embodiment of the present invention by 1H-NMR.
  • 3 is a view showing the results of verifying the structure of a cholesterol-bound toll-like receptor 7 or 8 effector according to an embodiment of the present invention by 1H-NMR.
  • FIG. 4 is a view showing the results of verifying the structure of a Toll-like receptor 7 or 8 effector according to an embodiment of the present invention with 15N-HSQC.
  • FIG. 5 is a view showing the results of verifying the structure of a cholesterol-bound toll-like receptor 7 or 8 effector according to an embodiment of the present invention by 15N-HSQC.
  • FIG. 6 is an enlarged view showing a result of verifying the structure of a cholesterol-bound toll-like receptor 7 or 8 effector with 15N-HSQC according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a view showing a mechanism in which cholesterol-bound toll-like receptor 7 or 8 effector according to an embodiment of the present invention is separated into cholesterol and toll-like receptor 7 or 8 effector by a physiological environment in a cell.
  • FIG. 8 is a view showing a mechanism by which cholesterol-disulfide cross-linked toll-like receptor 7 or 8 effectors according to an embodiment of the present invention are separated from cholesterol by a physiological environment in a cell.
  • FIG. 9 is a diagram schematically illustrating the form of nanoparticles including a conjugate of cholesterol and a Toll-like receptor 7 or 8 agonist.
  • FIG. 10 is a view showing the result of confirming that the conjugate of the Toll-like receptor 7 or 8 effector and cholesterol according to an embodiment of the present invention is kineticly separated over time at a constant pH.
  • FIG. 11 is a view showing the result of confirming that the conjugate of cholesterol with a Toll-like receptor 7 or 8 effector according to an embodiment of the present invention is kineticly separated over time by an enzyme.
  • FIG. 12 is a view showing the results of confirming the cytotoxicity of nanoliposomes containing a conjugate of cholesterol with a Toll-like receptor 7 or 8 effector according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 13 is a view showing the results of confirming the immune cell activation index (IL-6) of a nanoliposome comprising a conjugate of cholesterol-like receptor 7 or 8 and cholesterol according to an embodiment of the present invention.
  • IL-6 immune cell activation index
  • TNF-alpha immune cell activation index
  • cleavage material 15 is a Chol-R848 material synthesized so that cleavage occurs at the binding site of a conjugate of a toll-like receptor 7 or 8 effector and cholesterol according to an embodiment of the present invention, and a C18-R848 material synthesized so that cleavage does not occur.
  • FIG. 16 is a view illustrating the amount and residence time reaching the lymph node after injecting nanoliposome and resquimod containing a conjugate of cholesterol with a Toll-like receptor 7 or 8 according to an embodiment of the present invention in vivo. It is a figure showing the result.
  • FIG. 17 is a view showing the results of confirming the efficacy and toxicity of activating immune cells of nanoliposomes comprising a conjugate of cholesterol with a Toll-like receptor 7 or 8 according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 18 is a view showing the results of confirming the tumor growth inhibitory effect and survival rate of nanoliposomes including a conjugate of a Toll-like receptor 7 or 8 effector and cholesterol according to an embodiment of the present invention.
  • 19 is a view showing the results of confirming the ability to modulate immune cell activity in a tumor site of a nanoliposome comprising a conjugate of a Toll-like receptor 7 or 8 effector and cholesterol according to an embodiment of the present invention.
  • 20 is a view showing the results of confirming the ability to regulate immune cell activity in the spleen of a nanoliposome comprising a conjugate of cholesterol with a Toll-like receptor 7 or 8 according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 21 shows the results of confirming the effect of co-administration of a nanoliposome containing a conjugate of cholesterol with a Toll-like receptor 7 or 8 effector and an immune checkpoint inhibitor according to an embodiment of the present invention in a B16-OVA animal model. It is a drawing.
  • FIG. 22 is a view showing the results of confirming the effect of co-administration of a nanoliposome containing a conjugate of cholesterol with a Toll-like receptor 7 or 8 effector and an immune checkpoint inhibitor according to an embodiment of the present invention in a 4T1 animal model .
  • FIG. 23 is a view showing the results of confirming the effect of co-administration of a nanoliposome containing a conjugate of cholesterol with a Toll-like receptor 7 or 8 effector and an immune checkpoint inhibitor according to an embodiment of the present invention in a TC1 animal model .
  • FIG. 24 is a view showing the results of confirming the effect of co-administration of a nanoliposome containing a conjugate of cholesterol with a Toll-like receptor 7 or 8 effector according to an embodiment of the present invention and a chemical anticancer agent.
  • the conjugate of the toll-like receptor 7 or 8 agonist and cholesterol is bound in a form in which the cholesterol group is cleavable to the activation site of the toll-like receptor 7 or 8 agonist, so that the immune activation function is temporarily It is characterized by being inhibited (Fig. 1).
  • the inhibition may mean that the function of the activation site of the Toll-like receptor 7 or 8 effector is delayed.
  • the conjugate is a tumor microenvironment and/or It is characterized in that it is cross-linked to a site in which cleavage is induced by the physiological environment (low pH, enzymes, glutathione, etc.) of the cells, particularly endosomes and lysosomes (FIG. 1).
  • the physiological environment low pH, enzymes, glutathione, etc.
  • the microenvironment of tumor it may have a binding form that can be adjusted to cause cleavage by specific stimuli such as pH, temperature, redox potential, ultrasound, enzyme, magnetic filed, and near-infrared light.
  • the bond may preferably form a bond such as carbamate, disulfide, ester, peptide, azide, etc., but is not limited thereto as long as it is cleavable. .
  • the conjugates are various enzymes present in the tumor microenvironment and cells, Acid phosphatase, Acid phyrophosphatase, Phosphodiesterase, Phosphoprotein phosphatase, Phosphatidic acid phosphatase, Arylsulfatase, Proteases, Cathepsins, Collagenase, Arylamidase, Peptidase, Acid ribonuclease, deoxyribonuclease, Lipases, Triglyceride lipase, Phospholipase, Esterase, Carboxyesterase Clucocerebrosidase, Galactocerebrosidase, Sphingomyelinase, Glycosidases, alpha-Glucosidase, beta-Glucosidase, beta-Galactosidase, beta-Glucosidase, beta-Galactosidase, alpha-cet
  • the Toll-like receptor 7 or 8 agonist is characterized in that it overcomes the disadvantages of the salt-like Toll-like receptor 7 or 8 agonist by chemically binding cholesterol so that it is not absorbed into blood vessels in the body. .
  • the conjugate is easily prepared in various formulations such as nanoliposomes, nanomicelles, and nanoemulsions by easily interacting with various substances such as various lipid substances and saponins, thereby enhancing the delivery efficiency into immune cells. do.
  • cholesterol is a type of lipid, which is a generic term for a steroid-based organic substance having hydrophobic properties, and cholesterol is a variety of analogues based on cholesterol structure, and some of cholesterol is chemically It can include all compounds that can be obtained by changing to.
  • bile acid cholic acid, deoxycholic acid, lithocholic acid, chenodeoxycholic acid
  • Vitamine D Vitamine D
  • steroid hormones testosterone, estradiol, cortisol, aldosteron, prednisolone, prednisone
  • the cholesterol is a substance that helps to locate the Toll-like receptor 7 or 8 effector on the surface and inside of various types of nanoparticles, and a lipid substance having a similar function, for example, a natural lipid such as phospholipids, synthetic It can also be replaced with lipid.
  • Toll-like receptor 7/8 agonist-based materials refers to toll-like receptor 7 or 8 agonist, and imidazoquinoloine series , Hydroxyadenine (8-hydroxyadenine) series, pteridone (pteridone) series, aminopyrimidine (2-aminopyrimidine) series, benzoazepine (benzoazepine) series, thiaoxoguanosine (7-thia-8-oxoguanosine) ) May be selected from the group consisting of, and the imidazoquinoline-based compound is a compound or a pharmaceutically acceptable salt of the type mentioned in WO 2018 196823, WO 2011 049677, WO 2011 027022, WO 2017 102652, WO 2019 040491, etc.
  • the hydroxyadenine-based compound is WO 2012 080730, WO 2013 068438, WO 2019 036023, WO 2019 035969, WO 2019 035970, WO 2019 035971, WO 2019 035968, CN 108948016, US 2014 8846697, WO 2016 023511, WO Compounds or pharmaceutically acceptable salts of the type mentioned in 2017 133683, WO 2017 133686, WO 2017 133684, WO 2017 133687, WO 2017 076346, WO 2018 210298, WO 2018 095426, WO 2018 068593, WO 2018 078149, WO 2018 041763, etc. Includes, but is not limited thereto.
  • the pteridone-based compound includes compounds of the type mentioned in US 2010 0143301, WO 2016 007765, WO 2016 044182, WO 2017 035230, WO 2017 219931, WO 2011 057148, CN 1087 94486, etc., or pharmaceutically acceptable salts, , Is not limited thereto.
  • the aminopyrimidine-based compounds are WO 2010 133885, WO 2012066335, WO 2012 066336, WO 2012 067268, WO 2013 172479, WO 2012 136834, WO 2014 053516, WO 2014 053595, US 2018 0215720, WO 2012 156498, WO 2014 076221, WO 2016 141092, WO 2018 045144, WO 2015 014815, WO 2018 233648, WO 2014 207082, WO 2014 056593, WO 2018 002319, WO 2013 117615, and the like, including compounds or pharmaceutically acceptable salts of the type mentioned, but are not limited thereto. Does not.
  • the benzoazepine-based compounds are WO 2007 024612, WO 2010 014913, WO 2010 054215, WO 2011 022508, WO 2011 022509, WO 2012 097177, WO 2012 097173, WO 2016 096778, WO 2016 142250, WO 2017 202704, WO 2017 202703 , WO 2017 216054, WO 2017 046112, WO 2017 197624, and the like, including, but not limited to, compounds or pharmaceutically acceptable salts of the type mentioned.
  • the thiaoxoguanosine-based compounds include compounds of the type mentioned in WO 2016 180691, WO 2016 055553, WO 2016 180743, WO 2016 091698, etc., or pharmaceutically acceptable salts, but are not limited thereto.
  • toll-like receptor 7 or 8 compounds mentioned in PCT/US2009/035563, PCT/US2015/028264, PCT/US2016/020499, WO 2015 023598, PCT/US 2015/039776, etc. or pharmaceutically acceptable salts may be included.
  • the present invention is not limited thereto, and includes all cases of Toll-like receptor 7 or 8 agonists that can be easily guessed and used by those in the art.
  • Toll-like receptor 7 or 8 agonist is also the same as “Toll-like receptor 3 agonist” or “Toll-like receptor 9 agonist” that has a receptor inside endosomes by being delivered into cells. It can be applied as a concept to form a conjugate with cholesterol, but is not limited thereto.
  • the conjugate of a Toll-like receptor 7 or 8 effector and cholesterol regulates the immune function of immune cells which are antigen presenting cells (dendritic cells, macrophages, etc.), natural killer cells (NK cells), and T cells.
  • immune cells by inducing immune activation such as, or by regulating the functions of immune cells (Treg (regulatory T cells), MDSC (myeoloid derived suppressor cells), M2 macrophages, etc.) that act as immunosuppressive in the tumor microenvironment.
  • the function of the immune cells that have the immunosuppressive action can be regulated by inhibiting the action of Tregs, MDSC, or reducing the number of individuals, or by inducing the anticancer immune function of MDSC. It can also be controlled by converting to antigen-presenting cells. Alternatively, M2 macrophage can be converted to M1 macrophage.
  • the combined administration refers to administration with various substances such as a Toll-like receptor 7 or 8 effector and cholesterol conjugate and antigen, an immune checkpoint inhibitor, an immune antigen adjuvant, an immune activating substance, and a chemo-anticancer agent.
  • a Toll-like receptor 7 or 8 effector and cholesterol conjugate and antigen such as a Toll-like receptor 7 or 8 effector and cholesterol conjugate and antigen, an immune checkpoint inhibitor, an immune antigen adjuvant, an immune activating substance, and a chemo-anticancer agent.
  • the chemical anticancer agent is not limited as long as it is a compound used for cancer treatment known to those skilled in the art, and examples thereof include Paclitaxel, Docetaxel, 5-Flurouracil, Alendronate, Doxorubicin, Simvastatin, Hydrazinocurcumin, Amphotericin B, Ciprofloxacin, Rifabutin, Rifampicin , Efavirenz, Cisplatin, Theophyline, Pseudomonas exotoxin A, Zoledronic acid, Trabectedin, Siltuximab, Dasatinib, Sunitinib, Apatinib, 5,6-Dimethylxanthenone-4-acetic acid, Silibinin, PF-04136309, Trabectedin, Carlumab, BLZactuz97, and BLZactuz , AMG-820, IMC-CS4, GW3580, PLX6134, N-acetyl-
  • the term "immune checkpoint inhibitor” refers to a cancer treatment method that activates the immune function of the human body's immune cells to fight cancer cells, and examples thereof include anti-PD-1, anti -PD-L1, anti-CTLA-4, anti-KIR, anti-LAG3, anti-CD137, anti-OX40, anti-CD276, anti-CD27, anti-GITR, anti-TIM3, anti-41BB, anti-CD226 , anti-CD40, anti-CD70, anti-ICOS, anti-CD40L, anti-BTLA, anti-TCR, anti-TIGIT, etc., but are not limited thereto.
  • the immune activating substance is a generic term for a substance that activates immune cells, and examples thereof include toll-like receptor agonist, saponin, antiviral peptide, and inflamersome inducer ( inflammasome inducer), NOD ligand, CDS ligand (cytosolic DNA sensor ligand), STING (stimulator of interferon genes) ligand, emulsion, alum, etc., but are not limited thereto.
  • the "antigen” refers to all substances that cause an immune response in the body, and preferably, pathogens (bacteria, viruses, etc.), compounds, pollen, cancer cells, shrimp, etc., or some peptides thereof Or a protein, more preferably a cancer antigen peptide, or a substance capable of inducing an immune response in the body is not limited thereto.
  • the antigen may be preferably a protein, a recombinant protein, a glycoprotein, a gene, a peptide, a polysaccharide, a lipopolysaccharide, a polynucleotide, a cell, a cell lysate, a bacteria, a virus, etc., more preferably, a cancer antigen peptide Can be
  • the glycoproteins are antibodies, antibody fragments, structural proteins, regulatory proteins, transcription factors, toxin proteins, hormones, hormone analogs, enzymes, enzyme fragments, transport proteins, receptors, receptor fragments, biodefense inducing substances, It may be a storage protein, a movement protein, an explosive protein, a reporter protein, or the like. However, any substance capable of inducing an immune response by acting as an antigen in a living body is not limited thereto.
  • vaccine refers to a biological preparation containing an antigen that causes an immune response in a living body, and refers to an immunogen that induces immunity in a living body by injection or oral administration to a person or animal to prevent infection.
  • the animal is a human or non-human animal, and the non-human animal refers to a pig, cow, horse, dog, goat, sheep, etc., but is not limited thereto.
  • prevention refers to any action that suppresses or delays the onset of diseases such as cancer, immune disease, and infectious disease by administration of the composition according to the present invention.
  • treatment refers to any action in which symptoms such as cancer, immune disease, and infectious disease are improved or beneficially changed by administration of the composition according to the present invention.
  • composition of the present invention can be administered, and the subject is not limited.
  • cancer refers to various hematologic cancers, malignant solid tumors, and the like that can expand locally by invasion and systematically through metastasis.
  • specific examples of cancer include colon cancer, adrenal cancer, bone cancer, brain cancer, breast cancer, bronchial cancer, colon cancer and/or rectal cancer, gallbladder cancer, gastrointestinal cancer, head and neck cancer, kidney cancer, laryngeal cancer, liver cancer.
  • cancers include adenocarcinoma, adenoma, basal cell carcinoma, cervical dysplasia and intraepithelial cancer, Ewing's sarcoma, squamous cell carcinoma, axillary cell carcinoma, malignant brain tumors, blast cancer, intestinal ganglion neuroma, hyperplastic corneal nerve carcinoma, islet cell carcinoma, Kaposi cancer, leiomyoma, leukemia, lymphoma, malignant carcinoma, malignant melanoma, malignant hypercalcemia, Marpanoidhabitus cancer, water cancer, metastatic skin cancer, mucosal neuroma, myelodysplastic syndrome group, myeloma, filamentous sarcoma, neuroblastoma, osteosarcoma, bone Protozoal and other sarcomas, ovarian cancer, pheochromocytoma, true erythrocytosis, primary brain tumor, small cell lung cancer, ulcerative and papillary squamous cell carcinoma, seminal
  • infectious disease refers to a disease induced by infection by a heterogeneous organism such as a bacterium or a virus.
  • the term "pharmaceutical composition” or “vaccine composition” may be characterized in the form of capsules, tablets, granules, injections, ointments, powders, or beverages, and the pharmaceutical composition or The vaccine composition may be characterized as targeting humans.
  • the pharmaceutical composition or vaccine composition is not limited thereto, but is formulated in the form of oral dosage forms such as powders, granules, capsules, tablets, aqueous suspensions, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions according to a conventional method. Can be used.
  • the pharmaceutical composition or vaccine composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers can be used as binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, colors, flavors, etc. for oral administration, and buffers, preservatives, painlessness, etc. for injections.
  • Agents, solubilizers, isotonic agents, stabilizers, etc. can be mixed and used, and in the case of topical administration, base agents, excipients, lubricants, preservatives, and the like can be used.
  • the formulation of the pharmaceutical composition or vaccine composition of the present invention may be prepared in various ways by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • oral administration it can be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixir, suspension, syrup, wafers, etc.
  • it can be prepared in the form of unit dosage ampoules or multiple dosage forms.
  • Others, solutions, suspensions, tablets, capsules, can be formulated as sustained-release preparations.
  • examples of carriers, excipients and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, malditol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil and the like can be used.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, preservatives and the like may be further included.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition or vaccine composition according to the present invention is not limited thereto, but oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, This includes intestinal, topical, sublingual or rectal. Oral or parenteral administration is preferred.
  • parenteral as used herein includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intrasynovial, intrasternal, intrathecal, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.
  • the pharmaceutical composition or vaccine composition of the present invention may also be administered in the form of suppositories for rectal administration.
  • the pharmaceutical composition or vaccine composition of the present invention can be used in various ways, including the activity of the specific compound used, age, weight, general health, sex, formulation, administration time, route of administration, excretion rate, drug combination and the severity of the specific disease to be prevented or treated. It may vary in various ways depending on factors, and the dosage of the pharmaceutical composition varies depending on the patient's condition, weight, degree of disease, drug type, administration route and duration, but may be appropriately selected by those skilled in the art, and 0.0001 per day. To 500 mg/kg or 0.001 to 500 mg/kg. Administration may be administered once a day, or may be divided into several times. The above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the pharmaceutical composition or vaccine composition according to the present invention may be formulated as a pill, dragee, capsule, liquid, gel, syrup, slurry, or suspension.
  • the vaccine composition according to the present invention may further include a known "immune antigen adjuvant".
  • the immune antigen adjuvant generally refers to any substance that increases the body fluid and/or cellular immune response to an antigen, and any substance known in the art may be used without limitation, but, for example, Freund's A complete adjuvant or an incomplete adjuvant may be further included to increase its immunity.
  • repeated antigen stimulation may be performed arbitrarily following the initial dose.
  • Toll-like receptors 7 or 8 agonists conjugated to cholesterol are prepared by a chemical reaction as in Scheme 1 or 2, and toll-like receptors 7 or 8
  • a cholesterol analog that can form a bond between the amine group (NH 2 ) site, which is the activation site of the functional agent, and carbamate, disulfide, ester, peptide, azide, etc. Can be prepared by reacting.
  • the analog (derivative) is a generic term for similar compounds obtained by chemically altering a part of the Toll-like receptor 7 or 8 agonist.
  • R is a side branch containing an aliphatic or aromatic group, -NH-, -CO-, -CONH-, -CSNH-, -COO-, -CSO-, -SO 2 NH-, -SO 2 -, -SO -, -O-, etc. may be included.
  • R is a side branch containing an aliphatic or aromatic group, -NH-, -CO-, -CONH-, -CSNH-, -COO-, -CSO-, -SO 2 NH-, -SO 2 -, -SO -, -O-, etc. may be included.
  • resquimod to which white powdered cholesterol was bound was obtained.
  • the structure of the resquimod used in the synthesis and the obtained cholesterol-bound resquimod was verified using 1H-NMR and 15N-HSQC (Heteronuclear single quantum coherence spectroscopy).
  • the structure of resquimod is shown in Figs. 2 and 4, and the structure of resquimod to which cholesterol is bound is shown in Figs. 3, 5 and 6.
  • the mechanism by which resquimod to which cholesterol is bound is separated from cholesterol by a physiological environment in cells is shown in FIG. 7.
  • the R 1 or R 2 is a side branch containing an aliphatic or aromatic group, and -NH- ⁇ -CO- ⁇ -CONH- ⁇ -CSNH- ⁇ -COO- ⁇ -CSO- ⁇ -SO 2 NH- ⁇ -SO 2 -, -SO-, -O-, etc. may be included.
  • Example 2 Disulfide furnace Crosslinked toll-like receptor 7 or 8 With the effector Synthesis of cholesterol conjugate
  • resquimod and 80 mg of cholesterol-disulfide were added to 5 mL of dichloromethane, followed by stirring at room temperature for 16 hours. Then, distilled water was added to the stirred solution to separate water and dichloromethane layers, and sodium sulfate was added to the separated dichloromethane layer, followed by reaction for 16 hours to remove remaining water. Then, the remaining solution was purified using a silica gel column, and resquimod in which white powder of cholesterol-disulfide was cross-linked was obtained.
  • the R 1 or R 2 is a side branch containing an aliphatic or aromatic group, and -NH- ⁇ -CO- ⁇ -CONH- ⁇ -CSNH- ⁇ -COO- ⁇ -CSO- ⁇ -SO 2 NH- ⁇ -SO 2 -, -SO-, -O-, etc. may be included.
  • Example 3 Preparation of nanoparticles containing conjugates of cholesterol-tol-like receptor 7 or 8 effector
  • Conjugates of cholesterol-tol-like receptor 7 or 8 agonists can be prepared in the form of various nanoparticles to maximize interaction with immune cells (FIG. 9).
  • an anionic nanoliposome containing cholesterol-bound resquimod 4 mg of DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, Avanti), 1.2 in 1 mL of chloroform Resquimod to which mg cholesterol is bound, and 1 mg of DPPG (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), Avanti) were added and dissolved to prepare a mixture Then, the mixture was evaporated using a rotary evaporator to form a thin film, and 2 mL of a phosphate buffer solution was added to the thin film, followed by stirring at 45° C.
  • DOPC 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, Avanti
  • DPPG 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), Avanti
  • a tip ultrasonicator (amplitude: 20%, 2 minutes) to prepare anionic nanoliposome containing cholesterol-bound resquimod through a homogenization step.
  • a cationic nanoliposome containing cholesterol-bound resquimod 4 mg of DOPC, 1.2 mg of cholesterol-bound resquimod, and 2 mg of dimethyldioctadecyl in 1 mL of chloroform Ammonium bromide (DDAB; Dimethyldioctadecylammonium bromide) was added and dissolved to prepare a mixture, and the mixture was evaporated using a rotary evaporator to form a thin film, and 2 mL of a phosphate buffer solution was added to the thin film.
  • DDAB chloroform Ammonium bromide
  • Tip sonicator Ultrasonic disperser
  • phosphatidylcholine: saponin: cholesterol-bound resquimod was mixed in a weight ratio of 5:3:2, and then 14 It was added to ether to a concentration of mg/mL and dissolved to prepare an ether solution containing lipids. And saponin was dissolved in 4 mL of distilled water at a concentration of 1.5 mg/mL, placed in a 20 mL glass bottle, and closed with a rubber stopper, and then stored in a water jacket at 55°C.
  • an ether solution containing 1 mL of lipid was added to a glass bottle containing saponin at a rate of 0.2 mL/min using a syringe pump, and stirred for 2 hours.
  • the tip of the syringe needle was positioned below the surface of the aqueous solution containing saponin, and the second needle was inserted into a rubber stopper for ventilation.
  • the glass bottle was transferred to room temperature, stirred for 3 days, and stabilized to prepare a nanomicelle composed of resquimod and saponin to which cholesterol was bound.
  • an ultrasonic disperser Tip sonicator, Sonics&Materials Model VCX 750.
  • the output of the disperser is 750 watt
  • the vibration intensity is 20 kHz
  • the amplitude is set to 20%.
  • the prepared aqueous solution was stirred at 600 rpm for 8 hours or longer at room temperature in order to completely evaporate the organic solvent in which PLGA was dissolved.
  • centrifugation was performed using a centrifuge (Centrifuge, Hanil, Combi-514R) at 12,000 rpm for 12 minutes, and the supernatant was removed, followed by ultrapure water 10 mL was added and dispersed in an ultrasonic disperser for 30 seconds. After repeating the above process 3 times, it was dried using a freeze-drying method and then stored at -20°C.
  • Example 4 Cholesterol-tol-like receptor 7 or 8 Operative Characterization of nanoparticles containing conjugates and evaluation of immune activation efficacy of immune cells
  • a nanoliposome containing cholesterol-bound resquimod was prepared in the same manner as in Example 3.1, and then 30 units of carboxylesterase were treated. And reacted at 37°C. And it was confirmed whether cholesterol was cut. The results are shown in FIG. 11.
  • liposomes at concentrations of 500 ng/mL and 1,000 ng/mL, nanoliposomes containing a cholesterol-resquimod conjugate, and resquimod were added to Raw264.7 macrophages 10 and 100 to 4 cells. Each ⁇ L was treated and reacted for 24 hours. And cell viability was measured using CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega). As a negative control (control), the experiment was conducted using a phosphate buffer solution. The results are shown in FIG. 12.
  • the nanoliposome containing the conjugate of cholesterol-resquimod did not show cytotoxicity, but also showed an effect of promoting proliferation by activating immune cells.
  • liposomes at concentrations of 500 ng/mL and 1,000 ng/mL, nanoliposomes containing a cholesterol-resquimod conjugate, and resquimod were respectively used in Raw264.7 macrophages.
  • 10 6 cells were treated with 1 mL each and cultured for 24 hours to obtain a cell culture solution, centrifuged at 1,500 rpm for 10 minutes to obtain a cell-free supernatant, and then the supernatant by ELISA method using a BD OptiEIATM kit.
  • the concentration of IL-6 and TNF- ⁇ contained in the liquid was measured. The results are shown in FIGS. 13 and 14.
  • a liposome comprising a cholesterol-resquimod conjugate of the present invention Lipo (Chol-R848)
  • a liposome comprising a cholesterol-resquimod conjugate that is not cleaved Lipo (C18-R848)
  • a liposome, And resquimod were treated in BMDC (Bone marrow-derived macrophage) and BMDM (Bone marrow-derived macrophage) 2 ⁇ 10 5 cells/mL for each concentration, and cultured for 24 hours. Then, the culture solution was obtained and centrifuged at 490 g for 5 minutes to obtain only the supernatant, and then ELISA analysis was performed using the BD OptEIA TM kit. The results are shown in FIG. 15.
  • the conjugate of cholesterol-tol-like receptor 7 or 8 of the present invention induces cleavage of cholesterol in the cytoplasm, effectively activating immune cells, whereas cleavage of cholesterol is not induced. In this case, it was confirmed that the activation site of resquimod was not exposed, and thus immune cells could not be activated.
  • the conjugate of the cholesterol-tol-like receptor 7 or 8 effector of the present invention exists in an inactive state in a form in which cholesterol is not cleaved, but when cholesterol is cleaved under certain conditions, it effectively activates immune cells afterwards. It was confirmed that the immune response can be regulated by shikim.
  • Example 5 cholesterol-tol-like receptor 7 or 8 Operative Conjugate In vivo After injection At the lymph node Evaluation of immune activation and toxicity in serum
  • liposomes or resquimods containing cholesterol-resquimod conjugates were injected subcutaneously into the right flank of C57BL/6 mice at a concentration of 25 ⁇ g/100 ⁇ L. After 1, 4, and 8 days, the lymph node was isolated from the mouse, and a cryosection was performed. And the dendritic cells and macrophages were labeled with the CD205 antibody and the CD169 antibody, respectively, and confirmed using a fluorescence microscope. The results are shown in FIG. 16.
  • a liposome containing a cholesterol-resquimod conjugate Lipo (Chol-R848)
  • Lipo Lipo (Chol-R848)
  • Resquimod Rosquimod
  • Fig. 17A Cells and supernatant were separated using a centrifuge (490 g, 5 minutes). And the obtained cells were labeled using CD11c antibody and CD11b antibody, and the cells were fixed using 4% paraformaldehyde. And the analysis was carried out using a BD FACS Canto II flow cytometer. And the separated supernatant was measured for the amount of cytokine IL-12 using ELISA. The results are shown in Fig. 17A.
  • a concentration of 25 ⁇ g/100 ⁇ L of liposome (Lipo (Chol-R848)), liposome or resquimod (R848) containing cholesterol-resquimod conjugate C57BL/6 mice were injected subcutaneously into the right flank of the mouse, the weight of the mice was measured, and blood was collected from the orbital vein at each time. Then, the collected blood was centrifuged (4° C., 13,000 rpm, 20 minutes) to separate serum from blood cells, and the amount of cytokines was measured by ELISA using serum. The results are shown in Fig. 17B.
  • Example 6 Verification of anticancer effect of conjugate of cholesterol-tol-like receptor 7 or 8 effector
  • OVA antigen was administered 10 ⁇ g, resquimod 25 ⁇ g, and cholesterol-resquimod nanoliposome containing 25 ⁇ g (based on resquimod). And the survival rate of the mouse and the size of the cancer were measured. The results are shown in FIG. 18.
  • the size of the cancer increased sharply as in the control group injected with the phosphate buffer solution, there were no mice that survived more than 3 weeks, and the experimental group injected with resquimod and OVA antigen Compared to the control group, the rate at which the size of the cancer increases was decreased, but it was confirmed that the size of the cancer was still increased.
  • the experimental group injected with the nanoparticles containing the conjugate of the cholesterol-tol-like receptor 7 or 8 agonist of the present invention it was confirmed that cancer hardly grew, and showed a survival rate of about 60% or more even after 60 days.
  • Nano-liposome and OVA antigen (Lipo (Chol-R848)) containing the modal conjugate were administered by intratumoral injection, and the tumor tissue and spleen were isolated from mice 7 days after administration of the last sample. And the obtained tumor tissue was first crushed using scissors, treated with 1 mg/mL of collagenase type I to the crushed tissue and reacted at 37° C. for 1 hour to separate into single cells.
  • the separated cells were filtered using a 70 ⁇ m strainer and washed with a phosphate buffer solution.
  • the obtained spleen was first crushed using scissors, and the crushed tissue was treated with an erythropoietin buffer and reacted at 37° C. for 10 minutes to degrade red blood cells. Then, it was filtered using a 70 ⁇ m strainer and washed with a phosphate buffer solution. Washed tumor cells and spleen cells were labeled with an antibody.
  • T cells were labeled with anti-CD4 antibody and anti-CD8 antibody, and type 2 macrophages (M2 macrophage) were labeled with anti-CD11b antibody and anti-CD206 antibody, and myeloid-derived immune suppressor cells (Myeloid- derived suppressor cells (MDSCs) were labeled with anti-CD11b antibody and anti-Gr1 antibody, and natural killer cells (NK cells) were labeled with anti-NK1.1 antibody. And analyzed using a fluorescence flow cytometer. The results are shown in FIGS. 19 and 20.
  • Phosphate buffer solution PBS
  • anti-PD-1 and cancer antigen ⁇ -PD-1
  • anti-PD-L1 and cancer antigen ⁇ -PD- L1
  • nano-liposomes and cancer antigens Lipo (Chol-R848)
  • PBS Phosphate buffer solution
  • ⁇ -PD-1 anti-PD-1 and cancer antigen
  • ⁇ -PD- L1 antigen containing a conjugate of cholesterol-resquimod
  • nano-liposomes containing a conjugate of cholesterol-resquimod anti-PD-1
  • a cancer antigen Lipo (Chol-R848)+ ⁇ -PD-1
  • a nano-liposome containing a conjugate of cholesterol-resquimod, anti-PD-L1, and a cancer antigen Lipo(Chol-R848)+ ⁇ -PD-L1).
  • the immune checkpoint inhibitors anti-PD-1 and anti-PD-L1 were administered by intraperitoneal injection at a concentration of 100 ⁇ g/100 ⁇ L on days 0, 3, and 6, and the rest were intratumoral in the same manner as in Example 5.1. It was administered by injection method.
  • the cancer antigen the OVA antigen was used in the B16-OVA animal model, the peptide-based antigen was used in the TC-1 animal model, and the lysate of tumor cells was used as the antigen in the 4T1 animal model. And the survival rate of the mouse and the size of the cancer were measured. The results are shown in Figs. 21 to 23.
  • a 4T1 animal model was prepared in the same manner as in Example 6.2, and the chemotherapy drug doxorubicin or paclitaxel (paclitaxel) and a nano-liposome containing a conjugate of cholesterol-resquimod were administered in combination. And after 2 weeks, the size of the cancer was measured. The results are shown in FIG. 24.
  • the conjugate of the toll-like receptor 7 or 8 agonist and cholesterol can prevent penetration into the blood, the side effects of the existing Toll-like receptor 7 or 8 agonist can be significantly reduced, and cytotoxicity is reduced. It was not shown, and it was confirmed that not only can increase the delivery power into cells, but also effectively separate from cholesterol within the cells, thereby increasing the degree of immune activation than when using a Toll-like receptor 7 or 8 agonist alone.
  • Toll-like receptor 7 or 8 agonists can be widely used as immunostimulating therapeutic agents, as well as antigens ( antigen) and used as an adjuvant of an immune antigen, which is expected to increase the immune response of the antigen.
  • the conjugate of cholesterol with a Toll-like receptor 7 or 8 effector in the present invention not only induces immune activation of antigen presenting cells (dendritic cells, macrophages, etc.), natural killer cells (NK cells), T cells, etc., It has the property of regulating the function of immune cells (regulatory T cells (Treg), myeoloid derived suppressor cells (MDSC), M2 macrophages, etc.) that act as immunosuppressive in the tumor microenvironment, and is used for various anticancer treatments. It is expected to be used as a composition.
  • the anticancer effect can be remarkably enhanced by synergistic effects, so it is expected that it can be used in combination administration of various anticancer drugs.
  • the conjugate of the toll-like receptor 7 or 8 effector of the present invention and cholesterol is inactive when administered into the body, but is subsequently activated after being separated from cholesterol under specific conditions in the tumor microenvironment and/or cells, and thus non-specific hypersensitivity immune reactions, etc.
  • Cholesterol since it is a conjugate with cholesterol, it can be prepared in various types of formulations, and absorption into blood vessels is suppressed, thereby suppressing side effects such as cytokine storms.
  • by effectively regulating immune cells not only does it exhibit anti-cancer effects alone, but also can significantly increase its effects by co-administering with various cancer treatments and immunological drugs. It is expected that it can be effectively and widely applied to treatment.

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Abstract

본 발명은 콜레스테롤과 톨유사수용체 7 또는 8 작용자가 절단가능한 부위(cleavable site)를 포함하는 화학결합으로 연결된 톨유사수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤 결합체 물질 및 그 용도에 관한 것으로, 콜레스테롤이 화학적으로 결합된 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자 물질은 혈관 내로 흡수되지 않아, 원래 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 부작용을 감소시킬 수 있다. 특히, 콜레스테롤과의 화학적 결합에 의해, 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 면역활성화 기능이 저해(inhibition)되어 있다가, 종양미세환경 또는 타겟 면역세포내에서 면역활성 기능이 회복(recovery)되도록 설계되어, 시간에 따라 면역활성화 효능을 조절할 수 있는 동력학적 특성을 나타내며, 비특이적 면역반응 유도를 최소화 할 수 있다. 또한, 다양한 나노 입자 형태의 제형으로 제조가 용이하기 때문에, 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자-콜레스테롤 결합체는 종양미세환경하에서 치료용 면역세포 활성화뿐만 아니라, 면역억제세포 및 환경을 제어할 수 있는 다양한 용도의 약물 조성물에 폭넓게 사용될 수 있다.

Description

톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체 및 그 용도
본 발명은 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체에 관한 것으로, 보다 자세하게는, 콜레스테롤이 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 활성화 부위(active site)와 절단가능한 클리버블 부위(cleavable site)로 화학적으로 결합된 결합체, 이의 용도 등에 관한 것이다.
면역반응은 활성화된 면역세포가 외래성 및 내인성 물질, 즉, 항원(antigen)에 대하여 일으키는 일련의 반응으로서, 세균, 바이러스 등을 포함하는 미생물, 생체의 이물질 등이 생체 내로 유입되게 되면, 면역세포가 이를 인식하고 활성화되어, 사이토카인 등의 인자를 분비하여 염증 반응을 유발한다. 최근에는 감염 초기에 비특이적으로 작용하는 선천성 면역반응 단계에서 기작에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 이 중 톨-유사 수용체(Toll-like receptor; TLR)는 염증 초기의 병원체를 인식할 수 있는 유전자로서, 병원체의 원형질막 구성물, 핵산 구성물 등을 인식하여 면역반응을 유도하는 것으로 알려져 있으며, 이를 이용하여, 면역 세포를 활성화시키기 위한 다양한 톨-유사 수용체 리간드(ligand)들에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
이 중 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자(agonist) 기반 물질은 세포성 면역 반응을 유도하는 면역 보조제로 사용되고 있으며, 이미퀴모드(Imiquimod), 레시퀴모드(Resiquimod), 닥토리십(Dactolisib), 가디퀴모드(Gardiquimod), 수마니롤(Sumanirole), 모톨리모드 (Motolimod), 베사톨리모드(vesatolimod), 록소리바인(loxoribine), SM360320, CL264, 3M-003, IMDQ, Compound 54 등이 알려져 있다(미국공개특허 2012-0294885). 이러한 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자는 엔도좀 내의 톨-유사 수용체 7 또는 8의 작용자로써 체액성 면역뿐만 아니라, 세포성 면역 또한 효과적으로 유도하는 것으로 알려져 있다. 그러나 이러한 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자는 그 분자 구조로 인하여 수용액에 분산되는데 어려움이 있다. 또한, DMSO, 메탄올 등과 같은 특수 유기용매에만 용해되고, 일반적으로 사용되고 있는 유기 용제에는 용해되지 않기 때문에 다양한 제형의 면역 활성화 물질을 제조하는데 한계점을 가지고 있다. 따라서 다양한 계면활성제를 혼합한 크림 형태의 제형(예, Aldara® cream)으로 상용화되고 있다. 일부 연구에서는, 이러한 문제점을 극복하기 위하여 염(salt)의 형태로 제조하여 수용액에 용해시킬 수 있도록 하였으나, 염의 형태로 제조된 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자는 체내에서 혈관으로 흡수되어, 혈관 내의 면역반응(systemic immune response)을 유도함으로써, 많은 부작용(예, 사이토카인 폭풍(cytokine storm), 여러가지 비특이적 과민 면역반응 등)을 유발하기 때문에, 사용이 용이하지 않은 실정이다. 이러한 부작용 문제로 인하여, 실질적으로 치료에 사용하기 위해서는 유효량(effective dose)보다 적은 농도를 처리해야 하기 때문에, 효능 저하의 요인이 되기도 한다. 일부 제약기업에서는 이러한 문제점을 극복하기 위하여 친유성 특성을 보이는 리피디를 도입하거나, 거대한 크기를 갖는 고분자 사슬에 직접 화학적으로 결합시킴으로써 혈관으로 직접 흡수되는 것을 방지하기 위한 시도도 진행되고 있다. 하지만, 이러한 방법에 의해 제조된 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자는 그 활성부위가 여전히 외부로 노출되어 있기 때문에, 체내에서 비특이적 면역 반응을 유도함으로써, 독성을 유발할 수 있는 가능성을 여전히 가지고 있다.
따라서 체내에서 혈관으로 흡수되지 않으면서도 비특이적 면역 반응이 억제된, 다양한 제형의 형태로 제조가 가능한 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자가 개발된다면, 다양한 면역 활성화 제제로서 낮은 부작용을 가지며, 폭넓게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 톨-유사 수용체 7 또는 8의 면역활성화 기능이 일시적으로 저해(inhibition)되어 있다가, 종양미세환경 또는 타겟 세포내에서 면역활성이 회복(recovery)되도록 설계된, 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체, 이의 용도 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자가 실제 임상에서 효과적으로 사용되기 위하여 다양한 약물학적 제형으로서의 응용이 가능하고, 체내에서 비특이적 면역반응 유도, 사이토카인 폭풍 등을 최소화할 수 있는 기술에 관한 것이다.
본 발명은 면역활성화 기능이 저해되어 있다가, 종양미세환경 및 타겟 면역세포에서 활성이 회복되어 면역활성화 효능을 보일 수 있는 동력학적으로 활성 제어가 가능한(kinetically controlled activity) 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 구조체 설계에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체를 포함하는 나노리포좀, 나노에멀젼, 나노마이셀, 고분자 나노입자 등에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자 결합체를 포함하는 면역항원보강제(adjuvant) 조성물 등에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자 결합체를 포함하는 면역항원보강제 조성물; 및 항원을 포함하는 백신 조성물 등에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자 결합체를 포함하는 면역세포 활성화 조성물 등에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자 결합체를 포함하는 면역억제세포 기능제어 조성물 등에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자 결합체를 포함하는 항암면역치료 조성물 등에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자 결합체; 및 항암제, 면역관문억제제 등을 추가로 포함하는 항암치료용 조성물 등에 관한 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자(agonist)와 콜레스테롤의 결합체로서, 상기 결합체는 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 활성화 부위에 콜레스테롤이 결합된 형태인 결합체를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 결합은 분리가 가능한 형태로서, 바람직하게는 카바메이트(carbamate), 다이설파이드(disulfide), 에스터(ester), 펩타이드(peptide), 아자이드(azide) 등의 절단이 가능한 형태의 화학적 결합이나, 종양미세환경, 또는 세포내의 엔도좀 및 라이소좀의 효소 및 pH 에 반응하여, 결합 부위의 화학적 결합이 절단(cleavage)될 수 있는 형태의 결합이라면 이에 제한되지 않는다. 그리고 상기 결합이 절단됨으로써 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 활성화 부위가 노출되어 4 일내에 동력학적으로 기능이 회복되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자는 바람직하게는 이미다조퀴놀린(imidazoquinoloine) 계열, 하이드록시아데닌(8-hydroxyadenine) 계열, 프테리돈(pteridone) 계열, 아미노피리미딘(2-aminopyrimidine) 계열, 벤조아제핀(benzoazepine) 계열, 타이아옥소구아노신(7-thia-8-oxoguanosine) 계열, 이들의 유사체(derivative), 이들의 조합 등으로 이루어질 수 있으며, 더욱 바람직하게는 이미퀴모드(Imiquimod), 레시퀴모드(Resiquimod), 닥토리십(Dactolisib), 가디퀴모드(Gardiquimod), 수마니롤(Sumanirole), 모톨리모드 (Motolimod), 베사톨리모드(vesatolimod), 록소리바인(loxoribine), SM360320, CL264, 3M-003, IMDQ, Compound 54 등이나, 활성화 부위에 콜레스테롤이 화학적으로 결합되어 비활성화 형태를 나타낼 수 있는 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 결합체를 포함하는 나노 입자 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 나노 입자는 면역세포 활성화 효능을 증가시키는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 본 발명의 결합체를 포함하고 있는 나노리포좀, 나노마이셀, 고형 나노입자, 나노에멀젼, 고분자 나노입자 등이나, 이에 제한되지 않는다. 상기 포함은 결합과 관계없이 내포되어 있는 형태일 수 있으며, 또는 나노 입자 표면에 부착되어 있는 형태일 수도 있으며, 또는 나노 입자 구조 사이에 끼어들어가 있는 형태일 수도 있으나, 본 발명의 결합체를 포함하고 있는 형태라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 결합체를 포함하는 면역항원보강제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 면역항원보강제 조성물 및 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 항원은 바람직하게는 단백질, 재조합 단백질, 당단백질, 유전자, 펩티드, 다당류, 지질다당류, 폴리뉴클레오티드, 세포, 세포 용해물(lysate), 박테리아, 바이러스 등이나 일반적으로 알려져 있는 항원이라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 결합체를 유효성분으로 포함하는 면역기능제어용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 면역기능제어용 조성물은 종양미세환경(tumor microenvironment)에서 면역세포의 활성화를 유도하거나, 면역억제세포의 기능을 제어할 수 있으며, 바람직하게는 항원제시세포(dendritic cells, macrophage 등), 자연살해세포(NK cell), T 세포 등의 면역 활성화를 유도하거나, 면역억제작용을 하는 면역세포(Treg; regulatory T cell), MDSC(myeoloid derived suppressor cells), M2 macrophage 등)의 기능을 조절함으로써 체내의 면역기능을 조절할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 결합체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 일반적으로 암의 치료에 사용되고 있는 물질들을 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 화학 항암제, 면역관문억제제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 본 발명의 결합체를 포함함으로써 체내의 면역 기능을 효과적으로 활성화시킬 수 있기 때문에 기존의 화학 항암제, 면역관문억제제 등의 효능을 증진시킬 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 암의 증식, 전이, 재발 등을 억제하거나, 항암 치료 요법에 대한 내성을 억제하는 것을 특징으로 하나, 일반적으로 사용되는 암 치료 방법의 일환이라면, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 암은 바람직하게는 유방암, 대장암, 직장암, 폐암, 결장암, 갑상선암, 구강암, 인두암, 후두암, 자궁경부암, 뇌암, 난소암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 혀암, 자궁암, 위암, 골암, 혈액암 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 결합체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 결합체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 암 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 결합체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 감염성 질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 결합체의 암의 예방 또는 치료에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 활성화 부위에 콜레스테롤을 클리버블 링커를 이용하여 화학적으로 결합시키는 단계를 포함하는 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 제조 방법은 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자, 콜레스테릴 클로로포르메이트, 및 피리딘을 디클로로메탄에 혼합하고 반응시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 제조 방법은 (a) 2-히드록시에틸 다이설파이드를 테트라히드로푸란에 용해시키고 톨루엔 용액에 첨가하며 용해시킨 후에, N-하이드로석신이미드 및 트리에틸아민을 첨가하고 용해시켜 다이설파이드 교차 결합 연결기를 제조하는 단계; (b) 상기 다이설파이드 교차 결합 연결기 및 콜레스테롤을 혼합하고 반응시켜 다이설파이드-콜레스테롤 교차 결합 연결기를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 다이설파이드-콜레스테롤 교차 결합 연결기 및 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자를 혼합하고 반응시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 (b) 단계에서의 혼합은 다이설파이드 교차 결합 연결기와 콜레스테롤을 3 : 1 내지 1 : 1의 질량비로 혼합할 수 있으며, 상기 (c) 단계에서의 혼합은 다이설파이드-콜레스테롤 교차 결합 연결기와 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자를 4 : 1 내지 1 : 1의 질량비로 혼합할 수 있다.
본 발명에 따른 콜레스테롤이 화학적으로 결합된 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자(콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체)는 친유성이 증가하여, 혈액 내로 침투되는 것을 방지할 수 있을 뿐만 아니라, 종양미세환경 또는 면역세포 내의 엔도좀과 같은 환경 이외의 환경에서는 면역 활성화 기능이 저해되어 있어, 기존 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 부작용 및 세포독성을 현저히 감소시킬 수 있다.
또한, 종양미세환경 및 면역세포 내로 전달된 이후에 콜레스테롤과 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자가 서서히 분리되어, 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 활성화 부위가 동력학적으로 조율(kinetic immune modulation)됨으로써, 장시간 지속적으로 톨-유사 수용체와 반응하기 때문에, 톨-유사 수용체 작용자를 단독으로 사용할 때보다 면역 세포의 면역 활성화의 지속시간(persistence)을 증가시켜, 치료 효과를 현저히 증가시킬 수 있다.
또한, 콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자 결합체는 항원제시세포(dendritic cells, macrophage 등), 자연살해세포(NK cell), T 세포 등의 면역활성화를 유도할 수도 있으며, 종양미세환경(tumor microenvironment)에서 면역억제작용을 하는 면역세포(Treg; regulatory T cell), MDSC(myeoloid derived suppressor cells), M2 macrophage 등)의 기능을 조절할 수 있기 때문에, 단독으로도 항암 효과를 나타낼 수 있을 뿐만 아니라, 면역관문억제제, 화학항암제 등과 병용투여하여, 시너지 효과에 의해 항암효과를 현저히 증가시킬 수도 있다.
뿐만 아니라, 생체막을 구성하는 기본 성분인 콜레스테롤을 기반으로 하기 때문에, 다양한 지질(lipid)과의 조합을 통하여 나노에멀젼, 나노리포좀, 나노마이셀 등의 다양한 제형으로 용이하게 제조할 수 있으며, 이를 통하여 세포 내로의 전달력을 높일 수 있기 때문에, 본 발명은 콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체는 다양한 제형으로 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 다양한 약학적 조성물에 포함시켜 면역 활성화를 유도함으로써 다양한 질환의 치료 효과를 현저히 증가시킬 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체의 구조 및 활성화/비활성화(Activation/Inactivation) 작용 메커니즘을 도식화한 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 구조를 1H-NMR로 검증한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 콜레스테롤이 결합된 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 구조를 1H-NMR로 검증한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 구조를 15N-HSQC로 검증한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 콜레스테롤이 결합된 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 구조를 15N-HSQC로 검증한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 콜레스테롤이 결합된 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 구조를 15N-HSQC로 검증한 결과를 확대하여 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 콜레스테롤이 결합된 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자가 세포 내의 생리적 환경에 의하여 콜레스테롤과 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자로 분리되는 기작을 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 콜레스테롤-다이설파이드가 교차 결합된 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자가 세포 내에서 생리적 환경에 의하여 콜레스테롤과 분리되는 기작을 나타낸 도면이다.
도 9는 콜레스테롤과 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체를 포함하는 나노 입자 형태를 도식화한 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체가 일정 pH에서 시간에 따라 동력학적으로 분리되는 것을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체가 효소에 의해 시간에 따라 동력학적으로 분리되는 것을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체를 포함하는 나노리포좀의 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체를 포함하는 나노리포좀의 면역세포 활성화 지표(IL-6)를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체를 포함하는 나노리포좀의 면역세포 활성화 지표(TNF-alpha)를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체의 결합부위에서 절단이 일어나도록 합성된 Chol-R848 물질과 절단이 일어나지 않도록 합성된 C18-R848 물질에 의한, 면역 세포의 활성화 차이를 나타낸 도면이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체를 포함하는 나노리포좀과 레스퀴모드를 생체 내에 주입한 후에, 림프노드에 도달하는 양과 체류시간을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체를 포함하는 나노리포좀의 면역 세포 활성화 효능 및 독성 여부를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체를 포함하는 나노리포좀의 종양 성장 억제 효과 및 생존률을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체를 포함하는 나노리포좀의 종양 부위에서의 면역 세포 활성 조절 능력을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체를 포함하는 나노리포좀의 비장에서의 면역 세포 활성 조절 능력을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체를 포함하는 나노리포좀과 면역체크포인트억제제와의 병용 투여 효과를 B16-OVA 동물 모델에서 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따른 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체를 포함하는 나노리포좀과 면역체크포인트억제제와의 병용 투여 효과를 4T1 동물 모델에서 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체를 포함하는 나노리포좀과 면역체크포인트억제제와의 병용 투여 효과를 TC1 동물 모델에서 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체를 포함하는 나노리포좀과 화학 항암제와의 병용 투여 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명에서 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체는 콜레스테롤 그룹이 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 활성화 부위(acvite site) 부위에 절단 가능한 형태로 결합되어, 면역 활성화 기능이 일시적으로 저해(inhibition)되어 있는 것을 특징으로 한다(도 1). 상기 저해는 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 활성화 부위의 기능이 지연(retarded)되어 나타나는 것을 의미할 수도 있다.
본 발명에서 상기 결합체는 종양미세환경 및/또는 세포 내, 특히 엔도좀 및 라이소좀의 생리학적 환경(low pH, 효소, 글루타치온 등)에 의해 cleavage가 유도되는 부위(site)로 교차 결합되어 있는 형태인 것을 특징으로 한다(도 1). 특별히, 종양미세환경 하에서는 pH, 온도, redox potential, ultrasound, 효소, magnetic filed, near-infrared light 등의 특정 자극에 의하여 절단이 일어나도록 조절할 수 있는 결합 형태를 가질 수도 있다. 상기 결합은 바람직하게는 카바메이트(carbamate), 다이설파이드(disulfide), 에스터(ester), 펩타이드(peptide), 아자이드(azide) 등의 결합을 형성할 수 있으나, 절단 가능한 형태라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에서 상기 결합체는 종양미세환경 및 세포 내에 존재하는 다양한 효소, Acid phosphatase, Acid phyrophosphatase, Phosphodiesterase, Phosphoprotein phosphatase, Phosphatidic acid phosphatase, Arylsulfatase, Proteases, Cathepsins, Collagenase, Arylamidase, Peptidase, Acid ribonuclease, Acid deoxyribonuclease, Lipases, Triglyceride lipase, Phospholipase, Esterase, Carboxyesterase Clucocerebrosidase, Galactocerebrosidase, Sphingomyelinase, Glycosidases, alpha-Glucosidase, beta-Glucosidase, beta-Galactosidase, alpha-Mannosidase, alpha-ucosidase, beta-Xylosidase, alpha-N-Acetylhexosaminidase, beta-N-Acetylhexosaminidase, Sialidase, Lysozyme, Hyaluronidase, beta-Glucuronidase 등에 의하여 콜레스테롤과 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자가 분리될 수도 있다.
본 발명에서 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자는 콜레스테롤을 화학적으로 결합시킴으로써, 체내에서 혈관으로 흡수되지 않도록 제조함으로써, 염 형태의 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자가 가지는 단점을 극복하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 상기 결합체는 다양한 지질성 물질, 사포닌 등 다양한 물질들과 용이하게 상호작용함으로써 나노리포좀, 나노마이셀, 나노에멀젼 등 다양한 제형으로 용이하게 제조되어, 면역 세포 내로의 전달 효율을 높이는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에 있어서, “콜레스테롤(cholesterol)”이란 지질(lipid)의 한 종류로 소수성 성질을 가지는 스테로이드 계열의 유기물질을 총칭하며, 상기 콜레스테롤은 콜레스테롤 구조를 기반으로 하는 다양한 유사체, 콜레스테롤의 일부를 화학적으로 변화시켜 획득할 수 있는 화합물을 모두 포함할 수 있다. 바람직하게는, bile acid(cholic acid, deoxycholic acid, lithocholic acid, chenodeoxycholic acid), Vitamine D, steroid hormones(testosteron, estradiol, cortisol, aldosteron, prednisolone, prednisone) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 콜레스테롤은 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자를 다양한 형태의 나노 입자의 표면 및 내부에 위치하게 도와주는 물질로서, 이와 유사한 기능을 하는 리피드 물질, 예를 들어, phospholipids와 같은 natureal lipid, synthetic lipid 등으로 대체될 수도 있다.
본 명세서에 있어서, "톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자 물질(Toll-like receptor 7/8 agonist-based materials)"이란 톨-유사 수용체 7 또는 8의 작용자로서, 이미다조퀴놀린(imidazoquinoloine) 계열, 하이드록시아데닌(8-hydroxyadenine) 계열, 프테리돈(pteridone) 계열, 아미노피리미딘(2-aminopyrimidine) 계열, 벤조아제핀(benzoazepine) 계열, 타이아옥소구아노신(7-thia-8-oxoguanosine) 계열로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 상기 이미다조퀴놀린 계열의 화합물은 WO 2018 196823, WO 2011 049677, WO 2011 027022, WO 2017 102652, WO 2019 040491 등에서 언급된 유형의 화합물 또는 제약상 허용 가능한 염을 포함하며, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 하이드록시아데닌 계열의 화합물은 WO 2012 080730, WO 2013 068438, WO 2019 036023, WO 2019 035969, WO 2019 035970, WO 2019 035971, WO 2019 035968, CN 108948016, US 2014 8846697, WO 2016 023511, WO 2017 133683, WO 2017 133686, WO 2017 133684, WO 2017 133687, WO 2017 076346, WO 2018 210298, WO 2018 095426, WO 2018 068593, WO 2018 078149, WO 2018 041763 등에서 언급한 유형의 화합물 또는 제약상 허용 가능한 염을 포함하며, 이에 한정되지 않는다. 상기 프테리돈 계열의 화합물은 US 2010 0143301, WO 2016 007765, WO 2016 044182, WO 2017 035230, WO 2017 219931, WO 2011 057148, CN 1087 94486 등에서 언급한 유형의 화합물 또는 제약상 허용 가능한 염을 포함하며, 이에 한정되지 않는다. 상기 아미노피리미딘 계열 화합물은 WO 2010 133885, WO 2012066335, WO 2012 066336, WO 2012 067268, WO 2013 172479, WO 2012 136834, WO 2014 053516, WO 2014 053595, US 2018 0215720, WO 2012 156498, WO 2014 076221, WO 2016 141092, WO 2018 045144, WO 2015 014815, WO 2018 233648, WO 2014 207082, WO 2014 056593, WO 2018 002319, WO 2013 117615 등에서 언급한 유형의 화합물 또는 제약상 허용 가능한 염을 포함하며, 이에 한정되지 않는다. 상기 벤조아제핀 계열 화합물은 WO 2007 024612, WO 2010 014913, WO 2010 054215, WO 2011 022508, WO 2011 022509, WO 2012 097177, WO 2012 097173, WO 2016 096778, WO 2016 142250, WO 2017 202704, WO 2017 202703, WO 2017 216054, WO 2017 046112, WO 2017 197624 등에서 언급한 유형의 화합물 또는 제약상 허용 가능한 염을 포함하며, 이에 한정되지 않는다. 상기 타이아옥소구아노신 계열 화합물은 WO 2016 180691, WO 2016 055553, WO 2016 180743, WO 2016 091698 등에서 언급한 유형의 화합물 또는 제약상 허용 가능한 염을 포함하며, 이에 한정되지 않는다. 이외에도 PCT/US2009/035563, PCT/US2015/028264, PCT/US2016/020499, WO 2015 023598, PCT/US 2015/039776 등에서 언급한 톨-유사 수용체 7 또는 8 화합물 또는 제약상 허용 가능한 염을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지 않고, 당 업계에 종사하는 사람이 용이하게 추측하여 사용할 수 있는 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 경우를 모두 포함한다.
본 명세서에 있어서, “톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자”는 세포 내로 전달되어 엔도좀 내부에 수용체를 가지고 있는 “톨-유사 수용체 3 작용자” 또는 “톨-유사 수용체 9 작용자”에도 동일 개념으로 적용하여 콜레스테롤과 결합체를 형성할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체는 면역 세포의 면역 기능을 조절하며, 이는 항원제시세포(dendritic cells, macrophage 등), 자연살해세포(NK cell), T 세포 등의 면역 활성화를 유도하거나, 종양미세환경(tumor microenvironment)에서 면역억제작용을 하는 면역세포(Treg; regulatory T cell), MDSC(myeoloid derived suppressor cells), M2 macrophage 등)의 기능을 조절하여 면역 세포의 면역 기능을 조절할 수 있으며, 상기 면역억제작용을 하는 면역세포의 기능을 조절하는 것은 Treg, MDSC 등의 작용을 억제하거나, 개체수를 감소시키는 방법으로 조절할 수도 있고, MDSC를 항암면역기능을 유도하는 항원제시세포로 전환하는 방법으로 조절할 수도 있다. 또는 M2 macrophage를 M1 macrophage로 전환할 수도 있다.
본 명세서에 있어서, 병용 투여란 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체와 항원, 면역관문억제제, 면역항원보강제, 면역활성화 물질, 화학항암제 등 다양한 물질과 함께 투여하는 것으로서 그 종류 및 형태에는 제한이 없다.
본 명세서에 있어서, 화학 항암제란 당업자에게 알려져 있는 암 치료에 사용되고 있는 화합물이라면 제한이 없으며, 그 일례로 Paclitaxel, Docetaxel, 5-Flurouracil, Alendronate, Doxorubicin, Simvastatin, Hydrazinocurcumin, Amphotericin B, Ciprofloxacin, Rifabutin, Rifampicin, Efavirenz, Cisplatin, Theophyline, Pseudomonas exotoxin A, Zoledronic acid, Trabectedin, Siltuximab, Dasatinib, Sunitinib, Apatinib, 5,6-Dimethylxanthenone-4-acetic acid, Silibinin, PF-04136309, Trabectedin, Carlumab, BLZ945, PLX3397, Emactuzumab, AMG-820, IMC-CS4, GW3580, PLX6134, N-acetyl-l-cystein, Vitamin C, bortezomib, aspirin, salicylates, Indolecarboxamide derivatives, quinazoline analogues, Thalidomide, prostaglandin metabolites, 2ME2, 17-AAG, Camptothecin, Topotecan, Pleurotin, 1-methylpropyl, 2-imidazolyl dissulphide, Tadalafil, Sildenafil, L-AME, Nitroaspirin, Celecoxib, NOHA, Bardoxolone methyl, D,L-1-methyl-tryptophan, Gemcitabine, Axitinib, Sorafenib, Cucurbitacin B, JSI-124, Anti IL-17 antibodies, Anti-glycan antibodies, Anti-VEGF antibodies, Bevacizumab, Antracycline, Tasquinimod, Imatinib, cyclophosphamide 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 있어서, "면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor)"란 인체가 가지고 있는 면역 세포의 면역 기능을 활성화시켜 암 세포와 싸우게 하는 암 치료 방법을 총칭하며, 그 일례로 anti-PD-1, anti-PD-L1, anti-CTLA-4, anti-KIR, anti-LAG3, anti-CD137, anti-OX40, anti-CD276, anti-CD27, anti-GITR, anti-TIM3, anti-41BB, anti-CD226, anti-CD40, anti-CD70, anti-ICOS, anti-CD40L, anti-BTLA, anti-TCR, anti-TIGIT 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, 상기 면역활성화 물질이란 면역 세포를 활성화시키는 물질을 총칭하며, 그 일례로 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist), 사포닌, 항바이러스성 펩티드, 인플라머좀 인듀서(inflammasome inducer), NOD 리간드(NOD ligand), CDS 리간드(cytosolic DNA sensor ligand), STING(stimulator of interferon genes) 리간드, 에멀젼(emulsion), 알룸(alum) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, 상기 “항원(antigen)”이란 체내에서 면역 반응을 일으키는 모든 물질을 총칭하며, 바람직하게는 병원균 (박테리아, 바이러스 등), 화합물질, 꽃가루, 암세포, 새우 등 또는 이들의 일부 펩타이드 또는 단백질이며, 더욱 바람직하게는 암 항원 펩타이드이나, 체내에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 물질이라면 이에 제한되지 않는다. 상기 항원은 바람직하게는 단백질, 재조합 단백질, 당단백질, 유전자, 펩티드, 다당류, 지질다당류, 폴리뉴클레오티드, 세포, 세포 용해물(lysate), 박테리아, 바이러스 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 암 항원 펩타이드일 수 있다. 상기 당백질은 항체, 항체의 단편, 구조 단백질, 조절 단백질, 전사인자, 독소 단백질, 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소의 단편, 수송 단백질, 수용체(receptor), 수용체의 단편, 생체방어 유도 물질, 저장 단백질, 이동 단백질(movement protein), 익스플로이티브 단백질(exploitive protein), 리포터 단백질 등일 수 있다. 그러나 생체에서 항원으로 작용하여 면역 반응을 유도할 수 있는 물질이라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, “백신(vaccine)”이란 생체에 면역 반응을 일으키는 항원을 함유하는 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원을 말한다. 상기 동물은 인간 또는 비인간 동물로서, 상기 비인간 동물은 돼지, 소, 말, 개, 염소, 양 등을 지칭하나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, “예방(prevention)”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 암, 면역질환, 감염성 질환 등의 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에 있어서, “치료(treatment)”란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 암, 면역질환, 감염성 질환 등의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에 있어서, “개체(individual or subject)”란 본 발명의 조성물이 투여될 수 있는 대상을 말하며, 그 대상에는 제한이 없다.
본 명세서에 있어서, “암(cancer)”이란 침윤에 의해 국부적으로 그리고 전이를 통해 체계적으로 확장할 수 있는 각종 혈액암, 악성 고형 종양 등을 총칭한다. 특별히 이에 제한되지는 않지만, 암의 구체적인 예로는 대장암, 부신암, 골암, 뇌암, 유방암, 기관지암, 결장암 및/또는 직장암, 담낭암, 위장관암, 두부 및 목의 암, 신장암, 후두암, 간암, 폐암, 신경조직암, 췌장암, 전립선암, 부갑상선암, 피부암, 위암, 갑상선암 등이 포함된다. 암의 다른 예로는, 선암, 선종, 기저 세포암, 자궁경부 이형성증 및 상피 내암, Ewing 육종, 편평세포암종, 액선 세포암, 악성 뇌종양, 모세포암, 장의 신경절신경종, 과다형성 각막신경암, 섬세포암, Kaposi 암, 평활근종, 백혈병, 림프종, 악성 암양종, 악성 흑색종, 악성 고칼슘혈증, Marpanoidhabitus 암, 수양암, 전이성 피부암, 점막 신경종, 골수이형성 증훈군, 골수종, 사상식육종, 신경아세포종, 골육종, 골원성 및 기타 육종, 난소암, 크롬 친화성 세포종, 진성 적혈구 증가증, 원발성 뇌종양, 소세포성 폐암, 궤양성 및 유두상 편평상피암, 정낭피종, 연조직 육종, 망막아종, 횡문근아세포종, 신세포 종양 또는 신세포암, 망상세포성 육종, 및 빌름스 종양이 포함된다. 또한 성상 세포종, 위장 기저 종양(gastrointestinal stromal tumor, GIST), 신경교종 또는 신경교아종, 신세포암(renal cell carcinoma, RCC), 간세포암(hepatocellular carcinoma, HCC), 췌장 신경내분비암 등이 포함된다.
본 명세서에 있어서, "감염성 질환(infected disease)"이란, 세균, 바이러스 등의 이종의 생명체에 의한 감염으로 인하여 유도된 질병을 총칭한다.
본 명세서에 있어서, “약학적 조성물(pharmaceutical composition)” 또는 “백신 조성물(vaccine composition)”이란 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물 또는 백신 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 약학적 조성물 또는 백신 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물 또는 백신 조성물은 약제적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물 또는 백신 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물 또는 백신 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물 또는 백신 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물 또는 백신 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 500 mg/kg 또는 0.001 내지 500 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학 조성물 또는 백신 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 백신 조성물은 추가로 기존에 알려져 있는 “면역항원보강제(adjuvant)”를 추가로 포함할 수 있다. 상기 면역항원보강제는 일반적으로 항원에 대한 체액 및/또는 세포 면역 반응을 증가시키는 임의의 물질을 총칭하며, 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다. 또한 상기 백신 조성물의 경우에는 필요에 따라 초기 용량에 이어 임의로 반복된 항원 자극을 수행할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1: 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체의 합성
콜레스테롤이 결합(conjugation)된 다양한 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자 (이미다조퀴놀린(imidazoquinoloine) 계열, 하이드록시아데닌(8-hydroxyadenine) 계열, 프테리돈(pteridone) 계열, 아미노피리미딘(2-aminopyrimidine) 계열, 벤조아제핀(benzoazepine) 계열, 타이아옥소구아노신(7-thia-8-oxoguanosine) 계열 등)는 반응식 1 또는 2와 같은 화학반응에 의하여 제조되며, 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 활성화 부위인 아민기(NH 2) 부위와 카바메이트(carbamate), 다이설파이드(disulfide), 에스터(ester), 펩타이드(peptide), 아자이드(azide) 등과의 결합을 형성할 수 있는 콜레스테롤 유사체가 반응하여 제조될 수 있다. 상기 유사체(derivative)는 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 일부를 화학적으로 변화시켜서 얻어지는 유사한 화합물을 총칭한다.
[반응식 1]
Figure PCTKR2020001753-appb-img-000001
상기 R은 aliphatic 또는 aromatic 그룹을 포함하는 곁가지이며, -NH-、-CO-、-CONH-、-CSNH-、-COO-、-CSO-、-SO 2NH-、-SO 2-, -SO-, -O- 등을 포함할 수 있다.
[반응식 2]
Figure PCTKR2020001753-appb-img-000002
상기 R은 aliphatic 또는 aromatic 그룹을 포함하는 곁가지 이며, -NH-、-CO-、-CONH-、-CSNH-、-COO-、-CSO-、-SO 2NH-、-SO 2-, -SO-, -O- 등을 포함할 수 있다.
1.1. 카바메이트 결합을 갖는 레스퀴모드 -콜레스테롤 결합체 합성
콜레스테롤이 결합(conjugation)된 레스퀴모드(Resquimod; R848)를 합성하기 위하여, 하기 반응식 3의 방법을 이용하였다. 보다 자세하게는, 31.4 mg의 레스퀴모드에 100 μL의 피리딘을 첨가하고 3 mL의 디클로로메탄에 첨가하여 용해시킨 용액에 90.0 mg의 콜레스테릴 클로로포르메이트를 1 mL의 디클로로메탄에 첨가하고 용해시킨 용액을 한 방울씩 천천히 첨가하여 주었다. 그 후 4 ℃에서 16 시간 동안 교반시켜 혼합물을 제조하였다. 그리고 상기 혼합물을 상온의 온도로 맞춰준 후에 증류수를 첨가하여 물과 디클로로메탄 층을 분리한 후, 분리된 디클로로메탄 층에 황산나트륨을 첨가하고 16 시간 동안 반응시켜 남아있는 물을 제거하였다. 그리고 남은 용액은 실리카겔 컬럼을 이용하여 정제하였고, 흰색 가루의 콜레스테롤이 결합된 레스퀴모드를 획득하였다. 합성에 사용된 레스퀴모드와 획득된 콜레스테롤이 결합된 레스퀴모드의 구조는 1H-NMR 및 15N-HSQC(Heteronuclear single quantum coherence spectroscopy)를 이용하여 검증하였다. 레스퀴모드의 구조는 도 2 및 4에 나타내었고, 콜레스테롤이 결합된 레스퀴모드의 구조는 도 3, 5 및 6에 나타내었다. 콜레스테롤이 결합된 레스퀴모드가 세포 내에서 생리적 환경에 의하여 콜레스테롤과 분리되는 기작(mechanism)은 도 7에 나타내었다.
[반응식 3]
Figure PCTKR2020001753-appb-img-000003
1.2. 카바메이트 결합을 갖는 이미퀴모드 -콜레스테롤 결합체 합성
콜레스테롤이 결합(conjugation)된 이미퀴모드(Imiquimod; R837)를 합성하기 위하여, 하기 반응식 4의 방법을 이용하였다. 보다 자세하게는, 31.4 mg에 100 μL의 피리딘을 첨가하고 3 mL의 디클로로메탄에 첨가하여 용해시킨 용액에 90.0 mg의 콜레스테릴 클로로포르메이트를 1 mL의 디클로로메탄에 첨가한 용해시킨 용액을 한 방울씩 천천히 첨가하여주었다. 그 후 4 ℃에서 16 시간 동안 교반시켜 혼합물을 제조하였다. 그리고 상기 혼합물을 상온의 온도로 맞춰준 후에 증류수를 첨가하여 물과 디클로로메탄 층을 분리한 후, 분리된 디클로로메탄 층에 황산나트륨을 첨가하고 16 시간 동안 반응시켜 남아있는 물을 제거하였다. 그리고 남은 용액은 실리카겔 컬럼을 이용하여 정제하였고, 흰색 가루의 콜레스테롤이 결합된 이미퀴모드를 획득하였다.
[반응식 4]
Figure PCTKR2020001753-appb-img-000004
상기 R 1 또는 R 2는 aliphatic 또는 aromatic 그룹을 포함하는 곁가지 이며, -NH-、-CO-、-CONH-、-CSNH-、-COO-、-CSO-、-SO 2NH-、-SO 2-, -SO-, -O- 등을 포함할 수 있다.
실시예 2: 다이설파이드로 교차결합된 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤 결합체의 합성
2.1. 다이설파이드로 교차결합된 레스퀴모드와 콜레스테롤 결합체 합성
콜레스테롤-다이설파이드(cholesterol-disulfide)가 교차결합(crosslinking)된 레스퀴모드를 합성하기 위하여, 하기 반응식 5의 방법을 이용하였다. 보다 자세하게는, 1.54 g의 2-히드록시에틸 다이설파이드(2-hydroxyethyl disulfide)를 30 mL의 테트라히드로푸란에 첨가하여 용해시킨 후에 포스겐 용액(15 mL, 15 wt% in toluene)에 한 방울씩 천천히 첨가하여 혼합물을 제조하였다. 그리고 상기 혼합물을 25 ℃에서 10 시간 동안 교반시킨 후에 진공 상태에서 용매를 증발시켰다. 그리고 2.3 g의 N-하이드로석신이미드를 테트라히드로푸란에 첨가하여 용해시킨 후에 상기 혼합물과 혼합하고, 1.57 mL의 트리에틸아민을 첨가하였다. 그리고 40 ℃에서 16 시간 동안 반응시킨 후에 침전물을 제거하고, 진공 상태에서 용매를 증발시켰다. 그리고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제한 후에 차가운 헥산으로 재결정화하고, 진공 상태에서 건조시켜 흰색 고체의 정제된 다이설파이드 교차결합 연결기를 획득하였다. 그리고 387 mg의 콜레스테롤을 10 mL의 디클로로메탄에 첨가하여 용해시킨 후에, 523 mg의 다이설파이드 교차 결합 연결기를 첨가하고 상온에서 16 시간 동안 교반시키고, 실리카겔 컬럼을 이용하여 콜레스테롤과 다이설파이드가 결합된 흰색 가루의 콜레스테롤-다이설파이드를 정제하였다. 그리고 31.4 mg의 레스퀴모드와 80 mg의 콜레스테롤-다이설파이드를 5 mL의 디클로로메탄에 첨가하고 상온에서 16 시간 동안 교반시켰다. 그리고 교반시킨 용액에 증류수를 첨가하여 물과 디클로로메탄 층을 분리한 후, 분리된 디클로로메탄 층에 황산나트륨을 첨가하고 16 시간 동안 반응시켜 남아있는 물을 제거하였다. 그리고 남은 용액은 실리카겔 컬럼을 이용하여 정제하였고, 흰색 가루의 콜레스테롤-다이설파이드가 교차 결합된 레스퀴모드를 획득하였다.
[반응식 5]
Figure PCTKR2020001753-appb-img-000005
콜레스테롤-다이설파이드가 교차 결합된 레스퀴모드가 세포 내에서 생리적 환경에 의하여 콜레스테롤과 분리되는 기작은 도 8에 나타내었다.
2.2. 다이설파이드로 교차결합된 이미퀴모드와 콜레스테롤 결합체 합성
콜레스테롤-다이설파이드가 교차 결합된 이미퀴모드를 합성하기 위하여, 하기 반응식 6의 방법을 이용하였다. 보다 자세하게는, 1.54 g의 2-히드록시에틸 다이설파이드(2-hydroxyethyl disulfide)를 30 mL의 테트라히드로푸란에 첨가하여 용해시킨 후에 포스겐 용액(15 mL, 15 wt% in toluene)에 한 방울씩 천천히 첨가하여 혼합물을 제조하였다. 그리고 상기 혼합물을 25 ℃에서 10 시간 동안 교반시킨 후에 진공 상태에서 용매를 증발시켰다. 그리고 2.3 g의 N-하이드로석신이미드를 테트라히드로푸란에 첨가하여 용해시킨 후에 상기 혼합물과 혼합하고, 1.57 mL의 트리에틸아민을 첨가하였다. 그리고 40 ℃에서 16 시간 동안 반응시킨 후에 침전물을 제거하고, 진공 상태에서 용매를 증발시켰다. 그리고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제한 후에 차가운 헥산으로 재결정화하고, 진공 상태에서 건조시켜 흰색 고체의 정제된 다이설파이드 교차 결합 연결기를 획득하였다. 그리고 387 mg의 콜레스테롤을 10 mL의 디클로로메탄에 첨가하여 용해시킨 후에, 523 mg의 다이설파이드 교차 결합 연결기를 첨가하고 상온에서 16 시간 동안 교반시키고, 실리카겔 컬럼을 이용하여 콜레스테롤과 다이설파이드가 결합된 흰색 가루의 콜레스테롤-다이설파이드를 정제하였다. 그리고 31.4 mg의 이미퀴모드와 80 mg의 콜레스테롤-다이설파이드를 5 mL의 디클로로메탄에 첨가하고 상온에서 16 시간 동안 교반시켰다. 그리고 교반시킨 용액에 증류수를 첨가하여 물과 디클로로메탄 층을 분리한 후, 분리된 디클로로메탄 층에 황산나트륨을 첨가하고 16 시간 동안 반응시켜 남아있는 물을 제거하였다. 그리고 남은 용액은 실리카겔 컬럼을 이용하여 정제하였고, 흰색 가루의 흰색 가루의 콜레스테롤-다이설파이드가 교차 결합된 이미퀴모드를 획득하였다.
[반응식 6]
Figure PCTKR2020001753-appb-img-000006
상기 R 1 또는 R 2는 aliphatic 또는 aromatic 그룹을 포함하는 곁가지 이며, -NH-、-CO-、-CONH-、-CSNH-、-COO-、-CSO-、-SO 2NH-、-SO 2-, -SO-, -O- 등을 포함할 수 있다.
실시예 3: 콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체를 포함하는 나노 입자의 제조
콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체는 면역세포와의 상호작용을 극대화하기 위하여 다양한 나노입자형태로 제조 될 수 있다(도 9).
3.1. 콜레스테롤이 결합된 레스퀴모드를 포함하는 나노리포좀 제조
콜레스테롤이 결합된 레스퀴모드를 포함하는 음이온성 나노리포좀(nanoliposome)을 제조하기 위하여, 1 mL의 클로로포름에 4 mg의 DOPC(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, Avanti), 1.2mg의 콜레스테롤이 결합된 레스퀴모드, 및 1 mg의 DPPG(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), Avanti)를 첨가한 후 용해시켜 혼합물을 제조하고, 상기 혼합물을 회전식 증발기를 이용하여 용매를 증발시켜 얇은 필름 형태를 제조하고, 얇은 필름에 2 mL의 인산염완충용액을 첨가하고 45 ℃에서 30 분간 교반시키고, 팁 초음파 분해기(amplitude: 20 %, 2 분)를 이용하여 균질화 단계를 거쳐 콜레스테롤이 결합된 레스퀴모드를 포함하는 음이온성 나노리포좀을 제조하였다. 콜레스테롤이 결합된 레스퀴모드를 포함하는 양이온성 나노리포좀을 제조하기 위하여, 1 mL의 클로로포름에 4 mg의 DOPC, 1.2mg의 콜레스레롤이 결합된 레스퀴모드, 및 2 mg의 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(DDAB; Dimethyldioctadecylammonium bromide)를 첨가한 후 용해시켜 혼합물을 제조하고, 상기 혼합물을 회전식 증발기를 이용하여 용매를 증발시켜 얇은 필름 형태를 제조하고, 얇은 필름에 2 mL의 인산염완충용액을 첨가하고 45 ℃에서 30 분간 교반시키고, 팁 초음파 분해기(amplitude: 20 %, 2 분)를 이용하여 균질화 단계를 거쳐 콜레스테롤이 결합된 레스퀴모드를 포함하는 양이온성 나노리포좀을 제조하였다.
3.2. 콜레스테롤이 결합된 레스퀴모드를 포함하는 나노에멀젼 제조
콜레스테롤이 결합된 레스퀴모드를 포함하는 나노에멀젼(nanoemulsion)을 제조하기 위하여, 1 mL의 클로로포름에 1 mg의 DOPC, 240 μg의 콜레스테롤, 240 μg의 콜레스레롤이 결합된 레스퀴모드를 첨가한 후 용해시켜 혼합물을 제조하였다. 그리고 상기 혼합물을 둥근 바닥 플라스크로 옮겨 담은 후에 회전농축기(rotary evaporator)를 이용하여 클로로포름을 완전히 증발시켜 얇은 지질막(thin-film) 형태를 제조하였다. 그리고 인산염완충용액 2 mL에 Squalene(5 %v/v), Tween 80(0.5 %v/v), 및 Span 85(0.5 %v/v)를 첨가하여 용해시킨 후에, 상기 용액을 지질막 위에 첨가하고 초음파 분산기(Tip sonicator)를 이용하여서 1 분 동안 분산시키고, 회전기(tube revolve)를 이용하여 2 시간 정도 교반시켜, 콜레스테롤이 결합된 레스퀴모드를 포함하는 나노에멀젼을 제조한 후에 사용 전까지 4 ℃ 냉장고에 보관하였다.
3.3. 콜레스테롤이 결합된 레스퀴모드 및 사포닌으로 구성된 나노마이셀 제조
콜레스테롤이 결합된 레스퀴모드 및 사포닌으로 구성되는 나노마이셀(nanomicelle)을 제조하기 위하여, 포스패티딜콜린 : 사포닌 : 콜레스테롤이 결합된 레스퀴모드를 5 : 3 : 2의 무게 비율로 혼합한 후에 14 mg/mL의 농도가 되도록 에테르에 첨가하고 용해시켜 지질을 포함하는 에테르 용액을 제조하였다. 그리고 사포닌은 1.5 mg/mL의 농도로 4 mL의 증류수에 용해시킨 후에 20 mL의 유리병에 담고 고무마개로 유리병을 막은 후에 55 ℃의 워터 재킷에 보관하였다. 그리고 1 mL의 지질을 포함하는 에테르 용액을 주사기 펌프를 이용하여 0.2 mL/min의 속도로 사포닌이 담겨있는 유리병에 첨가하며 2 시간 동안 교반시켰다. 이 때, 주사기 바늘의 끝은 사포닌을 포함하는 수용액의 표면보다 아래에 위치하게 하였고, 환기를 위하여 두 번째 바늘은 고무마개에 꽂아두었다. 그리고 상온으로 유리병을 옮기고 3 일 동안 교반시켜 안정화시키는 단계를 거쳐 콜레스테롤이 결합된 레스퀴모드 및 사포닌으로 구성된 나노마이셀을 제조하였다.
3.4. 콜레스테롤이 결합된 레스퀴모드로 구성된 고분자 나노입자제조
Lactide와 glycolide 조성비가 50 : 50인 PLGA 고분자(Eudragit) 60 mg을 1 mL의 Chloroform 용매에 녹여준다. 5 mg의 콜레스테롤이 결합된 레스퀴모드를 용매에 첨가하고, 초음파 세척기(ultrasonic bath, Emerson Model CPX5800H-E)를 이용하여 콜레스테롤-레스퀴모드 결합체와 고분자를 용해시켰다. 그리고 2.5 % PVA 수용액 10 mL에 상기 용해시킨 용액을 200 μL씩 첨가해주며, 초음파 분산기(Tip sonicator, Sonics&Materials Model VCX 750)를 이용하여 1 분간 분산시켰다. 이때, 분산기의 출력은 750 watt이고, 진동강도는 20 kHz이며, Amplitude는 20%로 설정하였다. 그리고 PLGA가 용해된 유기용매를 완전히 증발시키기 위하여 제조된 수용액을 600 rpm으로 실온에서 8 시간 이상 교반하였다. 반응하지 않은 고분자와 콜레스테롤-레스퀴모드 결합체를 제거하기 위해 원심분리기(Centrifuge, Hanil, Combi-514R)를 이용하여 12,000 rpm, 12 분의 조건으로 원심분리를 실시하였으며, 상층액은 제거한 후 초순수 10 mL을 첨가하고, 초음파 분산기에 30초간 분산시켰다. 상기 과정을 3회 반복한 후, 동결건조 방법을 사용하여 건조 시킨 후 -20 ℃에서 보관하였다.
실시예 4: 콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체를 포함하는 나노 입자의 특성 분석 및 면역세포의 면역활성화 효능 평가
본 발명의 콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체를 포함하는 나노 입자가 세포 내로 전달된 후에 세포질 내의 산성 조건 하에서 콜레스테롤과 레스퀴모드가 분리되는지 확인하였다. 보다 자세하게는, 실시예 3.1과 동일한 방법으로 콜레스테롤이 결합된 레스퀴모드를 포함하는 나노리포좀을 제작한 후, 제작된 나노리포좀 10 μg을 37 ℃의 pH 5 또는 7의 인산염완충용액(phosphate buffered saline; PBS) 1 mL에 각각 첨가하였다. 그리고 0.5, 1, 1,5 및 2 일에 각각 시료를 채취하여 UV-Vis spectrum을 이용하여 분리된 레스퀴모드의 농도를 측정하였다. 그 결과는 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, pH 7의 조건에서는 레스퀴모드와 콜레스테롤이 분리되지 않았지만, pH 5에서는 시간이 지남에 따라 레스퀴모드가 콜레스테롤과 분리되는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체를 포함하는 나노 입자는 체내에서 세포질로 전달된 후에, 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤이 분리되어 세포질 내에서 면역활성화 반응을 유도할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
또한, pH 외에 종양미세환경에서 존재하는 특정 효소에 의해서도 절단되는지 확인하기 위하여, 실시예 3.1과 동일한 방법으로 콜레스테롤이 결합된 레스퀴모드를 포함하는 나노리포좀을 제작한 후, 30 Unit의 Carboxylesterase를 처리하고, 37 ℃에서 반응시켰다. 그리고 콜레스테롤의 절단 여부를 확인하였다. 그 결과는 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이, 종양미세환경의 세포 내에 존재하는 특정 효소에 의하여 콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체의 콜레스테롤이 절단되는 것을 확인하였다.
세포 독성 여부를 확인하기 위하여, 500 ng/mL 및 1,000 ng/mL의 농도의 리포좀, 콜레스테롤-레스퀴모드의 결합체를 포함하는 나노리포좀, 및 레스퀴모드를 Raw264.7 대식세포 10 4 개에 100 μL씩 처리하고 24 시간 동안 반응시켰다. 그리고 CellTiter 96　 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega)를 이용하여 세포 생존률을 측정하였다. 음성 대조군(control)으로는 인산염완충용액을 사용하여 실험을 진행하였다. 그 결과는 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, 콜레스테롤-레스퀴모드의 결합체를 포함하는 나노리포좀은 세포 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라, 면역세포를 활성화시켜 증식을 촉진하는 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
또한, 면역세포의 활성화 정도를 확인하기 위하여, 500 ng/mL 및 1,000 ng/mL의 농도의 리포좀, 콜레스테롤-레스퀴모드의 결합체를 포함하는 나노리포좀, 및 레스퀴모드를 각각 Raw264.7 대식세포 10 6 개에 1 mL씩 처리하고 24 시간 동안 배양한 후에 세포 배양액을 획득하고, 1,500 rpm에서 10 분간 원심분리하여 세포가 제거된 상층액을 획득한 후에, BD OptiEIATM 키트를 이용하여 ELISA 방식으로 상층액 내에 포함되어 있는 IL-6 및 TNF-α의 농도를 측정하였다. 그 결과는 도 13 및 14에 나타내었다.
도 13 및 14에 나타난 바와 같이, 콜레스테롤-레스퀴모드의 결합체를 포함하는 나노리포좀을 처리한 실험군에서 레스퀴모드를 단독으로 처리한 경우보다 IL-6 및 TNF-α의 분비량이 증가된 것을 확인하였으며, 이를 통하여 콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체를 포함하는 나노리포좀을 사용하여, 안정적으로 세포 내에서 원하는 시점에 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 면역 활성화를 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 면역 활성화 정도를 증진시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
콜레스테롤이 특정 시점에서 잘려지지 않는 형태의 콜레스테롤-레스퀴모드의 결합체를 대조군으로 이용하여 면역세포의 활성화 정도를 확인하였다. 보다 자세하게는, 본 발명의 콜레스테롤-레스퀴모드 결합체를 포함하는 리포좀(Lipo(Chol-R848)), 절단되지 않는 콜레스테롤-레스퀴모드 결합체를 포함하는 리포좀(Lipo(C18-R848)), 리포좀, 및 레스퀴모드를 각각 BMDC(Bone marrow-derived macrophage)와 BMDM(Bone marrow-derived macrophage) 2×10 5 cells/mL에 농도별로 처리하고, 24 시간 동안 배양하였다. 그리고 배양액을 획득하여 490 g에서 5 분간 원심분리하여 상층액 만을 획득한 후에, BD OptEIA ™ 키트를 사용하여 ELISA 분석을 진행하였다. 그 결과는 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타난 바와 같이, 본 발명의 콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체는 세포질 내에서 콜레스테롤의 절단이 유도되어, 면역 세포를 효과적으로 활성화시키는 반면, 콜레스테롤의 절단이 유도되지 않는 결합체의 경우에는 레스퀴모드의 활성화 부위가 노출되지 않기 때문에, 면역 세포를 활성화시키지 못하는 것을 확인하였다. 상기 결과들을 통하여, 본 발명의 콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체는 콜레스테롤이 절단되지 않은 형태에서는 비활성화 상태로 존재하나, 특정 조건에서 콜레스테롤이 절단되게 되면, 이후에 면역 세포를 효과적으로 활성화시킴으로서 면역 반응을 조절할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체의 생체내 주입 후 림프노드에서의 면역활성화 및 혈청에서의 독성 영향도 평가
콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체가 생체 내에서 미치는 영향을 확인하기 위하여, in vivo 실험을 진행하였다. 보다 자세하게는, 콜레스테롤-레스퀴모드 결합체를 포함하는 리포좀(liposome) 또는 레스퀴모드(free drug)를 25 μg/100 μL의 농도로 C57BL/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하주사하였다. 그리고 1, 4, 8일 이후 마우스에서 림프노드를 분리하고, 냉동 섹션(cryosection)을 진행하였다. 그리고 CD205 항체와 CD169 항체를 이용하여 각각 수지상세포와 대식세포를 표지하고, 형광 현미경을 이용하여 확인하였다. 그 결과는 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타난 바와 같이, 레스퀴모드를 단독으로 처리한 마우스의 경우에는 림프노드에서 면역 세포의 활성화가 유도되지 않은 반면, 콜레스테롤-레스퀴모드 결합체를 포함하는 리포좀을 처리한 마우스의 경우에는 림프노드 내에서 면역세포가 활성화된 것을 확인하였다.
또한, 콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체가 장시간 in vivo에서 미치는 영향을 확인하기 위하여, 콜레스테롤-레스퀴모드 결합체를 포함하는 리포좀(Lipo(Chol-R848)), 리포좀(Liposome) 또는 레스퀴모드(R848)를 25 μg/100 μL의 농도로 C57BL/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하주사하고, 15일까지 각각의 처리 시간에 따라 림프노드를 획득하였다. 그리고 획득된 림프노드는 일차적으로 가위를 이용하여 물리적으로 분쇄한 후에, 1 mg/mL 농도의 콜라겐분해효소 D를 처리하고 1 시간 동안 반응시켜 2차 분해시킨 후에 70 μm 스트레이너를 이용하여 거른 후에, 원심분리기(490 g, 5 분)를 사용하여 세포와 상층액을 분리하였다. 그리고 획득된 세포는 CD11c 항체와 CD11b 항체를 이용하여 표지하고, 4 % 파라포름알데히드를 이용하여 세포를 고정하였다. 그리고 BD FACS Canto II 유세포 분석기를 사용하여 분석을 진행하였다. 그리고 분리되었던 상층액은 ELISA를 이용하여 사이토카인 IL-12의 양을 측정하였다. 그 결과는 도 17a에 나타내었다.
도 17a에 나타난 바와 같이, 리포좀 또는 레스퀴모드를 단독으로 처리한 마우스에서는 면역 세포의 활성화가 유도되지 않은 반면, 본 발명의 콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체를 포함하는 나노 입자를 처리한 실험군의 경우에는 림프노드에서 면역 세포의 수가 점차적으로 증가될 뿐만 아니라, 효과적으로 활성화되어 장기간에 걸쳐 안정적으로 사이토카인이 분비되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, in vivo에서의 독성을 확인하기 위하여, 콜레스테롤-레스퀴모드 결합체를 포함하는 리포좀(Lipo(Chol-R848)), 리포좀(Liposome) 또는 레스퀴모드(R848)를 25 μg/100 μL의 농도로 C57BL/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하주사하고, 마우스의 체중을 측정하고 각각의 시간에 안와정맥에서 혈액을 채취하였다. 그리고 채취된 혈액은 원심분리(4 ℃, 13,000 rpm, 20 분)하여 혈청과 혈구를 분리하고, 혈청을 이용하여 사이토카인의 양을 ELISA로 측정하였다. 그 결과는 도 17b에 나타내었다.
도 17b에 나타난 바와 같이, 레스퀴모드를 단독으로 처리한 실험군에서는 초기에 혈청에서 사이토카인이 급격하게 증가되어 사이토카인 폭풍이 유도되었으며, 이로 인하여 세포 독성이 유도되어 몸무게가 급격하게 변화된 반면, 본 발명의 콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체를 포함하는 나노 입자의 경우에는 혈청에서 사이토카인의 양이 변하지 않았으며, 몸무게의 감소도 관찰되지 않아 in vivo에서 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.
실시예 6: 콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체의 항암 효과 검증
6.1. 콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체와 암 항원의 항암 효과 검증
콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체가 항암 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, B16-OVA 흑색종 세포주와 Ovalbumin(OVA) 항원을 이용하여 실험을 진행하였다. 보다 자세하게는, B16-OVA 세포주 5×10 5 개를 C57BL/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하주사 방법으로 주입하고, 종양의 크기가 약 50 mm 3 가 되었을 때를 0 일로 하여 0, 3, 6, 9 일에 인산염완충용액(control), OVA 항원(OVA), 레스퀴모드 및 OVA 항원(R848+OVA), 및 콜레스테롤-레스퀴모드의 결합체를 포함하는 나노 리포좀 및 OVA 항원(Lipo(Chol-R848)+OVA)를 각각의 마우스에 종양내 주사 방법으로 투여하였다. OVA 항원은 10 μg, 레스퀴모드는 25 μg, 콜레스테롤-레스퀴모드의 결합체를 포함하는 나노 리포좀은 25 μg(레스퀴모드 기준)을 투여하였다. 그리고 마우스의 생존률 및 암의 크기를 측정하였다. 그 결과는 도 18에 나타내었다.
도 18에 나타난 바와 같이, OVA 항원만을 주사한 실험군에서는 인산염완충용액을 주사한 대조군과 마찬가지로 암의 크기가 급격히 증가되었으며, 3주 이상 생존한 마우스가 없었고, 레스퀴모드 및 OVA 항원을 주사한 실험군에서는 대조군과 비교하여 암의 크기가 증가되는 속도가 감소되었으나, 여전히 암의 크기가 증가되는 것을 확인하였다. 반면, 본 발명의 콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체를 포함하는 나노 입자를 주사한 실험군에서는 암이 거의 성장하지 못하였으며, 60 일 이후에도 약 60% 이상의 생존율을 나타내는 것을 확인하였다.
또한, 면역 세포에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 동일하게 0, 3, 6, 9 일에 각각 PBS, OVA 항원 및 나노 리포좀(liposome), 레스퀴모드 및 OVA 항원(R848), 및 콜레스테롤-레스퀴모드의 결합체를 포함하는 나노 리포좀 및 OVA 항원(Lipo(Chol-R848))를 종양내 주사 방법으로 투여하고, 마지막 시료를 투여하고 7 일 이후에 마우스로부터 종양 조직과 비장을 분리하였다. 그리고 획득된 종양 조직은 가위를 이용하여 일차적으로 분쇄하고, 분쇄된 조직에 1 mg/mL의 콜라겐분해효소 type I을 처리하고 37 ℃애서 1 시간 동안 반응시켜, 단일 세포로 분리하였다. 그리고 분리된 세포는 70 μm의 스트레이너를 이용하여 거르고, 인산염완충용액을 이용하여 세척하였다. 획득된 비장은 가위를 이용하여 일차적으로 분쇄하고, 분쇄된 조직에 적혈구 분해 버퍼를 처리하고 37 ℃에서 10 분간 반응시켜 적혈구를 분해하였다. 그리고 70 μm의 스트레이너를 이용하여 거르고, 인산염완충용액을 이용하여 세척하였다. 세척된 종양 세포와 비장 세포는 항체를 이용하여 표지하였다. T세포는 anti-CD4 항체 및 anti-CD8 항체를 이용하여 표지하였고, 2형 대식세포(M2 macrophage)는 anti-CD11b 항체 및 anti-CD206 항체를 이용하여 표지하였고, 골수유래면역억제세포(Myeloid-derived suppressor cells; MDSCs)는 anti-CD11b 항체 및 anti-Gr1 항체를 이용하여 표지하였고, 자연살해세포(natural killer cells; NK cells)는 anti-NK1.1 항체를 이용하여 표지하였다. 그리고 형광유세포분석기를 이용하여 분석하였다. 그 결과는 도 19 및 20에 나타내었다.
도 19 및 20에 나타난 바와 같이, 콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체를 포함하는 나노 입자를 주입한 실험군에서는 종양 조직에서 항암 효과를 나타내는 CD4+ T 세포, CD8+ T세포 및 자연살해세포의 수는 유의성 있게 증가한 반면에, 면역억제기능을 하는 M2 macrophage, MDSC 세포의 수는 유의성 있게 감소된 것을 확인하였다.
6.2. 콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체와 면역체크포인트억제제의 병용투여 항암 효과 검증
콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체와 면역체크포인트억제제의 병용 투여 시의 항암 효과를 확인하기 위하여, B16-OVA 흑색종 세포주, TC-1 폐암 세포주, 4T1 유방암 세포주를 이용하여 실험을 진행하였다. 보다 자세하게는, B16-OVA 세포주, TC-1 세포주, 및 4T1 세포주를 5×10 5 개를 각각 C57BL/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하주사 방법으로 주입하고, 종양의 크기가 약 50 mm 3 가 되었을 때를 0 일로 하여 0, 3, 6, 9 일에 인산염완충용액(PBS), anti-PD-1 및 암 항원(α-PD-1), anti-PD-L1 및 암 항원(α-PD-L1), 콜레스테롤-레스퀴모드의 결합체를 포함하는 나노 리포좀 및 암 항원(Lipo(Chol-R848)), 콜레스테롤-레스퀴모드의 결합체를 포함하는 나노 리포좀, anti-PD-1 및 암 항원(Lipo(Chol-R848)+α-PD-1), 및 콜레스테롤-레스퀴모드의 결합체를 포함하는 나노 리포좀, anti-PD-L1 및 암 항원(Lipo(Chol-R848)+α-PD-L1)을 투여하였다. 면역체크포인트억제제인 anti-PD-1 및 anti-PD-L1은 0, 3, 6 일에 100 μg/100μL의 농도로 복강 내 주사 방법으로 투여하였고, 나머지는 실시예 5.1과 동일한 방법으로 종양내 주사 방법으로 투여하였다. 암 항원은 B16-OVA 동물 모델에서는 OVA 항원을 사용하였고, TC-1 동물 모델에서는 펩타이드 기반 항원을 사용하였으며, 4T1 동물 모델에서는 종양 세포의 용해물(lysate)을 항원으로 사용하였다. 그리고 마우스의 생존률 및 암의 크기를 측정하였다. 그 결과는 도 21 내지 23에 나타내었다.
도 21에 나타난 바와 같이, B16-OVA 동물 모델에서는 면역체크포인트억제제를 함께 투여한 실험군에서는 종양의 성장이 현저히 억제되었으며, 10 마리의 마우스 중에서 6-7 마리의 마우스에서 tumor free가 관찰될 정도로, 높은 항암 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
도 22에 나타난 바와 같이, TC1 동물 모델에서도 면역체크포인트억제제를 함께 투여한 실험군에서 종양의 성장이 현저히 억제되었으며, 생존률이 증가되는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, 폐로의 전이 또한 억제된 것을 확인하였다.
도 23에 나타난 바와 같이, 4T1 동물 모델에서도 면역체크포인트억제제를 함께 투여한 실험군에서 종양의 성장이 억제되고, 생존률이 증가되는 것을 확인하였다.
6.3. 콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체와 화학항암제의 병용투여 항암 효과 검증
콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체와 화학항암제의 병용 투여 시의 항암 효과를 확인하기 위하여, 실시예 6.2와 동일한 방법으로 4T1 동물 모델을 제조하고, 화학항암제인 독소루비신(doxorubicin) 또는 파클리탁셀(paclitaxel)과 콜레스테롤-레스퀴모드의 결합체를 포함하는 나노 리포좀을 병용 투여하였다. 그리고 2 주 후에 암의 크기를 측정하였다. 그 결과는 도 24에 나타내었다.
도 24에 나타난 바와 같이, 화학항암제의 단독 투여 군과 비교하여, 병용 투여한 경우 효과적으로 암의 성장이 억제되었을 뿐만 아니라, tumor free 마우스의 수도 증가됨을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체는 혈액 내로 침투되는 것을 방지할 수 있기 때문에 기존 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 부작용을 현저히 감소시킬 수 있으며, 세포 독성을 나타내지 않으며, 세포 내로의 전달력을 높일 수 있을 뿐만 아니라 세포 내에서 콜레스테롤과 효과적으로 분리되어 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자를 단독으로 사용할 때보다 면역 활성화 정도를 증가시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 콜레스테롤을 기반으로 하기 때문에 나노에멀젼, 나노리포좀, 나노마이셀 등의 형태로 용이하게 제조할 수 있기 때문에, 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자를 면역 활성화 치료제로서 폭넓게 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 항원(antigen)과 결합시켜 면역항원보강제(adjuvant)로서 사용하여 상기 항원의 면역 반응을 증가시킬 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명에서 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체는 항원제시세포(dendritic cells, macrophage 등), 자연살해세포(NK cell), T 세포 등의 면역 활성화를 유도할 뿐만 아니라, 종양미세환경(tumor microenvironment)에서 면역억제작용을 하는 면역세포(Treg(regulatory T cell), MDSC(myeoloid derived suppressor cells), M2 macrophage 등)의 기능을 조절하는 특성을 가지고 있어, 다양한 항암 치료를 위한 조성물로서 활용이 기대된다. 또한 특별히, 면역관문억제제, 화학항암제 등 기존의 항암 치료용 물질들과 병용투여 시, 시너지 효과에 의해 항암효과를 현저히 증진시킬 수 있기 때문에, 다양한 항암 치료제의 병용 투여에도 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명의 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체는 체내에 투여 시에는 비활성 상태이나, 이후 종양미세환경 및/또는 세포 내의 특정 조건에서 콜레스테롤과 분리되어 활성화되므로, 비특이적 과민 면역반응 등의 부작용을 낮출 수 있을 뿐만 아니라, 콜레스테롤과의 결합체이기 때문에 다양한 형태의 제형으로 제조가 가능하고, 혈관으로의 흡수가 억제되어 사이토카인 폭풍 등의 부작용도 억제할 수 있다. 또한, 면역 세포를 효과적으로 조절함으로써 단독으로도 항암 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 다양한 암 치료제, 면역 치료제 등과 병용 투여함으로써 그 효과를 현저히 증가시킬 수 있기 때문에 톨-유사 수용체 작용자를 적용할 수 있는 다양한 질환의 치료에 효과적으로 폭넓게 적용할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (21)

  1. 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자(agonist)와 콜레스테롤의 결합체로서,
    상기 결합체는 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 활성화 부위에 콜레스테롤이 결합된 형태인 것을 특징으로 하는, 결합체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 결합은 분리가 가능한 형태인 것을 특징으로 하는, 결합체.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 분리가 가능한 형태의 결합은 카바메이트(carbamate), 다이설파이드(disulfide), 에스터(ester), 펩타이드(peptide), 아자이드(azide), 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 결합체.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자는 이미다조퀴놀린(imidazoquinoloine) 계열, 하이드록시아데닌(hydroxyadenine) 계열, 프테리돈(pteridone) 계열, 아미노피리미딘(aminopyrimidine) 계열, 벤조아제핀(benzoazepine) 계열, 타이아옥소구아노신(thia-oxoguanosine) 계열 및 이들의 유사체(derivative)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 결합체.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 결합체는 종양미세환경, 또는 세포내의 엔도좀 및 라이소좀의 효소 및 pH 에 반응하여, 결합 부위의 화학적 결합이 절단(cleavage)되고 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 활성화 부위가 노출되어 4 일내에 동력학적으로 기능이 회복되는 것을 특징으로 하는, 결합체.
  6. 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자(agonist)와 콜레스테롤의 결합체를 포함하는, 나노 입자 조성물로서,
    상기 결합체는 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 활성화 부위에 콜레스테롤이 결합된 형태인 것을 특징으로 하는, 나노 입자 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 결합은 카바메이트(carbamate), 다이설파이드(disulfide), 에스터(ester), 펩타이드(peptide), 아자이드(azide), 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 나노 입자 조성물.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자는 이미다조퀴놀린(imidazoquinoloine) 계열, 하이드록시아데닌(hydroxyadenine) 계열, 프테리돈(pteridone) 계열, 아미노피리미딘(aminopyrimidine) 계열, 벤조아제핀(benzoazepine) 계열, 타이아옥소구아노신(thia-oxoguanosine) 계열 및 이들의 유사체(derivative)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 나노 입자 조성물.
  9. 제 6 항에 있어서,
    상기 나노 입자는 나노리포좀, 나노에멀젼, 나노마이셀, 고형 나노입자 및 고분자 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 나노 입자 조성물.
  10. 제 1 항의 결합체를 유효성분으로 포함하는, 면역항원보강제(adjuvant) 조성물.
  11. 제 10 항의 면역항원보강제 조성물 및 항원을 포함하는, 백신 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 항원은 단백질, 재조합 단백질, 당단백질, 유전자, 펩티드, 다당류, 지질다당류, 폴리뉴클레오티드, 세포, 세포 용해물(lysate), 박테리아 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  13. 제 1 항의 결합체를 유효성분으로 포함하는, 면역기능제어용 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 면역기능제어용 조성물은 항원제시세포, 자연살해세포(NK cell) 및 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 면역 세포를 활성화시키는 것을 특징으로 하는, 면역기능제어용 조성물.
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 면역기능제어용 조성물은 Treg(regulatory T cell), MDSC(myeoloid derived suppressor cells), 및 M2 macrophage로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 면역 세포의 기능을 조절하는 것을 특징으로 하는, 면역기능제어용 조성물.
  16. 제 1 항의 결합체를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 화학 항암제 또는 면역관문억제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  18. 제 16 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 암의 증식, 전이, 재발 또는 항암 치료 요법에 대한 내성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  19. 제 1 항의 결합체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법.
  20. 제 1 항의 결합체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 암의 예방 또는 치료 용도.
  21. 제 1 항의 결합체의 암의 예방 또는 치료에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도.
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