BR112021015577A2 - Complexo-colesterol agonista do receptor toll-like 7 ou 8 e uso do mesmo - Google Patents

Complexo-colesterol agonista do receptor toll-like 7 ou 8 e uso do mesmo Download PDF

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Abstract

complexo-colesterol agonista do receptor toll-like 7/8, composição de nanopartícula, composição adjuvante, composição de vacina, composição para regular uma função imunológica, composição farmacêutica e uso do complexo. a presente invenção refere-se a um complexo-colesterol agonista do receptor toll-like 7/8 em que o colesterol e um agonista de receptor toll-like 7 ou 8 estão ligados por uma ligação química contendo um sítio clivável, e ao uso do complexo. a substância de receptor toll-like 7 ou 8 com o colesterol quimicamente ligado a esta não é absorvida pelos vasos sanguíneos e, desse modo, pode reduzir os efeitos colaterais adversos de um de receptor do toll-like 7 ou 8 original. em particular, uma vez que o complexo é projetado de modo que a função de ativação imune do agonista de receptor toll-like 7 ou 8 seja inibida devido à ligação química com o colesterol, e a função de ativação imune é subsequentemente restaurada em um microambiente tumoral ou em células imunes alvo, o complexo exibe características dinâmicas que podem modular a eficácia da ativação imune ao longo do tempo, e pode minimizar a indução de respostas imunes não específicas. além disso, o complexo agonista de receptor toll-like 7 ou 8?colesterol é fácil de preparar em várias formulações de nanopartículas, podendo assim ser amplamente utilizado em composições de medicamentos para vários fins, tais como a ativação terapêutica de células imunes em um microambiente tumoral e também o controle de células imunossupressoras e o ambiente.

Description

COMPLEXO-COLESTEROL AGONISTA DO RECEPTOR TOLL-LIKE 7/8, COMPOSIÇÃO DE NANOPARTÍCULA, COMPOSIÇÃO ADJUVANTE, COMPOSIÇÃO DE VACINA, COMPOSIÇÃO PARA REGULAR UMA FUNÇÃO IMUNOLÓGICA,
COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DO COMPLEXO CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a um complexo-colesterol agonista do receptor Toll- like 7/8 e, mais particularmente, a um complexo no qual o colesterol está ligado a um sítio ativo de um agonista de receptor Toll-like 7/8 por meio de uma ligação química com um Sítio clivável e um uso do mesmo.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Uma resposta imune é uma série de respostas de células imunes ativadas contra materiais exógenos e endógenos, ou seja, antígenos, e quando microrganismos como bactérias ou vírus, ou biossubstâncias estranhas são introduzidos no corpo, eles são reconhecidos pelas células do sistema imune, que são então ativadas para secretar um fator como uma citocina, causando assim uma resposta inflamatória. Recentemente, a pesquisa ativa sobre os mecanismos em um estágio de resposta imune inata que atua não especificamente no estágio inicial da infecção está progredindo ativamente e, entre esses mecanismos, um receptor Toll-like (TLR, do inglês To//-Like Receptor), que é um gene capaz de reconhecer um patógeno no estágio inicial da inflamação, é conhecido por reconhecer um componente da membrana celular de um patógeno ou um componente de ácido nucleico e induzir uma resposta imune e, pelo uso do TLR, os estudos sobre vários ligantes de receptores Toll-like para ativar células imunes estão progredindo ativamente.
[003] Dentre esses ligantes, uma substância baseada em agonista de receptor Toll-like 7/8 é usada como um adjuvante que induz uma resposta imune celular; e tal substância pode ser imiquimode, resiquimode, dactolisibe, gardiquimode, sumanirol, motolimode, vesatolimode, loxoribina, SM360320, CL264, 3M-003, IMDQ ou Composto 54 (US 2012- 0294885 Al). O agonista de receptor Toll-like 7/8 é um agonista de receptor Toll-like 7/8 em um endossomo e é conhecido por induzir efetivamente não apenas a imunidade humoral, mas também a imunidade celular. No entanto, o agonista de receptor Toll-like 7/8 tem dificuldade em ser disperso em uma solução aquosa devido à sua estrutura molecular.
Além disso, uma vez que tal agonista é dissolvido apenas em um solvente orgânico especial, como DMSO ou metanol, mas não é dissolvido em um solvente orgânico geralmente utilizado, há uma limitação na preparação das várias formas de materiais de ativação imune. Portanto, o agonista é usado comercialmente em uma formulação do tipo creme (por exemplo, Aldaraº creme), no qual diversos tensoativos são misturados. Em alguns estudos, para superar esse problema, ao ser preparado na forma de um sal a ser dissolvido em uma solução aquosa, o agonista de receptor Toll-like 7/8 preparado na forma de sal é absorvido por um vaso sanguíneo no corpo para induzir uma resposta imune sistêmica no vaso sanguíneo, causando muitos efeitos colaterais (por exemplo, tempestade de citocinas e várias respostas imunes de hipersensibilidade não específicas). Por esta razão, o agonista de receptor Toll-like 7/8 na forma de sal descrito acima é de difícil uso. Devido a esses efeitos colaterais, para realmente utilizá-lo para o tratamento, é necessário que seja tratado em uma concentração menor do que uma dose eficaz, podendo, portanto, tornar-se a causa de redução da eficácia. Em algumas empresas farmacêuticas, para superar esses problemas, também está sendo feita uma tentativa de evitar a absorção direta em um vaso sanguíneo, introduzindo um lipídio que exibe propriedade lipofílica ou pela ligação direta a uma cadeia de polímero de tamanho enorme. No entanto, uma vez que o sítio ativo de um agonista de receptor do Toll-like 7/8 preparado pelo supramencionado ainda está exposto ao exterior, ele ainda tem um potencial para causar toxicidade induzindo uma resposta imune não específica no corpo.
[004] Consequentemente, se um agonista de receptor do Toll-like 7/8, que não é absorvido por um vaso sanguíneo no corpo e que pode ser preparado em várias formas nas quais uma resposta imune não específica é suprimida for desenvolvido, espera-se que ele seja amplamente usado como agente de ativação imunológica com poucos efeitos colaterais.
DIVULGAÇÃO PROBLEMA TÉCNICO
[005] Para resolver os problemas técnicos convencionais, a presente invenção é dirigida a fornecer um complexo-colesterol agonista do receptor Toll-like 7/8 que é projetado para inibir temporariamente uma função da ativação imune e recuperar a atividade imune em um microambiente tumoral ou de células-alvo, e um uso do mesmo.
[006] A presente invenção refere-se à tecnologia na qual um agonista de receptor Toll-like 7/8 pode ser aplicado a várias formulações farmacêuticas para serem efetivamente utilizadas na prática clínica real e minimizar a indução de uma resposta imune não específica e uma tempestade de citocinas no corpo.
[007] A presente invenção refere-se ao desenvolvimento da estrutura de um agonista de receptor Toll-like 7/8 com atividade cineticamente controlada, que tem uma função de ativação imune inibida e, em seguida, a recuperação da atividade em um microambiente tumoral e de células-alvo imunes, mostrando assim a ativação imune eficaz.
[008] Além disso, a presente invenção refere-se a um nanolipossoma, uma nanoemulsão, uma nanomicela e uma nanopartícula de polímero, que incluem um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-colesterol.
[009] Além disso, a presente invenção refere-se a uma composição adjuvante, que inclui um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-—colesterol.
[010] Além disso, a presente invenção refere-se a uma composição de vacina, que inclui uma composição adjuvante incluindo um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8- colesterol e um antígeno.
[011] Além disso, a presente invenção refere-se a uma composição de ativação de célula imune, que inclui um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-colesterol.
[012] Além disso, a presente invenção refere-se a uma composição de controle da função celular imunossupressora, que inclui um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8- colesterol.
[013] Além disso, a presente invenção refere-se a uma composição imunoterapêutica contra o câncer, que inclui um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8—colesterol.
[014] Além disso, a presente invenção refere-se a uma composição anticâncer, que inclui um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-—colesterol; e inclui ainda um agente anticâncer e um inibidor do ponto de controle imunológico (immune checkpoint inhibitor).
[015] No entanto, os problemas técnicos a serem resolvidos na presente invenção não estão limitados aos problemas descritos acima, e outros problemas que não estão descritos no presente documento serão totalmente compreendidos por aqueles versados na técnica a partir das seguintes descrições.
SOLUÇÃO TÉCNICA
[016] A presente invenção fornece um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8- colesterol, no qual o colesterol está ligado a um sítio ativo de um agonista de receptor Toll- like 7/8.
[017] Em um exemplo de realização da presente invenção, a ligação é uma forma separável e, de preferência, ela não está limitada, contanto que a ligação seja uma ligação química clivável, como um carbamato, dissulfeto, éster, peptídeo ou uma azida, ou uma ligação química clivável no sítio ligado em resposta a um microambiente tumoral ou enzima de um endossomo e lisossomo e pH nas células. Além disso, o sítio ativo do agonista de receptor Toll-like 7/8 é exposto pela clivagem da ligação, recuperando assim cineticamente uma função no prazo de 4 dias.
[018] Em outro exemplo de realização da presente invenção, o agonista de receptor Toll- like 7/8 é preferencialmente um composto à base de imidazoquinolina, um composto à base de 8-hidroxiadenina, um composto à base de pteridona, um composto à base de 2- aminopirimidina, um composto à base de 7-tia-8-oxoguanosina, um derivado dos mesmos ou uma combinação dos mesmos e, mais preferencialmente, imiquimode, resiquimode, dactolisib, gardiquimode, sumanirol, motolimode, vesatolimode, loxoribina, SM360320, CL264, 3M-003, IMDQ ou Composto 54. Mas qualquer agonista de receptor Toll-like 7/8 que possa exibir uma forma inativa por ligação química ao colesterol a um sítio ativo é usado sem limitação.
[019] Além disso, a presente invenção fornece uma composição de nanopartículas que inclui o complexo.
[020] Em um exemplo de realização da presente invenção, as nanopartículas aumentam a eficácia de ativação de células imunes e, de preferência, são nanolipossomas, nanomicelas, nanopartículas sólidas, uma nanoemulsão ou nanopartículas de polímero, que estão incluindo o complexo, mas a presente invenção não está limitada a eles. O termo “incluindo” é usado sem limitação e pode significar uma forma contida independentemente de um produto químico ligado, uma forma de estar ligada à superfície da nanopartícula, ou uma forma de estar em um formato de sanduíche entre estruturas de nanopartículas, e qualquer forma, incluindo o complexo da presente invenção.
[021] Além disso, a presente invenção fornece uma composição adjuvante incluindo o complexo.
[022] Além disso, a presente invenção fornece uma composição de vacina, que inclui a composição adjuvante e um antígeno.
[023] Em um exemplo de realização da presente invenção, o antígeno é preferencialmente uma proteína, uma proteína recombinante, uma glicoproteína, um gene, um peptídeo, um polissacarídeo, um lipopolissacarídeo, um polinucleotídeo, células, um lisado celular, bactérias, vírus ou um antígeno geralmente conhecido, mas a presente invenção não se limita aos mesmos.
[024] Além disso, a presente invenção provê uma composição para controlar uma função imunológica, que inclui o complexo como ingrediente ativo.
[025] Em um exemplo de realização da presente invenção, a composição para controlar uma função imune pode induzir a ativação de células imunes em um microambiente tumoral ou controlar a função de células imunossupressoras e, de preferência, induzir a ativação imune de células apresentadoras de antígeno (células dendríticas, macrófagos, etc.), células assassinas naturais (células NK, do inglês Natural Killer) ou células T, ou regular a função de células imunes que exibem uma ação imunossupressora (células T reguladoras (Tregs), células supressoras derivadas de mieloides (MDSCs) e macrófagos M2), regulando assim a função imunológica no corpo.
[026] Além disso, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar o câncer, que inclui o complexo como ingrediente ativo.
[027] Em um exemplo de realização da presente invenção, a composição farmacêutica pode incluir ainda materiais que são geralmente usados no tratamento do câncer e, de preferência, inclui ainda um agente quimioterápico e um inibidor do ponto de controle imunológico. Uma vez que a composição farmacêutica pode incluir o complexo da presente invenção para ativar eficazmente a função imunológica no corpo, ela pode aumentar a eficácia de um agente quimioterápico convencional ou inibidor do ponto de verificação imunológico.
[028] Em outro exemplo de realização da presente invenção, a composição farmacêutica inibe a proliferação, metástase e recorrência do câncer, ou resistência a uma terapia anticâncer, mas desde que faça parte de um método geralmente usado para o tratamento do câncer, ela pode ser usada sem limitação.
[029] Em outro exemplo de realização da presente invenção, o câncer é preferencialmente um câncer de mama, câncer colorretal, câncer retal, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer de tireoide, câncer oral, câncer de faringe, câncer de laringe, câncer cervical, câncer cerebral, câncer de ovário, câncer de bexiga, câncer de rim, câncer de fígado, câncer de pâncreas, câncer de próstata, câncer de pele, câncer de língua, câncer de útero, câncer de estômago, câncer dos ossos ou câncer do sangue, mas a presente invenção não se limita aos mesmos.
[030] Além disso, a presente invenção fornece um método de prevenção ou tratamento do câncer, que inclui a administração da composição incluindo o complexo como um ingrediente ativo a um sujeito.
[031] Além disso, a presente invenção fornece um uso da composição incluindo o complexo como um ingrediente ativo para prevenir ou tratar o câncer.
[032] Além disso, a presente invenção fornece um uso da composição incluindo o complexo como um ingrediente ativo para prevenir ou tratar uma doença infecciosa.
[033] Além disso, a presente invenção fornece o uso do complexo para a produção de um medicamento usado na prevenção ou tratamento do câncer.
[034] Além disso, a presente invenção fornece um método de preparação de um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8—colesterol, que inclui a ligação química do colesterol a um Sítio ativo de um agonista de receptor Toll-like 7/8 usando um ligante clivável.
[035] Em um exemplo de realização da presente invenção, o método de preparação pode incluir misturar e reagir o agonista de receptor Toll-like 7/8, cloroformato de colesterila e piridina em diclorometano.
[036] Em outro exemplo de realização da presente invenção, o método de preparação pode incluir (a) a preparação de um agente de reticulação dissulfeto por dissolução de dissulfeto de 2-hidroxietil em tetra-hidrofurano, adição e dissolução em uma solução de tolueno e adição e dissolução de N-hidrossuccinimida e trietilamina; (b) a preparação de um reticulante dissulfeto-colesterol misturando e reagindo o reticulante dissulfeto e colesterol; e (c) misturar e reagir o reticulante dissulfeto-colesterol e um agonista de receptor Toll-like
7/8.
[037] Em outro exemplo de realização da presente invenção, na mistura na etapa (b), o agente de reticulação dissulfeto e o colesterol podem ser misturados em uma proporção em peso de 3:1 a 1:1, e durante a mistura na etapa (c), o agente de reticulação dissulfeto- colesterol e o agonista de receptor Toll-like 7/8 podem ser misturados em uma proporção em peso de 4:1 a 1:1.
EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO
[038] Um agonista de receptor Toll-like 7/8 ao qual o colesterol está quimicamente ligado de acordo com a presente invenção (complexo agonista de receptor Toll-like 7/8—colesterol) não pode apenas prevenir a penetração no sangue devido ao aumento da lipofilicidade, mas também reduzir notavelmente os efeitos colaterais e de citotoxicidade de um agonista de receptor Toll-like 7/8 convencional, uma vez que sua função de ativação imune é inibida em um ambiente diferente de um microambiente tumoral ou endossomos em células imunes.
[039] Além disso, após a entrega ao microambiente tumoral e às células imunes, o colesterol e o agonista de receptor Toll-like 7/8 são separados lentamente e reagem consistentemente com o receptor Toll-like por um longo tempo por modulação imune cinética do sítio ativo do agonista de receptor Toll-like 7/8, de modo que pode aumentar notavelmente um efeito terapêutico aumentando a persistência de ativação imune de células imunes em comparação com quando o agonista de receptor Toll-like é usado sozinho.
[040] Além disso, uma vez que o complexo agonista de receptor Toll-like 7/8—colesterol pode induzir a ativação imune de células apresentadoras de antígeno (células dendríticas, macrófagos, etc.), células assassinas naturais (células VM) ou células T, e regular a função de células imunes que exibem uma ação imunossupressora (células T reguladoras (Tregs), células supressoras derivadas de mieloides (MDSCs) ou macrófagos M2) em um microambiente tumoral, ele pode não apenas apresentar um efeito anticâncer sozinho, como também aumentar notavelmente um efeito anticâncer devido a um efeito sinérgico pela coadministração com um inibidor de ponto de controle imune ou um agente quimioterápico.
[041] Além disso, uma vez que o complexo agonista de receptor Toll-like 7/8—colestero| é baseado no colesterol, que é um componente básico de uma biomembrana, ele pode ser facilmente preparado em diversas formas, como uma nanoemulsão, um nanolipossoma e uma nanomicela em combinação com vários lipídios e, portanto, a eficácia da entrega intracelular pode aumentar. Por esta razão, na presente invenção, o complexo agonista de receptor Toll-like 7/8—colestero! pode ser preparado em várias formas, e também é esperado que ele aumente de forma notável o efeito terapêutico em várias doenças induzindo a ativação imune por ser incluído em vários composições farmacêuticas.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[042] Fig. 1 é um diagrama que ilustra a estrutura e o mecanismo de ativação / inativação de um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-colesterol.
[043] Fig. 2 mostra o resultado da verificação da estrutura de um agonista de receptor Toll- like 7/8 de acordo com um exemplo de realização da presente invenção através de !'H-RMN.
[044] Fig. 3 mostra o resultado da verificação da estrutura de um agonista de receptor Toll- like 7/8 ligado ao colesterol de acordo com um exemplo de realização da presente invenção através de *H-RMN.
[045] Fig. 4 mostra o resultado da verificação da estrutura de um agonista de receptor Toll- like 7/8 de acordo com um exemplo de realização da presente invenção através de !ºN- HSQC.
[046] Fig. 5 mostra o resultado da verificação da estrutura de um agonista de receptor Toll- like 7/8 ligado ao colesterol de acordo com um exemplo de realização da presente invenção através de !*N-HSQC.
[047] Fig. 6 mostra o resultado ampliado da verificação da estrutura de um agonista de receptor Toll-like 7/8 ligado ao colesterol de acordo com um exemplo de realização da presente invenção através de **N-HSQC.
[048] Fig. 7 mostra o mecanismo de separação de um agonista de receptor Toll-like 7/8 ligado ao colesterol de acordo com um exemplo de realização da presente invenção em colesterol e agonista de receptor Toll-like 7/8 de acordo com um ambiente fisiológico nas células.
[049] Fig. 8 mostra o mecanismo de separar um agonista de receptor Toll-like 7/8 reticulado com dissulfeto-colesterol de acordo com um exemplo de realização da presente invenção a partir do colesterol devido a um ambiente fisiológico em células.
[050] Fig. 9 é um conjunto de diagramas esquemáticos que ilustram as formas de uma nanopartícula incluindo um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8—colesterol.
[051] Fig. 10 é um gráfico que mostra o resultado da confirmação de que um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-colesterol de acordo com um exemplo de realização da presente invenção é cineticamente separado ao longo do tempo em um pH constante.
[052] Fig. 11 é um gráfico que mostra o resultado da confirmação de que um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-colesterol de acordo com um exemplo de realização da presente invenção é cineticamente separado ao longo do tempo devido a uma enzima.
[053] Fig. 12 é um gráfico que mostra o resultado da confirmação da citotoxicidade de um nanolipossoma incluindo um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-colesterol de acordo com um exemplo de realização da presente invenção.
[054] Fig. 13 é um gráfico que mostra o resultado da confirmação de um indicador de ativação de células imunes (IL-6) de um nanolipossoma compreendendo um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-colesterol de acordo com um exemplo de realização da presente invenção.
[055] Fig. 14 é um gráfico que mostra o resultado da confirmação de um indicador de ativação de células imunes (TNF-alfa) de um nanolipossoma compreendendo um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-colesterol de acordo com um exemplo de realização da presente invenção.
[056] Fig. 15 mostra a diferença na ativação de células imunes por uma substância Chol- R848 sintetizada para permitir a clivagem em um sítio de ligação de um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-colesterol de acordo com um exemplo de realização da presente invenção e uma substância C18-R848 sintetizada para prevenir sua clivagem.
[057] Fig. 16 mostra o resultado da confirmação de uma quantidade que atinge um nódulo linfático e um tempo de retenção após um nanolipossoma incluindo resquimode e um complexo agonista de receptor Toll-like 7 ou 8-colesterol de acordo com um exemplo de realização da presente invenção serem injetados no corpo.
[058] Fig. 17 mostra o resultado da confirmação da eficácia da ativação de células imunes e toxicidade de um nanolipossoma compreendendo um complexo agonista de receptor Toll- like 7/8-colesterol de acordo com um exemplo de realização da presente invenção.
[059] Fig. 18 mostra o resultado da confirmação do efeito inibidor do crescimento tumoral e da taxa de sobrevida com um nanolipossoma compreendendo um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8—colesterol de acordo com um exemplo de realização da presente invenção.
[060] Fig. 19 mostra o resultado da confirmação da capacidade de regular a atividade de células imunes de um nanolipossoma compreendendo um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-colesterol de acordo com um exemplo de realização da presente invenção em um local do tumor.
[061] Fig. 20 mostra o resultado da confirmação da capacidade de regular a atividade de células imunes de um nanolipossoma compreendendo um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8—colesterol de acordo com um exemplo de realização da presente invenção no baço.
[062] Fig. 21 mostra o resultado da confirmação do efeito da coadministração de um nanolipossoma compreendendo um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-colestero| de acordo com um exemplo de realização da presente invenção e um inibidor de ponto de controle imunológico em um modelo animal B16-OVA.
[063] Fig. 22 mostra o resultado da confirmação do efeito da coadministração de um nanolipossoma compreendendo um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8—colestero| de acordo com um exemplo de realização da presente invenção e um inibidor de ponto de controle imunológico em um modelo animal 4T1.
[064] Fig. 23 mostra o resultado da confirmação do efeito da coadministração de um nanolipossoma compreendendo um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8—colestero| de acordo com um exemplo de realização da presente invenção e um inibidor de ponto de controle imunológico em um modelo animal TC1.
[065] Fig. 24 mostra o resultado da confirmação do efeito da coadministração com um nanolipossoma incluindo um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-colesterol de acordo com um exemplo de realização da presente invenção e um agente quimioterápico.
MELHORES MODOS DE REALIZAR A INVENÇÃO
[066] Na presente invenção, em um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-colesterol, um grupo de colesterol está ligado a um sítio ativo de um agonista de receptor Toll-like 7/8 em uma forma clivável e, portanto, uma função de ativação imune é temporariamente inibida (FIG. 1). A inibição pode significar que uma função do sítio ativo do agonista de receptor Toll-like 7/8 é retardada.
[067] Na presente invenção, o complexo é reticulado a um sítio no qual a clivagem é induzida devido a um microambiente tumoral e/ou ambiente intracelular, particularmente, ambientes fisiológicos (pH baixo, enzima, glutationa, etc.) de um endossomo e um lisossomo (FIG. 1). Especificamente, sob um microambiente tumoral, pode haver uma forma de ligação que pode ser regulada de modo que a clivagem ocorra por um estímulo específico, como um pH, temperatura, potencial redox, ultrassom, uma enzima, um campo magnético ou luz infravermelha próxima. Embora a ligação seja preferencialmente formada por uma ligação carbamato, dissulfeto, éster, peptídeo ou azida, qualquer ligação em uma forma clivável é usada sem limitação.
[068] Além disso, na presente invenção, no complexo, o colesterol e um agonista de receptor Toll-like 7/8 podem ser separados devido a várias enzimas presentes em uma célula ou microambiente tumoral, tais como fosfatase ácida, pirofosfatase ácida, fosfodiesterase, fosfoproteína fosfatase, fosfatase fosfatídica ácida, arilsulfatase, proteases, catepsinas, colagenase, arilamidase, peptidase, ribonuclease ácida, desoxirribonuclease ácida, lipases, triglicerídeos —lipase, fosfolipase, esterase, carboxiesterase, clucocerebrosidase, galactocerebrosidase, esfingomielinase, glicosidases, alfa-glucosidase, beta-glucosidase, beta-galactosidase, —alfa-manosidase, alfa-glucosidase, Dbeta-xilosidase, alfa-Macetil- hexosaminidase, beta-Macetil-hexosaminidase, sialidase, lisozima, hialuronidase e beta- glucuronidase.
[069] Na presente invenção, como o agonista de receptor Toll-like 7/8 é preparado ligando quimicamente o colesterol de modo que ele não seja absorvido pelos vasos sanguíneos do corpo, as desvantagens de um agonista de receptor Toll-like 7/8 na forma de sal são superadas.
[070] Na presente invenção, o complexo é facilmente preparado em várias formas, como um nanolipossoma, uma nanomicela e uma nanoemulsão, facilmente pela interação com vários materiais, como vários materiais lipídicos e saponinas, aumentando assim a eficiência de entrega nas células imunes.
[071] O “colesterol” utilizado na presente invenção é um tipo de lipídeo e abrange materiais orgânicos à base de esteroides com uma propriedade hidrofóbica, e o colesterol pode incluir vários derivados com base em uma estrutura de colesterol e compostos que podem ser obtidos alterando quimicamente uma parte do colesterol. De preferência, o colesterol inclui ácidos biliares (ácido cólico, ácido desoxicólico, ácido litocólico e ácido quenodeoxicólico), vitamina D e hormônios esteroides (testosterona, estradiol, cortisol, aldosterona, prednisolona e prednisona), mas a presente invenção não está limitada aos mesmos. Além disso, o colesterol é uma substância que auxilia o agonista de receptor Toll-like 7/8 a estar localizado na superfície e em várias formas de nanopartículas e pode ser substituído por materiais lipídicos com uma função semelhante, por exemplo, lipídios naturais como um fosfolipídeo e lipídeos sintéticos.
[072] A “substância à base de agonista de receptor Toll-like 7/8" usada na presente invenção pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em agonistas do receptor Toll- like 7 ou 8, tal como um composto à base de imidazoquinolina, um composto à base de 8- hidroxiadenina, um composto à base de pteridona, um composto à base de 2- aminopirimidina, um composto à base de benzoazepina e um composto à base de 7-tia-8- oxoguanosina. Aqui, o composto à base de imidazoquinolina inclui compostos divulgados nos documentos WO 2018 196823, WO 2011 049677, WO 2011 027022, WO 2017 102652 e WO 2019 040491, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, mas a presente invenção não está limitada a eles. Além disso, o composto à base de 8-hidroxiadenina inclui compostos divulgados nos documentos WO 2012 080730, WO 2013 068438, WO 2019 036023, WO 2019 035969, WO 2019 035970, WO 2019 035971, WO 2019 035968, CN 108948016, US 2014 8846697, WO 2016 023511, WO 2017 133683, WO 2017 133686, WO 2017 133684, WO 2017 133687, WO 2017 076346, WO 2018 210298, WO 2018 095426, WO 2018 068593, WO 2018 078149, WO 2018 041763, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, mas a presente invenção não está limitada aos mesmos. O composto à base de pteridona inclui compostos divulgados nos documentos US 2010 0143301, WO 2016 007765, WO 2016 044182, WO 2017 035230, WO 2017 219931, WO 2011 057148 e CN 1087 94486, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, mas a presente invenção não está limitada aos mesmos. O composto à base de 2-aminopirimidina inclui compostos divulgados nos documentos WO 2010 133885, WO 2012066335, WO 2012 066336, WO 2012 067268,
WO 2013 172479, WO 2012 136834, WO 2014 053516, WO 2014 053595, US 2018 0215720, WO 2012 156498, WO 2014 076221, WO 2016 141092, WO 2018 045144, WO 2015 014815, WO 2018 233648, WO 2014 207082, WO 2014 056593, WO 2018 002319 e WO 2013 117615, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, mas a presente invenção não está limitada aos mesmos. O composto à base de benzoazepina inclui compostos divulgados nos documentos WO 2007 024612, WO 2010 014913, WO 2010 054215, WO 2011 022508, WO 2011 022509, WO 2012 097177, WO 2012 097173, WO 2016 096778, WO 2016 142250, WO 2017 202704, WO 2017 202703, WO 2017 216054, WO 2017 046112 e WO 2017 197624, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, mas a presente invenção não está limitada aos mesmos. O composto à base de 7-tia-8-oxoguanosina inclui compostos divulgados nos documentos WO 2016 180691, WO 2016 055553, WO 2016 180743 e WO 2016 091698, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, mas a presente invenção não está limitada aos mesmos. Além disso, compostos de receptor Toll-like 7/8 divulgados nos documentos PCT/US2009/035563, PCT/US2015/028264, PCT/US2016/020499, WO 2015 023598 e PCT/US 2015/039776 ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser incluídos, mas a presente invenção não está limitada a estes. Todos os agonistas do receptor Toll-like 7/8 disponíveis que podem ser facilmente inferidos por aqueles versados na técnica estão incluídos.
[073] A expressão “agonista de receptor Toll-like 7/8" usada no presente documento pode ser aplicada a um “agonista de receptor Toll-like 3” ou “agonista de receptor Toll-like 9", que é entregue nas células e tem um receptor em um endossomo, e da mesma forma, o “agonista de receptor Toll-like 3" ou “agonista de receptor Toll-like 9" também pode formar um complexo com o colesterol, mas a presente invenção não está limitada ao mesmo.
[074] Ao longo do relatório descritivo, o complexo agonista de receptor Toll-like 7/8- colesterol pode regular uma função imune de células imunes, de modo que a ativação imune de células apresentadoras de antígeno (células dendríticas, macrófagos, etc.), células assassinas naturais ou células T seja induzida, ou pode regular uma função imune de células imunes regulando a função das células imunes (células T reguladoras (Tregs), células supressoras derivadas de mieloides (MDSCs) e macrófagos M2), que exibem uma ação imunossupressora, em um microambiente tumoral. A função das células imunes que exibem uma ação imunossupressora pode ser regulada pela inibição da ação de Tregs ou MDSCs, ou reduzindo a contagem de células, ou pode ser regulada por um método de conversão de MDSCs em células apresentadoras de antígeno que induzem uma função imunológica anticâncer. Alternativamente, os macrófagos M2 podem ser convertidos em macrófagos M1.
[075] Os termos “coadministração” ou “administração combinada” utilizados na presente invenção indicam a administração de um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8- colesterol conjuntamente com vários materiais, como um antígeno, um inibidor de ponto de controle imunológico, um adjuvante, uma substância de ativação imune e um agente quimioterápico, e não há limitações quanto ao tipo e forma dos materiais.
[076] O “agente quimioterápico” usado no presente documento pode ser qualquer composto conhecido no estado da técnica, que pode ser usado no tratamento do câncer, sem limitação, e o agente quimioterápico pode ser paclitaxel, docetaxel, 5-flurouracila, alendronato, doxorrubicina, sinvastatina, hidrazinocurcumina, anfotericina B, ciprofloxacina, rifabutina, rifampicina, efavirenz, cisplatina, teofilina, exotoxina A de pseudomonas, ácido zoledrônico, trabectedina, siltuximabe, dasatinibe, sunitinibe, apatinibe, ácido 5,6- dimetilxantenona-4-acético, silibinina, PF-04136309, trabectedina, carlumabe, BLZ945, PLX3397, emactuzumabe, AMG-820, IMC-CS4, GW3580, PLX6134, N-acetil-I-cisteína, vitamina C, bortezomibe, aspirina, salicilatos, derivados de indolecarboxamida, análogos de quinazolina, talidomida, metabólitos de prostaglandina, 2ME2, 17-AAG, camptotecina, topotecana, pleurotina, 1-metilpropila, dissulfeto de 2-imidazolila, tadalafil, sildenafil, L- AME, nitroaspirina, celecoxibe, NOHA, metil bardoxolona, D,L-1-metil-trriptofano, gemrcitabina, axitinibe, sorafenibe, cucurbitacina B, JSI-124, anticorpos anti-IL-17, anticorpos antiglicanos, anticorpos anti-VEGF, bevacizumabe, antraciclina, tasquinimod, imatinibe ou ciclofosfamida, mas a presente invenção não se limita aos mesmos.
[077] O “inibidor do ponto de controle imunológico” usado neste documento inclui todos os métodos de tratamento do câncer, que ativam a função imunológica das células imunes para combater as células cancerosas, e o inibidor do ponto de controle imunológico inclui, por exemplo, anti-PD-1, anti-PD-L1 anti-CTLA-4, anti-KIR, anti-LAG3, anti-CD137, anti- OX40, anti-CD276, anti-CD27, anti-GITR, anti-TIM3, anti-41BB, anti-CD226, anti-CD40, anti- CD70, anti-ICOS, anti-CD40L, anti-BTLA, anti-TCR ou anti-TIGIT, mas a presente invenção não se limita aos mesmos.
[078] A substância de ativação imune usada no presente documento inclui todas as substâncias para ativação de células imunes, e a substância de ativação imune é, por exemplo, um agonista de receptor Toll-like, uma saponina, um peptídeo antiviral, um indutor de inflamassoma, um ligante NOD, um sensor de DNA citosólico (CDS) ligante, um estimulador do ligante do gene do interferon (STING), uma emulsão ou alúmen, mas a presente invenção não está limitada aos mesmos.
[079] O “antígeno” utilizado na presente invenção inclui todos os materiais que provocam uma resposta imune no organismo, e é preferencialmente um agente patogênico (bactéria, um vírus, etc.), um produto químico composto, pólen, células cancerosas, camarão, ou um peptídeo ou proteína derivado do antígeno e, mais preferencialmente, um peptídeo de antígeno de câncer ou uma substância que pode causar uma resposta imune no corpo, mas a presente invenção não está limitada aos mesmos. O antígeno é preferencialmente uma proteína, uma proteína recombinante, uma glicoproteína, um gene, um peptídeo, um polissacarídeo, um lipopolissacarídeo, um polinucleotídeo, uma célula, um lisado celular, uma bactéria ou um vírus e, mais preferencialmente, um peptídeo de antígeno de câncer. A glicoproteína pode ser um anticorpo, um fragmento de anticorpo, uma proteína estrutural, uma proteína reguladora, um fator de transcrição, uma proteína de toxina, um hormônio, um derivado de hormônio, uma enzima, um fragmento de enzima, uma proteína de transporte, um receptor, um receptor fragmento, um indutor de biodefesa, uma proteína de armazenamento, uma proteína de movimento, uma proteína exploradora ou uma proteína repórter. No entanto, o antígeno não está limitado a estes desde que seja uma substância que possa induzir uma resposta imune agindo como um antígeno no corpo.
[080] A “vacina” utilizada na presente invenção refere-se a uma preparação biológica contendo um antígeno que provoca uma resposta imune no corpo e um imunógeno que cria imunidade no corpo por injeção ou administração oral a um humano ou animal para a prevenção de infecção. O animal é um animal humano ou não humano, como um porco, vaca, cavalo, cão, cabra ou uma ovelha, mas a presente invenção não se limita aos mesmos.
[081] O termo “prevenção” utilizado na presente divulgação refere-se a todas as ações de inibição de uma doença, como câncer, uma doença imune ou uma doença infecciosa, ou ações de retardar o início das mesmas, pela administração da composição de acordo com a presente invenção.
[082] O termo “tratamento” utilizado na presente invenção refere-se a todas as ações envolvidas no alívio ou alteração benéfica dos sintomas de uma doença, como câncer, doença imune ou doença infecciosa, pela administração da composição de acordo com a presente invenção.
[083] O “indivíduo” ou “sujeito” utilizado na presente invenção refere-se a um alvo ao qual a composição da presente invenção pode ser administrada e não há limitação para o sujeito.
[084] O termo “câncer” utilizado na presente invenção refere-se ao termo genérico para vários tipos de câncer de sangue e tumores sólidos malignos, que podem se expandir localmente por infiltração e sistemicamente por meio de metástases. Embora não seja particularmente limitado aos mesmos, exemplos específicos de câncer incluem câncer colorretal, câncer adrenal, câncer ósseo, câncer cerebral, câncer de mama, câncer brônquico, câncer de cólon e/ou câncer retal, câncer de vesícula biliar, câncer gastrointestinal, câncer de cabeça e pescoço, câncer renal, câncer de laringe, câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer de tecido neural, câncer de pâncreas, câncer de próstata, câncer de paratireoide, câncer de pele, câncer de estômago e câncer de tireoide. Outros exemplos de câncer incluem adenocarcinoma, adenoma, carcinoma de células basais, displasia cervical e carcinoma n situ, sarcoma de Ewing, carcinoma escamoso, carcinoma ductal, tumor cerebral maligno, tumor de células pilosas, ganglioneuroma intestinal, tumor do nervo da córnea hiperplásico, carcinoma de células da ilhota, sarcoma de Kaposi, leiomioma, leucemia, linfoma, carcinoide maligno, melanoma maligno, hipercalcemia maligna, tumor de hábito marfanoide, carcinoma medular, câncer de pele metastático, neuroma da mucosa, síndrome mielodisplásica, mieloma, micose fungoide,
[085] neuroblastoma, osteosarcoma, e outros sarcomas osteogênicos, câncer de ovário, feocromocitoma, policitemia, tumor cerebral primário, câncer de pulmão de células pequenas, carcinoma ulcerativo e papilar de células escamosas, seminoma, sarcoma de tecidos moles, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, tumor de células renais ou carcinoma de células renais (RCC), sarcoma de células do retículo e tumor de Wilms. Exemplos de câncer também incluem astrocitoma, tumor estromal gastrointestinal (GIST), glioma ou glioblastoma, carcinoma hepatocelular (HCC) e câncer neuroendócrino pancreático.
[086] O termo “doença infecciosa” inclui todas as doenças induzidas por infecção causada por organismos heterogêneos, como bactérias e vírus.
[087] As expressões “composição farmacêutica” ou “composição de vacina” utilizadas na presente invenção são preparadas sob a forma de uma cápsula, comprimido, granulado, injeção, unguento, pó ou bebida, e a composição farmacêutica ou composição de vacina pode ser direcionada para um ser humano. A composição farmacêutica ou composição de vacina pode ser usada em uma formulação oral tal como um pó, grânulo, cápsula, comprimido ou uma suspensão aquosa, externa, um supositório, e uma solução injetável estéril de acordo com um método convencional, mas a presente invenção não está limitada aos mesmos. A composição farmacêutica ou composição de vacina da presente invenção pode incluir um veículo farmaceuticamente aceitável. Como veículo farmaceuticamente aceitável, um aglutinante, um lubrificante, um desintegrante, um excipiente, um solubilizante, um agente dispersante, um estabilizante, um agente de suspensão, um corante e um agente aromatizante podem ser utilizados para administração por via oral, uma mistura de um tampão, um conservante, um agente de alívio da dor, um solubilizante, um agente isotônico e um estabilizante podem ser usados para um injetável, e uma base, um excipiente, um lubrificante e um conservante pode ser utilizado para administração local. A composição farmacêutica ou composição de vacina da presente invenção pode ser preparada em várias formas de dosagem misturando os veículos farmaceuticamente aceitáveis descritos acima. Por exemplo, para administração oral, a composição farmacêutica ou composição de vacina da presente invenção pode ser preparada em várias formas de dosagem, tais como um comprimido, uma pastilha, uma cápsula, um elixir, uma suspensão, um xarope e um Wwafer, e para injetáveis, a composição farmacêutica ou composição de vacina da presente invenção pode ser preparada em uma ampola de dose unitária ou em formas de dosagens múltiplas. Além disso, a composição farmacêutica ou composição de vacina da presente invenção pode ser formulada como uma solução, uma suspensão, um comprimido, uma cápsula ou uma preparação de libertação controlada (sustentada).
[088] Entretanto, exemplos de transportadores/veículos, excipientes e diluentes adequados para preparação podem incluir lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, amido, goma acácia, alginato, gelatina, fosfato de cálcio, silicato de cálcio, celulose, metilcelulose, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, água, hidroxibenzoato de metila, hidroxibenzoato de propila, talco, estearato de magnésio e óleo mineral. Os exemplos de transportadores/veículos, excipientes e diluentes também podem incluir uma carga, um antiaglomerante, um deslizante, um agente umectante, uma fragrância, um emulsificante e um conservante.
[089] As vias de administração para a composição farmacêutica ou composição de vacina de acordo com a presente invenção podem incluir, mas não estão limitadas a via oral, intravenosa, intramuscular, — intra-arterial, intramedular, intratecal, intracardíaca, transdérmica, subcutânea, intraperitoneal, intranasal, intraperitoneal, intranasal, intestinal, administração local, sublingual ou retal. A administração oral ou parenteral é preferível. O termo “parenteral” utilizado na presente invenção significa técnicas de injeção subcutânea, intracutânea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intrabursal, intraesternal, intratecal, intralesional e intracraniana. A composição farmacêutica ou composição de vacina da presente invenção pode ser administrada na forma de um supositório para administração retal.
[090] A composição farmacêutica ou composição de vacina da presente invenção pode ser alterada de acordo com vários fatores, incluindo a atividade de um composto específico usado, idade, peso corporal, saúde geral, sexo, dieta, tempo de administração, via de administração, taxa de excreção, formulação do medicamento, e a gravidade de uma doença específica a ser prevenida ou tratada, e uma dosagem da composição farmacêutica pode ser adequadamente selecionada por aqueles versados na técnica, dependendo da condição do paciente, peso corporal, gravidade de uma doença, do tpo de medicamento, via de administração e duração da administração, e pode ser de 0,0001 à 500 mg/kg ou 0,001 a 500 mg/kg por dia. A composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada uma vez por dia ou várias vezes em porções divididas. A dose não limita o escopo da presente invenção de forma alguma. A composição farmacêutica ou composição de vacina de acordo com a presente invenção pode ser formulada como uma pílula, uma drágea, uma cápsula, um líquido, um gel, um xarope, uma pasta ou uma suspensão.
[091] Além disso, a composição da vacina de acordo com a presente invenção pode incluir ainda um “adjuvante” convencionalmente conhecido. O adjuvante geralmente abrange todos os materiais que aumentam as respostas imunes humorais e/ou celulares contra um antígeno, e qualquer adjuvante conhecido na técnica pode ser usado sem limitação. Por exemplo, a imunidade pode ser aumentada adicionando ainda um aditivo completo ou incompleto de Freund à composição de vacina de acordo com a presente invenção. Além disso, no caso da composição de vacina, se necessário, a estimulação do antígeno opcionalmente repetida pode ser realizada após uma dose inicial.
[092] Doravante, para ajudar na compreensão da presente invenção, exemplos serão sugeridos. No entanto, os seguintes exemplos são fornecidos meramente para compreender mais facilmente a presente invenção e não para limitar a presente invenção.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: SÍNTESE DO COMPLEXO AGONISTA DE RECEPTOR TOLL-LIKE 7/8-
COLESTEROL
[093] Vários agonistas do receptor Toll-like 7/8 (à base de imidazoquinolina, à base de 8- hidroxiadenina, à base de pteridona, à base de 2-aminopirimidina, à base de benzoazepina e à base de 7-tia-8-o0xoguanosina) conjugados com colesterol foram preparados por uma reação química, tal como o Esquema de Reação 1 ou 2. O agonista de receptor Toll-like 7/8 pode ser preparado pela reação de um sítio ativo do agonista de receptor Toll-like 7/8, um grupo amina (NH>), com um derivado de colesterol que pode formar uma ligação com um carbamato, um dissulfeto, um éster, um peptídeo ou uma azida. O derivado abrange compostos semelhantes obtidos por alteração química de uma parte de um agonista de receptor Toll-like 7/8. ESQUEMA DE REAÇÃO 1
| piidina + DEM, dxe, durante a note À 3“ à série imidazoquinolina "> + DOM, 4, dantes note NºS tz o” kb, série 8-hidróxiadenina : (z= derivados aromáticos ou alifáticos) We + piridina RO Ó + o DEM, de durante a noto er série pteridona (Ar= derivados aromáticos) * piridina + o DEM, 4%, durante a noite
OO série 2-aminopirimidina o piridina ? + —. h A DCM, 4% durante a noite Jd i cr x série benzoazepina (Ar= derivados aromáticos)
[094] R é uma cadeia lateral com um grupo alifático ou aromático e pode incluir -NH-, -CO- , -CONH-, -CSNH-, -COO-, -CSO-, -SO2NH-, -SO2-, -SO- e -O-. ESQUEMA DE REAÇÃO 2
NH É E É rtirntnaittrtmsennenano MA série imidazoquinolina .
NH E sao À, > kz série 8-hidróxiadenina (z= derivados aromáticos ou alifáticos) W TA, —.— DS C no io fuemuannatatnitnttnttnrnt— Sa. 1 th série 2-aminopirimidina ' RW e na AÉ O» no série benzoazepina
[095] R é uma cadeia lateral com um grupo alifático ou aromático e pode incluir -NH-, -CO- , -CONH-, -CSNH-, -COO-, -CSO-, -SO2NH-, -SO7-, -SO- e -O-.
1.1. SÍNTESE DO COMPLEXO RESIQUIMODE-COLESTEROL COM LIGAÇÃO CARBAMATO
[096] Para sintetizar resiquimode conjugado com colesterol (R848), foi usado um método do Esquema de Reação 3 abaixo. Mais especificamente, uma solução na qual 90,0 mg de cloroformato de colesterila foram adicionados e dissolvidos em 1 mL de diclorometano que foi lentamente adicionado gota a gota a uma solução na qual 100 uL de piridina foram adicionados a 31,4 mg de resiquimode, e a solução adicionada e dissolvida em 3 mL de diclorometano. Em seguida, uma mistura foi preparada agitando a solução resultante a 4ºC por 16 horas. Além disso, a mistura foi ajustada à temperatura ambiente e água destilada foi adicionada para separar a água e uma camada de diclorometano. Subsequentemente, sulfato de sódio foi adicionado à camada de diclorometano separada e reagiu durante 16 horas para remover a água remanescente. Além disso, a solução restante foi purificada usando uma coluna de gel de sílica, obtendo-se assim pó de resiquimode conjugado com colesterol como uma substância branca. As estruturas de resiquimode usadas na síntese e o resiquimode conjugado a colesterol obtidos foram verificados usando espectroscopia de !H-RMN e de *N-Coerência Heteronuclear de Simples Quantum (HSQC). As estruturas de resiquimode são mostradas nas Figuras 2 e 4, e as estruturas de resiquimode conjugado com colesterol são mostradas nas Figuras 3, 5 e 6. Um mecanismo de separação do colesterol do resiquimode conjugado com colesterol devido a um ambiente fisiológico nas células é mostrado na FIG. 7. ESQUEMA DE REAÇÃO 3 H à. o CC E ”. o DOM, 4ºC, durante a noite E
1.2. SÍNTESE DO COMPLEXO IMIQUIMODE-COLESTEROL COM LIGAÇÃO CARBAMATO
[097] Para sintetizar imiquimode conjugado com colesterol (R837), foi usado um método mostrado no Esquema de Reação 4 abaixo. Mais especificamente, uma solução na qual 90,0 mg de cloroformato de colesterila foram adicionados e dissolvidos em 1 mL de diclorometano que foi lentamente adicionado gota a gota a uma solução na qual 100 yuL de piridina foram adicionados a 31,4 mg de imiquimode, e em seguida a solução foi adicionada e dissolvida em 3 mL de diclorometano. Em seguida, uma mistura foi preparada agitando a solução resultante a 4ºC por 16 horas. Além disso, a mistura foi ajustada à temperatura ambiente e, em seguida, água destilada foi adicionada para separar a água e uma camada de diclorometano, e sulfato de sódio foi adicionado à camada de diclorometano separada para permitir uma reação durante 16 horas de modo a remover a água restante. A solução remanescente foi então purificada usando uma coluna de gel de sílica, obtendo assim imiquimode ligado ao colesterol em um pó branco. ESQUEMA DE REAÇÃO 4 *. AX ATÉ ( 2 Rh EM DOM APG, dante ante ID CC R2
[098] R: ou R2> é uma cadeia lateral com um grupo alifático ou aromático e pode incluir - NH-, -CO-, -CONH-, -CSNH-, -COO-, -CSO-, -SO2NH-, -SO7-, -SO- e -O-. EXEMPLO 2: SÍNTESE DO COMPLEXO AGONISTA DE RECEPTOR TOLL-LIKE 7/8-
COLESTEROL RETICULADO POR DISSULFETO
2.1. SÍNTESE DO COMPLEXO RESIQUIMODE-COLESTEROL RETICULADO POR DISSULFETO
[099] Para sintetizar resiquimode com colesterol reticulado com dissulfeto, um método do Esquema Reacional 5 abaixo foi utilizado. Mais especificamente, adicionou-se 1,54 g de dissulfeto de 2-hidroxietila que foi dissolvido em 30 mL de tetrahidrofurano, e então adicionou-se lentamente gota a gota a uma solução de fosgênio (15 mL, 15% em peso em tolueno), preparando-se assim uma mistura. Adicionalmente, a mistura foi agitada a 25ºC durante 10 horas, e em seguida, o solvente foi evaporado em vácuo. Além disso, foi adicionado 2,3 g de N-hidrosuccinimida e dissolvido em tetrahidrofurano que foram misturados com a mistura, seguido pela adição de 1,57 mL de trietilamina. Além disso, após a reação a 40ºC durante 16 horas, um precipitado foi removido, e, em seguida, o solvente foi evaporado /n vacuo. Além disso, a solução resultante foi purificada por cromatografia em coluna de gel de sílica e recristalizada usando hexano frio, a mistura foi seca /n vacuo obtendo-se assim um sólido branco, o qual é um ligante dissulfeto reticulado purificado. Além disso, foi adicionado 387 mg de colesterol e dissolvido em 10 mL de diclorometano, adicionou-se 523 mg de um agente de ligação reticulada por dissulfeto e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas, e então colesterol-dissulfeto como um pó branco no qual o colesterol e dissulfetos são ligadas foi purificado utilizando uma coluna de gel de sílica. Além disso, 31,4 mg de resiquimode e 80 mg de colesterol-dissulfeto foram adicionados a 5 mL de diclorometano, e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas. Além disso, adicionou-se água destilada à solução agitada para separar água e uma camada de diclorometano, e o sulfato de sódio foi adicionado à camada separada de diclorometano e reagido durante 16 horas de modo a remover a água remanescente. Além disso, a solução restante foi purificada usando uma coluna de gel de sílica, obtendo-se assim resiquimode reticulado com colesterol-dissulfeto como um pó branco. ESQUEMA DE REAÇÃO 5 etica + BELLE + A FA, õ — SK LARA, Lia pat nem .
XX AX 2 ANDO A Ao Ae” UE GA ag ga do rs : E. tras atte o Sz ou
[0100] Um mecanismo de separação do colesterol do resiquimode reticulado com colesterol-dissulfeto devido a um ambiente fisiológico nas células é mostrado na FIG. 8.
2.2. SÍNTESE DE COMPLEXO DE COLESTEROL-IMIQUIMODE RETICULADO POR
DISSULFETO
[100] Para sintetizar imiquimode reticulado com colesterol-dissulfeto, foi utilizado um método do Esquema de reação 6. Mais especificamente, adicionou-se 1,54 g de dissulfeto de 2-hidroxietila que foi dissolvido em 30 mL de tetrahidrofurano, e então adicionou-se lentamente gota a gota a uma solução de fosgênio (15 mL, 15% em peso em tolueno), preparando-se assim uma mistura. Adicionalmente, a mistura foi agitada a 25ºC durante 10 horas, e em seguida, o solvente foi evaporado em vácuo. Além disso, foi adicionado 2,3 g de N-hidrosuccinimida e dissolvido em tetrahidrofurano que foram misturados com a mistura, seguido pela adição de 1,57 mL de trietilamina. Além disso, após a reação a 40ºC durante 16 horas, um precipitado foi removido, e, em seguida, o solvente foi evaporado in vacuo. Além disso, a solução resultante foi purificada por cromatografia em coluna de gel de sílica e recristalizada usando hexano frio, a mistura foi seca /n vacuo obtendo-se assim um sólido branco, o qual é um ligante dissulfeto reticulado purificado. Além disso, foi adicionado 387 mg de colesterol e dissolvido em 10 mL de diclorometano, adicionou-se 523 mg de um agente de ligação reticulada por dissulfeto e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas, e então colesterol-dissulfeto como um pó branco no qual o colesterol e dissulfetos foram conjugados foi purificado utilizando uma coluna de gel de Sílica. Além disso, 31,4 mg de imiquimode e 80 mg de colesterol-dissulfeto foram adicionados a 5 mL de diclorometano, e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas. Além disso, adicionou-se água destilada à solução agitada para separar água e uma camada de diclorometano, e o sulfato de sódio foi adicionado à camada separada de diclorometano e reagido durante 16 horas para remover a água remanescente. Além disso, a solução restante foi purificada usando uma coluna de gel de sílica, obtendo- se assim imiquimode reticulado com colesterol-dissulfeto como um pó branco. ESQUEMA DE REAÇÃO 6 A BA as ee Aa AC Ra a A EIO
O O
[101] Ri ou Ro é uma cadeia lateral com um grupo alifático ou aromático e pode incluir - NH-, -CO-, -CONH-, -CSNH-, -COO-, -CSO-, -SO2NH-, -SO7-, -SO- e -O-. EXEMPLO 3: PREPARAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS INCLUINDO COMPLEXO AGONISTA DE RECEPTOR TOLL-LIKE 7/8-COLESTEROL
[102] Para maximizar a interação com as células imunes, um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8—colesterol pode ser preparado em várias formas de nanopartículas (FIG. 9).
3.1. PREPARAÇÃO DE NANOLIPOSSOMA INCLUINDO RESIQUIMODE CONJUGADO COM
COLESTEROL
[103] Para preparar um nanolipossoma aniônico incluindo resiquimode conjugado com colesterol, 4 mg de 1,2-dioleoil-sr-glicero-3-fosfocolina (DOPC, Avanti), 1,2 mg de resiquimode conjugado com colesterol e 1 mg de 1,2-dipalmitoil-sr-glicero-3-fosfo-(1'-rac glicerol) (DPPG, Avanti) foram adicionados e dissolvidos em 1 mL de clorofórmio, preparando-se assim uma mistura. A mistura foi preparada em uma forma de filme fino por evaporação do solvente usando um evaporador rotativo, e 2 mL de solução salina tamponada com fosfato foram adicionados ao filme fino e agitado a 45 ºC por 30 minutos, preparando assim um nanolipossoma aniônico compreendendo resiquimode conjugado com colesterol por homogeneização usando um sonicador de ponta (amplitude: 20%, 2 min). Para preparar um nanolipossoma catiônico incluindo resiquimode conjugado com colesterol, 4 m g de DOPC, 1,2 mg de resiquimode conjugado com colesterol e 2 mg de brometo de dimetiloctadecilamônio (DDAB) foram adicionados e dissolvidos em 1 mL de clorofórmio, preparando assim uma mistura. A mistura foi preparada em uma forma de filme fino por evaporação do solvente usando um evaporador rotativo, e 2 mL de solução salina tamponada com fosfato foram adicionados ao filme fino e agitado a 45 ºC por 30 minutos, preparando assim um nanolipossoma catiônico compreendendo resiquimode conjugado com colesterol por homogeneização usando um sonicador de ponta (amplitude: 20%, 2 min).
3.2. PREPARAÇÃO DE NANOEMULSÃO INCLUINDO RESIQUIMODE CONJUGADO COM
COLESTEROL
[104] Para preparar uma nanoemulsão incluindo resiquimode conjugado com colesterol, 1 mg de DOPC, 240 ug de colesterol e 240 ug de resiquimode conjugado com colestero! foram adicionados e dissolvidos em 1 mL de clorofórmio, preparando assim uma mistura. Além disso, a mistura foi preparada na forma de um filme lipídico fino, contendo a mistura em um balão de fundo redondo e evaporando completamente o clorofórmio usando um evaporador rotativo. Além disso, esqualeno (5% v/v), Tween 80 (0,5% v/v) e Span 85 (0,5% v/v) foram adicionados e dissolvidos em 2 mL de solução salina tamponada com fosfato e a solução foi adicionada sobre o filme lipídico, disperso usando um sonicador de ponta por 1 minuto e agitado usando um revólver de tubo por aproximadamente 2 horas, preparando assim uma nanoemulsão incluindo resiquimode conjugado com colesterol e, em seguida, a nanoemulsão foi armazenada a 4ºC em uma geladeira até o uso.
3.3. PREPARAÇÃO DE NANOMICELA CONSISTINDO DE RESIQUIMODE CONJUGADO COM
COLESTEROL E SAPONINA
[105] Para preparar uma nanomicela que consiste em resiquimode conjugado com colesterol e saponina, fosfatidilcolina, saponina e resiquimode conjugado com colesterol! foram misturados em uma proporção em peso de 5:3:2, e éter foi adicionado e dissolvido na mistura para ter uma concentração de 14 mg/mL, preparando assim uma solução de éter incluindo um lipídeo. Além disso, a saponina foi dissolvida em 4 mL de água destilada na concentração de 1,5 mg/mL e colocada em um frasco de vidro de 20 mL. A garrafa de vidro foi fechada com uma rolha de borracha e, em seguida, armazenada em uma câmara de água a 55ºC. Além disso, 1 mL da solução de éter contendo lipídios foi adicionado ao frasco de vidro contendo saponina a uma taxa de 0,2 mL/min usando uma bomba de seringa e agitada por 2 horas. Aqui, a ponta da agulha da seringa foi colocada abaixo da superfície da solução aquosa contendo saponina, e uma segunda agulha foi inserida na rolha de borracha para ventilação. Além disso, o frasco de vidro foi transferido à temperatura ambiente, agitado por 3 horas para estabilizar, preparando assim uma nanomicela consistindo de resiquimode conjugado com colesterol e saponina.
3.4. PREPARAÇÃO DE NANOPARTÍCULA DE POLÍMERO CONSISTINDO EM RESIQUIMODE
CONJUGADO A COLESTEROL
[106] 60 mg de um polímero PLGA (Eudragit) tendo uma proporção de composição de lactídeo e glicolídeo de 50:50 foram dissolvidos em 1 mL de um solvente clorofórmio. 5 mg de resiquimode conjugado com colesterol foram adicionados ao solvente e o complexo colesterol-resiquimode e o polímero foram dissolvidos usando um sonicador (banho ultrassônico, Emerson Modelo CPX5800H-E). Além disso, a solução resultante foi adicionada a 10 mL de um 2,5% de PVA aquosa à solução por 200 mL, e disperso durante 1 minuto utilizando um sonicador de ponta (Sonics & Materials Modelo VCX 750). Aqui, a saída de um dispersor foi de 750 watts, a intensidade de vibração foi de 20 kHz e a amplitude foi ajustada para 20%. Além disso, para evaporar completamente o PLGA dissolvido em solvente orgânico, a solução aquosa preparada foi agitada a 600 rom em temperatura ambiente durante 8 horas ou mais. Para remover o polímero que não reagiu e o complexo colesterol- resiquimode, a centrifugação foi realizada a 12.000 rpm por 12 minutos usando uma centrífuga (Hanil, Combi-514R), o sobrenadante foi removido e 10 mL de água deionizada foram adicionados e, em seguida, a solução resultante foi dispersa utilizando um sonicador por 30 segundos. O processo descrito acima foi repetido três vezes, seguido pela secagem por liofilização e armazenamento a -20ºC. EXEMPLO 4: CARACTERIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS COMPREENDENDO O COMPLEXO AGONISTA DE RECEPTOR TOLL-LIKE 7/8-COLESTEROL E AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DE
ATIVAÇÃO IMUNE DE CÉLULAS IMUNES
[107] Após nanopartículas compreendendo o complexo agonista de receptor Toll-like 7/8- colesterol da presente invenção serem entregues às células, foi confirmado se o colesterol! e o resiquimode se separavam em condições ácidas no citoplasma. Mais especificamente, nanolipossomas incluindo resiquimode conjugado com colesterol foram preparados pelo mesmo método que no Exemplo 3.1, 10 ug do nanolipossoma preparado foram adicionados a 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) com pH 5 ou 7 a 37 ºC. Além disso, cada amostra foi obtida no dia 0,5, 1, 1,5 ou 2 para medir uma concentração de resiquimode separado usando um espectro UV—Vis. O resultado é mostrado na Figura 10
[108] Como mostrado na Fig. 10, enquanto resiquimode e colesterol não foram separados em pH 7, foi confirmado que resiquimode é separado do colesterol ao longo do tempo em pH 5. De acordo com o resultado, depois que as nanopartículas incluindo o complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-colesterol foram entregue no citoplasma do corpo, foi confirmado que o agonista de receptor Toll-like 7/8 é separado do colesterol para induzir uma reação de ativação imunológica no citoplasma.
[109] Além disso, para confirmar se a clivagem é feita por uma enzima específica presente em um microambiente tumoral excluindo o pH, um nanolipossoma incluindo resiquimode conjugado com colesterol foi preparado pelo mesmo método do Exemplo 3.1, 30 unidades de carboxilesterase foram tratadas e reagiram a 37 ºC. Além disso, a clivagem do colesterol! foi confirmada. O resultado é mostrado na Figura 11
[110] Como mostrado na FIG. 11, foi confirmado que o colesterol do complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-colesterol foi clivado por uma enzima específica presente nas células de um microambiente tumoral.
[111] Para confirmar a citotoxicidade, 10º macrófagos Raw264.7 foram tratados com 100 HL cada um de 500 ng/mL e 1.000 ng/mL de lipossomas, nanolipossomas incluindo um complexo colesterol|-resiquimode e resiquimode, e reagiram por 24 horas. Além disso, a taxa de sobrevida celular foi medida usando o kit Ce/fTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega). Como controle negativo, foi realizado um experimento usando solução salina tamponada com fosfato. O resultado é mostrado na Figura 12
[112] Como mostrado na Fig. 12, foi confirmado que os nanolipossomas incluindo o complexo colestero|-resiquimode não apenas exibem citotoxicidade, como também exibem um efeito de promoção da proliferação por ativação de células imunes.
[113] Além disso, para confirmar o grau de ativação de células imunes, 10º macrófagos Raw264.7 foram tratados com 1 mL de 500 ng/mL e 1.000 ng/mL de lipossomas, nanolipossomas compreendendo um complexo colesterol-resiquimode e resiquimode, e incubados por 24 horas, obtendo-se assim uma cultura líquida de células. A cultura de células líquida foi centrifugada a 1.500 rom por 10 minutos para obtenção de um sobrenadante livre de células, e as concentrações de IL-6 e TNF-a incluídas no sobrenadante foram medidas por ELISA com o kit BD OptiEIATM. O resultado é mostrado nas Figuras 13 ela.
[114] Como mostrado nas Figuras 13 e 14, em comparação com quando o resiquimode foi tratado sozinho, foi confirmado que as quantidades de IL-6 e TNF-a liberadas aumentam em um grupo experimental tratado com nanolipossomas incluindo um complexo colesterol- resiquimode, demonstrando que a ativação imune de um agonista de receptor Toll-like 7/8 pode não apenas ser induzida de forma estável em um ponto de tempo desejado nas células, como também pode aumentar o grau de ativação imunológica, usando os nanolipossomas que compreendem um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-colesterol.
[115] O grau de ativação das células imunes foi confirmado usando um complexo colesterol-resiquimode no qual o colesterol não é clivado em um ponto específico do tempo como controle. Mais especificamente, 2 x 10º células/mL de células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDCs) ou macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) foram tratados com: um lipossoma (Lipo (Chol-R848)) que compreende o complexo colesterol- resiquimode da presente invenção, um lipossoma (Lipo (C18-R848)) que compreende um complexo colesterol-resiquimode não clivado, um lipossoma e resiquimode por concentração; e incubados durante 24 horas. Além disso, foi obtida uma cultura líquida, centrifugada a 490 g por 5 minutos, obtendo-se assim apenas um sobrenadante, e o ELISA foi realizado com o kit BD OptEIA"”. O resultado é mostrado na Figura 15.
[116] Como mostrado na Figura 15, enquanto o complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-—colesterol da presente invenção ativa efetivamente as células imunes induzindo a clivagem do colesterol! no citoplasma, foi confirmado que o complexo no qual a clivagem do colesterol não é induzida não ativa células imunes, uma vez que o sítio ativo do resiquimode não é exposto. A partir dos resultados acima, foi confirmado que o complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-colesterol da presente invenção é inativado quando o colesterol não é clivado, mas efetivamente ativa as células imunes após o colesterol ser clivado sob uma condição específica, regulando assim uma resposta imune. EXEMPLO 5: AVALIAÇÃO DA ATIVAÇÃO IMUNE NO LINFONODO E EFEITO TÓXICO NO SORO APÓS A INJEÇÃO IN VIVODO COMPLEXO AGONISTA DE RECEPTOR TOLL-LIKE 7/8-
COLESTEROL
[117] Um experimento in vivo foi realizado para confirmar um efeito /n vivo do complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-colesterol. Mais especificamente, um lipossoma incluindo um complexo colesterol-resiquimode ou resiquimode (fármaco livre) foi injetado por via subcutânea no flanco direito de um camundongo C57BL/6 a 25 pg/100 uL. Além disso, após 1, 4 e 8 dias, um linfonodo foi separado do camundongo, seguido por criossecção. Além disso, células dendríticas e macrófagos foram marcados com um anticorpo CD205 e um anticorpo CD169, respectivamente, que foi detectado usando um microscópio fluorescente. O resultado é mostrado na Figura 16.
[118] Como mostrado na Figura 16, enquanto a ativação de células imunes em um nódulo linfático não é induzida no caso de camundongos tratados com resiquimode sozinho, foi confirmado que as células imunes são ativadas em um nódulo linfático no caso de camundongos tratados com o lipossoma que compreende o complexo colesterol resiquimode.
[119] Além disso, para confirmar o efeito de longo prazo /n vivo do complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-colesterol, um lipossoma (Lipo (Chol-R848)) incluindo o complexo colesterol-resiquimode, um lipossoma ou resiquimode (R848) foi injetado por via subcutânea no flanco direito de camundongos C57BL/6 a 25 ug/100 4L e, em seguida, os linfonodos foram obtidos de acordo com o tempo de tratamento até 15 dias. Além disso, os linfonodos obtidos foram primeiro fragmentados fisicamente com tesoura, tratados com 1 mg/mL de colagenase D, reagidos por 1 hora para a segunda lise e, em seguida, filtrados usando um filtro de 70 um, seguido pela separação das células e um sobrenadante usando uma centrífuga (490 g, 5 min). Além disso, as células obtidas foram marcadas com um anticorpo CDilc e um anticorpo CDi1b e fixadas usando paraformaldeído a 4%. Adicionalmente, a análise foi realizada usando um citômetro de fluxo BD FACS Canto II. Além disso, o sobrenadante separado foi analisado por ELISA para medir a quantidade de citocina IL-12. O resultado é mostrado na Figura 17A.
[120] Como mostrado na Figura 17A, enquanto a ativação de células imunes não foi induzida em camundongos tratados com um lipossoma ou resiquimode sozinho, foi confirmado que no grupo experimental tratado com nanopartículas incluindo um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8—colesterol da presente invenção, não apenas o número de células imunes em um nódulo linfático aumentou gradualmente, como as células imunes foram efetivamente ativadas, liberando assim uma citocina de forma estável por um longo tempo.
[121] Além disso, para confirmar a toxicidade /n vivo, um lipossoma (Lipo (Chol-R848)) contendo o complexo colesterol|-resiquimode, um lipossoma ou resiquimode (R848) foi injetado por via subcutânea no flanco direito de um camundongo C57BL/6 a 25 pg/100 uL, e o peso corporal do camundongo foi medido e o sangue foi coletado da veia orbital em cada ponto de tempo. Além disso, o sangue coletado foi centrifugado (4 ºC, 13.000 rpm, min) para separar o soro e as células sanguíneas, e a quantidade de citocina foi medida por ELISA usando o soro. O resultado é mostrado na Figura 17B.
[122] Como mostrado na Figura 17B, no grupo experimental tratado apenas com resiquimode, houve um aumento rápido de citocina no soro em um estágio inicial induzindo uma tempestade de citocinas, alterando assim dramaticamente o peso corporal ao induzir citotoxicidade, enquanto que no caso de uma nanopartícula compreendendo um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-colesterol da presente invenção, não houve alteração na quantidade de citocina e a perda de peso corporal não foi observada, confirmando a ausência de toxicidade in vivo. EXEMPLO 6: VERIFICAÇÃO DO EFEITO ANTICÂNCER DO COMPLEXO AGONISTA DE
RECEPTOR TOLL-LIKE 7/8-COLESTEROL
6.1. VERIFICAÇÃO DO EFEITO ANTICÂNCER DO COMPLEXO AGONISTA DE RECEPTOR TOLL-LIKE 7/8-COLESTEROL E ANTÍGENO DO CÂNCER
[123] Para confirmar que o complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-colesterol exibe um efeito anticâncer, foi realizado um experimento usando uma linhagem de células de melanoma B16-OVA e um antígeno de ovalbumina (OVA). Mais especificamente, 5 x 10º células de uma linhagem de células B16-OVA foram injetadas por via subcutânea no flanco direito de um camundongo C57BL/6, e foi definido como sendo o dia O o momento em que o tamanho do tumor atingiu aproximadamente 50 mm?; cada um dos tratamentos com solução salina tamponada com fosfato (controle), antígeno OVA (OVA), resiquimode + antígeno OVA (R848 + OVA) e nanolipossoma compreendendo um complexo colesterol- resiquimode + antígeno OVA (Lipo (Chol-R848) + OVA) foi administrado aos camundongos por meio de injeção intratumoral no dia 0, 3, 6 e 9. 10 ug do antígeno OVA foram administrados, 25 ug de resiquimode foram administrados e 25 ug (com base no resiquimode) do nanolipossoma incluindo um complexo colesterol-resiquimode foram administrados. Além disso, a taxa de sobrevida dos camundongos e o tamanho do câncer foram medidos. O resultado é mostrado na Figura 18.
[124] Conforme mostrado na Figura 18, no grupo experimental que recebeu apenas o antígeno OVA, como o controle injetado com solução salina tamponada com fosfato, o tamanho do câncer aumentou dramaticamente e não houve camundongo sobrevivendo três semanas ou mais, e no grupo experimental injetado com resiquimode e um antígeno OVA foi confirmado que a taxa de aumento no tamanho do câncer foi reduzida em comparação com o controle, mas o tamanho do câncer ainda aumentou. No entanto, foi confirmado que no grupo experimental injetado com a nanopartícula compreendendo o complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-—colesterol da presente invenção o câncer dificilmente cresce, e mesmo após 60 dias, uma taxa de sobrevida de aproximadamente 60% ou mais é exibida.
[125] Além disso, para confirmar um efeito sobre as células imunes, da mesma maneira que acima, cada um dos tratamentos com PBS, antígeno OVA e nanolipossoma (lipossoma), resiquimode e um antígeno OVA (R848) e um nanolipossoma compreendendo um complexo colesterol-resiquimode e um antígeno OVA (Lipo (Chol-R848)) foi administrado nos dias O,
3, 6 e 9 por meio de injeção intratumoral, e 7 dias após a administração do tratamento final o tecido tumoral e um baço foram excisados de um camundongo. Além disso, o tecido tumoral obtido foi fragmentado principalmente com tesouras, e o tecido fragmentado foi tratado com 1 mg/mL de colagenase tipo I e reagiu a 37 ºC por 1 hora para se separar em células únicas. Além disso, as células separadas foram filtradas usando uma peneira de 70 pm e lavadas com solução salina tamponada com fosfato. O baço obtido foi fragmentado principalmente com uma tesoura, tratado com um tampão de lise de glóbulos vermelhos e reagido a 37 ºC durante 10 minutos para lisar os glóbulos vermelhos. Além disso, as células foram filtradas em uma peneira de 70 um e lavadas com solução salina tamponada com fosfato. As células tumorais lavadas e as células do baço foram marcadas com anticorpos. As células T foram marcadas com anticorpo anti-CD4 e anticorpo anti-CD8, macrófagos tipo 2 (macrófagos M2) foram marcados com anticorpo anti-CDilb e anticorpo anti-CD206, células supressoras derivadas de mieloide (MDSCs) foram marcadas com anticorpo anti- CD11b e anticorpo anti-Gr1 e células assassinas naturais (células VK) foram marcadas com anticorpo anti-NK1.1. Além disso, essas células foram analisadas usando um citômetro de fluxo de fluorescência. Os resultados são mostrados nas Figuras 19 e 20.
[126] Como mostrado nas Figuras 19 e 20, no grupo experimental injetado com a nanopartícula incluindo um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-—colesterol foi demonstrado que o número de células T CD4*, células T CD8* e células NK, que exibem um efeito anticâncer no tecido tumoral, aumentam significativamente, enquanto que o número de macrófagos M2 e células MDSC, que têm uma função imunossupressora, é significativamente reduzido.
6.2. VERIFICAÇÃO DO EFEITO ANTICÂNCER CAUSADO PELA COADMINISTRAÇÃO DO COMPLEXO AGONISTA DE RECEPTOR TOLL-LIKE 7/8-COLESTEROL E DO INIBIDOR DO
PONTO DE CONTROLE IMUNOLÓGICO
[127] Para confirmar um efeito anticâncer pelo cotratamento com um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-—colesterol e um inibidor do ponto de controle imunológico, foi realizado um experimento com uma linhagem de células de melanoma B16-OVA, uma linha de células de câncer de pulmão TC-1 e uma linhagem de células de câncer de mama 4T1. Mais especificamente, 5 x 10º células da linhagem de células B16-OVA, linhagem de células
TC-1 ou linhagem de células 4T1 foram injetadas subcutaneamente no flanco direito de um camundongo C57BL/6, e foi definido como sendo o dia O o momento em que o tamanho do tumor atingiu aproximadamente 50 mm?, os tratamentos que incluíram solução salina tamponada com fosfato (PBS); anti-PD-1 e um antígeno de câncer (a-PD-1); anti-PD-L1 e um antígeno de câncer (a-PD-L1); um nanolipossoma compreendendo um complexo colesterol-resiquimode e um antígeno do câncer (Lipo (Chol-R848)); um nanolipossoma compreendendo um complexo colesterol|-resiquimode, anti-PD-1 e um antígeno do câncer (Lipo (Chol-R848) + a-PD-1); e um nanolipossoma compreendendo um complexo colesterol- resiquimode, anti-PD-L1 e um antígeno do câncer (Lipo (Chol-R848) + a-PD-L1) foram administrados nos dias 0, 3, 6 e 9. Anti-PD- 1 e anti-PD-L1, que são inibidores do ponto de verificação imune, foram injetados intraperitonealmente a 100 ug/100 uL no dia 0, 3e6,e os outros foram administrados por meio de injeção intratumoral da mesma maneira que no Exemplo 5.1. Como antígeno do câncer, um antígeno OVA foi usado para um modelo animal B16-OVA, um antígeno baseado em peptídeo foi usado para o modelo animal TC-1 e um lisado de células tumorais foi usado como antígeno para o modelo animal 4T1. Além disso, a taxa de sobrevida dos camundongos e o tamanho do câncer foram medidos. Os resultados são mostrados nas Figuras 21 a 23.
[128] Como mostrado na Figura 21, no caso do modelo animal B16-OVA, foi confirmado que o crescimento do tumor é consideravelmente inibido, e 6 ou 7 camundongos sem tumor entre 10 camundongos são observados no grupo experimental coadministrado com inibidor do ponto de controle imunológico, indicando um alto efeito anticâncer.
[129] Como mostrado na Figura 22, no caso do modelo animal TC1, também foi confirmado que o crescimento do tumor é consideravelmente inibido e uma taxa de sobrevida é aumentada no grupo experimental ao qual foi coadministrado um inibidor do ponto de verificação imunológico. Além disso, foi confirmado que a metástase para os pulmões também foi inibida.
[130] Como mostrado na Figura 23, no caso do modelo animal 4T1, também foi confirmado que o crescimento do tumor é inibido e uma taxa de sobrevida é aumentada no grupo experimental ao qual foi coadministrado um inibidor do ponto de verificação imunológico.
6.3. VERIFICAÇÃO DO EFEITO ANTICÂNCER PELA COADMINISTRAÇÃO DO COMPLEXO
AGONISTA DE RECEPTOR TOLL-LIKE 7/8-COLESTEROL E UM AGENTE QUIMIOTERÁPICO
[131] Para confirmar um efeito anticâncer pela coadministração de um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-colesterol e um agente quimioterápico, um modelo animal 4T1 foi preparado usando o mesmo método do Exemplo 6.2, e doxorrubicina ou paclitaxel como agente quimioterápico e um nanolipossoma compreendendo um complexo colesterol- resiquimode foram coadministrados. Além disso, após duas semanas, o tamanho do câncer foi medido. O resultado é mostrado na Figura 24.
[132] Como mostrado na Figura 24, em comparação ao grupo ao qual foi administrado um agente quimioterápico isolado, foi confirmado que no caso da coadministração o crescimento do câncer não apenas foi inibido de maneira efetiva como o número de camundongos sem tumor também aumentou.
[133] A partir dos resultados acima, uma vez que o complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-colesterol pode ser impedido de penetrar no sangue, os efeitos colaterais do agonista de receptor Toll-like 7/8 convencional podem ser consideravelmente reduzidos sem exibir citotoxicidade, e foi confirmado que não apenas a eficácia de entrega intracelular aumenta, mas o grau de atividade imunológica também aumenta devido à separação eficaz do colesterol em comparação ao uso do agonista de receptor Toll-like 7/8 sozinho. Além disso, uma vez que o complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-colesterol é baseado no colesterol, ele pode ser facilmente preparado na forma de uma nanoemulsão, nanolipossoma ou nanomicela e, portanto, espera-se que o agonista de receptor Toll-like 7/8 possa não apenas ser amplamente utilizado como um agente terapêutico de ativação imune, como também possa aumentar uma resposta imune ao antígeno quando usado como um adjuvante em combinação com um antígeno. Além disso, o complexo agonista de receptor Toll-like 7/8-colesterol da presente invenção induz a ativação imune de células apresentadoras de antígeno (células dendríticas ou macrófagos), células NK e células T, e regula a função de células imunes que possuem uma ação imunossupressora (células T regulatórias (Tregs), células supressoras derivadas de mieloides (MDSCs) ou macrófagos M2) em um microambiente tumoral e, portanto, espera-se que possam ser usadas como uma composição para o tratamento anticâncer de vários tipos de cânceres. Além disso, especialmente, uma vez que um efeito anticâncer pode aumentar consideravelmente devido a um efeito sinérgico pela coadministração com materiais para o tratamento anticâncer, como um inibidor do ponto de controle imunológico e um agente quimioterápico, o complexo agonista de receptor Toll-like 7/8—colesterol também pode ser usado em coadministração com vários agentes terapêuticos anticâncer.
[134] Deve ser entendido pelos versados na técnica que a descrição acima da presente invenção é exemplar, e os exemplos de realização divulgados no presente documento podem ser facilmente modificados em outras formas específicas sem se afastar do espírito técnico ou características essenciais da presente invenção. Portanto, os exemplos de realização descritos acima devem ser interpretados como ilustrativos e não limitantes da presente invenção em qualquer aspecto.
APLICABILIDADE INDUSTRIAL
[135] Um complexo agonista de receptor Toll-like 7/8—colesterol da presente invenção está inativado quando administrado no corpo, mas é ativado quando separado do colesterol em um microambiente tumoral e/ou sob uma condição específica nas células. Portanto, ele pode não apenas reduzir um efeito colateral, tal como uma resposta imune hipersensível não específica, como também pode ser preparado em várias formulações, pois ele é complexado com colesterol, o que também inibe a absorção em um vaso sanguíneo, inibindo assim um efeito colateral, como a tempestade de citocinas. Além disso, uma vez que o complexo agonista de receptor Toll-like 7/8—colesterol sozinho pode exibir um efeito anticâncer ao regular eficazmente as células imunes, ele também pode aumentar consideravelmente esse efeito pela coadministração com vários agentes terapêuticos contra o câncer e agentes imunoterapêuticos, assim, espera-se que o complexo agonista de receptor Toll-like 7/8- colesterol seja eficaz e amplamente aplicado ao tratamento de várias doenças às quais o agonista de receptor do Toll-like pode ser aplicado.

Claims (19)

Reivindicações
1. COMPLEXO-COLESTEROL AGONISTA DO RECEPTOR TOLL-LIKE 7/8, caracterizado por compreender: um colesterol; e um agonista do receptor Toll-like 7/8; em que o colesterol está ligado a um sítio ativo de um agonista de receptor Toll-like 7/8.
2. COMPLEXO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por à ligação ser feita de uma forma separável.
3. COMPLEXO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por à ligação separável ser feita por pelo menos uma ligação selecionada a partir do grupo que consiste em uma ligação de carbamato, dissulfeto, éster, peptídeo, azida e uma combinação das mesmas.
4. COMPLEXO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o agonista de receptor Toll-like 7/8 incluir pelo menos um agonista selecionado a partir do grupo que consiste em um agonista à base de imidazoquinolina, um agonista à base de hidroxiadenina, um agonista à base de pteridona, um agonista à base de aminopirimidina, um agonista à base de benzoazepina, um agonista à base de tia-oxoguanosina e um derivado destes.
5. COMPLEXO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por à ligação ser clivada em resposta a um microambiente tumoral, enzimas endossomais e lisossomais, ou pelo pH nas células, e o sítio ativo do agonista de receptor Toll-like 7/8 ser exposto de modo que uma função cinética é recuperada em 4 dias.
6. COMPOSIÇÃO DE NANOPARTÍCULA, caracterizada por compreender um complexo-colesterol agonista do receptor Toll-like 7/8 conforme definido na reivindicação 1.
7. COMPOSIÇÃO DE NANOPARTÍCULA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por a ligação separável ser feita por pelo menos uma ligação selecionada a partir do grupo que consiste em uma ligação de carbamato, dissulfeto, éster, peptídeo, azida e uma combinação das mesmas.
8. COMPOSIÇÃO DE NANOPARTÍCULA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por o agonista de receptor Toll-like 7/8 incluir pelo menos um agonista selecionado a partir do grupo que consiste em um agonista à base de imidazoquinolina, um agonista à base de hidroxiadenina, um agonista à base de pteridona, um agonista à base de aminopirimidina, um agonista à base de benzoazepina, um agonista à base de tia- oxoguanosina e um derivado destes.
9. COMPOSIÇÃO DE NANOPARTÍCULA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por a nanopartícula incluir pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em um nanolipossoma, uma nanoemulsão, uma nanomicela, uma nanopartícula sólida e uma nanopartícula de polímero.
10. “COMPOSIÇÃO ADJUVANTE, caracterizada por compreender o complexo conforme definido na reivindicação 1 como um ingrediente ativo.
11. COMPOSIÇÃO DE VACINA, caracterizada por compreender a composição adjuvante conforme definida na reivindicação 10 e um antígeno.
12. COMPOSIÇÃO DE VACINA, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por o antígeno incluir um ou mais antígenos selecionados a partir do grupo que consiste em uma proteína, uma proteína recombinante, uma glicoproteína, um gene, um peptídeo, um polissacarídeo, um lipopolissacarídeo, um polinucleotídeo, uma célula, um lisado de células, uma bactéria e um vírus.
13. — COMPOSIÇÃO PARA REGULAR UMA FUNÇÃO IMUNOLÓGICA, caracterizada por compreender o complexo conforme definido na reivindicação 1 como um ingrediente ativo.
14. — COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por ativar pelo menos um tipo de células imunes selecionadas a partir do grupo que consiste em células apresentadoras de antígeno, células assassinas naturais (células NK) e células T.
15. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por regular a função de um ou mais tipos de células imunes selecionadas a partir do grupo que consiste em células T reguladoras (Tregs), células supressoras derivadas de mieloides (MDSCs) e macrófagos M2.
16. “COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada por ser para prevenção ou tratamento do câncer, compreendendo o complexo conforme definido na reivindicação 1 como um ingrediente ativo.
17. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por compreender ainda um agente quimioterápico ou um inibidor do ponto de controle imunológico.
18. — COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por inibir a proliferação, a metástase, a recorrência do câncer ou a resistência à terapia anticâncer.
19. USO do complexo conforme definido na reivindicação 1, caracterizado por ser para a produção de um medicamento para tratar câncer.
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