CN117205309A - 一种流感免疫原组合物和制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种流感免疫原组合物和制备方法及其用途。本发明提供的一种免疫原组合物,包括至少一种抗原srRNA分子,所述抗原srRNA分子包含至少1个ORF,所述ORF编码包含来自不同流感病毒毒株的抗原的多肽;该抗原srRNA分子中一种或多种,单独使用或联合使用,或结合佐剂srRNA‑RLT7一起使用,来预防流感。本发明采用自复制RNA的技术,可以采用多价联合的方法来生产流感疫苗,能同时保护多种类型的流感病毒的感染,这有效的解决了以前流感疫苗生产成本高、保护效率低,特别是对B型流感病毒保护效率低下的缺点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种流感免疫原组合物和制备方法及其用途。
背景技术
流感病毒(Influenza virus)包括A、B、C、D四种类型。其中,甲型流感病毒是唯一会导致全球流感大流行的流感病毒。乙型流感病毒也可引起季节性流行。C型流感病毒感染通常会引起轻度疾病,不引起人类流行病。D型流感病毒主要影响牛,可传播到其他动物身上,目前未发现感染人类。
甲流病毒表面有两类特异蛋白质,血凝素(Hemagglutinin,HA),和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)。HA有多个亚型1-18;NA也有多个亚型1-11。根据血凝素和神经氨酸酶的不同亚型组合,目前在自然界中已经鉴定出130多种甲型流感亚型,主要来自野生鸟类。当两种流感病毒同时感染一个宿主并交换基因信息时,就会产生新的毒株。
目前流行的甲型H1N1流感病毒与2009年春季出现并导致流感大流行的2009年H1N1流感病毒有关。这些病毒经历了基因变化,自2009年以来一直在季节性传播,称为“A(H1N1)pdm09病毒”,更普遍地称为“2009 H1N1”。甲型流感H3N2在基因和抗原上也发生了变化,形成了许多基因不同的独立分支,并继续共同传播。
乙型流感病毒(Influenza B virus),有两个分支:B/Yamagata/16/88-型病毒,以及B/Victoria/2/87-型病毒。流感监测数据显示,世界各地两个谱系的B型流感病毒共同传播,但是每个谱系中传播的B型流感病毒的比例可能因地理位置和季节而异。B/Yamagata较B/Victoria流感病毒相比,传播频率要低得多。
一价或由它们组成的多价疫苗是目前常见的流感疫苗,主要针对四种不同的流感病毒:一种H1N1流感病毒、一种H3N2流感病毒以及两种乙型流感病毒Yamagata和Victoria。流感疫苗,包括灭活的全病毒疫苗,减毒活病毒疫苗及亚单位疫苗等。经多年使用,都显示了不同程度的保护能力,大约为30-50%左右。但是这些疫苗也存在许多的缺点,如采用全病毒接种,接种量大,病毒的其它组分易导致不良反应或者是病毒的DNA插入到人的基因组中导致一些遗传突变的风险;免疫时间短,需打加强针;以及病毒逃逸机制,整体保护率偏低等问题。同时这些疫苗亦存在生产周期长、成本高,对一些紧急情况的应对相对滞后等问题。
鉴于目前流感疫苗的较低的保护效率,一种能够提供有效保护的疫苗已变得越来越迫切。近年来,mRNA疫苗在新冠上的使用,证明了mRNA疫苗是一种非常有效的,能够快速应对于流行突变菌株的防疫手段。
mRNA疫苗是将编码的目的抗原基因克隆到相应的质粒载体上(plasmid),然后通过体外转录(in vitro transcription)的方式大量生产mRNA,并将该mRNA封装于纳米载体中,然后递送到宿主体内。在接种疫苗和被抗原提呈细胞摄取后,mRNA被转运到细胞质中,经过抗原处理后引发MHC呈递级联效应。因此,抗原呈递细胞在MHC I类和MHC II类上呈递肿瘤相关抗原后可以激活CD8+和CD4+T细胞。此外,CD4+T细胞可以共激活抗原特异性B细胞并诱导体液免疫反应。作为抗原提呈细胞的B细胞在内化细胞外蛋白并呈递到B细胞的MHCII类后,可以反过来激活CD4+T细胞。
与亚单位疫苗、灭活病毒疫苗和减毒活病毒疫苗以及基于DNA的疫苗相比,mRNA疫苗具有几种显著优点:1)安全性:由于mRNA是一种非感染性、非整合性平台,因此不存在感染或插入突变的潜在风险。此外,mRNA会被正常的细胞过程降解,其体内半衰期可以通过使用各种修饰和递送方法进行调节。还可以下调mRNA的固有免疫原性以进一步提高安全性。2)有效性:各种修饰使mRNA更加稳定和高度可翻译,通过将mRNA构建到载体分子上,可以在细胞质中快速摄取和表达,从而实现有效体内递送。mRNA是最小的遗传载体,因此,避免了抗载体免疫反应,并且可以重复施用。3)生产效率高:mRNA疫苗具有快速、廉价和可扩展制造的潜力,主要是由于体外转录反应的高产率。
mRNA 疫苗已被运用于多种传染性疾病和肿瘤中。但由于生产成本依然很高,不利于广泛的推广。一种优化的低成本mRNA疫苗就显得尤为重要。srRNA疫苗(self-replicating RNA),即自我扩增型mRNA疫苗,就是较好的替代品。与普通mRNA的区别是,除了携带抗原的编码序列(open reading frame,ORF)外,srRNA还携带一个RNA复制酶的序列。在这个RNA复制酶产生后,它可以用抗原的编码序列作为模板来产生更多的拷贝的抗原RNA分子。因此,srRNA疫苗,不但具有mRNA疫苗的所有优点,它还具有使用剂量低、毒副作用小和生产成本更低等优点。
发明内容
因此,本发明要解决的技术问题在于提供一种流感免疫原组合物和制备方法及其用途。
为此,本发明提供了如下的技术方案:
一种免疫原组合物,包括至少一种抗原srRNA分子;所述抗原srRNA分子包含至少1个ORF,所述ORF编码包含来自不同流感病毒毒株的抗原的多肽。
可选的,所述来自不同流感病毒毒株选自甲型流感病毒H1N1、甲型流感病毒H3N2、乙型流感病毒B/Victoria 谱系和/或乙型流感病毒B/Yamagata谱系。
可选的,来自不同流感病毒毒株的抗原的多肽选自如下至少一种:
(1)、与野生型甲型流感病毒A/Wisconsin/588/2019 (H1N1)pdm09的HA抗原具有80%以上的同源性的氨基酸序列;
(2)、与野生型甲型流感病毒A/Darwin/6/2021 (H3N2)的HA抗原具有80%以上的同源性的氨基酸序列;
(3)、与野生型乙型流感病毒B/Austria/1359417/2021(B/Victoria 谱系)的HA抗原具有80%以上的同源性的氨基酸序列;
(4)、与野生型乙型流感病毒B/Phuket/3073/2013(B/Yamagata谱系)的HA抗原具有80%以上的同源性的氨基酸序列;
(5)、与野生型乙型流感病毒B/Phuket/3073/2013的NA抗原具有80%以上的同源性的氨基酸序列;
(6)、与野生型乙型流感病毒B/Austria/1359417/2021的NP抗原具有80%以上的同源性的氨基酸序列;和
(7)、与野生型乙型流感病毒B/Austria/1359417/2021的M2抗原具有80%以上的同源性的氨基酸序列。
可选的,来自不同流感病毒毒株的抗原的多肽选自如SEQ ID NO.1~7所示的氨基酸序列;和/或
来自不同流感病毒毒株的抗原的多肽的DNA序列经过密码子优化,选自如SEQ IDNO.8~14所示的核苷酸序列。
可选的,还包括佐剂srRNA分子,所述佐剂 srRNA分子包含至少1个ORF,所述ORF编码包含有活性的组成型表达的TLR-7的多肽。
可选的,所述有活性的组成型表达的TLR-7的多肽为与野生型人TLR-7具有80%以上的同源性的氨基酸序列。
可选的,所述TLR-7的多肽为如SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列;和/或
所述TLR-7的多肽的DNA序列经过密码子优化,其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
可选的,所述srRNA分子还包括5’帽结构、5’UTR序列、3’UTR序列、启动子、编码复制酶的序列和/或poly(A)尾。
可选的,所述5’帽结构选自7mG ( 5 ' ) ppp Nm;和/或
所述5’UTR序列的5’端含有转录起始的序列为5’-GCCACC-3’;和/或
所述5’UTR序列为经过优化的人β-珠蛋白的5’UTR序列;和/或
所述3’UTR序列为串联的经优化的2-3个的人β-珠蛋白的3’UTR序列或非洲爪蟾β珠蛋白的3’UTR序列;和/或
所述启动子选自T7启动子;和/或
所述poly(A)尾的长度为30-50个核苷酸;和/或
所述编码复制酶的序列选自委内瑞拉马脑炎病毒 (Venezuelan equineencephalitis virus);和/或
所述srRNA分子按照5’-3’方向依次包括如下元件:5’帽结构、5’UTR序列、编码复制酶的序列、ORF、3’UTR序列和poly(A)尾。
优选的,所述5’UTR序列如SEQ ID NO.17所示。
优选的,所示3’UTR序列如SEQ ID NO.18所示。
一种生物材料,包括如下任一种:
A1、含有所述的srRNA分子的重组载体;
A2、含有A1中所述的重组载体的宿主细胞。
一种药物组合物,包含所述的免疫原组合物,以及药学上可接受的载体。
可选的,所述载体包括脂质体纳米颗粒(lipid nanoparticles,LNP)。所述脂质体纳米颗粒由一个可电离的阳离子脂质、非阳离子脂质、固醇和经过结构修饰后的PEG脂质构成。脂质体纳米颗粒的组成比例分别为:可电离的阳离子脂质(20-60wt%)、非阳离子脂质(20-55 wt %)、胆固醇(20-55 wt %)和经过结构修饰后的PEG脂质(0.5-5 wt %)。举例讲,可电离的阳离子脂质是DLin-MC3-DMA 或者SM-102等。非阳离子脂质(中性脂)是DSPC。固醇是胆固醇。经过结构修饰后的PEG脂质是PEG2000DMG。这些脂类物质以一定比例混合后,按比例与srRNA一起,经加工形成srRNA脂质体纳米颗粒。纳米颗粒的加工,可采用微流控的纳米仪,或其它方式制备获得。纳米颗粒直径的大小、粒径大小分布(PDI) 以及其表面所带的电荷(zeta potential) 对LNP的体内吸收至关重要,能决定LNP进入细胞的效率。srRNA脂质体纳米颗粒,进入体内可诱导机体产生中和抗体保护机体杀死流感病毒。srRNA脂质体纳米颗粒,被机体细胞吸收后,进入机体细胞。在机体细胞中,脂质体破裂,释放出被包裹的srRNA。此时在胞浆中,包括核糖体在内的多种蛋白结合到mRNA 的帽结构区域以及它的上游区域,形成一个复合体,引发蛋白合成。第一个密码子为ATG,亦称起始密码子。在本发明中首先被翻译出来的蛋白质是VEE 复制酶和少量的抗原序列。在胞浆中被翻译出VEE的复制酶蛋白, 和胞浆中已有的srRNA 中的抗原ORF结合,复制出多达1000个拷贝的抗原ORF的mRNA;然后这些抗原ORF, 被进一步翻译成相应的抗原蛋白,从而大大提升抗原蛋白的表达的效率。
所述的免疫原组合物、所述的生物材料或所述的药物组合物具有如下的用途:
(1)、在制备预防或治疗流感的疫苗中的用途;
(2)、在制备抑制流感病毒的产品中的用途;
(3)、在制备流感相关检测试剂产品中的用途。
本发明技术方案,具有如下优点:
1、本发明提供的一种免疫原组合物,包括至少一种抗原srRNA分子;所述抗原srRNA分子包含至少1个ORF,所述ORF编码包含来自不同流感病毒毒株的抗原的多肽;本发明采用自复制RNA的技术,可以采用多价联合的方法来生产流感疫苗,能同时保护多种类型的流感病毒的感染,这有效的解决了以前流感疫苗对B型流感病毒保护效率低下的缺点。
2、本发明提供的一种免疫原组合物,所述srRNA分子中引入了复制酶基因,可大量复制靶向抗原的RNA,从而使在低接种剂量的条件下抗原蛋白可大量表达,让机体产生持续的足够强的免疫反应,来保护机体免受流感病毒的侵袭。和传统裂解疫苗相比, 最直接的优点是疫苗使用剂量很低,在人体中产生的毒副作用就很小,不会由此带来一些列的不适。抗原蛋白表达时间很长;第二个优点是抗原蛋白表达时间长,那么机体产生的相应的免疫球蛋白的时间也就变长,从而机体对流感病毒的免疫时间就相应变长;再者,使用剂量的降低,可大量节约生产成本, 降低药品的销售价格,让广大人民收益。
3、本发明提供的一种免疫原组合物,还包括佐剂srRNA分子,佐剂srRNA分子包含至少1个ORF,所述ORF编码包含有活性的组成型表达的TLR-7的多肽,本发明结合表达免疫激动剂基因TLR-7作为佐剂,将其设计成srRNA分子,与抗原srRNA分子组合,进一步增强了抗原的免疫反应,从而使保护效率得以大大提高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中的srRNA分子的结构示意图;图中A图为srRNA的关键位点克隆示意图,B图为构建的重组质粒图谱。
图2是本发明实施例2中线性化质粒及酶切前的重组质粒的代表性电泳图;图中,从左至右,泳道1为DNA分子量标准(marker);泳道2:未酶切质粒;泳道3: 酶切后的质粒。
图3是本发明实施例2步骤(6)中的电泳鉴定图谱;从左往右分别对应:ssRNA 标准品、JF-FV01 srRNA、JF-FV02 srRNA、JF-FV03 srRNA、JF-FV04 srRNA、JF-FV05 srRNA、JF-FV06 srRNA、JF-FV07 srRNA、TLR7 srRNA。
图4(1)是本发明实施例2步骤(7)中JF-FV01 srRNA的毛细管电泳分析结果。
图4(2)是本发明实施例2步骤(7)中JF-FV02 srRNA的毛细管电泳分析结果。
图4(3)是本发明实施例2步骤(7)中JF-FV03 srRNA的毛细管电泳分析结果。
图4(4)是本发明实施例2步骤(7)中JF-FV04 srRNA的毛细管电泳分析结果。
图4(5)是本发明实施例2步骤(7)中JF-FV05 srRNA的毛细管电泳分析结果。
图4(6)是本发明实施例2步骤(7)中JF-FV06 srRNA的毛细管电泳分析结果。
图4(7)是本发明实施例2步骤(7)中JF-FV07 srRNA的毛细管电泳分析结果。
图4(8)是本发明实施例2步骤(7)中TLR-7 srRNA的毛细管电泳分析结果。
图5是本发明实施例4中GFP对照组转染细胞的显微镜下观察图。
图6是本发明实施例5中蛋白质印迹图;图中从左往右泳道分别为:蛋白分子量标准、JF-FV01 srRNA(简称JF-FV01)、蛋白分子量标准、JF-FV02 srRNA(简称JF-FV02)、蛋白分子量标准、JF-FV03 srRNA(简称JF-FV03) 、蛋白分子量标准、JF-FV04 srRNA(简称JF-FV04)。
图7是本发明实施例6中荧光素酶srRNA -Luc LNPs在动物体内的不同时间的表达。
图8是本发明实施例7中单独使用JF-FV01 srRNA LNPs注射21天和42天后的ELISA检测抗体滴度图;图中,与PBS相比,表示p<0.05,表示p<0.01。
图9是本发明实施例7中单独使用JF-FV02 srRNA LNPs注射21天和42天后的ELISA检测抗体滴度图;图中,与PBS相比,表示p<0.05,表示p<0.01。
图10是本发明实施例7中单独使用JF-FV03 srRNA LNPs注射21天和42天后的ELISA 检测抗体滴度图;图中,与PBS相比,表示p<0.05,表示p<0.01。
图11是本发明实施例7中单独使用JF-FV04 srRNA LNPs注射21天和42天后的ELISA 检测抗体滴度图;图中,与PBS相比,表示p<0.05,表示p<0.01。
图12是本发明实施例7中混合使用JF-FV01 srRNA LNPs和JF-FV08 srRNA LNPs注射21天和42天后的ELISA 检测抗体滴度图;图中,与PBS相比,表示p<0.05,表示p<0.01。
图13是本发明实施例7中混合使用JF-FV04 srRNA LNPs和JF-FV08 srRNA LNPs注射21天和42天后的ELISA 检测抗体滴度图;图中,与PBS相比,表示p<0.05,表示p<0.01。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明,并不局限于所述最佳实施方式,不对本发明的内容和保护范围构成限制,任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品,均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者,按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
为了便于理解,本发明提供了以下科学背景信息和定义。由此公开的任何技术特征都可以是本发明的每个实施例的一部分。其它的技术特征亦可能于说明书的上下文中提供。
细胞免疫/细胞免疫反应:细胞免疫通常与巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)、抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的激活以及各种细胞因子对抗原的反应有关。一般来说,细胞免疫与抗体无关,而是与免疫系统细胞的激活有关。细胞免疫反应的特征是通过激活细胞毒T淋巴细胞、激活巨噬细胞和自然杀伤细胞,使其能够摧毁病原体;以及刺激细胞分泌多种细胞因子,这些细胞因子影响参与免疫反应的其他细胞的功能。
体液免疫/体液免疫反应:体液免疫通常指抗体产生及其伴随的辅助过程。体液免疫反应的典型特征可能是Th2激活和细胞因子产生、生发中心形成和同种型转换、亲和力成熟和记忆细胞产生。体液免疫通常也可以指抗体的效应功能,包括病原体和毒素的中和、经典的补体激活以及促吞噬作用和病原体消除。
佐剂/佐剂组分:最广泛意义上的佐剂或佐剂组分通常是一种(如药理学或免疫学)试剂或组合物,可以改变或增强其他试剂(如药物或疫苗)的效力。在本发明的上下文中,该术语通常指用作免疫原和/或其他药物活性化合物的载体或辅助物质的化合物或组合物。在本发明的上下文中,佐剂将优选增强本发明活性剂的特异性免疫原性作用。通常,“佐剂”或“佐剂组分”具有相同的含义,并且可以相互使用。
成熟mRNA的主体序列是编码区开放阅读框,在其上游5’侧和下游都有非编码区,即5‘UTR和3’UTR。真核生物mRNA分子两端还有5’帽子和3’尾部结构。原核细胞的mRNA一般没有尾,但感染真核细胞的病毒mRNA一般有尾。
开放阅读框,即ORF, 是一段连续的DNA或是RNA序列,始于起始密码子(ATG orAUG)而终止于终止密码子(TAA, TAG, TGA 或UAA, UAG, UGA)。 一个ORF通常编码一个蛋白。
帽子结构(Cap), 是指再mRNA 的5‘端的帽子结构,其对稳定mRNA及其翻译具有重要意义。最简单的帽子结构是7-甲基鸟苷三磷酸, m7GpppN (Cap 0)。较复杂的帽子结构在后面的一个或两个核苷酸还有2’-O-甲基修饰 (Cap1, Cap2)。帽子结构的通式可写为m7GpppN(m)pN(m)。
5’非翻译区(5’UTR)是帽子与编码区起始密码子之间的一段较短的序列,是翻译起始的高度敏感区,其长度、二级结构以及AUG的数量都会影响翻译起始的效率。5’UTR的长度一般是100~200个核苷酸,少于20个碱基时有可能会错过翻译起始密码AUG。而过长的5’UTR则容易形成过多二级结构,不利于翻译起始。
3’非翻译区(3’UTR)是终止密码子以后的转录序列,含有加尾信号,包括核心序列AAUAAA,以及下游10-30碱基处的一段富含GU的辅助序列。3’UTR也参与翻译调控。
3’端尾部是一段多聚A序列。成熟的mRNA一般在它的3’端都加上了长度为20-200碱基的多聚A尾,可以防止外切酶降解,也可以作为核孔转运系统的标志,与成熟的mRNA通过核孔转运到胞浆有关。尾部结构也与翻译过程及其调控相关。
密码子优化。密码子是用来编码氨基酸的三联体核糖核苷酸序列。有些不同的密码子可以编码同一氨基酸,称为同义密码子。不同的生物体中存在密码子的偏好性,即不均匀的密码子使用频率。编码区的二级结构和密码子选择都可能影响翻译效率,过多的二级结构和稀有密码子都会降低翻译速度。因此通过密码子优化,可以提高蛋白的表达水平。
下述实施例中的DNA序列均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
脂质体SM-102:MedChemExpresss;CAS号:2089251-47-6。
PEG –DMG 2000: Merk 公司, CAS号:1397695-86-1。
DSPC(二硬脂酰基磷脂酰胆碱):Merk 公司,CAS #:63-89-8。
胆固醇:Merk 公司,CAS #:57-88-5。
实施例1构建重组质粒
(1)、序列的选取
本实施例来自不同流感病毒毒株的抗原的多肽选自如SEQ ID NO.1~7所示的氨基酸序列,上述氨基酸序列依次来源于的毒株和抗原见下表1。
通过序列分析以及密码子优化,上述来自不同流感病毒毒株的抗原的多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.8~14所示。
TLR-7的多肽为如SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列,来源于野生型人TLR-7,通过序列分析以及密码子优化,TLR-7的多肽的DNA序列如SEQ ID NO.15所示。
绿色荧光蛋白(GFP)作为对照组。
(2)重组质粒的构建
本实施例所用的质粒载体是在VEEV replicon vector YFV-C3opt 的基础上改造而来。克隆所用的方法为常用的分子克隆方法(具体操作参见Molecular Cloning:ALaboratory Manual;Fourth Edition(作者 Michael R. Green, Joseph Sambrook))。T7启动子(T7 promotor),sg启动子(sg promotor), 氯霉素抗性序列(chloramphenicol)均为通用的序列。主要替换的元件为:
1)用T7 启动子替换SP6启动子
替换方式采用基因合成和同源重组的方法。基因合成即是在合成序列的两端加上内切酶位点,合成后酶切、连接即可。同源重组可用通用的商业克隆试剂盒。引物为目的序列下游15-20bp 的核苷酸序列,具体步骤为:(1)用限制性内切酶线性化质粒后;(2)在目的片段上下游引物的5'端引入15-25bp左右载体末端同源序列;(3)通过PCR的方法扩增目的片段,使目的片段的两端加上了与载体末端相应的同源序列;(4)按比例混合线性化载体和目的片段,50℃反应20 min,进行重组反应;(5)转化,鉴定重组克隆。以下的克隆步骤用同样的方法来改造。
2 )在T7启动子后,用本发明的5’UTR(如SEQ ID NO.17所示)去替换委内瑞拉马脑炎病毒的5’UTR,方法同步骤1)。
3) 用sg启动子序列,替换黄热病毒的启动子,方法同步骤1)。
4) 用SEQ ID NO. 8- SEQ ID NO. 15替换原来的黄热病毒的所有组件。
5)在抗原序列的末端链接串联的3’UTR(如SEQ ID NO.18所示),方法同步骤1)。
6) 紧接3’UTR的添加10-40bp的 polyA,方法同步骤1)。
7) 删除嘌呤霉素(purimycine)和 bla 组件,并用氯霉素抗性序列替换它,方法同步骤1)。
本发明中所用到的序列见SEQ ID NO. 8-15。克隆的关键位点见图1中A图,重组质粒图见图1中B图。
表1:抗原序列表
HA为SEQ ID NO.8,构建的重组质粒命名为JF-FV01,代表性的,GFP对照组的重组质粒的序列如SEQ ID NO.19所示,其中抗原序列为对应GFP的基因序列,抗原序列可以替换为SEQ ID NO.8~15,重组质粒图谱如图1所示。HA分别替换为SEQ ID NO.9~14的重组质粒命名为JF-FV02~ JF-FV07。HA替换为人的TLR-7 的序列,相对应的核酸序列号为SEQ IDNO.15,构建的重组质粒命名为JF-FV08(或TLR-7)。
实施例2srRNA质粒的制备
本实施例提供了一种srRNA质粒的制备方法,包括如下步骤:
(1)酶切
取实施例1中的重组质粒命名为JF-FV01~ JF-FV08,或GFP对照组,分别采用限制性内切酶BspQI进行酶切,酶切体系为:50μl;酶切条件为:50℃,反应时间为15-60分钟。然后采用Qiagen 质粒纯化试剂盒回收线性化质粒,线性化质粒及酶切前的重组质粒的代表性电泳图见图2所示。任何商业化的内切酶均可使用。
(2)体外转录得到RNA
100 μl反应体系中,加入步骤(1)中制备的线性化质粒10μg,10 μl NTP混合物,5μl 10×缓冲液,10 μl的T7转录酶,余量为无核酶水。NTP混合物提供的有效成分为ATP、CTP、GTP、UTP。反应体系中,ATP、CTP、GTP和UTP的浓度为(10mM),T7转录酶的含量为50 U。反应中可用50%的假尿嘧啶(甲基化尿嘧啶)来代替尿嘧啶。 NTP混合物、 10×缓冲液及 T7转录酶均为商业上可获得。
反应条件:37℃水浴,2-4小时。
(3)线性DNA模板的消化
向步骤(2)得到的RNA中,加入DNase I,每1μg RNA加入5 U的DNase I,并37℃孵育15-60 分钟。
(4)RNA纯化
将步骤(3)中消化后的反应液,用醋酸钠进行沉淀纯化RNA,得到纯化后的RNA。具体步骤如下:将含核酸的溶液用移液器转至一新的Eppendorf离心管,同时测量核酸溶液的体积,加入1/10体积的3 mol/L醋酸钠缓冲液。使醋酸钠的终浓度为0.3mo1/L;颠倒混匀后,准确加入2倍体积(RNA为2.5倍体积)的预冷无水乙醇,颠倒混匀,置冰浴中15-30 min或20-30 min,离心16000g,30分钟。
(5)加帽
将步骤(4)中纯化的RNA,65℃孵育1-30min。然后使用商业上可获得的RNA加帽试剂盒(赛默飞的试剂盒)进行加帽反应,这里的帽子化合物,可为不同的结构,在本实施例中5’帽结构选择7mG ( 5 ' ) ppp Nm,配制的反应体系(40μl):步骤(4)制备的RNA为20 μg,10×反应缓冲液4 μl,GTP(中文名称为三磷酸鸟苷)为2 μl,VCE加帽酶为2 μl,S-腺苷蛋氨酸为2 μl,Cap 2'-O-甲基转移酶为2 μl,余量为无核酶水。反应体系中,GTP的浓度为0.5mM,VCE加帽酶和Cap 2'-O-甲基转移酶的含量分别为100 U。 反应条件:37℃水浴,1-4h。
(6)纯化
将步骤(5)中获得的反应产物采用醋酸钠进行沉淀纯化(方法同步骤(4)),得到纯化后srRNA,其电泳鉴定图谱见图3所示,图中所示的8种抗原的RNA,几乎无降解。8种抗原的ORF分别为SEQ ID NO.8~15,GFP对照组的ORF为GFP蛋白的基因序列。
(7)分析
将步骤(6)制备的8种srRNA进行毛细管电泳分析 (Agilent Fragment Analyzer5400)上样、电泳、分析均按照商家的操作(安捷伦RNA- FA试剂盒)步骤进行,毛细管电泳分析结果如图4(1)-图4(8)所示。每种抗原的RNA完整性均大于80%。说明,8种srRNA均构建成功。
实施例3脂质体纳米颗粒(Lipid nanoparticle, LNP)的制备
本实施例提供了一种脂质体纳米颗粒的制备方法,该纳米颗粒可作为药物的一种有效成分来使用。包括如下步骤:
将实施例2中制备的任意一种srRNA,用pH=4、50mM的乙酸钠缓冲液稀释至浓度为5μg/ml,得到溶液A;
取SM-102、DSPC、胆固醇、PEG-DMG2000,溶于纯乙醇,使SM-102浓度为50mM、DSPC浓度为20mM、胆固醇浓度为50mM、PEG-DMG 2000浓度为20mM,得到溶液B;
将各溶液A和溶液B同时加样至微流体混合器( 迈安那),溶液A和溶 液B的体积比为8 :1,总流速为3 ml/min。收集流出液。将流出液转移至透析管中(30K规格),离心浓缩至srRNA浓度为0.5 mg/ml,然后采用0 .22μm滤膜过滤,收集滤液,制备得到srRNA脂质体纳米颗粒,即对应获得JF-FV01 srRNA LNPs溶液~JF-FV08 srRNA LNPs溶液,-20℃保存。
分别将JF-FV01 srRNA LNPs溶液~JF-FV08 srRNA LNPs溶液,采用Malvern仪器(Malvern , England)测量LNPs的粒径、PDI(particle distribution index)和zeta(Zetapotential)电位。分别对JF-FV01 srRNA LNPs溶液~JF-FV08 srRNA LNPs溶液,用RNAAssay Kit (Thermo Fisher Scientific)计算 LNPs的包封率。结果如下表2:
表2:LNP表征数据
实施例4srRNA脂质体纳米颗粒的体外表达
(1)取6孔板,接种HEK293细胞(4×105个细胞/孔),采用含10%血清和1%双抗的DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific)培养16-18小时。所用的一抗均为义翘神州对应的抗体,二抗为抗人IgG-HRP (义翘)。
(2)完成步骤(1)后,加入实施例3制备的JF-FV01 srRNA LNPs 或其它的srRNA脂质体纳米颗粒(0.1µg RNA/孔),然后培养24-48小时。
(3)完成步骤(2)后,显微镜下观察细胞状态。对于GFP对照组可直接在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。如图5所示,图中可清晰地反应自复制RNA在四种不同细胞系 HEK293,Hela,H446,22Rv1 中的自复制GFP的高效表达。
实施例5srRNA脂质体纳米颗粒的蛋白细胞表达鉴定
取实施例3中的srRNA脂质体纳米颗粒,分别感染HEK293 细胞(按照实施例4中步骤(1)-(2))。48小时后,收获细胞,加入RIPA 缓冲液(Thermo Fisher) 裂解细胞。用蛋白印迹法来检测srRNA脂质体纳米颗粒蛋白表达。 所用的一抗均为义翘神州对应的抗体,二抗为抗人IgG-HRP (义翘)。方法为通常所用的蛋白质印迹(Western blot)方法。结果显示,JF-FV01 srRNA LNPs~JF-FV08 srRNA LNPs的抗原均可特异性的表达,代表性的结果如图6所示,可以清晰的看出抗原特异性的表达。
实施例6srRNA脂质体纳米颗粒的体内表达和蛋白鉴定
选择6~8周龄雌性Balb/C小鼠,注射药品如实施例3制备的荧光素酶srRNA -LucLNPs(Luciferase srRNA LNPs),免疫剂量为4 μg srRNA。注射部位为右大腿肌肉。单次注射体积均为50 μl(用PBS缓冲液调整)。
阴性对照组为左侧大腿肌肉,注射PBS缓冲液。
注射后1-30天,腹腔注射荧光素钾盐 (D-luciferin, potassium Salt D),1.5mg/10g体重。
荧光素钾盐溶于无镁无钙1×PBS,无菌过滤 -20℃保存。
荧光素腹腔注射后10-15分钟,当光信号达到最强稳定平台期后,利用Tan'non 成像仪进行活体城像。活体成像见图7。从注射后的24 小时后,蛋白开始表达,到7-10天时,表达最强,且可持续表达30天左右。从图中亦可看出,本发明制备的srRNA脂质体纳米颗粒的蛋白表达只集中在注射部位的肌肉组织中,其它地方无表达。
实施例7srRNA疫苗评价
一、免疫方案设计
选择6~8周龄雌性Balb/C小鼠,随机分组(每组6-9只),见下表3。各组均采用肌肉单次免疫,单次免疫剂量见下表3。单次免疫体积均为50 μl(用PBS缓冲液调整)。对于G12~G19中混合的srRNA疫苗,混合比例为等剂量比,疫苗的各自剂量为10ng。
阴性对照组注射PBS缓冲液,低剂量组注射药品如实施例3制备的JF-FV01 srRNALNPs,免疫剂量为1000ng为高剂量组,10ng为中剂量组,2ng为低剂量组。
表3、免疫方案
免疫剂量均指的是RNA剂量。
二、血清特异性抗体ELISA检测
试验第0天(即初次免疫的前1天)、试验第21天(3周)、试验第42天(6周)分别于小鼠眼眶后静脉丛取血,按照常规方法制成血清。
包被抗原:易翘神州的抗原(Sino Biological公司)。
1、取96孔板,加入包被抗原溶液(100微升/孔),4℃包被15小时,弃上清。包被抗原溶液中,包被抗原的浓度为1-5 μg/ml。
2、完成步骤1后,取所述96孔板,每孔加入100微升含1-5g/100ml BSA的PBS缓冲液,37℃封闭1-3小时,然后采用PBS缓冲液洗涤5次。
3、完成步骤2后,取所述96孔板,加入供试血清样本(50μl/孔),室温孵育60分钟。每孔供试血清样本设置5个复孔。
供试血清样本的制备方法:取血清,56℃加热30分钟以灭活,得到灭活血清;取灭活血清,采用PBS缓冲液作为溶剂,进行梯度稀释(稀释到实验组的OD450值为PBS对照组的2.5倍为止,实验组所对应的稀释度为抗体最大滴度),得到供试血清样本。
4、完成步骤3后,弃上清,采用PBS缓冲液洗涤3次,加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG (1:10000,易翘神州),室温孵育60分钟。
5、完成步骤4后,弃上清,采用PBS缓冲液洗涤3次,加入TMB显色液,室温孵育15分钟,用酶标板阅读器(Bio Tek)读取吸光度(450 nm)。结果显示,免疫本发明的srRNA LNPs均产生了高滴度的anti-HA特异性IgG抗体,srRNA-Luc LNP、阴性对照组未产生抗体。具体结果见下表4:
表4、最高免疫滴度
代表性ELISA的结果见图8~图13(纵坐标为OD450的吸光值)。
从上表4和图8~13中可以看出:42天的抗体滴度部分明显高于21天组。单独使用各抗原疫苗时,JF-FV01 srRNA LNPs的21d的滴度为1:8000,42d的滴度为1:16000;JF-FV02srRNA LNPs的滴度为1:12000;JF-FV03 srRNA LNPs的滴度为1:16000;JF-FV04 srRNALNPs的21d的滴度为1:1000,42d的滴度为1:4000;
当抗原结合TLR-7 (JF-FV08 srRNA LNPs) 使用时,抗体的滴度显著提高。当JF-FV01 srRNA LNPs结合JF-FV08 srRNA LNPs使用时,10ng 的注射剂量,可以看出,21d的抗体滴度从原来的1:8000 提高到1:64000,提高了八倍;同样在JF-FV04 srRNA LNPs结合JF-FV08 srRNA LNPs使用时,10ng 的注射剂量,21d的抗体滴度从原来1:1000提高到1:16000,提高了16倍,42d的抗体滴度从原来1:4000提高到1:16000,提高了4倍。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (11)
1.一种免疫原组合物,其特征在于,包括至少一种抗原srRNA分子;所述抗原srRNA分子包含至少1个ORF,所述ORF编码包含来自不同流感病毒毒株的抗原的多肽。
2.根据权利要求1所述的免疫原组合物,其特征在于,所述来自不同流感病毒毒株选自甲型流感病毒H1N1、甲型流感病毒H3N2、乙型流感病毒B/Victoria 谱系和/或乙型流感病毒B/Yamagata谱系。
3.根据权利要求2所述的免疫原组合物,其特征在于,来自不同流感病毒毒株的抗原的多肽选自如下至少一种:
(1)、与野生型甲型流感病毒A/Wisconsin/588/2019的HA抗原具有80%以上的同源性的氨基酸序列;
(2)、与野生型甲型流感病毒A/Darwin/6/2021的HA抗原具有80%以上的同源性的氨基酸序列;
(3)、与野生型乙型流感病毒B/Austria/1359417/2021的HA抗原具有80%以上的同源性的氨基酸序列;
(4)、与野生型乙型流感病毒B/Phuket/3073/2013的HA抗原具有80%以上的同源性的氨基酸序列;
(5)、与野生型乙型流感病毒B/Phuket/3073/2013的NA抗原具有80%以上的同源性的氨基酸序列;
(6)、与野生型乙型流感病毒B/Austria/1359417/2021的NP抗原具有80%以上的同源性的氨基酸序列;和
(7)、与野生型乙型流感病毒B/Austria/1359417/2021的M2抗原具有80%以上的同源性的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的免疫原组合物,其特征在于,来自不同流感病毒毒株的抗原的多肽选自如SEQ ID NO.1~7所示的氨基酸序列;和/或
来自不同流感病毒毒株的抗原的多肽的DNA序列经过密码子优化,选自如SEQ ID NO.8~14所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求1-4任一项所述的免疫原组合物,其特征在于,还包括佐剂srRNA分子,所述佐剂srRNA分子包含至少1个ORF,所述ORF编码包含有活性的组成型表达的TLR-7的多肽。
6.根据权利要求5所述的免疫原组合物,其特征在于,所述有活性的组成型表达的TLR-7的多肽为与野生型人TLR-7具有80%以上的同源性的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的免疫原组合物,其特征在于,所述TLR-7的多肽为如SEQ IDNO.16所示的氨基酸序列;和/或
所述TLR-7的多肽的DNA序列经过密码子优化,其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
8.根据权利要求1-4任一项或6或7所述的免疫原组合物,其特征在于,抗原srRNA分子或佐剂srRNA分子还包括5’帽结构、5’UTR序列、3’UTR序列、启动子、编码复制酶的序列和/或poly(A)尾;
所述5’UTR序列的5’端含有转录起始的序列为5’-GCCACC-3’;和/或
所述5’UTR序列为经过优化的人β-珠蛋白的5’UTR序列;和/或
所述3’UTR序列为串联的经优化的2-3个的人β-珠蛋白的3’UTR序列或非洲爪蟾β珠蛋白的3’UTR序列;和/或
所述poly(A)尾的长度为30-50个核苷酸;和/或
所述srRNA分子按照5’-3’方向依次包括如下元件:5’帽结构、5’UTR序列、编码复制酶的序列、ORF、3’UTR序列和poly(A)尾。
9.一种生物材料,其特征在于,包括如下任一种:
A1、含有权利要求1-8任一项中抗原srRNA分子或佐剂srRNA分子的重组载体;
A2、含有A1中所述的重组载体的宿主细胞。
10.一种药物组合物,其特征在于,包含权利要求1-8任一项所述的免疫原组合物,以及药学上可接受的载体。
11.权利要求1-8任一项所述的免疫原组合物、权利要求9所述的生物材料或权利要求10所述的药物组合物具有如下的用途:
(1)、在制备预防或治疗流感的疫苗中的用途;
(2)、在制备抑制流感病毒的产品中的用途;
(3)、在制备流感相关检测试剂产品中的用途。
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