WO2023008793A1 - 단백질 발현을 위한 mrna와 이를 위한 주형 - Google Patents

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WO2023008793A1
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transcription vector
mrna transcription
nucleotide sequence
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최영준
김훈
김민지
이정민
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에스케이바이오사이언스(주)
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    • C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal

Definitions

  • Nucleic acid-based treatment and vaccine development technology has shown insufficient efficacy as a therapeutic agent due to insufficient transcription and translation efficiency when applied to a target organism beyond the cell level, which has been pointed out as a limitation in the development of nucleic acid-based therapeutic agents. come. Therefore, increasing the intra/external expression ability of antigenic proteins for the treatment of infectious diseases is one of the essential requirements for the development of pharmaceuticals using artificial nucleic acid molecules.
  • securing an mRNA sequence with high stability and translation efficiency has emerged as an essential condition for mRNA-based therapy.
  • mRNA “vaccine” refers to medicines used for the prevention and treatment of cancer, infectious diseases, autoimmune diseases, etc. by using a protein encoded by mRNA as an antigen.
  • the mRNA vaccine has the advantage of being stable and easy to mass-produce, so it is expected to be widely used as a platform for anti-cancer vaccines and infectious disease vaccines in pandemic situations in the future.
  • the mRNA vaccine contains an artificial RNA molecule produced by mimicking the natural mRNA structure as an active ingredient, and its main goal is to strengthen the immune system of an individual by using the RNA molecule.
  • the immune activating properties that induce stimulation of adjuvants such as the toll-like receptor agonist (TLR agonist), which naked mRNA has fundamentally, reverse the transcriptional signaling system of mRNA It is known that it inhibits the expression of a sufficient amount of mRNA antigen to exhibit pharmacological activity.
  • TLR agonist toll-like receptor agonist
  • attempts to manufacture vaccines using modified mRNA from which immunogenicity has been removed or attenuated are actively underway.
  • due to the low immunogenicity of mRNA due to the low immunogenicity of mRNA, it also has limitations in inducing effective humoral immunity and/or cellular immune response.
  • One aspect is to provide an mRNA transcription vector including a promoter region recognized by RNA polymerase and a gene construct capable of enhancing the expression of a target mRNA antigen.
  • Another aspect is to provide a method for preparing an mRNA molecule using an mRNA transcription vector as a template, and an mRNA molecule prepared by the method.
  • Another aspect is to provide an immunogenic composition
  • an immunogenic composition comprising the mRNA molecule and a pharmaceutically acceptable excipient as active ingredients.
  • One aspect is an mRNA transcription vector comprising a promoter region recognized by RNA polymerase and a gene construct operably linked to the promoter region,
  • the gene construct comprises a 5'-untranslated region (5'-UTR) region consisting of SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence having 90% or more sequence identity therewith; an open reading frame (ORF) region comprising a nucleotide sequence encoding a target antigen operably linked to the 5'-UTR region; And a 3'-untranslated region in which a unit sequence consisting of SEQ ID NO: 2 or a nucleotide sequence having 90% or more sequence identity thereto operably linked to the open reading frame region is repeated twice (3'-Untranslated region: 3' -UTR) region, an mRNA transcription vector is provided.
  • 5'-UTR 5'-untranslated region consisting of SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence having 90% or more sequence identity therewith
  • ORF open reading frame
  • 3'-untranslated region in which a unit sequence consisting of SEQ ID NO: 2 or a nucleotide sequence having 90% or more sequence identity thereto
  • nucleotide sequence refers to a polymer material comprising a plurality of nucleotide units, specifically, a polymer in which a plurality of nucleotide units are linked to each other by phosphodiester bonds of a sugar / phosphate backbone
  • polynucleotide refers to a polymer material comprising a plurality of nucleotide units, specifically, a polymer in which a plurality of nucleotide units are linked to each other by phosphodiester bonds of a sugar / phosphate backbone
  • polynucleotide “nucleic acid”, and “nucleic acid molecule” may be used interchangeably.
  • the polynucleotide is a biopolymer essential for life and may be RNA or DNA that encodes genetic information through a unique base sequence.
  • the polynucleotide is isolated, artificially synthesized, or non-naturally occurring or engineered, and "non-naturally occurring or engineered” means in nature It means a state created by applying artificial deformation, not a state as it exists.
  • the artificial modification may be for improving the expression of the target antigen in cells by mimicking the structure of natural mRNA, specifically, mature mRNA.
  • mRNA (Messenger RNA) refers to RNA that is transcribed from a DNA template and transfers genetic information of DNA to ribosomes in the cytoplasm.
  • the transcription process in eukaryotic organisms proceeds in the nucleus of a cell and includes the process of processing immature RNA (Premature RNA). Specifically, this process is called post-transcriptional modification, and includes splicing, 5'-capping, polyadenylation, export from the nucleus or mitochondria, etc. includes the process of As a result of this process, mature mRNA containing a nucleotide sequence that can be translated into the amino acid sequence of a specific peptide or protein is produced.
  • Premature RNA immature RNA
  • the mature mRNA may optionally include a 5'-cap, 5'UTR, open reading frame, 3'UTR, and poly A tail.
  • the mRNA may be synthesized according to any of a number of known methods, for example, the mRNA may be synthesized via in vitro transcription (IVT).
  • the term "vector” refers to a vector capable of expressing an antigen of interest in a suitable host cell, and refers to a genetic construct comprising regulatory elements operably linked to express a gene insert.
  • a vector may include expression control elements such as a promoter, an operator, an initiation codon, a stop codon, a polyadenylation signal, and/or an enhancer, and the promoter of the vector may be constitutive or inducible.
  • the vector may be an expression vector capable of stably expressing a target antigen in a host cell.
  • the expression vector may be a conventional one used in the art to express foreign proteins in plants, animals, or microorganisms, and the vector may be constructed through various methods known in the art.
  • the gene construct sequence described above may be operably linked to a promoter.
  • operably linked can refer to the linking of nucleotide sequences on a single nucleic acid fragment such that the function of one is affected by the other.
  • the vector may be a vector capable of expressing an mRNA molecule as a target antigen in a host cell, that is, it may refer to an mRNA transcription vector.
  • the mRNA transcription vector is composed of a genetic construct in the form of DNA, and may refer to a template DNA for mRNA production.
  • the mRNA transcription vector may include a promoter recognized by RNA polymerase, and an mRNA molecule may be generated through a transcription process mediated by the promoter.
  • the mRNA transcription vector may be in the form of a plasmid, and the mRNA transcription vector may be a linearized vector, specifically, a linearized plasmid.
  • the linearized plasmid can be obtained by contacting the plasmid DNA with a restriction enzyme under suitable conditions such that the restriction enzyme cleaves the plasmid DNA at the recognition site and disrupts the plasmid structure.
  • the linearized plasmid includes a free 5' end and a free 3' end, which may be used to perform a subsequent in vitro transcription process.
  • known techniques in the art may be applied to elements such as the type of plasmid and a restriction enzyme recognition site without limitation.
  • RNA polymerase refers to an enzyme that synthesizes primary transcript RNA from DNA.
  • the RNA polymerase may be, for example, T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase, SP6 RNA polymerase, or mitochondrial polymerase (POLRMT).
  • promoter region recognized by RNA polymerase may refer to a DNA sequence region that serves as a template capable of generating promoter mRNA recognized by RNA polymerase through the above-described transcription process.
  • the promoter region may be recognized by RNA polymerase acting in the cytoplasm, for example, as recognized by T7 RNA polymerase, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 15 or the above It may consist of a sequence having at least 90% or more sequence identity with the nucleotide sequence.
  • identity refers to the overall relationship between polymer molecules, eg, between nucleic acids (eg, DNA molecules and/or RNA molecules) and/or between polypeptides.
  • polypeptides are considered “substantially identical” to each other if their amino acid sequences are at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, or 99% identical. do.
  • Calculation of percent identity of two nucleic acid or polypeptide sequences can be performed, for example, by aligning the two sequences for optimal comparison purposes (e.g., for optimal alignment, one of the first and second sequences or Gaps may be introduced in both, and non-identical sequences may be disregarded for comparison purposes).
  • the length of a sequence aligned for comparison purposes is at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or substantially 100% of the length of the reference sequence.
  • the nucleic acid or polypeptide sequences at corresponding positions are then compared. Determination of percent identity between two sequences and comparison of sequences can be accomplished using mathematical algorithms. As is well known to those skilled in the art, amino acid or nucleic acid sequences can be compared using any of a variety of algorithms, including those available in commercial computer programs such as BLASTN for nucleotide sequences and BLASTP, gapped BLAST, and PSIBLAST for amino acid sequences. It can be.
  • nucleotide sequence indicates that it is linked or positioned in the direction from the 5' end to the 3' end.
  • the gene construct is a technical element for enhancing the expression of mRNA molecules or mRNA antigens, including a 5'-untranslated region; an open reading frame region comprising a nucleotide sequence encoding a target antigen; and a 3'-untranslated region.
  • the term "open reading frame” can generally be a sequence of several nucleotide triplets that can be translated into a peptide or protein, interchangeably with the term “protein coding region” can be used
  • the open reading frame preferably includes a start codon, that is, a combination of three nucleotide sequences (ATG or AUG) encoding the amino acid methionine, in a subsequent region starting from its 5'-end, and
  • the region of the direction may preferably contain a stop codon (e.g., TAA, TAG, TGA, or UAA, UAG, UGA) indicating termination of translation.
  • the term “open reading frame region” may refer to a DNA sequence region that serves as a template capable of generating an open reading frame mRNA, ie, a target mRNA antigen, through the above-described transcription process.
  • 5'-untranslated region refers to a region located at the 5' end of the open reading frame, specifically, an mRNA region upstream from the initiation codon.
  • the term “5'-untranslated region” may refer to a DNA sequence region that serves as a template capable of generating 5'-untranslated region mRNA through the above-described transcription process.
  • 3'-untranslated region refers to a region located at the 3' end of the open reading frame, specifically, an mRNA region downstream from a stop codon. refers to The term “3'-untranslated region region” may refer to a DNA sequence region that serves as a template capable of generating 3'-untranslated region mRNA through the above-described transcription process.
  • the open reading frame region may include a nucleotide sequence encoding an antigen derived from a pathogen.
  • an antigen derived from a pathogen may be selected from the group consisting of virus, bacterium, prion, fungus, protozoon, viroid, and parasite, but is limited thereto it is not going to be
  • the open reading frame region may be a nucleotide sequence encoding a viral surface protein or a functional domain thereof, but if it is an mRNA antigen that can infect mammals, including humans, and cause pathological symptoms, it can be expanded without limitation. Applicable.
  • the 5'-untranslated region region is a modified sequence derived from human hemoglobin subunit alpha2 (HBA2), and has at least 90% or more sequence identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or the nucleotide sequence It may consist of a sequence having.
  • HBA2 human hemoglobin subunit alpha2
  • the 3'-untranslated region region is a modified sequence derived from human hemoglobin subunit beta (HBA2), having at least 90% sequence identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or the nucleotide sequence A unit sequence composed of sequences may be repeated twice.
  • the 3'-untranslated region may be composed of nucleotide sequences to which the unit sequences are directly linked or linked by a linker sequence.
  • the 3'-untranslated region may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or a sequence having at least 90% sequence identity with the nucleotide sequence.
  • the gene construct is a nucleotide sequence operably linked to the 5'-UTR, which is transcribed as a 5' Cap, and/or a poly A tail operably linked to the 3'-UTR region. It may further include a nucleotide sequence to be transcribed.
  • 5'Cap refers to a structure located at the 5' terminal region that affects the stability and expression efficiency of a polynucleotide, and is generally modified by a nucleotide, particularly a derivative of guanine nucleotide.
  • the 5'cap is m 7 G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG, m 7 Gppp, Gppp, m 7 (3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA )pG, m 7 (3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeG)pG, G(5')ppp(5')G, m 7 G(5')ppp(5') G, 3 ⁇ -O-Me-m 7 G(5')ppp(5')G, m 7 G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG, or m 7 G(5') It may be any one of ppp(5')(2'OMeA)pU, but a known 5'cap having the same functionality as above may be applied without limitation.
  • Poly A tail is located at the 3' end region that affects the expression efficiency by delaying the degradation process of RNA exo-nuclease and extending the stability and in vivo half-life of polynucleotides.
  • it can generally be formed by a plurality of adenine nucleotide sequences.
  • the poly A tail may consist of 20 to 200 adenines, for example, 20 to 190, 20 to 170, 20 to 150, 20 to 130, 20 to 110, 20 to 90, 20 to 70, 20 to 50, 20 to 30, 30 to 190, 30 to 170, 30 to 150, 30 to 130, 30 to 110, 30 to 90, 30 to 70, or 30 to 50 repetitive adenine nucleotide sequences.
  • the poly A tail may be composed of a plurality of units linked by a linker.
  • the mRNA transcription vector includes a promoter region and a gene construct consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 15, and the gene construct consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 5'- UTR region; an ORF region operably linked to the 5′-UTR region; And it may be a plasmid comprising a 3'-UTR region consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the mRNA transcription vector according to one embodiment including a gene construct having a combination of a specific 5'-UTR region and a 3'-UTR region, produces luciferase mRNA with higher efficiency than conventional vectors. was able to manifest.
  • the mRNA molecule according to one embodiment prepared by adopting the coronavirus spike protein as the target mRNA antigen induces a high level of immune response when administered to an animal model in the form of a vaccine formulation, including various types of modifications.
  • the mRNA transcription vector can be used in the field of manufacturing mRNA molecules and therapeutic agents or vaccines containing the mRNA molecules.
  • Another aspect provides a method for producing an mRNA molecule comprising performing in vitro transcription using the mRNA transcription vector as a template, and the mRNA molecule prepared by the method.
  • in vitro transcription refers to a process in which a target mRNA molecule is synthesized in a cell-free system (in vitro), and preferably, DNA constituting a transcription vector is a template for mRNA transcript production. , and RNA polymerase can be used to control the transcription process in vitro.
  • DNA templates for RNA in in vitro RNA transcription can be obtained by cloning a specific cDNA corresponding to each RNA to be transcribed in vitro and introducing it into a suitable vector for RNA in vitro transcription.
  • the performing of the in vitro transcription is performed using an mRNA transcription vector according to an embodiment comprising a gene construct having a combination of the above-described specific 5'-UTR region and 3'-UTR region.
  • Other execution conditions or the configuration of the ORF region may be appropriately changed and implemented according to the purpose.
  • Another aspect is an immunogenic composition
  • an immunogenic composition comprising the mRNA molecule and a pharmaceutically acceptable excipient as active ingredients, a medical use of the mRNA transcription vector or the mRNA molecule prepared by the transcription vector for preparing the immunogenic composition, or a method of stimulating an immune response comprising administering the immunogenic composition to a subject.
  • the term "immunogenic composition” refers to an active ingredient effective for inducing a certain level of immunity in a subject against a specific pathogen or disease, or a substance containing an effective amount thereof, and the term “vaccine”, “vaccine” It can be used interchangeably with “agent”, “vaccine composition”.
  • the immunogenic composition may be a pharmaceutical composition that induces a decrease in the severity, duration or other symptoms of a disease or symptom associated with infection by a pathogen.
  • the immunogenic composition may optionally include pharmaceutically acceptable carriers, diluents, excipients, buffers, salts, surfactants, cryoprotectants, and the like.
  • the term "immunogenicity” refers to the ability of a composition to elicit an immune response against a specific pathogen, wherein the immune response is primarily a cellular immune response mediated by cytotoxic T-cells and cytokine-producing T-cells. response, or a humoral immune response mediated primarily by helper T-cells followed by activation of B-cells to produce antibodies.
  • the term "pharmaceutically acceptable excipient” may include any substance that maintains the activity of the mRNA molecule when combined/mixed with the mRNA molecule and does not react with the subject's immune system.
  • buffer systems such as phosphate buffered saline, surfactants, water, emulsions such as oil/water emulsions and various types of humectants, starch, milk, sugar, certain types of clay, gelatin, stearic acid or salts thereof, magnesium or any standard pharmaceutical excipients such as, but not limited to, calcium stearate, talc, vegetable oils, gums, glycols, or other known excipients.
  • the immunogenic composition may be in any form known in the art, for example, in the form of a solution or an injection, but is not limited thereto. In the case of liquid or injection, 10 to 40% of propylene glycol and the like may be contained if necessary. Any diluent or buffer known in the art may be included in the solution or injection.
  • the immunogenic composition may be prepared immediately before use by preserving a preparation containing the active ingredient in a container such as a vial and adding a necessary carrier or adjuvant, saline, etc. to the injection before use.
  • the mRNA molecule may form a complex with at least one lipid component to form liposomes, lipid nanoparticles, and/or lipoplexes.
  • the lipid nanoparticles contain an ionizable cationic lipid as one component, and a helper lipid that encapsulates mRNA or aids in delivery efficiency and stabilization. ), and other ingredients such as stabilizers may also be included.
  • the lipid nanoparticle may include cationic and neutral lipids (eg, phospholipids), sterols or steroids (eg, cholesterol), PEG-conjugated lipids, and the like.
  • cationic lipid include ALC-0315 ([(4-hydroxybutyl) azanediyl] di (hexane-6,1-diyl) bis (2-hexyldecanoate)), SM-102 (9-Heptadecanyl 8- ⁇ (2-hydroxyethyl)[6-oxo-6-(undecyloxy)hexyl]amino ⁇ octanoate), N,N-dioleyl-N,N-dimethyIammonium chloride (DODAC), N-(l-(2,3-dioleyloxy )propyl)-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA), N-(l-(2,3-
  • the lipid nanoparticle is a cationic lipid (in the range of 35 to 60 mol% of total lipids), phospholipids (in the range of 5 to 15 mol% of total lipids), cholesterol (30% of total lipids), such as the type described above. to 50 mol% range), and PEG-conjugated lipids such as DMG-PEG 2000 (0.5 to 2.5 mol% range of total lipids), but is not particularly limited thereto.
  • components known in the art may be applied to the lipid nanoparticle, and may include cationic lipids, helper lipids, and PEG-conjugated lipids.
  • the cationic lipid is, for example, ALC-0315 and/or SM-102;
  • Helper lipids include Distearoylphosphatidylcholine (DSPC) and/or Cholesterol;
  • the PEG-conjugated lipid may be ALC-0159, and/or PEG-Dimyristoyl glycerol (PEG-DMG), for example ALC-0315: DSPC: Chol: ALC-0159 (47.5:10:40.8:1.7 mol%) ), but may be a particle made of, but is not limited thereto.
  • the lipid compounds disclosed in WO2014/172045A1, WO2020/252589A1, and WO2021/000041A1 may be used as the lipid of the lipid nanoparticle without particular limitation, and PNI123/DSPC/Cholesterol/PEG-DMG (50:10: 38.5 or 37.5: 1.5 or 2.5 mol%), PNI123/DOPE/Cholesterol/PEG-DMG may be used, but is not limited thereto either.
  • the term "individual” means a subject in need of treatment or prevention of a disease, and more specifically, a human or non-human primate, mouse, dog, cat, horse, cow, etc. of mammals.
  • a target mRNA molecule can be expressed with high efficiency by including a specific gene construct.
  • the mRNA molecule prepared by the method induces a high level of immune response in an animal model and can be applied to the treatment or prevention of various infections.
  • the mRNA molecule-related technology can be used in the field of manufacturing mRNA molecules and therapeutic agents or vaccines including the mRNA molecules.
  • FIG. 1 is a diagram schematically illustrating the structure of an mRNA transcription vector according to an embodiment.
  • Figure 2 is a schematic diagram showing the structure of an mRNA transcription vector prepared to compare the intracellular antigen expression level with the mRNA transcription vector according to one embodiment
  • Figure 2 A shows pSKBS-Luciferase
  • Figure 2 B represents pMod-Luciferase
  • C in FIG. 2 represents pBNT-Luciferase.
  • FIG. 3 is a result of transfecting HEK 293 cells with a luciferase mRNA molecule prepared using an mRNA transcription vector according to an embodiment, and confirming the luciferase activity accordingly.
  • Figure 4 is a result of confirming the antibody titer of IgG in the serum of mice induced by the composition after administering an immunogenic composition containing a coronavirus spike mRNA molecule according to an embodiment to mice.
  • Figure 5 is an immunogenic composition comprising a full-length spike mRNA molecule (Spike) or RBD mRNA molecule (RBD) in coronavirus according to an embodiment was administered to a mouse, and then the IgG in the serum of the mouse induced by the composition This is the result of comparing antibody titers.
  • Spike spike mRNA molecule
  • RBD RBD mRNA molecule
  • Figure 6 is a result of comparing antibody titers of IgG in the serum of mice induced by the composition after administering an immunogenic composition comprising a spike mRNA molecule having a modified poly-A tail sequence according to one embodiment to mice. am.
  • FIG. 11 shows changes in the ratio of KI-67 + , CD62L low , CD44 high , and CD8 + T cells according to external antigen stimulation in animal models (G1 to G5) to which each vaccine preparation was administered according to an embodiment. This is the result of checking
  • FIG. 12 is a result of evaluating immunogenicity to an omicron spike protein antigen over time in animal models (G1 to G5) to which each vaccine formulation according to an embodiment was administered, and FIG. 12 A is the result of confirming the antibody titer level of Omicron RBD IgG1, and B in FIG. 12 is the result of confirming the antibody titer level of Omicron RBD IgG2a.
  • FIG. 13 is a result of evaluating immunogenicity to the Wuhan Spike protein antigen over time in animal models (G1 to G5) to which each vaccine formulation according to an embodiment was administered.
  • FIG. 13B is the result of confirming the antibody titer level of Wuhan RBD IgG2a
  • C of FIG. 13 is the result of confirming the antibody titer level of Wuhan S IgG1
  • FIG. 13 D is the result of confirming the antibody titer level of Wuhan S IgG2a.
  • VNT50 serum dilution factor
  • Example 1 Preparation of mRNA antigen expression system and comparison of expression level of target antigen
  • an mRNA transcription vector according to an embodiment was prepared using luciferase mRNA as a target antigen, and the prepared mRNA molecules were transfected into HEK 293 cells, and their expression levels were quantitatively compared.
  • the promoter region sequence, 5' UTR region sequence, ORF region sequence, 3' UTR region sequence, and poly A-tail region sequence can be operated sequentially.
  • An mRNA transcription vector was prepared using the linked structure as a basic skeleton.
  • the T7 promoter and 5'UTR region sequence (SEQ ID NO: 6) were inserted between the KpnI and BamHI recognition sites (GGTACC to GGATCC), and then between the XbaI and HindIII recognition sites of the plasmid ( TCTAGA ⁇ AAGCTT) by inserting 3'UTR and A30LA70 (SEQ ID NO: 7) to construct a pSKBS plasmid (SEQ ID NO: 8).
  • the luciferase gene (SEQ ID NO: 9) was inserted between the BamHI and XbaI recognition sites (GGATCC ⁇ TCTAGA) of the plasmid to construct pSKBS-Luciferase plasmid (SEQ ID NO: 10) did
  • the genetic information of the main functional structures in the pSKBS-Luciferase plasmid is shown in Table 1 below.
  • the pMod-Luciferase plasmid containing 5'UTR and 3'UTR of Moderna (Comparative Example 1), 5'UTR of BioNTech and pBNT-Luciferase plasmids (Comparative Example 2) containing 3'UTR were prepared (2004, NAR, A simple, rapid, high-fidelity and cost effective PCR based two step DNA synthesis method for long gene sequence).
  • the pMod-Luciferase plasmid uses the pUC19 plasmid, inserts the T7 promoter and Moderna's 5'UTR region sequence (SEQ ID NO: 11) between the KpnI and BamHI recognition sites (GGTACC to GGATCC), then the plasmid By inserting Moderna's 3'UTR region sequence (SEQ ID NO: 12) between the XbaI and SacII recognition sites (TCTAGA ⁇ CCGCGG), and inserting the luciferase gene between the BamHI and XbaI recognition sites (GGATCC ⁇ TCTAGA) of the plasmid, produced.
  • the pBNT-Luciferase plasmid also adopts the recognition site used in the construction of the pMod-Luciferase plasmid, and uses BioNTech's 5'UTR region sequence (SEQ ID NO: 13) and 3'UTR region sequence (SEQ ID NO: 14) in the same way. inserted.
  • the structure of the mRNA transcription vector prepared in this example is shown in Figure 2.
  • E. coli transformed with the plasmid prepared in Example 1-1 was cultured, the plasmid was isolated therefrom, and the plasmid was linearized using EcoRV restriction enzyme. After recovering the linearized plasmid using PCI ethanol precipitation, it was used in an in vitro transcription (IVT) reaction for mRNA production. To this end, after mixing the linearized plasmid DNA template according to the conditions described in Table 2, the mixture was reacted at 37 °C for 2 hours. Then, after the above reaction was terminated, DNase1 at a concentration of 2 KU/mL was added thereto and reacted at 37° C. for 15 minutes to remove the linearized plasmid.
  • IVTT in vitro transcription
  • the synthesized mRNA was purified using the MEGAclear Transcription Clean-Up Kit (Thermo Fisher). Then, the HEK293 cell line was transfected with the purified mRNA using LipofectamineTM MessengerMAX (Thermo Fisher). 24 hours after the transfection was performed, the activity of luciferase expressed in the HEK293 cell line was measured using the ONE-GloTM Luciferase Assay System (Promega), and the relative expression level of luciferase was determined through the measured activity. was evaluated. Meanwhile, as a control group, a group (Mock) that did not perform transfection was used.
  • FIG. 3 is a result of transfecting HEK 293 cells with a luciferase mRNA molecule prepared using an mRNA transcription vector according to an embodiment, and confirming the luciferase activity accordingly.
  • the luciferase mRNA molecule prepared using the mRNA transcription vector according to one embodiment showed a high level of luciferase activity when transfected into a host cell, and through this, by the target mRNA antigen Excellent intracellular expression efficiency was confirmed.
  • an mRNA transcription vector according to an embodiment was prepared using corona spike mRNA as the target antigen, and the mRNA molecule produced through this was formulated into a lipid mRNA-LNP (mRNA-lipid Nanoparticle) vaccine formulation, It was administered to an animal model to evaluate the immunogenicity, specifically, the level of antibody formation.
  • lipid mRNA-LNP mRNA-lipid Nanoparticle
  • An mRNA transcription vector was prepared in a manner similar to Example 1-1. Specifically, in this example, using the pUC19 plasmid and the T7 promoter (SEQ ID NO: 15) in which +1 is A and +2 is G, the promoter and After inserting the 5'UTR region sequence (SEQ ID NO: 16), the 3'UTR and A20 (SEQ ID NO: 17) were inserted between the XbaI and HindIII recognition sites (TCTAGA ⁇ AAGCTT) of the plasmid to obtain pSKBS-AG plasmid (SEQ ID NO: 16). No. 18) was produced.
  • the spike gene (SEQ ID NO: 19) of the SARS-CoV2 beta-mutant virus was inserted between the BamHI and XbaI recognition sites (GGATCC ⁇ TCTAGA) of the plasmid, pSKBS-Spike (SA) -AG plasmid (SEQ ID NO: 20) produced.
  • mRNA was prepared using the pSKBS-Spike(SA)-AG plasmid prepared above. More specifically, E. coli transformed with the prepared plasmid was cultured, and the plasmid was isolated therefrom, and then the plasmid was linearized using EcoRV restriction enzyme. After the linearized plasmid was recovered using PCI ethanol precipitation, it was used for in vitro transcription reaction for mRNA production. To this end, after mixing the linearized plasmid DNA template according to the conditions described in Table 3, the mixture was reacted at 37 °C for 2 hours. Then, after the reaction was terminated, DNase1 at a concentration of 2 KU/mL was added thereto and reacted at 37° C.
  • the materials were mixed under the conditions shown in Table 4 using the Poly(A) Polymerase Tailing Kit (Lucigen), and reacted at 37 °C for 1 hour. Then, the synthesized mRNA was purified by AKTA FPLC (GE Healthcare) using a CIMmultus ® Oligo dT (Sartorius) column.
  • the purified mRNA molecule/stock solution of Example 2-1 was formulated as a lipid mixture to prepare mRNA-LNP (Lipid nanoparticle) encapsulated with mRNA in the lipid component.
  • mRNA-LNP Lipid nanoparticle
  • the mRNA stock solution was diluted to 0.17 mg/mL with Formulation Buffer, GenVoy-ILM (PRECISION NANOSYSTEMS) was diluted 1/2 with ethanol, and each of them was filled into a syringe.
  • MWCO 50 kDa centrifugal ultrafiltration unit
  • 0.1 mL injection containing 100 ⁇ l of the stock solution containing 5 ⁇ g or 25 ⁇ g of mRNA-LNP prepared in Example 2-2 was injected into an animal model (mouse, BALB/c, female) at week 0, 2 or 3
  • Intramuscular administration (IM) was administered twice at weekly intervals.
  • serum was separated from specimens collected from animal models before and after administration, and the antibody titer of IgG produced by the vaccine preparation was measured by ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) using the serum as a sample. Specifically, after coating the surface of a 96-well plate with 1 ⁇ g/mL antigen, it was incubated at 2-8° C. for 18 ⁇ 2 hours.
  • Figure 4 is a result of confirming the antibody titer of IgG in the serum of mice induced by the vaccine preparation containing the coronavirus spike mRNA molecule according to an embodiment to mice. As shown in FIG. 4, it was confirmed that an effective level of IgG antibody titer was formed by administering the mRNA-LNP vaccine formulation according to one embodiment, and it was found that the efficacy was enhanced by repeated administration.
  • the poly-A tails in this embodiment include a 124 nt-long poly-A tail (A124, SA), a 30 nt-long poly-A and a 70 nt-long poly-A connected by a GCAUAUGACU linker (A30LA70, SAL) was used, and as a modification of the uridine sequence, pseudouridine ( ⁇ ) was applied instead of uridine.
  • 5 to 7 are vaccine formulations containing a full-length spike mRNA molecule (Spike) or RBD mRNA molecule (RBD) in coronavirus according to an embodiment, and vaccine formulations including a spike mRNA molecule having a modified poly-A tail sequence, according to an embodiment.
  • Spike full-length spike mRNA molecule
  • RBD RBD mRNA molecule
  • FIGS. 5 to 7 it was confirmed that an effective level of IgG antibody titer was formed even in vaccine formulations including various types of modifications.
  • the mRNA transcription vector is the SARS-CoV2 Omicron spike-2P prefusion type gene between the BamHI and XbaI recognition sites (GGATCC to TCTAGA) of the pSKBS-AG plasmid (SEQ ID NO: 18) of Example 2-1 (SEQ ID NO: 21), SARS-CoV2 Omicron spike-6P prefusion type gene (SEQ ID NO: 22), or SARS-CoV2 Wuhan spike-2P prefusion type gene (SEQ ID NO: 23).
  • N1-methyl pseudouridine m1 ⁇
  • the prepared mRNA was formulated and 0.1 mL of injection containing 100 ⁇ l of stock solution containing 10 ⁇ g of mRNA-LNP was intramuscularly administered to animal models (mouse, BALB/c, female), respectively.
  • the prepared mRNA-LNP stock solution was intramuscularly administered (IM) to an animal model (mouse, BALB/c, female). Specifically, it was administered twice at 2-week intervals at week 0 and week 2, and after 1 week of secondary immunization, the spleen was harvested through autopsy, red blood cells were removed from the spleen, and spleen cells were obtained.
  • IM intramuscularly administered
  • the spleen was harvested through autopsy, red blood cells were removed from the spleen, and spleen cells were obtained.
  • CD4 T cells and CD8 T cells responding to the antigen were analyzed by FACS (Fluorescence-activated cell sorting), and the results are shown in FIGS. 8 to 11 .
  • FIGS. 10 and 11 show CD103 + , CD62L high , CD44 high , CD4 + T cells and KI-67 according to external antigen stimulation, targeting animal models (G1 to G5) to which each vaccine formulation according to an embodiment was administered.
  • FIGS. 10 and 11 are targeting animal models (G1 to G5) administered with each vaccine formulation according to an embodiment, external antigen
  • a foreign antigen that is, a spike antigen of SARS-CoV2 antigen mixture, SARS-CoV2 Wuhan or SARS-CoV2 Omicron
  • resident memory CD4 T cells CD4 Memory resident T cells
  • proliferative memory CD4 T cells CD4 Memory proliferation T cells
  • the prepared mRNA-LNP stock solution was intramuscularly administered (IM) to an animal model (mouse, BALB/c, female). It was administered twice at 2-week intervals at 0 and 2 weeks, and serum was separated from blood samples collected before administration and at 2 and 4 weeks after administration. Then, using the separated serum as a sample, the antibody titer of IgG produced by the vaccine preparation was measured through ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) in the same manner as in Example 2-3. Thereafter, RBD protein and Spike protein of each strain were coated with an antigen to measure Ig antibody titers, and the results are shown in FIGS. 12 and 13 .
  • FIG. 12 is a result of evaluating immunogenicity to an omicron spike protein antigen over time in animal models (G1 to G5) to which each vaccine formulation according to an embodiment was administered, and FIG. Immunogenicity to the Wuhan Spike protein antigen was evaluated over time in animal models (G1 to G5) to which each vaccine formulation according to the Example was administered.
  • the vaccine formulations prepared according to one embodiment, in view of the antibody formation level were administered with SARS-CoV2 Omicron spike mRNA vaccine formulations over all time points in the G1 group and the G2 group group showed cross-reactivity to the Wuhan spike protein antigen, and it was confirmed that the G5 group administered with the SARS-CoV2 Wuhan spike mRNA vaccine formulation also showed cross-reactivity to the omicron spike protein antigen.
  • PBNA Humoral immunoassay
  • the prepared mRNA-LNP stock solution was intramuscularly administered (IM) to an animal model (mouse, BALB/c, female). It was administered twice at 2-week intervals, 0 weeks and 2 weeks, and serum was separated from blood samples collected 2 weeks after administration. Thereafter, neutralizing antibody analysis (PBNA) was performed using the separated serum as a sample.
  • SARS-CoV2 Wuhan (D614G), VSV pseudotyped virus (REVACC SCIENTIFIC) containing omicron mutant Spike protein and luciferase gene were appropriately diluted. Thereafter, this was mixed with the serial dilution serum sample, treated with the Vero cell line, and infected for 24 hours. Luciferase activity was measured, and the results are shown in FIG. 14 .
  • VNT50 serum dilution factor

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Abstract

본 출원은 단백질 발현을 위한 mRNA와 이를 위한 주형에 관한 것으로서, 일 실시예에 따른 유전자 컨스트럭트를 포함하는 mRNA 전사 벡터, 상기 mRNA 전사 벡터를 이용하여 시험관내 전사를 수행하는 단계를 포함하는 mRNA 분자를 제조하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 mRNA 분자, 및 상기 mRNA 분자를 유효 성분으로 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.

Description

단백질 발현을 위한 MRNA와 이를 위한 주형
단백질 발현을 위한 mRNA와 이를 위한 주형에 관한 것이다. 본 특허출원은 2021년 07월 27일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2021-0098684호, 및 2022년 05월 20일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2022-0062306호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
핵산 기반의 치료 및 백신 개발 기술은 세포 수준을 넘어 대상 개체에 적용하였을 때, 충분하지 못한 전사, 번역 효율을 가지게 되어 치료제로서 충분하지 못한 효과를 보여왔으며, 이는 핵산 기반 치료제 개발의 한계로 지적되어 왔다. 따라서, 감염성 질병의 치료를 위한 항원성 단백질에 대한 세포내/외에서의 발현 능력을 높이는 것은 인공적인 핵산 분자를 이용한 의약품의 개발에 있어 필수적인 요건 중 하나이다. 또한, 핵산 기반의 치료 및 백신 개발 분야에서 mRNA 기반의 치료제에 대해서도, 안정성과 번역 효율이 높은 mRNA 서열을 확보하는 것이 필수 조건으로 대두되고 있다.
한편, mRNA　백신은　mRNA에 의해 코딩된 단백질을　항원 (antigen)으로 하여 암, 감염성 질환, 자가면역 질환 등의 예방 및 치료에 사용되는 의약품을 지칭한다. 상기　mRNA　백신은 DNA 백신과 비교하여, 안정하며 대량생산이 용이하다는 장점이 있어 향후 항암 백신과 팬더믹 상황에서의 감염성 질환 백신 플랫폼으로 널리 활용이 기대되고 있다. 상기 mRNA 백신은 자연적인 mRNA 구조를 모방하여 제작된 인공적인 RNA 분자를 유효 성분으로 포함하며, 상기 RNA 분자를 이용하여　개체의 면역 계통을 강화하는 것을 주요 목표로 한다. 현재, 모더나의 mRNA-1273, 바이온텍/화이자의　BNT162b2 등은 긴급사용승인 절차를 통해 상용화된 바 있으나, 이러한 mRNA 백신은 RNA 분자의 불안정성으로 인해 세포질로의 전달을 위한 기술적 요소가 필수적으로 필요하다는 점, 세포질로 RNA 분자가 전달된 후, 과다한 선천성 면역반응으로 인한 RNA 분자의 손상 또는 번역 효율 저하를 최소화하여야 한다는 점에서, 상기 mRNA 백신 기술 분야에 대한 다각적인 연구가 요구된다. 특히, 근본적으로 naked　mRNA가 가지고 있는 톨-유사 수용체 작용자 (toll-like receptor agonist; TLR agonist) 등과 같은 아주번트 (adjuvant)의 자극을 유도하는 면역활성화 성질은, 반대로　mRNA의 전사 신호전달 체계를 방해하기 때문에, 약학적 활성을 나타낼 만큼 충분한 양의　mRNA　항원이 발현되는 것을 저해하는 것으로 알려져 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 면역원성이 제거된, 또는 약화시킨 modified　mRNA를 이용하여, 백신을 제조하려는 시도가 활발하게 진행 중이다. 하지만, 이 경우에는　mRNA의 낮은 면역원성(immunogenicity) 때문에 이 역시 효과적인 체액성 면역 및/또는 세포성 면역반응을 유도하는 데 한계가 있는 실정이다.
이러한 기술적 배경 하에서, 의약적으로 사용되는 mRNA 분자의 효용성을 향상시키기 위한 개발의 일환으로써, mRNA 분자의 발현을 향상시키거나, 이의 면역원성을 증진시키기 위한 다각적인 연구가 진행되고 있으나 (한국 공개 특허 10-2022-0017377), 아직은 미비한 실정이다.
일 양상은 RNA 중합효소 (RNA polymerase)에 의해 인식되는 프로모터 영역 및 목적 mRNA 항원의 발현을 향상시킬 수 있는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 mRNA 전사 벡터를 제공하는 것이다.
다른 양상은 mRNA 전사 벡터를 주형으로 이용하는 mRNA 분자를 제조하는 방법, 및 상기 방법에 의해 제조된 mRNA 분자를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 mRNA 분자 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 유효 성분으로 포함하는, 면역원성 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
일 양상은 RNA 중합효소 (RNA polymerase)에 의해 인식되는 프로모터 영역 및 상기 프로모터 영역과 작동 가능하게 연결된, 유전자 컨스트럭트를 포함하는 mRNA 전사 벡터로서,
상기 유전자 컨스트럭트는 서열번호 1 또는 이와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 5’-비번역 부위 (5’-Untranslated region: 5’-UTR) 영역; 상기 5’-UTR 영역에 작동 가능하게 연결된, 목적 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 오픈 리딩 프레임 (Open reading frame: ORF) 영역; 및 상기 오픈 리딩 프레임 영역에 작동 가능하게 연결된, 서열번호 2 또는 이와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 단위체 서열이 2회 반복되는 3’-비번역 부위 (3’-Untranslated region: 3’-UTR) 영역을 포함하는, mRNA 전사 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 용어, "뉴클레오티드 서열"는 복수의 뉴클레오티드 단위체를 포함하는 고분자 물질로서, 구체적으로, 복수의 뉴클레오티드 단위체가 당/포스페이트 기본 골격의 포스포디에스테르 결합에 의해 서로 연결되어 있는 폴리머를 지칭하며, 용어, "폴리뉴클레오티드", "핵산", "핵산 분자"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 생명체에 필수적인 생체 고분자로서, 고유의 염기 서열을 통해 유전적 정보를 코딩하는 RNA 또는 DNA일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단리되거나 (Isolated), 인위적으로 합성되거나 (Artificially synthesized), 또는 비-천연 발생 또는 조작 (Non-naturally occurring or engineered)된 것이며, 상기 “비-천연 발생 또는 조작”은 자연 상태에서 일어나는 존재 그대로의 상태가 아닌, 인위적인 변형을 가하여 생성된 상태를 의미한다. 여기서, 상기 인위적인 변형은 자연적인 mRNA, 구체적으로, 성숙 mRNA의 구조를 모방하여 세포에서 목적 항원의 발현을 향상시키기 위한 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "mRNA (Messenger RNA)"는 DNA 주형으로부터 전사되고, DNA의 유전 정보를 세포질 안의 리보솜으로 전달하는 RNA를 지칭한다. 진핵 유기체에서의 전사 과정은 세포의 핵 내에서 진행되며, 미성숙 RNA (Premature RNA)를 가공하는 과정을 포함한다. 구체적으로, 이러한 과정을 전사 후 변형(Post-transcriptional modification)이라 일컬으며, 스플라이싱 (Splicing), 5'-캡핑 (Capping), 폴리아데닐레이션(Polyadenylation), 핵 또는 미토콘드리아로부터 유출 (Export) 등의 과정을 포함한다. 이러한 과정이 진행된 결과, 특정 펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열로 번역될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 성숙 mRNA (Mature mRNA)를 생성한다. 일반적으로, 상기 성숙 mRNA는 선택적으로, 5'-캡, 5'UTR, 오픈 리딩 프레임, 3'UTR, 및 폴리 A 테일을 포함할 수 있다. 상기 mRNA는 여러 가지 공지의 방법 중 임의의 것을 따라 합성될 수 있고, 예를 들어, 상기 mRNA는 시험관내 전사 (IVT)를 통해 합성될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "벡터"는 적당한 숙주 세포에서 목적 항원을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 지칭한다. 일 실시예에 따른 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 및/또는 인핸서와 같은 발현 조절 요소를 포함할 수 있으며, 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 상기 벡터는, 숙주 세포 내에서 안정적으로 목적 항원을 발현시킬 수 있는, 발현용 벡터일 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있고, 상기 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다. 상기 벡터에서, 전술한 유전자 컨스트럭트 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있을 수 있다. 용어, "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 하나의 기능이 다른 것에 의하여 영향을 받도록 단일 핵산 단편 상에서 뉴클레오티드 서열들이 연결된 것을 나타낼 수 있다. 일 구체예에서, 상기 벡터는 숙주 세포에서 목적 항원으로서 mRNA 분자를 발현할 수 있는 벡터일 수 있으며, 즉, mRNA 전사 벡터를 지칭하는 것일 수 있다. 상기 mRNA 전사 벡터는 DNA 형태의 유전자 작제물로 구성되며, mRNA 제조를 위한 주형 DNA를 지칭하는 것일 수 있다. 이를 위하여, 상기 mRNA 전사 벡터는 RNA 중합효소에 의해 인식되는 프로모터를 포함하고, 이를 매개로 하는 전사 (Transcription) 과정을 통해 mRNA 분자를 생성할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 mRNA 전사 벡터는 플라스미드 형태일 수 있으며, 또한, 상기 mRNA 전사 벡터는 선형화된 벡터, 구체적으로, 선형화된 플라스미드일 수 있다. 상기 선형화된 플라스미드는 제한 효소가 인식 부위에서 플라스미드 DNA를 절단하고, 플라스미드 구조를 파괴하는 적합한 조건 하에서, 플라스미드 DNA를 제한 효소와 접촉시킴으로써 수득될 수 있다. 상기 선형화된 플라스미드는 유리 5' 말단, 및 유리 3' 말단을 포함하며, 이는 후속 단계인 시험관 내 전사 과정을 수행하기 위한 것일 수 있다. 또한, 상기 플라스미드에서 플라스미드의 종류, 제한효소 인식 부위 등의 요소는 당업계의 공지의 기술이 비제한적으로 적용될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "RNA 중합효소 (RNA polymerase)"는 DNA로부터 1차 전사체 (primary transcript) RNA를 합성하는 효소를 지칭한다. 상기 RNA 중합효소로는 예를 들어, T7 RNA 중합효소, T3 RNA 중합효소, SP6 RNA 중합효소, 또는 미토콘드리아 중합효소(POLRMT)일 수 있다. 상기 용어, "RNA 중합효소에 의해 인식되는 프로모터 영역”은 전술한 전사 과정을 통해 RNA 중합효소에 의해 인식되는 프로모터 mRNA를 생성할 수 있는 주형으로 작용하는 DNA 서열 영역을 지칭할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 프로모터 영역은 세포질에서 작용하는 RNA 중합효소에 의해 인식되는 것일 수 있고, 예를 들어, T7 RNA 중합효소에 의해 인식되는 것으로서, 서열번호 4 또는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "동일성"은 폴리머 분자들 간의, 예를 들어, 핵산(예를 들어, DNA 분자들 및/또는 RNA 분자들) 간의 및/또는 폴리펩티드 간의 전체 관련성을 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 이들의 아미노산 서열이 적어도, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일하다면 서로 "실질적으로 동일한" 것으로 간주된다. 두 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 동일성 퍼센트의 계산은, 예를 들어, 최적의 비교 목적을 위해 두 서열을 정렬함으로써 수행될 수 있다(예를 들어, 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭이 도입될 수 있고, 비교 목적을 위해 비-동일 서열이 무시될 수 있다). 예를 들어, 비교 목적으로 정렬된 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 실질적으로 100%이다. 이어서, 상응하는 위치에서의 핵산 또는 폴리펩티드 서열이 비교된다. 두 서열 간의 동일성 퍼센트의 결정 및 서열의 비교는 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 당업자에게 널리 공지된 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 뉴클레오티드 서열의 경우 BLASTN, 및 아미노산 서열의 경우 BLASTP, gapped BLAST, 및 PSIBLAST와 같이 상업적 컴퓨터 프로그램에서 입수 가능한 것들을 포함하는 임의의 다양한 알고리즘을 이용하여 비교될 수 있다.
본 명세서에 있어서, 뉴클레오티드 서열의 위치와 관련하여 달리 언급이 없으면, 5' 말단으로부터 3' 말단의 방향으로 연결되거나 위치하는 것을 나타낸다.
또한, 상기 유전자 컨스트럭트는 mRNA 분자 또는 mRNA 항원의 발현을 향상시키기 위한 기술적 요소로서, 5’-비번역 부위 영역; 목적 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 오픈 리딩 프레임 영역; 및 3’-비번역 부위 영역을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "오픈 리딩 프레임 (Open reading frame)"은 일반적으로 펩티드 또는 단백질로 번역될 수 있는 여러 뉴클레오티드 트리플렛 (Triplets)의 서열일 수 있으며, 용어, "단백질 코딩 영역"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 오픈 리딩 프레임은 이의 5'-말단으로부터 시작되는 후속 영역 (Subsequent region)에 바람직하게 시작 코돈, 즉, 아미노산 메티오닌을 코딩하는 3개의 뉴클레오티드 서열의 조합 (ATG 또는 AUG)을 포함하며, 3'말단 방향의 영역에 바람직하게 번역의 종결을 지시하는 정지 코돈 (예를 들어, TAA, TAG, TGA, 또는 UAA, UAG, UGA)을 포함할 수 있다. 용어, "오픈 리딩 프레임 영역”은 전술한 전사 과정을 통해 오픈 리딩 프레임 mRNA, 즉, 목적 mRNA 항원을 생성할 수 있는 주형으로 작용하는 DNA 서열 영역을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "5’-비번역 부위 (5' -Untranslated region)"는 상기 오픈 리딩 프레임의 5' 말단에 위치하는 영역, 구체적으로, 개시 코돈으로부터 상류에 있는 mRNA 영역을 지칭한다. 상기 용어, "5’-비번역 부위 영역”은 전술한 전사 과정을 통해 5’-비번역 부위 mRNA를 생성할 수 있는 주형으로 작용하는 DNA 서열 영역을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "3’-비번역 부위 (3'-Untranslated region: 3'-UTR)"는 상기 오픈 리딩 프레임의 3' 말단에 위치하는 영역, 구체적으로, 정지 코돈으로부터 하류에 있는 mRNA 영역을 지칭한다. 상기 용어, "3’-비번역 부위 영역”은 전술한 전사 과정을 통해 3'-비번역 부위 mRNA를 생성할 수 있는 주형으로 작용하는 DNA 서열 영역을 지칭할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 오픈 리딩 프레임 영역은 병원체로부터 유래되는 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 여기서, 바이러스(virus), 박테리아(bacterium), 프리온(prion), 균류(fungus), 원생동물(protozoon), 바이로이드(viroid), 및 기생동물(parasite)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 오픈 리딩 프레임 영역은 바이러스 표면 단백질, 이의 기능적 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열일 수 있으나, 인간을 포함하는 포유류에 감염되어 병리학적 증상을 야기할 수 있는 mRNA 항원이라면, 비제한적으로 확장 적용 가능하다.
일 구체예에서, 상기 5’-비번역 부위 영역은 인간 헤모글로빈 서브유닛 알파2 (HBA2)로부터 유래된 서열을 변형한 것으로서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 3’-비번역 부위 영역은 인간 헤모글로빈 서브유닛 베타 (HBA2)로부터 유래된 서열을 변형한 것으로서, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 단위체 서열이 2회 반복되는 것일 수 있다. 여기서, 상기 3’-비번역 부위 영역은 상기 단위체 서열이 직접 연결되거나, 링커 서열에 의해 연결되어 있는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것일 수 있다. 또한, 상기 3’-비번역 부위 영역은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
또한, 상기 유전자 컨스트럭트는 상기 5’-UTR에 작동 가능하게 연결된, 5' 캡 (5' Cap)으로 전사되는 뉴클레오티드 서열 및/또는 상기 3’-UTR 영역에 작동 가능하게 연결된, 폴리 A 테일로 전사되는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "5'캡 (5'Cap)"은 폴리뉴클레오티드의 안정성 및 발현 효율에 영향을 미치는 5'말단 영역에 위치하는 구조물로서, 일반적으로 변형된 뉴클레오티드, 특히 구아닌 뉴클레오티드의 유도체에 의해 형성될 수 있다. 상기 5'캡은 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG, m7Gppp, Gppp, m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG, m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeG)pG, G(5')ppp(5')G, m7G(5')ppp(5')G, 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G, m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG, 또는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pU 중 어느 하나일 수 있으나, 상기와 동일한 기능성을 갖는 공지의 5'캡이 비제한적으로 적용될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "폴리 A 테일 (Poly A tail)"은 RNA exo-nuclease의 분해 과정을 지연시키고, 폴리뉴클레오티드의 안정성과 생체 내 반감기를 연장시켜 발현 효율에 영향을 미치는 3'말단 영역에 위치하는 구조물로서, 일반적으로 복수 개의 아데닌 뉴클레오티드 서열에 의해 형성될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 폴리 A 테일은 20 내지 200개의 아데닌으로 이루어질 수 있으며, 예를 들어, 20 내지 190개, 20 내지 170개, 20 내지 150개, 20 내지 130개, 20 내지 110개, 20 내지 90개, 20 내지 70개, 20 내지 50개, 20 내지 30개, 30 내지 190개, 30 내지 170개, 30 내지 150개, 30 내지 130개, 30 내지 110개, 30 내지 90개, 30 내지 70개, 또는 30 내지 50개의 반복적인 아데닌 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 또한, 상기 폴리 A 테일은 링커에 의해 연결된 복수의 단위체로 구성될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 mRNA 전사 벡터는 서열번호 4 또는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 프로모터 영역 및 유전자 컨스트럭트를 포함하며, 상기 유전자 컨스트럭트는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 5’-UTR 영역; 상기 5’-UTR 영역에 작동 가능하게 연결된, ORF 영역; 및 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 3’-UTR 영역을 포함하는 플라스미드일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 특정 5’-UTR 영역 및 3’-UTR 영역의 조합을 갖는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 일 실시예에 따른 mRNA 전사 벡터는 기존의 벡터에 비해 높은 효율로 루시퍼레이즈 mRNA를 발현시킬 수 있었다. 또한, 목적 mRNA 항원으로 코로나 바이러스 스파이크 단백질을 채택하여 제조한 일 실시예에 따른 mRNA 분자는 백신 제제 형태로 동물 모델에 투여될 경우, 높은 수준의 면역 반응을 유도하였고, 다양한 형태의 변형을 포함하는 mRNA 항원에서도 역시 유효한 면역원성을 나타내었는 바, 상기 mRNA 전사 벡터는 mRNA 분자의 제조 및 상기 mRNA 분자를 포함하는 치료제 또는 백신 분야 등에서 활용될 수 있다.
다른 양상은 상기 mRNA 전사 벡터를 주형으로 하여 시험관내 전사 (in vitro　transcription)를 수행하는 단계를 포함하는 mRNA 분자를 제조하는 방법, 및 상기 방법에 의해 제조된 mRNA 분자를 제공한다.
하기 mRNA 분자를 제조하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 mRNA 분자에 언급된 용어 또는 요소 중 상기 mRNA 전사 벡터에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 상기한 바와 같다
본 명세서에서 용어, “시험관내 전사 (in vitro　transcription)”는 목적 mRNA 분자가 무세포 시스템(시험관 내)에서 합성되는 과정으로서, 바람직하게, 전사 벡터를 구성하는 DNA가 mRNA 전사체 생성을 위한 주형으로 사용될 수 있고, RNA 중합 효소는 시험관 내 전사 과정을 제어하는데 사용될 수 있다. 통상적으로, 시험관내 RNA 전사에서 RNA를 위한 DNA 주형은 시험관내 전사되는 각각의 RNA에 상응하는 특정 cDNA의 클로닝 및 이를 RNA 시험관내 전사를 위한 적합한 벡터를 도입함으로써 수득될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 시험관내 전사를 수행하는 단계는 전술한 특정 5’-UTR 영역 및 3’-UTR 영역의 조합을 갖는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 일 실시예에 따른 mRNA 전사 벡터를 사용하는 것일 수 있으며, 이 밖의 수행 조건, 또는 ORF 영역의 구성은 목적에 따라 적의 변경하여 실시할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 mRNA 분자 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 유효 성분으로 포함하는 면역원성 조성물, 면역원성 조성물을 제조하기 위한 상기 mRNA 전사 벡터 또는 상기 전사 벡터에 의해 제조된 mRNA 분자의 의약적 용도, 또는 상기 면역원성 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다.
하기 면역원성 조성물에 언급된 용어 또는 요소 중 상기 mRNA 전사 벡터, mRNA 분자를 제조하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 mRNA 분자에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 용어, "면역원성 조성물"은 특정 병원체 또는 질환에 대하여 대상체에서 특정한 정도의 면역성을 유도하는 데 효과적인 활성 성분, 또는 이의 유효량을 함유하는 물질을 지칭하며, 용어, "백신", "백신 제제", "백신 조성물"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 또한, 상기 면역원성 조성물은 질환 또는 병원체에 의한 감염과 연관된 증상의 중증도, 지속 시간 또는 다른 징후의 저하를 유도하는 약제학적 조성물일 수 있다. 따라서, 상기 면역원성 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제, 완충제, 염, 계면활성제, 저온보호물질 등을 선택적으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "면역원성"은 특정 병원체에 대해 면역 반응을 유발시키는 조성물의 능력을 의미하며, 상기 면역 반응은 세포독성 T-세포 및 사이토카인-생성 T-세포에 의해 주로 매개되는 세포 면역 반응, 또는 헬퍼 T-세포에 의해 주로 매개된 후 B-세포를 활성화시켜 항체를 생성시키는 체액 면역 반응일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "약학적으로 허용가능한 부형제"는 mRNA 분자와 결합/혼합되는 경우 mRNA 분자의 활성을 유지하고, 대상의 면역 시스템과 반응하지 않는 임의의 물질을 포함할 수 있다. 일례로서, 인산염 완충 식염수와 같은 버퍼 시스템, 계면활성제, 물, 오일/물 에멀젼과 같은 에멀젼 및 다양한 형태의 습윤제, 전분, 우유, 당, 특정 형태의 클레이, 젤라틴, 스테아르산 또는 그 염, 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트, 탈크, 식물성 유지, 검, 글리콜, 또는 다른 공지된 부형제와 같은 임의의 표준 약학 부형제를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 면역원성 조성물은 당업계에 알려진 임의의 형태, 예를 들어, 액제 및 주사제의 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 액제 또는 주사제의 경우, 필요시 10∼40%의 프로필렌 글리콜 등을 함유할 수 있다. 상기 액제 또는 주사제에는 당업계에 알려진 임의의 희석제 또는 완충제가 포함될 수 있다. 또한, 상기 면역원성 조성물은, 유효 성분을 포함하는 제제를 바이알과 같은 용기에 보존하고, 사용하기 전에 주사제에 필요한 담체 또는 아주반트, 식염수 등을 부가함으로써 사용 직전에 조제될 수도 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 mRNA 분자는 적어도 하나 이상의 지질 성분과 복합체를 형성하여, 리포솜 (liposomes), 지질 나노입자(lipid nanoparticles) 및/또는 리포플렉스(lipoplexes)를 형성하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 지질 나노입자(lipid nanoparticles)는 이온화 가능한 양이온성 지질(ionizable cationic lipid)을 일 구성성분으로 포함하며, mRNA를 캡슐화하거나 전달 효율, 안정화에 도움을 주는 헬퍼 지질(helper lipid), 안정화제(stabilizer) 와 같은 기타 성분 또한 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 지질 나노입자는 양이온성 지질과 중성 지질(예를 들어, 인지질), 스테롤 또는 스테로이드(예를 들어, 콜레스테롤), PEG-접합된 지질 등을 포함할 수 있다. 이때, 상기 양이온성 지질의 구체예로는 ALC-0315([(4-hydroxybutyl)azanediyl]di(hexane-6,1-diyl) bis(2-hexyldecanoate)), SM-102(9-Heptadecanyl 8-{(2-hydroxyethyl)[6-oxo-6-(undecyloxy)hexyl]amino}octanoate), N,N-dioleyl-N,N-dimethyIammonium chloride (DODAC), N-(l-(2,3-dioleyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammonium chloride(DOTMA), N-(l-(2,3-dioleoyloxy)propyl)-N,N,N- trimethylammonium chloride (DOTAP), N,N-dimethyl-(2,3-dioleyloxy)propylamine (DODMA), N,N-distearyl-N,N-dimethylammonium bromide(DDAB), 1,2-dilinoleyloxy-N,N-dimethylaminopropane(DLinDMA), 1,2-dilinolenyloxy-N,Ndimethylaminopropane (DLenDMA), DLin-KC2-DMA, (6Z,9Z,28Z,31Z)-Heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yl 4-(dimethylamino)butanoate (DLinMC3-DMA, CAS 1224606-06-7), ((4-hydroxybutyl)azanediyl)bis(hexane-6,1-diyl)bis(2-hexyldecanoate) 등을 사용할 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 있어서, 상기 지질 나노입자는 전술한 종류 등의 양이온성 지질 (전체 지질의 35 내지 60 mol% 범위), 인지질(전체 지질의 5 내지 15 mol% 범위), 콜레스테롤(전체 지질의 30 내지 50 mol% 범위), DMG-PEG2000와 같은 PEG-접합 지질(전체 지질의 0.5 내지 2.5 mol% 범위)을 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 있어서, 상기 지질 나노입자는 당업계의 공지의 성분을 적용할 수 있으며, 양이온성 지질, 헬퍼 지질, 및 PEG-접합된 지질을 포함할 수 있다. 여기서, 양이온성 지질은 예를 들어, ALC-0315 및/또는 SM-102; 헬퍼 지질 (helper lipid)은 Distearoylphosphatidylcholine (DSPC) 및/또는 Cholesterol; 및 PEG-접합 지질은 ALC-0159, 및/또는 PEG-DMG (PEG-Dimyristoyl glycerol)일 수 있으며, 예들 들어, ALC-0315: DSPC: Chol: ALC-0159 (47.5:10:40.8:1.7 mol%)로 이루어진 입자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 있어서, 상기 지질 나노입자의 지질로 WO2014/172045A1, WO2020/252589A1, WO2021/000041A1에 개시된 지질 화합물들을 특별한 제한 없이 사용할 수 있고, PNI123/DSPC/Cholesterol/PEG-DMG (50:10:38.5 또는 37.5:1.5 또는 2.5 mol%), PNI123/DOPE/Cholesterol/PEG-DMG를 사용할 수 있으나, 이 역시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어, "개체"는 질병의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
일 양상에 따른 mRNA 전사 벡터 및 상기 전사 벡터를 이용한 mRNA 분자를 제조하는 방법에 따르면, 특정 유전자 컨스트럭트를 포함함으로써 높은 효율로 목적하는 mRNA 분자를 발현시킬 수 있다. 또한, 상기 방법에 의해 제조된 mRNA 분자는 동물 모델에서 높은 수준의 면역 반응을 유도하여, 다양한 감염증의 치료 또는 예방에 적용될 수 있음을 확인하였다.
따라서, 일 양상에 따른 mRNA 분자 관련 기술은 mRNA 분자의 제조 및 상기 mRNA 분자를 포함하는 치료제 또는 백신 분야 등에서 활용될 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 mRNA 전사 벡터의 구조를 간략하게 나타낸 도이다.
도 2는 일 실시예에 따른 mRNA 전사 벡터와 세포 내 항원 발현 수준을 비교하기 위하여 제작된 mRNA 전사 벡터의 구조를 간략하게 나타낸 도로서, 도 2의 A는 pSKBS-Luciferase를 나타낸 것이고, 도 2의 B는 pMod-Luciferase를 나타낸 것이며, 도 2의 C는 pBNT-Luciferase를 나타낸 것이다.
도 3은 일 실시예에 따른 mRNA 전사 벡터를 사용하여 제조된 루시퍼레이즈 mRNA 분자를 HEK 293 세포에 형질감염시킨 뒤, 이에 따른 루시퍼레이즈의 활성을 확인한 결과이다.
도 4는 일 실시예에 따른 코로나 바이러스 내 스파이크 mRNA 분자를 포함하는 면역원성 조성물을 마우스에 투여한 후, 상기 조성물에 의해 유도된 마우스의 혈청 내 IgG의 항체가를 확인한 결과이다.
도 5는 일 실시예에 따른 코로나 바이러스 내 전장 스파이크 mRNA 분자 (Spike) 또는 RBD mRNA 분자(RBD)를 포함하는 면역원성 조성물을 마우스에 투여한 후, 상기 조성물에 의해 유도된 마우스의 혈청 내 IgG의 항체가를 비교한 결과이다.
도 6은 일 실시예에 따른 폴리-A 테일 서열이 변형된 스파이크 mRNA 분자를 포함하는 면역원성 조성물을 마우스에 투여한 후, 상기 조성물에 의해 유도된 마우스의 혈청 내 IgG의 항체가를 비교한 결과이다.
도 7은 일 실시예에 따른 스파이크 mRNA 분자 내 유리딘 서열이 변형된 mRNA 분자를 포함하는 면역원성 조성물을 마우스에 투여한 후, 상기 조성물에 의해 유도된 마우스의 혈청 내 IgG의 항체가를 비교한 결과이다.
도 8은 일 실시예에 따른 각각의 백신 제제가 투여된 동물 모델 (G1 내지 G5)을 대상으로, 외부 항원 자극에 따른 CD103+, CD62Lhigh, CD44high, CD4+ T 세포의 비율 변화를 확인한 결과이다.
도 9는 일 실시예에 따른 각각의 백신 제제가 투여된 동물 모델 (G1 내지 G5)을 대상으로, 외부 항원 자극에 따른 KI-67+, CD62Lhigh, CD44high, CD4+ T 세포의 비율 변화를 확인한 결과이다.
도 10은 일 실시예에 따른 각각의 백신 제제가 투여된 동물 모델 (G1 내지 G5)을 대상으로, 외부 항원 자극에 따른 KI-67+, CD62Lhigh, CD44high, CD8+ T 세포의 비율 변화를 확인한 결과이다.
도 11은 일 실시예에 따른 각각의 백신 제제가 투여된 동물 모델 (G1 내지 G5)을 대상으로, 외부 항원 자극에 따른 KI-67+, CD62Llow, CD44high, CD8+ T 세포의 비율 변화를 확인한 결과이다.
도 12는 일 실시예에 따른 각각의 백신 제제가 투여된 동물 모델 (G1 내지 G5)을 대상으로, 오미크론 스파이크 단백질 항원에 대한 면역원성을 시간의 경과에 따라 평가한 결과로서, 도 12의 A는 Omicron RBD IgG1의 항체가 수준을 확인한 결과이고, 도 12의 B는 Omicron RBD IgG2a의 항체가 수준을 확인한 결과이다.
도 13은 일 실시예에 따른 각각의 백신 제제가 투여된 동물 모델 (G1 내지 G5)을 대상으로, 우한 스파이크 단백질 항원에 대한 면역원성을 시간의 경과에 따라 평가한 결과로서, 도 13의 A는 Wuhan RBD IgG1의 항체가 수준을 확인한 결과이고, 도 13의 B는 Wuhan RBD IgG2a의 항체가 수준을 확인한 결과이고, 도 13의 C는 Wuhan S IgG1의 항체가 수준을 확인한 결과이고, 및 도 13의 D는 Wuhan S IgG2a의 항체가 수준을 확인한 결과이다.
도 14는 일 실시예에 따른 각각의 백신 제제가 투여된 동물 모델 (G1 내지 G5)을 대상으로, pseudovirus에 대한 중화 능력을 평가한 결과로서, VSV pseudotyped virus (REVACC SCIENTIFIC)로 감염된 Vero 세포주에 대한 serum dilution factor (VNT50)를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. mRNA 항원 발현 시스템의 제작 및 목적 항원의 발현 수준 비교
본 실시예에서는 일 실시예에 따른 mRNA 항원 발현 시스템을 사용하여, 세포 내 목적 항원의 발현 수준을 향상시킬 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 목적 항원으로 luciferase mRNA를 사용하여, 일 실시예에 따른 mRNA 전사 벡터를 제작하였고, 이를 통해 제작된 mRNA 분자를 HEK 293 세포에 형질감염시킨 뒤, 이들의 발현 수준을 정량적으로 비교하였다.
1-1. mRNA 전사 벡터의 제작
도 1에 도시한 바와 같이, 5' 말단으로부터 3' 말단 방향으로, 프로모터 영역 서열, 5' UTR 영역 서열, ORF 영역 서열, 3' UTR 영역 서열, 및 폴리 A-테일 영역 서열이 순차적으로 작동 가능하게 연결된 구조를 기본 골격으로 하여, mRNA 전사 벡터를 제조하였다. 본 실시예에서는 pUC19 플라스미드를 사용하여, KpnI와 BamHI 인식부위 사이 (GGTACC ~ GGATCC)에 T7 프로모터 및 5'UTR 영역 서열 (서열번호 6)을 삽입한 뒤, 상기 플라스미드의 XbaI과 HindIII 인식부위 사이 (TCTAGA ~ AAGCTT)에 3'UTR 및 A30LA70 (서열번호 7)을 삽입하여, pSKBS 플라스미드 (서열번호 8)를 제작하였다. 이후, 목적 항원인 luciferase mRNA을 발현시키고자, 상기 플라스미드의 BamHI와 XbaI 인식부위 사이 (GGATCC ~ TCTAGA)에 루시퍼레이즈 유전자 (서열번호 9)를 삽입하여, pSKBS-Luciferase 플라스미드 (서열번호 10)를 제작하였다. 한편, 상기 pSKBS-Luciferase 플라스미드 내 주요 기능적 구조물의 유전적 정보는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
[표 1]
Figure PCTKR2022010285-appb-img-000001
또한, 일 실시예에 따른 pSKBS-Luciferase 플라스미드와 mRNA 항원의 발현 효율을 비교하고자, 모더나 사의 5'UTR 및 3'UTR을 포함하는 pMod-Luciferase 플라스미드 (비교예 1), 바이오엔텍 사의 5'UTR 및 3'UTR 을 포함하는 pBNT-Luciferase 플라스미드 (비교예 2)를 각각 제작하였다 (2004, NAR, A simple, rapid, high-fidelity and cost effective PCR based two step DNA synthesis method for long gene sequence). 구체적으로, pMod-Luciferase 플라스미드는 pUC19 플라스미드를 사용하여, KpnI와 BamHI 인식부위 사이 (GGTACC ~ GGATCC)에 T7 프로모터 및 모더나 사의 5'UTR 영역 서열 (서열번호 11)을 삽입한 뒤, 상기 플라스미드의 XbaI과 SacII 인식부위 사이 (TCTAGA ~ CCGCGG)에 모더나 사의 3'UTR 영역 서열 (서열번호 12)을 삽입하고, 상기 플라스미드의 BamHI와 XbaI 인식부위 사이 (GGATCC ~ TCTAGA)에 루시퍼레이즈 유전자를 삽입하여 제작하였다. 또한, pBNT-Luciferase 플라스미드 역시 상기 pMod-Luciferase 플라스미드 제작에서 사용된 인식부위를 채용하여, 동일한 방식으로 바이오엔텍 사의 5'UTR 영역 서열 (서열번호 13) 및 3'UTR 영역 서열 (서열번호 14)을 삽입하였다. 본 실시예에서 제작한 mRNA 전사 벡터의 구조를 도 2에 나타내었다.
1-2. 세포 내 목적 항원의 발현 수준 평가
상기 실시예 1-1에서 제조된 플라스미드로 형질전환된 대장균을 배양하고, 이로부터 플라스미드를 분리한 뒤, EcoRV 제한효소를 이용하여 상기 플라스미드를 선형화시켰다. 상기 선형화된 플라스미드를 PCI 에탄올 침전법을 이용하여 회수한 후, 이를 mRNA 제조를 위한 시험관 내 전사 (In vitro transcription; IVT) 반응에 사용하였다. 이를 위하여, 표 2에 기재된 조건에 따라 선형화된 플라스미드 DNA 주형 등을 혼합한 후 37 ℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 이후, 상기의 반응을 종료시킨 후, 여기에 2 KU/mL 농도의 DNase1을 첨가하고 37 ℃에서 15 분 동안 반응시켜, 선형화된 플라스미드를 제거하였다. 이후, 형질감염에 적합한 mRNA 분자를 준비하기 위하여, 위해 MEGAclear쪠 Transcription Clean-Up Kit (Thermo Fisher)를 이용하여 합성된 mRNA를 정제하였다. 이후, HEK293 세포주에 상기 정제된 mRNA를 Lipofectamine™ MessengerMAX (Thermo Fisher)를 이용하여 형질감염시켰다. 상기 형질감염을 수행한 시점으로부터 24시간 경과 후, ONE-Glo쪠 Luciferase Assay System (Promega)을 통해 HEK293 세포주에 발현된 루시퍼레이즈의 활성을 측정하였고, 상기 측정된 활성도를 통해 루시퍼레이즈의 상대적 발현량을 평가하였다. 한편 대조군으로는 형질감염을 수행하지 않은 군(Mock)을 사용하였다.
[표 2]
Figure PCTKR2022010285-appb-img-000002
도 3은 일 실시예에 따른 mRNA 전사 벡터를 사용하여 제조된 루시퍼레이즈 mRNA 분자를 HEK 293 세포에 형질감염시킨 뒤, 이에 따른 루시퍼레이즈의 활성을 확인한 결과이다. 상기 도 3에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에 따른 mRNA 전사 벡터를 사용하여 제조된 루시퍼레이즈 mRNA 분자는 숙주 세포에 형질감염 시 높은 수준의 루시퍼레이즈 활성을 나타내었으며, 이를 통하여, 목적 mRNA 항원에 의한 우수한 세포 내 발현 효율을 확인하였다.
실시예 2. mRNA 항원 발현 시스템을 이용한 면역원성 조성물의 효능 평가
본 실시예에서는 일 실시예에 따른 mRNA 항원 발현 시스템을 사용하여, 동물 모델에서 유효한 면역 반응을 유도할 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 목적 항원으로 코로나 스파이크 mRNA를 사용하여, 일 실시예에 따른 mRNA 전사 벡터를 제작하였고, 이를 통해 제작된 mRNA 분자를 지질 mRNA-LNP (mRNA-lipid Nanoparticle) 백신 제제로 제형화한 뒤, 이를 동물 모델에 투여하여, 이에 따른 면역원성, 구체적으로, 항체가 형성 수준을 평가하였다.
2-1. mRNA 전사 벡터 및 목적 mRNA 분자의 제조
mRNA 전사 벡터는 상기 실시예 1-1과 유사한 방식으로 제조하였다. 구체적으로, 본 실시예에서는 pUC19 플라스미드 및 전사개시 서열 +1이 A이고, +2가 G인 T7 프로모터 (서열번호 15)를 사용하여, KpnI와 BamHI 인식부위 사이 (GGTACC ~ GGATCC)에 상기 프로모터 및 5'UTR 영역 서열 (서열번호 16)을 삽입한 뒤, 상기 플라스미드의 XbaI과 HindIII 인식부위 사이 (TCTAGA ~ AAGCTT)에 3'UTR 및 A20 (서열번호 17)을 삽입하여, pSKBS-AG 플라스미드 (서열번호 18)를 제작하였다. 이후, 상기 플라스미드의 BamHI와 XbaI 인식부위 사이 (GGATCC ~ TCTAGA)에 SARS-CoV2 베타변이 바이러스의 스파이크 유전자 (서열번호 19)를 삽입하여, pSKBS-Spike(SA)-AG 플라스미드 (서열번호 20)를 제작하였다.
상기 제작한 pSKBS-Spike(SA)-AG 플라스미드를 이용하여 mRNA를 제작하였다. 보다 구체적으로, 상기 제조된 플라스미드로 형질전환된 대장균을 배양하고, 이로부터 플라스미드를 분리한 뒤, EcoRV 제한효소를 이용하여 상기 플라스미드를 선형화시켰다. 상기 선형화된 플라스미드를 PCI 에탄올 침전법을 이용하여 회수한 후, 이를 mRNA 제조를 위한 시험관 내 전사 반응에 사용하였다. 이를 위하여, 표 3에 기재된 조건에 따라 선형화된 플라스미드 DNA 주형 등을 혼합한 후 37 ℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 이후, 상기의 반응을 종료시킨 후, 여기에 2 KU/mL 농도의 DNase1을 첨가하고 37 ℃에서 15분 동안 반응시켜, 선형화된 플라스미드를 제거하였다. 이후, mRNA의 3'말단에 폴리 A 테일을 추가하기 위해 Poly(A) Polymerase Tailing Kit (Lucigen)을 이용하여 표 4의 조건으로 물질을 혼합한 후 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, CIMmultus® Oligo dT (Sartorius) 컬럼을 사용하여, 합성된 mRNA를 AKTA　FPLC(GE Healthcare)에서 정제하였다.
[표 3]
Figure PCTKR2022010285-appb-img-000003
[표 4]
Figure PCTKR2022010285-appb-img-000004
2-2. mRNA-LNP 백신 제제의 제조
상기 실시예 2-1의 정제된 mRNA 분자/원액을 Lipid mixture으로 제형화하여, 지질 성분 내 mRNA가 봉입된 mRNA-LNP (Lipid nanoparticle)를 제조하였다. 구체적으로, 상기 mRNA 원액을 Formulation Buffer로 0.17 mg/mL로 희석하고, GenVoy-ILM (PRECISION NANOSYSTEMS)를 ethanol로 1/2 희석한 후, 이들 각각을 syringe에 충진하였다. 이후, Ignite™ 장비에 미세관 Cartridge를 장착한 후, 상기 mRNA 희석액이 담긴 syringe와 상기 GenVoy-ILM 희석액이 담긴 syringe를 장착하고, 3:1의 부피비로 반응하여 N/P ratio = 4의 조건으로 제형화 공정을 수행하였다. 이후, 제형화 공정이 수행된 반응액을 회수하고, 이에 대하여, Centrifugal ultrafiltration unit (MWCO 50 kDa)을 이용하여 20배 이상 부피의 PBS로 Buffer exchange를 실시하고, 이의 농축을 진행하였다. 이후, mRNA-LNP 원액을 4 ℃에 보관하였고, mRNA 함량 및 캡슐화 비율 측정 후, 이를 동물 실험에 사용하였다.
2-3. 면역원성 평가
상기 실시예 2-2에서 제조된 5㎍ 또는 25㎍의 mRNA-LNP이 포함된 원액 100㎕가 포함된 0.1mL의 주사제를 동물 모델 (마우스, BALB/c, female)에 0주차, 2 또는 3주차의 간격으로 2회에 걸쳐 근육 투여(IM) 하였다. 또한, 투여 전 및 투여 후에 동물 모델로부터 채혈된 검체로부터 혈청을 분리 후, 이를 시료로 사용하여, 백신 제제에 의해 생성된 IgG의 항체가를 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)로 측정하였다. 구체적으로, 96-well plate의 표면을 1 μg/mL의 항원으로 코팅한 뒤, 이를 2-8 ℃에서 18 ± 2시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션된 플레이트를 세척한 후, 실온에서 1시간 동안 BSA 용액으로 블로킹하였다. 이후, 상기 플레이트를 세척한 후 연속 희석을 통해 준비된 혈청 희석액을 플레이트에 분주하였다. 2차 항체인 Goat Anti-Mouse IgG-Alkaline phosphatase conjugates를 희석하여 플레이트에 첨가한 뒤, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, 상기 플레이트를 세척하고, 여기에 1 mg/mL p-nitrophenylamine buffer를 첨가한 뒤, 실온에서 다시 2시간 동안 반응시켰다. 이후, 각 웰에 3 M NaOH를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 405 nm와 690 nm의 흡광도를 측정하여, IgG 항체가의 Optical Density (OD)값을 산출하였다.
도 4는 일 실시예에 따른 코로나 바이러스 내 스파이크 mRNA 분자를 포함하는 백신 제제를 마우스에 투여한 후, 상기 제제에 의해 유도된 마우스의 혈청 내 IgG의 항체가를 확인한 결과이다. 상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에 따른 mRNA-LNP 백신 제제를 투여에 의해, 유효한 수준의 IgG 항체가가 형성됨을 확인하였고, 이는 반복 투여에 의해 그 효능이 강화됨을 알 수 있었다.
2-4. 다양한 형태의 변형을 포함하는 백신 제제에 의한 면역원성 평가
상기 실시예 2-1 내지 2-3과 동일한 방식으로, 1) 코로나 바이러스 내 전장 스파이크 mRNA 분자 (Spike) 또는 RBD mRNA 분자(RBD)를 포함하는 백신 제제, 2) 폴리-A 테일 서열이 변형된 스파이크 mRNA 분자를 포함하는 백신 제제, 3) 스파이크 mRNA 분자 내 유리딘 서열이 변형된 mRNA 분자를 포함하는 백신 제제에 대한 면역원성을 평가하였다. 구체적으로, 본 실시예에서 폴리-A 테일은 각각 124nt 길이의 폴리-A 테일(A124, SA), 30nt 길이의 폴리-A와 70nt 길이의 폴리 A가 GCAUAUGACU 링커로 연결된 폴리-A 테일(A30LA70, SAL)을 사용하였고, 유리딘 서열의 변형으로는 유리딘을 대신하여, 슈도우리딘(pseudouridine, Ψ)을 적용하였다.
도 5 내지 도 7은 일 실시예에 따른 코로나 바이러스 내 전장 스파이크 mRNA 분자 (Spike) 또는 RBD mRNA 분자(RBD)를 포함하는 백신 제제, 폴리-A 테일 서열이 변형된 스파이크 mRNA 분자를 포함하는 백신 제제, 스파이크 mRNA 분자 내 유리딘 서열이 변형된 mRNA 분자를 포함하는 백신 제제를 마우스에 투여한 후, 상기 조성물에 의해 유도된 마우스의 혈청 내 IgG의 항체가를 비교한 결과이다. 도 5 내지 도 7에 나타낸 바와 같이, 다양한 형태의 변형을 포함하는 백신 제제에서도, 모두 유효한 수준의 IgG 항체가가 형성됨을 확인하였다.
실시예 3. 동물 모델을 이용한 면역 반응 유도 효능 평가
본 실시예에서는 일 실시예에 따른 mRNA 항원 발현 시스템을 사용하여, 동물 모델에서 특정 외부 항원에 대한 작용으로서, 유효한 면역 반응을 유도할 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 면역 반응에 관여하는 세포 수준의 변화를 평가하였고, 코로나 바이러스 유래 항원의 특성으로부터 기인한 교차 반응성을 확인하였다. 한편, mRNA 전사 벡터는 상기 실시예 2-1의 pSKBS-AG 플라스미드 (서열번호 18)에 대하여, 상기 플라스미드의 BamHI과 XbaI 인식부위 사이 (GGATCC ~ TCTAGA)에 SARS-CoV2 Omicron 스파이크-2P prefusion형 유전자 (서열번호 21), SARS-CoV2 Omicron 스파이크-6P prefusion형 유전자 (서열번호 22), 또는 SARS-CoV2 Wuhan 스파이크-2P prefusion형 유전자 (서열번호 23)를 도입하여 제작하였으며, 본 실시예 3에서 유리딘 서열의 변형으로는 유리딘을 대신하여, N1-메틸슈도우리딘(N1-methyl pseudouridine, m1Ψ)을 적용하였다. 이를 통해 제조된 mRNA를 제형화하여 10㎍의 mRNA-LNP이 포함된 원액 100㎕가 포함된 0.1mL의 주사제를 동물 모델 (마우스, BALB/c, female)에 각각 근육 투여하였다.
한편, 본 실시예에서는 투여되는 제제에 포함된 유효 물질의 종류를 기준으로 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 총 5개의 군으로 분류하여 실험을 수행하였다.
[표 5]
Figure PCTKR2022010285-appb-img-000005
이후, 상기 동물 실험군에 대하여, 외부 항원에 의한 자극의 종류에 따라, 별도의 자극을 가하지 않은 군 (Non), SARS-CoV2 항원 혼합물 (SARS-CoV-2 (S1), scanning (3629-1), mebtech.com)로 자극을 가한 군 (Peptide pool), SARS-CoV2 Wuhan 스파이크 항원으로 자극을 가한 군 (RBD Wuhan), SARS-CoV2 Omicron 스파이크 항원으로 자극을 가한 군 (RBD Omicron)으로 재차 분류하여, 각각의 항원에 따른 면역 반응 유도 효능을 평가하였다.
3-1. 세포 매개 면역 분석 (T 세포 분석)
상기 제조된 mRNA-LNP 원액을 동물모델 (마우스, BALB/c, female)에 근육 투여 (IM) 하였다. 구체적으로, 0주차, 2주차의 2주 간격으로 2회 투여하였으며, 2차 면역 1주 후에 부검을 통해 비장을 적출하고, 적출된 비장으로부터 적혈구를 제거하고, 비장 세포를 수득하였다. 상기 수득된 비장 세포 중 항원에 반응하는 세포주를 분석하기 위해서, Wuhan, omicron 변이의 SARS-CoV2 RBD 단백질 또는 SARS-CoV2 CD8 epitope prediction peptide pool (Sinobiological)을 처리하여 stimulation시킨 후, KI-67 dye 및 CD62L, CD44, CD8 항체로 표지하였다. 상기와 같이 준비된 비장 세포 중 FACS (Fluorescence-activated cell sorting)를 통하여 항원에 반응하는 CD4 T 세포 및, CD8 T 세포를 분석하였으며, 그 결과를 도 8 내지 11에 나타내었다.
도 8 및 9는 일 실시예에 따른 각각의 백신 제제가 투여된 동물 모델 (G1 내지 G5)을 대상으로, 외부 항원 자극에 따른 CD103+, CD62Lhigh, CD44high, CD4+ T 세포 및 KI-67+, CD62Lhigh, CD44high, CD4+ T 세포의 비율 변화를 확인한 결과이고, 도 10 및 11은 일 실시예에 따른 각각의 백신 제제가 투여된 동물 모델 (G1 내지 G5)을 대상으로, 외부 항원 자극에 따른 KI-67+, CD62Lhigh, CD44high, CD8+ T 세포, 및 KI-67+, CD62Llow, CD44high, CD8+ T 세포의 비율 변화를 확인한 결과이다.
상기 도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 외부 항원, 즉, SARS-CoV2 항원 혼합물, SARS-CoV2 Wuhan 또는 SARS-CoV2 Omicron의 스파이크 항원에 대한 면역 반응으로서, 상주 기억 CD4 T 세포 (CD4 Memory resident T cell), 및 증식 기억 CD4 T 세포 (CD4 Memory proliferation T cell)의 비율이 증가됨을 확인하였다. 또한, 도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 외부 항원에 대한 면역 반응으로서, 증식 기억 CD8 T 세포 (CD8 Memory proliferation T cell) 및 증식 활성화 CD8 T 세포 (CD8 Effector proliferation T cell)의 비율이 증가됨을 확인하였다.
3-2. 체액성 면역분석 (ELISA 분석)
상기 제조된 mRNA-LNP 원액을 동물 모델 (마우스, BALB/c, female)에 근육 투여 (IM) 하였다. 0주차, 2주차의 2주 간격으로 2회 투여하였으며, 투여 전 및 투여 후 2주차, 4주차에 채혈된 검체에서 혈청을 분리하였다. 이후, 상기 분리된 혈청을 시료로 사용하여, 백신 제제에 의해 생성된 IgG의 항체가를 상기 실시예 2-3과 동일한 방식으로 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)를 통하여 측정하였다. 이후, 각 strain의 RBD 단백질 및 Spike 단백질을 항원으로 코팅하여 이에 대한 Ig 항체가를 측정하였으며, 그 결과를 도 12 및 13에 나타내었다.
도 12는 일 실시예에 따른 각각의 백신 제제가 투여된 동물 모델 (G1 내지 G5)을 대상으로, 오미크론 스파이크 단백질 항원에 대한 면역원성을 시간의 경과에 따라 평가한 결과이고, 도 13은 일 실시예에 따른 각각의 백신 제제가 투여된 동물 모델 (G1 내지 G5)을 대상으로, 우한 스파이크 단백질 항원에 대한 면역원성을 시간의 경과에 따라 평가 결과이다.
도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에 따라 제조된 백신 제제는 상기 항체가 형성 수준에 비추어 볼 때, 모든 시점에 걸쳐 SARS-CoV2 Omicron 스파이크 mRNA 백신 제제를 투여한 G1 군, 및 G2 군은 우한 스파이크 단백질 항원에 대하여 교차 반응성을 나타내며, SARS-CoV2 Wuhan 스파이크 mRNA 백신 제제를 투여한 G5 군 역시 오미크론 스파이크 단백질 항원에 대해서 교차 반응성을 나타냄을 확인하였다.
3-3. 체액성 면역분석 (PBNA, Pseudovirion-based neutralization assay)
상기 제조된 mRNA-LNP 원액을 동물 모델 (마우스, BALB/c, female)에 근육 투여 (IM) 하였다. 0주차, 2주차의 2주 간격으로 2회 투여하였으며, 투여 후 2주차에 채혈된 검체에서 혈청을 분리하였다. 이후, 상기 분리된 혈청을 시료로 사용하여, 중화항체 분석 (PBNA)을 진행하였다. SARS-CoV2 Wuhan (D614G), omicron 변이의 Spike 단백질을 가지고, luciferase 유전자를 포함하는 VSV pseudotyped virus (REVACC SCIENTIFIC)를 적절하게 희석하였다. 이후, 이를 상기 serial dilution된 혈청 시료와 혼합하여 Vero 세포주에 처리하여, 24시간 동안 감염시킨 후, Luciferase의 활성을 측정하였으며, 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14는 배양 세포에 대하여 50% 감염시 serum dilution factor (VNT50, 50% neutralization titres)를 나타낸 그래프로서, 백신 제제를 접종한 그룹 (G1, G2, 및 G5)에서 생성된 항체가 서로 다른 변이의 spike 단백질을 발현하는 pseudovirus에 대하여 중화 능력이 있음을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (16)

  1. RNA 중합효소 (RNA polymerase)에 의해 인식되는 프로모터 영역 및 상기 프로모터 영역과 작동 가능하게 연결된, 유전자 컨스트럭트를 포함하는 mRNA 전사 벡터로서,
    상기 유전자 컨스트럭트는 서열번호 1 또는 이와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 5’-비번역 부위 (5’-Untranslated region: 5’-UTR) 영역;
    상기 5’-UTR 영역에 작동 가능하게 연결된, 목적 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 오픈 리딩 프레임 (Open reading frame: ORF) 영역; 및
    상기 오픈 리딩 프레임 영역에 작동 가능하게 연결된, 서열번호 2 또는 이와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 단위체 서열이 2회 반복되는 3’-비번역 부위 (3’-Untranslated region: 3’-UTR) 영역을 포함하는 것인, mRNA 전사 벡터.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 프로모터 영역은 T7 RNA 중합효소, T3 RNA 중합효소, SP6 RNA 중합효소, 또는 미토콘드리아 중합효소(POLRMT) 중 어느 하나의 RNA 중합효소에 의해 인식되는 것인, mRNA 전사 벡터.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 오픈 리딩 프레임 영역은 병원체로부터 유래되는 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, mRNA 전사 벡터.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 병원체는 바이러스(virus), 박테리아(bacterium), 프리온(prion), 균류(fungus), 원생동물(protozoon), 바이로이드(viroid), 및 기생동물(parasite)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, mRNA 전사 벡터.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 3’-UTR 영역은 상기 단위체 서열이 직접 연결되거나, 링커 서열에 의해 연결되어 있는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것인, mRNA 전사 벡터.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 유전자 컨스트럭트는 상기 5’-UTR에 작동 가능하게 연결된, 5' 캡 (5' Cap)으로 전사되는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것인, mRNA 전사 벡터.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 유전자 컨스트럭트는 상기 3’-UTR 영역에 작동 가능하게 연결된, 폴리 A 테일로 전사되는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것인, mRNA 전사 벡터.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 폴리 A 테일은 20 내지 200개의 아데닌으로 이루어진 것인, mRNA 전사 벡터.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 mRNA 전사 벡터는 플라스미드인 것인, mRNA 전사 벡터.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 mRNA 전사 벡터는 선형화된 것인, mRNA 전사 벡터.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 mRNA 전사 벡터는 서열번호 4 또는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 프로모터 영역 및 유전자 컨스트럭트를 포함하며,
    상기 유전자 컨스트럭트는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 5’-UTR 영역; 상기 5’-UTR 영역에 작동 가능하게 연결된, ORF 영역; 및 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 3’-UTR 영역을 포함하는 것인, mRNA 전사 벡터.
  12. 청구항 1의 mRNA 전사 벡터를 주형으로 하여 시험관내 전사(in vitro　transcription)를 수행하는 단계를 포함하는, mRNA 분자를 제조하는 방법.
  13. 청구항 12의 방법에 의해 제조된 mRNA 분자.
  14. 청구항 13의 mRNA 분자 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 유효 성분으로 포함하는, 면역원성 조성물.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 mRNA 분자는 적어도 하나 이상의 지질 성분과 복합체를 형성하여, 리포솜(liposomes), 지질 나노입자(lipid nanoparticles) 및/또는 리포플렉스(lipoplexes)를 형성하는 것인, 면역원성 조성물.
  16. 청구항 14에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 근육 또는 피하 투여되는 것인, 면역원성 조성물.
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