KR20220017377A - 동력학적 제어가 가능한 아주번트를 포함하는 mRNA 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역활성화 기능이 동력학적으로 제어되는 아주번트를 포함하는 mRNA 백신에 관한 것으로, 보다 자세하게는, mRNA가 단백질로 전사가 일어난 후에 순차적으로 아주번트의 활성화 기능이 작용하는 것을 특징으로 하는 아주번트를 포함하는 mRNA 백신에 관한 것이다. 본 발명에서는 서로 상반되는 항원의 발현(expression)과 항원의 면역원성(immunogenicity)을 효과적으로 조절하기 위하여 mRNA 항원의 발현과 면역활성화 시점의 시간 간격(time interval)을 최적화 하는 핵심기술에 관한 것이다. 본 발명에서는, mRNA의 항원 발현량과 아주번트의 작용시간을 최적화하기 위하여, 면역활성화 물질의 작용을 동력학적으로 제어함으로써, 항원의 발현량과 면역원성을 동시에 높임으로써, mRNA 백신의 효능을 현저하게 증가시키는 핵심기술을 제공한다.

Description

동력학적 제어가 가능한 아주번트를 포함하는 mRNA 백신{mRNA vaccine containing dynamic immunomodulatory adjuvants}

본 발명은 면역활성화 기능이 동력학적으로 제어되는 아주번트를 포함하는 mRNA 백신에 관한 것으로, 보다 자세하게는, mRNA가 단백질로 전사가 일어난 후에 순차적으로 아주번트의 활성화 기능이 작용하는 것을 특징으로 하는 mRNA 백신에 관한 것이다.

mRNA 백신은 mRNA를 항원(antigen)으로 하여 암, 감염성 질환, 자가면역 질환 등의 예방 및 치료에 사용되는 의약품이다. mRNA 백신은 DNA 백신과 비교하여, 안정하며 대량생산이 용이하다는 장점이 있어 향후 항암 백신과 팬더믹 상황에서의 감염성 질환 백신 플랫폼으로 널리 활용이 기대되고 있다. 하지만, 근본적으로 naked mRNA가 가지고 있는 톨-유사 수용체 작용자(toll-like receptor agonist; TLR agonist) 등과 같은 아주번트(adjuvant)의 자극을 유도하는 면역활성화 성질은, 반대로 mRNA의 전사(translation) 신호전달 체계를 방해하기 때문에, 약학적 활성을 나타낼 만큼 충분한 양의 mRNA 항원이 발현되는 것을 저해하는 것으로 알려져 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 면역원성이 제거된, 또는 약화시킨 modified mRNA를 이용하여, 백신을 제조하려는 시도가 활발하게 진행 중이다. 하지만, 이 경우에는 mRNA의 낮은 면역원성(immunogenicity) 때문에 효과적인 체액성 면역 및/또는 세포성 면역반응을 유도하는 데 한계가 있다. 따라서 서로 상반되는 작용을 하는 항원의 발현(expression) 기작과 항원의 면역원성(immunogenicity)을 나타내난 기작을 효과적으로 조절함으로, 최상의 효과를 나타낼 수 있는 신규한 시스템의 mRNA 백신의 개발이 매우 중요하다.

한편, 면역반응은 활성화된 면역세포가 외래성 및 내인성 물질, 즉, 항원에 대하여 일으키는 일련의 반응으로서, 세균, 바이러스 등을 포함하는 미생물, 생체의 이물질 등이 생체 내로 유입되게 되면, 면역세포가 이를 인식하고 활성화되어, 사이토카인 등의 인자를 분비하여 염증 반응을 유발한다. 최근에는 감염 초기에 비특이적으로 작용하는 선천성 면역반응 단계에서의 기작에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 이 중 톨-유사 수용체는 염증 초기의 병원체를 인식할 수 있는 수용체로서, 병원체의 원형질막 구성물, 핵산 구성물 등을 인식하여 면역반응을 유도하는 것으로 알려져 있으며, 이를 이용하여, 면역 세포를 활성화시키기 위한 다양한 톨-유사 수용체 리간드(ligand)들에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

톨-유사 수용체 작용자는 엔도좀 내의 톨-유사 수용체의 작용자로써 체액성 면역뿐만 아니라, 세포성 면역 또한 효과적으로 유도하는 것으로 알려져 있다. 그러나 이러한 다기능성 톨-유사 수용체 작용자는 그 분자 구조로 인하여 수용액에 분산되는데 어려움이 있다. 또한, DMSO, 메탄올 등과 같은 특수 유기용매에만 용해되고, 일반적으로 사용되고 있는 유기 용제에는 용해되지 않기 때문에 다양한 제형의 면역 활성화 약제를 제조하는데 한계점을 가지고 있다. 따라서 다양한 계면활성제를 혼합한 크림 형태의 제형(예, Aldara　cream 등)으로 상용화되고 있다. 일부 연구에서는, 이러한 문제점을 극복하기 위하여 염(salt)의 형태로 제조하여 수용액에 용해시킬 수 있도록 하였으나, 염의 형태로 제조된 톨-유사 수용체 작용자는 체내에서 혈관으로 흡수되어, 혈관 내의 면역반응(systemic immune response)을 유도함으로써, 많은 부작용(예, 사이토카인 폭풍(cytokine storm), 여러가지 비특이적 과민 면역반응 등)을 유발하기 때문에, 사용이 용이하지 않은 실정이다. 또한, 이러한 부작용 문제로 인하여, 실질적으로 치료에 사용하기 위해서는 유효량(effective dose)보다 적은 농도를 처리해야 하기 때문에, 효능 저하의 요인이 되기도 한다. 일부 제약기업에서는 이러한 문제점을 극복하기 위하여 친유성 특성을 보이는 지질을 도입하거나, 거대한 크기를 갖는 고분자 사슬에 직접 화학적으로 결합시킴으로써 혈관으로 직접 흡수되는 것을 방지하기 위한 시도도 진행되고 있다. 하지만, 이러한 방법에 의해 제조된 톨-유사 수용체 작용자는 그 활성부위가 여전히 외부로 노출되어 있기 때문에, 체내에서 비특이적 면역 반응을 유도함으로써, 독성을 유발할 수 있는 가능성을 여전히 가지고 있다.

따라서, 동력학적으로 활성화 시점이 제어되는 톨-유사 수용체 작용자와 mRNA를 포함하는 mRNA 백신이 개발된다면, 투여 후 초기에는 mRNA 항원의 면역원성 작용이 억제되고, 대신 정상적으로 mRNA 항원의 발현이 유도되고, 이후 순차적으로 동력학적으로 활성화 시점이 제어되는 톨-유사 수용체 작용자가 활성화 상태로 전환됨에 따라 mRNA의 면역활성화 유도됨으로써, 작용 기작의 시간 간격(time interval)을 최적화할 수 있기 때문에, 차세대 mRNA 백신 시장에서 매우 큰 파급효과를 가져올 것으로 기대된다.

대한민국공개특허 10-2020-0118386

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 동력학적으로 활성화 시점이 제어되는 아주번트 및 mRNA를 유효성분으로 포함하는 mRNA 백신용 조성물로서, mRNA가 사이토졸로 이동하여 전사가 일어난 후에, 아주번트가 엔도좀/라이소좀 및 사이토졸 내에서 면역활성화 부위에 결합하여 면역활성화를 유도함으로써, 항원의 발현량을 높이면서도, 면역활성화를 통한 항원의 면역원성을 동시에 높일 수 있는 mRNA 백신 조성물 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 mRNA 항원, 및 동력학적 제어(kinetically control)가 가능한 면역활성화 물질을 유효성분으로 포함하는, mRNA 백신용 조성물로서, 상기 면역활성화 물질은 면역활성화 물질의 활성화 부위(active site)에 절단 가능한 링커(cleavable linker)가 결합되어 있는 결합체인 mRNA 백신용 조성물을 제공한다. 상기 mRNA 항원은 mRNA 백신에 사용되는 것으로 알려져 있는 mRNA 항원이라면 제한이 없다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 mRNA 백신용 조성물은 투여 후 mRNA가 단백질로 전사되는 과정이 진행된 후에, 순차적으로 면역활성화 물질의 활성화 부위에 결합되어 있는 절단 가능한 링커가 절단되어 면역활성화 물질의 활성화 기능이 유도되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 동력학적 제어는 면역활성화 물질의 활성화 부위에 절단 가능한 링커가 결합되어 있어 비활성화(inactive) 상태가 유지되다가, mRNA의 전사가 시작된 후 바람직하게는 2 내지 12 시간 이내에, 더욱 바람직하게는 3 내지 9 시간 이내에 활성화 부위를 블로킹하고 있던 절단 가능한 링커가 절단되어 면역활성화 물질의 활성이 시간적으로 지연되어 나타나는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 동력학적 제어는 분자스케일(molecular scale) 및/또는 거시스케일(macro scale)에서 작용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 절단 가능한 링커는 바람직하게는 다이설파이드(disulfide), 카바메이트(carbamate), 하이드라진(hydrazine), 에스터(ester), 펩타이드(peptide), 아자이드(azide), 아마이드(amide), 하이드라존(hydrazone), 티오이써(thioether), 포스포디에스터(phosphodiester), 티오케탈(thioketal) 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 결합을 포함하고 있는 것을 특징으로 한다. 그러나 생체의 내인성 요인(효소, Redox potential, GSH, pH 등) 및/또는 외인성 요인(redox, pH, temperature, photo/light, magnetic, ultrasound, electrical responsive 등)에 의하여 결합이 절단될 수 있는 형태라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 절단 가능한 링커는 양측 말단 또는 일측 말단에 에틸렌옥사이드(ethylene oxide) 또는 에틸렌글라이콜(ethylene glycol) 등의 알킬유도체를 추가로 포함함으로써, 결합체의 수용액에서의 용해도 및 유연성을 높이는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 절단 가능한 링커는 효소, pH, 산화 환원 전위(redox potential), 온도, 초음파, 자성, 및 광원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 요인에 의하여 결합 부위의 화학적 결합이 절단되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 절단 가능한 링커의 말단에는 콜레스테롤, 지질, 단백질, 아미노산, 펩타이드 및 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 물질이 결합되어 있는 것을 특징을 하며, 상기 물질은 톨-유사 수용체 작용자의 활성화 부분을 블록킹하는 역할로서, 친수 또는 친유 그룹을 가지고 있는 다양한 물질일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 면역활성화 물질은 바람직하게는 톨-유사 수용체 작용자(toll-like receptor agonist)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 톨-유사 수용체 1 작용자, 톨-유사 수용체 2 작용자, 톨-유사 수용체 3 작용자, 톨-유사 수용체 4 작용자, 톨-유사 수용체 5 작용자, 톨-유사 수용체 6 작용자, 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자, 및 톨-유사 수용체 9 작용자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 mRNA 항원과 동력학적 제어가 가능한 면역활성화 물질은 나노리포좀, 나노에멀젼, 나노마이셀, 하이드로겔, 스캐폴드, 고형 나노입자 및 고분자 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 약물 전달체에 로딩되어 있는 것을 특징으로 한다. 상기 로딩은 결합과 관계없이 단순히 내포되어 있는 형태일 수 있으며, 또는 나노 입자 구조 사이에 끼어 들어가 있는 형태이거나, 결합되어 있는 형태일 수도 있으나, 본 발명의 mRNA 항원과 면역활성화 물질을 포함하고 있는 형태라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 약물 전달체는 내부에 로딩된 mRNA 항원이 사이토졸로 먼저 전달된 이후에, 동력학적으로 작용하는 면역활성화 물질이 세포 표면, 엔도좀 또는 라이소좀 내의 수용체(receptor)와의 상호작용이 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 약물 전달체에는 바람직하게는 톨-유사 수용체 작용자, 사포닌, 항바이러스성 펩티드, 인플라머좀 인듀서(inflammasome inducer), NOD 리간드(NOD ligand), CDS 리간드(cytosolic DNA sensor ligand), STING(stimulator of interferon genes) 리간드, 병원균의 외벽성분, 알룸(alum), 리피드(lipids), 이들의 조합 및 이들의 유사체(derivative)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 면역활성화 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 면역활성화 물질은 아주번트로 사용되고 있는 면역활성화 물질이라면 제한이 없다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 mRNA 백신용 조성물은 감염성 질환(infectious disease), 암(cancer), 대사증후군(metabolic syndrome), 자가면역질환(autoimmune disease) 및 희귀질환(rare disease)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 질환의 예방 또는 치료 용도로 사용되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 mRNA 항원, 및 동력학적 제어(kinetically control)가 가능한 면역활성화 물질을 유효성분으로 포함하는 mRNA 백신용 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 감염성 질환(infectious disease), 암(cancer), 대사증후군(metabolic syndrome), 자가면역질환(autoimmune disease) 또는 희귀질환(rare disease)의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 mRNA 항원, 및 동력학적 제어(kinetically control)가 가능한 면역활성화 물질을 유효성분으로 포함하는 mRNA 백신용 조성물의 감염성 질환(infectious disease), 암(cancer), 대사증후군(metabolic syndrome), 자가면역질환(autoimmune disease) 또는 희귀질환(rare disease)의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 mRNA 항원, 및 동력학적 제어(kinetically control)가 가능한 면역활성화 물질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 감염성 질환(infectious disease), 암(cancer), 대사증후군(metabolic syndrome), 자가면역질환(autoimmune disease) 또는 희귀질환(rare disease)의 예방 또는 치료에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 mRNA 백신용 조성물은 mRNA가 사이토졸로 이동하여 전사가 일어난 후에, 엔도좀/라이소좀 및 사이토졸 내에서 면역활성화 부위에 결합하여 면역활성화를 유도함으로써, 항원의 발현량을 높이면서도, 면역활성화를 통하여 항원의 면역원성을 동시에 높일 수 있는 기술로서 다양한 mRNA 백신의 예방 및/또는 치료 효과를 현저히 향상시킬 수 있기 때문에 다양한 mRNA 백신에 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 미성숙 상태 항원제시세포 단계에서 mRNA 항원이 사이토졸(cytosol)로 이동하여 전사(translation)가 이루어진 후에, 동력학적 기능을 보이는 아주번트가 엔도좀/라이소좀 또는 사이토졸 내의 면역활성화 부위와의 상호작용이 순차적으로 일어남으로써, mRNA 백신의 항원 발현과 면역원성을 동시에 향상시킬 수 있는 새로운 아이디어에 대한 개념도이다.
도 2는 서로 상반되는 항원의 발현(expression)과 항원의 면역원성(immunogenicity)을 효과적으로 조절함으로써, 최적의 성질을 갖는 mRNA 백신을 개발하기 위한 본 발명의 차별화된 전략을 나타내며, 이를 위하여 mRNA 항원의 발현과 면역활성화 시점의 시간 간격(time interval)을 최적화하는 것이 중요함을 나타내는 도면이다.
도 3은 톨-유사 수용체 작용자(agonist)의 활성화 그룹(critical moiety), 즉, 활성화 부위(active site)를 일시적으로 비활성화시키기 위하여, 활성화 부위에 친수 또는 친유 그룹을 가지는 물질을 결합시켜 블로킹(blocking)하고, 그 결합부위는 분리 가능한 링커로 연결시킴으로써 동력학적 거동이 조절될 수 있음을 나타내는 것으로, mRNA 백신에서의 동력학적 면역기능 제어를 위한 톨-유사 수용체 작용자 기반 아주번트의 개념도를 나타내는 도면이다.
도 4는 약물전달체에 의한 동력학적 제어 개념을 나타낸 것으로, mRNA 항원이 사이토졸로 먼저 전달된 이후에, 면역활성화 물질이 순차적으로 엔도좀/라이소좀 및 사이토졸에 방출되도록 설계된 것을 나타내며, 약물전달체는 나노리포좀, 나노에멀젼, 나노마이셀, 하이드로겔, 스캐폴드, 고형 나노입자, 고분자 나노입자 등으로 제조될 수 있음을 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 BMDC에 mRNA와 R848을 처리하였을 때의 항원 제시 정도를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 BMDC에 mRNA와 R848을 처리하였을 때의 세포 표면 분자를 측정하여 세포 활성화 정도를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 BMDC에 mRNA와 R848을 처리하였을 때의 염증성 사이토카인의 분비를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 BMDC에 mRNA와 LPS를 처리하였을 때의 항원 제시 정도를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 BMDC에 mRNA와 Poly I:C를 처리하였을 때의 항원 제시 정도를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 BMDC에 mRNA와 Poly I:C를 처리하였을 때의 사이토카인인 1형 인터페론의 분비를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 T 세포와 BMDC의 공동 배양에 mRNA와 Poly I:C를 처리하였을 때의 활성화 정도를 IFN-γ+ T 세포의 양, 분비된 IFN-γ의 양, 그리고 IL-2의 양으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 BMDC에 mRNA, Poly I:C, 및 R848을 처리하였을 때의 항원 제시 정도와 사이토카인인 1형 인터페론의 분비를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 T 세포와 BMDC의 공동 배양에 mRNA, Poly I:C, 및 R848을 처리하였을 때의 활성화 정도를 IFN-γ+ T 세포의 양, 분비된 IFN-γ의 양, 그리고 IL-2의 양으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 BMDC에 mRNA, LPS, 및 R848을 처리하였을 때의 항원 제시 정도와 세포 활성화 정도를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 BMDC에 mRNA, LPS, 및 R848을 처리하였을 때의 Th1으로의 분화 정도를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 BMDC에 eGFP modified-mRNA, LPS, 및 R848을 처리하였을 때의 mRNA와 type 1 IFN간의 상관관계를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 pDC에 mRNA과 R848, 또는 mRNA와 SKKU-078-liposome을 처리하였을 때의 항원 제시 정도를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 pDC에 mRNA, 또는 mRNA와 SKKU-078-liposome을 처리하였을 때의 세포 활성화 정도를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 T 세포와 pDC의 공동 배양에 mRNA와 SKKU-078-liposome을 처리하였을 때의 T 세포의 표현형을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 T 세포와 pDC의 공동 배양에 mRNA와 SKKU-078-liposome을 처리하였을 때의 T 세포의 이중 표현형과 IFN-γ 사이토카인의 분비량을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명자들은 mRNA 항원의 발현 시점과 아주번트의 면역활성화 시점이 최적화된 병용 투여 방식으로 mRNA 백신의 효과를 현저히 향상시킬 수 있는 시스템에 대하여 예의 연구한 결과, 면역활성화 물질인 아주번트의 활성화 부위에 절단 가능한 링커를 연결하여 일시적으로 활성이 저해된 상태로 유지되다가, 체내 투여 후 목표로 하는 조직, 또는 세포에 도달한 후에 mRNA 항원이 단백질로 전사되기 시작되고 2 내지 12 시간 이내에 절단 가능한 링커가 절단되어 아주번트의 활성이 나타나는 동력학적 제어가 가능한 면역활성화 물질을 mRNA 항원과 함께 사용함으로써, mRNA 항원의 발현 시점과 면역활성화 시점의 시간 간격을 최적화한 효능이 현저히 증가된 mRNA 백신용 조성물을 발명하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 mRNA 백신은 mRNA 항원이 사이토졸(cytosol)로 이동하여 전사가 이루어진 후에, 엔도좀/라이소좀 또는 사이토졸 내의 면역활성화 부위와의 상호작용이 이루어지는 시스템이다. 이와 같은 시스템은 naked mRNA가 가지고 있는 근본적인 한계점인 체내에 투여된 후에 톨-유사 수용체의 자극을 유도하는 면역활성화 작용이 활성화되어, mRNA 항원의 전사 신호전달 체계가 방해되어 백신으로서 작용하기 위한 충분한 양의 mRNA 항원의 발현이 저해되기 때문에 효능이 약화되는 문제점을 해결하기 위한 시스템이다(도 2). 기존에 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 면역원성을 약화시킨 modified mRNA를 이용하고자 하는 시도들이 있었으나, 결론적으로는 낮은 면역원성으로 인하여 정상적인 체액성 면역 및/또는 세포성 면역 반응을 유도하지 못하여 효능이 약화되는 문제점을 여전히 가지고 있었다. 따라서, 본 발명자들은 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 톨-유사 수용체 작용자의 활성화 부위에 절단 가능한 링커를 연결함으로써, 톨-유사 수용체 작용자를 일시적으로 비활성화 상태로 존재하다가, 엔도좀/라이소좀 또는 사이토졸 환경 내에서 절단 가능한 링커가 절단되어, 활성이 회복됨으로써 수용체와 결합함으로써, mRNA 항원의 발현과 면역활성화 시점의 시간 간격을 최적화한 새로운 개념의 mRNA 백신 시스템을 제공하였다(도 2 및 3).

본 명세서에 있어서, “mRNA 백신(mRNA vaccine)”이란 유전정보가 담긴 메신저 리보핵산(mRNA)을 항원으로 사용하는 백신을 총칭하며, 백신을 접종하면 체내에서 mRNA가 단백질을 생산하고, 인체 면역 시스템이 이를 감지하여 면역반응을 일으키어 중화항체를 생성하는 원리로 작동한다. 최근에는 감염성 질환뿐만 아니라, 암, 자가면역 질환, 대사증후군, 희귀질환 등 다양한 분야의 질환에 적용되고 있는 추세이다.

본 명세서에 있어서, “면역활성화 물질(immune modulator)”이란 면역계의 정상적인 면역 기능을 활성화시키거나, 유도하거나, 회복시키는 역할을 하는 물질을 총칭하며, 아주번트(adjuvant)로 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 상기 아주번트란 면역 반응을 향상시키기 위하여, 항원과 함께 사용되는 물질을 의미하며, 항원과 함께 사용함으로써 항체의 생성을 증가시키고, 체액성 면역 및/또는 세포성 면역을 증가시킬 수 있다. 상기 면역활성화 물질로는 바람직하게는 톨-유사 수용체 작용자(toll-like receptor agonist), 사포닌, 항바이러스성 펩티드, 인플라머좀 인듀서(inflammasome inducer), NOD 리간드(NOD ligand), CDS 리간드(cytosolic DNA sensor ligand), STING(stimulator of interferon genes) 리간드, 에멀젼(emulsion), 알룸(alum), 불완전 프로인드 보조제, 프로인드 보조제, 또는 이들의 조합들을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 톨-유사 수용체 작용자를 포함할 수 있다.

본 명세서에 있어서, “톨-유사 수용체 작용자(toll-like receptor agonist)”란 선천성 면역에 관여하는 막 단백질인 톨-유사 수용체에 직접적으로 또는 간접적으로 작용하는 리간드로서, 내인성 또는 외인성 리간드의 생성을 통해 신호전달 경로를 통한 신호전달 반응을 야기시킬 수 있는 성분을 의미하는 것일 수 있다. 본 명세서에 있어서, 톨-유사 수용체 작용자는 천연 톨-유사 수용체 작용자 또는 합성 톨-유사 수용체 작용자일 수도 있고, 톨-유사 수용체 1 작용자, 톨-유사 수용체 2 작용자, 톨-유사 수용체 3 작용자, 톨-유사 수용체 4 작용자, 톨-유사 수용체 5 작용자, 톨-유사 수용체 6 작용자, 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자, 톨-유사 수용체 9 작용자 등일 수 있다.

상기 톨-유사 수용체 1 작용자는 TLR-1을 통해 신호전달 반응을 유도할 수 있는 리간드를 의미하며, 일례로, 트리-아실화된 지질펩티드(LP); 페놀-가용성 모듈린(modulin); 코박테리움튜베르쿨로시스(Mycobacteriumtuberculosis)의 지질펩티드; S-(2,3-비스(팔미토일옥시)-(2-RS)-프로필)-N-팔미토일-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH; 보렐리아 부르그도르페이(Borrelia burgdorfei)의 지질펩티드; OspA 지질펩티드의 아세틸화된 아미노 말단을 모방하는 트리히드로클로라이드(Pam3Cys) 지질펩티드 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 톨-유사 수용체 2 작용자는 TLR-2를 통해 신호전달 반응을 유도할 수 있는 리간드를 의미하며, 일례로, 펩티도글라이칸(peptidoglycan), 자이모산(zymosan), HSP70, HMGB1, HA, bam3Cys-Lip 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 톨-유사 수용체 3 작용자는 TLR-3을 통해 신호전달 반응을 유도할 수 있는 리간드를 의미하며, 일례로, 폴리아이시 계열로서 Poly(I:C), Poly(ICLC), Poly(IC12U), ampligen 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 톨-유사 수용체 4 작용자는 TLR-4를 통해 신호전달 반응을 유도할 수 있는 리간드를 의미하며, 일례로, 시겔라 플렉시네리(Shigella flexineri)의 외막 단백질 제조물, AGP, CRX-527, MPLA, PHAD, 3D-PHAD, GLA, LPS 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 톨-유사 수용체 5 작용자는 TLR-5를 통해 신호전달 반응을 유도할 수 있는 리간드를 의미하며, 일례로, 플라겔린(Flagellin) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 톨-유사 수용체 6 작용자는 TLR-6를 통해 신호전달 반응을 유도할 수 있는 리간드를 의미하며, 일례로, 다이아실 리포펩타이드(Diacyl lipopeptide), 리포테이코익산(lipoteichoic acid) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자는 TLR-7 또는 8을 통해 신호전달 반응을 유도할 수 있는 리간드를 의미하며, 일례로, 이미다조퀴놀린 계열 작용자(imidazoquinoloine-based agonist), 하이드록시아데닌계열 작용자(8-hydroxyadenine-based agonist), 프테리돈 계열 작용자(pteridone-based agonist), 아미노피리미딘 계열 작용자(2-aminopyrimidine-based agonist), 벤조아제핀 계열 작용자(benzoazepine-based agonist), 타이아옥소구아노신 계열 작용자(7-thia-8-oxoguanosine-based agonist) 등일 수 있으며, 상기 이미다조퀴놀린 계열의 화합물은 WO 2018 196823, WO 2011 049677, WO 2011 027022, WO 2017 102652, WO 2019 040491 등에서 언급된 유형의 화합물 또는 제약상 허용 가능한 염을 포함하며, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 하이드록시아데닌 계열의 화합물은 WO 2012 080730, WO 2013 068438, WO 2019 036023, WO 2019 035969, WO 2019 035970, WO 2019 035971, WO 2019 035968, CN 108948016, US 2014 8846697, WO 2016 023511, WO 2017 133683, WO 2017 133686, WO 2017 133684, WO 2017 133687, WO 2017 076346, WO 2018 210298, WO 2018 095426, WO 2018 068593, WO 2018 078149, WO 2018 041763 등에서 언급한 유형의 화합물 또는 제약상 허용 가능한 염을 포함하며, 이에 한정되지 않는다. 상기 프테리돈 계열의 화합물은 US 2010 0143301, WO 2016 007765, WO 2016 044182, WO 2017 035230, WO 2017 219931, WO 2011 057148, CN 1087 94486 등에서 언급한 유형의 화합물 또는 제약상 허용 가능한 염을 포함하며, 이에 한정되지 않는다. 상기 아미노피리미딘 계열 화합물은 WO 2010 133885, WO 2012066335, WO 2012 066336, WO 2012 067268, WO 2013 172479, WO 2012 136834, WO 2014 053516, WO 2014 053595, US 2018 0215720, WO 2012 156498, WO 2014 076221, WO 2016 141092, WO 2018 045144, WO 2015 014815, WO 2018 233648, WO 2014 207082, WO 2014 056593, WO 2018 002319, WO 2013 117615 등에서 언급한 유형의 화합물 또는 제약상 허용 가능한 염을 포함하며, 이에 한정되지 않는다. 상기 벤조아제핀 계열 화합물은 WO 2007 024612, WO 2010 014913, WO 2010 054215, WO 2011 022508, WO 2011 022509, WO 2012 097177, WO 2012 097173, WO 2016 096778, WO 2016 142250, WO 2017 202704, WO 2017 202703, WO 2017 216054, WO 2017 046112, WO 2017 197624 등에서 언급한 유형의 화합물 또는 제약상 허용 가능한 염을 포함하며, 이에 한정되지 않는다. 상기 타이아옥소구아노신 계열 화합물은 WO 2016 180691, WO 2016 055553, WO 2016 180743, WO 2016 091698 등에서 언급한 유형의 화합물 또는 제약상 허용 가능한 염을 포함하며, 이에 한정되지 않는다. 이외에도 PCT/US2009/035563, PCT/US2015/028264, PCT/US2016/020499, WO 2015 023598, PCT/US 2015/039776 등에서 언급한 톨-유사 수용체 7 또는 8 화합물 또는 제약상 허용 가능한 염을 포함할 수 있다. 또한, 이미퀴모드(Imiquimod), 레시퀴모드(Resiquimod), 닥토리십(Dactolisib), 가디퀴모드(Gardiquimod), 수마니롤(Sumanirole), 모톨리모드 (Motolimod), 베사톨리모드(vesatolimod), 록소리바인(loxoribine), SM360320, CL264, 3M-003, IMDQ, Compound 54 등일 수 있으나, 이에 한정되지 않고, 당 업계에 종사하는 사람이 용이하게 추측하여 사용할 수 있는 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 경우를 모두 포함한다.

상기 톨-유사 수용체 9 작용자는 TLR-9를 통해 신호전달 반응을 유도할 수 있는 리간드를 의미하며, 일례로, 면역 자극성 올리고뉴클레오티드 등일 수 있으며, 상기 면역 자극성 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 CpG 모티프를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 명세서에 있어서, “사포닌(saponin)”이란 양친매성 배당체로서, 계면활성제로서 작용한다. 일례로, QS21, Quil A, QS7, QS17, β-에스킨, 디지토닌 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, “항바이러스성 펩티드(antiviral peptide)"란 항바이러스 효과를 나타내는 펩티드를 총칭하며, 일례로, 케이엘케이(KLK) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, “인플라머좀 인듀서(inflammasome inducer)”란 진핵세포의 세포질 내에서 위험신호를 인식하고 활성화하는 단백질 복합체인 염증소체(inflammasome)을 유도하는 물질들을 총칭하며, 일례로, TDB(trehalose-6,6-dibehenate) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, “NOD 리간드(NOD ligand)"란 Nod-like receptor를 활성화시키는 리간드를 총칭하며, 일례로, M-TriLYS, N-glycolylated muramyldipeptid 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, “CDS 리간드(cytosolic DNA sensor ligand)”란 DNA 센서인 cGAS를 활성화시키는 리간드를 총칭하며, 일례로, Poly(dA:dT) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, “STING 리간드(stimulator of interferon genes ligand)”란 면역세포가 암을 탐지하는데 사용하는 센서인 스팅을 활성화시키는 리간드를 총칭하며, 일례로, cGAMP, di-AMP, di-GMP 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, “콜레스테롤(cholesterol)”이란 지질(lipid)의 한 종류로 소수성 성질을 가지는 스테로이드 계열의 유기물질을 총칭하며, 상기 콜레스테롤은 콜레스테롤 구조를 기반으로 하는 다양한 유사체, 콜레스테롤의 일부를 화학적으로 변화시켜 획득할 수 있는 화합물을 모두 포함할 수 있다. 바람직하게는, bile acid(cholic acid, deoxycholic acid, lithocholic acid, chenodeoxycholic acid), Vitamine D, steroid hormones(testosteron, estradiol, cortisol, aldosteron, prednisolone, prednisone) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 콜레스테롤은 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자를 다양한 형태의 나노 입자의 표면 및 내부에 위치하게 도와주는 물질로서, 이와 유사한 기능을 하는 리피드 물질, 예를 들어, phospholipids와 같은 natureal lipid, synthetic lipid 등으로 대체될 수도 있으며, 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 활성화 부위에 결합하여 비활성화 상태로 만드는 동시에, 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자가 체내에서 혈관으로 흡수되지 않게 하는 용도이기 때문에, 알려져 있는 지질의 종류라면 제한이 없다.

본 명세서에 있어서, “절단 가능한 링커(cleavable linker)”란 절단 가능한 결합을 포함하고 있어, 종양미세환경, 세포 내의 엔도좀 및 라이소좀의 생리학적 환경 등 체내의 low pH, 효소, 글루타치온 등의 조건; 또는 외부의 자극, 즉, 온도, redox potential, ultrasound, magnetic filed, near-infrared light 등의 특정 자극에 의하여 절단이 일어날 수 있는 링커를 총칭하며, 바람직하게는 카바메이트(carbamate), 다이설파이드(disulfide), 에스터(ester), 펩타이드(peptide), 아자이드(azide) 등의 결합을 포함하고 있는 링커를 의미하나, 절단 가능한 형태라면 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, "예방(prevention)"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 감염성 질환, 암, 대사증후군, 자가면역질환, 희귀질환 등의 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에 있어서, "치료(treatment)"란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 감염성 질환, 암, 대사증후군, 자가면역질환, 희귀질환 등의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에 있어서, "개체(individual 또는 subject)"란 본 발명의 조성물이 투여될 수 있는 대상을 말하며, 그 대상에는 제한이 없다.

본 명세서에 있어서, “감염성 질환(infectious disease)”이란 바이러스, 세균, 진균 등 이종의 생명체에 의한 감염으로 인하여 유도된 질병을 총칭한다.

본 명세서에 있어서, "암(cancer)"이란 침윤에 의해 국부적으로 그리고 전이를 통해 체계적으로 확장할 수 있는 각종 혈액암, 악성 고형 종양 등을 총칭한다. 특별히 이에 제한되지는 않지만, 암의 구체적인 예로는 대장암, 부신암, 골암, 뇌암, 유방암, 기관지암, 결장암 및/또는 직장암, 담낭암, 위장관암, 두부 및 목의 암, 신장암, 후두암, 간암, 폐암, 신경조직암, 췌장암, 전립선암, 부갑상선암, 피부암, 위암, 갑상선암 등이 포함된다. 암의 다른 예로는, 선암, 선종, 기저 세포암, 자궁경부 이형성증 및 상피 내암, Ewing 육종, 편평세포암종, 액선 세포암, 악성 뇌종양, 모세포암, 장의 신경절신경종, 과다형성 각막신경암, 섬세포암, Kaposi 암, 평활근종, 백혈병, 림프종, 악성 암양종, 악성 흑색종, 악성 고칼슘혈증, Marpanoidhabitus 암, 수양암, 전이성 피부암, 점막 신경종, 골수이형성 증훈군, 골수종, 사상식육종, 신경아세포종, 골육종, 골원성 및 기타 육종, 난소암, 크롬 친화성 세포종, 진성 적혈구 증가증, 원발성 뇌종양, 소세포성 폐암, 궤양성 및 유두상 편평상피암, 정낭피종, 연조직 육종, 망막아종, 횡문근아세포종, 신세포 종양 또는 신세포암(renal cell carcinoma, RCC), 망상세포성 육종, 및 빌름스 종양이 포함된다. 또한 성상 세포종, 위장 기저 종양(gastrointestinal stromal tumor, GIST), 신경교종 또는 신경교아종, 간세포암(hepatocellular carcinoma, HCC), 췌장 신경내분비암 등이 포함된다.

본 명세서에 있어서, “대사증후군(metabolic syndrome)”이란 심장질환, 당뇨병, 뇌졸중을 비롯하여 건강 문제의 위험성을 증가시키는 5가지 위험요소들(고혈압, 고혈당, 고중성지방 혈증, 낮은 고밀도지단백 콜레스테롤, 및 중심비만) 중 3가지 이상을 한 개인이 가지고 있는 것을 의미하며, 일례로, 비만, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 심장병, 통풍 등의 대사성 질환(metabolic disease)을 포함하나, 대사증후군으로 인하여 발병되는 모든 질환을 총칭한다.

본 명세서에 있어서, “자가면역질환(autoimmune disease)"이란 자가 항원에 대한 병적 반응에 의한 질환을 총칭하며, 전신홍반성낭창(systemic lupus erythematosus; SLE), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis; RA), 다발성 경화증(multiple sclerosis; MS) 등과 같은 전신성 자가면역질환, 인슐린 의존성 당뇨(insulin-dependent diabetes mellitus; IDDM), 그레이브스 병(grave’s disease), 알레르기(allergy) 등이 포함된다.

본 명세서에 있어서, “희귀질환(rare disease)”이란 인구 중 적은 비중에만 영향을 미치는 모든 질환을 통칭하며, 일반적으로 유전성을 가지고 있으며, 질환의 발병률이나 유병률이 매우 낮아 진단이 어렵고, 제대로 된 치료법이 없는 경우를 의미한다. 나라마다 정의가 조금씩 다르지만, 우리나라는 희귀질환 관리법 제2조에 의거해 “희귀질환이란 유병인구가 2만 이하이거나 진단이 어려워 유병인구를 알 수 없는 질환으로 보건복지부령으로 정한 절차와 기준에 따라 정한 질환을 말한다”라고 정의하고 있다. WHO(세계보건기구)는 유병률이 인구 1,000명당 약 0.65-1명 이하인 경우로, 미국은 전체 환자 수가 20만 명 미만인 경우로, 유럽(EU)은 10,000명당 5명 이하인 경우로 희귀질환을 지정하고 있다.

본 명세서에 있어서, "약학적 조성물(pharmaceutical composition)" 또는 "백신 조성물(vaccine composition)"이란 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물 또는 백신 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 약학적 조성물 또는 백신 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물 또는 백신 조성물은 약제적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물 또는 백신 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물 또는 백신 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물 또는 백신 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물 또는 백신 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학적 조성물 또는 백신 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 500 mg/kg 또는 0.001 내지 500 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학 조성물 또는 백신 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 백신 조성물은 추가로 기존에 알려져 있는 “면역항원보강제(adjuvant)”를 추가로 포함할 수 있다. 상기 면역항원보강제는 일반적으로 항원에 대한 체액 및/또는 세포 면역 반응을 증가시키는 임의의 물질을 총칭하며, 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다. 또한 상기 백신 조성물의 경우에는 필요에 따라 초기 용량에 이어 임의로 반복된 항원 자극을 수행할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체의 합성

콜레스테롤이 결합(conjugation)된 다양한 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자(이미다조퀴놀린 계열 작용자(imidazoquinoloine-based agonist), 하이드록시아데닌계열 작용자(8-hydroxyadenine-based agonist), 프테리돈 계열 작용자(pteridone-based agonist), 아미노피리미딘 계열 작용자(2-aminopyrimidine-based agonist), 벤조아제핀 계열 작용자(benzoazepine-based agonist), 타이아옥소구아노신 계열 작용자(7-thia-8-oxoguanosine-based agonist) 등)는 하기 반응식 1 또는 2의 화학 반응을 통하여 제조되었다. 보다 자세하게는, 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 활성화 부위인 아민기(NH₂) 부위에 절단 가능한 결합(cleavable bond)인 카바메이트(carbamate), 다이설파이드(disulfide), 에스터(ester), 펩타이드(peptide), 또는 아자이드(azide) 결합을 통해 콜레스테롤(Sigma-Aldrich)을 결합시켜, 활성화 부위가 일시적으로 비활성화된 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자와 콜레스테롤의 결합체(Toll-like receptor 7/8 agonist-Cholesterol conjugate)를 제조하였다.

[반응식 1]

상기 R은 aliphatic 또는 aromatic 그룹을 포함하는 곁가지이며, -NH-、-CO-、-CONH-、-CSNH-、-COO-、-CSO-、-SO₂NH-、-SO₂-, -SO-, -O- 등을 포함할 수 있다.

[반응식 2]

상기 R은 aliphatic 또는 aromatic 그룹을 포함하는 곁가지 이며, -NH-、-CO-、-CONH-、-CSNH-、-COO-、-CSO-、-SO₂NH-、-SO₂-, -SO-, -O- 등을 포함할 수 있다.

실시예 2 : 2-메틸-1-(3-니트로퀴놀린-4-일아미노)프로판-2-올의 합성

하기 반응식 3의 방법을 이용하여 2-메틸-1-(3-니트로퀴놀린-4-일아미노)프로판-2-올(화합물 2)을 합성하였다. 보다 자세하게는, 10 내지 20℃에서 화합물 1(30g)이 첨가된 디클로로메탄(450ml)에 1-아미노-2-메틸프로판-2-올(14g) 및 테트라에틸아민(9.6g)을 첨가하고, 2시간 동안 교반시켜 혼합물을 제조하였다. 그리고 진공상태에서 용매를 증발시켜 혼합물을 농축시킨 후에, 메틸터트-부틸에테르(150ml)를 이용하여 저작하였다. 저작된 혼합물은 필터를 이용하여 분리한 후 저압 상태에서 농축시켜 화합물 2(32g, 85.2%, 황색 고체)를 획득하였다. 획득된 화합물 2의 구조는 ¹H NMR을 이용하여 검증하였다.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9.91 (brs, 1H), 9.18 (s, 1H)), 8.46 (d, J = 8.0Hz, 1H), 7.83-7.92 (m, 2H), 7.56-7.60 (m, 1H), 5.15 (s, 1H), 3.86 (d, J = 4.8Hz, 2H), 1.15 (s, 6H).

[반응식 3]

실시예 3: 1-(3-아미노퀴놀린-4-일아미노)-2-메틸프로판-2-올의 합성

하기 반응식 4의 방법을 이용하여 1-(3-아미노퀴놀린-4-일아미노)-2-메틸프로판-2-올(화합물 3)을 합성하였다. 보다 자세하게는, 10 내지 20℃의 리액터에 화합물 2(32g), 메탄올(500ml), 그리고 Pd/C 촉매(3.2g)를 혼합한 후, 혼합물은 수소를 이용하여 3회 디게싱(degassing) 및 플러싱(flushing)하였다. 수소는 기체화되어 1 atm을 유지하게 한 후 실온에서 5시간 동안 교반시켰다. 이후 혼합물은 메틸터트-부틸에테르(100ml)를 이용하여 저작하였다. 저작된 혼합물은 필터를 이용하여 분리한 후 저압 상태에서 농축시켜 화합물 3(27g, 95.4%, 황색 고체)을 획득하였다. 획득된 화합물 3의 구조는 ¹H NMR을 이용하여 검증하였다.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.37 (s, 1H)), 7.99-8.01 (m, 1H), 7.72-7.74 (m, 1H), 7.32-7.39 (m, 2H), 5.04 (s, 2H), 4.77 (brs, 1H), 4.67-4.70 (m, 1H), 4.12 (brs, 2H), 1.15 (s, 6H).

[반응식 4]

실시예 4: 1-(2-에톡시메틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)-2-메틸프로판-2-올의 합성

하기 반응식 5의 방법을 이용하여 1-(2-에톡시메틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)-2-메틸프로판-2-올(화합물 4)을 합성하였다. 보다 자세하게는, 10 내지 20℃의 리액터에 화합물 3(27g) 및 2-에톡시아세트산(30ml)을 첨가한 후, 5시간 동안 120 내지 130℃에서 5시간 동안 교반시켰다. 이후 혼합물을 20 내지 25℃로 냉각시키고, 포화된 탄산나트륨(150ml)을 첨가하였다. 그리고 디클로로메탄과 메탄올(10/1, v/v)의 혼합용액을 이용하여 반응물을 추출하였다. 추출된 유기용액 층을 염수(brine)로 세척한 후 황산나트륨(10g)을 이용하여 수분을 제거하였다. 그리고 수분이 제거된 유기용액 층은 필터를 이용하여 필터링한 후 저압 상태에서 농축시켜 화합물 4(30g, 85.8%, 황색 겔)를 획득하였다. 획득된 화합물 4의 구조는 ¹H NMR을 이용하여 검증하였다.

¹HNMR (DMSO_d6 400 MHz): δ 9.18 (s, 1H)), 8.63 (d, J = 8.0Hz, 1H), 8.13 (dd, J = 1.6, 8.0Hz, 1H), 7.63-7.71 (m, 2H), 4.91 (s, 2H), 4.78 (brs, 2H), 3.54 (q, J = 6.8Hz, 2H), 1.10-1.18 (m, 9H).

[반응식 5]

실시예 5: 2-(에톡시메틸)-1-(2-하이드록시-2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린 5-옥사이드의 합성

하기 반응식 6의 방법을 이용하여 2-(에톡시메틸)-1-(2-하이드록시-2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린 5-옥사이드(화합물 5)를 합성하였다. 보다 자세하게는, 10 내지 20℃의 리액터에 화합물 4(30g), 디클로로메탄(350ml), 및 메타클로로퍼옥시 벤조산(26g)을 첨가한 후 실온에서 4시간 동안 교반시켰다. 그리고 교반된 혼합물에 포화된 탄산나트륨 용액(150ml) 과 황산나트륨 용액(150ml)을 첨가한 후, 디클로로메탄과 메탄올(10/1, v/v)의 혼합용액을 이용하여 반응물을 추출하였다. 추출된 유기용액 층의 수분은 황산나트륨(30g)을 이용하여 제거한 후 필터를 이용하여 필터링한 후 저압 상태에서 농축시켰다. 이후 농축시킨 반응물을 에틸 아세테이트(50ml)를 이용하여 저작하고, 필터를 이용하여 분리한 후 저압 상태에서 건조시켜 화합물 5(30g, 94.9%, 황색 고체)를 획득하였다. 획득된 화합물 5의 구조는 ¹H NMR을 이용하여 검증하였다.

¹HNMR (DMSO_d6 400 MHz): δ 9.04 (s, 1H)), 8.79 (d, J = 8.4Hz, 1H), 8.71 (d, J = 8.4Hz, 1H), 7.77-7.80 (m, 2H), 4.93 (s, 2H), 4.73 (brs, 2H), 3.54 (q, J = 6.8Hz, 2H), 1.12-1.18 (m, 9H).

[반응식 6]

실시예 6: 1-(4-아미노-2-에톡시메틸)-1H-이미다조[4.5-c]퀴놀린-1-일)-2-메틸프로판-2-올의 합성

하기 반응식 7의 방법을 이용하여 1-(4-아미노-2-에톡시메틸)-1H-이미다조[4.5-c]퀴놀린-1-일)-2-메틸프로판-2-올(화합물 6)을 합성하였다. 보다 자세하게는, 10 내지 20℃의 리액터에 화합물 5(30g), DCM(600ml), 4-메틸벤젠-1-술포닐 클로라이드(18.2g), 및 암모니아수(NH₃.H₂O, 180ml)를 첨가한 후 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 그리고 교반된 혼합물에 증류수를 첨가한 후, 디클로로메탄과 메탄올(10/1, v/v)의 혼합용액을 이용하여 혼합물을 분리하였다. 분리된 유기용액 층은 염수(brine)를 이용하여 세척한 후 무수 황산나트륨(50g)을 이용하여 수분을 제거하였다. 수분이 제거된 유기용액 층은 필터를 이용하여 필터링한 후 저압 상태에서 농축시키고, 농축시킨 반응물을 메틸터트-부틸에테르와 메탄올(15/1, v/v)의 혼합용액을 이용하여 30분간 저작하였다. 이후 필터를 이용하여 분리한 후 저압상태에서 건조시켜 화합물 6(18g, 60%, 황색 고체)을 획득하였다. 획득된 화합물 6의 구조는 ¹H NMR을 이용하여 검증하였다.

¹HNMR (DMSO_d6 400 MHz): δ 8.27 (d, J = 8.0Hz, 1H), 7.59 (d, J = 7.6Hz, 1H), 7.40 (t, J = 7.2Hz, 1H), 7.21 (t, J = 7.2Hz, 1H), 6.57 (brs, 2H), 4.89 (s, 2H), 4.68 (brs, 2H), 3.52 (q, J = 6.8Hz, 2H), 1.11-1.17 (m, 9H).

[반응식 7]

실시예 7: 10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로[a]페난트렌-3-일 2-(에톡시메틸)-1-(2-하이드록시-2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-일 카바메이트의 합성

하기 반응식 8의 방법을 이용하여 10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로[a]페난트렌-3-일 2-(에톡시메틸)-1-(2-하이드록시-2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-일 카바메이트(화합물 8)를 합성하였다. 우선, 화합물 7(TCI, 50g, Cholesterol chloroformate)을 250g의 실리카 겔이 충진된 컬럼 크로마토그래피(0%~20% 아세트산에틸 in n-헥산)를 이용하여 순수한 화합물 7(30g)을 획득하였다. 그리고 10 내지 20℃의 리액터에 화합물 화합물 6(15g)과 디클로로메탄(198.9g)을 첨가한 후, 순수한 화합물 7(30g)과 테트라에틸아민(9.6g)을 순서대로 첨가하고, 20 내지 25℃에서 16시간 동안 교반시켰다. 교반된 혼합물에 물을 첨가한 후, 디클로로메탄을 첨가하여 반응물을 추출하였다. 추출된 유기용액 층은 염수를 이용하여 세척한 후 무수 황산나트륨(195g)을 이용하여 수분을 제거하였다. 수분이 제거된 유기용액 층은 필터를 이용하여 필터링한 후, 저압 상태에서 농축시켰다. 그리고 농축시킨 반응물은 메틸터트-부틸에테르와 메탄올(10/1, v/v)의 혼합용액을 이용하여 저작하였다. 이후 필터를 이용하여 분리한 후 저압상태에서 건조시켜 화합물 8(10.2g, 55.1%, 백색 고체)을 획득하였다. 획득된 화합물 8의 구조는 ¹H NMR을 이용하여 검증하였다. ¹H NMR 결과를 통하여, 레시퀴모드(resiquimod; R848)와 콜레스테롤이 카바메이트 결합으로 연결된 결합체가 제조된 것을 확인하였다.

¹H NMR (CDCl₃ 400 MHz): δ 8.13-8.19 (m, 2H), 7.59-7.63 (m, 1H)), 7.46-7.50 (m, 1H), 5.42-5.43 (m, 1H), 4.92 (brs, 2H), 4.72-4.80 (m, 3H), 3.68 (q, J = 6.8Hz, 2H), 3.24 (s, 1H), 2.51-2.59 (m, 1H), 2.36-2.47 (m, 1H), 1.96-2.11 (m, 3H), 1.81-1.95 (m, 2H), 1.45-1.75 (m, 9H), 1.02-1.35 (m, 27H), 0.94 (d, J = 6.4Hz, 3H), 0.89 (d, J = 6.4Hz, 6H), 0.71 (s, 3H).

[반응식 8]

실시예 8: 비스(2,5-디옥소피로리딘-1-일) 2,2‘-디설페인디일비스(에테인-2,1-디일) 디카보네이트의 합성

하기 반응식 9의 방법을 이용하여 비스(2,5-디옥소피로리딘-1-일) 2,2‘-디설페인디일비스(에테인-2,1-디일) 디카보네이트(화합물 9)를 합성하였다. 우선, 화합물 7(TCI, 70g)을 350g의 실리카 겔이 충진된 컬럼 크로마토그래피(0%~20% 아세트산에틸 in n-헥산)를 이용하여 순수한 화합물 7(40g)을 획득하였다. 그리고 10 내지 15℃의 리액터에 순수한 화합물 7(40g) 및 디클로로메탄(100ml)을 첨가한 후, 비스(2-하이드록시에틸) 디설파이드가 첨가되어 있는 디클로로메탄(250ml) 용액과 피리딘(21g)을 순서대로 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반시킨 후 증류수(200ml)를 첨가하였다. 이어서 디클로로메탄(150ml)을 3회 첨가하여 반응물을 추출하였다. 추출된 유기용액 층은 염수를 이용하여 세척한 후 무수 황산나트륨(20g)을 이용하여 수분을 제거하였다. 수분이 제거된 반응물은 필터를 이용하여 필터링한 후, 저압 상태에서 농축시켰다. 이후 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔, 300g, 10%~30% 아세트산에틸 in n-헥산)를 이용하여 화합물 9(20g, 39.6%, 황색 겔)를 획득하였다. 획득된 화합물 9의 구조는 ¹H NMR을 이용하여 검증하였다.

¹HNMR (CDCl₃ 400 MHz): δ 5.41-5.42 (m, 1H), 4.46-4.56 (m, 1H), 4.41 (t, J = 6.8Hz, 2H), 3.91 (t, J = 6.0Hz, 2H), 2.98 (t, J = 6.8Hz, 2H), 2.91 (t, J = 6.0Hz, 2H), 2.35-2.47 (m, 2H), 1.79-2.08 (m, 6H), 1.43-1.73 (m, 7H), 1.25-1.42 (m, 5H), 1.06-1.22 (m, 7H), 0.97-1.03 (m, 5H), 0.93 (d, J = 6.4Hz, 3H), 0.88 (dd, J = 1.6, 6.8Hz, 6H), 0.69 (s, 3H).

[반응식 9]

실시예 9: 화합물 10의 합성

하기 반응식 10의 방법을 이용하여 화합물 10을 합성하였다. 보다 자세하게는, 10 내지 15℃의 리액터에 화합물 9(20g)와 디클로로메탄(200ml)을 첨가한 후, 비스(2,5-디옥소피로리딘-1-일) 카보네이트(18g)와 테트라에틸아민(10.7g)을 순서대로 첨가하였다. 혼합물은 3시간 동안 실온에서 교반시킨 후 증류수(300ml)를 첨가하고, 이어서 디클로로메탄(150ml)을 3회 첨가하여 반응물을 추출하였다. 추출된 유기용액 층은 염수를 이용하여 세척한 후 무수 황산나트륨(20g)을 이용하여 수분을 제거하였다. 수분이 제거된 반응물은 필터를 이용하여 필터링한 후, 여과물을 저압 상태에서 농축시켰다. 이후 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔, 200g, 5%~20% 아세트산에틸 in n-헥산)를 이용하여 화합물 10(18g, 72%, 황색 겔)을 획득하였다. 획득된 화합물 10의 구조는 ¹H NMR을 이용하여 검증하였다.

¹HNMR (CDCl₃ 400 MHz): δ 5.39-5.40 (m, 1H), 4.57 (t, J = 6.8Hz, 2H), 4.43-4.52 (m, 1H), 4.37 (t, J = 6.4Hz, 2H), 2.96-3.03 (m, 4H), 2.84 (s, 4H), 2.34-2.44 (m, 2H), 1.78-2.04 (m, 5H), 1.42-1.73 (m, 7H), 1.22-1.40 (m, 5H), 1.06-1.20 (m, 7H), 0.95-1.04 (m, 5H), 0.91 (d, J = 6.0Hz, 3H), 0.86 (d, J = 6.4Hz, 6H), 0.67 (s, 3H).

[반응식 10]

실시예 10: 2-((2-((10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 -테트라데카하이드로-1H-사이클로[a]페난트렌-3-일옥시)카보닐옥시)에틸)디설바닐)에틸 2-(에톡시메틸)-1-(2-하이드록시-2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-일 카바메이트의 합성

하기 반응식 11의 방법을 이용하여 2-((2-((10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 -테트라데카하이드로-1H-사이클로[a]페난트렌-3-일옥시)카보닐옥시)에틸)디설바닐)에틸 2-(에톡시메틸)-1-(2-하이드록시-2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-일 카바메이트(화합물 11)을 합성하였다. 보다 자세하게는, 10 내지 20℃의 리액터에 화합물 6(15g)과 디클로로메탄(198.9g)을 첨가한 후, 화합물 10(40.5g)과 테트라에틸아민(9.6g)을 순서대로 첨가하였다. 혼합물은 20 내지 25℃에서 16시간 동안 교반시킨 후, 증류수(225ml)를 첨가하였다. 이어서 디클로로메탄(99.45g)을 5회 첨가하여 반응물을 추출하였다. 추출된 유기용액 층은 염수를 이용하여 세척한 후 무수 황산나트륨(195g)을 이용하여 수분을 제거하였다. 그리고 수분이 제거된 반응물은 필터를 이용하여 필터링한 후 여과물을 저압 상태에서 농축시켰다. 이후 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔, 100g, 10%~50% 아세트산에틸 in n-헥산)를 이용하여 화합물 11(10.8g, 37.4%, 백색 고체)을 획득하였다. 획득된 화합물 11의 구조는 ¹H NMR을 이용하여 검증하였다. ¹H NMR 결과를 통하여, R848과 콜레스테롤이 다이설파이드로 교차결합된 결합체가 제조되었다는 것을 확인하였다.

¹H NMR (CDCl₃ 400 MHz): δ 8.15-8.17 (m, 2H), 7.60-7.64 (m, 1H)), 7.47-7.51 (m, 1H), 5.39-5.40 (m, 1H), 4.93 (s, 2H), 4.81 (s, 2H), 4.56 (t, J = 6.4Hz, 2H), 4.45-4.54 (m, 1H), 4.41 (t, J = 6.4Hz, 2H), 3.68 (q, J = 6.8Hz, 2H), 3.13 (s, 1H), 3.09 (t, J = 6.4Hz, 2H), 3.01 (t, J = 6.4Hz, 2H), 2.34-2.47 (m, 2H), 1.92-2.06 (m, 3H), 1.79-1.90 (m, 2H), 1.23-1.72 (m, 21H), 1.06-1.21 (m, 7H), 0.96-1.05 (m, 5H), 0.93 (d, J = 6.4Hz, 3H), 0.88 (dd, J = 1.6, 6.4Hz, 6H) , 0.69 (s, 3H).

[반응식 11]

실시예 11: 콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체를 포함하는 나노 입자의 제조

콜레스테롤-톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 결합체는 콜레스테롤을 포함하고 있기 때문에, 다양한 나노 입자 형태로 용이하게 제조될 수 있으며, 이를 통하여 면역세포와의 상호작용을 극대화할 수 있다.

11.1. 콜레스테롤이 결합된 레시퀴모드를 포함하는 나노리포좀 제조

콜레스테롤이 결합된 레시퀴모드를 포함하는 음이온성 나노리포좀(nanoliposome)을 제조하기 위하여, 1ml의 클로로포름에 4mg의 DOPC(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, Avanti), 1.2mg의 콜레스테롤이 결합된 레시퀴모드, 및 1mg의 DPPG(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), Avanti)를 첨가한 후 용해시켜 혼합물을 제조하고, 상기 혼합물을 회전식 증발기를 이용하여 용매를 증발시켜 얇은 필름 형태를 제조하고, 얇은 필름에 2ml의 인산염완충용액을 첨가하고 45℃에서 30 분간 교반시키고, 팁 초음파 분해기(amplitude: 20%, 2분)를 이용하여 균질화 단계를 거쳐 콜레스테롤이 결합된 레시퀴모드를 포함하는 음이온성 나노리포좀을 제조하였다. 콜레스테롤이 결합된 레시퀴모드를 포함하는 양이온성 나노리포좀을 제조하기 위하여, 1ml의 클로로포름에 4mg의 DOPC, 1.2mg의 콜레스레롤이 결합된 레시퀴모드, 및 2mg의 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(DDAB; Dimethyldioctadecylammonium bromide)를 첨가한 후 용해시켜 혼합물을 제조하고, 상기 혼합물을 회전식 증발기를 이용하여 용매를 증발시켜 얇은 필름 형태를 제조하고, 얇은 필름에 2ml의 인산염완충용액을 첨가하고 45℃에서 30분간 교반시키고, 팁 초음파 분해기(amplitude: 20%, 2분)를 이용하여 균질화 단계를 거쳐 콜레스테롤이 결합된 레시퀴모드를 포함하는 양이온성 나노리포좀을 제조하였다.

11.2. 콜레스테롤이 결합된 레시퀴모드를 포함하는 나노에멀젼 제조

콜레스테롤이 결합된 레시퀴모드를 포함하는 나노에멀젼(nanoemulsion)을 제조하기 위하여, 1ml의 클로로포름에 1mg의 DOPC, 240μg의 콜레스테롤(Sigma-Aldrich), 240μg의 콜레스테롤이 결합된 레시퀴모드를 첨가한 후 용해시켜 혼합물을 제조하였다. 그리고 상기 혼합물을 둥근 바닥 플라스크로 옮겨 담은 후에 회전농축기(rotary evaporator)를 이용하여 클로로포름을 완전히 증발시켜 얇은 지질막(thin-film) 형태를 제조하였다. 그리고 인산염완충용액 2ml에 Squalene(5%v/v), Tween 80(0.5%v/v), 및 Span 85(0.5%v/v)를 첨가하여 용해시킨 후에, 상기 용액을 지질막 위에 첨가하고 초음파 분산기(Tip sonicator)를 이용하여서 1분 동안 분산시키고, 회전기(tube revolve)를 이용하여 2시간 정도 교반시켜, 콜레스테롤이 결합된 레시퀴모드를 포함하는 나노에멀젼을 제조한 후에 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다.

11.3. 콜레스테롤이 결합된 레시퀴모드 및 사포닌으로 구성된 나노마이셀 제조

콜레스테롤이 결합된 레시퀴모드 및 사포닌으로 구성되는 나노마이셀(nanomicelle)을 제조하기 위하여, 포스패티딜콜린 : 사포닌 : 콜레스테롤이 결합된 레시퀴모드를 5 : 3 : 2의 무게 비율로 혼합한 후에 14mg/ml의 농도가 되도록 에테르에 첨가하고 용해시켜 지질을 포함하는 에테르 용액을 제조하였다. 그리고 사포닌은 1.5mg/ml의 농도로 4ml의 증류수에 용해시킨 후에 20ml의 유리병에 담고 고무마개로 유리병을 막은 후에 55℃의 워터 재킷에 보관하였다. 그리고 1ml의 지질을 포함하는 에테르 용액을 주사기 펌프를 이용하여 0.2ml/min의 속도로 사포닌이 담겨있는 유리병에 첨가하며 2시간 동안 교반시켰다. 이 때, 주사기 바늘의 끝은 사포닌을 포함하는 수용액의 표면보다 아래에 위치하게 하였고, 환기를 위하여 두 번째 바늘은 고무마개에 꽂아두었다. 그리고 상온으로 유리병을 옮기고 3일 동안 교반시켜 안정화시키는 단계를 거쳐 콜레스테롤이 결합된 레시퀴모드 및 사포닌으로 구성된 나노마이셀을 제조하였다.

11.4. 콜레스테롤이 결합된 레시퀴모드로 구성된 고분자 나노입자제조

Lactide와 glycolide 조성비가 50 : 50인 PLGA 고분자(Eudragit) 60mg을 1ml의 Chloroform 용매에 녹여준다. 5mg의 콜레스테롤이 결합된 레시퀴모드를 용매에 첨가하고, 초음파 세척기(ultrasonic bath, Emerson Model CPX5800H-E)를 이용하여 콜레스테롤-레시퀴모드 결합체와 고분자를 용해시켰다. 그리고 2.5% PVA 수용액 10ml에 상기 용해시킨 용액을 200μl씩 첨가해주며, 초음파 분산기(Tip sonicator, Sonics&Materials Model VCX 750)를 이용하여 1분간 분산시켰다. 이때, 분산기의 출력은 750watt이고, 진동강도는 20kHz이며, Amplitude는 20%로 설정하였다. 그리고 PLGA가 용해된 유기용매를 완전히 증발시키기 위하여 제조된 수용액을 600rpm으로 실온에서 8시간 이상 교반하였다. 반응하지 않은 고분자와 콜레스테롤-레시퀴모드 결합체를 제거하기 위해 원심분리기(Centrifuge, Hanil, Combi-514R)를 이용하여 12,000rpm, 12분의 조건으로 원심분리를 실시하였으며, 상층액은 제거한 후 초순수 10ml을 첨가하고, 초음파 분산기에 30초간 분산시켰다. 상기 과정을 3회 반복한 후, 동결건조 방법을 사용하여 건조 시킨 후 -20℃에서 보관하였다.

실시예 12: mRNA 및 콜레스테롤-톨-유사 수용체 작용자를 포함하는 mRNA 백신용 조성물의 효능 확인

12.1. mRNA 백신용 조성물의 처리 방법

본 발명의 mRNA 백신용 조성물의 효능을 확인하기 위하여, mRNA 백신으로 많이 사용되고 있는 OVA mRNA를 사용하여 실험을 진행하였다. 보다 자세하게는, 우선 CleanCap^® OVA mRNA(5moU, L-7210, TriLink Biotechnologies)와 Opti-MEM™(Reduced Serum Medium, ThermoFisher Scientific)을 1:49의 부피 비율로 혼합하고, 전달체로는 Lipofectamine(Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent, ThermoFisher Scientific)과 Opti-MEM™을 2:23의 부피 비율로 혼합한 후에, 각각의 혼합물을 1:1의 부피 비율로 다시 혼합하고, 5분 동안 반응시켜 mRNA 조성물을 준비하였다. 톨-유사 수용체 작용자로는 톨-유사 수용체 3 작용자인 Polyinosinic-polycytidylic acid(poly I:C, Sigma-Aldrich), 톨-유사 수용체 4 작용자인 Lipopolysaccharide(LPS, Sigma-Aldrich), 그리고 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자인 레시퀴모드(Biorbyt)를 이용하였다. Poly I:C는 인산염완충용액(phosphate buffered saline; PBS)에 0.8mg/ml의 농도로 분산시켜 사용하였고, LPS는 PBS에 0.3μg/ml의 농도로 분산시켜 사용하였고, R848은 일차적으로 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 20mg/ml의 농도로 용해시킨 후, 용해된 용액을 다시 PBS를 이용하여 20μg/ml의 농도가 되도록 분산시켜 사용하였다. 단일 톨-유사 수용체 작용자를 처리하는 경우에는 각각 Poly I:C는 40μg/ml, LPS는 30ng/ml, R848은 1μg/ml의 농도로 처리하였으며, 혼합하여 사용하는 경우에는 Poly I:C 2μg/ml과 R848 1μg/ml의 농도, 또는 LPS 2ng/ml과 R848 1μg/ml의 농도로 진행하였으며, mRNA는 모두 1μg/ml의 농도로 처리하였다.

12.2. 골수 유래 수지상세포, 형질세포양 수지상세포, Ovalbumin 특이적 TCR 보유 실험용 쥐의 비장세포 배양

본 발명의 mRNA 백신용 조성물의 효능을 확인하기 위하여, 실험용 세포로는 골수 유래 수지상세포(Bone Marrow-derived Dendritic Cell; BMDC), 형질세포양 수지상세포(plasmacytoid dendritic cell; pDC), 그리고 Ovalbumin 특이적 TCR 보유 실험용 쥐(OT-I transgenic mouse; OT-I mouse)의 비장에서 분리된 T 세포를 이용하였다. BMDC와 pDC는 실험용 쥐인 C57BL/6(female, Orient Bio)의 골수에서 획득하여 사용하였다. 보다 자세하게는, 6주령의 쥐를 안락사시키고, 대퇴골과 경골을 절단한 후, 배지를 흘려보내 내부의 물질을 추출하였다. 그리고 추출된 물질들에 적혈구 용해액(Red Blood Cell lysis buffer, BioLegend)을 처리하여 적혈구를 제거한 후에 사용하였다. pDC는 6주령의 C57BL/6를 안락사시킨 후에, 대퇴골과 경골을 절단하고 배지를 흘려보내 내부의 물질을 추출하였다. 그리고 추출된 물질들에 적혈구 용해액(Red Blood Cell lysis buffer, BioLegend)을 처리하여 적혈구를 제거한 후에, pDC isolation kit(Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit, mouse, MACS Miltenyi Biotec)를 사용하여 pDC만을 분리하여 실험에 사용하였다. 비장세포는 OT-I 실험용 쥐에서 비장을 추출하여 물리적으로 분쇄하여 단일 세포로 만들어준 후에, PBS를 이용하여 세척하고, 적혈구 용해액을 이용하여 적혈구를 제거한 후에 사용하였다. 그리고 획득된 세포들은 100mmX25mm의 배양 접시(Corning petri dish)에 2X10⁶ cells가 되도록 분주하고, 5% CO₂, 37℃의 조건에서 배양하였다. 배양 배지로는 20ng/ml의 GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, Recombinant Mouse GM-CSF Protein, R&D Systems)가 첨가된 complete RPMI 1640 medium(Gibco)을 사용하였다. 배양 기간 동안은 3일 간격으로 새로운 배지를 교체해주었으며, 배양 7일차의 세포를 실험에 사용하였다.

12.3. OT-I 쥐의 비장세포와 pDC의 공동 배양

본 발명의 mRNA 백신용 조성물의 효능을 확인하기 위하여, OT-1 쥐의 비장에서 분리된 T 세포와 pDC를 공동배양하였다. 실시예 12.2와 동일한 방법으로 획득한 비장세포(1X10⁵cells/100μL)와 pDC(1X10⁴cells/100μL)를 96-웰 플레이트에 분주한 후에, 실시예 12.1과 동일한 방법으로 준비한 mRNA 백신용 조성물을 처리하고, 48시간 이후에 세포 및 사이토카인의 분석을 실시하였다. 세포내 사이토카인의 분석은 세포를 수집하기 전에 세포에 cell activation cocktail(BioLgend)과 protein transport inhibitor(BD GolgiStop™ Protein Transport Inhibitor)를 처리해 세포 골지체 내의 사이토카인의 분비를 활성화 시킨 후에, 세포를 수집하여 측정하였다. 수집된 세포는 Fixation/Permeabilization kit(BD Cytofix/Cytoperm™ Plus)를 이용하여 세포막과 세포 내에 구멍을 뚫어 antibody가 부착될 수 있도록 작업한 후에 IFN-γ antibody(PE Rat Anti-Mouse IFN-γ; PE-IFN-γ, BioLegend)를 이용하여 세포 내에 분비된 IFN-γ의 양을 측정하였다.

12.4. OT-I 쥐의 비장세포와 BMDC의 공동 배양

본 발명의 mRNA 백신용 조성물의 효능을 확인하기 위하여, OT-1 쥐의 비장에서 분리된 T 세포와 BMDC를 공동배양하였다. BMDC의 경우 ex vivo DC therapy(cell therapy)의 형태로 진행하기 위하여, 비장세포와 공동 배양하기 전에 먼저 실시예 12.1과 동일한 방법으로 준비한 mRNA 백신용 조성물을 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 그리고 24시간 동안 배양된 BMDC(1X10⁴cells/100μL)와 T 세포(1X10⁵cells/100μL)를 96-웰 플레이트에 분주한 후에, 48시간 이후에 세포 및 사이토카인의 분석을 실시하였다. 사이토카인의 분석은 실시예 12.3과 동일한 방법으로 실시하였으며, BMDC의 세포 활성화 정도 측정을 위해서는, 세포 표면 분자 80(Cluster of Differentiation 80; CD80), CD86, CD40의 평균 형광 강도(Mean Fluorescence Intensity; MFI)를 형광 항체(antibody)를 부착하여 확인하였다. CD80의 측정은 PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD80 Antibody(PerCP/Cy5.5-CD80, BioLegend)를 이용하였고, CD86은 PE anti-mouse CD86 Antibody(PE-CD86, BioLegend)를 이용하였고, CD40은 FITC anti-mouse CD40 Antibody(FITC-CD40, BioLegend)를 이용하여 확인하였다. BMDC의 경우에는 먼저 산란광(Forward Scatter and Side Scatter; FSC and SSC)을 조절하여 단일 세포로 분리한 후에 CD11c 항체(APC anti-mouse CD11c Antibody(APC-CD11c, BD Bioscience)를 이용하여 BMDC의 모집단을 분리하여 진행하였다. 항원 제시 정도를 측정하기 위해서는 anti-OVA SIINFEKL antibody를 사용하였다.

12.5. BMDC에서 mRNA 백신용 조성물의 효능 확인

12.5.1. 단일 톨-유사 수용체 작용자의 효과

BMDC에서의 단일 톨-유사 수용체를 포함하는 mRNA 백신용 조성물의 효과를 확인하기 위하여, 우선 톨-유사 수용체 작용자와 modified-mRNA(5-methoxyuridine modified OVA mRNA, TriLink)를 실시예 12.1과 동일한 방법으로 BMDC에 처리하고, 항원 제시 정도, 세포 표면 분자, 사이토카인인 인터류킨-12p70(Interleukin-12p70; IL-12p70)과 인터페론의 양을 측정하였다. 염증성 사이토카인의 양은 ELISA를 이용하여 측정하였다. 톨-유사 수용체 작용자로는 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자인 R848, 톨-유사 수용체 4 작용자인 LPS, 그리고 톨-유사 수용체 3 작용자인 poly I:C를 사용하였고, poly I:C는 20μg/ml, 30μg/ml, 그리고 40μg/ml으로 농도를 달리하여 사용하였다. 이후 모든 실험은 최소 세 번 이상 반복하였으며, 결과는 평균값±표준편차로 나타내었다. 통계적 유의성은 Student’s t-test로 확인하였고, P < 0.05이면, 통계적으로 유의성이 있다고 판단하였다. R848을 사용한 결과는 도 5 내지 7에 나타내었고, LPS를 사용한 결과는 도 8에 나타내었고, poly I:C를 사용한 결과는 도 9 내지 도 10에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, mRNA를 단독으로 처리한 대조군(mRNA only)과 비교하여, mRNA와 R848을 동시에 처리한 실험군(0h)의 경우에는 항원 제시 정도가 일부 증가되었으나, 유의성 있는 차이를 나타내지 않았지만, mRNA를 처리하고, 4시간 후에 R848을 처리한 실험군(4h)과 8시간 후에 R848을 처리한 실험군(8h)에서는 유의성 있는 차이를 나타내며 항원 제시 정도가 증가된 것을 확인하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, mRNA를 단독으로 처리한 대조군(mRNA only)과 비교하여, mRNA와 R848을 함께 처리한 실험군에서는 처리 시간 차이와 관계없이 모두 세포 표면 분자가 증가되었으며, 이를 통하여, mRNA와 톨-유사 수용체 작용자와의 병용투여를 통하여 세포 활성화 정도를 증가시킬 수 있다는 것을 확인하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, IL-12p70의 경우 mRNA와 R848을 동시에 처리한 실험군(0h)과 비교하여, 시간 간격을 두고 처리한 실험군(4h)에서 IL-12p7의 분비가 증가되는 것을 확인하였다. 또한, Th1으로의 분화(Th1 polarization) 유도 지표로 사용되는 IL-12p70과 IL-10의 비율(IL-12p70/IL-10)의 경우에도 mRNA와 R848을 동시에 처리한 실험군(0h)과 비교하여, 시간 간격을 두고 처리한 실험군(4h 및 8h)에서 유의성있게 증가되는 것을 확인하였다.

도 8에 나타난 바와 같이, mRNA와 LPS를 동시에 처리한 실험군(0h)의 경우에는 mRNA를 단독으로 처리한 대조군(mRNA only)과 비교하여, 항원 제시 정도가 감소되었으나, mRNA를 처리하고, 시간 간격을 두고 LPS를 처리한 실험군(4h 및 8h)에서는 항원 제시 정도가 증가되는 것을 확인하였다.

도 9에 나타난 바와 같이, mRNA와 Poly I:C를 동시에 처리한 실험군(0h)의 경우에는 Poly I:C의 농도와 관계없이, mRNA를 단독으로 처리한 대조군(mRNA only)과 비교하여, 항원 제시 정도가 현저히 감소되는 것을 확인하였다. 반면, 시간 간격을 두고 Poly I:C를 처리한 실험군(4h)에서는 Poly I:C의 농도(20, 30, 및 40)와 관계없이, 항원 제시 정도가 유의성있게 증가되는 것을 확인하였다.

도 10은 mRNA와 40μg/ml의 poly I:C를 처리하고, 항바이러스 사이토카인인 1형 인터페론(type 1 Interferon, type 1 IFN)의 경향성을 비교한 결과이다. mRNA를 단독으로 처리한 대조군(mRNA)에서는 type 1 IFN의 분비가 확인되지 않았으나, mRNA와 poly I:C를 동시에 처리한 실험군(0h)의 경우에는 type 1 IFN의 분비가 현저히 증가되는 것을 확인하였다. 또한, 4시간의 시간 차이를 두고 poly I:C를 처리한 실험군(4h)의 경우에는 type 1 IFN의 분비가 감소되는 것을 확인하였다.

각기 다른 항원 제시 능력, 세포 활성화 정도, 그리고 염증성 사이토카인 분비 능력을 가진 각각의 수지상세포 그룹을 ovalbumin 특이적 TCR transgenic mice(OT-I mice)의 비장에서 분리한 T 세포와 공동 배양하였을 때, mRNA 백신용 조성물의 효과를 확인하기 위하여, OT-1 T 세포의 활성화 정도를 확인하였다. T 세포의 활성화 정도를 확인하기 위하여 활성화된 T 세포에서 분비되는 사이토카인인 인터페론 감마(Interferon-γ; IFN-γ)를 확인하였다. 보다 자세하게는, 전체 T 세포 중에서 세포 내부에 IFN-γ를 보유하고 있는 세포의 비율과 세포 외부로 분비된 IFN-γ의 농도를 측정하였다. 또한, T 세포로부터 분비되어 T 세포의 분화 및 활성도 증가에 기여하는 사이토카인인 인터루킨-2(Interleukin-2; IL-2)의 농도도 함께 확인하였다. 그 결과는 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타난 바와 같이, mRNA를 단독으로 처리한 BMDC와 T 세포를 배양한 대조군(mRNA)과 비교하여, mRNA와 poly I:C를 동시에 처리한 BMDC와 T 세포를 배양한 실험군(0h)은 IFN-γ⁺ T 세포, 분비된 IFN-γ의 양, 그리고 IL-2의 양 모두 현저히 감소되는 것을 확인하였다. 반면, mRNA를 처리하고, 4시간 후에 poly I:C를 처리한 BMDC와 T 세포를 배양한 실험군(4h) 또는 mRNA를 처리하고, 8시간 후에 poly I:C를 처리한 BMDC와 T 세포를 배양한 실험군(8h)의 경우에는 IFN-γ⁺ T 세포의 양, 분비된 IFN-γ의 양, 그리고 IL-2의 양 모두 현저히 증가되는 것을 확인하였다. 특별히, IL-2의 경우에는, 4시간의 시간 간격을 두고 처리한 실험군(4h)이 가장 높은 분비량을 나타내는 것을 확인하였다.

12.5.2. 톨-유사 수용체 3 작용자 및 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 복합 투여 효과

BMDC에서 복합 톨-유사 수용체, 즉, 톨-유사 수용체 3 작용자 및 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자를 포함하는 mRNA 백신용 조성물의 효과를 확인하기 위하여, 우선 poly I:C, R848 그리고 modified-mRNA를 실시예 12.1과 동일한 방법으로 BMDC에 처리하고, 항원 제시 정도와 인터페론 양을 측정하였다. 그 결과는 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타난 바와 같이, mRNA와 복합 톨-유사 수용체 작용자를 동시에 처리한 실험군(0h)의 경우에는 mRNA를 단독으로 처리한 경우과 비교하여 항원 제시 정도가 현저히 감소하나, 반대로 mRNA를 처리하고 4시간 후에 복합 톨-유사 수용체 작용자를 처리한 실험군(4h)의 경우에는 항원 제시 정도가 현저히 증가되는 것을 확인하였다. 그리고 mRNA를 단독으로 처리한 대조군(mRNA)에서는 type 1 IFN의 분비가 확인되지 않았으나, mRNA와 poly I:C를 동시에 처리한 실험군(0h)의 경우에는 type 1 IFN의 분비가 현저히 증가되는 것을 확인하였다. 또한, 4시간의 시간 차이를 두고 poly I:C를 처리한 실험군(4h)의 경우에는 type 1 IFN의 분비가 감소되는 것을 확인하였다.

또한, BMDC와 T 세포를 공동 배양하였을 때의 mRNA 백신용 조성물의 효과를 확인하기 위하여, OT-1 T 세포의 활성화 정도를 확인하였다. 그 결과는 도 13에 나타내었다.

도 13에 나타난 바와 같이, mRNA를 단독으로 처리한 BMDC와 T 세포를 배양한 대조군(mRNA)과 비교하여, mRNA, Poly I:C, 및 R848을 동시에 처리한 BMDC와 T 세포를 배양한 실험군(0h)은 IFN-γ⁺ T 세포, 분비된 IFN-γ의 양, 그리고 IL-2의 양 모두 mRNA를 단독으로 처리한 대조군과 유사한 결과를 나타내는 것을 확인하였다. 반면, mRNA를 처리하고, 4시간 후에 Poly I:C 및 R848을 처리한 BMDC와 T 세포를 배양한 실험군(4h) 또는 mRNA를 처리하고, 8시간 후에 poly I:C 및 R848을 처리한 BMDC와 T 세포를 배양한 실험군(8h)의 경우에는 IFN-γ⁺ T 세포의 양, 분비된 IFN-γ의 양, 그리고 IL-2의 양 모두 현저히 증가되는 것을 확인하였다.

12.5.3. 톨-유사 수용체 4 작용자 및 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자의 복합 투여 효과

BMDC에서의 복합 톨-유사 수용체, 즉, 톨-유사 수용체 4 작용자 및 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자를 포함하는 mRNA 백신용 조성물의 효과를 확인하기 위하여, 우선 LPS, R848 그리고 modified-mRNA를 실시예 12.1과 동일한 방법으로 BMDC에 처리하고, 항원 제시 정도와 세포 활성화 정도를 확인하였다. 세포 활성화 정도는 세포 표면 분자를 측정하여 확인하였다. 그 결과는 도 14에 나타내었다.

도 14에 나타난 바와 같이, mRNA를 단독으로 처리한 대조군(mRNA only)과 비교하여, mRNA, LPS 및 R848을 동시에 처리한 실험군(0h)의 경우에는 항원 제시 정도가 일부 감소되었으나, 유의성 있는 차이를 나타내지 않았지만, mRNA를 처리하고, 4시간 후에 LPS 및 R848을 처리한 실험군(4h)과 8시간 후에 LPS 및 R848을 처리한 실험군(8h)에서는 항원 제시 정도가 현저히 증가하여 유의성 있는 차이를 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 세포 표면 분자에서도, mRNA를 단독으로 처리한 대조군(mRNA only)과 비교하여, mRNA, LPS 및 R848을 함께 처리한 실험군에서는 모두 세포 표면 분자가 증가된 것을 확인하였다.

또한, Th1으로의 분화(Th1 polarization) 유도 지표로 사용되는 IL-12p70과 IL-10의 비율(IL-12p70/IL-10)을 확인하였다. 그 결과는 도 15에 나타내었다.

도 15에 나타난 바와 같이, mRNA, LPS 및 R848을 동시에 처리한 실험군(0h)과 비교하여 시간 차이를 두고 투여한 실험군(4h, 8h)에서 유의성있게 증가되는 것을 확인하였다.

그리고 mRNA와 type 1 IFN의 상관관계를 확인하기 위하여, eGFP modified-mRNA를 BMDC에 처리하고 12시간 후에, eGFP 단백질을 발현하는 세포의 비율과 type 1 IFN의 양을 측정하였다. 그 결과는 도 16에 나타내었다.

도 16에 나타난 바와 같이, mRNA, LPS 및 R848을 동시에 처리한 실험군(0h)은 mRNA만을 처리한 대조군(mRNA only)과 비교하여, GFP를 발현하는 세포의 수가 감소되었으나, 시간 차이를 두고 투여한 실험군(4h, 8h)에서 GFP를 발현하는 세포의 수가 현저히 증가되는 것을 확인하였다. 그리고 Type 1 IFN의 경우에는 mRNA만을 단독으로 처리한 대조군에서는 분비가 되지 않았으나, mRNA, LPS 및 R848을 동시에 처리한 실험군(0h)에서 가장 많이 분비가 되었으며, mRNA와 톨-유사 수용체의 처리 시간 간격이 증가할수록 분비량이 감소되는 것을 확인하였다.

상기 결과들을 통하여, mRNA 항원과 톨-유사 수용체 작용자를 동시에 투여한 경우에는 mRNA의 발현이 억제되고, mRNA 항원의 면역원성 작용이 활성화되어 Type 1 IFN의 발현이 증가되나, mRNA 항원과 톨-유사 수용체 작용자를 시간 차이를 두고 투여한 경우에는 초기에는 mRNA 항원의 발현이 유도되고, 시간 간격을 두고 mRNA 항원의 면역원성이 활성화되는 것을 확인할 수 있었다.

12.6. pDC에서 mRNA 백신용 조성물의 효능 확인

BMDC와 비교하여 상대적으로 많은 양의 type 1 IFN을 분비하는 것으로 알려져 있는 pDC를 이용하여 실험을 진행하였다. 처리 방법은 BMDC와 동일한 방법으로 수행하였다. 그리고 톨-유사 수용체 작용자로는 R848과 R848에 다이설파이드 결합으로 콜레스테롤이 교차결합된 결합체(conjugate)를 이용하여 실시예 11.1과 동일한 방법으로 제조한 나노리포좀(SKKU-078-liposome)을 사용하였다. 그리고 항원 제시 정도와 인터류킨-12p70의 분비량을 측정하였다. 그 결과는 도 17 및 18에 나타내었다.

도 17에 나타난 바와 같이, mRNA를 단독으로 처리한 대조군(mRNA only)은 PBS만을 처리한 대조군(PBS)과 비교하여 유의성있는 차이를 나타내지 않으며, mRNA와 R848을 동시에 처리한 실험군(0h)에서는 일부 증가된 것을 확인하였다. 그러나, mRNA를 처리하고 4시간 후에 R848을 처리한 실험군(4h)에서는 항원 제시 정도가 현저히 증가된 것을 확인하였다. 또한, 리포좀과 mRNA를 동시에 처리한 실험군(mRNA+SKKU-078-liposome)의 경우에도 현저히 증가된 항원 제시 정도를 나타내는 것을 확인하였다. 이는 mRNA 처리 후 4시간의 시간 간격을 두고 R848을 처리한 실험군과 동일한 결과인 것을 확인하였다.

또한, 도 18에 나타난 바와 같이, mRNA를 단독으로 처리한 대조군(mRNA only)과 비교하여, 리포좀과 mRNA를 동시에 처리한 실험군(mRNA+SKKU-078-liposome)의 경우에 인터류킨-12p70의 분비량이 현저히 증가되는 것을 확인하였다.

그리고 pDC와 비장의 T 세포와의 공동 배양하였을 때, mRNA 백신용 조성물의 효과를 확인하기 위하여, 공동 배양하며 modified mRNA와 R848-콜레스테롤 결합체를 포함하는 리포좀을 처리하였다. 그리고 48시간 후에 표현형 별로 T 세포의 비율을 분석하였다. 그 결과는 도 19 및 20에 나타내었다.

도 19 및 20에 나타난 바와 같이, mRNA를 단독으로 처리한 대조군(mRNA only)의 경우에는 PBS를 처리한 대조군(PBS)과 유사하거나 약간 증가된 결과들을 나타내나, mRNA와 리포좀을 처리한 실험군(mRNA+SKKU-078-liposome)의 경우에는 인터페론 감마(interferon gamma; IFN-γ) 양성 T 세포, 종양괴사인자 알파(tumor necrosis factor alpha; TNF-α) 양성 T 세포, 그리고 이중 양성 T 세포의 비율이 현저히 증가하는 것을 확인하였다. 또한, IFN-γ 사이토카인의 분비량 역시 증가하는 것을 확인하였다.

상기 결과들을 통하여, 톨-유사 수용체 작용자를 포함하는 mRNA 백신용 조성물을 제조하는데 있어서, 톨-유사 수용체 작용자와 mRNA가 체내에 주입되어 동시에 작동하는 경우에는 mRNA의 약학적 활성을 감소시키는 반면, mRNA가 단백질로 전사가 일어난 후에 순차적으로 톨-유사 수용체 작용자, 즉, 아주번트의 활성화 기능이 작용할 때, 면역화 반응이 최적화되어 가장 효과적으로 백신의 효능을 향상시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 즉, 효과적인 mRNA 백신용 조성물을 제조하는데 있어서, mRNA와 톨-유사 수용체 작용자의 순차적 작동이 중요하다는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 본 발명의 톨-유사 수용체 작용자와 콜레스테롤의 결합체(conjugate)는 톨-유사 수용체 작용자의 활성화 부위(active site)에 콜레스테롤이 절단 가능한 결합(cleavable bond)으로 연결되어 있어, 초기에는 활성이 일시적으로 저해(inhibition)되어 있다가, 이후 결합체가 생리적 환경에 의하여, 목적하는 위치에 도달하였을 때, 톨-유사 수용체 작용자와 콜레스테롤이 분리되어, 활성을 나타냄으로써 mRNA와 시간 차이를 두고 처리한 것과 동일한 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명의 톨-유사 수용체 작용자-콜레스테롤의 결합체를 아주번트로 사용함으로써, 톨-유사 수용체 작용자-콜레스테롤의 결합체 및 mRNA를 유효성분으로 포함하는 백신용 조성물은 동시 투여로도 mRNA가 단백질로 전사가 일어난 후에 순자적으로 아주번트인 톨-유사 수용체 작용자의 활성화 기능이 작용함으로써, mRNA 백신용 조성물의 효과를 현저히 높일 수 있을 뿐만 아니라, 다양한 종류의 mRNA 백신 분야에 폭넓게 사용될 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 톨-유사 수용체 작용자-콜레스테롤의 결합체를 이용하여 용이하게 제조될 수 있는 나노입자에 다양한 아주번트를 추가로 포함함으로써 mRNA 백신용 조성물의 면역활성화 효능을 더욱 증가시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (13)

1. mRNA 항원, 및 동력학적 제어(kinetically control)가 가능한 면역활성화 물질을 유효성분으로 포함하는, mRNA 백신용 조성물로서, 상기 면역활성화 물질은 면역활성화 물질의 활성화 부위(active site)에 절단 가능한 링커(cleavable linker)가 결합되어 있는 결합체인 것을 특징으로 하는, mRNA 백신용 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 mRNA 백신용 조성물은 투여 후 mRNA가 단백질로 전사되는 과정이 진행된 후에, 순차적으로 면역활성화 물질의 활성화 부위에 결합되어 있는 절단 가능한 링커가 절단되어 면역활성화 물질의 활성화 기능이 유도되는 것을 특징으로 하는, mRNA 백신용 조성물.
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 동력학적 제어는 면역활성화 물질의 활성화 부위에 절단 가능한 링커가 결합되어 있어 비활성화(inactive) 상태가 유지되다가, mRNA의 전사가 시작된 후 2 내지 12 시간 이내에 활성화 부위를 블로킹하고 있던 절단 가능한 링커가 절단되어 면역활성화 물질의 활성이 시간적으로 지연되어 나타나는 것을 특징으로 하는, mRNA 백신용 조성물.
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 절단 가능한 링커는 다이설파이드(disulfide), 카바메이트(carbamate), 하이드라진(hydrazine), 에스터(ester), 펩타이드(peptide), 아자이드(azide), 아마이드(amide), 하이드라존(hydrazone), 티오이써(thioether), 포스포디에스터(phosphodiester), 티오케탈(thioketal) 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 결합을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는, mRNA 백신용 조성물.
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 절단 가능한 링커는 양측 말단 또는 일측 말단에 에틸렌옥사이드(ethylene oxide) 또는 에틸렌글라이콜(ethylene glycol)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, mRNA 백신용 조성물.
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 절단 가능한 링커는 효소, pH, 산화 환원 전위(redox potential), 온도, 초음파, 자성, 및 광원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 요인에 의하여 결합 부위의 화학적 결합이 절단되는 것을 특징으로 하는, mRNA 백신용 조성물.
7. 제 1 항에 있어서,
   상기 절단 가능한 링커의 말단에는 콜레스테롤, 지질, 단백질, 아미노산, 펩타이드 및 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 물질이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, mRNA 백신용 조성물.
8. 제 1 항에 있어서,
   상기 면역활성화 물질은 톨-유사 수용체 작용자(toll-like receptor agonist)인 것을 특징으로 하는, mRNA 백신용 조성물.
9. 제 8 항에 있어서,
   상기 톨-유사 수용체 작용자는 톨-유사 수용체 1 작용자, 톨-유사 수용체 2 작용자, 톨-유사 수용체 3 작용자, 톨-유사 수용체 4 작용자, 톨-유사 수용체 5 작용자, 톨-유사 수용체 6 작용자, 톨-유사 수용체 7 또는 8 작용자, 및 톨-유사 수용체 9 작용자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, mRNA 백신용 조성물.
10. 제 1 항에 있어서,
    상기 mRNA 항원과 동력학적 제어가 가능한 면역활성화 물질은 나노리포좀, 나노에멀젼, 나노마이셀, 하이드로겔, 스캐폴드, 고형 나노입자 및 고분자 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 약물 전달체에 로딩되어 있는 것을 특징으로 하는, mRNA 백신용 조성물.
11. 제 10 항에 있어서,
    상기 약물 전달체는 내부에 로딩된 mRNA 항원이 사이토졸로 먼저 전달된 이후에, 동력학적으로 작용하는 면역활성화 물질이 세포 표면, 엔도좀 또는 라이소좀 내의 수용체(receptor)와 상호작용이 이루어지는 것을 특징으로 하는, mRNA 백신용 조성물.
12. 제 10 항에 있어서,
    상기 약물 전달체에는 톨-유사 수용체 작용자, 사포닌, 항바이러스성 펩티드, 인플라머좀 인듀서(inflammasome inducer), NOD 리간드(NOD ligand), CDS 리간드(cytosolic DNA sensor ligand), STING(stimulator of interferon genes) 리간드, 병원균의 외벽성분, 알룸(alum), 리피드(lipids), 이들의 조합 및 이들의 유사체(derivative)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 면역활성화 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, mRNA 백신용 조성물.
13. 제 1 항에 있어서,
    상기 mRNA 백신용 조성물은 감염성 질환(infectious disease), 암(cancer), 대사증후군(metabolic syndrome), 자가면역질환(autoimmune disease) 및 희귀질환(rare disease)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 질환의 예방 또는 치료 용도로 사용되는 것을 특징으로 하는, mRNA 백신용 조성물.

Images