WO2018181542A1 - アジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物並びに薬剤キット - Google Patents

アジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物並びに薬剤キット Download PDF

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WO2018181542A1
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奈央樹 坂口
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Definitions

  • the present invention relates to an adjuvant composition and a vaccine composition containing the same.
  • CTL cytotoxic T cells
  • CTL induction is usually expressed as follows. That is, endogenous antigens such as proteins produced in virus-infected cells and cancer cells are ubiquitinated and then decomposed into peptides by the proteasome. The degraded peptide binds to major histocompatibility complex (MHC) class I molecules, and the resulting complex is presented to CD8 + T cells on the surface of antigen presenting cells, activating CD8 + T cells. Is done. Then, activated CD8-positive T cells differentiate into CTL.
  • MHC major histocompatibility complex
  • antigen presentation by MHC class I molecules is a process that occurs against endogenous antigens, it does not occur against exogenous antigens outside the cell.
  • the exogenous antigen is taken up by antigen-presenting cells by endocytosis, digested by proteolytic enzymes in endosomes, and decomposed into peptide fragments.
  • the peptide fragment is presented on MHC class II molecules and used for the production of antibodies. For this reason, it is well known that it is difficult to induce CTL using an exogenous antigen.
  • exogenous antigens are degraded in endosomes in antigen-presenting cells and are not used for antigen presentation of MHC class I molecules.
  • the exogenous antigen is delivered to the cytosol in the cell, and the exogenous antigen is allowed to act like the endogenous antigen, thereby binding the exogenous antigen to the MHC class I molecule and presenting the antigen.
  • CTL can be induced.
  • substances having stimuli that activate innate immunity induce maturation of antigen-presenting cells and produce costimulatory molecules and MHC class I molecules. Strengthen.
  • the antigen-presenting cell can be induced to a state where CTL can be induced. Therefore, it is expected to induce a large amount of CTL by combining a technique for delivering an exogenous antigen to the cytosol and a substance that activates innate immunity.
  • an adjuvant composition comprising a pH-sensitive carrier capable of delivering an antigen to the cytosol through a membrane destruction function promoting effect and a substance that stimulates innate immunity is added to CTL. It is disclosed that a large amount of induction is generated.
  • CTL plays a role in killing target cells, it has been reported that induction of a large amount of CTL leads to highly effective cancer immunotherapy (for example, Clin Cancer Res 2013 19 (8 ) 2224-31).
  • cancer immunotherapy in which two drugs are combined has been studied with the expectation that an antitumor effect will be increased by combining the drugs by using different immune systems.
  • Mangsbo SM et al. , J Immunother 2010; 33 (3): 225-35
  • a Toll-like receptor agonist a short-chain DNA containing a CpG motif
  • an anti-PD-1 antibody that is an immune checkpoint inhibitor are administered in combination. It has been shown that survival of tumor-bearing mice is prolonged.
  • an object of the present invention is to provide a combination of drugs having a higher antitumor effect.
  • the present inventor can obtain a particularly high antitumor effect by combining an adjuvant composition in which a substance that activates innate immunity is added to a pH-sensitive carrier and an immune checkpoint inhibitor as a CTL-inducing agent. As a result, the present invention has been completed.
  • Preferred embodiments of the present invention are as follows.
  • An adjuvant composition containing a pH-sensitive carrier and a substance that activates innate immunity used in combination with an immune checkpoint inhibitor.
  • the immune checkpoint inhibitor is at least one selected from the group consisting of anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-PD-L2 antibody and anti-CTLA-4 antibody, (1) or The adjuvant composition according to (2).
  • the pH-sensitive carrier contains a pH-sensitive compound and an amphiphile, and the pH-sensitive compound is deoxycholic acid, cholic acid, ursodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, hyodeoxycholic acid, higher bile acid, glycodeoxy At least one selected from the group consisting of cholic acid, glycyrrhizic acid, glycyrrhetinic acid and salts thereof, wherein the amphiphile is phosphatidylcholine having 10 to 12 carbon atoms, polyoxyethylene sorbitan monomono having 12 to 18 carbon atoms A small amount selected from the group consisting of fatty acid esters, sorbitan fatty acid esters of 16 to 18 carbon atoms, glycerol monooleate, glycerol dilaurate, glycerol distearate, glycerol dioleate, polyoxyethylene castor oil and ⁇ -tocopherol.
  • the “carbon number” in the amphiphilic substance means the carbon number of the fatty acid component (acyl group) constituting the hydrophobic part of the amphiphilic substance.
  • acyl group the carbon number of the fatty acid component constituting the hydrophobic part of the amphiphilic substance.
  • two or more acyl groups it refers to the number of carbon atoms of one acyl group, not the total number.
  • a vaccine composition comprising the adjuvant composition according to any one of (1) to (6) and an antigen.
  • a drug kit in which an adjuvant composition containing a pH-sensitive carrier and a substance that activates innate immunity is combined with an immune checkpoint inhibitor.
  • the immune checkpoint inhibitor is at least one selected from the group consisting of an anti-PD-1 antibody, an anti-PD-L1 antibody, an anti-PD-L2 antibody and an anti-CTLA-4 antibody, (10) The drug kit according to any one of (10).
  • the pH-sensitive carrier includes a pH-sensitive compound and an amphiphile
  • the pH-sensitive compound is deoxycholic acid, cholic acid, ursodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, hyodeoxycholic acid, higher bile acid, glycodeoxy At least one selected from the group consisting of cholic acid, glycyrrhizic acid, glycyrrhetinic acid and salts thereof, wherein the amphiphile is phosphatidylcholine having 10 to 12 carbon atoms, polyoxyethylene sorbitan monomono having 12 to 18 carbon atoms Selected from the group consisting of fatty acid esters, C16-18 sorbitan fatty acid esters, glycerol monooleate, glycerol dilaurate, glycerol distearate, glycerol dioleate, polyoxyethylene castor oil, and ⁇ -tocopherol Even without a one, pharmaceutical kit according
  • An immune checkpoint inhibitor after administering to a subject in need of treatment or prevention an effective amount of an adjuvant composition containing a pH-sensitive carrier and a substance that activates innate immunity and a vaccine composition containing an antigen A method of treating or preventing a disease, comprising administering an effective amount of
  • FIG. 1 is a schematic diagram of an adjuvant composition and a vaccine composition containing the adjuvant composition.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a possible mechanism by which the induction of CTL is increased by the vaccine composition.
  • FIG. 3 is a diagram showing CTL induction evaluation by the ELIspot method.
  • A is a group administered with ovalbumin (hereinafter also simply referred to as OVA) and oligonucleotide containing CpG motif
  • OVA ovalbumin
  • B is a group administered with oligonucleotide containing OVA, CpG motif and pH sensitive carrier.
  • C shows the results of the group administered with OVA and a pH-sensitive carrier.
  • FIG. 4 shows the evaluation of the antitumor effect in a mouse cancer bearing experimental system.
  • FIG. 5 shows the state of the tumor of each group of mice 21 days after cancer cell inoculation.
  • (A) is a group 3 mouse
  • (B) is a group 6 mouse
  • (C) is a group 7 mouse.
  • X to Y indicating a range includes X and Y, and means “X or more and Y or less”.
  • measurement of operation and physical properties is performed under conditions of room temperature (20 ° C. or more and 25 ° C. or less) / relative humidity of 40% RH or more and 50% RH or less.
  • the adjuvant composition 4 includes an amphipathic substance 1, a pH sensitive compound 2, and a substance 3 that activates innate immunity.
  • the pH sensitive carrier 7 is composed of an amphiphilic substance 1 and a pH sensitive compound 2.
  • the substance 3 that activates innate immunity associates with the pH-sensitive compound 2 in the hydrophobic part of the amphiphilic substance 1.
  • the adjuvant composition 4 can also be referred to as an adjuvant complex.
  • the substance 3 that activates innate immunity is present independently of the pH-sensitive carrier comprising the amphiphilic substance 1 and the pH-sensitive compound 2.
  • the vaccine composition 6 includes an adjuvant composition 4 and an antigen 5.
  • the antigen 5 may be included in the adjuvant composition 4 according to the above two forms, or may exist independently.
  • the vaccine composition 6 in which the antigen 5 is included in the adjuvant complex 4 can also be referred to as a vaccine complex.
  • the “adjuvant composition” means a substance containing a pH-sensitive carrier and a substance that activates innate immunity, and the form thereof is not particularly limited. That is, the “adjuvant composition” may be a mixture of a pH-sensitive carrier and a substance that activates innate immunity, or a substance that supports or includes a substance that activates innate immunity in a pH-sensitive carrier (adjuvant). In the present specification, both are collectively referred to as an “adjuvant composition”.
  • the “vaccine composition” means a composition containing an adjuvant composition and an antigen, and the form thereof is not particularly limited. That is, the “vaccine composition” may be a mixture of two or more selected from the group consisting of the components of the adjuvant composition and the antigen, or the adjuvant complex carries or includes the antigen. In the present specification, both are collectively referred to as a “vaccine composition”.
  • the vaccine composition 6 increases the induction of CTL (FIG. 3B). Although this reason is not necessarily clear, it is guessed that it is due to the following reason.
  • antigen-presenting cells mature by a substance that activates innate immunity (not shown).
  • the antigen 5 and the pH-sensitive carrier 7 are taken into the dendritic cell 8 by endocytosis and then transferred into the endosome 9.
  • the pH-sensitive carrier delivers the antigen from within the endosome to the cytosol and undergoes dendritic cell processing. Thereafter, the fragmented antigen binds to the MHC class I molecule and is presented on the cell surface.
  • the production of costimulatory molecules and MHC class I molecules is enhanced, which is thought to increase CTL induction.
  • the substance that activates innate immunity and the pH-sensitive carrier need not necessarily be in the form of a complex. It may be present separately in the composition. In the vaccine composition, the antigen may be present separately from the substance that activates innate immunity and the pH-sensitive carrier.
  • the adjuvant composition includes a pH-sensitive carrier (hereinafter sometimes simply referred to as “carrier”, “aggregate”, or “complex”) and a substance that activates innate immunity. According to the adjuvant composition of the present invention, a high antitumor effect can be obtained.
  • the pH-sensitive carrier is sensitive to pH and has a function of transporting intracellular antigens to the cytosol when the pH becomes acidic.
  • the pH sensitive carrier includes a pH sensitive compound and an amphiphile.
  • the pH-sensitive carrier is considered to be formed by association of a pH-sensitive compound and an amphiphilic substance at a physiological pH or higher. More specifically, it is considered that the pH-sensitive carrier is formed by associating a pH-sensitive compound with a hydrophobic portion constituting an amphiphilic substance.
  • the association format of the pH-sensitive carrier is speculation, and the pH-sensitive carrier is not limited to the association format.
  • the pH sensitive carrier preferably has a membrane breaking function.
  • “Membrane breaking function” means a function of causing dissolution in a dissolution test.
  • the dissolution test in this specification refers to adding a liposome (dispersion) containing an aqueous solution containing a quenching substance and a fluorescent substance, and an evaluation sample dispersion to an aqueous solution adjusted to a predetermined pH, In this test, the aqueous solution is incubated at 37 ° C. for 90 minutes or 30 minutes, and then the fluorescence of the aqueous solution is measured. By this method, the amount of fluorescent substance eluted from the liposome can be measured, and the membrane-disrupting function of the pH-sensitive carrier liposome can be confirmed. In addition, about a dissolution test, it demonstrates in detail in the Example mentioned later.
  • “expressing a membrane destruction function promoting effect” means (1) in the dissolution test, the dissolution rate at a predetermined pH lower than physiological pH is higher than the dissolution rate at physiological pH, and the increase width In the elution test at a predetermined pH lower than the physiological pH, the pH sensitive compound and the amphiphilic substance are pH sensitive carriers. It means that the elution rate at the time of forming is satisfying both the elution rate of the pH sensitive compound alone and the sum of the elution rates of the amphiphile alone. More specifically, the expression of the membrane destruction function promoting effect means that in the dissolution test between pH 7.4 and pH 5.0 or pH 4.5, the dissolution rate Lc of the pH sensitive carrier, the dissolution rate La of the pH sensitive compound alone.
  • the elution rate Lb of the amphiphilic substance alone satisfies both of the following relationships. That is, said (1) is represented by following formula (1), and said (2) is represented by following formula (2).
  • the elution rate at pH 7.4 is expressed as Lc 7.4 , La 7.4 , and Lb 7.4 , respectively, and the elution rate at pH 5.0 or 4.5 is expressed as Lc x , Expressed as La x and Lbx.
  • ⁇ only needs to exceed 0, but is preferably 5 or more, more preferably 10 or more, and further preferably 30 or more.
  • ⁇ is preferably as large as possible, and the upper limit thereof is not particularly limited, but is usually less than 100.
  • ⁇ ′ only needs to exceed 0, but is preferably 5 or more, more preferably 10 or more, and further preferably 15 or more.
  • ⁇ ′ is preferably as large as possible, and the upper limit thereof is not particularly limited, but is usually less than 100.
  • ⁇ and ⁇ ′ in the above formula (1) and the above formula (2) are each 5 or more, and a pH sensitive carrier containing bile acid and lipid is preferable.
  • physiological pH in this specification means pH in normal tissue or normal body fluid.
  • the physiological pH is usually 7.4, but varies slightly ( ⁇ 0.1) depending on normal tissues and normal body fluids.
  • the “predetermined pH less than physiological pH” may be less than pH 7.4, preferably pH 3.0 or more, less than pH 7.4, more preferably pH 4.0 or more, less than pH 7.3,
  • the pH is preferably 4.5 or more and less than 7.0.
  • the mechanism by which the pH-sensitive carrier exerts the effect of promoting the membrane destruction function is not clear, but is presumed as follows.
  • the present invention is not limited by the following estimation.
  • the pH-sensitive carrier is considered to have an effect of promoting the membrane destruction function as a result of a change in the form of association between the pH-sensitive compound and the amphiphile when the surrounding environment is below physiological pH.
  • a pH-sensitive carrier and a biological membrane for example, a cell membrane, a vesicle membrane, etc.
  • the association form of the pH-sensitive carrier changes, After contact with the membrane, it is presumed that the membrane structure change of the biological membrane is also induced by the change. That is, the pH sensitive carrier induces a membrane structure change of the biological membrane.
  • a pH-sensitive compound in the pH-sensitive carrier is destabilized in the structure of the carrier by changing the pH to weakly acidic, so that the pH-sensitive carrier is rearranged from the biological membrane present in the system.
  • a pH-sensitive compound is considered to be a molecule that changes its solubility in hydrophobic association by protonation when the pH changes to weak acidity. That is, it can be said that the hydrophobic association containing the pH-sensitive compound is capable of expressing a function in response to a weakly acidic environment.
  • Membrane breakdown refers to such a change in the membrane structure, and it is not necessary that all membrane constituent components are separated or decomposed. When such “membrane destruction” occurs, components that can be contained inside the membrane of the biological membrane (eg, endosome) are eluted out of the biological membrane (eg, cytosol).
  • the pH-sensitive carrier has a dissolution rate in a dissolution test of less than 20% at pH 7.4 and greater than 20% at pH 4.0.
  • the dissolution rate in the dissolution test is more preferably less than 20% at pH 6.5 and more than 20% at pH 4.0.
  • the elution rate at pH 7.4 or pH 6.5 is more preferably 15% or less, and further preferably 10% or less.
  • the elution rate at pH 4.0 is more preferably 40% or more, and further preferably 50% or more.
  • the pH-sensitive carrier can express a membrane fusion function promoting effect as well as a membrane disrupting function promoting effect.
  • membrane fusion function means a function of causing membrane fusion in a membrane fusion test.
  • the membrane fusion test in the present specification is performed by adding a liposome (dispersion) in which two kinds of fluorescent substances are incorporated into a bilayer membrane and an evaluation sample dispersion to an aqueous solution adjusted to a predetermined pH, In this test, the aqueous solution is incubated at 37 ° C. for 60 minutes, and then the fluorescence of the aqueous solution is measured. By this method, changes in energy resonance transfer of two types of fluorescent substances incorporated in the liposome can be measured, and the membrane fusion function of the pH-sensitive carrier can be confirmed.
  • the methods described in International Publication No. 2015/079952, [0189] to [0194] US Patent Application Publication No. 2016/0271246, [0307] to [0312]
  • expressing a membrane fusion function promoting effect means that in a membrane fusion test, the fusion rate at a predetermined pH lower than physiological pH is higher than the fusion rate at physiological pH, and the range of the increase is pH sensitive. It means satisfying that it is larger than the increase in the case of experimenting with the compound alone. More specifically, expression of a membrane fusion function promoting effect means that the fusion rate of a pH sensitive carrier (a complex of a pH sensitive compound and an amphiphile) in a membrane fusion test at pH 7.4 and pH 5.0.
  • Rc (%) means the one satisfying the relationship of the fusion rate Ra (%) of the pH sensitive compound alone and the following formula (3).
  • the fusion rate at pH 7.4 is represented as Rc 7.4 and Ra 7.4 , respectively
  • the fusion rate at pH 5.0 is represented as Rc x and Ra x , respectively.
  • ⁇ R only needs to exceed 0, but is preferably 2 or more, more preferably 5 or more, and even more preferably 10 or more.
  • the pH-sensitive carrier exhibits a membrane fusion function promoting effect at a weakly acidic pH (a predetermined pH lower than physiological pH). These mechanisms are not clear, but are considered to be the same mechanism as the above-described effect of promoting the film destruction function.
  • the present invention is not limited by the estimation.
  • the pH-sensitive carrier of the present invention changes the association form of the pH-sensitive compound and the amphiphile and rearranges it with the biological membrane present in the system. Therefore, it is estimated that membrane fusion occurs.
  • a component eg, antigen
  • an antigen is surrounded by an endosome, which is a kind of biological membrane, and taken up by a cell (antigen-presenting cell or the like). Thereafter, the pH inside the endosome is lowered by the action of the proton pump. In addition, endosomes fuse with lysosomes containing hydrolases and the antigen is degraded (which can then be complexed with MHC class II molecules and presented to CD4 positive T cells). For this reason, most antigens are not delivered into the cytosol.
  • an antigen for example, exogenous antigen
  • an antigen can be delivered to the cytosol. More specifically, when an antigen is surrounded by an endosome together with a pH-sensitive carrier and taken up by a cell, it is similarly led to a reduced pH environment. As the pH decreases (acidification), the pH-sensitive compound destabilizes the pH-sensitive carrier, and membrane rearrangement occurs between the endosome and the pH-sensitive carrier. As a result, a membrane disrupting function (a membrane disrupting function that is expressed together with the membrane fusion function) by the pH-sensitive carrier occurs. With this membrane disruption function (or membrane fusion function and membrane disruption function), antigen can be delivered from the endosome to the cytosol.
  • the antigen since the antigen can be transported to the cytosol as long as it is incorporated into the endosome together with the pH-sensitive carrier, it can be used in the form of a composition in which the antigen and the pH-sensitive carrier are mixed. However, it is understood that the antigen may be used in a form supported or included in a pH sensitive carrier.
  • the pH sensitive compound is selected from the group consisting of deoxycholic acid, cholic acid, ursodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, hyodeoxycholic acid, higher bile acids, glycodeoxycholic acid, glycyrrhizic acid, glycyrrhetinic acid and their salts It is preferable that there is at least one.
  • the salt of the pH-sensitive compound is not particularly limited, and examples thereof include alkali metal salts such as lithium, sodium and potassium; alkaline earth metal salts such as magnesium, calcium and barium; ammonium salts and the like. These pH sensitive compounds may be used alone or in combination of two or more.
  • the pH-sensitive compound is a group consisting of deoxycholic acid, cholic acid, ursodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, hyodeoxycholic acid, glycodeoxycholic acid, glycyrrhizic acid, and salts thereof. It is preferable that it is at least 1 type selected from.
  • the pH-sensitive compound is a group consisting of deoxycholic acid, ursodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, hyodeoxycholic acid, glycodeoxycholic acid, glycyrrhizic acid or a salt thereof. And at least one selected from the group consisting of deoxycholic acid, ursodeoxycholic acid, glycyrrhizic acid or salts thereof is more preferable.
  • Bile acids Deoxycholic acid, cholic acid, ursodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, hyodeoxycholic acid, higher bile acids and glycodeoxycholic acids preferably used as pH-sensitive compounds are collectively referred to as bile acids.
  • Bile acid has been known as a typical steroid derivative since the 1920s and is used in the field of bacteriology. Bile acids form a complex with cholesterol, lipids, and fat-soluble vitamins in the human body, and have a function of assisting in their absorption.
  • deoxycholic acid ursodeoxycholic acid or a salt thereof (for example, sodium salt)
  • deoxycholic acid or a salt thereof for example, sodium salt
  • the pH sensitive compound is preferably contained in a proportion of 10 mol or more, more preferably in a proportion of 10 to 640 mol, and more preferably in a proportion of 20 to 320 mol with respect to 100 mol of the amphiphilic substance. Is more preferable, and it is particularly preferable to be contained in a proportion of 20 to 160 mol.
  • Amphiphile Amphiphilic substances are phosphatidylcholine having 10 to 12 carbon atoms, polyoxyethylene sorbitan monofatty acid ester having 12 to 18 carbon atoms, sorbitan fatty acid ester having 16 to 18 carbon atoms, glycerol monooleate, glycerol dilaurate, glycerol distearate It is preferably at least one selected from the group consisting of glycerol dioleate, polyoxyethylene castor oil, and ⁇ -tocopherol. These amphiphiles may be used alone or in combination of two or more.
  • the “carbon number” in the amphiphilic substance means the carbon number of the fatty acid component (acyl group) constituting the hydrophobic part of the amphiphilic substance.
  • acyl group the carbon number of the fatty acid component constituting the hydrophobic part of the amphiphilic substance.
  • two or more acyl groups it refers to the number of carbon atoms of one acyl group, not the total number.
  • dilauroyl phosphatidylcholine contains two lauric acid components
  • the carbon number of dilauroyl phosphatidylcholine refers to the carbon number of one of the lauric acid components, that is, 12.
  • the hydrophobic part of phosphatidylcholine has an appropriate length of 10 to 12 carbon atoms, so that the amphipathic lipid has a micelle-forming ability and can be easily fused to the membrane (WO 2013/180253, FIG. 8).
  • the phosphatidylcholine having 10 to 12 carbon atoms is preferably a diacylphosphatidylcholine having a saturated acyl group.
  • DDPC didecanoylphosphatidylcholine
  • DLPC dilauroyl Phosphatidylcholine
  • phosphatidylcholine may be naturally derived or synthesized by a known method, or a commercially available product can be used.
  • the number of carbon atoms constituting the hydrophobic part of phosphatidylcholine is 10-12, the amphiphilic lipid has the ability to form micelles and easily induces membrane rearrangement.
  • polyoxyethylene sorbitan monofatty acid ester having 12 to 18 carbon atoms examples include polyoxyethylene sorbitan monolaurate (polyoxyethylene sorbitan monolaurate), polyoxyethylene sorbitan myristate (polyoxyethylene sorbitan monomyristate), Polyoxyethylene sorbitan monopalmitate (polyoxyethylene sorbitan palmitate), polyoxyethylene sorbitan monostearate (polyoxyethylene sorbitan monostearate), polyoxyethylene sorbitan monooleate (polyoxyethylene sorbitan monooleate) Art).
  • the polymerization degree of polyoxyethylene is not particularly limited, but the total polymerization degree of polyoxyethylene chains added to sorbitan is preferably 10 to 200, more preferably 15 to 100, and more preferably 20 to More preferably, it is 50.
  • the polyoxyethylene sorbitan monofatty acid ester a synthetic product or a commercially available product may be used.
  • polyoxyethylene sorbitan monofatty acid ester examples include Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate), Tween 40 (polyoxyethylene sorbitan monopalmitate), Tween 60 (polyoxyethylene sorbitan monostearate), What is marketed as Tween 80 (polyoxyethylene sorbitan monooleate) can be preferably used.
  • Tween 20 polyoxyethylene sorbitan monolaurate
  • Tween 40 polyoxyethylene sorbitan monopalmitate
  • Tween 60 polyoxyethylene sorbitan monostearate
  • Tween 80 polyoxyethylene sorbitan monooleate
  • it is preferable to use polyoxyethylene sorbitan monofatty acid esters having 12 to 18 carbon atoms Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80).
  • sorbitan fatty acid ester having 16 to 18 carbon atoms examples include sorbitan monopalmitate (sorbitan monopalmitate), sorbitan monostearate (sorbitan monostearate), sorbitan monooleate (sorbitan monooleate) and the like. Fatty acid esters; sorbitan tripalmitate (sorbitan tripalmitate), sorbitan tristearate (sorbitan tristearate), sorbitan trioleate (sorbitan trioleate), and other sorbitan trifatty acid esters.
  • sorbitan fatty acid ester a synthetic product or a commercially available product may be used.
  • sorbitan fatty acid esters examples include SPAN40 (sorbitan palmitate), SPAN60 (sorbitan stearate), SPAN80 (sorbitan oleate), SPAN65 (sorbitan tristearate), and SPAN85 (sorbitan trioleate). What is marketed as ester is preferably used. Of these, SPAN80, SPAN65, and SPAN85 are preferably used.
  • Glycerol monooleate (glyceryl monooleate), glycerol dilaurate (glyceryl dilaurate), glycerol distearate (glyceryl distearate), and glycerol dioleate (glyceryl dioleate) are ester-bonded to one or two molecules of fatty acid.
  • the site to which the fatty acid binds is not particularly limited.
  • a fatty acid may be ester-bonded to the C1 position or C2 position of glycerol.
  • glycerol dilaurate, glycerol distearate, and glycerol dioleate which are diacylglycerols
  • fatty acids may be ester-bonded at the C1 and C2 positions, or the C1 and C3 positions of glycerol.
  • glycerol dilaurate is preferably ⁇ , ⁇ '-dilaurin in which the C1 and C3 positions are substituted.
  • diacylglycerol substituted at the C1 position and the C2 position is preferable.
  • synthetic products or commercially available products may be used.
  • Polyoxyethylene castor oil is obtained by adding polyoxyethylene to castor oil.
  • the degree of polymerization of polyoxyethylene is not particularly limited, but is preferably 3 to 200, more preferably 5 to 100, and still more preferably 10 to 50.
  • As the polyoxyethylene castor oil a synthetic product or a commercially available product may be used.
  • ⁇ -tocopherol a naturally-derived or synthesized method may be used, or a commercially available product may be used.
  • the amphiphiles are phosphatidylcholine having 10 to 12 carbon atoms, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monooleate, sorbitan monooleate, polyoxyethylene castor oil and It is preferably at least one selected from the group consisting of ⁇ -tocopherol, and dilauroyl phosphatidylcholine, didecanoyl phosphatidylcholine, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monooleate, sorbitan monooleoleate, poly More preferably, it is at least one selected from the group consisting of oxyethylene castor oil and ⁇ -tocopherol, and dilauroylphosphatidylcholine and / or didekanoy Ruphosphatidylcholine is more preferred, and dilauroylphosphatidylcholine is particularly preferred.
  • the pH sensitive compound is selected from the group consisting of deoxycholic acid, cholic acid, ursodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, hyodeoxycholic acid, higher bile acids, glycodeoxycholic acid, glycyrrhizic acid, glycyrrhetinic acid and their salts
  • at least one kind of amphiphile is phosphatidylcholine having 10 to 12 carbon atoms, polyoxyethylene sorbitan monofatty acid ester having 12 to 18 carbon atoms, sorbitan fatty acid ester having 16 to 18 carbon atoms, glycerol monooleate, dilaurin It is preferably at least one selected from the group consisting of acid glycerol, glycerol distearate, glycerol dioleate, polyoxyethylene castor oil, and ⁇ -tocopherol.
  • the pH-sensitive carrier can exhibit a membrane destruction function promoting effect at a desired pH by a combination of a pH-sensitive compound and an amphiphilic substance.
  • the pH at which the effect of promoting the membrane destruction function of the pH-sensitive carrier begins to appear varies depending on the combination of the pH-sensitive compound and the amphiphilic substance. This is considered to originate from the fact that the pKa differs depending on the pH-sensitive compound, and further, the mode of association formation with the amphiphilic substance differs depending on the combination of the pH-sensitive compound and the amphiphilic substance. Therefore, by appropriately changing the combination of the pH-sensitive compound and the amphiphilic substance, it is possible to select a pH at which the function is expressed, and it is possible to set the delivery in detail.
  • combinations of pH-sensitive compounds and amphiphiles include cholic acid and DLPC, deoxycholic acid and DDPC, deoxycholic acid and DLPC, deoxycholic acid and Tween 20, deoxycholic acid and Tween 40, deoxycholic Acid and Tween 60, Deoxycholic acid and Tween 80, Deoxycholic acid and SPAN40, Deoxycholic acid and SPAN60, Deoxycholic acid and SPAN80, Deoxycholic acid and SPAN65, Deoxycholic acid and SPAN85, Deoxycholic acid and SPAN85, Deoxycholic acid, Deoxycholic Acid and glycerol monooleate, deoxycholic acid and glycerol distearate, deoxycholic acid and di Glycerolate, deoxycholic acid and glycerol dilaurate ( ⁇ , ⁇ '-dilaurin), deoxycholic acid and polyoxyethylene castor oil, chenodeoxycholic acid and polyoxyethylene castor oil,
  • cholic acid and DLPC deoxycholic acid and DDPC, deoxycholic acid and DLPC, deoxycholic acid and Tween 20, deoxycholic acid and Tween 40, deoxycholic acid and Tween 60, deoxycholic acid and Tween 80, deoxycholic acid and Tween 80, deoxycholic acid and SPAN 40 Deoxycholic acid and SPAN65, deoxycholic acid and SPAN80, deoxycholic acid and SPAN85, deoxycholic acid and ⁇ -tocopherol, deoxycholic acid and monooleic acid glycerol, deoxycholic acid and polyoxyethylene castor oil, chenodeoxycholic acid and DLPC Hyodeoxycholic acid and DLPC, Glyodeoxycholic acid and DLPC, Ursodeoxy Cholic acid and DDPC, Ursodeoxycholic acid and DLPC, Ursodeoxycholic acid and Tween 40, Ursodeoxycholic acid and
  • deoxycholic acid and DDPC deoxycholic acid and DLPC
  • deoxycholic acid and DLPC deoxycholic acid and Tween 20
  • deoxycholic acid and Tween 80 deoxycholic acid and SPAN 80
  • deoxycholic acid and ⁇ -tocopherol deoxycholic acid and DDPC
  • urso Deoxycholic acid and DLPC urso Deoxycholic acid and DLPC
  • glycyrrhizic acid and DLPC most preferably deoxycholic acid and DDPC, deoxycholic acid and DLPC.
  • the pH-sensitive compound may be a salt.
  • the substance that activates innate immunity means a substance that is recognized by a structural pattern recognition receptor and leads to activation of immunocompetent cells.
  • the substance that activates innate immunity is not particularly limited, but is preferably an agonist for a Toll-like receptor.
  • substances that activate innate immunity include, but are not limited to, oligonucleotides containing a CpG motif; mineral salts such as alum; gel type adjuvants such as aluminum hydroxide, aluminum phosphate and calcium phosphate; immunostimulatory RNA Molecule, endotoxin (lipopolysaccharide (LPS; endotoxin), monophosphoryl lipid A (MPL: registered trademark)), exotoxin (cholera toxin, E.
  • oligonucleotides containing a CpG motif mineral salts such as alum
  • gel type adjuvants such as aluminum hydroxide, aluminum phosphate and calcium phosphate
  • immunostimulatory RNA Molecule immunostimulatory RNA Molecule
  • endotoxin lipopolysaccharide (LPS; endotoxin), monophosphoryl lipid A (MPL: registered trademark)
  • exotoxin cholera toxin, E.
  • IFA incomplete Freund's adjuvant
  • oily adjuvants such as liquid paraffin and lanolin, biodegradable microspheres, saponins (QS-21, Quil-A
  • substances that activate innate immunity include oligonucleotides containing CpG motifs; mineral salts; gel type adjuvants such as aluminum hydroxide, aluminum phosphate, and calcium phosphate; immunostimulatory RNA molecules, monophosphoryl lipid A (MPL) : Registered trademark)), exotoxins (cholera toxin, E.
  • coli heat labile toxin pertussis toxin
  • microbial adjuvants such as flagellin, saponins (QS-21, Quil-A, etc.), synthetic polynucleotides (non- CpG synthetic polynucleotide etc.), synthetic adjuvants such as imidazoquinoline, single stranded RNA; preferably double stranded RNA, etc., more preferably monophosphoryl lipid A, CpG motif, oligonucleotide containing aluminum hydroxide
  • immune checkpoint inhibition Since the very excellent combined effect with, and particularly preferably an oligonucleotide comprising a CpG motif.
  • the substances that activate innate immunity may be used alone or in combination of two or more.
  • the content of the substance that activates innate immunity varies depending on the type of substance that activates innate immunity, but is preferably 0.0227 to 22.7 mol with respect to 100 mol of the amphiphilic substance. It is preferable that the content of the substance that activates innate immunity is 0.0227 mol or more because an immune response can be suitably induced. On the other hand, if the content of the substance that activates innate immunity is 22.7 mol or less, it is preferable because the cost can be reduced.
  • the oligonucleotide containing the CpG motif is preferably an unmethylated CpG oligodeoxynucleotide (CpG ODN), and is an unmethylated CpG oligodeoxynucleotide (CpG ODN) that is a ligand of Toll-like receptor 9 (TLR9). It is more preferable.
  • CpG ODN unmethylated CpG oligodeoxynucleotide
  • TLR9 Toll-like receptor 9
  • Oligodeoxynucleotides are deoxynucleosides (deoxyadenosine (base part is adenine (A)), deoxyguanosine (base part is guanine (G)), thymidine (base part is thymine (T)), deoxycytidine (base
  • the moiety refers to a compound in which cytosine (C))) is multimerized by phosphodiester bonds mediated by phosphoric acid.
  • the part of the phosphodiester bond of the oligonucleotide may be phosphorothioate-modified in which all or a part of the oligonucleotide is substituted with a sulfur atom.
  • a phosphorothioate-modified phosphodiester bond can also be referred to as a phosphorothioate bond.
  • CpG ODN is an oligodeoxynucleotide having a single or a plurality of unmethylated CpG motifs in the nucleic acid molecule (not 5 'end or 3' end).
  • the unmethylated CpG motif is a cytosine (C) -guanine (G) (5′-CpG-3 ′) dinucleotide sequence, and the dinucleotide in which the 5-position of the cytosine is not methylated An array.
  • cytosine is methylated by CG methylase in the 5′-CpG-3 ′ sequence, so the occurrence frequency of unmethylated 5′-CpG-3 ′ sequences in the genome is small. .
  • Unmethylated CpG oligodeoxynucleotide (CpG ODN) can be easily prepared using a known nucleic acid synthesis method, or a commercially available product may be used.
  • CpG ODN preferably consists of 18-25 deoxynucleotides, more preferably 20-22 deoxynucleotides.
  • CpG ODN examples include CpG ODN of class A (Class A; also referred to as type D (type D)), class B (also referred to as Class B; also referred to as type K (type K)), and class C (Class C). .
  • a class A CpG ODN is a palindromic sequence including an unmethylated CpG sequence having one or more sequences, a portion having a phosphodiester bond in the skeleton, and a 5 ′ side and / or a 3 ′ side of the palindromic sequence.
  • This is a CpG ODN consisting of a poly G sequence (poly (G), a sequence in which two or more deoxyguanosines are linked) bound to, and a skeleton having a phosphorothioate bond.
  • the palindromic sequence refers to a sequence having a palindromic structure in which the sequence and the complementary strand sequence match.
  • class A CpG ODN ODN 2216, ODN 2336, and ODN 1585 are exemplified. All of these can be purchased from InvivoGen.
  • Class B CpG ODN refers to CpG ODN that contains one or more unmethylated CpG sequences in the sequence and whose backbone is a phosphorothioate bond over the entire length of the oligonucleotide.
  • Specific examples of class B CpG ODNs include ODN 2006, ODN 1668, and ODN 1826. All of these can be purchased from InvivoGen.
  • Type C CpG ODN consists of a 5 'portion containing one or more unmethylated CpG sequences in the sequence and a 3' portion containing a palindromic sequence containing unmethylated CpG sequences, and the backbone spans the entire length of the oligonucleotide. It refers to CpG ODN which is a phosphorothioate bond. Specific examples of class C CpG ODNs include ODN 2395 and ODN M362. ODN2395 and ODN M362 have markedly immunostimulatory activity in humans and mice. All of these can be purchased from InvivoGen.
  • the adjuvant composition may contain an aqueous solvent.
  • the pH-sensitive carrier and the substance that activates innate immunity can be a dispersion dispersed in the aqueous solvent.
  • the pH-sensitive carrier preferably forms a complex containing the pH-sensitive compound and the amphiphilic substance in an aqueous solvent.
  • the form of these complexes is not particularly limited, and the pH-sensitive compound and the amphiphilic substance may form a film, or a part or the whole of the pH-sensitive compound is associated with the structure formed by the amphiphilic substance. May be embedded.
  • a pH-sensitive compound and an amphiphile are micelle-like particles (particles in which a pH-sensitive compound and an amphiphile are associated in a granular form by hydrophobic interaction, and typically have a monomolecular film structure. Is preferably formed.
  • the micelle particles preferably have a particle size of 10 to 200 nm. More preferably, it is 100 nm.
  • the micelle-like particles do not include those that form a lipid bilayer structure (for example, liposome).
  • the particle diameter of the pH-sensitive carrier can be measured by a dynamic light scattering method (NanoZS90, manufactured by MALVERN Instruments).
  • the adjuvant composition preferably forms a complex (adjuvant complex) containing the complexed pH-sensitive carrier and a substance that activates innate immunity in an aqueous solvent.
  • a complex adjuvant complex
  • the form of the complex is not particularly limited, but it is preferable that the pH-sensitive substance and the amphiphilic substance constituting the pH-sensitive carrier and the substance that activates innate immunity form micelle-like particles.
  • the particle size of the micellar particles is preferably 10 to 200 nm, and more preferably 10 to 100 nm.
  • aqueous solvent containing the adjuvant composition at least one of a pH-sensitive compound, an amphiphilic substance, and a substance having an activity of stimulating innate immunity does not form an aggregate and exists in a free state. Good.
  • the aqueous solvent is preferably an aqueous solution containing a buffer, saccharides such as NaCl, glucose and sucrose.
  • any known buffer can be used as appropriate as long as the pH of the adjuvant composition is maintained at a physiological pH or higher, and is not particularly limited.
  • the buffer include phosphate buffer, citrate buffer, citrate-phosphate buffer, trishydroxymethylaminomethane-HCl buffer (Tris-HCl buffer), and trishydroxymethylaminomethane-EDTA buffer.
  • phosphate buffer such as PBS (Phosphate buffered saline), citrate buffer, citrate-phosphate buffer, Tris hydrochloride buffer, Tris EDTA buffer (TE buffer), MES buffer, acetic acid It is preferable to use a buffer, HEPES-NaOH buffer.
  • concentration of the buffer is not particularly limited and is preferably 0.1 to 200 mM, more preferably 1 to 100 mM.
  • buffer concentration refers to the concentration (mM) of the buffer contained in the aqueous solvent.
  • the concentration of saccharides such as NaCl, glucose and sucrose is not particularly limited and is preferably 0.1 to 200 mM, more preferably 1 to 150 mM.
  • the concentration of the pH-sensitive carrier in the adjuvant composition when an aqueous solvent is used is not particularly limited, but the total molar concentration of the pH-sensitive compound and the amphiphile is preferably 0.73 ⁇ mol / L-7. It is 4 mmol / L, more preferably 7.3 ⁇ mol / L to 6.5 mmol / L, and still more preferably 8.0 ⁇ mol / L to 4.2 mmol / L.
  • the molar concentration of the substance that activates innate immunity in the adjuvant composition when an aqueous solvent is used is not particularly limited, but is preferably 0.14 nmol / L to 0.227 mmol / L, more preferably 1. It is 4 nmol / L to 0.19 mmol / L, more preferably 1.6 nmol / L to 0.12 mmol / L.
  • the adjuvant composition may contain other components. Although it does not restrict
  • the stabilizer is not particularly limited as long as it does not adversely affect the pH-sensitive carrier and the substance that activates innate immunity.
  • saturation such as 1-octanol, 1-dodecanol, 1-hexadodecanol, 1-eicosanol, etc.
  • unsaturated alcohols having 4 to 20 carbon atoms saturated and unsaturated fatty acids having 12 to 18 carbon atoms such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid and oleic acid; methyl caprylate (methyl octoate); Saturated and unsaturated fatty acid having 8 to 18 carbon atoms such as ethyl caprylate (ethyl octoate), methyl laurate, ethyl laurate, ethyl myristate, ethyl palmitate, ethyl stearate, methyl oleate, ethyl oleate Alkyl ester (alkyl having 1 to 3 carbon atoms); D (L) -alanine, a D (L) -amino acids such as ginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glycine, histidine, leucine, isoleucine,
  • the content of these other components is not particularly limited as long as it does not adversely affect the pH-sensitive carrier and the substance that activates innate immunity, but is preferably 150 mol or less with respect to 100 mol of the amphiphilic substance. And more preferably 66.4 mol or less.
  • An adjuvant composition containing a pH-sensitive carrier and a substance that activates innate immunity can induce CTLs effectively when administered together with an antigen.
  • the function of the pH-sensitive carrier for example, the membrane destruction function promoting effect (and the membrane fusion function promoting effect) is suitable. Can be demonstrated.
  • the function of the substance that activates innate immunity can be suitably exhibited.
  • the pH-sensitive carrier contains a pH-sensitive compound and an amphiphilic substance, and has a membrane destruction function promoting effect (in some cases, a membrane destruction function promoting effect and a membrane fusion function promoting effect).
  • the membrane destruction function promoting effect (and the membrane fusion function promoting effect) is, as described above, inducing the change in the association state of the pH sensitive carrier by the pH sensitive compound in an acidic environment, and the amphiphilic substance in this case It is based on rearrangement with cell membranes such as endosomes.
  • the pH-sensitivity of the pH-sensitive compound does not vary, so that the pH-sensitive compound can cause a change in the association state of the pH-sensitive carrier.
  • the substance that activates innate immunity is incorporated into an amphiphile or independent of a pH-sensitive carrier, it will affect the rearrangement of the cell membrane by the amphiphile. Don't give. Then, even if a substance that activates innate immunity is used in combination with a pH-sensitive carrier, the function of the pH-sensitive carrier is not impaired.
  • the substance that activates innate immunity is, for example, incorporated into the amphiphile of the pH-sensitive carrier by a hydrophobic interaction, or simply exists independently of the pH-sensitive carrier. And its function is not impaired.
  • the adjuvant composition according to the present embodiment when administered together with the antigen, can introduce the antigen into the cytosol by the function of the pH-sensitive carrier, and the substance that activates innate immunity acts on the site.
  • Cross presentation based on the antigen introduced into the sol can be suitably induced, and CTL can be effectively induced.
  • the adjuvant composition can also induce humoral immunity suitably.
  • exogenous antigens are usually decomposed into peptide fragments by endosomes in antigen-presenting cells, form complexes with MHC class II molecules, and presented to CD4-positive T cells.
  • the pH-sensitive carrier activates the antigen and innate immunity when causing rearrangement of the endosomal cell membrane. Substances that turn into can be introduced into the cytosol. However, in one embodiment, even if rearrangement occurs, some or all of the antigen and the substance that activates innate immunity may remain in the endosome. In one embodiment, when the antigen and the adjuvant composition are present independently, only a part of the endosome may take up only the antigen.
  • the antigen is decomposed into peptide fragments in the endosome, forms a complex with the MHC class II molecule, and is presented to CD4 positive T cells to induce humoral immunity.
  • the dendritic cells that are preferably inducing cross-presentation are in an immunologically activated state, the induction of humoral immunity is suitably expressed.
  • dendritic cells that are preferably inducing cross-presentation actively produce cytokines that activate immunity (eg, IFN ⁇ ), and lead the surrounding environment to an environment suitable for immunity induction.
  • the adjuvant composition can induce humoral immunity with or in place of cross presentation.
  • the adjuvant composition is used to be administered in combination with an immune checkpoint inhibitor.
  • T cells An immune checkpoint receptor exists on T cells and interacts with ligands expressed on antigen-presenting cells. T cells recognize and activate antigens presented on MHC molecules and cause an immune response, but T cell activation is regulated by the immune checkpoint receptor-ligand interaction that occurs in parallel. There are two types of immune checkpoint receptors, costimulatory and inhibitory, and T cell activation and immune responses are regulated by the balance between the two.
  • Cancer cells express a ligand for an inhibitory immune checkpoint receptor, and escape from destruction by cytotoxic T cells using the receptor.
  • An immune checkpoint inhibitor is one that inhibits the function of an immune checkpoint of a receptor or a ligand, and examples thereof include an antagonist for an inhibitory receptor and an agonist for a costimulatory immune checkpoint receptor.
  • antagonist includes various substances that interfere with the activation of the receptor by binding the receptor to the ligand.
  • a substance that binds to a receptor and interferes with the binding between the receptor and the ligand and a substance that binds with the ligand and interferes with the binding between the receptor and the ligand can be exemplified.
  • Antagonists against inhibitory immune checkpoints are designed based on antagonistic antibodies that bind to inhibitory immune checkpoint molecules (suppressor receptors or ligands of the receptors) and inhibitory immune checkpoint ligands.
  • inhibitory immune checkpoint molecules suppressor receptors or ligands of the receptors
  • inhibitory immune checkpoint ligands inhibitory immune checkpoint ligands.
  • a soluble polypeptide that does not activate the receptor a vector that can express the polypeptide, and the like can be mentioned.
  • antagonists to the suppressive immune checkpoint receptor include anti-PD-1 antibody, anti-CTLA-4 antibody, anti-LAG-3 antibody, anti-TIM-3 antibody, anti-BTLA antibody and the like.
  • antagonists to the ligand for the suppressive immune checkpoint receptor include anti-PD-L1 antibody, anti-PD-L2 antibody, anti-CD80 antibody, anti-CD86 antibody, anti-GAL9 antibody, and anti-HVEM antibody.
  • the immune checkpoint inhibitor comprises an anti-PD-1 antibody, an anti-PD-L1 antibody, an anti-PD-L2 antibody and an anti-CTLA-4 antibody Is preferably at least one selected from the group consisting of an anti-PD-1 antibody and / or an anti-PD-L1 antibody, and more preferably an anti-PD-1 antibody.
  • Antibodies such as anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody, and anti-PD-L2 are monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, single-chain antibodies, modified antibodies (eg, “humanized antibodies” in which only the antigen recognition site is humanized)
  • the antibody may be of any class such as IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. From the viewpoint of specific binding to an antigen, it is more preferable to use a monoclonal antibody.
  • Monoclonal antibodies and polyclonal antibodies can be prepared in consideration of conventionally known methods.
  • the pH-sensitive compound and the amphiphilic substance may be contacted in an aqueous solution. Therefore, the pH sensitive carrier can be produced by bringing the pH sensitive compound and the amphiphile into contact in an aqueous solution. Specifically, an aqueous solution containing a pH sensitive compound and an amphiphilic substance is prepared, and the solution is vigorously stirred and dispersed using an emulsifier, a vortex mixer, an ultrasonic wave, etc. A pH-sensitive carrier in which an amphiphile is associated can be obtained.
  • the method for preparing an aqueous solution containing a pH-sensitive compound and an amphiphilic substance is not particularly limited as long as the pH-sensitive compound and the amphiphilic substance form an aggregate.
  • An aqueous solution containing a pH-sensitive compound and an aqueous solution containing an amphiphile are prepared separately, the aqueous solutions are mixed, and the solution is mixed with an emulsifier, vortex mixer, ultrasonic wave, etc.
  • a method of obtaining a pH-sensitive carrier by vigorously stirring and dispersing and (2) a method of preparing by a Bangham method known as a method for producing liposomes / micelles.
  • a pH sensitive carrier such as a pH sensitive compound and an amphiphile
  • an organic solvent for example, methanol, chloroform
  • a solution containing a pH sensitive compound in which a pH sensitive compound is dissolved in an organic solvent (eg, methanol, chloroform) and an innate immunity in which an amphiphile is dissolved in an organic solvent (eg, methanol, chloroform) are activated. It is preferable to prepare a solution containing the substance to be converted and to mix the solution containing the pH sensitive compound and the solution containing the amphiphilic substance.
  • the order of mixing at this time is not particularly limited, and the solution containing the pH-sensitive carrier and the amphiphilic substance may be mixed together, or the other may be added to one of them.
  • the concentration of the pH-sensitive carrier in the solution containing the pH-sensitive compound and the concentration of the amphiphilic substance in the solution containing the amphiphilic substance are not particularly limited and are appropriately set.
  • the solution containing an amphiphilic substance may contain an additive as necessary.
  • the organic solvent of the mixed solution is removed by a rotary evaporator or the like to form a thin film on the wall of the glass container.
  • an aqueous solvent is added to the glass container on which the thin film is formed, and the thin film is swollen at room temperature (5-35 ° C.), and then the glass container is shaken at room temperature (5-35 ° C.).
  • the thin film can be sufficiently dispersed in the aqueous solution by vigorously stirring using an emulsifier, a vortex mixer, and ultrasonic waves.
  • an aqueous solvent the aqueous solvent contained in the adjuvant composition mentioned above can be used as an aqueous solvent.
  • a dispersion (solution) of a pH sensitive carrier can be obtained.
  • the dispersion of the pH sensitive carrier may be used as it is for the production of the adjuvant composition, or the pH sensitive carrier may be separated from the dispersion.
  • liposomes Shinochi Nojima, Junzo Sunamoto, Junzo Inoue, Nankodo
  • liposomes in life science Hiroshi Terada, edited by Tetsuro Yoshimura, Springer Fairlake Tokyo.
  • the adjuvant composition is not particularly limited, and can be produced by various methods. Specifically, methods described in International Publication No. 2015/079952 (U.S. Patent Application Publication No. 2016/271246) can be appropriately taken into consideration.
  • an adjuvant composition in which a pH-sensitive carrier and a substance that activates innate immunity exist independently can be produced by mixing a pH-sensitive carrier and a substance that activates innate immunity.
  • Examples of a method of mixing a pH-sensitive carrier and a substance that activates innate immunity include a method of mixing a dispersion of a pH-sensitive carrier obtained by the Bangham method and a solution containing a substance that activates innate immunity.
  • the order of mixing at this time is not particularly limited, and a solution containing a pH-sensitive carrier and a solution containing a substance that activates innate immunity may be mixed at one time, or the other may be added to one of them.
  • the solution containing a substance that activates innate immunity includes a substance that activates innate immunity and an aqueous solvent. Moreover, the additive may be included as needed. In addition, as an aqueous solvent, the aqueous solvent contained in the adjuvant composition mentioned above can be used.
  • the concentration of the substance that activates innate immunity in the solution containing the substance that activates innate immunity is preferably a molar concentration of the substance that activates innate immunity, preferably 0.14 nmol / L to 0.227 mmol / L. Is 1.4 nmol / L to 0.19 mmol / L.
  • an adjuvant composition in which a substance that activates innate immunity is carried or included in a pH-sensitive carrier it can be produced by associating a pH-sensitive carrier with a substance that activates innate immunity.
  • the pH-sensitive compound, the amphipathic substance, and the substance that activates innate immunity are brought into contact in an aqueous solution. Good.
  • the method for bringing a pH-sensitive compound, an amphipathic substance, and a substance that activates innate immunity into contact in an aqueous solution is not particularly limited as long as they form an aggregate.
  • an aqueous solution containing a pH-sensitive compound, an aqueous solution containing an amphiphile, and an aqueous solution containing a substance that activates innate immunity are prepared separately, and these aqueous solutions are mixed, A method in which the solution is vigorously stirred and dispersed using an emulsifier, a vortex mixer, an ultrasonic wave or the like to obtain an adjuvant composition; (2) a method prepared by a Bangham method, which is known as a method for producing liposomes, and the like. .
  • the specific procedure of the bangham method is the same as that described in the column of the method for producing the pH-sensitive carrier.
  • the addition method in particular of other components, such as a stabilizer which can be contained in the adjuvant composition containing an aqueous solvent as a component is not restrict
  • it may be added to an aqueous solution containing a pH-sensitive compound, an aqueous solution containing an amphiphile, and / or an aqueous solution containing a substance that activates innate immunity, or when preparing a thin film by the Bangham method
  • it may be dissolved together with the components of the pH-sensitive carrier or the adjuvant composition, and an aqueous solution containing the adjuvant composition may be obtained using a thin film containing these ingredients.
  • the vaccine composition includes an adjuvant composition and an antigen.
  • adjuvant composition Since the above-mentioned adjuvant composition can be used, the description thereof is omitted here.
  • the antigen is not particularly limited as long as it causes an immune response, but is preferably a peptide or protein.
  • peptides or proteins examples include viral antigens, bacterial antigens, fungal antigens, protozoal or parasitic antigens, cancer antigens and the like.
  • viral antigens include, but are not limited to, human immunodeficiency virus (HIV) antigens such as gene products of gag, pol, and env genes, Nef protein, reverse transcriptase, and other HIV components; S of hepatitis B virus Hepatitis virus antigens such as hepatitis B virus pre-S antigen, hepatitis C virus RNA, and viral components of hepatitis A, B, and C; hemagglutinin and neuraminidase, and others Influenza virus antigens such as influenza virus components; measles virus antigen; rubella virus antigen; rotavirus antigen; cytomegalovirus antigen; respiratory syncytial virus antigen; herpes simplex virus antigen; varicella-zoster virus antigen; Include the disease virus antigen.
  • HAV human immunodeficiency virus
  • S of hepatitis B virus Hepatitis virus antigens such as hepatitis B virus pre-S
  • adenovirus retrovirus, picornavirus, herpes virus, rotavirus, hantavirus, coronavirus, togavirus, flavivirus, rhabdovirus, paramyxovirus, orthomyxovirus, bunyavirus, arenavirus, leo Peptides derived from viruses, papillomaviruses, parvoviruses, poxviruses, hepadnaviruses or spongy viruses.
  • Bacterial antigens include, but are not limited to, bacterial antigens such as pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, pertactin, FIM2, FIM3, adenylate cyclase, other pertussis bacterial antigen components; diphtheria toxin or toxoid, other Diphtheria bacterial antigens such as diphtheria bacterial antigen components; Tetanus toxin or toxoid, Tetanus bacterial antigens Streptococcus bacterial antigens such as other tetanus bacterial antigen components; Grams such as lipopolysaccharide, other Gram negative bacterial antigen components Negative Neisseria gonorrhoeae bacterial antigens; Mycobacterial bacterial antigens such as mycobacterial antigen components; Helicobacter pylori bacterial antigen components; Streptococcus pneumoniae bacterial antigens; Haemophilus influenzae bacterial
  • fungal antigens include, but are not limited to, Candida fungal antigen component; Histoplasma fungal antigen; Cryptococcus fungal antigen; Coccidioides fungal antigen;
  • the protozoan or parasite antigen is not particularly limited, and examples thereof include Plasmodium falciparum antigen; Toxoplasma antigen; Schistosomiasis antigen; Leishmania antigen; Trypanosoma cruzi antigen and the like.
  • Cancer antigens are not particularly limited, and include cancer antigens derived from the cell surface, cytoplasm, nucleus, organelles, etc. of tumor tissue cells.
  • Such cancers include leukemia, lymphoma, neurological tumor, melanoma, breast cancer, lung cancer, head and neck cancer, stomach cancer, colon cancer, liver cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, uterine cancer, ovarian cancer, vaginal cancer, testicular cancer, prostate Cancer, penile cancer, bone tumor, blood vessel tumor, lip cancer, nasopharyngeal cancer, pharyngeal cancer, esophageal cancer, rectal cancer, gallbladder cancer, bile duct cancer, laryngeal cancer, bladder cancer, kidney cancer, brain cancer, thyroid cancer, Hodgkin disease, Non-Hodgkin lymphoma and the like can be mentioned.
  • cancer antigens include HER2 / neu (Human EGFR related 2), CEA (Carcinogenic Embryonic Antigen), MAGE (Melanoma-associated Antigen), and XAGE (Xantigen-FN).
  • Gp100 Melan / mart-1, Tyrosinase, PSA (Prostate Specific Antigen), PAP (Prostate Acid Phosphatase), K-ras, N-ras, Bcr-Abl, MUC-1 (Mucin-1), PSMAProst Membrane Antigen), survivin WT-1 (Wilmstumor suppressor gene 1), AFP (AlphaFetoprotein), GPC (Glypican), EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) and the like.
  • antigens may be used alone or in combination of two or more.
  • the content of the antigen is preferably 3.2 ⁇ g to 1.0 mg with respect to 100 nmol of the amphiphile constituting the pH sensitive carrier.
  • the incorporation rate of the antigen is not particularly limited, and the antigen and the adjuvant composition may exist independently, but is preferably 3% or more, more preferably 5 to 80%, and more preferably 10 to More preferably, it is 60%.
  • the integration rate is 3% or more, for example, when the vaccine composition is endocytosed into cells, the possibility that the antigen is introduced into the same endosome as the adjuvant composition is high, and the effect of the invention is preferable.
  • the “antigen incorporation rate” mainly means a ratio in which an antigen is carried or included in an adjuvant composition, and the values are [0195] to [0198] of WO2015 / 079952 (US Patent) The value measured by the method described in the application publication No. 2016/271246 specification [0312] to [0315]) is adopted.
  • the vaccine composition may contain other pharmaceutical additives.
  • the vaccine composition may be in the form of a solid preparation such as a tablet, powder or capsule, or in the form of a liquid preparation such as an injection preparation, but is preferably a liquid preparation.
  • a liquid preparation it may be provided as a dry product that is regenerated with water or other suitable excipient at the time of use.
  • the vaccine composition is a liquid preparation
  • a solvent eg, physiological saline, sterilized water, buffer, etc.
  • a membrane stabilizer eg, cholesterol
  • an isotonic agent eg, sodium chloride, glucose, glycerin, etc.
  • Antioxidants eg, tocopherol, ascorbic acid, glutathione, etc.
  • preservatives eg, chlorbutanol, parabens, etc.
  • the solvent used for manufacture of a vaccine composition may be sufficient as a solvent.
  • the vaccine composition can efficiently induce cellular immunity by cross-presenting the antigen.
  • a large amount of CTL can be induced.
  • inducing CTL means a control (ie, a mixture of an antigen and a substance that activates innate immunity) that has not been treated with the vaccine composition by the ELIspot method described in the present specification. In contrast, it means that a lot of spot formation is obtained.
  • the vaccine composition can induce humoral immunity.
  • antibodies such as IgG
  • humoral immunity means that the IgG antibody titer is higher than that of the control administered with the antigen.
  • the membrane destruction function promoting effect or the membrane destruction function promoting effect are expressed, and the antigen can be efficiently released into the cytosol.
  • cell immunity and CTL can be induced
  • the vaccine composition according to this embodiment is not particularly limited, and can be produced by various methods.
  • Specific methods for producing a vaccine composition include a dispersion preparation method, a mixed preparation method, a freeze-thaw-lyophilized preparation method, and the like.
  • methods described in International Publication No. 2015/079952 U.S. Patent Application Publication No. 2016/271246) can be appropriately taken into consideration.
  • the dispersion preparation method includes a step of mixing a pH-sensitive compound, an amphipathic substance, a substance that activates innate immunity, and an antigen. Specifically, a thin film containing the components of the adjuvant composition is formed on the wall of the glass container. Next, the antigen-containing solution is added to the glass container in which the thin film is formed, and the thin film is swollen at 5 to 35 ° C., and then the glass container is shaken. At this time, a vaccine composition is prepared by a method of vigorously stirring and dispersing using an emulsifier, a vortex mixer and ultrasonic waves.
  • a thin film containing a pH-sensitive compound and an amphiphilic substance is formed on the wall of the glass container, and then a solution containing an antigen and a substance that activates innate immunity is added to the glass container formed with the thin film. After swelling the thin film at 5-35 ° C., the glass container is shaken. At this time, a vaccine composition is prepared by a method of vigorously stirring using an emulsifier, a vortex mixer, and ultrasonic waves.
  • the solution containing the antigen and the solution containing the antigen and a substance that activates innate immunity can be the same as the following mixed preparation method or those prepared with reference.
  • the mixed preparation method includes a step of mixing a solution containing a pH-sensitive compound, a solution containing an amphiphile, a solution containing a substance that activates innate immunity, and a solution containing an antigen.
  • a vaccine composition is prepared by mixing an adjuvant composition dispersion and an antigen or a solution containing an antigen. You can get things.
  • the solution containing the antigen preferably contains the antigen and an aqueous solvent. Moreover, the additive may be included as needed. In addition, as an aqueous solvent, the aqueous solvent contained in the adjuvant composition mentioned above can be used.
  • the concentration of the antigen in the solution containing the antigen is appropriately set depending on the antigen species, and the molar concentration of the antigen is, for example, 32 mg / L to 10 g / L.
  • the mixing method of the above-mentioned adjuvant composition dispersion and antigen-containing solution is not particularly limited.
  • the obtained mixed liquid is preferably dispersed, and the dispersion can be performed using, for example, an emulsifier, a vortex mixer, an ultrasonic wave, or the like.
  • the freeze-thaw-lyophilized preparation method includes a step of freeze-thawing a solution obtained by a dispersion preparation method or a mixed preparation method to prepare a melt, and a step of freeze-drying the melt.
  • Step of preparing a melt The melt can be prepared by freezing and thawing a solution obtained by a dispersion preparation method or a mixed preparation method.
  • Freezing and thawing means lyophilizing a solution and then thawing the obtained dried product.
  • the lyophilization method is not particularly limited, but a method of sublimating water using liquid nitrogen, cooled methanol or the like is preferable.
  • the method for melting the dried product is not particularly limited, but a method of raising the temperature of the dried product obtained by cooling and a method of adding a solvent are preferred.
  • Step of freeze-drying This step is a step of freeze-drying the melt obtained above.
  • the freeze-drying method is not particularly limited as described above, but a method of sublimating water using liquid nitrogen, cooled methanol or the like is preferable.
  • Adjuvant compositions and immune checkpoint inhibitors are used in combination.
  • an adjuvant composition containing a pH-sensitive carrier and a substance that activates innate immunity is used so as to be administered in combination with an immune checkpoint inhibitor.
  • the administration order of the adjuvant composition and the immune checkpoint inhibitor is not particularly limited, and the adjuvant composition and the immune checkpoint inhibitor may be administered simultaneously, or may be administered with a time difference. Moreover, when administering after a time difference, an immune checkpoint inhibitor may be administered after administration of an adjuvant composition, and an adjuvant composition may be administered after administration of an immune checkpoint inhibitor.
  • An immune checkpoint inhibitor acts on an immune checkpoint receptor-ligand on T cells to obtain an effect. Since it is considered that an increase in the antitumor effect is exerted by administering an immune checkpoint inhibitor after inducing T cells, an adjuvant composition comprising a pH-sensitive carrier and a substance that activates innate immunity is provided. It is preferred to administer an immune checkpoint inhibitor after administration. Therefore, the adjuvant composition is preferably administered before the immune checkpoint inhibitor is administered. In the administration mode with a time difference, the administration route may be the same or different as long as the administration is performed with a time difference.
  • preferred forms of this embodiment comprise an adjuvant composition comprising an immune checkpoint inhibitor, an adjuvant composition used to be administered in combination and a pH-sensitive carrier and a substance that activates innate immunity, and an antigen. It is a vaccine composition.
  • the administration order of the vaccine composition and the immune checkpoint inhibitor is not particularly limited, and the vaccine composition and the immune checkpoint inhibitor may be administered simultaneously, or may be administered with a time difference. Moreover, when administering after a time difference, an immune checkpoint inhibitor may be administered after administering a vaccine composition, and a vaccine composition may be administered after administering an immune checkpoint inhibitor.
  • the vaccine composition is preferably administered before the immune checkpoint inhibitor is administered.
  • the administration route may be the same or different as long as the administration is performed with a time difference.
  • the adjuvant composition and the composition containing the immune checkpoint inhibitor are separately formulated.
  • Combination kit and the like.
  • a preferred form is a combination of the adjuvant composition and immune checkpoint inhibitor formulated separately. That is, in this embodiment, it is preferable that the drug kit is a combination of an adjuvant composition containing a pH-sensitive carrier and a substance that activates innate immunity and an immune checkpoint inhibitor.
  • the pH-sensitive carrier, the substance that activates innate immunity, and the immune checkpoint inhibitor are as described above.
  • the administration order of the adjuvant composition and the immune checkpoint inhibitor is not particularly limited, and the adjuvant composition and the immune checkpoint inhibitor may be administered at the same time or administered at a time difference. May be.
  • an immune checkpoint inhibitor may be administered after administration of an adjuvant composition, and an adjuvant composition may be administered after administration of an immune checkpoint inhibitor. It is preferable to administer an adjuvant composition and then administer an immune checkpoint inhibitor since an increase in the antitumor effect is more exhibited. With such an embodiment, a remarkable antitumor effect can be obtained.
  • the administration route may be the same or different as long as the administration is performed with a time difference.
  • a suitable form of the present embodiment is a pharmaceutical kit comprising a vaccine composition comprising an adjuvant composition containing a pH-sensitive carrier and a substance that activates innate immunity and an antigen, and an immune checkpoint inhibitor. It is. Yet another embodiment is a pharmaceutical kit that combines an adjuvant composition comprising a pH-sensitive carrier and a substance that activates innate immunity, an antigen, and an immune checkpoint inhibitor. According to the drug kit of the present invention, a high antitumor effect can be obtained.
  • the order of administration of the vaccine composition, the adjuvant composition and the antigen, and the immune checkpoint inhibitor is not particularly limited, and may be administered at the same time or may be administered with a time difference. .
  • an immune checkpoint inhibitor when administered at a time lag, an immune checkpoint inhibitor may be administered after administration of the vaccine composition or adjuvant composition and antigen, or a vaccine composition after administration of the immune checkpoint inhibitor, Alternatively, an adjuvant composition and antigen may be administered. It is preferable to administer a vaccine composition or an adjuvant composition and an antigen, and then administer an immune checkpoint inhibitor since an increase in the antitumor effect is exhibited more.
  • the drug kit is preferably a drug kit for cancer treatment or prevention.
  • the administration form in the case of co-administering an adjuvant composition and an immune checkpoint inhibitor is not particularly limited as long as an appropriate administration route, administration frequency and dosage are adopted, for example, (1) Adjuvant composition And a composition containing an immune checkpoint inhibitor, that is, administration as a single preparation, (2) the same administration route of two preparations obtained by separately formulating an adjuvant composition and an immune checkpoint inhibitor (3) Administration of two types of preparations obtained by separately formulating an adjuvant composition and an immune checkpoint inhibitor separately in the same route of administration, (4) Adjuvant composition and immunization Co-administration of two preparations obtained by separately formulating checkpoint inhibitors by different administration routes, (5) Ajuba Such as administration of at bets composition and the time difference in the two different administration routes preparations obtained immune checkpoint inhibitors are separately formulated, and the like.
  • a preferred mode of administration in combination administration is a method of administering an immune checkpoint inhibitor after administering an adjuvant composition or a vaccine composition.
  • Another aspect of the invention provides a subject in need of treatment or prevention with an effective amount of an adjuvant composition comprising a pH sensitive carrier and a substance that activates innate immunity, an effective amount of an immune checkpoint inhibitor, A method of treating or preventing a disease, comprising administering Also, other embodiments provide an effective amount of an adjuvant composition comprising a pH sensitive carrier and a substance that activates innate immunity and a vaccine composition comprising an antigen, and immune checkpoint inhibition to a subject in need of treatment or prevention. A method for treating or preventing a disease, comprising administering an effective amount of the agent.
  • the disease is preferably cancer.
  • the above subject is preferably a mammal, particularly preferably a human.
  • an adjuvant composition or a vaccine composition and an immune checkpoint inhibitor are administered at a time interval, it is necessary to administer the immune checkpoint inhibitor at an interval sufficient to enhance the antitumor effect.
  • Specific administration intervals are appropriately determined according to individual cases in consideration of patient symptoms, age, sex, and the like.
  • the vaccine composition and the immune checkpoint inhibitor are preferably administered in a certain cycle.
  • the administration cycle it is preferable to appropriately adjust the administration cycle so as to be suitable for combined use.
  • Specific administration frequency, dose, infusion administration time, administration cycle, and the like are appropriately determined according to individual cases in consideration of patient symptoms, age, sex, and the like.
  • an immune checkpoint inhibitor is conventionally known, and for example, it is administered once to several times a day in the range of 2 to 3 mg / kg / day.
  • an adjuvant composition and an immune checkpoint inhibitor are used in combination, depending on the route of administration normally administered, the same dose as that usually administered alone or lower (for example, when administered alone) 0.10 to 0.99 times the maximum dose).
  • the dosage of the adjuvant composition is appropriately determined according to the individual case in consideration of the patient's symptoms, age, sex and the like.
  • the dose (mg / kg / Day) ratio of the immune checkpoint inhibitor and the adjuvant composition is also appropriately determined according to individual cases in consideration of the patient's symptoms, age, sex, etc. .
  • the administration method of the adjuvant composition, vaccine composition and immune checkpoint inhibitor is not particularly limited and is oral administration; intravenous injection, intraarterial injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intraperitoneal, intramuscular injection, medulla
  • parenteral administration such as intracavitary injection, transdermal administration, and percutaneous absorption.
  • parenteral route particularly subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection, or intravenous injection is preferred.
  • a vaccine composition in which an antigen is not carried in or contained in an adjuvant composition but is mixed independently is administered locally, specifically, in the form of subcutaneous administration, intradermal administration, or intramuscular administration. Is preferred.
  • an immune checkpoint inhibitor is intraperitoneal administration.
  • cell E ⁇ G7-OVA cells (ATCC number CRL-2113, hereinafter also simply referred to as EG7 cells) were cultured and used from ATCC.
  • Cell culture The cells were cultured using an incubator (MCO20AIC) set at 5% CO 2 and 37 ° C.
  • sample preparation etc.
  • Penicillin 100 units / mL
  • streptomycin 100 mg / mL
  • FBS was additionally added as necessary to obtain a RPMI medium containing 10% serum.
  • Oligonucleotides containing CpG motifs were dissolved to 1 ⁇ g / ⁇ L using sterile water (endotoxin free) which is an attached dissolution solution to prepare a temporary solution.
  • Anti-PD-1 antibody administration solution The administration solution of the anti-PD-1 antibody was obtained by diluting the purchased antibody stock solution 10-fold with PBS (anti-PD-1 antibody 0.1 g / L).
  • Dissolution test Leakage (dissolution rate) measurement Leakage (dissolution rate) Kono et al. Bioconjugate Chem. According to the method described in 2008 19 1040-1048, evaluation was performed using EYPC liposomes encapsulating Pyranine as a fluorescent substance and DPX as a quencher.
  • the elution rate was calculated with 0% for the EYPC liposome dispersion alone and 100% for 30 ⁇ L of 10-fold diluted Triton-X100. Specifically, the dissolution rate was calculated according to the following formula. In the following formula, the measured fluorescence intensity is L, the fluorescence intensity of only the EYPC liposome dispersion containing the fluorescent substance is L 0 , and the fluorescence intensity when Triton-X100 is added is L 100 .
  • the adjuvant composition has an effect of promoting the membrane destruction function.
  • test substances used were OVA and CpG-ODN mixture (OVA + CpG-ODN), OVA, CpG-ODN and pH sensitive carrier mixture (vaccine composition) (OVA + CpG-ODN + pH sensitive carrier), and OVA and pH sensitive carrier mixture ( OVA + pH sensitive carrier).
  • the sample used for administration was prepared using the administration solution prepared according to “Preparation of administration solution”. Further, a mixture of OVA, CpG-ODN and pH-sensitive carrier was obtained by adding a temporary solution of OVA to the adjuvant composition and mixing with ultrasound.
  • mice were euthanized on the seventh day after the final administration by immunization of the mice, and the spleen was removed. After adding 3.0 mL of 10% serum-containing RPMI medium, the spleen was treated with a BD Falcon cell strainer to obtain a cell suspension. After hemolysis operation using RBC lysis buffer, the cells were washed with RPMI medium containing 10% serum. The cells were dispersed with RPMI medium containing 10% serum, and then the number of cells was counted to obtain a spleen cell dispersion.
  • the ELIspot method was performed using a Mouse IFN ⁇ ELISPOT Set.
  • the prepared plate was washed with 10% serum-containing RPMI medium, 200 ⁇ L of 10% serum-containing RPMI medium was added, and the plate was allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours for blocking. After the plate was washed with 10% serum-containing RPMI medium, 100 ⁇ L of 10% serum-containing RPMI medium containing 40 ⁇ g / mL of OVA peptide was added to the plate.
  • the plate was seeded with 2 ⁇ 10 6 cells / well of a spleen cell dispersion, and finally adjusted to a total volume of 200 ⁇ L per well using 10% serum-containing RPMI medium. Then, it culture
  • the plate was colored according to the protocol described in Mouse IFN ⁇ ELISPOT Set and AEC Substrate Set.
  • the mixture of OVA and CpG-ODN (FIG. 3A) had a small number of spots, and only a small number of CTLs could be induced.
  • the mixture of OVA, CpG-ODN and pH-sensitive carrier (FIG. 3B) formed many spots and was able to induce many CTLs. Therefore, the inclusion of the adjuvant composition has been shown to lead to the induction of numerous CTLs. It is considered that a large number of CTLs were induced as a result of inducing antigen presentation by a large number of MHC class I molecules on antigen-presenting cells matured in a pH-sensitive carrier.
  • mice were divided into 7 groups. Group 1: No treatment, Group 2: OVA administration, Group 3: OVA and anti-PD-1 antibody administration, Group 4: OVA and CpG-ODN administration, Group 5: OVA, CpG-ODN and pH sensitive carrier (in the figure, Group 6: OVA and CpG-ODN and anti-PD-1 antibody administration, Group 7: OVA, CpG-ODN and pH sensitive carrier, and anti-PD-1 antibody administration.
  • the sample used for administration was prepared using the administration solution prepared according to “Preparation of administration solution”.
  • the mixture of OVA, CpG-ODN and pH-sensitive carrier used was a vaccine composition obtained by adding a temporary solution of OVA to the adjuvant composition and mixing with ultrasound.
  • the administration of anti-PD-1 antibody (Group 3, 6 and 7) shall be performed by intraperitoneally injecting the administration solution of anti-PD-1 antibody at 500 ⁇ L / shot, according to the schedule of Day 8, Day 15, Day 22. It was supposed to be implemented three times. Since there are large individual differences, one group consisted of 5 animals.
  • the pH-sensitive carrier was amphiphile: 2 nmol / head, pH-sensitive compound: 3.2 nmol / head.
  • the substance that activates innate immunity was 2 ⁇ g (0.284 nmol) / head.
  • the antigen was 16 ⁇ g / head using OVA as a model antigen.
  • the tumor (cancer) size was determined by measuring the major axis a and minor axis b of the tumor using a digital caliper, and calculating the volume using the formula (1). Individuals who reached the endpoint were treated for euthanasia.
  • FIG. 4 (A) shows the results of groups 1 to 5 and 7.
  • FIG. 4 (A): Group 2 Compared with OVA alone (FIG. 4 (A): Group 2) or a mixture of OVA and CpG-ODN (FIG. 4 (A): Group 4), a group administered with a mixture of OVA, CpG-ODN and pH sensitive carrier (FIG. 4 (A): Group 5) was able to slow down the rate of tumor growth.
  • the mixture of OVA, CpG-ODN and pH-sensitive carrier could induce a large amount of CTL having a function of attacking the tumor in the living body as shown in FIG. It is thought that it was made. Therefore, the inclusion of a vaccine composition comprising OVA, CpG-ODN and a pH sensitive carrier has been shown to have a high anti-tumor effect.
  • the combined use of the vaccine composition containing OVA, CpG-ODN and a pH-sensitive carrier and the anti-PD-1 antibody has a strong anti-tumor effect It was shown to bring Therefore, it can be said that the combined use of the vaccine composition containing OVA, CpG-ODN and pH-sensitive carrier and the anti-PD-1 antibody acted synergistically to produce a strong anti-tumor effect. Since the anti-PD-1 antibody reduced the immune evasion ability of the tumor, a large amount of CTL induced by the adjuvant composition was able to attack the tumor, and it is considered that a particularly high antitumor effect was obtained.
  • FIG. 4 (B): Group 6 The combined use of an anti-PD-1 antibody and a substance that activates innate immunity was able to confirm the antitumor effect as the tumor growth rate slowed down from Day 10, but in Day 20, The tumor volume increased again and had only a small effect compared to the combined use of the anti-PD-1 antibody and the adjuvant composition (FIG. 4 (B): Group 7). It is considered that a substance that activates innate immunity alone could induce only a small amount of CTL and could not obtain a large antitumor effect. 5A to 5C show the state of the tumor of each group of mice. FIG.
  • FIG. 5 (A) shows 3 groups of mice
  • FIG. 5 (B) shows 6 groups of mice
  • FIG. 5 (C) shows 7 groups of mice. It can also be seen from the photograph in FIG. 5 that the combined use with the adjuvant composition and the anti-PD-1 antibody has a very high antitumor effect.
  • the adjuvant composition of the present invention showed the best combination effect in combination with the anti-PD-1 antibody.
  • Adjuvant compositions containing innate immunity-activating substances and pH-sensitive carrier micelles can induce a large amount of CTL, and thus have a large combined effect on immune checkpoint inhibitors, especially high It was confirmed that an antitumor effect can be realized.
  • the combination of an adjuvant composition and an immune checkpoint inhibitor has good compatibility, and is expected to contribute to the realization of more effective cancer immunotherapy.

Abstract

【課題】より抗腫瘍効果の高い薬剤の組み合わせを提供する。 【解決手段】免疫チェックポイント阻害剤と、組み合わせて投与されるように用いられる、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物。

Description

アジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物並びに薬剤キット
　本発明はアジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物に関する。
　近年、免疫系を疾患の治療に応用する、免疫療法が注目を集めている。特に、がんを対象とした、がん免疫療法は大きな期待を集めており、より効果の高いがん免疫療法の実現が求められている。
　免疫系の機能は、一般に、液性免疫および細胞性免疫という２種の機構を介して発現する。細胞性免疫は、がん細胞の殺傷・排除を行う能力を有しているため、がん免疫療法において重要な働きとなることが判明している。細胞性免疫を構成する細胞の中でも、細胞傷害性Ｔ細胞（以下、単にＣＴＬとも称する）は、がん細胞を殺傷する主な働きを担っている。そのため、多量のＣＴＬの誘導は、効果の高いがん免疫療法に必要な要因となっている。
　ＣＴＬの誘導は、通常、以下のように発現する。すなわち、ウイルス感染細胞やがん細胞で産生されるタンパク質等の内因性抗原が、ユビキチン化された後、プロテアソームによってペプチドにまで分解される。分解されたペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子と結合し、得られた複合体が抗原提示細胞の表面でＣＤ８陽性Ｔ細胞に提示されて、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が活性化される。そして、活性化されたＣＤ８陽性Ｔ細胞が、ＣＴＬへと分化する。
　しかしながら、ＭＨＣクラスＩ分子での抗原提示は、内因性抗原に対して発生するプロセスであるため、細胞の外にある外因性抗原に対しては、発生しない。なお、外因性抗原は、エンドサイトーシスにより抗原提示細胞に取り込まれ、エンドソーム内でタンパク分解酵素により消化されて、ペプチド断片に分解される。当該ペプチド断片は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に提示され、抗体の産生に利用される。そのため、外因性抗原を用いてＣＴＬを誘導することは困難であることがよく知られている。
　そこで近年では、外因性抗原を用いて積極的にＣＴＬを誘導させるクロスプレゼンテーションの検討が多くなされている。
　外因性抗原は、上述のように、抗原提示細胞内のエンドソーム内で分解されて、ＭＨＣクラスＩ分子の抗原提示には利用されない。クロスプレゼンテーションでは、外因性抗原を細胞内のサイトゾルへ送達し、外因性抗原を内因性抗原のように作用させることで、外因性抗原をＭＨＣクラスＩ分子と結合させて抗原提示を行う。これにより、外因性抗原であってもＣＴＬを誘導させることができる。
　また、自然免疫を活性化する刺激を有する物質（以下、単に自然免疫を活性化する物質とも称する）は、抗原提示細胞に対して成熟化を誘起し、共刺激分子やＭＨＣクラスＩ分子の産生を増強させる。これにより、抗原提示細胞をＣＴＬの誘導が可能な状態へと誘起することができる。そのため、外因性抗原をサイトゾルへ送達する技術と、自然免疫を活性化する物質とを合わせ、多量のＣＴＬを誘導することが期待される。
　例えば、国際公開第２０１５／０７９９５２号において、膜破壊機能促進効果を通じて抗原をサイトゾルへ送達することができるｐＨ感受性担体と、自然免疫を刺激する物質とを合わせた、アジュバント組成物が、ＣＴＬへの誘導を多量に発生させることが開示されている。
　さらに、ＣＴＬは、ターゲットとなる細胞を殺傷する働きを担っているため、多量のＣＴＬの誘導が効果の高いがん免疫療法につながることが報告されている（例えば、Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　２０１３　１９（８）２２２４－３１）。
　一方、異なる免疫システムを利用することで、薬剤の組み合わせによる抗腫瘍効果の増大を期待して、２つの薬剤を組み合わせるがん免疫療法についても検討がなされている。例えば、Ｍａｎｇｓｂｏ　ＳＭ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ　２０１０；３３（３）：２２５－３５では、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストである、ＣｐＧモチーフを含む短鎖ＤＮＡおよび免疫チェックポイント阻害剤である抗ＰＤ－１抗体を組み合わせて投与することで、担癌マウスの生存期間が延びることが示されている。
　免疫療法において作用機序の異なる薬剤の併用は、有用であると考えられる。しかしながら、作用機序の異なる薬剤を併用したとしても必ずしも抗腫瘍効果の増強が得られるとは限らず、より抗腫瘍効果の高い薬剤の組み合わせが求められている。
　このため、本発明は、より抗腫瘍効果の高い薬剤の組み合わせを提供することを目的とする。
　本発明者は、ＣＴＬを誘導する薬剤として、ｐＨ感受性担体に自然免疫を活性化する物質を加えたアジュバント組成物と、免疫チェックポイント阻害剤との組み合わせにより、特に高い抗腫瘍効果を得られることを明らかにし、本発明を完成させるに至った。
　本発明の好適な形態は以下のとおりである。
　（１）免疫チェックポイント阻害剤と、組み合わせて投与されるように用いられる、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物。
　（２）免疫チェックポイント阻害剤が投与される前に投与される、（１）に記載のアジュバント組成物。
　（３）免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体および抗ＣＴＬＡ－４抗体からなる群から選択される少なくとも１種である、（１）または（２）に記載のアジュバント組成物。
　（４）ｐＨ感受性担体が、ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質を含み、ｐＨ感受性化合物が、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種であり、両親媒性物質が、炭素数１０～１２のホスファチジルコリン、炭素数１２～１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６～１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα－トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種である、（１）～（３）のいずれかに記載のアジュバント組成物。
　なお、本明細書において、両親媒性物質における「炭素数」とは、両親媒性物質の疎水部を構成する脂肪酸成分（アシル基）の炭素数を意味する。アシル基が２以上存在する場合には、合計数ではなく、１のアシル基の炭素数を指す。
　（５）膜破壊機能促進効果を発現する、（４）に記載のアジュバント組成物。
　（６）自然免疫を活性化する物質がＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドである、（１）～（５）のいずれかに記載のアジュバント組成物。
　（７）（１）～（６）のいずれかに記載のアジュバント組成物および抗原を含む、ワクチン組成物。
　（８）ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物と、免疫チェックポイント阻害剤と、を組み合わせた薬剤キット。
　（９）アジュバント組成物を投与し、その後免疫チェックポイント阻害剤を投与する、（８）に記載の薬剤キット。
　（１０）癌治療または予防のための薬剤キットである、（８）または（９）に記載の薬剤キット。
　（１１）免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体および抗ＣＴＬＡ－４抗体からなる群から選択される少なくとも１種である、（８）～（１０）のいずれかに記載の薬剤キット。
　（１２）ｐＨ感受性担体が、ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質を含み、ｐＨ感受性化合物が、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種であり、両親媒性物質が、炭素数１０～１２のホスファチジルコリン、炭素数１２～１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６～１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα－トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種である、（８）～（１１）のいずれかに記載の薬剤キット。
　（１３）アジュバント組成物が、膜破壊機能促進効果を発現する、（１２）に記載の薬剤キット。
　（１４）自然免疫を活性化する物質がＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドである、請求項（８）～（１３）のいずれかに記載の薬剤キット。
　（１５）治療または予防を必要とする対象者に、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物ならびに抗原を含むワクチン組成物の有効量を投与した後に、免疫チェックポイント阻害剤の有効量を投与することを含む、疾患の治療または予防方法。
　（１６）疾患が癌である、（１５）に記載の方法。
図１は、アジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物の模式図である。 図２は、ワクチン組成物によって、ＣＴＬの誘導が増大する、想定されるメカニズムを示す模式図である。 図３は、ＥＬＩｓｐｏｔ法によるＣＴＬの誘導評価を示す図である。（Ａ）はオボアルブミン（以下、単にＯＶＡとも称する）およびＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを投与した群であり、（Ｂ）はＯＶＡ、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドおよびｐＨ感受性担体を投与した群であり、（Ｃ）はＯＶＡとｐＨ感受性担体を投与した群の結果である。 図４は、マウス担癌実験系における抗腫瘍効果の評価を示す。（Ａ）はアジュバント組成物の抗腫瘍効果、およびアジュバント組成物と免疫チェックポイント阻害剤との併用効果を調べた結果であり、（Ｂ）は併用効果の詳細を検証した結果である。 図５は、がん細胞接種２１日後における各群マウスの腫瘍の様子を示す。（Ａ）は３群のマウスであり、（Ｂ）は６群のマウスであり、（Ｃ）は７群のマウスである。
　以下、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。
　本明細書において、範囲を示す「Ｘ～Ｙ」は、ＸおよびＹを含み、「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、本明細書において、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０℃以上２５℃以下）／相対湿度４０％ＲＨ以上５０％ＲＨ以下の条件で行う。
　以下、図面を参照しながら、アジュバント組成物およびワクチン組成物について説明するが、本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載に基づいて定められるべきであり、以下の形態のみに制限されない。なお、図面の寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。
　図１によれば、アジュバント組成物４は、両親媒性物質１と、ｐＨ感受性化合物２と、自然免疫を活性化する物質３と、を含む。また、図１において、ｐＨ感受性担体７は、両親媒性物質１およびｐＨ感受性化合物２から構成される。
　図１に示すように、一実施形態によれば、自然免疫を活性化する物質３は、両親媒性物質１の構成する疎水性部分に、ｐＨ感受性化合物２とともに会合する。この場合、アジュバント組成物４は、アジュバント複合体ともいうことができる。また、別の一実施形態によれば、自然免疫を活性化する物質３は、両親媒性物質１およびｐＨ感受性化合物２を含むｐＨ感受性担体と独立して存在する。
　また、ワクチン組成物６は、アジュバント組成物４と、抗原５とを含む。図１に示されるように、抗原５は、上記２つの形態に係るアジュバント組成物４に包含されてもよいし、独立に存在してもよい。このうち、特にアジュバント複合体４に抗原５が包含されるワクチン組成物６については、ワクチン複合体ともいうことができる。
　本明細書において、「アジュバント組成物」とは、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むものを意味し、その形態について特に制限はない。すなわち、「アジュバント組成物」は、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を混合したものであってもよいし、ｐＨ感受性担体に自然免疫を活性化する物質を担持または包含したもの（アジュバント複合体）であってもよく、本明細書においては両者をまとめて「アジュバント組成物」と称する。
　また、本明細書において、「ワクチン組成物」とは、アジュバント組成物および抗原を含むものを意味し、その形態については特に制限はない。すなわち、「ワクチン組成物」には、アジュバント組成物の構成要素および抗原からなる群から選択される２種以上が混合されたものでもあってもよいし、アジュバント複合体に抗原を担持または包含したもの（ワクチン複合体）であってもよく、本明細書においては両者をまとめて「ワクチン組成物」と称する。
　ワクチン組成物６によって、ＣＴＬの誘導が増大する（図３（Ｂ））。この理由は必ずしも明らかではないが、以下のような理由によるものと推察される。
　まず、自然免疫を活性化する物質により、抗原提示細胞（図２においては、樹状細胞）が成熟化する（図示せず）。また、抗原５とｐＨ感受性担体７が、エンドサイトーシスにより樹状細胞８内に取り込まれた後、エンドソーム９内に移行する。ｐＨ感受性担体によって、抗原がエンドソーム内からサイトゾルへ送達され、樹状細胞のプロセシングを受ける。その後、断片化された抗原がＭＨＣクラスＩ分子と結合し、細胞表面に抗原提示される。成熟化した樹状細胞においては、共刺激分子やＭＨＣクラスＩ分子の産生が増強されているため、ＣＴＬの誘導が増大すると考えられる。樹状細胞の成熟化と抗原のサイトゾルへの送達は、必ずしも同時に発生させる必要はないため、自然免疫を活性化する物質およびｐＨ感受性担体は、必ずしも複合体の形態でなくてもよく、アジュバント組成物内で別々に存在していてもよい。また、ワクチン組成物において、抗原は、自然免疫を活性化する物質およびｐＨ感受性担体と別々に存在していてもよい。
　なお、ｐＨ感受性担体によって、抗原がエンドソーム内からサイトゾルへ送達される機構については後述する。
　＜アジュバント組成物＞
　アジュバント組成物は、ｐＨ感受性担体（以下、単に「担体」、「会合体」、または「複合体」と称することがある）と、自然免疫を活性化する物質と、を含む。本発明のアジュバント組成物によれば、高い抗腫瘍効果を得ることができる。
　［ｐＨ感受性担体］
　ｐＨ感受性担体は、ｐＨに感受性を有し、ｐＨが酸性になると細胞内の抗原をサイトゾルに輸送できる機能を有する。ｐＨ感受性担体は、ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質を含む。
　以下、ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質を含む、ｐＨ感受性担体について詳細に説明する。
　（ｐＨ感受性担体の構造）
　ｐＨ感受性担体は、生理的ｐＨ以上において、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とが会合して形成されているものと考えられる。より詳細には、ｐＨ感受性担体は、ｐＨ感受性化合物が、両親媒性物質の構成する疎水性部分に会合して形成されているものと考えられる。なお、ｐＨ感受性担体の当該会合形式は推測であり、ｐＨ感受性担体は、当該会合形式には限定されない。
　（膜破壊機能促進効果）
　ｐＨ感受性担体は、膜破壊機能を有することが好ましい。
　「膜破壊機能」とは、溶出性試験において溶出を起こす機能を意味する。ここで、本明細書における溶出性試験とは、消光物質と蛍光物質とを含む水溶液を内包したリポソーム（分散液）と、評価サンプル分散液とを、所定のｐＨに調整した水溶液に添加し、当該水溶液を３７℃で９０分間あるいは３０分間インキュベーションした後、当該水溶液の蛍光を測定する試験である。当該方法により、リポソームから溶出した蛍光物質量が測定することができ、ｐＨ感受性担体のリポソームの膜破壊機能を確認することができる。なお、溶出性試験については、後述する実施例で詳細に説明する。
　また、「膜破壊機能促進効果を発現する」とは、（１）溶出性試験において、生理的ｐＨにおける溶出率よりも生理的ｐＨ未満の所定のｐＨにおける溶出率が上昇し、なおかつその上昇幅がｐＨ感受性化合物単独で実験した場合の上昇幅よりも大きいこと、および、（２）当該生理的ｐＨ未満の所定のｐＨでの溶出性試験において、ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質がｐＨ感受性担体を形成したときの溶出率が、ｐＨ感受性化合物単独の溶出率および両親媒性物質単独の溶出率の和より大きいこと、の両者を満たすことを意味する。より具体的には、膜破壊機能促進効果を発現するとは、ｐＨ７．４とｐＨ５．０またはｐＨ４．５との溶出性試験において、ｐＨ感受性担体の溶出率Ｌｃ、ｐＨ感受性化合物単独の溶出率Ｌａ、および両親媒性物質単独の溶出率Ｌｂが、下記の関係を双方満たすものをいう。すなわち、上記（１）が、下記式（１）で表され、上記（２）が下記式（２）で表される。なお、下記式中、ｐＨ７．４の溶出率を、それぞれ、Ｌｃ７．４、Ｌａ７．４、Ｌｂ７．４と表し、ｐＨ５．０または４．５の溶出率を、それぞれ、Ｌｃｘ、Ｌａｘ、Ｌｂｘと表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　上記式（１）において、Δは、０を超えていればよいが、５以上であることが好ましく、１０以上であることがより好ましく、３０以上であることがさらに好ましい。なお、Δは大きければ大きいほど好ましく、その上限は特に限定されないが、通常１００未満である。また、上記式（２）において、Δ’は、０を超えていればよいが、５以上であることが好ましく、１０以上であることがより好ましく、１５以上であることがさらに好ましい。なお、Δ’は大きければ大きいほど好ましく、その上限は特に限定されないが、通常１００未満である。
　本発明の一実施形態において、上記式（１）および上記式（２）におけるΔおよびΔ’が、それぞれ５以上であり、かつ、胆汁酸および脂質を含むｐＨ感受性担体が好ましい。
　ここで、本明細書において「生理的ｐＨ」とは、正常組織や正常体液におけるｐＨを意味する。生理的ｐＨは、通常、７．４であるが、正常組織や正常体液によって若干（±０．１）異なる。また、「生理的ｐＨ未満の所定のｐＨ」とは、ｐＨ７．４未満であればよく、好ましくはｐＨ３．０以上、ｐＨ７．４未満、より好ましくはｐＨ４．０以上、ｐＨ７．３未満、さらに好ましくはｐＨ４．５以上、ｐＨ７．０未満である。
　ｐＨ感受性担体が膜破壊機能促進効果を発現するメカニズムは明らかではないが、下記のように推測される。なお、本発明は、下記推測によって限定されるものではない。
　ｐＨ感受性担体は、周辺環境が生理的ｐＨ未満となった場合には、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との会合形態が変化し、その結果、膜破壊機能促進効果を有するものと考えられる。例えば、ｐＨ感受性担体と、生体膜（例えば、細胞膜、小胞膜など）とが存在している系で、ｐＨが生理的ｐＨ未満となった場合、ｐＨ感受性担体の会合形態が変化し、生体膜と接触した後、当該変化に誘起されて、生体膜の膜構造変化も生じるものと推測される。すなわち、ｐＨ感受性担体が生体膜の膜構造変化を誘起する。これは、ｐＨが弱酸性に変化することで、ｐＨ感受性担体中のｐＨ感受性化合物が該担体の構造中で不安定化し、その結果、ｐＨ感受性担体が、系内に存在する生体膜と再配列し、膜破壊機能促進効果が発現すると考えられる。また、換言すれば、ｐＨ感受性化合物は、ｐＨが弱酸性に変化すると、プロトン化により疎水的な会合への溶解性を変化させる分子であると考えられる。つまり、ｐＨ感受性化合物を含む疎水的な会合は、弱酸性環境に応答し、機能を発現することが可能であるといえる。なお、「膜破壊」とは、このような膜構造の変化を称するものであり、膜構成成分が全て分離または分解しなくてもよい。このような「膜破壊」が生じることにより、生体膜（例えば、エンドソーム）の膜内部に含有されうる成分が生体膜の外部（例えば、サイトゾル）に溶出等する。
　ｐＨ感受性担体は、溶出性試験における溶出率がｐＨ７．４で２０％未満であり、かつ、ｐＨ４．０で２０％より大きいものであることが好ましい。また、溶出性試験における溶出率がｐＨ６．５で２０％未満であり、かつ、ｐＨ４．０で２０％より大きいものであることがより好ましい。また、上記においてｐＨ７．４またはｐＨ６．５での溶出率が、１５％以下であることがより好ましく、１０％以下であることがさらに好ましい。また、ｐＨ４．０での溶出率が、４０％以上であることがより好ましく、５０％以上であることがさらに好ましい。ｐＨ感受性担体の溶出率が、上記のようになることで、弱酸性ｐＨにおける膜破壊機能促進効果の発現がより発揮される。
　また、ｐＨ感受性担体は、膜破壊機能促進効果とともに、膜融合機能促進効果を発現しうる。
　本発明において、「膜融合機能」とは、膜融合試験において膜融合を起こす機能を意味する。ここで、本明細書における膜融合試験とは、２種類の蛍光物質を二分子膜に組み込んだリポソーム（分散液）と、評価サンプル分散液とを、所定のｐＨに調整した水溶液に添加し、当該水溶液を３７℃で６０分間インキュベーションした後、当該水溶液の蛍光を測定する試験である。当該方法により、リポソーム中に組み込まれた２種類の蛍光物質のエネルギー共鳴移動の変化を測定することができ、ｐＨ感受性担体の膜融合機能を確認することができる。なお、膜融合試験については、国際公開第２０１５／０７９９５２号の［０１８９］～［０１９４］（米国特許出願公開第２０１６／０２７１２４６号明細書、［０３０７］～［０３１２］）に記載の方法を採用する。
　また、「膜融合機能促進効果を発現する」とは、膜融合試験において、生理的ｐＨにおける融合率よりも生理的ｐＨ未満の所定のｐＨにおける融合率が上昇し、なおかつその上昇幅がｐＨ感受性化合物単独で実験した場合の上昇幅よりも大きいこと、を満たすことを意味する。より具体的には、膜融合機能促進効果を発現するとは、ｐＨ７．４とｐＨ５．０との膜融合試験において、ｐＨ感受性担体（ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との複合体）の融合率Ｒｃ（％）が、ｐＨ感受性化合物単独の融合率Ｒａ（％）と、下記式（３）の関係を満たすものをいう。なお、下記式中、ｐＨ７．４の融合率を、それぞれ、Ｒｃ７．４、Ｒａ７．４と表し、ｐＨ５．０の融合率を、それぞれ、Ｒｃｘ、Ｒａｘと表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　上記式（３）においてΔＲは、０を超えていればよいが、２以上であることが好ましく、５以上であることがより好ましく、１０以上であることがさらに好ましい。
　上記式（３）においてΔＲが２以上であるｐＨ感受性担体であって、該担体は胆汁酸と脂質を含むものが好ましい。
　ｐＨ感受性担体は、弱酸性ｐＨ（生理的ｐＨ未満の所定のｐＨ）において、膜融合機能促進効果を発現する。これらのメカニズムは明らかではないが、上記の膜破壊機能促進効果と同様のメカニズムであると考えられる。なお、本発明は、当該推測によって限定されるものではない。
　すなわち、本発明のｐＨ感受性担体は、周辺環境が生理的ｐＨ未満となった場合、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との会合形態が変化し、系内に存在する生体膜と再配列することで、膜融合するものと推測される。この際、膜融合は互いに親和性のある成分どうしで再配列するため、生体膜と親和性がない、または低い成分（例えば、抗原）は、再配列される膜から排除、放出される。
　上述のように、通常、抗原は、生体膜の一種であるエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）に取り囲まれ、細胞（抗原提示細胞等）に取り込まれる。その後、プロトンポンプの作用によってエンドソーム内部のｐＨが低下する。さらに、エンドソームは、加水分解酵素を含むリソソームと融合して、抗原は分解される（その後、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に抗原提示されうる）。このため、ほとんどの抗原はサイトゾル内にデリバリーされない。
　これに対して、ｐＨ感受性担体を使用すると、抗原（例えば、外因性抗原）をサイトゾルにデリバリーすることができる。より詳細には、抗原がｐＨ感受性担体とともにエンドソームに取り囲まれ、細胞に取り込まれると、同様にして、ｐＨが低下した環境に導かれる。そして、ｐＨの低下（酸性化）に伴い、ｐＨ感受性化合物がｐＨ感受性担体を不安定化させ、エンドソームとｐＨ感受性担体との間で膜の再配列が起こる。その結果、ｐＨ感受性担体による膜破壊機能（場合によっては膜融合機能とともに発現する膜破壊機能）が生じる。この膜破壊機能（または膜融合機能および膜破壊機能）に伴い、抗原がエンドソームからサイトゾルにデリバリーされうる。なお、上記メカニズムによれば、原則として抗原はｐＨ感受性担体とともにエンドソームに取り込まれさえすればサイトゾルへの輸送が可能となりうることから、抗原とｐＨ感受性担体とを混合した組成物の形態で使用されても、抗原がｐＨ感受性担体に担持または包含された形態で使用されてもよいことが理解される。
　（ｐＨ感受性化合物）
　ｐＨ感受性化合物は、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。ｐＨ感受性化合物の塩としては、特に制限されないが、リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩；マグネシウム、カルシウム、バリウム等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩などが挙げられる。これらのｐＨ感受性化合物は、単独で用いても、２種以上を併用して用いてもよい。
　本発明の一実施形態によれば、ｐＨ感受性化合物は、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。
　また、本発明の別の一実施形態によれば、ｐＨ感受性化合物は、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましく、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、グリチルリチン酸またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種であることがより好ましい。
　ｐＨ感受性化合物として好ましく用いられるデオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸およびグリコデオキシコール酸は、胆汁酸と総称される。胆汁酸は、代表的なステロイド誘導体として１９２０年代以前から知られており、細菌学の分野において利用されている。胆汁酸はヒトの生体内においてコレステロールや脂質、脂溶性ビタミンと複合体を形成し、その吸収を補助する働きを有している。また、物理化学的な性質から脂質やタンパク質、疎水的な材料との複合体を形成することができるため、タンパク質の分離精製や可溶化剤、乳化剤として古くから利用されている。最近ではワクチンの製造工程の用途、胆汁酸トランスポーターを介在させることによる薬剤の吸収促進剤としても注目されている。特に、デオキシコール酸ナトリウム（別名デスオキシコール酸ナトリウム）とウルソデオキシコール酸（別名ウルソデスオキシコール酸）はヒトへの注射が可能な医薬品添加物として実績を有しており、優れた安全性が認められている。そのため、ｐＨ感受性化合物として、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸またはその塩（例えば、ナトリウム塩）を用いることがさらに好ましく、デオキシコール酸またはその塩（例えば、ナトリウム塩）を用いることが特に好ましい。
　ｐＨ感受性化合物は、両親媒性物質１００ｍｏｌに対して、１０ｍｏｌ以上の割合で含有されることが好ましく、１０～６４０ｍｏｌの割合で含有されることがより好ましく、２０～３２０ｍｏｌの割合で含有されることがさらに好ましく、２０～１６０ｍｏｌの割合で含有されることが特に好ましい。
　（両親媒性物質）
　両親媒性物質は、炭素数１０～１２のホスファチジルコリン、炭素数１２～１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６～１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα－トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。これらの両親媒性物質は、単独で用いても、２種以上を併用して用いてもよい。
　なお、本明細書において、両親媒性物質における「炭素数」とは、両親媒性物質の疎水部を構成する脂肪酸成分（アシル基）の炭素数を意味する。アシル基が２以上存在する場合には、合計数ではなく、１のアシル基の炭素数を指す。例えば、ジラウロイルホスファチジルコリンの場合、２つのラウリン酸成分を含むが、ジラウロイルホスファチジルコリンの炭素数とは、そのうちの１のラウリン酸成分の炭素数、すなわち１２を指す。ホスファチジルコリンの疎水部を構成する炭素数は１０～１２と適当な長さであることで、両親媒性脂質がミセル形成能を有するとともに膜に融合しやすくなる（国際公開第２０１３／１８０２５３号、図８）。
　炭素数１０～１２のホスファチジルコリンとしては、飽和のアシル基を有するジアシルホスファチジルコリンであることが好ましく、例えば、ジデカノイルホスファチジルコリン（ＤＤＰＣ；１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ；１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン）が挙げられる。これらのうち、ホスファチジルコリンとしては、天然由来または公知の方法で合成したものでもよく、また市販のものを用いることができる。ホスファチジルコリンの疎水部を構成する炭素数は１０～１２と適当な長さであることで、両親媒性脂質がミセル形成能を有するとともに膜の再配列を誘起しやすくなる。
　炭素数１２～１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルとしては、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）、ポリオキシエチレンソルビタンミリスチン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノミリステート）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンパルミテート）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）等が挙げられる。ポリオキシエチレンの重合度としては、特に制限されないが、ソルビタンに付加したポリオキシエチレン鎖の合計した重合度が、１０～２００であることが好ましく、１５～１００であることがより好ましく、２０～５０であることがさらに好ましい。ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルは、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルの市販品としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル）、Ｔｗｅｅｎ４０（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル）、Ｔｗｅｅｎ６０（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸エステル）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル）として販売されているものを好ましく用いることができる。これらのなかでも、炭素数１２～１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０）を用いることが好ましい。
　炭素数１６～１８のソルビタン脂肪酸エステルとしては、ソルビタンモノパルミチン酸エステル（ソルビタンモノパルミテート）、ソルビタンモノステアリン酸エステル（ソルビタンモノステアレート）、ソルビタンモノオレイン酸エステル（ソルビタンモノオレート）等のソルビタンモノ脂肪酸エステル；ソルビタントリパルミチン酸エステル（ソルビタントリパルミテート）、ソルビタントリステアリン酸エステル（ソルビタントリステアレート）、ソルビタントリオレイン酸エステル（ソルビタントリオレート）等のソルビタントリ脂肪酸エステル等が挙げられる。ソルビタン脂肪酸エステルは、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。ソルビタン脂肪酸エステルの市販品としては、例えば、ＳＰＡＮ４０（ソルビタンパルミチン酸エステル）、ＳＰＡＮ６０（ソルビタンステアリン酸エステル）、ＳＰＡＮ８０（ソルビタンオレイン酸エステル）、ＳＰＡＮ６５（ソルビタントリステアリン酸エステル）、ＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレイン酸エステル）として販売されているものを好ましく用いることができる。これらのなかでも、ＳＰＡＮ８０、ＳＰＡＮ６５、ＳＰＡＮ８５を用いることが好ましい。
　モノオレイン酸グリセロール（モノオレイン酸グリセリル）、ジラウリン酸グリセロール（ジラウリン酸グリセリル）、ジステアリン酸グリセロール（ジステアリン酸グリセリル）、ジオレイン酸グリセロール（ジオレイン酸グリセリル）は、グリセリンに１または２分子の脂肪酸がエステル結合したアシルグリセロールであり、脂肪酸が結合する部位は特に制限されない。例えば、モノアシルグリセロールであるモノオレイン酸グリセロールであれば、グリセリンのＣ１位またはＣ２位に脂肪酸がエステル結合していてよい。また、ジアシルグリセロールであるジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロールであれば、グリセリンのＣ１位およびＣ２位、またはＣ１位およびＣ３位に脂肪酸がエステル結合していればよい。例えば、ジラウリン酸グリセロールとしては、Ｃ１位およびＣ３位が置換された、α、α’－ジラウリンが好ましい。ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロールとしては、Ｃ１位およびＣ２位が置換されたジアシルグリセロールが好ましい。これらのグリセロール誘導体としては、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。
　ポリオキシエチレンヒマシ油は、ヒマシ油にポリオキシエチレンが付加したものである。ポリオキシエチレンの重合度としては、特に制限されないが、３～２００であることが好ましく、５～１００であることがより好ましく、１０～５０であることがさらに好ましい。ポリオキシエチレンヒマシ油は、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。
　α－トコフェロールとしては、天然由来または公知の方法で合成したものを用いても、市販のものを用いてもよい。
　上述の両親媒性物質のうち、両親媒性物質は、炭素数１０～１２のホスファチジルコリン、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレオレート、ソルビタンモノオレオレート、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα－トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましく、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジデカノイルホスファチジルコリン、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレオレート、ソルビタンモノオレオレート、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα－トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種であることがより好ましく、ジラウロイルホスファチジルコリンおよび／またはジデカノイルホスファチジルコリンであることがさらに好ましく、ジラウロイルホスファチジルコリンであることが特に好ましい。
　（ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質の組み合わせ）
　ｐＨ感受性化合物が、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種であり、両親媒性物質が、炭素数１０～１２のホスファチジルコリン、炭素数１２～１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６～１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα－トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。
　ｐＨ感受性担体は、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより、所望のｐＨにおいて、膜破壊機能促進効果を発現させることができる。この際、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより、ｐＨ感受性担体の膜破壊機能促進効果を発現し始めるｐＨは異なる。これはｐＨ感受性化合物によってｐＫａが異なること、さらには両親媒性物質との会合形成の様式が、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより異なることに由来するものと考えられる。したがって、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせを適宜変更することによって、機能を発現するｐＨを選択することが可能であり、デリバリーを詳細に設定することが可能であるといえる。
　ｐＨ感受性担体において、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせとしては、コール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＤＤＰＣ、デオキシコール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ６０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、デオキシコール酸およびα－トコフェロール、デオキシコール酸およびモノオレイン酸グリセロール、デオキシコール酸およびジステアリン酸グリセロール、デオキシコール酸およびジオレイン酸グリセロール、デオキシコール酸およびジラウリン酸グリセロール（α、α’－ジラウリン）、デオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、ケノデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ヒオデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、グリコデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＤＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ２０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ６０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、ウルソデオキシコール酸およびα－トコフェロール、ウルソデオキシコール酸およびモノオレイン酸グリセロール、ウルソデオキシコール酸およびジステアリン酸グリセロール、ウルソデオキシコール酸およびジオレイン酸グリセロール、ウルソデオキシコール酸およびジラウリン酸グリセロール（α、α’－ジラウリン）、ウルソデオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、グリチルリチン酸およびＤＤＰＣ、グリチルリチン酸およびＤＬＰＣ、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ２０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ４０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ６０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ８０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ４０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ６０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ８０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ６５、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ８５、グリチルリチン酸およびα－トコフェロール、グリチルリチン酸およびモノオレイン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびジステアリン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびジオレイン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびジラウリン酸グリセロール（α、α’－ジラウリン）、グリチルリチン酸およびポリオキシエチレンヒマシ油が好ましい。上記においてｐＨ感受性化合物は塩であってもよい。
　より好ましくは、コール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＤＤＰＣ、デオキシコール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、デオキシコール酸およびα－トコフェロール、デオキシコール酸およびモノオレイン酸グリセロール、デオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、ケノデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ヒオデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、グリコデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＤＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、ウルソデオキシコール酸およびα－トコフェロール、ウルソデオキシコール酸およびモノオレイン、ウルソデオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、グリチルリチン酸およびＤＤＰＣ、グリチルリチン酸およびＤＬＰＣ、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ４０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ６０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ８０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ４０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ６５、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ８５、グリチルリチン酸およびα－トコフェロール、グリチルリチン酸およびモノオレイン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびポリオキシエチレンヒマシ油である。上記においてｐＨ感受性化合物は塩であってもよい。
　特に好ましくは、デオキシコール酸およびＤＤＰＣ、デオキシコール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、デオキシコール酸およびα－トコフェロール、ウルソデオキシコール酸およびＤＤＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、グリチルリチン酸およびＤＬＰＣであり、最も好ましくは、デオキシコール酸およびＤＤＰＣ、デオキシコール酸およびＤＬＰＣである。上記においてｐＨ感受性化合物は塩であってもよい。
　［自然免疫を活性化する物質］
　自然免疫を活性化する物質とは、構造パターン認識受容体に認識され、免疫担当細胞を活性化に導く物質を意味する。
　自然免疫を活性化する物質としては、特に制限されないが、Ｔｏｌｌ様受容体に対するアゴニストであることが好ましい。
　自然免疫を活性化する物質の具体例としては、特に制限されないが、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド；ミョウバン等の鉱物塩；水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム等のゲルタイプアジュバント；免疫刺激性ＲＮＡ分子、内毒素（リポ多糖（ＬＰＳ；内毒素）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ：登録商標））、外毒素（コレラ毒素、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性毒素、百日咳毒素）、ムラミルジペプチド、フラジェリン等の微生物アジュバント；不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）等の油性アジュバント、流動パラフィン、ラノリン等の油性アジュバント生分解性ミクロスフェア、サポニン（ＱＳ－２１、Ｑｕｉｌ－Ａ等）、非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチド類似物、ポリホスファゼン、合成ポリヌクレオチド（非ＣｐＧ合成ポリヌクレオチド等）、イミダゾキノリン等の合成アジュバント；ＤＯＴＡＰ、ＤＣ－Ｃｈｏｌ、ＤＤＡ等のカチオン性脂質；一本鎖ＲＮＡ；二本鎖ＲＮＡ等が挙げられる。これらのうち、自然免疫を活性化する物質は、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド；鉱物塩；水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム等のゲルタイプアジュバント；免疫刺激性ＲＮＡ分子、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ：登録商標））、外毒素（コレラ毒素、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性毒素、百日咳毒素）、フラジェリン等の微生物アジュバント、サポニン（ＱＳ－２１、Ｑｕｉｌ－Ａ等）、合成ポリヌクレオチド（非ＣｐＧ合成ポリヌクレオチド等）、イミダゾキノリン等の合成アジュバント、一本鎖ＲＮＡ；二本鎖ＲＮＡ等であることが好ましく、モノホスホリルリピドＡ、ＣｐＧモチーフ、水酸化アルミニウムを含むオリゴヌクレオチドであることがより好ましく、免疫チェックポイント阻害剤との併用効果に非常に優れることから、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドであることが特に好ましい。
　自然免疫を活性化する物質は、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　自然免疫を活性化する物質の含有量は、使用する自然免疫を活性化する物質の種類によっても異なるが、両親媒性物質１００ｍｏｌに対して、０．０２２７～２２．７ｍｏｌであることが好ましい。自然免疫を活性化する物質の含有量が０．０２２７ｍｏｌ以上であると、免疫応答を好適に誘導させることができることから好ましい。一方、自然免疫を活性化する物質の含有量が２２．７ｍｏｌ以下であると、コストが低減できることから好ましい。
　ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧ　オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ　ＯＤＮ）であることが好ましく、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）のリガンドである非メチル化ＣｐＧ　オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ　ＯＤＮ）であることがより好ましい。オリゴデオキシヌクレオチドは、デオキシヌクレオシド（デオキシアデノシン（塩基部分は、アデニン（Ａ））、デオキシグアノシン（塩基部分は、グアニン（Ｇ））、チミジン（塩基部分は、チミン（Ｔ））、デオキシシチジン（塩基部分は、シトシン（Ｃ）））が、リン酸を介在したホスホジエステル結合によって多量体化した化合物を指す。オリゴヌクレオチドのホスホジエステル結合の部分は、その全部または一部が、酸素原子が硫黄原子に置換されたホスホロチオエート修飾されたものであってもよい。ホスホロチオエート修飾されたホスホジエステル結合を、ホスホロチオエート結合と換言することもできる。
　非メチル化ＣｐＧ　オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ　ＯＤＮ）とは、単一又は複数の非メチル化ＣｐＧモチーフを核酸分子内（５’末端または３’末端でない）に有する、オリゴデオキシヌクレオチドである。ここで、非メチル化ＣｐＧモチーフとは、シトシン（Ｃ）－グアニン（Ｇ）（５’－ＣｐＧ－３’）ジヌクレオチド配列であって、当該のシトシンの５位がメチル化されていないジヌクレオチド配列をいう。一般に、真核生物においては５’－ＣｐＧ－３’配列はＣＧメチラーゼによってシトシンがメチル化されているため、メチル化されていない５’－ＣｐＧ－３’配列のゲノム中での出現頻度は小さい。
　非メチル化ＣｐＧ　オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ　ＯＤＮ）は、公知の核酸合成方法を用いて容易に作製することが可能であり、また、市販品を用いてもよい。
　ＣｐＧ　ＯＤＮは、好ましくは、１８～２５のデオキシヌクレオチド、より好ましくは２０～２２のデオキシヌクレオチドからなる。
　ＣｐＧ　ＯＤＮとしては、クラスＡ（Ｃｌａｓｓ　Ａ；タイプＤ（ｔｙｐｅ　Ｄ）ともいう）、クラスＢ（Ｃｌａｓｓ　Ｂ；タイプＫ（ｔｙｐｅ　Ｋ）ともいう）およびクラスＣ（Ｃｌａｓｓ　Ｃ）のＣｐＧ　ＯＤＮが例示される。
　クラスＡのＣｐＧ　ＯＤＮは、配列が１以上の非メチル化ＣｐＧ配列を含むパリンドローム配列であって、骨格がホスホジエステル結合である部分と、該パリンドローム配列の５’側及び／又は３’側に結合したポリＧ配列（ｐｏｌｙ（Ｇ）、デオキシグアノシンが２個以上連結した配列）であって骨格がホスホロチオエート結合である部分とからなるＣｐＧ　ＯＤＮを指す。なお、パリンドローム配列とは、配列と相補鎖の配列とが一致する回文構造を有する配列を指す。
　クラスＡのＣｐＧ　ＯＤＮの具体例として、ＯＤＮ２２１６、ＯＤＮ２３３６、ＯＤＮ１５８５が例示される。これらはいずれもＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社から購入可能である。
　クラスＢのＣｐＧ　ＯＤＮは、配列中に１以上の非メチル化ＣｐＧ配列を含み、かつ、骨格がオリゴヌクレオチド全長にわたりホスホロチオエート結合であるＣｐＧ　ＯＤＮを指す。クラスＢのＣｐＧ　ＯＤＮの具体例として、ＯＤＮ２００６、ＯＤＮ１６６８、ＯＤＮ１８２６が例示される。これらはいずれもＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社から購入可能である。
　タイプＣのＣｐＧ　ＯＤＮは、配列中に１以上の非メチル化ＣｐＧ配列含む５’側部分、および非メチル化ＣｐＧ配列を含むパリンドローム配列を含む３’側部分からなり、骨格がオリゴヌクレオチド全長にわたりホスホロチオエート結合であるＣｐＧ　ＯＤＮを指す。クラスＣのＣｐＧ　ＯＤＮの具体例として、ＯＤＮ２３９５、ＯＤＮ　Ｍ３６２が例示される。ＯＤＮ２３９５、ＯＤＮ　Ｍ３６２は、ヒトおよびマウスにおいて顕著に免疫賦活活性が認められる。これらはいずれもＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社から購入可能である。
　［水性溶媒］
　アジュバント組成物は、水性溶媒を含んでいてもよい。
　アジュバント組成物が水性溶媒を含む場合、ｐＨ感受性担体、自然免疫を活性化する物質は、水性溶媒中で分散した分散液となりうる。
　この際、ｐＨ感受性担体は、好ましくは、水性溶媒中で、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とを含む複合体を形成する。これらの複合体の形態は特に制限されず、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とが膜を形成してもよいし、両親媒性物質が形成する構造にｐＨ感受性化合物の一部分もしくは全体が会合などにより埋め込まれていてもよい。また、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とがミセル状の粒子（ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とが疎水性相互作用により粒状に会合した粒子であり、典型的には単分子膜構造の粒子である）を形成するのが好ましい。また、ファゴサイトーシスやエンドサイトーシスによる取り込みは、一定以上の大きさの粒子に対して活発に行われることから、ミセル状の粒子は、粒子径が１０～２００ｎｍであることが好ましく、１０～１００ｎｍであることがより好ましい。なお、上記ミセル状の粒子には、脂質二分子膜構造（例えば、リポソーム）を形成するものは含まない。また、本明細書中、ｐＨ感受性担体の粒子径は、動的光散乱法（ＭＡＬＶＥＲＮ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、ＮａｎｏＺＳ９０）により測定することができる。
　また、アジュバント組成物は、水性溶媒中で、複合体を形成したｐＨ感受性担体と、自然免疫を活性化する物質と、を含む複合体（アジュバント複合体）を形成することが好ましい。複合体の形態は特に制限されないが、ｐＨ感受性担体を構成するｐＨ感受性物質および両親媒性物質と、自然免疫を活性化する物質とがミセル状の粒子を形成することが好ましい。当該ミセル状の粒子の粒子径は、１０～２００ｎｍであることが好ましく、１０～１００ｎｍであることがより好ましい。
　なお、アジュバント組成物を含む水性溶媒中、ｐＨ感受性化合物、両親媒性物質、自然免疫を刺激する活性を有する物質の少なくとも１つが、会合体を形成せず、遊離の状態で存在していてもよい。
　水性溶媒としては、緩衝剤、ＮａＣｌ、グルコース、ショ糖などの糖類を含む水溶液であることが好ましい。
　緩衝剤としては、アジュバント組成物のｐＨを生理的ｐＨ以上に維持するものであれば公知の緩衝剤が適宜使用でき、特に限定されるものではない。緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、クエン酸－リン酸緩衝剤、トリスヒドロキシメチルアミノメタン－ＨＣｌ緩衝剤（トリス塩酸緩衝剤）、トリスヒドロキシメチルアミノメタン－ＥＤＴＡ緩衝剤（トリスＥＤＴＡ緩衝剤、ＴＥ緩衝剤）、ＭＥＳ緩衝剤（２－モルホリノエタンスルホン酸緩衝剤）、ＴＥＳ緩衝剤（Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタンスルホン酸緩衝剤）、酢酸緩衝剤、ＭＯＰＳ緩衝剤（３－モルホリノプロパンスルホン酸緩衝剤）、ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸緩衝剤）、ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝剤などのＧＯＯＤ緩衝剤、グリシン－塩酸緩衝剤、グリシン－ＮａＯＨ緩衝剤、グリシルグリシン－ＮａＯＨ緩衝剤、グリシルグリシン－ＫＯＨ緩衝剤などのアミノ酸系緩衝剤；トリス－ホウ酸緩衝剤、ホウ酸－ＮａＯＨ緩衝剤、ホウ酸緩衝剤などのホウ酸系緩衝剤；またはイミダゾール緩衝剤などが用いられる。これらのうち、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ）などのリン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、クエン酸－リン酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、トリスＥＤＴＡ緩衝剤（ＴＥ緩衝剤）、ＭＥＳ緩衝剤、酢酸緩衝剤、ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝剤を用いることが好ましい。緩衝剤の濃度としては、特に制限されず、０．１～２００ｍＭであることが好ましく、１～１００ｍＭであることがより好ましい。なお、本明細書において「緩衝剤の濃度」とは、水性溶媒中に含まれる緩衝剤の濃度（ｍＭ）をいう。
　ＮａＣｌ、グルコース、ショ糖などの糖類の濃度としては、特に制限されず、０．１～２００ｍＭであることが好ましく、１～１５０ｍＭであることがより好ましい。
　水性溶媒を用いた場合のアジュバント組成物中のｐＨ感受性担体の濃度としては、特に制限されないが、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との合計モル濃度が、好ましくは０．７３μｍｏｌ／Ｌ～７．４ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは７．３μｍｏｌ／Ｌ～６．５ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは８．０μｍｏｌ／Ｌ～４．２ｍｍｏｌ／Ｌである。
　また、水性溶媒を用いた場合のアジュバント組成物中の自然免疫を活性化する物質のモル濃度は、特に制限されないが、好ましくは０．１４ｎｍｏｌ／Ｌ～０．２２７ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．４ｎｍｏｌ／Ｌ～０．１９ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは１．６ｎｍｏｌ／Ｌ～０．１２ｍｍｏｌ／Ｌである。
　［他の成分］
　アジュバント組成物は、他の成分を含んでいてもよい。当該他の成分としては、特に制限されないが、安定化剤等が挙げられる。
　安定化剤としては、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質に悪影響を与えなければ特に制限されず、例えば、１－オクタノール、１－ドデカノール、１－ヘキサドデカノール、１－エイコサノール等の飽和および不飽和の炭素数４～２０のアルコール；ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等の飽和および不飽和の炭素数１２～１８の脂肪酸；カプリル酸メチル（オクタン酸メチル）、カプリル酸エチル（オクタン酸エチル）、ラウリン酸メチル、ラウリン酸エチル、ミリスチン酸エチル、パルミチン酸エチル、ステアリン酸エチル、オレイン酸メチル、オレイン酸エチル等の飽和および不飽和の炭素数８～１８の脂肪酸アルキルエステル（炭素数１～３のアルキル）；Ｄ（Ｌ）－アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、フェニルアラニン、グルタミン酸等のＤ（Ｌ）－アミノ酸；トリカプロイン、トリカプリリン等のアミノ酸トリグリセライド；ポリオキシエチレンソルビタントリパルミチン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタントリオレイン酸エステル等の炭素数１２～１８のポリオキシエチレンソルビタントリ脂肪酸エステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ６５、Ｔｗｅｅｎ８５）；ポリオキシエチレンラウリン酸エステル、ポリオキシエチレンミリスチン酸エステル、ポリオキシエチレンパルミチン酸エステル、ポリオキシエチレンステアリン酸エステル等の炭素数１２～１８のポリオキシエチレンアルキルエステル（例えば、ＰＥＧ２０ステアリルエーテル、ＰＥＧ２３ラウリルエーテル）；ポリオキシアルキレン硬化ヒマシ油（例えば、ＰＥＧ１０硬化ヒマシ油、ＰＥＧ４０硬化ヒマシ油、ＰＥＧ６０硬化ヒマシ油）；カプリリン（オクタン酸グリセロール）、モノカプリン酸グリセロール、モノラウリン酸グリセロール、モノミリスチン酸グリセロール、モノパルミチン酸グリセロール、モノステアリン酸グリセロール、モノオレイン酸グリセロール等の飽和および不飽和の炭素数８～１８のモノ脂肪酸グリセロールエステル；ジオクタン酸グリセロール、ジカプリン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジミリスチン酸グリセロールエステル、ジパルミチン酸グリセロール等の炭素数８～１６のジ脂肪酸グリセロール；α－トコフェロール酢酸エステル、ヒマシ油、大豆油、コレステロール、スクアレン、スクアラン、ラクトース、パルミチン酸アスコルビル、安息香酸ベンジル、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル等の公知の安定化剤が用いられうる。なお、安定化剤における「炭素数」とは、疎水部を構成する脂肪酸成分（アシル基）の炭素数を意味する。
　これら他の成分の含有量としては、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質に悪影響を与えなければ特に制限されないが、両親媒性物質１００ｍｏｌに対して、１５０ｍｏｌ以下であることが好ましく、０ｍｏｌを超えて６６．４ｍｏｌ以下であることがより好ましい。
　ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物は、抗原とともに投与することにより、効果的にＣＴＬを誘導することができる。
　すなわち、上記アジュバント組成物においては、ｐＨ感受性担体に、自然免疫を活性化する物質を併用しても、ｐＨ感受性担体の機能、例えば、膜破壊機能促進効果（および膜融合機能促進効果）を好適に発揮することができる。また、ｐＨ感受性担体とともに自然免疫を活性化する物質を用いると、自然免疫を活性化する物質の機能も好適に発揮することができる。この理由は必ずしも明らかではないが、以下のような理由によるものと推察される。
　すなわち、ｐＨ感受性担体は、好ましい形態において、ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質を含み、膜破壊機能促進効果（場合によっては、膜破壊機能促進効果および膜融合機能促進効果）を有する。この際、膜破壊機能促進効果（および膜融合機能促進効果）は、上述のように、酸性環境下におけるｐＨ感受性化合物によるｐＨ感受性担体の会合状態の変化の惹起、およびこの場合における両親媒性物質によるエンドソーム等の細胞膜との再配列に基づくものである。ここで、ｐＨ感受性担体に自然免疫を活性化する物質を併用しても、ｐＨ感受性化合物のｐＨ感受性は変動しないため、ｐＨ感受性化合物は、ｐＨ感受性担体の会合状態の変化を惹起することができる。また、自然免疫を活性化する物質が、例えば、両親媒性物質に組み込まれていても、ｐＨ感受性担体と独立に存在していても、両親媒性物質による細胞膜との再配列には影響を与えない。そうすると、自然免疫を活性化する物質をｐＨ感受性担体と併用しても、ｐＨ感受性担体の機能は損なわれない。そして、自然免疫を活性化する物質は、例えば、疎水的な相互作用によりｐＨ感受性担体の両親媒性物質に組み込まれているだけであり、または、単にｐＨ感受性担体と独立して存在しているだけであり、その機能も損なわれない。その結果、本形態に係るアジュバント組成物は、抗原とともに投与した場合、ｐＨ感受性担体の機能により抗原をサイトゾルに導入することができるとともに、自然免疫を活性化する物質が作用することにより、サイトゾルに導入された抗原に基づくクロスプレゼンテーションを好適に誘導することができ、効果的にＣＴＬを誘導することができる。
　なお、上記理由は推定のものであり、これ以外の理由によって本発明の効果がもたらされたとしても、本発明の技術的範囲に含まれる。
　また、上記アジュバント組成物は、液性免疫をも好適に誘導することができる。
　上述のように、外因性抗原は、通常であれば、抗原提示細胞内のエンドソームでペプチド断片まで分解され、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に提示される。
　本形態に係るアジュバント組成物が、共に投与された抗原をクロスプレゼンテーションすることにより、ＣＴＬを誘導する場合には、ｐＨ感受性担体が、エンドソームの細胞膜の再配列を起こす際に抗原や自然免疫を活性化する物質がサイトゾルに導入されうる。しかし、一実施形態においては、再配列が起きたとしても、抗原および自然免疫を活性化する物質の一部または全部がエンドソーム内に残存する場合がありうる。また、一実施形態において、抗原とアジュバント組成物とが独立して存在する場合には、一部のエンドソームにおいては、抗原のみが取り込まれる場合がありうる。そうすると、エンドソームで抗原がペプチド断片まで分解され、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に提示されて液性免疫が誘導される。この際、クロスプレゼンテーションを好適に誘導している樹状細胞は、免疫的に活性化された状態にあることから、当該液性免疫の誘導は好適に発現することとなる。あるいは、クロスプレゼンテーションを好適に誘導している樹状細胞は、免疫を活性化するサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ）を盛んに産生し、周りの環境を、免疫誘導に適した環境に導くこととなる。
　したがって、アジュバント組成物は、クロスプレゼンテーションとともに、またはクロスプレゼンテーションに代えて、液性免疫を誘導することができる。
　［免疫チェックポイント阻害剤］
　アジュバント組成物は、免疫チェックポイント阻害剤と、組み合わせて投与されるように用いられる。
　Ｔ細胞上には免疫チェックポイント受容体が存在し、抗原提示細胞上に発現しているリガンドと相互作用する。Ｔ細胞はＭＨＣ分子上に提示された抗原を認識して活性化し、免疫反応を起こすが、並行して生じる免疫チェックポイント受容体－リガンドの相互作用によりＴ細胞の活性化が調節を受ける。免疫チェックポイント受容体には共刺激性のものと抑制性のものがあり、両者のバランスによってＴ細胞の活性化及び免疫反応が調節を受けている。
　がん細胞は、抑制性の免疫チェックポイント受容体に対するリガンドを発現し、該受容体を利用して細胞傷害性Ｔ細胞による破壊から逃避している。
　免疫チェックポイント阻害剤は、受容体またはリガンドの免疫チェックポイントの働きを阻害するものであり、例えば、抑制性の受容体に対するアンタゴニストや、共刺激性の免疫チェックポイント受容体に対するアゴニストが挙げられる。
　「アンタゴニスト」という語には、受容体とリガンドとの結合による受容体の活性化を妨害する各種の物質が包含される。例えば、受容体に結合して受容体－リガンド間の結合を妨害する物質、及びリガンドに結合して受容体－リガンド間の結合を妨害する物質を挙げることができる。
　抑制性の免疫チェックポイントに対するアンタゴニストとしては、抑制性の免疫チェックポイント分子（抑制性の受容体又は該受容体のリガンド）と結合するアンタゴニスト性抗体、抑制性の免疫チェックポイントリガンドに基づいて設計された、受容体を活性化しない可溶性のポリペプチド、又は該ポリペプチドを発現可能なベクター等が挙げられる。
　抑制性の免疫チェックポイント受容体に対するアンタゴニストとしては、具体的には、抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＢＴＬＡ抗体などが挙げられる。
　抑制性の免疫チェックポイント受容体に対するリガンドに対するアンタゴニストとしては、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、抗ＧＡＬ９抗体、抗ＨＶＥＭ抗体などが挙げられる。
　中でも、アジュバント組成物との併用による抗腫瘍効果が高いことから、免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体および抗ＣＴＬＡ－４抗体からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましく、抗ＰＤ－１抗体および／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体であることがより好ましく、抗ＰＤ－１抗体であることがさらに好ましい。
　抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２などの抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、改変抗体（例えば抗原認識部位のみヒト化した「ヒト化抗体」など）、キメラ抗体、２つのエピトープを同時に認識することができる二機能性抗体、断片抗体（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ＦａｂまたはＦｖ断片）などが挙げられる。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなど、いずれのクラスのものであってもよい。抗原への特異的結合性の観点からはモノクローナル抗体を用いることがより好ましい。
　モノクローナル抗体やポリクローナル抗体は従来公知の方法を参酌して作製することができる。
　抗体は市販品を用いてもよい。
　＜アジュバント組成物の製造方法＞
　ｐＨ感受性担体の製造方法は、国際公開第２０１３／１８０２５３号（米国特許出願公開第２０１３／３２３３２０号明細書）に記載の方法などを適宜参酌することができる。
　具体的には、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とを会合させる方法としては、ｐＨ感受性化合物と、両親媒性物質とが、水性溶液中で接触すればよい。よって、ｐＨ感受性担体は、ｐＨ感受性化合物と、両親媒性物質とを、水性溶液中で接触させることにより製造することができる。具体的には、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とを含む水性溶液を作製し、当該溶液を、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波などを用いて強く攪拌し分散することで、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とが会合したｐＨ感受性担体を得ることができる。
　ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とを含む水性溶液を調製する方法としては、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とが会合体を形成すれば特に制限されない。例えば、（１）ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液と、両親媒性物質を含む水性溶液とを別々に調製し、それら水性溶液を混合し、当該溶液を、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波などを用いて強く攪拌し分散させてｐＨ感受性担体を得る方法；（２）リポソーム／ミセルの製造法として公知であるバンガム法にて調製する方法；が挙げられる。
　バンガム法としては、以下の手順が具体的に挙げられる。
　まず、ガラス容器中で、ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質等のｐＨ感受性担体の構成成分を有機溶媒（例えば、メタノール、クロロホルム）に溶解する。
　具体的には、ｐＨ感受性化合物を有機溶媒（例えば、メタノール、クロロホルム）に溶解したｐＨ感受性化合物を含む溶液、および両親媒性物質を有機溶媒（例えば、メタノール、クロロホルム）に溶解した自然免疫を活性化する物質を含む溶液を準備して、ｐＨ感受性化合物を含む溶液および両親媒性物質を含む溶液を混合することが好ましい。この際の混合順序は特に限定されず、ｐＨ感受性担体を含む溶液および両親媒性物質を一括で混合してもよいし、どちらか一方に他方を添加してもよい。
　ｐＨ感受性化合物を含む溶液におけるｐＨ感受性担体の濃度および両親媒性物質を含む溶液における両親媒性物質の濃度は、特に限定されず、適宜設定される。両親媒性物質を含む溶液は、必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。
　次いで、ロータリーエバポレーターなどによって混合液の有機溶媒を除去して、ガラス容器の壁に薄膜を形成させる。次いで、水性溶媒を、薄膜を形成したガラス容器に加えて、常温（５～３５℃）で薄膜を膨潤させた後、常温（５～３５℃）でガラス容器を振盪する。この際、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波を用いて強く攪拌し、薄膜を十分に水性溶液中に分散させることができる。なお、水性溶媒としては、上述したアジュバント組成物に含まれる水性溶媒を使用することができる。
　このようにしてｐＨ感受性担体の分散液（溶液）を得ることができる。ｐＨ感受性担体の分散液はこのままアジュバント組成物の製造に用いてもよいし、分散液からｐＨ感受性担体を分離してもよい。
　なお、バンガム法の方法の詳細は、公知のリポソームの製造方法を参考にすることができ、「リポソーム」（野島庄七、砂本順三、井上圭三編、南江堂）および「ライフサイエンスにおけるリポソーム」（寺田弘、吉村哲郎編、シュプリンガー・フェアラーク東京）に記載されている。
　また、アジュバント組成物は、特に制限されず、種々の方法により製造することができる。具体的には、国際公開第２０１５／０７９９５２号（米国特許出願公開第２０１６／２７１２４６号明細書）に記載の方法などを適宜参酌することができる。
　例えば、ｐＨ感受性担体と、自然免疫を活性化する物質とが独立に存在するアジュバント組成物においては、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を混合することにより製造することができる。
　ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を混合する方法としては、例えばバンガム法により得られたｐＨ感受性担体の分散液および自然免疫を活性化する物質を含む溶液を混合する方法が挙げられる。この際の混合順序は特に限定されず、ｐＨ感受性担体を含む溶液および自然免疫を活性化する物質を含む溶液を一括で混合してもよいし、どちらか一方に他方を添加してもよい。
　自然免疫を活性化する物質を含む溶液は、自然免疫を活性化する物質および水性溶媒を含む。また、必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。なお、水性溶媒としては、上述したアジュバント組成物に含まれる水性溶媒を使用することができる。
　自然免疫を活性化する物質を含む溶液における自然免疫を活性化する物質の濃度は、自然免疫を活性化する物質のモル濃度が、好ましくは０．１４ｎｍｏｌ／Ｌ～０．２２７ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．４ｎｍｏｌ／Ｌ～０．１９ｍｍｏｌ／Ｌである。
　自然免疫を活性化する物質が、ｐＨ感受性担体に担持または包含されるアジュバント組成物においては、ｐＨ感受性担体と、自然免疫を活性化する物質とを会合させることにより製造することができる。
　ｐＨ感受性化合物、両親媒性物質、および自然免疫を活性化する物質を会合させる方法としては、ｐＨ感受性化合物、両親媒性物質、および自然免疫を活性化する物質が、水性溶液中で接触すればよい。
　ｐＨ感受性化合物と、両親媒性物質と、自然免疫を活性化する物質とを、水性溶液中で接触させる方法としては、これらが会合体を形成すれば特に制限されない。例えば、（１）ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液と、両親媒性物質を含む水性溶液と、自然免疫を活性化する物質を含む水性溶液とを別々に調製し、これら水性溶液を混合し、当該溶液を、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波などを用いて強く撹拌し分散させてアジュバント組成物を得る方法；（２）リポソームの製造法として公知であるバンガム法にて調製する方法等が挙げられる。バンガム法の具体的手順は、上記ｐＨ感受性担体の製造方法の欄に記載したものと同様である。
　なお、水性溶媒を成分として含むアジュバント組成物に含有されうる安定化剤等の他の成分の添加方法は、特に制限されない。例えば、ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液、両親媒性物質を含む水性溶液、および／または自然免疫を活性化する物質を含む水性溶液に添加していてもよいし、バンガム法により薄膜を調製する際に、ｐＨ感受性担体またはアジュバント組成物の構成成分と一緒に溶解させて、これらの成分を含む薄膜を用いて、アジュバント組成物を含む水性溶液を得てもよい。
　＜ワクチン組成物＞
　ワクチン組成物は、アジュバント組成物および抗原を含む。
　［アジュバント組成物］
　アジュバント組成物としては、上述したものが用いられうることからここでは説明を省略する。
　［抗原］
　抗原としては、免疫応答を生じさせるものであれば特に制限されないが、ペプチドまたはタンパク質であることが好ましい。
　ペプチドまたはタンパク質としては、ウイルス抗原、細菌性抗原、真菌性抗原、原虫性または寄生虫性抗原、がん抗原等が挙げられる。
　ウイルス抗原としては、特に制限されないが、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子の遺伝子産物、Ｎｅｆタンパク質、逆転写酵素、並びに他のＨＩＶコンポーネント等のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原；Ｂ型肝炎ウイルスのＳ、Ｍ、およびＬタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスのｐｒｅ－Ｓ抗原、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡ、並びにＡ、Ｂ、およびＣ型肝炎のウイルスコンポーネント等の肝炎ウイルス抗原；赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ、並びに他のインフルエンザウイルスコンポーネント等のインフルエンザウイルス抗原；麻疹ウイルス抗原；風疹ウイルス抗原；ロタウイルス抗原；サイトメガロウイルス抗原；呼吸器合胞体ウイルス抗原；単純ヘルペスウイルス抗原；水痘帯状疱疹ウイルス抗原；日本脳炎ウイルス抗原；狂犬病ウイルス抗原が挙げられる。その他、アデノウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルス、ヘルペスウイルス、ロタウイルス、ハンタウイルス、コロナウイルス、トガウイルス、フラビウイルス（ｆｌａｖｉｒｖｉｒｕｓ）、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、パピローマウイルス（ｐａｐｉｌｏｍａｖｉｒｕｓ）、パルボウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス又は海綿状ウイルス由来のペプチドが挙げられる。
　細菌性抗原としては、特に制限されないが、百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、パータクチン、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３、アデニル酸シクラーゼ、他の百日咳細菌性抗原コンポーネント等の細菌性抗原；ジフテリア毒素またはトキソイド、他のジフテリア細菌性抗原コンポーネント等のジフテリア細菌性抗原；破傷風毒素又はトキソイド、他の破傷風細菌性抗原コンポーネント等の破傷風細菌性抗原連鎖球菌細菌性抗原；リポ多糖、他のグラム陰性細菌性抗原コンポーネント等のグラム陰性桿菌細菌性抗原；ミコール酸、マイコバクテリア抗原コンポーネント等の結核菌細菌性抗原；ヘリコバクター・ピロリ細菌性抗原コンポーネント；肺炎球菌細菌性抗原；インフルエンザ菌細菌性抗原；炭疽菌細菌性抗原；リケッチア細菌性抗原等が挙げられる。
　真菌性抗原としては、特に制限されないが、カンジダ真菌性抗原コンポーネント；ヒストプラズマ真菌性抗原；クリプトコッカス真菌性抗原；コクシジオイデス真菌性抗原；白癬真菌性抗原等が挙げられる。
　原虫性または寄生虫性抗原としては、特に制限されないが、熱帯熱マラリア原虫抗原；トキソプラズマ抗原；住血吸虫抗原；リーシュマニア抗原；トリパノソーマ・クルージ抗原等が挙げられる。
　がん抗原としては、特に制限されず、腫瘍組織の細胞の細胞表面、細胞質、核、細胞小器官等に由来するがん抗原が挙げられる。当該がんとしては、白血病、リンパ腫、神経性腫瘍、メラノーマ、乳癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、結腸癌、肝癌、膵癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腟癌、精巣癌、前立腺癌、陰茎癌、骨腫瘍、血管腫瘍、口唇癌、上咽頭癌、咽頭癌、食道癌、直腸癌、胆嚢癌、胆管癌、喉頭癌、膀胱癌、腎臓癌、脳腫瘍、甲状腺癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫等が挙げられる。なお、がん抗原の具体例を挙げると、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（Ｈｕｍａｎ　ＥＧＦＲ　ｒｅｌａｔｅｄ　２）、ＣＥＡ（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＭＡＧＥ（Ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＸＡＧＥ（Ｘ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｆａｍｉｌｙ　ｍｅｍｂｅｒ）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｇｐ１００、Ｍｅｌａｎ／ｍａｒｔ－１、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、ＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＡＰ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ　Ａｃｉｄ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、Ｋ－ｒａｓ、Ｎ－ｒａｓ、Ｂｃｒ－Ａｂｌ、ＭＵＣ－１（Ｍｕｃｉｎ－１）、ＰＳＭＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ）、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＷＴ－１（Ｗｉｌｍｓｔｕｍｏｒ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　ｇｅｎｅ　１）、ＡＦＰ（ＡｌｐｈａＦｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＰＣ（Ｇｌｙｐｉｃａｎ）、ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）等が挙げられる。
　上述の抗原は、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　抗原の含有量は、ｐＨ感受性担体を構成する両親媒性物質１００ｎｍｏｌに対して、３．２μｇ～１．０ｍｇであることが好ましい。
　抗原の組込率は、特に制限されず、抗原とアジュバント組成物が独立して存在してもよいが、３％以上であることが好ましく、５～８０％であることがより好ましく、１０～６０％であることがより好ましい。組込率が３％以上であると、例えば、ワクチン組成物が細胞にエンドサイトーシスされる際に、抗原がアジュバント組成物と同じエンドソームに導入される可能性が高くなり、発明の効果を好適に得られうることから好ましい。なお、「抗原の組込率」は、主として抗原がアジュバント組成物に担持または包含された割合を意味し、その値は、国際公開第２０１５／０７９９５２号の［０１９５］～［０１９８］（米国特許出願公開第２０１６／２７１２４６号明細書［０３１２］～［０３１５］）に記載の方法によって測定された値を採用するものとする。
　［添加剤］
　ワクチン組成物は、他の医薬品添加剤を含んでいてもよい。
　使用されうる添加剤は、ワクチン組成物の剤型によって異なりうる。この際、ワクチン組成物は、錠剤、粉末、カプセルなどの固形製剤の形態であっても、注射製剤のような液体製剤の形態であってもよいが、液体製剤であることが好ましい。なお、液体製剤の場合には、用時に水または他の適切な賦形剤で再生する乾燥製品として提供されてもよい。
　ワクチン組成物が液体製剤である場合には、溶媒（例えば生理食塩水、滅菌水、緩衝液など）、膜安定剤（例えばコレステロールなど）、等張化剤（例えば塩化ナトリウム、グルコース、グリセリンなど）、抗酸化剤（例えばトコフェロール、アスコルビン酸、グルタチオンなど）、防腐剤（例えばクロルブタノール、パラベンなど）などを含みうる。なお、溶媒は、ワクチン組成物の製造に用いる溶媒であってもよい。
　本発明の一実施形態によれば、ワクチン組成物は、抗原をクロスプレゼンテーションさせることにより、効率良く細胞性免疫を誘導することができる。これにより、例えば、多量のＣＴＬを誘導することができる。なお、本明細書において、「ＣＴＬを誘導する」とは、本明細書に記載のＥＬＩｓｐｏｔ法にて、ワクチン組成物未処置のコントロール（すなわち、抗原と自然免疫を活性化する物質との混合物）と対比して、多くのｓｐｏｔ形成が得られることを意味する。
　また、本発明の別の一実施形態によれば、ワクチン組成物は、液性免疫を誘導することができる。これにより、ＩｇＧ等の抗体を産生することができる。この際、「液性免疫を誘導する」とは、抗原を投与したコントロールと対比して高いＩｇＧ抗体価となることを意味する。
　本形態のワクチン組成物は、対象者に投与して、ワクチン組成物の外部環境が生理的ｐＨ未満（例えば、ｐＨ６．５）となったときに、膜破壊機能促進効果、または膜破壊機能促進効果および膜融合機能促進効果を発現し、抗原を効率よくサイトゾルに放出させることが可能になる。そして、好適に細胞性免疫とＣＴＬを誘導することができ、免疫を付与することができる。
　＜ワクチン組成物の製造方法＞
　本実施形態に係るワクチン組成物は、特に制限されず、種々の方法により製造することができる。具体的なワクチン組成物の製造方法としては、分散調製法、混合調製法、および凍結融解－凍結乾燥調製法等が挙げられる。具体的には、国際公開第２０１５／０７９９５２号（米国特許出願公開第２０１６／２７１２４６号明細書）に記載の方法などを適宜参酌することができる。
　（分散調製法）
　分散調製法は、ｐＨ感受性化合物と、両親媒性物質と、自然免疫を活性化する物質と、抗原と、を混合する工程を含む。具体的には、ガラス容器の壁に、アジュバント組成物の構成成分を含む薄膜を形成させる。次いで、抗原を含む溶液を、薄膜を形成したガラス容器に加えて、５～３５℃で薄膜を膨潤させた後、ガラス容器を振盪する。この際、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波を用いて強く撹拌し、分散させる方法で、ワクチン組成物を調製する。または、ガラス容器の壁に、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質を含む薄膜を形成させ、次いで、抗原と自然免疫を活性化する物質とを、含む溶液を、薄膜を形成したガラス容器に加えて、５～３５℃で薄膜を膨潤させた後、ガラス容器を振盪する。この際、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波を用いて強く撹拌させる方法で、ワクチン組成物を調製する。
　抗原を含む溶液、および抗原と自然免疫を活性化する物質とを含む溶液は、下記混合調製法と同様のものまたは参考にして調製したものが用いられうる。
　（混合調製法）
　混合調製法は、ｐＨ感受性化合物を含む溶液と、両親媒性物質を含む溶液と、自然免疫を活性化する物質を含む溶液と、抗原を含む溶液と、を混合する工程を含む。
　具体的には、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を混合してアジュバント組成物を得た後、アジュバント組成物の分散液と、抗原または抗原を含む溶液とを混合することでワクチン組成物を得ることができる。
　抗原を含む溶液は、抗原および水性溶媒を含むことが好ましい。また、必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。なお、水性溶媒としては、上述したアジュバント組成物に含まれる水性溶媒を使用することができる。
　抗原を含む溶液における抗原の濃度は、抗原種により適宜設定されるが、抗原のモル濃度が、例えば、３２ｍｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌである。
　上述のアジュバント組成物の分散液、および抗原を含む溶液の混合方法は特に制限されない。得られた混合液は分散させることが好ましく、当該分散は、例えば、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波などを用いて行うことができる。
　（凍結融解－凍結乾燥調製法）
　凍結融解－凍結乾燥調製法は、分散調製法または混合調製法により得られた溶液を凍結融解して融解液を調製する工程、当該融解液を凍結乾燥する工程を含む。
　融解液を調製する工程
　融解液は、分散調製法または混合調製法により得られた溶液を凍結融解することにより調製することができる。
　凍結融解とは、溶液を凍結乾燥した後、得られた乾燥物を融解させることを意味する。
　凍結乾燥の方法としては、特に制限されないが、液体窒素、冷却したメタノール等を用いた水分を昇華させる方法が好ましい。
　また、乾燥物の融解方法としては、特に制限されないが、冷却して得られた乾燥物を昇温する方法、溶媒を添加する方法が好ましい。
　凍結乾燥する工程
　本工程は、上記で得られた融解液を、凍結乾燥する工程である。
　凍結乾燥の方法は、上記と同様に特に制限されないが、液体窒素、冷却したメタノール等を用いた水分を昇華させる方法が好ましい。
　＜アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤の併用＞
　アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤は組み合わせて用いられる。
　このため、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物は、免疫チェックポイント阻害剤と、組み合わせて投与されるように用いられる。
　アジュバント組成物、および免疫チェックポイント阻害剤の投与順序は特に制限がなく、アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤を同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。また、時間差をおいて投与する場合には、アジュバント組成物を投与後に免疫チェックポイント阻害剤を投与してもよいし、免疫チェックポイント阻害剤投与後にアジュバント組成物を投与してもよい。
　免疫チェックポイント阻害剤は、Ｔ細胞上の免疫チェックポイント受容体－リガンドに作用し、効果を得るものである。Ｔ細胞を誘導した後に免疫チェックポイント阻害剤を投与することで、抗腫瘍効果の増大がより発揮されると考えられることから、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物を投与した後に、免疫チェックポイント阻害剤を投与することが好ましい。このため、当該アジュバント組成物は、免疫チェックポイント阻害剤が投与される前に投与されることが好ましい。なお、時間差をおいての投与態様においては、時間差をおいての投与であれば、投与経路は同一であっても異なるものであってもよい。
　さらには、本実施形態の好適な形態は、免疫チェックポイント阻害剤と、組み合わせて投与されるように用いられる、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物ならびに抗原を含む、ワクチン組成物である。
　ワクチン組成物、および免疫チェックポイント阻害剤の投与順序は特に制限がなく、ワクチン組成物および免疫チェックポイント阻害剤を同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。また、時間差をおいて投与する場合には、ワクチン組成物を投与後に免疫チェックポイント阻害剤を投与してもよいし、免疫チェックポイント阻害剤投与後にワクチン組成物を投与してもよい。
　抗腫瘍効果の増大がより発揮されることから、ワクチン組成物を投与した後に、免疫チェックポイント阻害剤を投与することが好ましい。このため、当該ワクチン組成物は、免疫チェックポイント阻害剤が投与される前に投与されることが好ましい。なお、時間差をおいての投与態様においては、時間差をおいての投与であれば、投与経路は同一であっても異なるものであってもよい。
　アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤の製剤としては、アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤を含有する組成物（単一の製剤）、アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤を別々に製剤化しての組み合わせ（薬剤キット）などが挙げられる。好適な形態は、アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤を別々に製剤化しての組み合わせである。すなわち、本形態においては、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物と、免疫チェックポイント阻害剤と、を組み合わせた薬剤キットであることが好ましい。ｐＨ感受性担体、自然免疫を活性化する物質、免疫チェックポイント阻害剤については上述したとおりである。また、当該薬剤キットにおいては、アジュバント組成物、および免疫チェックポイント阻害剤の投与順序は特に制限がなく、アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤を同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。また、時間差をおいて投与する場合には、アジュバント組成物を投与後に免疫チェックポイント阻害剤を投与してもよいし、免疫チェックポイント阻害剤投与後にアジュバント組成物を投与してもよい。抗腫瘍効果の増大がより発揮されることから、アジュバント組成物を投与し、その後免疫チェックポイント阻害剤を投与することが好ましい。かような態様により、顕著な抗腫瘍効果を得ることができる。なお、時間差をおいての投与態様においては、時間差をおいての投与であれば、投与経路は同一であっても異なるものであってもよい。
　さらには、本実施形態の好適な形態は、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物ならびに抗原を含む、ワクチン組成物と、免疫チェックポイント阻害剤と、を組み合わせた薬剤キットである。さらに他の態様は、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物と、抗原と、免疫チェックポイント阻害剤と、を組み合わせた薬剤キットである。本発明の薬剤キットによれば、高い抗腫瘍効果を得ることができる。当該薬剤キットにおいては、ワクチン組成物、または、アジュバント組成物および抗原、ならびに免疫チェックポイント阻害剤の投与順序は特に制限がなく、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。また、時間差をおいて投与する場合には、ワクチン組成物、または、アジュバント組成物および抗原を投与後に免疫チェックポイント阻害剤を投与してもよいし、免疫チェックポイント阻害剤投与後にワクチン組成物、または、アジュバント組成物および抗原を投与してもよい。抗腫瘍効果の増大がより発揮されることから、ワクチン組成物、または、アジュバント組成物および抗原を投与し、その後免疫チェックポイント阻害剤を投与することが好ましい。
　また、当該薬剤キットは、癌治療または予防のための薬剤キットであることが好ましい。具体的には、白血病、リンパ腫、神経性腫瘍、メラノーマ、乳癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、結腸癌、肝癌、膵癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腟癌、精巣癌、前立腺癌、陰茎癌、骨腫瘍、血管腫瘍、口唇癌、上咽頭癌、咽頭癌、食道癌、直腸癌、胆嚢癌、胆管癌、喉頭癌、膀胱癌、腎臓癌、脳腫瘍、甲状腺癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫等の癌が挙げられる。
　アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤を併用投与する場合の投与形態としては、それぞれに適した投与経路、投与頻度及び投与量を採用する限りは特に限定されず、例えば、（１）アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤を含有する組成物、即ち、単一の製剤としての投与、（２）アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤を別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での同時投与、（３）アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤を別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、（４）アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤を別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での同時投与、（５）アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤を別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与等が挙げられる。
　併用投与における好ましい投与形態としては、アジュバント組成物またはワクチン組成物を投与した後に、免疫チェックポイント阻害剤を投与する方法である。
　本発明の他の態様は、治療または予防を必要とする対象者に、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物の有効量と、免疫チェックポイント阻害剤の有効量と、を投与することを含む、疾患の治療または予防方法である。また、他の態様は、治療または予防を必要とする対象者に、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物ならびに抗原を含むワクチン組成物の有効量と、免疫チェックポイント阻害剤の有効量と、を投与することを含む、疾患の治療または予防方法である。特に疾患が癌であることが好ましい。
　上記の対象者は、哺乳動物が好ましく、特に好ましくはヒトである。
　また、アジュバント組成物またはワクチン組成物と、免疫チェックポイント阻害剤と、を時間差をおいて投与する場合、抗腫瘍効果を増強するに足る間隔で免疫チェックポイント阻害剤を投与することが必要である。具体的な投与間隔は、患者の症状、年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。
　また、ワクチン組成物および免疫チェックポイント阻害剤は、一定のサイクルで投与することが好ましい。投与サイクルとしては、併用に適するように投与サイクルを適宜調整することが好ましい。具体的な、投与頻度、投与量、点滴投与時間、投与サイクル等は、患者の症状、年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。
　免疫チェックポイント阻害剤の単独投与については、従来公知であり、例えば、２～３ｍｇ／ｋｇ／Ｄａｙの範囲で、１日１回から数回投与される。
　アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤を併用して用いる場合は、通常投与される投与経路により、通常単独で投与される場合と同じ投与量若しくはそれより低用量（例えば、単独で投与した場合の最高投与量の０．１０～０．９９倍）に設定することができる。
　アジュバント組成物の投与量は、患者の症状、年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。
　また、免疫チェックポイント阻害剤およびアジュバント組成物の投与量の質量（ｍｇ／ｋｇ／Ｄａｙ）比についても、患者の症状、年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。
　アジュバント組成物、ワクチン組成物および免疫チェックポイント阻害剤の投与方法としては、特に制限はなく、経口投与；静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、皮内注射、腹腔内、筋肉内注射、髄腔内注射、経皮投与または経皮的吸収等の非経口的投与等が挙げられる。例えば、抗原としてペプチドおよびタンパク質を用いる場合は、非経口経路、特に皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、静脈内注射による投与が好ましい。なお、抗原がアジュバント組成物に担持または包含されずに独立に混合されてなるワクチン組成物については、局所投与、具体的には、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与の形態で投与することが好ましい。また、免疫チェックポイント阻害剤は、腹腔内投与であることが好ましい。
　本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。実施例において「部」あるいは「％」の表示を用いる場合があるが、特に断りがない限り、「重量部」あるいは「重量％」を表す。また、特記しない限り、各操作は、室温（２５℃）で行われる。
　１．試薬
・デオキシコール酸ナトリウム（ファーマグレード、シグマ社より購入）
・ＤＬＰＣ（１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン：日油社より購入、ＣＯＡＴＳＯＭＥ　ＭＣ－１２１２）
・ＥＹＰＣ（未水添卵黄ホスファチジルコリン：日油社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ　ＮＣ－５０）
・ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ－ＯＤＮ：ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社より購入、ＯＤＮ－２３９５、配列番号；５’－ｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔｃｇｇｃｇｃｇｃｇｃｃｇ－３’（配列番号１）（配列中、下線部は、パリンドローム配列を示す。）
・ＰＢＳ（ナカライテスク社より購入、リン酸緩衝生理食塩水（ＫＣｌ不含）（ｐＨ　７．４））
・ＭＥＳ－Ｎａ（メルク社より購入）
・塩化ナトリウム（関東化学社より購入）
・ＰＢＳ　Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ：タカラバイオ社より購入）
・水酸化ナトリウム水溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ：ナカライテスク社より購入）
・塩酸（０．１ｍｏｌ／Ｌ、１ｍｏｌ／Ｌ：ナカライテスク社より購入）
・リン脂質Ｃ－テストワコー（和光純薬工業株式会社より購入）
・Ｐｙｒａｎｉｎｅ（東京化成工業社より購入）
・ＤＰＸ（ｐ－ｘｙｌｅｎｅ－ｂｉｓ－ｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐｒｏｂｅｓ社より購入）
・Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（和光純薬工業社より購入）
・抗ＰＤ－１抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社より購入、ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＰＤ－１（ＣＤ２７９）ＦＧ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ＲＭＰ１－１４（ＢｉｏＸｃｅｌｌ社））
・メタノール（ナカライテスク社より購入）
・クロロホルム（和光純薬工業社より購入）
・ＯＶＡタンパク質（ＯＶＡｌｂｕｍｉｎ：和光純薬工業社より購入、オボアルブミン低エンドトキシン）（以下、単に「ＯＶＡ」とも称する。）
・ＯＶＡペプチド：ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ピーエイチジャパン委託合成）（以下、単に「ペプチド」とも称する。）
・ＲＰＭＩ（ナカライテスク社より購入、ＲＰＭＩ　１６４０培地（液体））
・Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔａｍｙｃｉｎ　Ｍｉｘｅｄ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク社より購入）
・ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ，Ｃｅｎｔｉｆｉｅｄ，Ｈｅａｔ　Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｅｄ，ＵＳ　Ｏｒｉｇｉｎ：Ｇｉｂｃｏ社より購入）
・ＲＢＣ　ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社より購入）：赤血球溶血バッファー
・Ｍｏｕｓｅ　ＩＦＮγ　ＥＬＩＳＰＯＴ　Ｓｅｔ（ＢＤバイオサイエンス社より購入）・ＡＥＣ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｓｅｔ（ＢＤバイオサイエンス社より購入）
　「動物」
　雌、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（６週齢）は日本エスエルシーより購入した。実験はテルモ株式会社における動物実験に関する指針に従って実施した。
　「細胞」
　Ｅ・Ｇ７－ＯＶＡ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－２１１３、以下、単にＥＧ７細胞とも表記）は、ＡＴＣＣ社より購入したものを培養し、使用した。
　「細胞の培養」
　細胞の培養は、５％ＣＯ２、３７℃に設定したインキュベーター（ＭＣＯ２０ＡＩＣ）を用いて実施した。
　「試料の調製等」
・ＲＰＭＩメディウム
　抗生物質としてペニシリン（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加した。また、必要に応じてＦＢＳを追加で添加し、１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムとした。
　２．投与液の調製
　（ｐＨ感受性担体の調製）
　クロロホルムに溶解した１０００ｎｍｏｌの両親媒性物質であるＤＬＰＣと、メタノールに溶解した１６００ｎｍｏｌのｐＨ感受性化合物であるデオキシコール酸ナトリウムを、１０ｍＬナスフラスコ混合し、ロータリーエバポレーターによって溶媒を揮発させて薄膜とした。作製した薄膜に０．５ｍＬのＰＢＳを添加し、超音波照射装置（ＵＳＣ－Ｊ、井内盛栄堂社製）を用いて分散させ、ｐＨ感受性担体の分散液（溶液）を調製した（ＤＬＰＣおよびデオキシコール酸ナトリウムの濃度：５．２ｍｍｏｌ／Ｌ）。
　（ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドの一時溶液の作製）
　ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを、付属の溶解液である滅菌水（エンドトキシンフリー）を用いて１μｇ／μＬとなるように溶解し、一時溶液とした。
　（アジュバント組成物の調製）
　上記で調製したｐＨ感受性担体の分散液（溶液）に、自然免疫を活性化する物質の一時溶液を添加し、混合した。濃度を調製するために追加のＰＢＳを添加し、混合することで、アジュバント組成物を調製した。
　（ＯＶＡの一時溶液）
　２ｍｇのＯＶＡ（モデル抗原）を１．０ｍＬのＰＢＳに溶解させ、ＯＶＡの一時溶液とした。
　（抗ＰＤ－１抗体の投与液）
　抗ＰＤ－１抗体の投与液は、購入した抗体の原液をＰＢＳにて１０倍希釈して、投与液とした（抗ＰＤ－１抗体０．１ｇ／Ｌ）。
　３．溶出性試験：Ｌｅａｋａｇｅ（溶出率）の測定
　Ｌｅａｋａｇｅ（溶出率）は、Ｋ．Ｋｏｎｏ　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．　２００８　１９　１０４０－１０４８に記載の方法に従い、蛍光物質であるＰｙｒａｎｉｎｅと消光剤であるＤＰＸとを内包したＥＹＰＣリポソームを用いて評価した。
　クロロホルムに溶解させた３０００ｎｍｏｌのＥＹＰＣを１０ｍＬナスフラスコに測り入れ、ロータリーエバポレーターを用いて薄膜とした。Ｐｙｒａｎｉｎｅ溶液（Ｐｙｒａｎｉｎｅ：３５ｍＭ、ＤＰＸ：５０ｍＭ、ＭＥＳ－Ｎａ：２５ｍＭ、ｐＨ７．４）５００μＬを加え、超音波照射装置（ＵＳＣ－Ｊ）を用いて分散させた後、エクストルーダーを用いて孔径１００ｎｍのポリカーボネート膜を通し、粒子径を揃えた。ＭＥＳ　ＢｕｆｆｅｒとＧ１００カラムを用いて外水層の置換を行い、蛍光物質を内包したＥＹＰＣリポソーム分散液を得た。リン脂質Ｃ－テストワコーを用いてリン脂質の濃度を求め、リン脂質が１．０ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＭＥＳ　Ｂｕｆｆｅｒを用いて濃度を調整した。
　濃度を調製したＥＹＰＣリポソーム分散液２０μＬと、評価サンプル分散液２０μＬを、ｐＨを調整した２９６０μＬのＭＥＳ　Ｂｕｆｆｅｒに投与し、３７℃にて９０あるいは３０分間インキュベーションした後（実施例において、特別な記載のない限り、９０分間の結果である）、分光光度計ＦＰ－６５００を用いてＥｘ４１６、Ｅｍ５１２ｎｍの蛍光を観察することにより、Ｌｅａｋａｇｅをモニターした。
　なお、ＥＹＰＣリポソーム分散液のみの場合を０％とし、１０倍希釈したＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を３０μＬ加えた場合の値を１００％として、溶出率を算出した。具体的には、溶出率は、下記式に従って計算した。なお、下記式中において、測定した蛍光強度をＬとし、蛍光物質を内包したＥＹＰＣリポソーム分散液のみの蛍光強度をＬ０、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を加えた場合の蛍光強度をＬ１００と表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　上記で調整したアジュバント組成物について、ｐＨ７．４およびｐＨ５．０における、ｐＨ感受性担体、ｐＨ感受性化合物、両親媒性物質の溶出率を測定し、下記式
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
よりΔおよびΔ’を算出した結果、Δ＝４０．９、Δ’＝３９．８であった。よって、アジュバント組成物は膜破壊機能促進効果を有する。
　［評価方法１：ＥＬＩｓｐｏｔ法を用いたＣＴＬ誘導の確認］
　ＥＬＩｓｐｏｔ法を用いてＣＴＬの誘導を確認した。用いた被験物質は、ＯＶＡおよびＣｐＧ－ＯＤＮ混合物（ＯＶＡ＋ＣｐＧ－ＯＤＮ）、ＯＶＡ、ＣｐＧ－ＯＤＮおよびｐＨ感受性担体の混合物（ワクチン組成物）（ＯＶＡ＋ＣｐＧ－ＯＤＮ＋ｐＨ感受性担体）、およびＯＶＡおよびｐＨ感受性担体混合物（ＯＶＡ＋ｐＨ感受性担体）である。
　なお、投与に使用した試料は、「投与液の調製」に従って調製した投与液を用いて調製した。また、ＯＶＡ、ＣｐＧ－ＯＤＮおよびｐＨ感受性担体の混合物は、アジュバント組成物に、ＯＶＡの一時溶液を添加し、超音波にて混合して得た。
　（１）マウスへの免疫
　投与は麻酔下にて実施した。背部１箇所に１００μＬ／ｈｅａｄにて皮下注射した。ｐＨ感受性担体は、両親媒性物質：１０ｎｍｏｌ／ｈｅａｄ、ｐＨ感受性化合物：１６ｎｍｏｌ／ｈｅａｄとした。自然免疫を活性化する物質は、ＣｐＧ－ＯＤＮの場合、１０μｇ（１．４２ｎｍｏｌ）／ｈｅａｄとした。抗原は、モデル抗原としてＯＶＡを使用し、８０μｇ／ｈｅａｄとした。投与は１回とし、投与から７日後にアッセイを実施した（ｎ＝１）。
　（２）ＥＬＩｓｐｏｔ法
　上記マウスへの免疫にて最終の投与から７日目においてマウスに安楽死を行い、脾臓を摘出した。３．０ｍＬの１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムを添加した後、ＢＤ　Ｆａｌｃｏｎセルストレーナーを用いて脾臓を処理し、細胞懸濁液とした。ＲＢＣ　ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒを用いて溶血操作を行った後、１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムを用いて細胞を洗浄した。細胞を１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムにて分散した後、細胞数をカウントし、脾臓の細胞分散液を得た。
　ＥＬＩｓｐｏｔ法は、Ｍｏｕｓｅ　ＩＦＮγ　ＥＬＩＳＰＯＴ　Ｓｅｔを用いて実施した。脾臓の細胞分散液を播種する前日に、９６ｗｅｌｌ　ＥＬＩｓｐｏｔプレートに薬剤キットに付属のｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙを吸着させて、プレートを作製した。作製したプレートを１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムにて洗浄した後、２００μＬの１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムを添加し、３７℃にて２時間静置しブロッキングを行った。１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムにてプレートを洗浄した後、４０μｇ／ｍＬのＯＶＡペプチドを含む１０％血清含有ＲＰＭＩメディウム１００μＬをプレートに添加した。プレートに、脾臓の細胞分散液を２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、最後に、１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムを用いて１穴あたりの全量が２００μＬとなるように、調整した。その後、二晩培養し、プレートの呈色を行った。
　プレートの呈色は、Ｍｏｕｓｅ　ＩＦＮγ　ＥＬＩＳＰＯＴ　Ｓｅｔ、およびＡＥＣ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　Ｓｅｔに記載のプロトコルに従って実施した。
　得られた結果を図３に示す。
　ＯＶＡとＣｐＧ－ＯＤＮの混合物（図３（Ａ））は、僅かな数のｓｐｏｔであり、少数のＣＴＬしか誘導できなかった。
　一方、ＯＶＡ、ＣｐＧ－ＯＤＮおよびｐＨ感受性担体の混合物（図３（Ｂ））は、多くのｓｐｏｔを形成し、多数のＣＴＬを誘導することができた。ゆえに、アジュバント組成物の含有は、多数のＣＴＬの誘導に繋がることが示された。ｐＨ感受性担体が成熟した抗原提示細胞に対して、多数のＭＨＣクラスＩ分子による抗原提示を誘起した結果、多数のＣＴＬを誘導したものと考えられる。
　また、自然免疫を活性化する物質であるＣｐＧ－ＯＤＮを使用していない、ＯＶＡおよびｐＨ感受性担体の混合物（図３（Ｃ））は、ｓｐｏｔを形成できず、ＣＴＬは誘導されなかった。自然免疫を活性化する物質を含まなければ、成熟した抗原提示細胞の数が増大しなかったため、ＣＴＬを誘導することができなかったものと考えられる。
　［評価方法２：マウスの担癌実験系を用いた抗腫瘍効果の確認］
　続いて、マウスの担癌実験系を用いて、抗腫瘍効果を確かめた。マウスは７つに群分けを行った。１群：処置なし、２群：ＯＶＡ投与、３群：ＯＶＡおよび抗ＰＤ－１抗体投与、４群：ＯＶＡおよびＣｐＧ－ＯＤＮ投与、５群：ＯＶＡ、ＣｐＧ－ＯＤＮおよびｐＨ感受性担体（図中、ミセルと表記）投与、６群：ＯＶＡおよびＣｐＧ－ＯＤＮ、ならびに抗ＰＤ－１抗体投与、７群：ＯＶＡ、ＣｐＧ－ＯＤＮおよびｐＨ感受性担体、ならびに抗ＰＤ－１抗体投与とした。投与に使用した試料は、「投与液の調製」に従って調製した投与液を用いて調製した。また、ＯＶＡ、ＣｐＧ－ＯＤＮおよびｐＨ感受性担体の混合物は、アジュバント組成物に、ＯＶＡの一時溶液を添加し、超音波にて混合して得たワクチン組成物を用いた。
　（１）評価系の構築、およびマウスへの免疫
　投与は、全て麻酔下にて実施した。Ｄａｙ０に、ＥＧ７細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｈｅａｄにてマウスの皮下に注射し、担癌を行った。比較試料（ＯＶＡのみ（２群、３群）、ＯＶＡおよびＣｐＧ－ＯＤＮ（４群、６群））、ワクチン組成物（ＯＶＡ、ＣｐＧ－ＯＤＮおよびｐＨ感受性担体の混合物）（５群、７群）を含む投与液は、２０μＬ／ｓｈｏｔにて、皮内に注射するものとし、Ｄａｙ５、Ｄａｙ１２、Ｄａｙ１９のスケジュールで、３回実施するものとした。抗ＰＤ－１抗体の投与（３群、６群、７群）は、抗ＰＤ－１抗体の投与液を５００μＬ／ｓｈｏｔにて、腹腔内に注射するものとし、Ｄａｙ８、Ｄａｙ１５、Ｄａｙ２２のスケジュールで、３回実施するものとした。個体差が大きいため、１群を５匹とした。１回あたりの投与において、ｐＨ感受性担体は、両親媒性物質：２ｎｍｏｌ／ｈｅａｄ、ｐＨ感受性化合物：３．２ｎｍｏｌ／ｈｅａｄとした。自然免疫を活性化する物質は、ＣｐＧ－ＯＤＮの場合、２μｇ（０．２８４ｎｍｏｌ）／ｈｅａｄとした。抗原は、モデル抗原としてＯＶＡを使用し、１６μｇ／ｈｅａｄとした。
　（２）腫瘍サイズの測定
　腫瘍（癌）のサイズは、腫瘍の長径ａと短径ｂを、デジタルノギスを用いて測定し、式１）の計算式を用いて、体積を求めた。エンドポイントに到達した個体は安楽死の処置を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
　得られた結果を図４に示す。結果は腫瘍サイズの平均値＋標準偏差（ＳＥＭ）で示した（ｎ＝５）。
　図４（Ａ）は、１～５および７群の結果を示す。
　ＯＶＡ単独（図４（Ａ）：２群）やＯＶＡおよびＣｐＧ－ＯＤＮの混合物（図４（Ａ）：４群）と比較して、ＯＶＡ、ＣｐＧ－ＯＤＮおよびｐＨ感受性担体の混合物を投与した群（図４（Ａ）：５群）は、腫瘍の増大速度を遅く抑えることができた。ＯＶＡ、ＣｐＧ－ＯＤＮおよびｐＨ感受性担体の混合物は、図３（Ｂ）で示すように生体において腫瘍を攻撃する機能を有したＣＴＬを多量に誘導することができたため、腫瘍の増大を遅らせることができたものと考えられる。したがって、ＯＶＡ、ＣｐＧ－ＯＤＮおよびｐＨ感受性担体を含むワクチン組成物の含有は、高い抗腫瘍効果を有することが示された。
　一方、本実験系においては、腫瘍の増大速度が速いため、ＯＶＡおよび抗ＰＤ－１抗体投与群（図４（Ｂ）：３群）は、目立った抗腫瘍効果を得られなかった。なお、抗ＰＤ－１抗体の抗腫瘍効果を奏する作用機序を考慮すると、抗ＰＤ－１抗体は樹状細胞を成熟化する能力は有していないため、抗ＰＤ－１抗体およびｐＨ感受性担体の組み合わせを用いたとしても、ＣＴＬは惹起されず、抗腫瘍効果の増大は望めないものと推定される。
　ＯＶＡ、ＣｐＧ－ＯＤＮおよびｐＨ感受性担体の混合物（図４（Ａ）：５群）と比較して、さらに抗ＰＤ－１抗体の投与を行った群（図４（Ａ）：７群）は、より顕著に腫瘍の増大を抑えた。一部の個体は、腫瘍の消失にまで至っており、本群は特に高い抗腫瘍効果を有していた。抗ＰＤ－１抗体単独（図４（Ａ）：３群）では、目立った抗腫瘍効果を得られなかったことを鑑みると、併用によって腫瘍が著しく減少したことは、驚くべき結果である。単独では抗腫瘍効果が発揮されない程度の抗ＰＤ－１抗体の投与量であっても、ＯＶＡ、ＣｐＧ－ＯＤＮおよびｐＨ感受性担体を含むワクチン組成物および抗ＰＤ－１抗体の併用が強い抗腫瘍効果をもたらすことが示された。ゆえに、ＯＶＡ、ＣｐＧ－ＯＤＮおよびｐＨ感受性担体を含むワクチン組成物および抗ＰＤ－１抗体の併用が相乗的に作用して、強い抗腫瘍効果をもたらしたといえる。抗ＰＤ－１抗体が腫瘍の免疫回避能力を低下させたため、アジュバント組成物によって誘導された多量のＣＴＬが腫瘍を攻撃でき、特に高い抗腫瘍効果を得られたものと考えられる。
　さらに、同じ実験系において、アジュバント組成物と免疫チェックポイント阻害剤との併用効果を確かめた。
　アジュバント組成物と免疫チェックポイント阻害剤との併用効果を検証するため、より詳細な比較を行った。結果を図４（Ｂ）に示す。抗ＰＤ－１抗体と自然免疫を活性化する物質との併用（図４（Ｂ）：６群）は、Ｄａｙ１０から腫瘍の増大速度が遅くなって抗腫瘍効果を確認できたが、Ｄａｙ２０では、再び腫瘍容積が増大し、抗ＰＤ－１抗体とアジュバント組成物との併用（図４（Ｂ）：７群）と比べて、小さな効果しか有していなかった。自然免疫を活性化する物質単独では、少量のＣＴＬしか誘導できず、大きな抗腫瘍効果を得られなかったものと考えられる。なお、図５（Ａ）～（Ｃ）に、各群マウスの腫瘍の様子を示している。図５（Ａ）は３群のマウスであり、図５（Ｂ）は６群のマウスであり、図５（Ｃ）は７群のマウスである。図５の写真からも、アジュバント組成物および抗ＰＤ－１抗体との併用が、非常に高い抗腫瘍効果を奏することがわかる。
　以上より、抗ＰＤ－１抗体との併用において、本発明のアジュバント組成物は最も良い併用の効果を示した。
　自然免疫を活性化する物質とｐＨ感受性担体のミセルを含むアジュバント組成物は、多量のＣＴＬを誘導することができるため、免疫チェックポイント阻害剤に対して大きな併用効果を有しており、特に高い抗腫瘍効果を実現できることが確認された。アジュバント組成物と免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせは良い相性であり、より効果の高いがん免疫療法の実現に資するものと期待される。
　本出願は、２０１７年３月２９日に出願された日本特許出願番号２０１７－０６６１４２号に基づいており、その開示内容は、参照され、全体として、組み入れられている。
　　１　両親媒性物質、
　　２　ｐＨ感受性化合物、
　　３　自然免疫を活性化する物質、
　　４　アジュバント組成物、
　　５　抗原、
　　６　ワクチン組成物、
　　７　ｐＨ感受性担体、
　　８　樹状細胞、
　　９　エンドソーム。

Claims (14)

  1. 　免疫チェックポイント阻害剤と、組み合わせて投与されるように用いられる、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物。
  2. 　前記免疫チェックポイント阻害剤が投与される前に投与される、請求項１に記載のアジュバント組成物。
  3. 　前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体および抗ＣＴＬＡ－４抗体からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１または２に記載のアジュバント組成物。
  4. 　前記ｐＨ感受性担体が、ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質を含み、
    　前記ｐＨ感受性化合物が、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種であり、
    　前記両親媒性物質が、炭素数１０～１２のホスファチジルコリン、炭素数１２～１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６～１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα－トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１～３のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
  5. 　膜破壊機能促進効果を発現する、請求項４に記載のアジュバント組成物。
  6. 　前記自然免疫を活性化する物質がＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドである、請求項１～５のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載のアジュバント組成物および抗原を含む、ワクチン組成物。
  8. 　ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物と、免疫チェックポイント阻害剤と、を組み合わせた薬剤キット。
  9. 　前記アジュバント組成物を投与し、その後免疫チェックポイント阻害剤を投与する、請求項８に記載の薬剤キット。
  10. 　癌治療または予防のための薬剤キットである、請求項８または９に記載の薬剤キット。
  11. 　前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体および抗ＣＴＬＡ－４抗体からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項８～１０のいずれか１項に記載の薬剤キット。
  12. 　前記ｐＨ感受性担体が、ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質を含み、
    　前記ｐＨ感受性化合物が、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種であり、
    　前記両親媒性物質が、炭素数１０～１２のホスファチジルコリン、炭素数１２～１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６～１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα－トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項８～１１のいずれか１項に記載の薬剤キット。
  13. 　前記アジュバント組成物が、膜破壊機能促進効果を発現する、請求項１２に記載の薬剤キット。
  14. 　前記自然免疫を活性化する物質がＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドである、請求項８～１３のいずれか１項に記載の薬剤キット。
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