JP2024514183A - エプスタイン－バーウイルスｍＲＮＡワクチン - Google Patents

Abstract

本開示は、エプスタイン－バーウイルスリボ核酸ワクチン、ならびにワクチンを使用する方法及びワクチンを含む組成物に関する。

Description

関連出願
本出願は、２０２１年４月１３日に出願された米国仮出願第６３／１７４，２８７号の米国特許法第１１９条（ｅ）下の利益を主張し、その出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

ヒトヘルペスウイルス４とも称されるエプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）は、体液、最も一般的には唾液を通して広がり、主に小児及び青年（それぞれ、約５０％及び約８９％の血清反応陽性）が罹患する一般的なヘルペスウイルスである。これは、米国における伝染性単核球症の主因であり、年間約１００万～２００万人の症例の９０％超を占める。伝染性単核球症は、患者を数週間～数ヶ月間衰弱させ得、場合によっては、入院及び脾臓破裂につながり得る。ＥＢＶ感染は、がんである特定のリンパ増殖性疾患の発症及び進行、ならびに中枢神経系の自己免疫疾患である多発性硬化症を含む自己免疫疾患のリスクの増加に関連している。ＥＢＶに対する承認されたワクチンはない。

米国仮出願第６３／１７４，２８７号

メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ベースのワクチンプラットフォームは、脂質ナノ粒子中に配合されたｍＲＮＡを含むワクチンの送達からの対応する合成ウイルスｍＲＮＡの送達及び細胞取り込みによって、標的ウイルスタンパク質（抗原）がインビボで産生され得るという原理及び観察に基づいて開発された。次いで、ｍＲＮＡは、細胞内リボソーム翻訳を受けて、合成ウイルスｍＲＮＡを含むワクチンによってコードされるウイルスタンパク質を内因的に発現する。これらのｍＲＮＡベースのワクチンは、細胞核に入ることも、ヒトゲノムと相互作用することもなく、非複製であり、一時的に発現される。ｍＲＮＡワクチンは、例えば、野生型ウイルス感染を模倣し、かつＥＢＶなどの感染性病原体に対する高度に標的化された免疫応答を誘導することができる様式で、複数の構造的に無傷の、適切に折り畳まれた、かつグリコシル化されたウイルス糖タンパク質のヒト細胞における内因性産生を刺激するメカニズムを供与する。

本開示のいくつかの態様は、ワクチンであって、（ａ）エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）糖タンパク質２２０（ｇｐ２２０）をコードするオープンリーディングフレームを含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）と、（ｂ）糖タンパク質４２（ｇｐ４２）をコードするオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡと、（ｃ）糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡと、（ｄ）糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）をコードするオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡと、を含む脂質ナノ粒子を含む、ワクチンを提供する。

いくつかの実施形態では、ｇｐ４２は、ｇｐ４２の可溶性形態である。

いくつかの実施形態では、（ａ）：（ｂ）：（ｃ）：（ｄ）の質量比は、４：１：１：１．５である。他の実施形態では、（ａ）：（ｂ）：（ｃ）：（ｄ）の質量比は、４：１：１：１である。

いくつかの実施形態では、（ａ）のｍＲＮＡが、（ｂ）、（ｃ）、及び／または（ｄ）のｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍である、請求項１または２に記載のワクチン。いくつかの実施形態では、（ａ）のｍＲＮＡは、（ｂ）、（ｃ）、及び／または（ｄ）のｍＲＮＡと等しい質量にある。

いくつかの実施形態では、（ｂ）のｍＲＮＡは、（ａ）、（ｃ）、及び／または（ｄ）のｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４．５倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍である。いくつかの実施形態では、（ｂ）のｍＲＮＡは、（ａ）、（ｃ）、及び／または（ｄ）のｍＲＮＡと等しい質量にある。

いくつかの実施形態では、（ｃ）のｍＲＮＡは、（ａ）、（ｂ）、及び／または（ｄ）のｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍である。いくつかの実施形態では、（ｃ）のｍＲＮＡは、（ａ）、（ｂ）、及び／または（ｄ）のｍＲＮＡと等しい質量にある。

いくつかの実施形態では、（ｄ）のｍＲＮＡは、（ａ）、（ｂ）、及び／または（ｃ）のｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍である。いくつかの実施形態では、（ｄ）のｍＲＮＡは、（ａ）、（ｂ）、及び／または（ｃ）のｍＲＮＡと等しい質量にある。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードする２６．７μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードする６．７μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇＬをコードする６．７μｇのｍＲＮＡ、及びＥＢＶ ｇＨをコードする１０μｇのｍＲＮＡを含む。他の実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードする５３．３μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードする１３．３μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇＬをコードする１３．３μｇのｍＲＮＡ、及びＥＢＶ ｇＨをコードする２０μｇのｍＲＮＡを含む。なお他の実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードする１０６．７μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードする２６．７μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇＬをコードする２６．７μｇのｍＲＮＡ、及びＥＢＶ ｇＨをコードする４０μｇのｍＲＮＡを含む

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、（ｅ）糖タンパク質Ｂをコードするオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡを更に含む。いくつかの実施形態では、（ａ）：（ｂ）：（ｃ）：（ｄ）：（ｅ）の質量比は、４：１：１：１．５：１．５である。

いくつかの実施形態では、ｇｐ２２０は、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇｐ２２０は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ｇＬは、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＬは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態ではｇＨは、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＨは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ｇｐ４２は、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇｐ４２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、可溶性ｇｐ４２は、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ｇｐ４２は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ｇＢは、配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＢは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、（ａ）～（ｅ）のうちのいずれか１つ以上のｍＲＮＡは、５’７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐキャップ及び３’ポリＡテールを含む。

いくつかの実施形態では、（ａ）～（ｅ）のうちのいずれか１つ以上のｍＲＮＡは、１－メチルプソイドウリジン化学修飾を含む。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４５～５５ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、１５～２０％の中性脂質、３５～４５ｍｏｌ％のコレステロール、及び約０．５～５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。

いくつかの実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質は、化合物Ｉである：
。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む。他の実施形態では、脂質ナノ粒子は、４９ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む。更に他の実施形態では、脂質ナノ粒子は、４８ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む。

本開示の他の態様は、方法であって、対象に、先行請求項のいずれか１項に記載のワクチンをＥＢＶに対する免疫応答を誘導するのに有効な量で投与することを含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、単回用量として投与される。他の実施形態では、ワクチンは、初回用量及び少なくとも１回のブースター用量として投与される。

ＥＢＶ ｍＲＮＡワクチンの細胞内送達及び細胞表面でのコードされたＥＢＶ糖タンパク質の発現を示す概略図である。 Ａ及びＢは、可溶性ＥＢＶ ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡの、ＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡ、及びｇｐ２２０をコードするｍＲＮＡを含むワクチンへの添加が、（１）Ｂ細胞感染に対して産生された中和抗体力価を、野生型（膜結合）ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡと同様に改善し（図２Ａ）、かつ（２）上皮細胞に対して産生された中和抗体力価を、野生型ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡの程度まで減衰させない（図２Ｂ）ことを示すデータのグラフ。データはまた、ＥＢＶ ｇＢをコードするｍＲＮＡの、可溶性ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡまたは野生型ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡのいずれかを含むワクチンへの添加が、Ｂ細胞中和抗体力価の著しい低下につながる（図２Ａ）ことを示す。 Ａ及びＢは、可溶性ＥＢＶ ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡの、ＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡ、及びｇｐ２２０をコードするｍＲＮＡを含むワクチンへの添加が、（１）Ｂ細胞感染に対して産生された中和抗体力価を、野生型（膜結合）ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡと同様に改善し（図２Ａ）、かつ（２）上皮細胞に対して産生された中和抗体力価を、野生型ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡの程度まで減衰させない（図２Ｂ）ことを示すデータのグラフ。データはまた、ＥＢＶ ｇＢをコードするｍＲＮＡの、可溶性ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡまたは野生型ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡのいずれかを含むワクチンへの添加が、Ｂ細胞中和抗体力価の著しい低下につながる（図２Ａ）ことを示す。 前臨床研究において観察された、Ｂ細胞感染に対する中和抗体（図３Ａ）を示すグラフを含む。 前臨床研究において観察された、上皮細胞感染に対する中和抗体（図３Ｂ）を示すグラフを含む。 Ａ及びＢは、Ｂａｌｂ／ｃマウス及び２つの異なる用量のｍＲＮＡワクチン：１０μｇ（ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードする５．３３μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇＨをコードする２μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇＬをコードする１．３３μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｓｇｐ４２をコードする１．３３μｇのｍＲＮＡ）、及び２．５μｇ（ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードする１．３３μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇＨをコードする０．５μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇＬをコードする０．３３μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｓｇｐ４２をコードする０．３３μｇのｍＲＮＡ）を使用する前臨床研究において観察された、Ｂ細胞感染に対する抗体（図４Ａ）及び上皮細胞感染に対する抗体（図４Ｂ）を示すグラフを含む。ｍＲＮＡワクチンは、両方の用量で免疫原性であり、Ｂ細胞中和抗体及び上皮細胞中和抗体（ｇＨｇＬ、ｇｐ２２０、及びｇｐ４２）を上昇させた。 Ａ～Ｃは、２つの異なる用量のｍＲＮＡワクチン：１０μｇ（ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードする５．３３μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇＨをコードする２μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇＬをコードする１．３３μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｓｇｐ４２をコードする１．３３μｇのｍＲＮＡ）、及び２．５μｇ（ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードする１．３３μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇＨをコードする０．５μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇＬをコードする０．３３μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードする０．３３μｇのｍＲＮＡ）を投与したＢａｌｂ／ｃマウス由来の試料を使用するＥＬＩＳＡアッセイにおけるＩｇＧ力価を示すグラフを含む。図５Ａ：ＥＢＶ ｇＨｇＬ、図５Ｂ：ＥＢＶ ｇｐ２２０、図５Ｃ：ＥＢＶ ｇｐ４２。ｍＲＮＡワクチンは、両方の用量で免疫原性であり、４つ全ての抗原（ｇＨｇＬ、ｇｐ２２０、及びｓｇｐ４２）に対する結合抗体を上昇させた。 Ａ～Ｃは、ラットにおける２用量３５日間の免疫原性研究からの抗原結合抗体力価を示すグラフを含む。動物に、１日目に第１の用量、及び２２日目に第２の用量を投与し、次いで、３５日目に抗体力価を評価した。３つの異なる用量を評価した：３０μｇの総ｍＲＮＡ、６０μｇの総ｍＲＮＡ、及び８０μｇの総ｍＲＮＡ（ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードするｍＲＮＡ、ＥＢＶｇＨをコードするｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｓｇｐ４２をコードするｍＲＮＡ）。Ｎ＝１０（５匹の雄、５匹の雌）。図６Ａ：ＥＢＶ ｇＨｇＬ、図６Ｂ：ＥＢＶ ｓｇｐ４２、図６Ｃ：ＥＢＶ ｇｐ２２０。判定された全ての用量において、ワクチン抗原に対する強力な血清ＩｇＧ応答が誘発された。

ＥＢＶは、ＣＭＶを含むヘルペスウイルスファミリーのメンバーであり、体液（例えば、唾液）を通して広がり、主に小児及び青年が罹患する。ＥＢＶのライフサイクルは、ＣＭＶなどの他のヘルペスウイルスと同様に、増殖期及び潜伏期、ならびに異なる細胞型におけるウイルス侵入を媒介する複数の表面（エンベロープ）糖タンパク質を有する。本明細書で提供するようなＥＢＶに対するｍＲＮＡワクチンは、ＥＢＶ中のウイルスタンパク質（ｇｐ２２０、ｇｐ４２、ｇＨ、及びｇＬ）をコードする少なくとも４つのｍＲＮＡを含有する。いくつかの実施形態では、これらのウイルスタンパク質は、免疫系による認識のために、それらのネイティブ膜結合形態で発現する。他の実施形態では、ｇｐ４２は、可溶性形態で発現する。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）をコードするｍＲＮＡを更に含む。

本明細書に記載のＥＢＶ ｍＲＮＡワクチンは、現在のワクチンよりもいくつかの点で優れている。例えば、本明細書で使用される脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達システムは、文献に記載されるプロタミンベースの手法を含む他の製剤と比較して、ｍＲＮＡワクチンの有効性を増加させる。このＬＮＰ送達システムの使用は、治療結果を産生する（例えば、産生中和抗体力価）追加のアジュバントを必要とすることなく、化学修飾ＲＮＡワクチンまたは非修飾ｍＲＮＡワクチンの効果的な送達を可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＥＢＶ ｍＲＮＡワクチンは、筋肉内（ＩＭ）または皮内（ＩＤ）に投与される場合、少なくとも１０倍、２０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１，０００倍の倍率で、従来のワクチンよりも優れている。これらの結果は、他のクラスの脂質ベースの製剤で使用されるＲＮＡ用量と比較して、著しく低い用量のｍＲＮＡが投与された場合でも達成され得る。

更に、細胞に十分なＲＮＡを送達して免疫原性応答を産生するためのウイルス複製経路に依拠する自己複製ＲＮＡワクチンとは異なり、本開示のワクチンは、強力な免疫応答をもたらすのに十分なタンパク質を産生するためにウイルス複製を必要としない。したがって、本開示のワクチンは、自己複製ＲＮＡを含まず、ウイルス複製に必要な構成要素を含まない。

本開示のワクチンのｍＲＮＡが天然に存在しないことが理解されるべきである。つまり、本明細書で提供されるようなＥＢＶ抗原をコードするｍＲＮＡは、天然には存在しない。また、本明細書に記載のワクチンは、ウイルスを除外することが理解されるべきである（すなわち、ワクチンは、ウイルスではないか、またはウイルスを含有しない）。

ＥＢＶ抗原
抗原は、免疫応答を誘導する（例えば、免疫系に、抗原に対する抗体の産生を起こさせる）ことが可能なタンパク質である。本明細書では、「抗原」という用語の使用は、免疫原性／抗原性タンパク質及び免疫原性／抗原性断片（ヒトＥＢＶに免疫応答を誘導する（または誘導することが可能である）免疫原性／抗原性断片）を包含する。「タンパク質」という用語が、完全長タンパク質、短縮タンパク質、修飾タンパク質、及びペプチドを包含することも理解されるべきである。

本明細書に提供されるワクチンのＥＢＶ抗原の例示的な核酸及びアミノ酸配列を表３に提供する。

いくつかの実施形態では、ｇｐ２２０は、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇｐ２２０は、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇｐ２２０は、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇｐ２２０は、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇｐ２２０は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ｇＬは、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＬは、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＬは、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＬは、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＬは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ｇＨは、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＨは、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＨは、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＨは、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＨは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ｇｐ４２は、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇｐ４２は、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇｐ４２は、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇｐ４２は、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇｐ４２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、可溶性ｇｐ４２は、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ｇｐ４２は、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ｇｐ４２は、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ｇｐ４２は、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、可溶性ｇｐ４２は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ｇＢは、配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＢは、配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＢは、配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＢは、配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＢは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。

本明細書に記載されるｍＲＮＡ Ｆタンパク質が、シグナル配列を含んでも、含んでいなくてもよいことが理解されるべきである。

ＥＢＶ核酸
本開示のワクチンは、ＥＢＶ抗原をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する（少なくとも１つの）ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリ（Ａ）テール、及び／または５’キャップ類似体を更に含む。

また、本開示のｍＲＮＡワクチンは、任意の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／または任意の３’ＵＴＲを含み得ることが理解されるべきである。例示的なＵＴＲ配列は、配列表（例えば、配列番号２～５）に提供されるが、しかしながら、他のＵＴＲ配列は、本明細書に記載されるＵＴＲ配列のうちのいずれかとして使用または交換され得る。また、ＵＴＲは、本明細書で提供するｍＲＮＡポリヌクレオチドから省いてもよい。

核酸は、ヌクレオチド（ヌクレオチドモノマー）のポリマーを含む。したがって、核酸はまた、ポリヌクレオチドとも称される。核酸は、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡであって、例としては、β－Ｄ－リボ構成を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ構成を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－ＬＮＡ、及び２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、及び／またはこれらのキメラ及び／または組み合わせであってもよく、これらを含んでもよい。

「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）は、（少なくとも１つの）タンパク質（天然に存在するか、天然に存在しないか、またはアミノ酸の修飾ポリマー）をコードする任意のＲＮＡを指し、これは、翻訳されて、インビトロで、インビボで、インサイチュで、またはエクスビボでコードされたポリペプチドを産生し得る。当業者であれば、別段明記しない限り、本出願に記載の核酸配列は、代表的なＤＮＡ配列において「Ｔ」を挙げることができるが、その配列がｍＲＮＡを表す場合、「Ｔ」は、「Ｕ」に置換されることを理解するであろう。したがって、本明細書で特定の配列同定番号によって開示及び同定されるＤＮＡのうちのいずれも、ＤＮＡに相補的な対応するｍＲＮＡ配列についても開示しており、ＤＮＡ配列の各「Ｔ」が、「Ｕ」で置換される。

オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、開始コドン（例えば、メチオニン（ＡＴＧまたはＡＵＧ））で始まり、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、もしくはＴＧＡ、またはＵＡＡ、ＵＡＧ、またはＵＧＡ）で終わるＤＮＡまたはＲＮＡの連続的なストレッチである。ＯＲＦは、典型的にはタンパク質をコードする。本明細書に開示される配列は、追加のエレメント、例えば、５’及び３’ＵＴＲを更に含み得るが、それらのエレメントは、ＯＲＦとは異なり、本開示のｍＲＮＡポリヌクレオチドに必ずしも存在する必要はないことが理解されるであろう。

バリアント
いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、ＥＢＶ抗原バリアントをコードするｍＲＮＡを含む。抗原バリアントまたは他のポリペプチドバリアントは、野生型、ネイティブ、または参照配列とはアミノ酸配列が異なる分子を指す。抗原／ポリペプチドバリアントは、ネイティブ配列または参照配列と比較して、アミノ酸配列内の特定の位置に置換、欠失、及び／または挿入を有し得る。通常、バリアントは、野生型、ネイティブ、または参照配列に対し少なくとも５０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントは、野生型、ネイティブ、または参照配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％の同一性を共有する。

本開示の核酸によってコードされるバリアント抗原／ポリペプチドは、例えば、その免疫原性を向上する、その発現を向上する、及び／または対象におけるその安定性もしくはＰＫ／ＰＤ特性を改善する、多数の望ましい特性のうちのいずれかを付与する、アミノ酸変化を含有し得る。バリアント抗原／ポリペプチドは、通例の変異誘発技法を使用して作製し、適宜アッセイして、所望の特性を有するかどうかを決定することができる。発現レベル及び免疫原性を決定するアッセイは、当該技術分野でよく知られており、例示的なそのようなアッセイは、実施例セクションに記載されている。同様に、タンパク質バリアントのＰＫ／ＰＤ特性は、当該技術分野で認識されている技法を使用して、例えば、ワクチン接種した対象における抗原の発現を経時的に評価することによって、及び／または誘導された免疫応答の持続性を確認することによって測定することができる。バリアント核酸によってコードされるタンパク質（複数可）の安定性は、熱安定性もしくは尿素変性時の安定性をアッセイすることによって測定することができるか、またはｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測を使用して測定することができる。そのような実験及びｉｎ ｓｉｌｉｃｏ評価のための方法は、当該技術分野で知られている。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、本明細書で提供される配列のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含むか（例えば、配列表及び表３を参照されたい）、または本明細書で提供される配列のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含む、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡオープンリーディングフレームを含む。

「同一性」という用語は、２つ以上のポリペプチド（例えば、抗原）またはポリヌクレオチド（核酸）の配列間の関係であって、この配列を比較することによって決定される関係を指す。同一性とはまた、配列間または配列同士の配列関連性の程度も指し、２つ以上のアミノ酸残基または核酸残基の鎖間の一致数によって決定される。同一性は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（例えば、「アルゴリズム」）によってアドレス指定されたギャップアラインメント（存在する場合）を有する２つ以上の配列のうちの小さい方の間の同一の一致のパーセントを測定する。関連する抗原または核酸の同一性は、既知の方法によって容易に計算することができる。ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に適用される「同一性パーセント（％）」とは、当該配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して最大の同一性パーセントを達成した後の第二の配列のアミノ酸配列または核酸配列における残基と同一の、アミノ酸または核酸の候補配列における残基（アミノ酸残基または核酸残基）のパーセンテージと定義される。整列のための方法及びコンピュータプログラムは、当該技術分野でよく知られている。同一性は、同一性パーセントの計算に依存するが、計算に導入されたギャップ及びペナルティにより価値が異なる場合があることが理解される。一般的に、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（例えば、抗原）のバリアントは、本明細書に記載され、当業者に知られている配列アライメントプログラム及びパラメーターによって決定される特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのものに対して、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。そのようなアライメント用ツールには、ＢＬＡＳＴスイートのツールが含まれる（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ． Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ（１９９７），「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）。別の普及しているローカルアラインメント技法は、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）″Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．″Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７を参照されたい）。動的プログラミングに基づく一般的なグローバルアラインメント技法は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）″Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．″Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）である。より最近では、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを含む他の最適なグローバルアラインメント方法よりも速くヌクレオチド及びタンパク質配列のグローバルアラインメントを生成すると言われる高速最適グローバルシーケンスアラインメントアルゴリズム（ＦＯＧＳＡＡ）が開発されている。

したがって、参照配列、特に本明細書に開示のポリペプチド（抗原）配列と比較して、置換、挿入及び／または付加、欠失、ならびに共有結合修飾を含有するペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、本開示の範囲内に含まれる。例えば、配列タグまたはアミノ酸、例えば、１つ以上のリジンが、ペプチド配列に（例えば、Ｎ末端またはＣ末端で）付加され得る。配列タグは、ペプチドの検出、精製または局在のために使用することができる。リジンは、ペプチドの溶解性を増加させるために、またはビオチン化を可能にするために使用され得る。代替的に、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ及びアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基を任意選択で欠失させて、短縮配列をもたらしてもよい。ある特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端またはＮ末端残基）は、あるいは、配列の使用に応じて、例えば、可溶性であるか、または固体支持体に連結された、より大きな配列の一部としての配列の発現に応じて欠失され得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列、終止配列、膜貫通ドメイン、リンカー、多量体化ドメイン（例えば、フォールドオン領域）などのための（またはこれらをコードする）配列は、同じまたは類似の機能を達成する代替的な配列で置換され得る。いくつかの実施形態では、タンパク質のコア内の空洞は、例えば、より大きなアミノ酸を導入することによって、充填して安定性を改善してもよい。他の実施形態では、埋もれた水素結合ネットワークを疎水性残基により置き換えて、安定性を改善することができる。また他の実施形態では、グリコシル化部位を除去し、適切な残基で置き換えてもよい。そのような配列は、当業者には容易に同定可能である。本明細書で提供される配列のうちのいくつかは、例えば、ｍＲＮＡワクチンの調製で使用する前に欠失され得る、配列タグまたは末端ペプチド配列を（例えば、Ｎ末端またはＣ末端に）含有することも理解されるべきである。

当業者には認識されるように、タンパク質断片、機能タンパク質ドメイン、及び相同タンパク質も、目的のＥＢＶ抗原の範囲内であると考えられる。例えば、本明細書では、参照タンパク質の任意のタンパク質断片（参照抗原配列より少なくとも１アミノ酸残基短いがそれ以外は同一であるポリペプチド配列を意味する）であって、免疫原性であり、ＥＢＶに対する防御免疫応答を付与することを条件とする、タンパク質断片を提供する。参照タンパク質と同一であるが短縮されているバリアントに加えて、いくつかの実施形態では、抗原は、本明細書で提供または言及するいずれかの配列に対し２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の変異を含む。抗原／抗原ポリペプチドの長さは、約４、６、または８アミノ酸から完全長タンパク質までの範囲をとり得る。

安定化エレメント
天然に存在する真核生物ｍＲＮＡ分子は、５’－キャップ構造または３’－ポリ（Ａ）テールなどの他の構造的特徴に加えて、限定されるものではないが、その５’末端（５’ＵＴＲ）及び／または３’末端（３’ＵＴＲ）の非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、安定化エレメントを含有し得る。５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは両方とも、典型的にはゲノムＤＮＡから転写され、未成熟ｍＲＮＡのエレメントである。成熟ｍＲＮＡに特有の構造的特徴、例えば、５’－キャップ及び３’－ポリ（Ａ）テールは、通常はｍＲＮＡのプロセシング中、転写された（未成熟）ｍＲＮＡに付加される。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、少なくとも１つの修飾、少なくとも１つの５’末端キャップを有する少なくとも１つの抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを含み、脂質ナノ粒子内に製剤化される。ポリヌクレオチドの５’キャッピングは、以下の化学的ＲＮＡキャップ類似体を使用するインビトロ転写反応中に同時に完了して、製造業者のプロトコルに従って５’－グアノシンキャップ構造を生成することができる：３´－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［ＡＲＣＡキャップ］、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。ｍＲＮＡの５’キャッピングは、ワクシニアウイルスキャッピング酵素を使用して、転写後に完了されて、「キャップ０」構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを生成してもよい（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。キャップ１構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素及び２’－Ｏメチルトランスフェラーゼの両方を使用して生成して、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ－２’－Ｏ－メチルを生成してもよい。キャップ２構造は、キャップ１構造から、２’－Ｏメチルトランスフェラーゼを使用して終わりから３番目の５’－ヌクレオチドを２’－Ｏ－メチル化することによって生成することができる。キャップ３構造は、キャップ２構造から、２’－Ｏメチルトランスフェラーゼを使用して終わりから４番目の５’－ヌクレオチドを２’－Ｏ－メチル化することによって生成することができる。酵素は、組換え供給源に由来し得る。

３’－ポリ（Ａ）テールは、典型的には、転写されたｍＲＮＡの３’末端に付加されるアデニンヌクレオチドの連なりである。いくつかの場合において、約４００のアデニンヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、３’－ポリ（Ａ）テールの長さは、個々のｍＲＮＡの安定性に関して必須のエレメントであり得る。

いくつかの実施形態では、ワクチンは安定化エレメントを含む。安定化エレメントは、例えば、ヒストンステムループを含み得る。３２ｋＤａのタンパク質であるステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）が特定されている。これは、核及び細胞質の両方におけるヒストンメッセージの３’末端にあるヒストンステムループと関連している。その発現レベルは細胞周期によって調節され、Ｓ期にピークに達し、このときヒストンｍＲＮＡレベルも上昇する。このタンパク質は、Ｕ７ ｓｎＲＮＰによるヒストンプレｍＲＮＡの効率的な３’末端プロセシングに必須であることが示されている。ＳＬＢＰはプロセシング後も引き続きステムループと会合し、次いで、細胞質中での成熟ヒストンｍＲＮＡからヒストンタンパク質への翻訳を促進する。ＳＬＢＰのｍＲＮＡ結合ドメインは、後生動物及び原生動物の全体にわたり保存されており、ヒストンのステムループとの結合は、ループの構造に依存する。最小結合部位は、ステムループに対して少なくとも３つのヌクレオチド５’及び２つのヌクレオチド３’を含む。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、コード領域、少なくとも１つのヒストンステムループ、及び任意選択で、ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルを含む。ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルは、概して、コードされたタンパク質の発現レベルを向上すべきである。コードされるタンパク質は、いくつかの実施形態では、ヒストンタンパク質、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、β－ガラクトシダーゼ、ＥＧＦＰ）、またはマーカーもしくは選択タンパク質（例えば、アルファ－グロビン、ガラクトキナーゼ及びキサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ））ではない。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルと少なくとも１つのヒストンステムループとの組み合わせであって、いずれも本来は代替的機構に相当するが、相乗的に作用して、個々のエレメントのいずれかで観察されるレベルを上回ってタンパク質発現を増加させる組み合わせを含む。ポリ（Ａ）と少なくとも１つのヒストンステムループとの組み合わせによる相乗効果は、エレメントの順序にも、ポリ（Ａ）配列の長さにも依存しない。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ヒストン下流エレメント（ＨＤＥ）を含まない。「ヒストン下流エレメント（ＨＤＥ）」は、天然に存在するステムループの３’にある約１５～２０ヌクレオチドのプリンリッチなポリヌクレオチドのストレッチを含み、これはヒストンプレｍＲＮＡから成熟ヒストンｍＲＮＡへのプロセシングに関与するＵ７ ｓｎＲＮＡの結合部位に相当する。いくつかの実施形態では、この核酸はイントロンを含まない。

ｍＲＮＡは、エンハンサー及び／またはプロモータ配列を含んでも含まなくてもよく、これらは、修飾されても修飾されなくてもよく、活性化されても活性化されなくてもよい。いくつかの実施形態では、ヒストンステムループは、概してヒストン遺伝子に由来し、短い配列からなるスペーサーによって隔てられた２つの隣接する部分的または全体的に逆相補的な配列の分子内塩基対を含み、これがこの構造のループを形成する。不対ループ領域は、典型的には、ステムループエレメントのいずれとも塩基対形成することができない。これは、多くのＲＮＡ二次構造の重要な構成要素であるので、ＲＮＡに存在する場合が多いが、一本鎖ＤＮＡにも存在し得る。ステムループ構造の安定性は、一般的に、長さ、ミスマッチまたはバルジの数、及び対となる領域の塩基ワクチンに依存する。いくつかの実施形態では、ゆらぎ塩基対（非ワトソン・クリック型塩基対）が生じることがある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒストンステムループ配列は、１５～４５ヌクレオチドの長さを含む。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、１つ以上のＡＵリッチな配列が除去されている。これらの配列（ＡＵＲＥＳと称されることがある）は、３’ＵＴＲに見られる不安定化配列である。ＡＵＲＥＳはｍＲＮＡワクチンから除去されてもよい。あるいは、ＡＵＲＥＳはｍＲＮＡワクチン中に残存していてもよい。

シグナルペプチド
いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ抗原と融合したシグナルペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを含む。シグナルペプチドは、タンパク質のＮ末端側の１５～６０アミノ酸を含み、典型的には、分泌経路上の膜を横断したトランスロケーションに必要であるので、真核生物及び原核生物の両方でほとんどのタンパク質が分泌経路に進入するのを普遍的に制御している。真核生物において、新生前駆体タンパク質（プレタンパク質）のシグナルペプチドは、リボソームを粗面小胞体（ＥＲ）膜に誘導し、プロセシングのために、成長ペプチド鎖の膜横断輸送を開始する。ＥＲプロセシングにより成熟タンパク質が生成され、シグナルペプチドは、典型的には、宿主細胞のＥＲ常駐シグナルペプチダーゼにより、前駆体タンパク質から切断されるか、または切断されないまま保たれ、膜アンカーとして機能する。シグナルペプチドはまた、タンパク質の細胞膜への標的化も促進することができる。

シグナルペプチドの長さは、１５～６０アミノ酸であり得る。例えば、シグナルペプチドの長さは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０アミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドの長さは、２０～６０、２５～６０、３０～６０、３５～６０、４０～６０、４５～６０、５０～６０、５５～６０、１５～５５、２０～５５、２５～５５、３０～５５、３５～５５、４０～５５、４５～５５、５０～５５、１５～５０、２０～５０、２５～５０、３０～５０、３５～５０、４０～５０、４５～５０、１５～４５、２０～４５、２５～４５、３０～４５、３５～４５、４０～４５、１５～４０、２０～４０、２５～４０、３０～４０、３５～４０、１５～３５、２０～３５、２５～３５、３０～３５、１５～３０、２０～３０、２５～３０、１５～２５、２０～２５、または１５～２０アミノ酸長である。

異種遺伝子由来のシグナルペプチド（事実上ＥＢＶ抗原以外の遺伝子の発現を調節する）が当該技術分野で知られており、これを所望の特性について試験し、次いで本開示の核酸に組み込んでもよい。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、以下の配列のうちの１つを含み得る：ＭＤＳＫＧＳＳＱＫＧＳＲＬＬＬＬＬＶＶＳＮＬＬＬＰＱＧＶＶＧ（配列番号２６）、ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳ（配列番号２７）；ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号２８）；ＭＬＧＳＮＳＧＱＲＶＶＦＴＩＬＬＬＬＶＡＰＡＹＳ（配列番号２９）；ＭＫＣＬＬＹＬＡＦＬＦＩＧＶＮＣＡ（配列番号３０）；ＭＷＬＶＳＬＡＩＶＴＡＣＡＧＡ（配列番号３１）。

融合タンパク質
いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、抗原性融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。したがって、コードされた抗原（複数可）は、一緒に結合された２つ以上のタンパク質（例えば、タンパク質及び／またはタンパク質断片）を含み得る。あるいは、タンパク質抗原が融合されるタンパク質は、それ自体に対する強力な免疫応答を促進しないが、むしろ、ＥＢＶ抗原に対する強力な免疫応答を促進する。抗原融合タンパク質は、いくつかの実施形態では、各々の起源のタンパク質由来の機能的特性を保持している。

足場部分
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるようなｍＲＮＡワクチンは、足場部分に連結されたＥＢＶ抗原を含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、そのような足場部分は、開示の核酸によってコードされる抗原に所望の特性を付与する。例えば、足場タンパク質は、例えば、抗原の構造を変更すること、抗原の取り込み及び処理を改変すること、ならびに／または結合パートナーへの抗原の結合を引き起こすことによって、抗原の免疫原性を改善し得る。

いくつかの実施形態では、足場部分は、１０～１５０ｎｍの直径、すなわち、免疫系の様々な細胞との最適な相互作用に非常に適しているサイズ範囲を有する、非常に対称であり、安定であり、かつ構造的に組織化されているタンパク質ナノ粒子へと自己組織化することができる、タンパク質である。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質またはウイルス様粒子を使用して、安定なナノ粒子構造を形成することができる。そのようなウイルスタンパク質の例は、当該技術分野で知られている。例えば、いくつかの実施形態では、足場部分は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）である。ＨＢｓＡｇは、約２２ｎｍの平均直径を有し、核酸を欠く、球状粒子を形成し、したがって非感染性である（Ｌｏｐｅｚ－Ｓａｇａｓｅｔａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ １４（２０１６）５８－６８）。いくつかの実施形態では、足場部分は、ＨＢＶに感染したヒト肝臓から得られるウイルスコアに類似する、２４～３１ｎｍの直径の粒子へと自己組織化する、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）である。１８０または２４０のプロトマーに対応する、３００Å及び３６０Åの直径の異なるサイズのナノ粒子の２つのクラスへと自己組織化する、生成されたＨＢｃＡｇ。いくつかの実施形態では、ＥＢＶ抗原は、ＥＢＶ抗原を表示するナノ粒子の自己組織化を容易にするために、ＨＢｓＡＧまたはＨＢｃＡＧに融合される。

いくつかの実施形態では、細菌タンパク質プラットフォームが使用され得る。これらの自己組織化タンパク質の非限定的な例としては、フェリチン、ルマジン、及びエンカプスリンが挙げられる。

フェリチンは、主な機能が細胞内の鉄貯蔵であるタンパク質である。フェリチンは、４つのアルファヘリックスバンドルで各々構成される２４個のサブユニットで作製され、これらは、八面体対称性を有する四次構造で自己組織化する（Ｃｈｏ Ｋ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；３９０：８３－９８）。フェリチンのいくつかの高分解能構造が決定されており、ヘリコバクターピロリフェリチンが２４個の同一のプロトマーで作製されていることが確認されているが、動物において、単独で組織化することができるか、または異なる比の２４個のサブユニットの粒子へと組み合わせることができる、フェリチン軽鎖及び重鎖が存在する（Ｇｒａｎｉｅｒ Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｉｎｏｒｇ Ｃｈｅｍ．２００３；８：１０５－１１１；Ｌａｗｓｏｎ Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９１；３４９：５４１－５４４）。フェリチンは、強力な熱的及び化学的安定性を備えたナノ粒子に自己集合する。したがって、フェリチンナノ粒子は、抗原を担持及び曝露するのに非常に好適である。

ルマジンシンターゼ（ＬＳ）はまた、抗原表示のためのナノ粒子プラットフォームとして非常に好適である。リボフラビンの生合成における最後から２番目の触媒ステップを担うＬＳは、古細菌、細菌、真菌、植物、及び真性細菌を含む多種多様な生物に存在する酵素である（Ｗｅｂｅｒ Ｓ．Ｅ．Ｆｌａｖｉｎｓ ａｎｄ Ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｅｒｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１４）。ＬＳモノマーは、１５０アミノ酸長であり、その側面に隣接するタンデムアルファヘリックスとともにベータシートからなる。ホモペンタマーから直径１５０Åのカプシドを形成する１２個のペンタマーの対称組織化物までのその形態的汎用性を示す、いくつかの異なる四次構造がＬＳについて報告されている。１００超のサブユニットのＬＳケージについてさえ、記載されている（Ｚｈａｎｇ Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００６；３６２：７５３－７７０）。

熱親和性Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａから単離された新規のタンパク質ケージナノ粒子であるエンカプスリンはまた、自己組織化ナノ粒子の表面上に抗原を提示するためのプラットフォームとして使用され得る。エンカプスリンは、それぞれ２０及び２４ｎｍの内径及び外径を有する薄い二十面体Ｔ＝１対称ケージ構造を有する同一の３１ｋＤａのモノマーの６０個のコピーから組織化される（Ｓｕｔｔｅｒ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００８，１５：９３９－９４７）。Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａにおけるエンカプスリンの正確な機能は未だ明確に理解されていないが、その結晶構造が最近解明されており、その機能は、酸化ストレス応答に関与するＤｙＰ（染料脱色ペルオキシダーゼ）及びＦｌｐ（フェリチン様タンパク質）などのタンパク質をカプセル化する細胞コンパートメントとして仮定された（Ｒａｈｍａｎｐｏｕｒ Ｒ．ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｊ．２０１３，２８０：２０９７－２１０４）。

リンカー及び切断可能なペプチド
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、本明細書では融合タンパク質と称される、２つ以上のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、融合タンパク質の少なくとも１つにまたは各ドメインの間に位置するリンカーを更にコードする。リンカーは、例えば、切断可能なリンカーまたはプロテアーゼ感受性リンカーであり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｆ２Ａリンカー、Ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｅ２Ａリンカー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。２Ａペプチドと称される自己切断ペプチドリンカーのこのファミリーは、当該技術分野で記載されている（例えば、Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６：ｅ１８５５６を参照されたい）。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｆ２Ａリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＳリンカーである。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ドメイン－リンカー－ドメイン－リンカー－ドメインの構造を有する、介在するリンカーを有する３つのドメインを含有する。

本開示と関連して、当該技術分野で知られている切断可能なリンカーが使用され得る。そのような例示的なリンカーとしては、Ｆ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｐ２Ａリンカー、Ｅ２Ａリンカーが挙げられる（例えば、ＷＯ２０１７／１２７７５０を参照されたい）。当業者は、他の当該技術分野で認識されているリンカーが、本開示のｍＲＮＡ（例えば、本開示の核酸によってコードされる）での使用に適している場合があることを理解するであろう。当業者は同様に、同じ分子内で１つを超える抗原／ポリペプチドを別々にコードする）他のポリシストロン性ｍＲＮＡが、本明細書に提供される使用に適している場合があることを理解するであろう。

配列最適化
いくつかの実施形態では、本開示の抗原をコードするＯＲＦは、コドン最適化される。コドン最適化方法は、当該技術分野で知られている。例えば、本明細書で提供される配列のうちのいずれか１つ以上のＯＲＦが、コドン最適化され得る。コドン最適化は、いくつかの実施形態では、標的生物及び宿主生物におけるコドン頻度を一致させて、適切な折り畳みを確実にするために；ＧＣ含量をバイアスして、ｍＲＮＡ安定性を増加させるか、または二次構造を低減するために；遺伝子の構築または発現を損なう可能性のあるタンデムリピートコドンまたはベースランを最小化するために；転写及び翻訳制御領域をカスタマイズするために；タンパク質トラフィッキング配列を挿入または除去するために；コードされたタンパク質（例えばグリコシル化部位）中の翻訳後修飾部位を除去／付加するために；タンパク質ドメインの追加、除去またはシャッフルのために；制限サイトを挿入または削除するために；リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位を修飾するために；タンパク質の様々なドメインが適切に折り畳まれることを可能にするように翻訳速度を調節するために；またはポリヌクレオチド内の問題の二次構造を低減もしくは排除するために使用され得る。コドン最適化ツール、アルゴリズム、及びサービスは、当該技術分野で知られており、非限定的な例としては、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ ＣＡ）からのサービス及び／または専有の方法が挙げられる。いくつかの実施形態では、このオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列は、最適化アルゴリズムを用いて最適化される。

いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するまたは野生型の配列ＯＲＦ（例えば、ＥＢＶ抗原をコードする天然に存在するまたは野生型のｍＲＮＡ配列）に対して９５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するかまたは野生型の配列（例えば、ＥＢＶ抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対して９０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するかまたは野生型の配列（例えば、ＥＢＶ抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対して８５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するかまたは野生型の配列（例えば、ＥＢＶ抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対して８０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するかまたは野生型の配列（例えば、ＥＢＶ抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対して７５％未満の配列同一性を共有する。

いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列（例えば、ＥＢＶ抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対して６５％～８５％（例えば、約６７％～約８５％または約６７％～約８０％）の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然または野生型の配列（例えば、ＥＢＶ抗原をコードする天然または野生型のｍＲＮＡ配列）に対して６５％～７５％または約８０％の配列同一性を共有する。

いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、非コドン最適化配列によってコードされるＥＢＶ抗原と免疫原性が同じか、またはそれよりも免疫原性が高い（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、または少なくとも２００％以上高い）抗原をコードする。

修飾ｍＲＮＡは、哺乳類宿主細胞にトランスフェクションされた場合、１２～１８時間、または１８時間超、例えば、２４、３６、４８、６０、７２時間、または７２時間超の安定性を有し、哺乳類宿主細胞による発現が可能である。

いくつかの実施形態では、コドン最適化ｍＲＮＡは、Ｇ／Ｃのレベルが向上されたものであってもよい。核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）のＧ／Ｃ含量は、ｍＲＮＡの安定性に影響を与え得る。グアニン（Ｇ）及び／またはシトシン（Ｃ）残基の量が増加したＲＮＡは、大量のアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含有するｍＲＮＡより機能的に安定していると考えられる。一例として、ＷＯ０２／０９８４４３は、翻訳領域内の配列修飾によって安定化されたｍＲＮＡを含有する薬学的組成物を開示している。遺伝暗号の縮退のため、該修飾は、得られるアミノ酸を変更することなくｍＲＮＡの安定性を更に高めるものに既存のコドンを置換することによって機能する。該手法は、該ｍＲＮＡのコード領域に限定される。

化学修飾されていないヌクレオチド
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、化学修飾されておらず、アデノシン、グアノシン、シトシン、及びウリジンからなる標準的なリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、転写ｍＲＮＡ内に存在するもの（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、または Ｕ）などの標準的なヌクレオシド残基を含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、ＤＮＡ内に存在するもの（例えば、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、または ｄＴ）などの標準的なデオキシリボヌクレオシドを含む。

化学修飾
本開示のワクチンは、いくつかの実施形態では、ＥＢＶ抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを含み、核酸が、標準（非修飾）であり得るか、または当該技術分野で知られているように修飾され得るヌクレオチド及び／またはヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。そのような修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドは、天然に存在する修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドであってもよく、または天然には存在しないヌクレオチド及びヌクレオシドであってもよい。そのような修飾は、当該技術分野で認識されているヌクレオチド及び／またはヌクレオシドの糖、骨格、または核酸塩基部分での修飾が含まれ得る。

いくつかの実施形態では、本開示の天然に存在する修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドは、一般的に知られているか、または当該技術分野で認識されているものである。そのような天然に存在する修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドの非限定的な例は、特に、広く認識されているＭＯＤＯＭＩＣＳデータベースに見出すことができる。

いくつかの実施形態では、本開示の非天然に存在する修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、概して知られているか、または当該技術分野で認識されているものである。そのような非天然に存在する修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドの非限定的な例は、特に、公開されている米国出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５８５１９号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７５１７７号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８８９７号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８８９１号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０４１３号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７７３号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７５９号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７７１号、またはＰＣＴ／ＩＢ２０１７／０５１３６７に見出すことができ、これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる。

したがって、本開示の核酸（例えば、ＤＮＡ核酸及びｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、標準的なヌクレオチド及びヌクレオシド、天然に存在するヌクレオチド及びヌクレオシド、非天然に存在するヌクレオチド及びヌクレオシド、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。

本開示の核酸（例えば、ＤＮＡ核酸及びｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、いくつかの実施形態では、様々な（１つより多くの）異なる種類の標準的な及び／または修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、核酸の特定の領域は、１つ、２つ、またはそれ以上の（任意選択で、異なる）種類の標準的な及び／または修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドを含有する。

いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入された修飾ｍＲＮＡは、標準的なヌクレオチド及びヌクレオシドを含む非修飾核酸と比較して、それぞれ、細胞または生物における分解の低減を呈する。

いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入される修飾ｍＲＮＡは、標準的なヌクレオチド及びヌクレオシドを含む非修飾核酸と比較して、それぞれ細胞または生物における低減された免疫原性（例えば、低減された生得的応答）を呈し得る。

核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、いくつかの実施形態では、核酸の合成または合成後に導入されて、所望の機能または特性を達成する非天然修飾ヌクレオチドを含む。修飾は、ヌクレオチド間結合、プリンもしくはピリミジン塩基、または糖に存在し得る。修飾は、化学合成によって導入されてもよいし、またはポリメラーゼ酵素を用いて鎖の末端もしくは鎖中の任意の場所に導入することもできる。核酸のいずれの領域も化学修飾することができる。

本開示は、核酸の修飾ヌクレオシド及びヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）を提供する。「ヌクレオシド」は、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも称される）と組み合わせた、糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）を含有する化合物またはその誘導体を指す。「ヌクレオチド」とは、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、１つ以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含めるため、任意の有用な方法で、例えば、化学的に、酵素的に、または組換え的に合成され得る。核酸は、ヌクレオシドが連結した領域（複数可）を含み得る。そのような領域は、可変骨格結合を有し得る。この結合は、標準的なホスホジエステル結合であり得、その場合、核酸は、ヌクレオチドの領域を含むことになろう。

修飾ヌクレオチドの塩基対合は、標準的なアデノシン－チミン、アデノシン－ウラシル、またはグアノシン－シトシン塩基対だけでなく、非標準または修飾塩基を含むヌクレオチド及び／または修飾ヌクレオチド間で形成される塩基対も包含し、水素結合供与体と水素結合受容体の配置により、非標準塩基と標準塩基間、または２つの相補的非標準塩基構造間の水素結合が可能になる。そのような非標準塩基対合の一例は、修飾ヌクレオチドイノシンとアデニン、シトシンまたはウラシル間の塩基対合である。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせを本開示のポリヌクレオチドに組み込むことができる。

いくつかの実施形態では、核酸中の修飾核酸塩基（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１ψ）、１－エチル－プソイドウリジン（ｅ１ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、及び／またはプソイドウリジン（ψ）を含む。いくつかの実施形態では、核酸中の修飾核酸塩基（例えば、ｍＲＮＡ核酸などのＲＮＡ核酸）は、５－メトキシメチルウリジン、５－メチルチオウリジン、１－メトキシメチルプソイドウリジン、５－メチルシチジン、及び／または５－メトキシシチジンを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、限定されないが、化学修飾を含む前述の修飾核酸塩基のうちのいずれかのうちの少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置に１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１ψ）置換を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置に１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）置換、及び核酸の１つ以上または全てのシチジン位置に５－メチルシチジン置換を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置にプソイドウリジン（ψ）置換を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置にプソイドウリジン（ψ）置換、及び核酸の１つ以上または全てのシチジン位置に５－メチルシチジン置換を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、核酸の１つ以上または全てのウリジン位置にウリジンを含む。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、特定の修飾について均一に修飾される（例えば、完全に修飾される、配列全体にわたり修飾される）。例えば、核酸は、１－メチル－プソイドウリジンで一様に修飾され得、つまり、当該ｍＲＮＡ配列の全てのウリジン残基が１－メチル－プソイドウリジンで置き換えられる。同様に、核酸は、配列中に存在する任意の種類のヌクレオシド残基を、上記のものなどの修飾残基で置き換えることによって一様に修飾することができる。

本開示の核酸は、分子の全長に沿って部分的にも完全にも修飾することができる。例えば、１つ以上または全てまたは所与の種類のヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ以上もしくは全て）は、本開示の核酸、またはその所定の配列領域（例えば、ポリＡテールを含むか、または除外するｍＲＮＡ）において均一に修飾され得る。いくつかの実施形態では、本開示の核酸（またはその配列領域）中の全てのヌクレオチドＸは、修飾ヌクレオチドであり、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのうちのいずれか１つ、または組み合わせＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋Ｃ、もしくはＡ＋Ｇ＋Ｃのうちのいずれか１つであり得る。

核酸は、約１％～約１００％の修飾ヌクレオチド（全体のヌクレオチド含有量に関して、または１つ以上の種類のヌクレオチド、すなわちＡ、Ｇ、Ｕ、もしくはＣのうちのいずれか１つ以上に関して）あるいは任意の介在するパーセンテージ（例えば、１％～２０％、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）を含有し得る。任意の残りのパーセンテージは、修飾されていないＡ、Ｇ、Ｕ、またはＣの存在によって決まることが理解されよう。

ｍＲＮＡは、１％以上１００％までの修飾ヌクレオチド、または任意の範囲のパーセンテージ（例えば、少なくとも５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも１０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも２５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも５０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％の修飾ヌクレオチド、もしくは少なくとも９０％の修飾ヌクレオチド）を含有し得る。例えば、核酸は、修飾ウラシルまたはシトシンなどの修飾ピリミジンを含有し得る。いくつかの実施形態では、核酸中のウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾ウラシル（例えば、５置換ウラシル）で置き換えられる。修飾ウラシルは、単一の独自の構造を有する化合物によって置き換えられ得るか、または異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の独自の構造）を有する複数の化合物によって置き換えられ得る。いくつかの実施形態では、核酸中のシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾シトシン（例えば、５置換シトシン）で置き換えられる。修飾シトシンは、単一の独自の構造を有する化合物によって置き換えられ得るか、または異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の独自の構造）を有する複数の化合物によって置き換えられ得る。

非翻訳領域（ＵＴＲ）
本開示のｍＲＮＡは、非翻訳領域として作用または機能する１つ以上の領域または部分を含み得る。ｍＲＮＡが、少なくとも１つの目的の抗原をコードするように設計される場合、核酸は、これらの非翻訳領域（ＵＴＲ）のうちの１つ以上を含み得る。核酸の野生型非翻訳領域は、転写されるが翻訳はされない。ｍＲＮＡにおいて、５’ＵＴＲは、転写開始部位で開始し、開始コドンまで続くが、開始コドンを含まない一方で、３’ＵＴＲは、終止コドンのすぐ後に始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子の安定性及び翻訳の観点から、ＵＴＲによって果たされる調節的役割に関する証拠が増えている。ＵＴＲの調節特徴は、特に分子の安定性を向上させるために、本開示のポリヌクレオチドに組み込むことができる。また、転写産物が望ましくない臓器部位に誤って向けられた場合に備え、転写産物の下方調節の制御を確保するための特定の特徴も組み込むことができる。様々な５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ配列が当該技術分野において知られており、利用可能である。

５’ＵＴＲとは、開始コドン（リボソームによって翻訳されるｍＲＮＡ転写産物の最初のコドン）からすぐ上流（５’）にあるｍＲＮＡの領域である。５’ＵＴＲはタンパク質をコードしない（非コードである）。天然５’ＵＴＲは、翻訳開始で役割を果たす機能を有する。これらは、Ｋｏｚａｋ配列のようなシグネチャーを保有し、この配列は、多くの遺伝子の翻訳をリボソームが開始するプロセスに関与することが一般的に知られている。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号３２）を有し、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流にあるプリン（アデニンまたはグアニン）であり、それに別の「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲも、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することが知られている。

本開示のいくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、異種ＵＴＲであり、すなわち、異なるＯＲＦに関連付けられる天然に見出されるＵＴＲである。別の実施形態では、５’ＵＴＲは合成ＵＴＲであり、すなわち、天然には存在しない。合成ＵＴＲとしては、例えば、遺伝子発現を増加させる、その特性を改善するために変異させたＵＴＲ、ならびに完全に合成されたものが挙げられる。例示的な５’ＵＴＲとしては、Ｘｅｎｏｐｕｓまたはヒト由来のａ－グロビンまたはｂ－グロビン（８２７８０６３、９０１２２１９）、ヒトシトクロムｂ－２４５ａポリペプチド、及びヒドロキシステロイド（１７ｂ）デヒドロゲナーゼ、及びタバコエッチウイルス（ＵＳ８２７８０６３、９０１２２１９）が挙げられる。ＣＭＶ即時早期１（ＩＥ１）遺伝子（ＵＳ２０１４／０２０６７５３、ＷＯ２０１３／１８５０６９）、配列ＧＧＧＡＵＣＣＵＡＣＣ（配列番号３３）（ＷＯ２０１４／１４４１９６）も使用され得る。別の実施形態では、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲは、５’ＴＯＰモチーフ（オリゴピリミジントラクト）が欠如したＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲであり（例えば、ＷＯ／２０１５／１０１４１４、ＷＯ／２０１５／１０１４１５、ＷＯ／２０１５／０６２７３８、ＷＯ２０１５／０２４６６７、ＷＯ２０１５／０２４６６７；リボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子に由来する５’ＵＴＲエレメント（ＷＯ／２０１５／１０１４１４、ＷＯ２０１５／１０１４１５、ＷＯ／２０１５／０６２７３８）、ヒドロキシステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメント（ＷＯ２０１５／０２４６６７）、またはＡＴＰ５Ａ１の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメント（ＷＯ２０１５／０２４６６７）が使用され得る。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲの代わりに内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用する。

いくつかの実施形態では、本開示の５’ＵＴＲは、配列番号１及び配列番号２４から選択される配列を含む。

３’ＵＴＲは、終止コドン（翻訳終了をシグナル伝達するｍＲＮＡ転写産物のコドン）のすぐ下流（３’）にあるｍＲＮＡの領域である。３’ＵＴＲはタンパク質をコードしない（非コードである）。天然または野生型の３′ＵＴＲは、一連のアデノシン及びウリジンが埋め込まれていることが知られている。これらのＡＵリッチシグネチャーは、高い回転率を有する遺伝子内で特に広く見られる。それらの配列特徴及び機能特性に基づいて、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）を３つのクラスに分離することができる（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，１９９５）：クラスＩ ＡＲＥは、Ｕリッチ地域内のＡＵＵＵＡモチーフのいくつかの分散コピーを含有する。Ｃ－Ｍｙｃ及びＭｙｏＤは、クラスＩ ＡＲＥを含有する。クラスＩＩ ＡＲＥは２つ以上の重複するＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）（配列番号３４）九量体を有する。この種類のＡＲＥを含有する分子としては、ＧＭ－ＣＳＦ及びＴＮＦ－ａが挙げられる。クラスＩＩＩ ＡＲＥＳは、あまりよく定義されていない。これらのＵリッチ領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含有しない。ｃ－Ｊｕｎ及びＭｙｏｇｅｎｉｎは、このクラスの中でも十分に研究された２つの例である。ＡＲＥに結合するほとんどのタンパク質はメッセンジャーを不安定化することが知られているが、ＥＬＡＶファミリーのメンバー、特にＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を高めることが報告されている。ＨｕＲは、３つ全てのクラスのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を核酸分子の３′ＵＴＲに操作することは、ＨｕＲ結合をもたらし、故に、インビボでのメッセージの安定化をもたらす。

３’ＵＴＲ ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去、または修飾を使用して、本開示の核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の安定性を調節してもよい。特定の核酸を操作する場合、ＡＲＥの１つまたは複数のコピーを導入して、本開示の核酸の安定性を低下させ、それによって翻訳を抑制し、得られるタンパク質の産生を減少させることができる。同様に、ＡＲＥを同定し、除去または変異させて、細胞内安定性を増加させ、故に、結果として生じるタンパク質の翻訳及び産生を増加させることができる。トランスフェクション実験は、本開示の核酸を使用して、関連細胞株において行うことができ、タンパク質産生は、トランスフェクション後の様々な時点でアッセイすることができる。例えば、細胞に様々なＡＲＥエンジニアリング分子をトランスフェクトし、ＥＬＩＳＡキットを使用して関連タンパク質にトランスフェクトし、トランスフェクションの６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、３日後、４日後、５日後、６日後、及び／または７日後に産生されたタンパク質をアッセイしてもよい。

３’ＵＴＲは、異種であっても合成であってもよい。３’ＵＴＲに関して、Ｘｅｎｏｐｕｓβ－グロビンＵＴＲ及びヒトβ－グロビンＵＴＲを含むグロビンＵＴＲは、当該技術分野で知られている（８２７８０６３、９０１２２１９、ＵＳ２０１１００８６９０７）。２つの連続ヒトβ－グロビン３’ＵＴＲをヘッドからテールへクローニングすることによって、いくつかの細胞型において向上した安定性を有する修飾β－グロビンをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）が開発され、当該技術分野でよく知られている（ＵＳ２０１２／０１９５９３６、ＷＯ２０１４／０７１９６３）。加えて、ａ２－グロビン、ａ１－グロビン、ＵＴＲ、及びそれらの変異体も、当該技術分野で知られている（ＷＯ２０１５１０１４１５、ＷＯ２０１５０２４６６７）。非特許文献中のｍＲＮＡに記載されている他の３’ＵＴＲとしては、ＣＹＢＡ（Ｆｅｒｉｚｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）及びアルブミン（Ｔｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）が挙げられる。他の例示的な３’ＵＴＲとしては、ウシまたはヒト成長ホルモン（野生型または修飾）（ＷＯ２０１３／１８５０６９、ＵＳ２０１４０２０６７５３、ＷＯ２０１４１５２７７４）、ウサギβグロビン及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、α－グロビン３’ＵＴＲ、及びウイルスＶＥＥＶ ３’ＵＴＲ配列のものが挙げられ、また、当該技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、配列ＵＵＵＧＡＡＵＵ（ＷＯ２０１４１４４１９６）が使用される。いくつかの実施形態では、ヒト及びマウスリボソームタンパク質の３’ＵＴＲが使用される。他の例としては、ｒｐｓ９ ３’ＵＴＲ（ＷＯ２０１５１０１４１４）、ＦＩＧ４（ＷＯ２０１５１０１４１５）、及びヒトアルブミン７（ＷＯ２０１５１０１４１５）が挙げられる。

いくつかの実施形態では、本開示の３’ＵＴＲは、配列番号３及び配列番号２５から選択される配列を含む。

当業者であれば、異種または合成の５’ＵＴＲが、任意の所望の３’ＵＴＲ配列とともに使用され得ることを理解するであろう。例えば、異種５’ＵＴＲを、異種３’ＵＴＲを含む合成３’ＵＴＲとともに使用することができる。

非ＵＴＲ配列はまた、核酸内の領域またはサブ領域として使用され得る。例えば、イントロン配列またはイントロン配列の部分は、本開示の核酸の領域に組み込まれ得る。イントロン配列の組み込みは、タンパク質産生ならびに核酸レベルを増加させ得る。

特徴の組み合わせをフランキング領域に含めることも、他の特徴の中に含有することもできる。例えば、ＯＲＦは、強力なコザック翻訳開始シグナルを含有し得る５´ＵＴＲ及び／またはポリＡテールのテンプレート化付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る３´ＵＴＲによって隣接され得る。５’ＵＴＲは、米国特許出願公開第２０１０／２９３６２５号及びその全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９１５５に記載の５ＵＴＲなどの、同じ及び／または異なる遺伝子からの第１のポリヌクレオチド断片及び第２のポリヌクレオチド断片を含み得る。

任意の遺伝子からの任意のＵＴＲが、核酸の領域に組み込まれ得ることが理解されるべきである。更に、任意の既知の遺伝子の複数の野生型ＵＴＲを利用してもよい。野生型領域のバリアントではない人工ＵＴＲを提供することも、本開示の範囲内である。これらのＵＴＲまたはその一部分は、それらが選択された転写物と同じ向きに配置されてもよいし、または向きもしくは位置が改変されてもよい。したがって、５’または３’ＵＴＲは、１つ以上の他の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲで逆転、短縮、延長、作製されてもよい。本明細書で使用される場合、「改変された」という用語は、ＵＴＲ配列に関するものであり、ＵＴＲが参照配列に関して何らかの形で変化したことを意味する。例えば、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲは、上に教示されるように、配向もしくは位置の変化によって野生型もしくは天然ＵＴＲと比較して、改変され得るか、または追加のヌクレオチドの包含、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドのスワッピングもしくは転位によって改変されてもよい。「改変された」ＵＴＲ（３’または５’のいずれか）を産生する任意のこれらの変化はバリアントＵＴＲを含む。

いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲなどの二重、三重、または四重のＵＴＲが使用され得る。本明細書で使用する「二重」ＵＴＲとは、同じＵＴＲの２つのコピーが直列または実質的に直列にコード化されているものである。例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１０／０１２９８７７号に記載の二重ベータ－グロビン３′ＵＴＲが使用され得る。

パターン化されたＵＴＲを有することも本開示の範囲内である。本明細書で使用される「パターン化ＵＴＲ」とは、ＡＢＡＢＡＢもしくはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢもしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣまたはそのバリアントが１回、２回、または３回以上反復されるような反復パターンまたは交互パターンを反映するＵＴＲである。これらのパターンでは、各文字Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルで異なるＵＴＲを表す。

いくつかの実施形態では、隣接領域は、そのタンパク質が共通の機能、構造、特徴、または特性を共有する、転写物のファミリーから選択される。例えば、目的のポリペプチドは、特定の細胞、組織または発達中のある時期に発現されるタンパク質のファミリーに属する場合がある。これらの遺伝子のいずれかに由来するＵＴＲは、同じかまたは異なるファミリーのタンパク質の任意の他のＵＴＲとスワッピングして、新しいポリヌクレオチドを作製してもよい。本明細書で使用される場合、「タンパク質のファミリー」とは、最も広い意味において使用され、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在、起点または発現パターンを共有する２つ以上の目的のポリペプチドの群を指す。

非翻訳領域は、翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）も含んでもよい。非限定的な例として、ＴＥＥとしては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００９０２２６４７０号に記載されているＴＥＥ、及び当該技術分野で知られているＴＥＥを含み得る。

ｍＲＮＡのインビトロ転写
本明細書に記載のポリヌクレオチドをコードするｃＤＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）システムを使用して転写され得る。ｍＲＮＡのインビトロ転写は、当該技術分野で知られており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ／２０１４／１５２０２７号に記載されている。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ転写産物は、ｍＲＮＡ転写産物を生成するためのインビトロ転写反応で、増幅されていない直鎖化されたＤＮＡテンプレートを使用して生成される。いくつかの実施形態では、テンプレートＤＮＡは、単離されたＤＮＡである。いくつかの実施形態では、テンプレートＤＮＡはｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡ、例えば、限定されるものではないが、ＥＢＶ ｍＲＮＡの逆転写によって形成される。いくつかの実施形態では、細胞、例えば、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、例えば、ＤＨ－１細胞に、プラスミドＤＮＡテンプレートを用いてトランスフェクションする。いくつかの実施形態では、トランスフェクトされた細胞は、プラスミドＤＮＡを複製するために培養され、次いで単離及び精製される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、ＲＮＡポリメラーゼプロモータ、例えば、目的の遺伝子の５’側に位置し、目的の遺伝子に作用可能に連結されているＴ７プロモータを含む。

いくつかの実施形態では、インビトロ転写テンプレートは、５′非翻訳（ＵＴＲ）領域をコードし、オープンリーディングフレームを含有し、３′ＵＴＲ及びポリＡテールをコードする。特定の核酸配列及びインビトロ転写テンプレートの長さは、テンプレートによってコードされるｍＲＮＡに依存する。

「５’非翻訳領域」（ＵＴＲ）は、ポリペプチドをコードしていない開始コドン（すなわち、リボソームによって翻訳されたｍＲＮＡ転写物の最初のコドン）から直接上流（すなわち、５’側）にあるｍＲＮＡの領域を指す。ｍＲＮＡ転写産物が生成されている場合、５’ＵＴＲはプロモータ配列を含み得る。そのようなプロモータ配列が、当該技術分野で知られている。本開示のワクチンには、そのようなプロモータ配列が存在しないことが理解されるべきである。

「３’非翻訳領域」（ＵＴＲ）は、ポリペプチドをコードしていない終止コドン（すなわち、翻訳終結をシグナル伝達するｍＲＮＡ転写物のコドン）から直接下流（すなわち、３’側）にあるｍＲＮＡの領域を指す。

「オープンリーディングフレーム」は、開始コドン（例えば、メチオニン（ＡＴＧ））で始まり、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）で終わるＤＮＡの連続ストレッチであり、ポリペプチドをコードする。

「ポリ（Ａ）テール」は、複数の連続したアデノシン一リン酸を含有する３’ＵＴＲの下流、例えば、すぐ下流（すなわち、３’）にある、ｍＲＮＡの領域である。ポリ（Ａ）テールは、１０～３００個のアデノシン一リン酸を含有し得る。例えば、ポリ（Ａ）テールは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または３００個のアデノシン一リン酸を含有し得る。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）テールは、５０～２５０個のアデノシン一リン酸を含有する。関連する生物学的環境（例えば、細胞内、インビボ）において、ポリ（Ａ）テールは、例えば、細胞質での酵素分解からｍＲＮＡを保護するように機能し、転写終結、及び／または核からのｍＲＮＡの輸送及び翻訳で補助する。

いくつかの実施形態では、核酸は、２００～３，０００ヌクレオチドを含む。例えば、核酸は、２００～５００、２００～１０００、２００～１５００、２００～３０００、５００～１０００、５００～１５００、５００～２０００、５００～３０００、１０００～１５００、１０００～２０００、１０００～３０００、１５００～３０００、または２０００～３０００ヌクレオチドを含み得る。

インビトロの転写系は、典型的には、転写緩衝液、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、ＲＮａｓｅ阻害剤、及びポリメラーゼを含む。

ＮＴＰは、社内で製造してもよいか、供給業者から選択してもよいか、または本明細書に記載されるように合成してもよい。ＮＴＰは、限定されないが、天然及び非天然（修飾）ＮＴＰを含む本明細書に記載のものから選択され得る。

任意の数のＲＮＡポリメラーゼまたはバリアントが、本開示の方法で使用され得る。ポリメラーゼは、限定されないが、ファージＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ならびに／または限定されないが、化学修飾核酸及び／またはヌクレオチドを含む、修飾核酸及び／または修飾ヌクレオチドを組み込むことが可能なポリメラーゼなどの変異体ポリメラーゼから選択され得る。いくつかの実施形態は、ＤＮａｓｅの使用を排除する。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ転写産物は、酵素キャッピングを介してキャッピングされる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’末端キャップ、例えば、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐを含む。

化学合成
固相化学合成。本開示の核酸は、固相技術を使用して全体的または部分的に製造してもよい。核酸の固相化学合成は、分子を固体支持体上に固定し、反応溶液中で段階的に合成する自動化された方法である。固相合成は、核酸配列への化学修飾の部位特異的導入に役立つ。

液相化学合成。モノマービルディングブロックの連続付加による本開示の核酸の合成は、液相で実行され得る。

合成方法の組み合わせ。上記で考察した合成方法には、各々独自の利点及び制限がある。その制限を克服するために、これらの方法を組み合わせる試みが行われている。そのような方法の組み合わせは、本開示の範囲内である。酵素ライゲーションと組み合わせた、固相または液相化学合成の使用は、化学合成単独では得ることができない長鎖核酸を生成する効率的な方式が提供される。

核酸領域または部分領域のライゲーション
リガーゼによる核酸の組み立ても使用され得る。ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼは、ホスホジエステル結合の形成を介して、ポリヌクレオチド鎖の５’末端と３’末端の分子間ライゲーションを促進する。キメラポリヌクレオチド及び／または環状核酸などの核酸は、１つ以上の領域または部分領域のライゲーションによって調製され得る。ＤＮＡフラグメントをリガーゼ触媒反応によって結合させて、異なる機能を有する組換えＤＮＡを生成することができる。２つのオリゴデオキシヌクレオチド（５’ホスホリル基を含むもの及び遊離３’ヒドロキシル基を含むもの）がＤＮＡリガーゼの基質として機能する。

精製
本明細書に記載の核酸の精製には、核酸のクリーンアップ、品質保証及び品質管理が含まれ得るが、これらに限定されない。クリーンアップは、限定されるものではないが、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ポリＴビーズ、ＬＮＡ（商標）オリゴＴキャプチャープローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、またはＨＰＬＣベースの精製方法、限定されるものではないが、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）などの当該技術分野で知られている方法によって実施することができる。「精製された」という用語は、「精製された核酸」などの核酸に関して使用される場合、少なくとも１つの夾雑物から分離されたものを指す。「夾雑物」とは、別の不適切なもの、不純なもの、または粗悪なものに変えてしまう任意の物質である。したがって、精製された核酸（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、それが天然に見出されるものとは異なる形態もしくは設定で、またはそれに処理もしくは精製方法を施す前に存在していたものとは異なる形態もしくは設定で存在する。

品質保証及び／または品質管理のチェックは、限定されるものではないが、ゲル電気泳動、ＵＶ吸光度、または分析的ＨＰＬＣなどの方法を使用して行うことができる。

いくつかの実施形態では、核酸は、限定されるものではないが、逆転写酵素ＰＣＲを含む方法によって配列決定され得る。

定量化
いくつかの実施形態では、本開示の核酸は、エクソソームにおいて、または１つ以上の体液に由来する場合に定量化され得る。体液には、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑膜液、痰性体液、羊膜液、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液または尿道球腺液、汗、糞便、髪、涙、嚢胞液、胸膜及び腹水、心膜液、リンパ液、粥状液、乳び、胆汁、間質液、月経、膿汁、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、便水、膵液、副鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤葉腔液、及び臍帯血が挙げられる。あるいは、エクソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、及び胎盤からなる群から選択される器官から取得され得る。

アッセイは、抗原特異的プローブ、サイトメトリー、ｑＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析、またはこれらの組み合わせを使用して実施することができ、エクソソームは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの免疫組織化学を使用して単離することができる。エクソソームはまた、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸着捕捉、アフィニティー精製、マイクロ流体分離、またはこれらの組み合わせによって単離することができる。

これらの方法により、研究者は、核酸の残留レベルまたは送達レベルをリアルタイムでモニターすることができる。これは、本開示の核酸が、いくつかの実施形態では、構造的または化学的修飾により内因性形態とは異なることから可能である。

いくつかの実施形態では、核酸は、限定されるものではないが、紫外線可視分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ）などの方法を使用して定量化され得る。ＵＶ／Ｖｉｓ分光計の非限定的な例は、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）である。定量化された核酸は、核酸が適切なサイズであるかどうか決定し、核酸の分解が生じていないか確認するために分析され得る。核酸の分解は、限定されるものではないが、アガロースゲル電気泳動、ＨＰＬＣベースの精製方法、例えば、限定されるものではないが、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣＭＳ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）及びキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）などの方法によって確認され得る。

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に製剤化される。脂質ナノ粒子は、典型的には、イオン化可能なアミノ脂質、非カチオン性脂質、ステロール、及びＰＥＧ脂質構成要素を、目的の核酸カーゴとともに含む。本開示の脂質ナノ粒子は、当該技術分野で一般的に知られているような構成要素、組成物、及び方法（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６８３００；ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３７５５１；ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７４００；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４７４０６；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０００１２９；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０；ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３８４２６；ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７０７７；ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５５３９４；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２１１７；ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０；ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７４９２；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５９５７５及びＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９４９１（これらは全てその全体が参照により本明細書に援用される）を参照）を使用して生成し得る。

本開示のワクチンは、典型的には、脂質ナノ粒子内で製剤化される。ワクチンは、例えば、マイクロ流体、及び２つの流体流（これらのうちの一方がｍＲＮＡを含有し、もう一方が脂質構成要素を有する）のＴ字合流混合などの混合プロセスを使用して作製することができる。いくつかの実施形態では、ワクチンは、イオン化可能なアミノ脂質、リン脂質（ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣなどの）、ＰＥＧ脂質（１，２－ジミリストイル－ＯＴ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール、ＰＥＧ－ＤＭＧとしても知られている）、及び構造脂質（コレステロールなどの）をアルコール（例えば、エタノール）中で組み合わせることによって調製される。脂質を組み合わせて、所望のモル比を得、例えば、約５．５ｍＭ～約２５ｍＭの最終脂質濃度まで水及びアルコール（例えば、エタノール）で希釈してもよい。

ｍＲＮＡ及び脂質構成要素を含むワクチンは、例えば、脂質溶液を、約５：１～約５０：１の脂質成分対ｍＲＮＡの重量：重量比でｍＲＮＡ溶液と組み合わせることによって調製され得る。脂質溶液は、マイクロ流体ベースのシステム（例えば、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ）を使用して、例えば、約１０ｍｌ／分～約１８ｍｌ／分の流速で、ｍＲＮＡ溶液中に急速に注入して、懸濁液を産生してもよい（例えば、約１：１～約４：１の水対アルコール比で）。

ワクチンを透析によって処理して、アルコール（例えば、エタノール）を除去し、緩衝液交換を達成することができる。製剤は、例えば、１０ｋＤの分画分子量を有する（例えば、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒカセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して）一次産物の体積よりも大きい体積で、例えば、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析してもよい。前述の例示的な方法は、ナノ沈殿及び粒子形成を誘導する。限定されるものではないが、Ｔ字合流及び直接注入を含む代替的プロセスを使用して、同じナノ沈殿を達成してもよい。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのイオン化可能なアミノ（カチオン性）脂質、少なくとも１つの非カチオン性脂質、少なくとも１つのステロール、及び／または少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を含む。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、２０～５０ｍｏｌ％、２０～４０ｍｏｌ％、２０～３０ｍｏｌ％、３０～６０ｍｏｌ％、３０～５０ｍｏｌ％、３０～４０ｍｏｌ％、４０～６０ｍｏｌ％、４０～５０ｍｏｌ％、または５０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、５０、または６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５～２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、５～２０ｍｏｌ％、５～１５ｍｏｌ％、５～１０ｍｏｌ％、１０～２５ｍｏｌ％、１０～２０ｍｏｌ％、１０～２５ｍｏｌ％、１５～２５ｍｏｌ％、１５～２０ｍｏｌ％、または２０～２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、１５ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％、または２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質を含む。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２５～５５ｍｏｌ％のステロールを含む。例えば、脂質ナノ粒子は、２５～５０ｍｏｌ％、２５～４５ｍｏｌ％、２５～４０ｍｏｌ％、２５～３５ｍｏｌ％、２５～３０ｍｏｌ％、３０～５５ｍｏｌ％、３０～５０ｍｏｌ％、３０～４５ｍｏｌ％、３０～４０ｍｏｌ％、３０～３５ｍｏｌ％、３５～５５ｍｏｌ％、３５～５０ｍｏｌ％、３５～４５ｍｏｌ％、３５～４０ｍｏｌ％、４０～５５ｍｏｌ％、４０～５０ｍｏｌ％、４０～４５ｍｏｌ％、４５～５５ｍｏｌ％、４５～５０ｍｏｌ％、または５０～５５ｍｏｌ％のステロールを含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２５ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、または５５ｍｏｌ％のステロールを含む。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．５～１５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、０．５～１０ｍｏｌ％、０．５～５ｍｏｌ％、１～１５ｍｏｌ％、１～１０ｍｏｌ％、１～５ｍｏｌ％、２～１５ｍｏｌ％、２～１０ｍｏｌ％、２～５ｍｏｌ％、５～１５ｍｏｌ％、５～１０ｍｏｌ％、または１０～１５ｍｏｌ％を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．５ｍｏｌ％、１ｍｏｌ％、２ｍｏｌ％、３ｍｏｌ％、４ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、１１ｍｏｌ％、１２ｍｏｌ％、１３ｍｏｌ％、１４ｍｏｌ％、または１５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０～６０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、５～２５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質、２５～５５ｍｏｌ％のステロール、及び約０．５～１５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能なアミノ脂質は、式（Ｉ）の化合物：
、
またはその塩もしくは異性体を含み、式中：
Ｒ_１が、_{Ｃ５－３０}アルキル、Ｃ_５－２０アルケニル、－Ｒ^＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び
－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ_２及びＲ_３が独立して、Ｈ、Ｃ_１－１４アルキル、Ｃ_２－１４アルケニル、－Ｒ^＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ^＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ_２及びＲ_３が、それらが付着している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ_４が、Ｃ_３－６炭素環、－（ＣＨ_２）_ｎＱ、－（ＣＨ_２）_ｎＣＨＱＲ、
－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）_２、及び非置換Ｃ_１－６アルキル（ここで、Ｑが、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮ（Ｒ）_２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ_３、－ＣＸ_２Ｈ、－ＣＸＨ_２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）_２から選択される）、
－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ_８、
－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、
－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、
－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）_２Ｃ（Ｏ）ＯＲからなる群から選択され、各ｎが独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ_５が独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ_６が独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’が独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、
－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ_７が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ_８が、Ｃ_３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ_９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ_２、Ｃ_１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、
－Ｓ（Ｏ）_２Ｎ（Ｒ）_２、Ｃ_２－６アルケニル、Ｃ_３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒが独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’が独立して、Ｃ_１－１８アルキル、Ｃ_２－１８アルケニル、
－Ｒ^＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”が独立して、Ｃ_３－１４アルキル及びＣ_３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊が独立して、Ｃ_１－１２アルキル及びＣ_２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙが独立して、Ｃ_３－６炭素環であり、
各Ｘが独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、Ｒ_４が－（ＣＨ_２）_ｎＱ、－（ＣＨ_２）_ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）_２である場合、（ｉ）ｎが１、２、３、４、もしくは５である場合、Ｑが－Ｎ（Ｒ）_２ではないか、または（ｉｉ）ｎが１もしくは２である場合、Ｑが５、６、もしくは７員のヘテロシクロアルキルではないものが含まれる。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ_１が、Ｃ_５－３０アルキル、Ｃ_５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び
－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ_２及びＲ_３が独立して、Ｈ、Ｃ_１－１４アルキル、Ｃ_２－１４アルケニル、－Ｒ^＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ^＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ_２及びＲ_３が、それらが付着している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ_４が、Ｃ_３－６炭素環、－（ＣＨ_２）_ｎＱ、－（ＣＨ_２）_ｎＣＨＱＲ、
－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）_２、及び非置換Ｃ_１－６アルキル（ここで、Ｑが、Ｃ_３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロアリール、－ＯＲから選択される）、
－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮ（Ｒ）_２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ_３、－ＣＸ_２Ｈ、－ＣＸＨ_２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、
－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－ＣＲＮ（Ｒ）_２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ_８、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＲ、
－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、
－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、
－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、ならびにオキソ（＝ＯＨ）、アミノ、モノ－またはジ－アルキルアミノ、及びＣ１－３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換されるＮ、Ｏ、Ｓから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロシクロアルキルからなる群から選択され、各ｎが独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ_５が独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ_６が独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’が独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、
－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ_７が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ_８が、Ｃ_３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ_９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ_２、Ｃ_１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、
－Ｓ（Ｏ）_２Ｎ（Ｒ）_２、Ｃ_２－６アルケニル、Ｃ_３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒが独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’が独立して、Ｃ_１－１８アルキル、Ｃ_２－１８アルケニル、
－Ｒ^＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”が独立して、Ｃ_３－１４アルキル及びＣ_３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ^＊が独立して、Ｃ_１－１２アルキル及びＣ_２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙが独立して、Ｃ_３－６炭素環であり、
各Ｘが独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるもの、
またはその塩もしくは異性体が含まれる。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ_１が、Ｃ_５－３０アルキル、Ｃ_５－２０アルケニル、－Ｒ^＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び
－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ_２及びＲ_３が独立して、Ｈ、Ｃ_１－１４アルキル、Ｃ_２－１４アルケニル、－Ｒ^＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ_２及びＲ_３が、それらが付着している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ_４が、Ｃ_３－６炭素環、－（ＣＨ_２）_ｎＱ、－（ＣＨ_２）_ｎＣＨＱＲ、
－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）_２、及び非置換Ｃ_１－６アルキル（ここで、Ｑが、Ｃ_３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員の複素環、－ＯＲから選択される）、
－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮ（Ｒ）_２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ_３、－ＣＸ_２Ｈ、－ＣＸＨ_２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、
－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－ＣＲＮ（Ｒ）_２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ_８、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＲ、
－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、
－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２からなる群から選択され、各ｎが独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、Ｑが５～１４員の複素環である場合、（ｉ）Ｒ_４が、ｎが１または２である－（ＣＨ_２）_ｎＱであるか、または（ｉｉ）Ｒ_４が、ｎが１である－（ＣＨ_２）_ｎＣＨＱＲであるか、または（ｉｉｉ）Ｒ_４が、－ＣＨＱＲ及び－ＣＱ（Ｒ）_２であり、Ｑが、５～１４員のヘテロアリールまたは８～１４員のヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
各Ｒ_５が独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ_６が独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’が独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、
－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_２－、－Ｓ－Ｓ－－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ_７が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ_８が、Ｃ_３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ_９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ_２、Ｃ_１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、
－Ｓ（Ｏ）_２Ｎ（Ｒ）_２、Ｃ_２－６アルケニル、Ｃ_３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒが独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’が独立して、Ｃ_１－１８アルキル、Ｃ_２－１８アルケニル、
－Ｒ^＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”が独立して、Ｃ_３－１４アルキル及びＣ_３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ^＊が独立して、Ｃ_１－１２アルキル及びＣ_２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙが独立して、Ｃ_３－６炭素環であり、
各Ｘが独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるもの、
またはその塩もしくは異性体が含まれる。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ_１が、Ｃ_５－３０アルキル、Ｃ_５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び
－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ_２及びＲ_３が独立して、Ｈ、Ｃ_１－１４アルキル、Ｃ_２－１４アルケニル、－Ｒ^＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ^＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ_２及びＲ_３が、それらが付着している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ_４が、Ｃ_３－６炭素環、－（ＣＨ_２）_ｎＱ、－（ＣＨ_２）_ｎＣＨＱＲ、
－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）_２、及び非置換Ｃ_１－６アルキル（ここで、Ｑが、Ｃ_３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロアリール、－ＯＲから選択される）、
－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮ（Ｒ）_２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ_３、－ＣＸ_２Ｈ、－ＣＸＨ_２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、
－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－ＣＲＮ（Ｒ）_２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ_８、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＲ、
－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、
－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、
－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２からなる群から選択され、各ｎが独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ_５が独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ_６が独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’が独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、
－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_２－、－Ｓ－Ｓ－－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ_７が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ_８が、Ｃ_３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ_９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ_２、Ｃ_１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、
－Ｓ（Ｏ）_２Ｎ（Ｒ）_２、Ｃ_２－６アルケニル、Ｃ_３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒが独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’が独立して、Ｃ_１－１８アルキル、Ｃ_２－１８アルケニル、
－Ｒ^＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”が独立して、Ｃ_３－１４アルキル及びＣ_３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊が独立して、Ｃ_１－１２アルキル及びＣ_２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙが独立して、Ｃ_３－６炭素環であり、
各Ｘが独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるもの、
またはその塩もしくは異性体が含まれる。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ_１が、Ｃ_５－３０アルキル、Ｃ_５－２０アルケニル、－Ｒ^＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び
－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ_２及びＲ_３が独立して、Ｈ、Ｃ_２－１４アルキル、Ｃ_２－１４アルケニル、－Ｒ^＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ^＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ_２及びＲ_３が、それらが付着している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ_４が、－（ＣＨ_２）_ｎＱまたは－（ＣＨ_２）_ｎＣＨＱＲであり、ここで、Ｑが、－Ｎ（Ｒ）_２であり、ｎが、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ_５が独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ_６が独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’が独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、
－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_２－、－Ｓ－Ｓ－－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ_７が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒが独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’が独立して、Ｃ_１－１８アルキル、Ｃ_２－１８アルケニル、
－Ｒ^＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”が独立して、Ｃ_３－１４アルキル及びＣ_３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ^＊が独立して、Ｃ_１－１２アルキル及びＣ_１－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙが独立して、Ｃ_３－６炭素環であり、
各Ｘが独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるもの、
またはその塩もしくは異性体が含まれる。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ_１が、Ｃ_５－３０アルキル、Ｃ_５－２０アルケニル、－Ｒ^＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び
－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ_２及びＲ_３が独立して、Ｃ_１－１４アルキル、Ｃ_２－１４アルケニル、－Ｒ^＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ^＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ_２及びＲ_３が、それらが付着している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ_４が、－（ＣＨ_２）_ｎＱ、－（ＣＨ_２）_ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、及び
－ＣＱ（Ｒ）_２からなる群から選択され、ここで、Ｑが、－Ｎ（Ｒ）_２であり、ｎが、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ_５が独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ_６が独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’が独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、
－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_２－、－Ｓ－Ｓ－－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ_７が、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒが独立して、Ｃ_１－３アルキル、Ｃ_２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’が独立して、Ｃ_１－１８アルキル、Ｃ_２－１８アルケニル、
－Ｒ^＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”が独立して、Ｃ_３－１４アルキル及びＣ_３－１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ^＊が独立して、Ｃ_１－１２アルキル及びＣ_１－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙが独立して、Ｃ_３－６炭素環であり、
各Ｘが独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるもの、
またはその塩もしくは異性体が含まれる。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＡ）のもの：
、
またはその塩もしくは異性体が含まれ、式中、ｌが、１、２、３、４、及び５から選択され、ｍが、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｍ_１が、結合またはＭ’であり、Ｒ_４が、非置換Ｃ_１－３アルキルまたは－（ＣＨ_２）_ｎＱであり、ここで、Ｑが、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ_８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、
－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’が独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、Ｒ_２及びＲ_３が独立して、Ｈ、Ｃ_１－１４アルキル、及びＣ_２－１４アルケニルからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＩ）のもの：
、またはその塩もしくは異性体が含まれ、式中、ｌが、１、２、３、４、及び５から選択され、Ｍ_１が、結合またはＭ’であり、Ｒ_４が、非置換Ｃ_１－３アルキルまたは－（ＣＨ_２）_ｎＱであり、ここで、ｎが、２、３、または４であり、Ｑが、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、
－Ｎ（Ｒ）Ｒ_８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ_９）Ｎ（Ｒ）_２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’が独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、
－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、Ｒ_２及びＲ_３が独立して、Ｈ、Ｃ_１－１４アルキル、及びＣ_２－１４アルケニルからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、もしくは（ＩＩｅ）のもの：
、またはその塩もしくは異性体が含まれ、式中、Ｒ_４が、本明細書に記載される通りである。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＩｄ）のもの：
、またはその塩もしくは異性体が含まれ、式中、ｎが、２、３、または４であり、ｍ、Ｒ’、Ｒ”、及びＲ_２～Ｒ_６が、本明細書に記載される通りである。例えば、Ｒ_２及びＲ_３の各々は独立して、Ｃ_５－１４アルキル及びＣ_５－１４アルケニルからなる群から選択され得る。

いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能なアミノ脂質は、以下の構造を有する化合物を含む：
。

いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能なアミノ脂質は、以下の構造を有する化合物を含む：
。

いくつかの実施形態では、本開示の非カチオン性脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ １６．０ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの混合物を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＤＭＧ－ＰＥＧ、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ（ＰＥＧ－ＤＯＭＧとも称される）、ＰＥＧ－ＤＳＧ、及び／またはＰＥＧ－ＤＰＧである。

いくつかの実施形態では、本開示のステロールは、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロール、及びそれらの混合物を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、化合物１のイオン化可能なアミノ脂質を含み、非カチオン性脂質が、ＤＳＰＣ、コレステロールである構造脂質であり、ＰＥＧ脂質が、ＤＭＧ－ＰＥＧである。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、４５～５５モルパーセントのイオン化可能なアミノ脂質を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、または５５モルパーセントのイオン化可能なアミノ脂質を含み得る。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５～１５モルパーセントのＤＳＰＣを含む。例えば、脂質ナノ粒子は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５モルパーセントのＤＳＰＣを含み得る。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、３５～４０モルパーセントのコレステロールを含む。例えば、脂質ナノ粒子は、３５、３６、３７、３８、３９、または４０モルパーセントのコレステロールを含み得る。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、１～２モルパーセントのＤＭＧ－ＰＥＧを含む。例えば、脂質ナノ粒子は、１、１．５、または２モルパーセントのＤＭＧ－ＰＥＧを含み得る。

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５０モルパーセントのイオン化可能なアミノ脂質、１０モルパーセントのＤＳＰＣ、３８．５モルパーセントのコレステロール、及び１．５モルパーセントのＤＭＧ－ＰＥＧを含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約２：１～約３０：１のＮ：Ｐ比を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約６：１のＮ：Ｐ比を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約３：１のＮ：Ｐ比を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約１０：１～約１００：１のイオン化可能なアミノ脂質構成要素対ｍＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約２０：１のイオン化可能なアミノ脂質構成要素対ｍＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約１０：１のイオン化可能なアミノ脂質構成要素対ｍＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比を含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍの平均直径を有する。

いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、約７０ｎｍ～約１２０ｎｍの平均直径を有する。

多価ワクチン
本明細書で提供されるようなワクチンは、複数のｍＲＮＡを含み、各々が１つ以上のＥＢＶ抗原をコードする。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ抗原をコードする１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上のｍＲＮＡを含む。

いくつかの実施形態では、抗原をコードする２つ以上の異なるｍＲＮＡを、同じ脂質ナノ粒子内に製剤化してもよい。他の実施形態では、抗原をコードする２つ以上の異なるｍＲＮＡが、別々の脂質ナノ粒子内に製剤化されてもよい（各ｍＲＮＡが単一の脂質ナノ粒子内に製剤化される）。次いで、脂質ナノ粒子を組み合わせ、（例えば、複数の抗原をコードする複数のｍＲＮＡを含む）単一のワクチンとして投与され得るか、または別々に投与され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＥＢＶワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードする第１のｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇｐ４２（可溶性または野生型）をコードする第２のｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇＨをコードする第３のｍＲＮＡ、及びＥＢＶ ｇＬをコードする第４のｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＥＢＶワクチンは、ＥＢＶ ｇＢをコードする第５のｍＲＮＡを更に含む。

多価ｍＲＮＡは、典型的には、一度に１つのｍＲＮＡを転写し、各ｍＲＮＡを精製し、次いで、製剤化前に、精製したｍＲＮＡを一緒に混合することによって産生される。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、（ａ）ＥＢＶ糖タンパク質２２０（ｇｐ２２０）をコードするオープンリーディングフレームを含む第１のｍＲＮＡ、（ｂ）糖タンパク質４２（ｇｐ４２）をコードするオープンリーディングフレーム（例えば、ｇｐ４２の可溶性形態）を含む第２のｍＲＮＡ、（ｃ）糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするオープンリーディングフレームを含む第３のｍＲＮＡ、及び（ｄ）糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）をコードするオープンリーディングフレームを含む第４のｍＲＮＡを含む。

いくつかの実施形態では、（ａ）：（ｂ）の質量比は、４：１、４：１．５、２：１、４：２．５、４：３、４：３．５、または１：１である。いくつかの実施形態では、（ａ）：（ｃ）の質量比は、４：１、４：１．５、２：１、４：２．５、４：３、４：３．５、または１：１である。いくつかの実施形態では、（ａ）：（ｄ）の質量比は、４：１、４：１．５、２：１、４：２．５、４：３、４：３．５、または１：１である。

いくつかの実施形態では、（ｂ）：（ｃ）の質量比は、２：１、２：１．５、１：１、１：１．５、または１：２である。いくつかの実施形態では、（ｂ）：（ｄ）の比は、２：１、２：１．５、１：１、１：１．５、または１：２である。

いくつかの実施形態では、（ｃ）：（ｄ）の質量比は、２：１、２：１．５、１：１、１：１．５、または１：２である。

いくつかの実施形態では、（ａ）：（ｂ）：（ｃ）：（ｄ）の質量比は、４：１：１：１．５である。いくつかの実施形態では、（ａ）：（ｂ）：（ｃ）：（ｄ）の質量比は、４：１：１：１である。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡと等しい質量で含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡと等しい質量で含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡと等しい質量で含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードするｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードするｍＲＮＡと等しい質量で含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡと等しい質量で含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡと等しい質量で含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードするｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードするｍＲＮＡと等しい質量で含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇ４２をコードするｍＲＮＡと等しい質量で含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡと等しい質量で含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードするｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードするｍＲＮＡと等しい質量で含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡと等しい質量で含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡと等しい質量で含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、（ｅ）ＥＢＶ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）をコードするオープンリーディングフレームを含む第５のｍＲＮＡを更に含む。

いくつかの実施形態では、（ａ）：（ｅ）の質量比は、４：１、４：１．５、２：１、４：２．５、４：３、４：３．５、または１：１である。いくつかの実施形態では、（ｂ）：（ｅ）の質量比は、２：１、２：１．５、１：１、１：１．５、または１：２である。いくつかの実施形態では、（ｃ）：（ｅ）の比は、２：１、２：１．５、１：１、１：１．５、または１：２である。いくつかの実施形態では、（ｄ）：（ｅ）の質量比は、２：１、２：１．５、１：１、１：１．５、または１：２である。

いくつかの実施形態では、（ａ）：（ｂ）：（ｃ）：（ｄ）：（ｅ）の質量比は、４：１：１：１．５：１．５である。いくつかの実施形態では、（ａ）：（ｂ）：（ｃ）：（ｄ）：（ｅ）の比は、４：１：１：１：１である。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇＢをコードするｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇＢをコードするｍＲＮＡと等しい質量で含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇＢをコードするｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇＢをコードするｍＲＮＡと等しい質量で含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇＢをコードするｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇＢをコードするｍＲＮＡと等しい質量で含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇＢをコードするｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇＢをコードするｍＲＮＡと等しい質量で含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＢをコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードするｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＢをコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードするｍＲＮＡと等しい質量で含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＢをコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＢをコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡと等しい質量で含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＢをコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＢをコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡと等しい質量で含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＢをコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＢをコードするｍＲＮＡを、ＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡと等しい質量で含む。

ワクチン製剤及び投薬スケジュール
いくつかの態様では、本明細書では、ヒトにおけるＥＢＶ感染の防止または治療のためのワクチン、方法、キット、及び試薬が提供される。本明細書で提供されるワクチンは、ＥＢＶ感染または疾患進行を防止または治療するための予防薬または治療薬として使用され得る。ワクチンは、健康な個体または潜伏期間中の感染初期または症状発現後の活動性感染中に、積極的な免疫化スキームの一環として予防的に投与されても、または治療的に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞、組織、または対象に提供されるｍＲＮＡの量は、免疫予防に有効な量であり得る。

ワクチンは、感染の有病率、または満たされていない医学的必要性の程度もしくはレベルに依存して、様々な状況で利用することができる。ｍＲＮＡワクチンは、市販のワクチンよりもはるかに大きな抗体力価、より良好な中和免疫を産生し、より持続性のある免疫応答を産生し、及び／またはより早期の応答を産生するという点で優れた特性を有する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｍＲＮＡを含有するＥＢＶワクチンは、対象（例えば、ヒト対象などの哺乳類対象）に投与することができ、ｍＲＮＡは、インビボで翻訳され、発現して、対象における免疫応答を刺激するＥＢＶ抗原を産生する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、抗原特異的（例えば、ＥＢＶ特異的）免疫応答を誘導するために有効量で対象（例えば、ヒト対象などの哺乳類対象）に投与される。

製剤化／用量
ｍＲＮＡ及びＬＮＰを含むワクチンは、１つ以上の他の構成要素を更に含んでも含んでいなくてもよい。例えば、ワクチンは、限定されるものではないが、アジュバント及び／または賦形剤を含む、他の構成要素を含み得る。いくつかの実施形態では、ワクチンは、アジュバントを含まない（アジュバントフリーである）。

ワクチンは、無菌、パイロジェンフリーであっても、無菌及びパイロジェンフリーの両方であってもよい。ワクチンなどの医薬品の製剤化及び／または製造における一般の考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。

本明細書に記載のワクチンの製剤は、薬理学の分野で知られているか、または今後開発される任意の方法によって、調製され得る。概して、そのような調製方法は、活性成分（例えば、ｍＲＮＡ）を賦形剤及び／または１つ以上の他の補助成分（例えば、本明細書に記載される脂質ナノ粒子構成要素）と会合させるステップ、次いで、必要であれば及び／または望ましい場合には、所望の単回投与単位または複数回投与単位に製品を分割、形成、及び／または包装するステップを含む。

本開示に従うワクチン中の活性成分（すなわち、ｍＲＮＡ）、薬学的に許容される賦形剤（例えば、ＬＮＰ構成要素）、及び／または任意の更なる成分の相対量は、治療される対象の固有性、サイズ、及び／または状態に依存して、更にはそのワクチンが投与される経路に依存して変動するであろう。例として、ワクチンは、０．１％～１００％、例えば、０．５～５０％、１～３０％、５～８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）のｍＲＮＡ含み得る。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、１つ以上の賦形剤を使用して製剤化されて、（１）安定性を増加する、（２）細胞トランスフェクションを増加する、（３）持続放出もしくは遅延放出（例えば、デポー製剤から）を可能にする、（４）生体内分布を改変する（例えば、特定の組織または細胞型を標的とする）、（５）コードされたタンパク質の翻訳をインビボで増加する、及び／または（６）コードされたタンパク質（抗原）の放出プロファイルをインビボで改変することができる。ありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクルなどの従来の賦形剤に加えて、分散剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、賦形剤としては、限定されないが、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ｍＲＮＡでトランスフェクトされた細胞（例えば、対象への移植用）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣物、及びそれらの組み合わせが挙げられる。

有効量（例えば、有効用量）は、臨床的に許容可能なレベルでウイルスによる感染症を防止する。いくつかの実施形態では、有効用量とは、ワクチンの添付文書に列記されている用量である。ワクチン（例えば、ｍＲＮＡを含む）の有効量（例えば、有効用量）は、少なくとも部分的には、標的組織、標的細胞の種類、投与手段、ｍＲＮＡの物理的特徴（例えば、長さ、ヌクレオチド組成、及び／または修飾ヌクレオシドの程度）、ワクチンの他の構成要素、ならびに対象の年齢、体重、身長、性別、及び全体的な健康状態などの他の決定因子に基づく。典型的には、ワクチンの有効量は、対象の細胞内での抗原産生の関数として、誘導または追加免疫された免疫応答を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学修飾を有するｍＲＮＡを含有するワクチンの有効量は、同じ抗原またはペプチド抗原をコードする対応する非修飾ポリヌクレオチドを含有するワクチンよりも効率的である。抗原産生の増加は、細胞トランスフェクションの増加（ｍＲＮＡワクチンでトランスフェクトされた細胞のパーセンテージ）、ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳及び／または発現の増加、核酸分解の減少（例えば、修飾ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳の持続時間の増加によって示される）、または宿主細胞の抗原特異的免疫応答の変化によって実証され得る。

本明細書で提供されるようなｍＲＮＡの有効量は、ワクチン接種される対象の年齢及びワクチン投薬スケジュールに少なくとも部分的に依存する。いくつかの実施形態では、ワクチンは、単回用量として投与される。他のいくつかの実施形態では、ワクチンの１つ以上のブースター用量（複数可）が投与される。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードする約２５～１２５μｇのｍＲＮＡを含む。例えば、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードする約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５１、５２、５３、５４、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１５、１２０、または１２５μｇのｍＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードする約２５～３０μｇ、５０～５５μｇ、または１０５～１１０μｇのｍＲＮＡを含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードする約５～３０μｇのｍＲＮＡを含む。例えば、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードする約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０μｇのｍＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードする約５～１０μｇ、１０～１５μｇ、または２５～２０μｇのｍＲＮＡを含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＬをコードする約５～３０μｇのｍＲＮＡを含む。例えば、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＬをコードする約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０μｇのｍＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＬをコードする約５～１０μｇ、１０～１５μｇ、または２５～２０μｇのｍＲＮＡを含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＨをコードする約１０～５０μｇのｍＲＮＡを含む。例えば、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＨをコードする約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０μｇのｍＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇＨをコードする約５～１５μｇ、１５～２５μｇ、または３０～５０μｇのｍＲＮＡを含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードする２６．７μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードする６．７μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇＬをコードする６．７μｇのｍＲＮＡ、及びＥＢＶ ｇＨをコードする１０μｇのｍＲＮＡを含む。

他の実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードする５３．３μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードする１３．３μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇＬをコードする１３．３μｇのｍＲＮＡ、及びＥＢＶ ｇＨをコードする２０μｇのｍＲＮＡを含む。

なお他の実施形態では、ワクチンは、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードする１０６．７μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードする２６．７μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇＬをコードする２６．７μｇのｍＲＮＡ、及びＥＢＶ ｇＨをコードする４０μｇのｍＲＮＡを含む。

「総用量」は、単回ワクチン接種として、または初回用量及び任意のブースター用量（複数可）の累積としてのいずれかで、投与されるｍＲＮＡの総量を指すことが理解されるべきである。したがって、ワクチンが５０μｇのｍＲＮＡの単回投与として投与される場合、総用量は、５０μｇのｍＲＮＡである。ワクチンが５０μｇのｍＲＮＡの初回用量として投与され、次いで、後に５０μｇのｍＲＮＡのブースター用量として投与される場合、総用量は、１００μｇのｍＲＮＡである。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、当該技術分野で知られている不活化ワクチンの投与と同様に、筋肉内、経鼻、または皮内に投与され得る。好ましい実施形態では、ワクチンは、筋肉内投与される。

本明細書に記載のＲＮＡは、鼻腔内、気管内、または注射用（例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、皮内、心臓内、腹腔内、及び皮下）などの、本明細書に記載の剤形で製剤化され得る。

投薬スケジュール
ＥＢＶ感染からの予防的保護は、本開示のｍＲＮＡワクチンの投与後に達成され得る。ワクチンは、１回、２回、３回、４回、またはそれ以上投与されてもよいが、ワクチンを１回投与するだけで十分である可能性が高い（任意選択で、単回のブースターが続く）。感染した個体にワクチンを投与して、治療応答を達成することも可能である。用量設定を適宜調整する必要がある場合がある。

ブースター用量は、ワクチンの追加投与を指す。ブースター（ブースター用量またはブースターワクチン）は、ワクチンの早期投与後に与えてもよい。任意の２回用量のｍＲＮＡワクチン（例えば、初回用量及びブースター用量、またはブースター用量及び第２のブースター用量）は、例えば、少なくとも１ヶ月（約２８、２９、３０、または３１日）間隔、または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヶ月間隔で投与され得る。いくつかの実施形態では、ブースター用量は、年１回投与される。

いくつかの実施形態では、ブースター用量（例えば、第１、第２、または第３のブースター用量）は、初回用量または別のブースター用量の少なくとも１ヶ月後、少なくとも２ヶ月後、少なくとも３ヶ月後、少なくとも４ヶ月後、少なくとも５ヶ月後、または少なくとも６ヶ月後に投与される。いくつかの実施形態では、ブースター用量は、初回用量または別のブースター用量の１ヶ月後、２ヶ月後、３ヶ月後、４ヶ月後、５ヶ月後、または６ヶ月後に投与される。いくつかの実施形態では、第２のブースター用量は、第１のブースター用量の少なくとも１ヶ月後、少なくとも２ヶ月後、少なくとも３ヶ月後、少なくとも４ヶ月後、少なくとも５ヶ月後、または少なくとも６ヶ月後に投与される。いくつかの実施形態では、第２のブースター用量は、第１のブースター用量の１ヶ月後、２ヶ月後、３ヶ月後、４ヶ月後、５ヶ月後、または６ヶ月後に投与される。いくつかの実施形態では、ブースター用量は、初回用量の１年後または少なくとも１年後に投与される。いくつかの実施形態では、第２のブースター用量は、第１のブースター用量の１年後または少なくとも１年後に投与される。

ＥＢＶ抗原（または多重抗原）に対する対象における免疫応答を誘発する方法は、本開示の態様で提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ＥＢＶ抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを含むワクチンを対象に投与し、それによって対象においてＥＢＶ抗原に特異的な免疫応答を誘導することを伴い、対象における抗抗原抗体力価が、抗原（例えば、ＥＢＶ抗原）に対する予防有効用量の従来のワクチンをワクチン接種した対象における抗抗原抗体力価と比較して、ワクチン接種後に増加する。

「抗抗原抗体」とは、抗原（例えば、ＥＢＶ抗原）に特異的に結合する血清抗体である。いくつかの実施形態では、対象における抗抗原抗体力価は、ワクチン接種後、ＥＢＶに対する予防有効用量の従来のワクチンをワクチン接種した対象またはワクチン未接種の対象における抗抗原抗体力価と比較して、１ｌｏｇ～１０ｌｏｇ増加する。いくつかの実施形態では、対象における抗－抗原抗体力価は、ワクチン接種後、ＥＢＶに対する従来のワクチンの予防有効用量をワクチン接種した対象またはワクチン未接種の対象における抗－抗原抗体力価と比較して、１ｌｏｇ、２ｌｏｇ、３ｌｏｇ、４ｌｏｇ、５ｌｏｇ、または１０ｌｏｇ増加する。

本明細書で使用される場合、従来のワクチンとは、本開示のｍＲＮＡワクチン以外のワクチンを指す。例えば、従来のワクチンとしては、限定されるものではないが、微生物生ワクチン、微生物不活化ワクチン、サブユニットワクチン、タンパク質抗原ワクチン、ＤＮＡワクチン、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチンなどが挙げられる。例示的な実施形態では、従来のワクチンは、国の薬物規制機関（例えば、米国の食品医薬品局（ＦＤＡ）または欧州医薬品庁（ＥＭＡ））によって規制上の承認を達成し、及び／または登録されているワクチンである。

いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、ワクチンに対して２倍～１００倍の投薬量レベルでＥＢＶに対する従来のワクチンをワクチン接種した対象における免疫応答と同等である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示のワクチンと比較して、２倍の投薬量レベルで従来のワクチンをワクチン接種した対象における免疫応答と同等である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示のワクチンと比較して、３倍の投薬量レベルで従来のワクチンをワクチン接種した対象における免疫応答と同等である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示のワクチンと比較して、４倍、５倍、１０倍、５０倍、または１００倍の投薬量レベルで従来のワクチンをワクチン接種した対象における免疫応答と同等である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示のワクチンと比較して、１０倍～１０００倍の投薬量レベルで従来のワクチンをワクチン接種した対象における免疫応答と同等である。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、本開示のワクチンと比較して、１００倍～１０００倍の投薬量レベルで従来のワクチンをワクチン接種した対象における免疫応答と同等である。

いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、ＥＢＶに対する予防有効用量の従来のワクチンをワクチン接種した対象において誘導される免疫応答と比較して、２日～１０週間早く誘導される。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、従来のワクチンを予防有効用量でワクチン接種した対象において誘導される免疫応答と比較して、２日、３日、１週間、２週間、３週間、５週間、または１０週間早く誘導される。

いくつかの実施形態では、免疫応答は、対象における［タンパク質］抗体力価を決定することによって評価される。他の実施形態では、免疫化された対象由来の血清または抗体の能力を、ウイルス取り込みを中和する能力またはヒトＢリンパ球のＥＢＶ形質転換を低減するその能力について試験する。他の実施形態では、強力なＴ細胞応答（複数可）を促進する能力は、当該技術分野で認識されている技法を使用して測定される。

ワクチン有効性
本開示のいくつかの態様は、ｍＲＮＡワクチンの製剤であって、ｍＲＮＡが、対象において抗原特異的免疫応答（例えば、ＥＢＶ抗原に特異的な抗体の産生）を産生するのに有効な量で製剤化される、製剤を提供する。「有効量」とは、抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効なｍＲＮＡの用量である。また、本明細書では、対象内の抗原特異的免疫応答を誘導する方法も提供する。

本明細書で使用される場合、本開示のワクチンまたはＬＮＰに対する免疫応答とは、ワクチン中に存在する（１つ以上の）ＥＢＶタンパク質（複数可）に対する対象における液性及び／または細胞性免疫応答の発生である。本開示の目的では、「液性」免疫応答は、例えば、分泌（ＩｇＡ）またはＩｇＧ分子を含む抗体分子によって媒介される免疫応答を指す一方で、「細胞性」免疫応答は、Ｔ－リンパ球（例えば、ＣＤ４＋ヘルパー及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、ＣＴＬ）及び／または他の白血球）によって媒介されるものを指す。細胞性免疫における１つの重要な態様は、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による抗原特異的応答を含む。ＣＴＬは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によってコードされたタンパク質とともに提示され細胞表面に発現するペプチド抗原に対し特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の破壊またはそのような微生物に感染した細胞の溶解を誘導及び促進する一助となる。細胞性免疫の別の態様は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答に関与する。ヘルパーＴ細胞は、ペプチド抗原をＭＨＣ分子とともにその表面に提示した細胞に対する非特異的エフェクター細胞の機能を刺激し、その活性に焦点を合わせる一助となるように作用する。細胞性免疫応答はまた、活性化Ｔ細胞及び／または他の白血球（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞由来のものを含む）によって産生されるサイトカイン、ケモカイン、及び他のそのような分子の産生にもつながる。

いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答は、本明細書で提供されるようなワクチンを投与された対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価を測定することによって特徴付けられる。抗体力価とは、対象内の抗体、例えば特定の抗原（例えば、抗ＥＢＶ Ｆ糖タンパク質）または抗原のエピトープに特異的な抗体の量の測定値である。抗体力価は、典型的には、陽性結果をもたらす最大希釈度の逆数として表される。例えば、酵素結合免疫吸着測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）とは、例えば、抗体力価を定量するための一般的なアッセイである。

いくつかの実施形態では、抗体力価は、対象が感染症に罹ったか否かを評価するため、または免疫化が必要か否かを判断するために使用される。いくつかの実施形態では、抗体力価は、自己免疫応答の強さを定量するため、ブースター免疫が必要か否かを判断するため、以前のワクチンが有効だった否かを判断するため、及び最近または過去の感染を確認するために使用される。本開示によれば、抗体力価を使用して、ｍＲＮＡワクチンによって対象において誘導される免疫応答の強度を決定してもよい。

いくつかの実施形態では、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、対照と比較して、少なくとも１ｌｏｇ増加する。例えば、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、対照と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、または少なくとも３ｌｏｇ増加し得る。いくつかの実施形態では、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、対照と比較して、１、１．５、２、２．５、または３ｌｏｇ増加する。いくつかの実施形態では、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、対照と比較して、１～３ｌｏｇ増加する。例えば、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、対照と比較して、１～１．５、１～２、１～２．５、１～３、１．５～２、１．５～２．５、１．５～３、２～２．５、２～３、または２．５～３ｌｏｇ増加し得る。

いくつかの実施形態では、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、対照と比較して、少なくとも２倍増加する。例えば、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原ｎ抗体力価は、対照と比較して、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍増加し得る。いくつかの実施形態では、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、対照と比較して、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍増加する。いくつかの実施形態では、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、対照と比較して、２～１０倍増加する。例えば、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、対照と比較して、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、３～４、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、４～５、５～１０、５～９、５～８、５～７、５～６、６～１０、６～９、６～８、６～７、７～１０、７～９、７～８、８～１０、８～９、または９～１０倍増加し得る。

いくつかの実施形態では、抗原特異的免疫応答は、ＥＢＶに対する血清中和抗体力価の幾何平均力価（ＧＭＴ）の比（幾何平均比（ＧＭＲ）と称される）として測定される。幾何平均力価（ＧＭＴ）は、全ての値を掛け合わせ、その数値のｎ乗根（ｎは利用可能なデータを有する対象数である）をとることによって算出される、対象の群における平均抗体力価である。

いくつかの実施形態では、対照は、ｍＲＮＡワクチンを投与されていない対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価である。いくつかの実施形態では、対照は、組換えまたは精製されたタンパク質ワクチンを投与された対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価である。組換えタンパク質ワクチンは、典型的には、異種発現系（例えば、細菌または酵母）で産生されたタンパク質抗原、または大量の病原性生物から精製されたタンパク質抗原を含む。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンが有効となる能力は、マウスモデルで測定される。例えば、ワクチンを、マウスモデルに投与してもよく、マウスモデルを中和抗体力価の誘導についてアッセイしてもよい。また、ウイルスチャレンジ研究も、本開示のワクチンの有効性を評価するために使用してもよい。例えば、ワクチンをマウスモデルに投与し、そのマウスモデルをウイルスでチャレンジし、そのマウスモデルを生存及び／または免疫応答（例えば、中和抗体応答、Ｔ細胞応答（例えば、サイトカイン応答））についてアッセイしてもよい。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンの有効量は、組換えタンパク質ワクチンの標準治療用量と比較して、低減された用量である。本明細書で使用する「標準治療」とは、医学的または心理学的な治療ガイドラインを指し、一般的であっても、特定的であってもよい。「標準治療」は、科学的根拠及び所与の状態の治療に携わる医療従事者間の協力に基づいた適切な治療を指す。それは、医師／臨床医がある特定のタイプの患者、病気、または臨床状況に対し従うべき診断及び治療のプロセスである。本明細書で使用する「標準治療用量」とは、医師／臨床医または他の医療専門家が、ＥＢＶ感染、または関連する状態を治療または防止するための標準治療ガイドラインに従いながら、ＥＢＶ感染、または関連する状態を治療または防止するために対象に投与する、組換えもしくは精製タンパク質ワクチン、または生弱毒化もしくは不活化ワクチン、またはＶＬＰワクチンの用量を指す。

いくつかの実施形態では、有効量の組成物を投与された対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、組換えもしくは精製されたタンパク質ワクチン、または生弱毒化もしくは不活性化ワクチン、またはＶＬＰワクチンの標準的なケア用量を投与された対照対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価と同等である。

ワクチン有効性は、標準的な解析を使用して評価され得る（例えば、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１０ Ｊｕｎ １；２０１（１１）：１６０７－１０を参照されたい）。例えば、ワクチン有効性は、二重盲検ランダム化対照臨床試験で測定することができる。ワクチン有効性は、ワクチン非接種研究コホートの罹患率（ＡＲＵ）とワクチン接種研究コホートの罹患率（ＡＲＶ）との間の疾患罹患率（ＡＲ）の比例的低減として表すことができ、以下の式を使用してワクチン接種群の疾患の相対リスク（ＲＲ）から算出することができる。
有効性＝（ＡＲＵ－ＡＲＶ）／ＡＲＵ×１００、及び
有効性＝（１－ＲＲ）×１００。

同様に、ワクチン有効性は標準的な解析を用いて評価され得る（例えば、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１０ Ｊｕｎ １；２０１（１１）：１６０７－１０を参照されたい）。ワクチン有効性とは、ワクチン（高いワクチン有効性を有することが既に判明している場合もある）が集団の中でどのように疾患を低減するかを評価するものである。この尺度は、対照臨床試験ではなく、自然現場条件下で、ワクチン自体だけでなく、ワクチン接種プログラムの利益と副作用との正味のバランスを評価することができる。ワクチン有効性は、ワクチン有効性（効力）に比例するが、また、集団内の標的群の免疫化の程度、ならびに入院、外来訪問、または費用の「現実世界」の結果に影響を与える他の非ワクチン関連因子によって影響を受ける。例えば、後ろ向きケースコントロール分析を使用して、感染症例のセット及び適切な対照におけるワクチン接種率を比較することができる。ワクチン有効性は、ワクチン接種したにもかかわらず感染症を発症したオッズ比（ＯＲ）の使用により、割合の差として表すことができる。
有効性＝（１－ＯＲ）×１００。

いくつかの実施形態では、ワクチンの有効性は、ワクチン未接種の対照対象と比較して、少なくとも６０％である。例えば、ワクチンの有効性は、ワクチン未接種対照の対象と比較して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％であり得る。

殺菌免疫。殺菌免疫とは、宿主への有効な病原体感染を防止する独自の免疫状態を指す。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンの有効量は、少なくとも１年間、対象における殺菌免疫を提供するのに十分である。例えば、本開示のワクチンの有効量は、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、または少なくとも５年間、対象内の殺菌免疫を提供するのに十分である。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンの有効量は、対照と比較して、少なくとも５倍低い用量で対象内の殺菌免疫を提供するのに十分である。例えば、有効量は、対照と比較して、少なくとも１０倍、１５倍、または２０倍低い用量で、対象における殺菌免疫を提供するのに十分であり得る。

検出可能な抗原。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンの有効量は、投与してから１～７２時間後の対象の血清において測定して、検出可能なレベルのＥＢＶ抗原を産生するのに十分である。

力価。抗体力価とは、対象内の抗体、例えば、特定の抗原（例えば、抗ＥＢＶ抗原）に特異的である抗体の量の測定値である。抗体力価は、典型的には、陽性結果をもたらす最大希釈度の逆数として表される。例えば、酵素結合免疫吸着測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）とは、例えば、抗体力価を定量するための一般的なアッセイである。

いくつかの実施形態では、本開示のワクチンの有効量は、投与してから１～７２時間後の対象の血清中の測定において、ＥＢＶ抗原に対する中和抗体によって産生される１，０００～１０，０００の中和抗体力価を産生するのに十分である。いくつかの実施形態では、有効量は、投与してから１～７２時間後の対象の血清中の測定において、ＥＢＶ抗原に対する中和抗体によって産生される１，０００～５，０００の中和抗体力価を産生するのに十分である。いくつかの実施形態では、有効量は、投与してから１～７２時間後の対象の血清中の測定において、ＥＢＶ抗原に対する中和抗体によって産生される５，０００～１０，０００の中和抗体力価を産生するのに十分である。

いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、少なくとも１００ＮＴ_５０である。例えば、中和抗体力価は、少なくとも２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ＮＴ_５０であり得る。いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、少なくとも１０，０００ＮＴ_５０である。

いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、ミリリットル当たり少なくとも１００中和単位（ＮＵ／ｍＬ）である。例えば、中和抗体力価は、少なくとも２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ＮＵ／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態では、中和抗体力価は、少なくとも１０，０００ＮＵ／ｍＬである。

いくつかの実施形態では、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、対照と比較して、少なくとも１ｌｏｇ増加する。例えば、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、対照と比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｌｏｇ増加し得る。

いくつかの実施形態では、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、対照と比較して、少なくとも２倍増加する。例えば、対象において産生された抗ＥＢＶ抗原抗体力価は、対照と比較して、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０倍増加する。

いくつかの実施形態では、ｎ個の数の積のｎ乗根である幾何平均を、比例増殖を説明するために一般的に使用する。幾何平均は、いくつかの実施形態では、対象において産生される抗体力価を特徴評価するために使用される。

対照は、例えば、ワクチン未接種の対象、または生弱毒化ウイルスワクチン、不活化ウイルスワクチン、またはタンパク質サブユニットワクチンを投与された対象であり得る。

実施例１
他のＥＢＶ抗原と組み合わせて可溶性ＥＢＶ ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡを含むワクチンを判定するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるインビボ研究を行った。実験的な設計を表１及び表２に示す。使用されたｍＲＮＡの配列を表３に提供する。

各抗原の組み合わせの２つの用量を試験した。「用量」及び「１／３用量」。各ＥＢＶ ｇｐ４２設計について、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡ（ＯＲＦ配列番号１０または１４）を、ＥＢＶ ｇＬをコードするｍＲＮＡ（ＯＲＦ配列番号８）と等しい質量で含めた。各ｇｐ４２設計を、各用量について、ＥＢＶ ｇＢをコードするｍＲＮＡ（ＯＲＦ配列番号１２）の存在下及び非存在下で試験した。安定性を考慮して、ＥＢＶ ｇＨをコードするｍＲＮＡ（ＯＲＦ配列番号６）及びＥＢＶ ｇＢをコードするｍＲＮＡ（該当する場合）を、ｇＬをコードするｍＲＮＡ及びｇｐ４２をコードするｍＲＮＡの質量の１．５倍含めた。ｇｐ２２０をコードするｍＲＮＡ（ＯＲＦ配列番号４）を、ｇＬ及びｇｐ４２の４倍の質量で含めた。

Ｂａｌｂ／ｃマウスを、脂質ナノ粒子中に製剤化された、上記の表１及び２に列挙されるような様々なＥＢＶ抗原をコードするｍＲＮＡを含むＥＢＶワクチンで筋肉内にワクチン接種した。「用量」群について、Ｂ細胞感染に対する中和（図２Ａ）及び上皮細胞感染に対する中和（図２Ｂ）を評価した。

これらのインビボ結果は、可溶性ＥＢＶ ｇｐ４２をコードするｍＲＮＡが、（ＷＴ ｇｐ４２とは異なり）上皮細胞感染に対して産生された中和抗体力価を減衰させない一方で、Ｂ細胞感染に対して産生された中和抗体力価をプラスに高めることを示す。ＥＢＶ ｇＢをコードするｍＲＮＡの添加は、ＥＢＶ ｇＨ、ＥＢＶ ｇＬ、ＥＢＶ ｇｐ２２０、及び可溶性ＥＢＶ ｇｐ４２（ＷＴ ｇｐ４２と同様）をコードする個々のｍＲＮＡを含むワクチンに添加する場合、Ｂ細胞感染に対して産生される中和抗体力価の低下を引き起こすことが見出された。

実施例２
ナイーブＢａｌｂ／ｃマウスに、約３週間間隔で実施例１のＥＢＶ ｇｐ２２０、ｓｏｌ ＥＢＶ ｇｐ４２、ＥＢＶ ｇＬ、及びＥＢＶ ｇＨタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む２つの用量のワクチンを与えた。Ｂ細胞または上皮細胞感染に対する中和抗体力価を、ＧＦＰ標識ウイルスを使用して、第２の用量の２週間後に測定した。比較のために、８つの回復期ヒト血清のセット中の中和抗体を測定した。

図３に示される結果は、群当たり８匹の動物を表し、Ｂ細胞及び上皮細胞感染に対する高レベルの中和抗体を示し、天然に感染したヒト血清で観察されるレベルよりも著しく高いレベルを示す。

実施例３
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、希釈剤、またはｇｐ２２０、ｇＨ、ｇＬ、及びｓｇｐ４２をコードするｍＲＮＡワクチン（１０μｇまたは２．５μｇ）で２回（３週間間隔）筋肉内に免疫化した。第２の用量の２週間後に、血清を採取し、中和及び結合抗体レベルについて分析した。中和抗体（ｎＡｂ）は、いずれかの用量のｍＲＮＡワクチンで免疫化したマウスの血清中で検出されたが、希釈剤を注射したマウスでは検出されなかった。ｍＲＮＡワクチン免疫化によって上昇した抗体は、Ｂ細胞（図４Ａ）及び上皮細胞感染（図４Ｂ）を阻害することができた。Ｂ細胞及び上皮細胞ｎＡｂ力価は、わずかな（＜２倍）用量依存的効果を呈した。
ＥＬＩＳＡを使用して、血清中の抗原特異的抗体のレベルを測定した。３つの個々のＥＬＩＳＡを使用して、抗ｇＨｇＬ（図５Ａ）、抗ｇｐ２２０（図５Ｂ）、及び抗ｇｐ４２（図５Ｃ）ＩｇＧを測定した。各抗原への結合抗体は、ｍＲＮＡワクチンで免疫化したマウス由来の血清中で検出されたが、希釈剤では検出されなかった。ｎＡｂ力価で見られたように、全体的な用量依存的効果は、控えめ：ｇｐ２２０及びｇｐ４２については２倍未満、ｇＨｇＬについては約２．３倍であった。

実施例４
３週間の摂取間隔で、３０μｇ、６０μｇ、もしくは８０μｇのｍＲＮＡワクチン、またはＰＢＳ（対照）の筋肉内注射で、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを２回免疫化した。多重アッセイを使用して、第２の免疫化の２週間後に血清中の抗体力価を測定した。ｍＲＮＡワクチンを受けた全ての動物は、ｇＨｇＬ（図６Ａ）、ｓｇｐ４２（図６Ｂ）、及びｇｐ２２０（図６Ｃ）に対する検出可能な抗体力価を示した。

本明細書に開示される全ての参考文献、特許、及び特許出願は、各々が示される主題に関して参照により組み込まれ、いくつかの場合において、それは書類の全体を包含し得る。

本明細書において、明細書中及び請求項中の「ａ」及び「ａｎ」という不定冠詞は、反対のことが明確に示されない限り、「少なくとも１つの」を意味するものと理解すべきである。
また、明確に反対のことが示されない限り、本明細書で特許請求される２つ以上のステップまたは行為を含む任意の方法において、当該方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも当該方法のステップまたは行為が記載されている順序に限定されないことも理解されたい。

特許請求の範囲、ならびに上の明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「有する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）」などの全ての移行句は、無制限、すなわち、含むが限定されないと意味すると理解されたい。「～からなる」「～から本質的になる」という移行句のみが、米国特許商標庁審査基準の２１１１．０３節に記載のように、それぞれクローズドまたはセミクローズドな移行句であるものとする。

数値の手前にある「約」及び「実質的に」という用語は、記載された数値の±１０％を意味する。

値の範囲が提供される場合、範囲の上端と下端との間の各値が具体的に企図され、本明細書に記載される。

国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７４００号、同ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４３３４８号、同ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３２７号、同ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３２４号、同ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３１４号、同ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３１０号、及び同ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３２１号の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

配列
本明細書に記載のｍＲＮＡ配列のうちのいずれかが５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含み得ることが理解されるべきである。ＵＴＲ配列は、以下の配列から選択してもよいが、他の既知のＵＴＲ配列を使用してもよい。また、本明細書に記載のｍＲＮＡ構築物のうちのいずれかは、ポリＡテール及び／またはキャップ（例えば、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ）を更に含み得ることが理解されるべきである。更に、本明細書に記載のｍＲＮＡ及びコードされた抗原配列のうちの多くが、シグナルペプチド及び／またはペプチドタグ（例えば、Ｃ末端Ｈｉｓタグ）を含むが、示されたシグナルペプチド及び／またはペプチドタグが、異なるシグナルペプチド及び／またはペプチドタグに置換されても、シグナルペプチド及び／またはペプチドタグが省略されてもよいことが理解されるべきである。
５’ＵＴＲ：ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号２４）
５’ＵＴＲ：ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣ（配列番号１）
３’ＵＴＲ：ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号２５）
３’ＵＴＲ：ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号３）

表３の配列のうちのいずれか１つが、Ｎ１－メチルプソイドウリジンによって完全に修飾され得ることが理解されるべきである。

Claims (38)

1. ワクチンであって、
   （ａ）エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）糖タンパク質２２０（ｇｐ２２０）をコードするオープンリーディングフレームを含むメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）と、
   （ｂ）糖タンパク質４２（ｇｐ４２）をコードするオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡと、
   （ｃ）糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）をコードするオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡと、
   （ｄ）糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）をコードするオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡと、を含む脂質ナノ粒子を含む、前記ワクチン。
2. 前記ｇｐ４２が、ｇｐ４２の可溶性形態である、請求項１に記載のワクチン。
3. （ａ）の前記ｍＲＮＡが、（ｂ）、（ｃ）、及び／または（ｄ）の前記ｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍である、請求項１または２に記載のワクチン。
4. （ａ）の前記ｍＲＮＡが、（ｂ）、（ｃ）、及び／または（ｄ）の前記ｍＲＮＡと等しい質量にある、請求項１または２に記載のワクチン。
5. （ｂ）の前記ｍＲＮＡが、（ａ）、（ｃ）、及び／または（ｄ）の前記ｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍である、請求項１または２に記載のワクチン。
6. （ｂ）の前記ｍＲＮＡが、（ａ）、（ｃ）、及び／または（ｄ）の前記ｍＲＮＡと等しい質量にある、請求項１または２に記載のワクチン。
7. （ｃ）の前記ｍＲＮＡが、（ａ）、（ｂ）、及び／または（ｄ）の前記ｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍である、請求項１または２に記載のワクチン。
8. （ｃ）の前記ｍＲＮＡが、（ａ）、（ｂ）、及び／または（ｄ）の前記ｍＲＮＡと等しい質量にある、請求項１または２に記載のワクチン。
9. （ｄ）の前記ｍＲＮＡが、（ａ）、（ｂ）、及び／または（ｃ）の前記ｍＲＮＡの５倍、４．５倍、４倍、３．５倍、３倍、２．５倍、２倍、または１．５倍である、請求項１または２に記載のワクチン。
10. （ｄ）の前記ｍＲＮＡが、（ａ）、（ｂ）、及び／または（ｃ）の前記ｍＲＮＡと等しい質量にある、請求項１または２に記載のワクチン。
11. （ａ）：（ｂ）：（ｃ）：（ｄ）の質量比が、４：１：１：１．５である、請求項１または２に記載のワクチン。
12. （ａ）：（ｂ）：（ｃ）：（ｄ）の質量比が、４：１：１：１である、請求項１または２に記載のワクチン。
13. 前記ワクチンが、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードする２６．７μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードする６．７μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇＬをコードする６．７μｇのｍＲＮＡ、及びＥＢＶ ｇＨをコードする１０μｇのｍＲＮＡを含む、請求項１または２に記載のワクチン。
14. 前記ワクチンが、ＥＢＶ ｇｐ２２０をコードする５３．３μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇｐ４２をコードする１３．３μｇのｍＲＮＡ、ＥＢＶ ｇＬをコードする１３．３μｇのｍＲＮＡ、及びＥＢＶ ｇＨをコードする２０μｇのｍＲＮＡを含む、請求項１または２に記載のワクチン。
15. 前記脂質ナノ粒子が、（ｅ）糖タンパク質Ｂをコードするオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡを更に含む、先行請求項のいずれか１項に記載のワクチン。
16. （ａ）：（ｂ）：（ｃ）：（ｄ）：（ｅ）の質量比が、４：１：１：１．５：１．５である、請求項１５に記載のワクチン。
17. 前記ｇｐ２２０が、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のワクチン。
18. 前記ｇｐ２２０が、前記配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のワクチン。
19. 前記ｇＬが、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のワクチン。
20. 前記ｇＬが、前記配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載のワクチン。
21. 前記ｇＨが、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のワクチン。
22. 前記ｇＨが、前記配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載のワクチン。
23. 前記ｇｐ４２が、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のワクチン。
24. 前記ｇｐ４２が、前記配列番号１４のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載のワクチン。
25. 可溶性ｇｐ４２が、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２～２４のいずれか１項に記載のワクチン。
26. 前記可溶性ｇｐ４２が、前記配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載のワクチン。
27. ｇＢが、配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１５～２６のいずれか１項に記載のワクチン。
28. 前記ｇＢが、前記配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のワクチン。
29. （ａ）～（ｅ）のうちのいずれか１つ以上の前記ｍＲＮＡが、５’７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐキャップ及び３’ポリＡテールを含む、先行請求項のいずれか１項に記載のワクチン。
30. （ａ）～（ｅ）のうちのいずれか１つ以上の前記ｍＲＮＡが、１－メチルプソイドウリジン化学修飾を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のワクチン。
31. 前記脂質ナノ粒子が、４５～５５ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質、１５～２０ｍｏｌ％の中性脂質、３５～４５ｍｏｌ％のコレステロール、及び０．５～５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾脂質を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のワクチン。
32. 前記イオン化可能なアミノ脂質が、化合物Ｉである、先行請求項のいずれか１項に記載のワクチン：
    。
33. 前記脂質ナノ粒子が、５０ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のワクチン。
34. 前記脂質ナノ粒子が、４９ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のワクチン。
35. 前記脂質ナノ粒子が、４８ｍｏｌ％のイオン化可能なアミノ脂質を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のワクチン。
36. 方法であって、対象に、先行請求項のいずれか１項に記載のワクチンをＥＢＶに対する免疫応答を誘導するのに有効な量で投与することを含む、前記方法。
37. 前記ワクチンが、単回用量として投与される、請求項３６に記載の方法。
38. 前記ワクチンが、初回用量及び少なくとも１回のブースター用量として投与される、請求項３６に記載の方法。