CN111212905A - Rna聚合酶变体 - Google Patents

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Abstract

本公开在一些方面提供变体RNA聚合酶，其提高转录效率、同时减少在体外转录反应期间产生的双链RNA污染物和连缀转录物的数量的用途。在一些实施方案中，RNA聚合酶变体(例如T7 RNA聚合酶变体)包含至具有高螺旋倾向性或限制主链灵活性以特异性匹配延伸复合物的灵活性的残基(例如丙氨酸)的突变。描述了C螺旋内的氨基酸取代，包括S43 A和G47 A，以及T7 RNA聚合酶的C接头区，以及C末端甘氨酸残基的添加。还描述了使用帽类似物的共转录方法。

Description

RNA聚合酶变体
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2017年8月18日提交的美国临时申请号62/547,677、2018年2月9日提交的美国临时申请号62/628,484，以及2018年3月5日提交的美国临时申请号62/638,684，2018年5月29日提交的美国临时申请号62/677,527的优先权，所述临时申请的每一者通过引用以其全文并入本文。
背景技术
体外转录(IVT)使用噬菌体DNA依赖性核糖核酸(RNA)聚合酶(例如SP6、T3和T7)合成模板指导的mRNA转录物。IVT反应中的问题可能导致完全失败(例如，未产生转录物)或转录物大小不正确(例如，比预期的短或长)。与IVT反应相关的具体问题包括例如在反应期间产生的流产性(截短)转录物、连缀转录物、polyA尾部变体/3′异质性、突变转录物和/或双链污染物。
RNA聚合酶展现出三个转录阶段-起始、延伸和终止。在起始阶段期间，RNA聚合酶与特定启动子DNA序列结合，打开DNA双链体，并且将模板链送入活性位点中。例如，T7 RNA聚合酶形成称为起始复合物的结构，该结构包括六螺旋束子结构域(启动子结合结构域)，该六螺旋束子结构域与启动子相互作用以引发DNA双链体解链。当与启动子结合时，聚合酶产生许多2-12个核苷酸(nt)长的短(截短)转录物，这一过程通常称为流产性合成/起始。截短的RNA转录物不能通过RNA聚合酶转化为全长转录物，而成为在转录期间积聚的副产物。在转变到延伸阶段并释放启动子之后，聚合酶沿着DNA模板向下进行，从而产生全长RNA转录物。
在延伸阶段期间，RNA聚合酶常常继续转录DNA，超过应该引发终止的点，从而产生比预期的RNA转录物更长的长度(“连缀转录物”)。例如，T7 RNA聚合酶在从模板“掉落”之前将核苷酸添加到转录物的末端。研究表明，在体外由T7 RNA聚合酶产生的转录物中超过70％是连缀转录物。在一些情况下，这些异常的RNA产物的长度是编码序列的两倍。由于连缀转录是随机的，因此在给定的IVT反应中，产物之间常常存在很大的3’异质性。这种3’异质性对于下游应用(诸如连接反应)是有问题的，这些下游应用依赖于确定长度和/或核苷酸组成的RNA转录物。
发明内容
在转录起始期间，RNA聚合酶平衡两个相反的阶段。聚合酶必须首先与启动子紧密缔合，足以允许两条DNA链(其中一条是模板链)解离并开始转录。聚合酶必须然后释放启动子并进入高度连续延伸阶段。这两个阶段之间的竞争导致产生流产性转录物。聚合酶反复尝试清除启动子，但无法克服过渡障碍并释放短(流产性)RNA产物。相反，聚合酶常常无法“逃离”DNA模板，从而产生具有3’异质性的RNA转录物群体。本文提供了变体RNA聚合酶，其增加了例如在体外转录(IVT)反应期间产生的转录效率和3’同质性、连缀转录物、双链污染物或其任何组合。
在从起始转变到延伸期间，RNA聚合酶经历构象变化，从而需要氨基末端结构域(N末端结构域)的较大重排(参见例如Bandwar，RP等人Journal of Biological Chemistry282，22879-22886(2009)；Guillerez，J.等人Proc National Acad Sci 102，5958-5963(2005)；Durniak，K.等人Science(New York，N.Y.)322，553(2008)；和Tahirov，T.H.等人Nature 420，43-50(2002)，其每一者通过引用并入本文)。在此N末端结构域内是“C螺旋”(例如，T7 RNA聚合酶的氨基酸28-71)和“C接头”(例如，T7 RNA聚合酶的氨基酸258-266)，其各自含有子区域(分别为氨基酸42-47和257-262)，所述子区域随着RNA聚合酶从起始复合物转变成延伸复合物经历从环结构到螺旋结构的构象变化(参见例如图10)，从而消除启动子结合位点，扩大活性位点并为RNA转录物创建出口通道。C螺旋结构和/或C接头接头区的子区域突变可以通过增加延伸复合物相对于起始复合物的热力学稳定性驱动向延伸复合物的构象平衡。不受理论的束缚，还认为选择区域(诸如C螺旋结构和/或C接头接头区)中的突变可以改变聚合酶的出口通道在延伸期间与转录物相互作用的方式，从而导致转录错误(例如，连续转录物)显著减少。因此，本公开的变体聚合酶在C螺旋和/或C接头中包含(至少一个)突变，以驱动向延伸复合物的构象平衡。
如本文所提供，N末端结构域中含有随着聚合酶从起始进行到延伸转变成螺旋结构的环结构的其他区域可以突变(点突变，称为取代)，如本文所提供。此类环-至-螺旋区域的非限制性实例包括跨越T7RNA聚合酶的氨基酸55-73、164-169或176-187的区域(例如SEQID NO：1)，或与前述区域同源(例如，至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同)的其他单亚基RNA聚合酶的区域(参见例如，Cermakian，N.等人J Mol Evol 45，671-681(1997)，通过引用并入本文)。其他单亚基RNA聚合酶的非限制性实例包括T3 RNA聚合酶、K11 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶。
在一些实施方案中，RNA聚合酶变体(例如T7 RNA聚合酶变体)包含至具有高螺旋倾向性或限制主链灵活性以特异性匹配延伸复合物的灵活性的残基(例如丙氨酸)的突变。
本文进一步提供了RNA聚合酶变体，其在聚合酶的C末端中包含至少一个额外的氨基酸。例如，T7 RNA聚合酶变体可以在聚合酶的C末端中包含至少一个额外的氨基酸，诸如额外的甘氨酸(G)。令人惊讶的是，使用经修饰以在C末端“脚”区域(例如，在野生型T7RNAP的位置880-883处包含“FAFA”氨基酸的区域)中包含额外G的T7 RNA聚合酶产生的RNA转录物群体展现出较低的3′异质性。例如，如图23所示，包含C末端甘氨酸(即FAFAG)的T7 RNA聚合酶变体产生RNA转录物群体，其中至少85％的转录物在3′末端处是均质的。鉴于先前的研究已经表明，C末端添加/插入导致T7聚合酶功能丧失，因此此数据特别令人意外(GardnerLP等人Biochemistry 36，2908-2918(1997)和Gross L等人Journal of MolecularBiology 228，488-505(1992))。
本文还提供了使用本文所述的T7 RNA聚合酶变体(例如，T7RNA聚合酶变体G47A或G47A* C末端变体)在体外转录测定中用帽类似物(例如三核苷酸)对ssRNA(例如mRNA)共转录加帽的方法(共转录加帽方法)。有效的共转录加帽通常包括双链DNA(dsDNA)模板，该模板起始5′ATP和等摩尔浓度的NTP和三核苷酸的转录。在这些条件下，T7 RNA聚合酶展现出的5′ATP起始活性大大降低。出乎意料的是，本文提供的数据显示，在存在GAG三核苷酸(例如，m7GpppA2′OMepG)的情况下，例如，T7 RNA聚合酶对5′ATP的有限起始活性驱动三核苷酸而不是5′ATP的起始，从而产生共转录加帽的RNA产物。令人惊讶的是，在一些实施方案中，大于90％的所产生RNA包含单链全长转录物，至少90％的所产生RNA包含功能性帽，并且所产生的RNA即使不存在IVT后纯化的情况下也不诱发显著的细胞因子应答。
因此，本发明的一些方面提供RNA聚合酶变体，其相对于野生型聚合酶包含至少一个氨基酸取代，所述至少一个氨基酸取代导致所述RNA聚合酶变体的至少一个环结构随着所述RNA聚合酶变体从起始复合物转变成延伸复合物经历向螺旋结构的构象变化。在一些实施方案中，估计至少一个氨基酸取代在延伸复合物中的折叠自由能比在起始复合物中具有更大的负变化。在一些实施方案中，相对于野生型氨基酸，至少一个氨基酸取代具有高螺旋倾向性。在一些实施方案中，RNA聚合酶变体在C末端处包含(至少一个)额外的氨基酸残基。例如，RNA聚合酶变体(例如，T7 RNA聚合酶变体)可以在C末端处包含甘氨酸(G)。
在一些实施方案中，RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶。在一些实施方案中，RNA聚合酶是T3 RNA聚合酶。在一些实施方案中，RNA聚合酶是SP6 RNA聚合酶。在一些实施方案中，RNA聚合酶是K11 RNA聚合酶。
在一些实施方案中，至少一个环结构呈C螺旋结构。在一些实施方案中，至少一个环结构呈C接头结构。在一些实施方案中，至少一个环结构存在于T7 RNA聚合酶或与T7 RNA聚合酶同源的RNA聚合酶的氨基酸55-73、164-169或176-187内的区域中。
在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代是至少一个高螺旋倾向性氨基酸取代。例如，至少一个高螺旋倾向性氨基酸取代可以选自丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸。在一些实施方案中，至少一个高螺旋倾向性氨基酸取代是丙氨酸。在一些实施方案中，至少一个高螺旋倾向性氨基酸取代是异亮氨酸。在一些实施方案中，至少一个高螺旋倾向性氨基酸取代是亮氨酸。在一些实施方案中，至少一个高螺旋倾向性氨基酸取代是精氨酸。在一些实施方案中，至少一个高螺旋倾向性氨基酸取代是甲硫氨酸。在一些实施方案中，至少一个高螺旋倾向性氨基酸取代是赖氨酸。在一些实施方案中，至少一个高螺旋倾向性氨基酸取代是谷氨酰胺。在一些实施方案中，至少一个高螺旋倾向性氨基酸取代是谷氨酸。
在一些实施方案中，修饰T7 RNA聚合酶以在选自以下的至少一个位置处包含高螺旋倾向性氨基酸的至少一个氨基酸取代：E42(例如E42R)、S43(例如S43A)、Y44(例如Y44A)、E45(例如E45R/L)、M46(例如M46A)、G47(例如G47A)、A255(例如A255K/Q/Y/I)、R257(例如R257A)、A258(例如A258R/E/L)、G259(例如G259A)、A260(例如A260R/E/L)、L261(例如L261A)和A262(例如A262R/E/L)。在一些实施方案中，T7 RNA聚合酶可以进一步包含一个或多个额外的氨基酸取代(除了至少一个高螺旋倾向性氨基酸取代之外)。因此，本公开涵盖对本文所提供的具有一个或多个高螺旋倾向性氨基酸取代的现有(例如，当前可用的和/或可商购获得的)T7 RNA聚合酶变体的进一步修饰。
在一些实施方案中，T7 RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，该氨基酸序列经修饰以在选自E42(例如E42R)、S43(例如S43A)、Y44(例如Y44A)、E45(例如E45R/L)、M46(例如M46A)和G47(例如G47A)的位置处包括高螺旋倾向性氨基酸的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代包括S43A。在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代包括G47A。
在一些实施方案中，T7 RNA聚合酶包含SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ IDNO：294、SEQ ID NO：295或SEQ ID NO：296的氨基酸序列，该氨基酸序列经修饰以在选自E42(例如E42R)、S43(例如S43A)、Y44(例如Y44A)、E45(例如E45R/L)、M46(例如M46A)和G47(例如G47A)的位置处包括高螺旋倾向性氨基酸的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代包括S43A。在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代包括G47A。
在一些实施方案中，T7 RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，该氨基酸序列经修饰以在选自A255(例如A255K/Q/Y/I)、R257(例如R257A)、A258(例如A258R/E/L)、G259(例如G259A)、A260(例如A260R/E/L)、L261(例如L261A)和A262(例如A262R/E/L)的位置处包括高螺旋倾向性氨基酸的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代包括R257A。在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代包括G259A。
在一些实施方案中，T7 RNA聚合酶包含SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ IDNO：294、SEQ ID NO：295或SEQ ID NO：296的氨基酸序列，该氨基酸序列经修饰以在选自A255(例如A255K/Q/Y/I)、R257(例如R257A)、A258(例如A258R/E/L)、G259(例如G259A)、A260(例如A260R/E/L)、L261(例如L261A)和A262(例如A262R/E/L)的位置处包括高螺旋倾向性氨基酸的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代包括R257A。在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代包括G259A。
在一些方面，本文还提供了包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的T7 RNA聚合酶，该氨基酸序列经修饰以在位置G47、S43、R257或G259处包括高螺旋倾向性氨基酸(例如丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸)的氨基酸取代。在一些方面，本文进一步提供了包含SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：294、SEQ IDNO：295或SEQ ID NO：296的氨基酸序列的T7 RNA聚合酶，该氨基酸序列经修饰以在位置G47、S43、R257或G259处包括高螺旋倾向性氨基酸(例如丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸)的氨基酸取代。
在一些实施方案中，本公开的T7 RNA聚合酶包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的T7 RNA聚合酶包含SEQID NO：107或108、SEQ ID NO：109或110、SEQ ID NO：111或112，或SEQ ID NO：113或114的氨基酸序列。
在一些实施方案中，T7 RNA聚合酶包含至少一个额外的C末端氨基酸。在一些实施方案中，T7 RNA聚合酶包含至少两个额外的C末端氨基酸。
在一些实施方案中，至少两个额外的C末端氨基酸包含相同类型的氨基酸(例如，均为Gly、均为Ala)。在一些实施方案中，至少两个额外的C末端氨基酸包括至少两种不同类型的氨基酸(例如，GlyAla、AlaGly)。
在一些实施方案中，T7 RNA聚合酶包含至少三个额外的C末端氨基酸。在一些实施方案中，至少三个额外的C末端氨基酸包括至少两个或至少三个相同类型或不同类型的氨基酸(例如，GlyGlyGly、AlaAlaAla)。
在一些实施方案中，T7 RNA聚合酶包含1至10个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)额外的C末端氨基酸。在一些实施方案中，T7 RNA聚合酶包含1至5个额外的C末端氨基酸。
在一些实施方案中，T7 RNA聚合酶包含C末端，所述C末端包含FAFAXn基序，其中X是任何氨基酸并且n是大于零的任何整数。在一些实施方案中，X是甘氨酸(G)。在一些实施方案中，n是1、2、3、4或5。应理解，在其中n大于1，使得C末端基序是例如FAFXX、FAFAXXX、FAFAXXXX或FAFAXXXXX的实施方案中，X’可以是相同的氨基酸或者它们可以是不同的氨基酸。例如，C末端基序可以是FAFAGG或FAFAGGG，或者C末端基序可以是FAFAGA、FAFAGC、FAFAGAA、FAFAGAG、FAFAGAC等。可以使用其他C末端氨基酸组合。
在一些实施方案中，T7 RNA聚合酶包含C末端，所述C末端包含FAFAG基序。
在一些实施方案中，T7 RNA聚合酶包含XAFAXn基序、FXFAXn基序、FAXAXn基序或FAFXXn基序，其中每个X是任何氨基酸，并且n是大于零的任何整数。因此，本公开包含各种C末端F880A881F882A883基序，其中在位置880、881、882或883(例如相对于野生型T7 RNAP，例如SEQ ID NO：1)中的一个或多个处的氨基酸经修饰以包括至少一个氨基酸取代，具有或不具有额外的C末端氨基酸(Xn)。
在一些方面，本公开提供了RNA聚合酶，其相对于对应的野生型RNA聚合酶包含至少一个额外的C末端氨基酸。在一些实施方案中，RNA聚合酶选自T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶。
在一些实施方案中，RNA聚合酶进一步包含至少一个额外的氨基酸取代。在一些实施方案中，RNA聚合酶进一步包含对应于选自G47A、S43A、R257A和G259A的SEQ ID NO：1的氨基酸取代的氨基酸取代。
在一些实施方案中，RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶，其包含与SEQ ID NO：1至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，所述氨基酸序列经修饰以在位置43±1(例如42、43或44)、47±1(例如46、47或48)、257±1(例如256、257或258)和/或259±1(例如258、259或260)处包含氨基酸取代，任选地其中氨基酸取代是丙氨酸(A)。在一些实施方案中，RNA聚合酶是T3 RNA聚合酶，其包含与SEQ ID NO：6至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列，所述氨基酸序列经修饰以在对应于野生型T7 RNA聚合酶位置43±1、47±1、257±1和/或259±1的位置处包含氨基酸取代(基于序列或结构比对)，任选地其中氨基酸取代是丙氨酸(A)。在一些实施方案中，RNA聚合酶是SP6 RNA聚合酶，其包含与SEQ ID NO：7至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，所述氨基酸序列经修饰以在对应于野生型T7 RNA聚合酶位置43±1、47±1、257±1和/或259±1的位置处包含氨基酸取代(基于序列或结构比对)，任选地其中氨基酸取代是丙氨酸(A)。
本公开的一些方面提供了T7 RNA聚合酶，其包含与SEQ ID NO：1至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列，所述氨基酸序列经修饰以在位置43、47、257和/或259的位置处包含氨基酸取代，任选地其中氨基酸取代是丙氨酸(A)。
本公开的其他方面提供了T3 RNA聚合酶，其包含与SEQ ID NO：6至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列，所述氨基酸序列经修饰以在对应于野生型T7 RNA聚合酶位置43、47、257和/或259的位置处包含氨基酸取代，任选地其中氨基酸取代是丙氨酸(A)。因此，在一些实施方案中，T3 RNA聚合酶包含与SEQ ID NO：6至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列，所述氨基酸序列经修饰以在位置44、48、258和/或260位置处包含氨基酸取代，任选地其中氨基酸取代是丙氨酸(A)。
本公开的又其他方面提供了SP6 RNA聚合酶，其包含与SEQ ID NO：7至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列，所述氨基酸序列经修饰以在对应于野生型T7 RNA聚合酶位置43、47、257和/或259的位置处包含氨基酸取代，任选地其中氨基酸取代是丙氨酸(A)。因此，在一些实施方案中，SP6 TNA聚合酶包含与SEQ ID NO：7至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列，所述氨基酸序列经修饰以在位置15、19、230和/或232位置处包含氨基酸取代，任选地其中氨基酸取代是丙氨酸(A)。
本公开还提供了产生RNA的方法，这些方法包括使DNA模板与如本文所述的RNA聚合酶变体在导致产生RNA转录物的条件下(例如，在IVT条件下)接触。
本公开进一步提供了进行IVT反应的方法，其包括使DNA模板与如本文所提供的RNA聚合酶变体在存在三磷酸核苷(NTP)和缓冲液的情况下在导致产生RNA转录物的条件下接触。
在一些实施方案中，所产生的RNA转录物，在任选地以未纯化形式递送至细胞中时，刺激相对于使用野生型RNA聚合酶在相同IVT条件下所产生的RNA低至少50％(例如至少60％、至少70％、至少80％、至少95％或至少98％)的细胞因子应答。
在一些实施方案中，通过IVT产生的dsRNA转录物的浓度相对于使用野生型聚合酶产生的dsRNA转录物低至少50％(例如，至少60％、至少70％、至少80％、至少95％或至少98％)。
在一些实施方案中，少于20％(例如，少于15％、少于10％、少于5％)的产生的RNA转录物展现出3’异质性。
在一些实施方案中，少于50％(例如，少于40％、少于30％、少于20％、少于10％)的产生的RNA转录物是截短RNA转录物。
在一些实施方案中，少于50％(例如，少于40％、少于30％、少于20％、少于10％)的产生的RNA转录物是连缀RNA转录物。
在一些实施方式中，所产生的全长RNA转录物的量比DNA模板的量大至少15倍。
在一些实施方案中，所产生的截短RNA转录物∶全长RNA转录物的比率小于1∶1。
在一些实施方案中，所产生的RNA转录物相对于DNA模板每100个核苷酸具有少于1个突变。
本公开在一些方面提供了编码RNA聚合酶变体的核酸，并且在一些实施方案中提供了包含核酸的载体(例如，质粒)和/或宿主细胞(例如，哺乳动物细胞，例如人细胞)。
还提供了通过本公开的方法产生的RNA转录物。在一些实施方案中，将RNA转录物(例如mRNA)配制在脂质纳米颗粒中。脂质纳米颗粒可以包含例如20％-60％可电离氨基脂质、5％-25％非阳离子脂质、25％-55％固醇和0.5％-15％PEG修饰的脂质的摩尔比。参见例如2017年4月27日公布的WO 2017/070624，其通过引用并入本文。
本文涵盖了包含RNA聚合酶变体的其他组合物和试剂盒。
本文还提供了用于核糖核酸(RNA)合成的共转录加帽方法，所述方法包括使多核苷酸模板与T7 RNA聚合酶变体、三磷酸核苷，以及帽类似物在体外转录反应条件下反应以产生RNA转录物。
在一些实施方案中，大于80％、大于85％或大于90％的所产生的RNA转录物包括功能性帽。在一些实施方案中，大于95％的所产生的RNA转录物包括功能性帽。
在一些实施方案中，三磷酸核苷包括未修饰或修饰的ATP、修饰或未修饰的UTP、修饰或未修饰的GTP，和/或修饰或未修饰的CTP。
在一些实施方案中，T7聚合酶变体包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列(或与SEQ IDNO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列)，所述氨基酸序列经修饰以在选自E42、S43、Y44、E45、M46、G47、A255、R257和G259的位置处包含高倾向氨基酸的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，T7聚合酶变体包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列(或与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列)，所述氨基酸序列经修饰以包含G47A的氨基酸取代。在一些实施方案中，T7聚合酶变体包含SEQ IDNO：1的氨基酸序列(或与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列)，所述氨基酸序列经修饰以包含S43A的氨基酸取代。
在一些实施方案中，T7聚合酶变体包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列(或与SEQ IDNO：99共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列)，所述氨基酸序列经修饰以在选自E42、S43、Y44、E45、M46、G47、A255、R257和G259的位置处包含高倾向氨基酸的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，T7聚合酶变体包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列(或与SEQ ID NO：99共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列)，所述氨基酸序列经修饰以包含G47A的氨基酸取代。在一些实施方案中，T7聚合酶变体包含SEQ IDNO：99的氨基酸序列(或与SEQ ID NO：99共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列)，所述氨基酸序列经修饰以包含S43A的氨基酸取代。
在一些实施方案中，T7聚合酶变体包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列(或与SEQ IDNO：100共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列)，所述氨基酸序列经修饰以在选自E42、S43、Y44、E45、M46、G47、A255、R257和G259的位置处包含高倾向氨基酸的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，T7聚合酶变体包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列(或与SEQ ID NO：100共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列)，所述氨基酸序列经修饰以包含G47A的氨基酸取代。在一些实施方案中，T7聚合酶变体包含SEQID NO：100的氨基酸序列(或与SEQ ID NO：100共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列)，所述氨基酸序列经修饰以包含S43A的氨基酸取代。
在一些实施方案中，三磷酸核苷和帽类似物以等摩尔浓度存在于所述反应中。在一些实施方案中，在反应中帽类似物与三磷酸核苷的摩尔比大于1∶1。在一些实施方案中，在反应中帽类似物与三磷酸核苷的摩尔比小于1∶1。
在一些实施方案中，所述帽类似物是二核苷酸帽、三核苷酸帽或四核苷酸帽。在一些实施方案中，所述帽类似物是三核苷酸帽。
在一些实施方案中，所述三核苷酸帽包含选自以下序列的序列：GAA、GAC、GAG、GAU、GCA、GCC、GCG、GCU、GGA、GGC、GGG、GGU、GUA、GUC、GUG和GUU。
在一些实施方案中，所述三核苷酸帽包含选自以下序列的序列：m7GpppApA、m7GpppApC、m7GpppApG、m7GpppApU、m7GpppCpA、m7GpppCpC、m7GpppCpG、m7GpppCpU、m7GpppGpA、m7GpppGpC、m7GpppGpG、m7GpppGpU、m7GpppUpA、m7GpppUpC、m7GpppUpG，和m7GpppUpU。
在一些实施方案中，所述三核苷酸帽包含选自以下序列的序列：m7G3′OMepppApA、m7G3′OMepppApC、m7G3′OMepppApG、m7G3′OMepppApU、m7G3′OMepppCpA、m7G3′OMepppCpC、m7G3′ OMepppCpG、m7G3′oMepppCpU、m7G3′OMepppGpA、m7G3′OMepppGpC、m7G3′OMepppGpG、m7G3′OMepppGpU、m7G3′OMepppUpA、m7G3′OMepppUpC、m7G3′OMepppUpG，以及m7G3′OMepppUpU。
在一些实施方案中，所述三核苷酸帽包含选自以下序列的序列：m7G3′OMepppA2′ OMepA、m7G3′OMepppA2′OMepC、m7G3′OMepppA2′OMepG、m7G3′OMepppA2′OMepU、m7G3′OMepppC2′OMepA、m7G3′ OMepppC2′OMepC、m7G3′OMepppC2′OMepG、m7G3′OMepppC2′OMepU、m7G3′OMepppG2′OMepA、m7G3′OMepppG2′ OMepC、m7G3′OMepppG2′OMepG、m7G3′OMepppG2′OMepU、m7G3′OMepppU2′OMepA、m7G3′OMepppU2′OMepC、m7G3′ OMepppU2′OMepG，和m7G3′OMepppU2′OMepU。
在一些实施方案中，所述三核苷酸帽包含选自以下序列的序列：m7GpppA2′OMepA、m7GpppA2′OMepC、m7GpppA2′OMepG、m7GpppA2′OMepU、m7GpppC2′OMepA、m7GpppC2′OMepC、m7GpppC2′ OMepG、m7GpppC2′OMepU、m7GpppG2′OMepA、m7GpppG2′OMepC、m7GpppG2′OMepG、m7GpppG2′OMepU、m7GpppU2′OMepA、m7GpppU2′OMepC、m7GpppU2′OMepG，和m7GpppU2′OMepU。
在一些实施方案中，所述三核苷酸帽包含选自以下序列的序列：GAG、GCG、GUG和GGG。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含序列GAG。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppA2′OmepG。
在一些实施方案中，多核苷酸模板在模板位置+1处包含2′-脱氧胸苷残基。在一些实施方案中，多核苷酸模板在模板位置+1处包含2′-脱氧胞苷残基。在一些实施方案中，多核苷酸模板在模板位置+1处包含2′-脱氧腺苷残基。在一些实施方案中，多核苷酸模板在模板位置+1处包含2′-脱氧鸟苷残基。
本文还提供了用于RNA合成的共转录加帽方法，所述方法包括使多核苷酸模板与以下各项在体外转录反应条件下反应以产生RNA转录物：(a)T7 RNA聚合酶变体，其相对于野生型RNA聚合酶包含至少一个氨基酸取代，所述至少一个氨基酸取代导致所述RNA聚合酶变体的至少一个环结构随着所述RNA聚合酶变体从起始复合物转变成延伸复合物经历向螺旋结构的构象变化；(b)三磷酸核苷；和(c)三核苷酸帽，其包含序列GpppA2′OmepG，其中所述多核苷酸模板在模板位置+1处包含2′-脱氧胸苷残基。
在一些实施方案中，所产生的RNA转录物在任选地以未纯化形式递送至细胞中时，不会刺激可检测的细胞因子应答。
本文进一步提供了组合物，其包含体外转录的(IVT)RNA和药学上可接受的赋形剂，其中所述组合物在不存在IVT后纯化的情况下基本上不含细胞因子诱导的RNA污染物。
在一些实施方案中，组合物包含IVT RNA和药学上可接受的赋形剂，其中所述组合物具有少于5％未加帽的RNA类别。
在一些实施方案中，IVT RNA的大于80％、85％或90％包含功能性帽。在一些实施方案中，IVT RNA的大于95％包含功能性帽。
在一些实施方案中，IVT RNA未经化学修饰。在其他实施方案中，IVT RNA经化学修饰。
在一些实施方案中，IVT RNA的大于95％包含单链全长转录物。
在一些实施方案中，所述RNA通过包括以下的方法产生：使多核苷酸模板与以下各项在体外转录反应条件下反应以产生RNA转录物：(a)T7 RNA聚合酶变体，其相对于野生型RNA聚合酶包含至少一个氨基酸取代，所述至少一个氨基酸取代导致所述RNA聚合酶变体的至少一个环结构随着所述RNA聚合酶变体从起始复合物转变成延伸复合物经历向螺旋结构的构象变化；(b)三磷酸核苷；和(c)三核苷酸帽，其包含序列GpppA2′OmepG，其中所述多核苷酸模板在模板位置+1处包含2′-脱氧胸苷残基。
在一些方面，本公开提供了T7 RNAP变体，其包含SEQ ID NO：294-313的氨基酸序列，其中x是任何氨基酸并且n是任何整数，例如在1与5之间的整数(例如1、2、3、4或5)。
在一些方面，本公开提供一种进行IVT反应的方法，其包括使DNA模板与本公开的RNA聚合酶变体在存在三磷酸核苷和缓冲液的情况下在导致产生RNA转录物的条件下接触。在一些实施方案中，所产生的RNA，在任选地以未纯化形式递送至细胞中时，刺激相对于使用WT所产生的dsRNA转录物低至少50％的细胞因子应答。在一些实施方案中，通过IVT反应产生的RNA转录物的少于30％展现出3′异质性。
附图说明
图1示出了使用野生型(WT)T7聚合酶或T7聚合酶变体G47A*(具有C末端G)和S43A*(具有C末端G)生成的人促红细胞生成素(hEPO)mRNA在260nm处的HPLC色谱图。
图2左图示出了描绘以下的图：在有或没有反相(RP)纯化的情况下，经使用WT T7RNA聚合酶或T7 RNA聚合酶变体S43A*(具有C末端G)或G47A*(具有C末端G)中的一种产生的未经化学修饰的hEPO RNA转录物转染的BJ成纤维细胞中的IFNβ应答。图2右图示出了描绘转染细胞中hEPO表达的图。
图3上图示出了描绘以下的图：在有或没有反相(RP)纯化的情况下，经使用WT T7RNA聚合酶或T7 RNA聚合酶变体S43A*(具有C末端G)或G47A*(具有C末端G)中的一种产生的经化学修饰的hEPO RNA转录物转染(N1-甲基假尿嘧啶(m1ψ)修饰)的BJ成纤维细胞中的IFNβ应答。图3下图示出了描绘以下的图：在有或没有反相(RP)纯化的情况下，经使用WT T7RNA聚合酶或T7 RNA聚合酶变体S43A*(具有C末端G)或G47A*(具有C末端G)中的一种产生的经化学修饰的hEPO RNA转录物转染(5-甲氧基-鸟苷(mo5U)修饰)的细胞中的IFNβ应答。
图4上图和下图示出了描绘经用于图3的hEPO RNA转录物转染的细胞中hEPO表达的图。N1-甲基假尿嘧啶(m1ψ)修饰的hEPO表达示于上图中，而5-甲氧基-尿苷(mo5U)修饰的hEPO表达示于下图中。
图5示出了经使用WT T7 RNA聚合酶或T7 RNA聚合酶变体S43A*(具有C末端G)或G47A*(具有C末端G)产生的未经化学修饰的hEPO RNA转录物转染的单核细胞衍生的巨噬细胞中的IP10应答的图。
图6上图示出了经使用WT T7 RNA聚合酶或T7 RNA聚合酶变体S43A*(具有C末端G)或G47A*(具有C末端G)产生的经化学修饰(N1-甲基假尿嘧啶(m1ψ))的hEPO RNA转录物转染的单核细胞衍生的巨噬细胞中的IP10应答的图。图6下图示出了经使用WT T7 RNA聚合酶或T7 RNA聚合酶变体S43A*(具有C末端G)或G47A*(具有C末端G)产生的经化学修饰(5-甲氧基-尿苷(mo5U))的hEPO RNA转录物转染的单核细胞衍生的巨噬细胞中的IP10应答的图。
图7示出了描绘使用具有1μg未经化学修饰的hEPO RNA转录物(左侧)或5μg未经化学修饰的hEPO RNA转录物的dsRNA ELISA检测的污染性双链(ds)RNA的浓度的图，所述转录物经由IVT反应，使用WT T7 RNA聚合酶或T7 RNA聚合酶变体S43A*(具有C末端G)或G47A*(具有C末端G)产生。
图8示出了描绘使用具有经化学修饰的hEPO RNA转录物(N1-甲基假尿嘧啶(m1ψ)修饰，上部；5-甲氧基-尿苷(mo5U)修饰，下部)的dsRNA ELISA检测的污染性dsRNA的浓度的图。
图9A-9B示出了使用WT T7 RNA聚合酶或T7 RNA聚合酶变体S43A*(具有C末端G)或G47A*(具有C末端G)产生的hEPO RNA转录物的RNA酶T1尾部消化的质量色谱图结果。图9A示出了来自LCMS分析的结果。图9B示出了来自图9A的3’末端群体分布的定量。
图10示出了随着T7 RNA聚合酶从起始复合物转变为延伸复合物，C螺旋和C接头环结构将构象变化成C螺旋和C环螺旋结构的示意图。图10由PDB晶体结构1MSW和1QLN生成，并且在分子操作环境[Chemical Computing Group ULC]中绘制。
图11A示出了在存在连接酶的情况下使用DNA夹板将通过IVT产生的“左聚体”RNA转录物连接到“右聚体”荧光标记的polyA信号的示意图。即使在连接位点处悬挂核苷酸也有效消除连接。图11B是PAGE-D凝胶，其示出了使用WT T7 RNA聚合酶和T7 RNA聚合酶变体G47A*(具有C末端G)或S43A*(具有C末端G)产生的右聚体的连接效率。
图12示出了使用32P-GTP标记流产性转录物或使用32P-CTP标记反向补体的放射性凝胶。使用短模型转录物进行IVT。此数据证明T7 RNA聚合酶变体S43A*(具有C末端G)和G47A*(具有C末端G)减少了反向补体形成。
图13是经由体外转录产生加帽mRNA的常规方法的示意图。
图14A-14E是示出了使用本公开的野生型T7 RNA聚合酶或T7RNA聚合酶变体(G47A*)的共转录加帽测定的结果的图。图14A示出了二核苷酸-(牛痘帽1)或三核苷酸-(GAG或GmAG)帽的实例。将三核苷酸帽用于共转录帽测定中。图14B示出了共转录加帽测定的mRNA产量。图14C示出了在共转录加帽测定中产生的mRNA具有高完整性。图14D示出了由WT T7 RNA聚合酶产生的加帽mRNA在BJ成纤维细胞中诱导了细胞因子产生，而由T7 RNA聚合酶变体G47A*(具有C末端G)产生的加帽mRNA令人惊讶地没有诱导细胞因子产生。图14E示出了由WT T7 RNA聚合酶产生的加帽mRNA在BJ成纤维细胞中不表达编码蛋白(hEPO)，而由T7 RNA聚合酶变体G47A*(具有C末端G)产生的加帽mRNA导致与对照相当的hEPO表达水平。对照是由WT T7 RNA聚合酶产生并用牛痘帽1加帽的mRNA。
图15示出了在共转录加帽测定中产生的mRNA的LC-质谱分析结果。结果出乎意料地显示，T7 RNA聚合酶变体G47A*(具有C末端G)比WT T7 RNA聚合酶产生更纯净的mRNA。两种酶的三核苷酸掺入率似乎相等。
图16A和16B是比较经产生并且在共转录加帽测定中用GAG三核苷酸加帽或在标准加帽测定中用牛痘帽1加帽的mRNA的细胞因子应答(图16A)或表达(图16B)的图。
图17是示出了使用T7 RNA聚合酶变体G47A*和三核苷酸帽m7GpppA2′OmepG的本文所述的共转录加帽测定的示意图。
图18A和18B是液相色谱-质谱(LCMS)结果，其示出了以5'ATP或5’GTP开始的mRNA的加帽效率比较。图18A示出了完整mRNA的分析。图18B示出了被RNA酶H切割的mRNA的5’末端的分析。
图19A-19C是示出了针对三种模型构建体(hEPO、荧光素酶和eGFP)，被由PCR片段模板产生的1-甲基-伪尿苷化学修饰的mRNA的分析的图。图19A显示，mRNA具有相同的序列，如通过RNA酶T1指纹测定所分析。图19B显示mRNA具有高完整度。图19C显示，mRNA在BJ成纤维细胞中不诱导细胞因子应答。
图20A-20F是示出了针对三种模型构建体(hEPO、Luc和eGFP)，被由质粒模板产生的1-甲基-伪尿苷化学修饰的mRNA的分析的图。示出了使用hEPO质粒(图20A)或eGFP质粒(图20B)作为模板的共转录加帽测定中的NTP消耗。图20C显示mRNA产物具有高完整度。图20D示出了mRNA产物的细胞因子应答。图20E示出了在BJ成纤维细胞中编码hEPO的mRNA的表达。图20F示出了在BJ成纤维细胞中编码荧光素酶(Luc)的mRNA的表达。图20G示出了在BJ成纤维细胞中编码eGFP的mRNA的表达。
图21是显示使用包含C末端甘氨酸(G)的T7 RNAP变体G47A*产生的大于85％(例如，约90％)的mRNA转录物在3′末端处具有羟基的图。
图22示出了来自含有WT或G47A T7 RNAP变体的IVT反应的未修饰的hEPO mRNA产量，其中一些在C末端具有额外的氨基酸(例如，一个或两个甘氨酸，或两个丙氨酸)。
图23示出了来自含有如所指示的WT、G47A或S43A/G47A T7 RNAP变体的IVT反应的1-甲基-假尿苷修饰的hEPO mRNA产量，其中一些在C末端具有额外的氨基酸(例如，一个或两个甘氨酸，或两个丙氨酸)。
图24A-24D示出了使用如所指示的WT、G47A或S43A/G47A T7 RNAP变体产生的hEPOmRNA转录产物的RNA抑制酶T1尾部消化的结果，其中一些变体在C末端处具有额外氨基酸(例如，一个或两个甘氨酸或两个丙氨酸)。图24A示出了在等摩尔浓度的NTP下使用WT T7RNAP(WT EQ)、在过量的GTP和ATP下使用WT T7 RNAP(WTα)或在等摩尔浓度的NTP下使用具有额外C末端甘氨酸的G47A* T7 RNAP(G47A* EQ)的IVT反应产生的hEPO mRNA的LCMS分析结果。图24B示出了来自图24A的3’末端群体分布的定量。图24C示出了在IVT反应中使用未修饰的mRNA产生的纯净3′末端群体的百分比。图24D示出了在IVT反应中使用1-甲基-假尿苷修饰的mRNA产生的纯净3′末端群体的百分比。
图25A-25B是比较BJ成纤维细胞对由IVT反应产生的未修饰的(图25A)和1-甲基-伪尿苷修饰的(图25B)mRNA的细胞因子应答的图，所述IVT反应含有如所指示的WT、G47A或S43A/G47A T7 RNAP变体，其中一些变体在C末端具有取代。
图26A-26B示出了由IVT反应产生的放射性标记的mRNA，所述IVT反应含有如所指示的WT或G47A T7 RNAP变体，其中一些变体在C末端具有额外的氨基酸。IVT mRNA产物在聚丙烯酰胺变性凝胶上按大小分离。在图26A中，未修饰的或1-甲基-伪尿苷修饰的mRNA用32P-CTP放射性标记。在图26B中，反向补体mRNA用32P-CTP放射性标记。
图27A和27B示出了数据图，表明在第1天(图27A)和第29天(图27B)，编码萤火虫荧光素酶(ffLuc)的三核苷酸加帽的G47A* mRNA在体内诱导类似于mRNA对照的IP-10血清细胞因子水平。
图28A和28B示出了数据图，表明编码ffLuc的三核苷酸加帽的G47A* mRNA在BJ成纤维细胞(BJF)(图28A)和单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)(图28B)中，在体外诱导类似于mRNA对照的基线细胞因子水平。
图29示出了数据图，表明在六(6)周剂量之后，编码ffluc的三核苷酸加帽的G47A*mRNA在体内保持高表达。
图30示出了数据图，表明在六(6)周剂量之后，编码ffLuc的三核苷酸加帽的G47A*mRNA诱导低抗PEG IgM水平。
图31示出了数据图，表明编码ffLuc的三核苷酸加帽的G47A* mRNA展现出类似于mRNA对照的低B细胞活化。
图32A和32B示出了数据图，表明在第1天(图32A)和第22天(图32B)，编码人促红细胞生成素(hEPO)的三核苷酸加帽的G47A* mRNA在体内诱导类似于mRNA对照的IP-10血清细胞因子水平。
图33A和33B示出了数据图，表明编码hEPO的三核苷酸加帽的G47A* mRNA在BJ成纤维细胞(BJF)(图33A)和单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)(图33B)中，在体外诱导类似于mRNA对照的基线细胞因子水平。
图34示出了数据图，表明在六(6)周剂量之后，编码hEPO的三核苷酸加帽的G47A*mRNA在体内保持高表达。
图35示出了数据图，表明在六(6)周剂量之后，编码hEPO的三核苷酸加帽的G47A*mRNA诱导低抗PEG IgM水平。
图36示出了数据图，表明编码hEPO的三核苷酸加帽的G47A* mRNA展现出类似于mRNA对照的低B细胞活化。
图37A和37B显示G47A* T7 RNA聚合酶变体不影响插入缺失频率(图37A)或点突变频率(图37B)。
具体实施方式
本公开提供了RNA聚合酶(RNAP)变体，其增加了转录效率和3’同质性，同时减少了例如在体外转录(IVT)反应期间产生的连缀转录物和/或双链污染物的数量。这些RNAP变体(在一些实施方案中，包括单氨基酸取代)促进了RNAP构象从起始复合物向延伸复合物的转变，从而减少了与转录起始阶段有关的许多问题。
本文提供了出乎意料的实验结果，这些结果表明DNA依赖性RNA聚合酶(例如T7RNA聚合酶)的一个或多个N末端C螺旋和/或C接头结构的一个或多个修饰驱动聚合酶向延伸复合物的构象平衡，从而促进DNA模板启动子的释放和高度持续性延伸阶段的开始。令人惊讶的是，在IVT反应中使用本文提供的聚合酶变体减少了产生的转录物之间的3’异质性，并且还减少了(或消除了)双链污染物的产生。此外，结果显示，使用聚合酶变体产生的转录物的纯度和表达水平与使用野生型聚合酶产生的转录物的纯度和表达水平相当。
因此，使用本公开的RNA聚合酶变体减少了与IVT反应产物相关的许多问题。尽管野生型T7 RNA聚合酶(RNAP)普遍用于工业界和学术界中，但其某些活性明显损害了所得RNA转录物的纯度。特别地，使用这种野生型T7 RNAP酶导致将核苷酸非模板化添加到RNA转录物的3′末端。例如，野生型T7 RNAP在3’末端安装至少1个，和通常2个或更多个非模板化核苷酸，这些非模板化核苷酸似乎对核碱基同一性的偏好很小。令人惊讶的是，本文提供的T7 RNAP变体减少了3’异质性的出现。在一些实施方案中，使用本公开的RNA聚合酶变体通过IVT产生的RNA转录物的少于30％展现出3’异质性。在一些实施方案中，使用本公开的RNA聚合酶变体通过IVT产生的RNA转录物的少于20％(例如，少于15％、10％或5％)展现出3’异质性。在一些实施方案中，通过IVT产生的RNA转录物的1-20％、1-15％、1-10％或1-5％展现出3’异质性。在一些实施方案中，使用本公开的RNA聚合酶变体通过IVT产生的RNA转录物的少于1％展现出3’异质性。
因此，例如在IVT反应中使用本公开的RNA聚合酶变体导致产生‘更纯净的’RNA转录物(在3’末端具有降低的异质性/增加的同质性的RNA转录物群体)。在一些实施方案中，使用本公开的RNA聚合酶变体产生的RNA转录物的至少70％展现出3’同质性。在一些实施方案中，使用本公开的RNA聚合酶变体产生的RNA转录物的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，或至少95％展现出3’同质性。在一些实施方案中，使用本公开的RNA聚合酶变体产生的RNA转录物的至少90％展现出3’同质性。在一些实施方案中，使用本公开的RNA聚合酶变体产生的RNA转录物的至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或至少99％展现出3’同质性。
另外，本文令人惊讶的是表明以下的结果：使用氨基酸取代(例如，SEQ ID NO：1的S43A和/或G47A)或C末端添加(例如，WT、具有一个或多个氨基酸添加的S43A*和/或G47A*)T7RNA聚合酶变体产生的RNA转录物在任选地以未纯化形式(例如，未通过反相色谱纯化)递送到细胞中时刺激相对于使用野生型RNA聚合酶产生的RNA更低的细胞因子应答。在一些实施方案中，已接受使用本公开的T7 RNA变体聚合酶产生的RNA转录物的细胞中不存在可检测的细胞因子应答。在一些实施方案中，使用RNA聚合酶变体(例如，T7RNAP S43A*变体和/或T7 RNAP G47A*变体)产生的RNA刺激相对于使用野生型RNA聚合酶产生的RNA低至少50％(例如，55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％)的细胞因子应答。在一些实施方案中，使用RNA聚合酶变体(例如，T7 RNAP S43A*变体和/或T7 RNAP G47A*变体)产生的RNA刺激相对于使用野生型RNA聚合酶产生的RNA低50％-60％、50％-70％、50％-80％、50％-90％、50％-100％、60％-70％、60％-80％、60％-90％、60％-100％、70％-80％、70％-90％、70％-100％、80％-90％、80％-100％或90％-100％的细胞因子应答。在一些实施方案中，使用RNA聚合酶变体(例如，T7 RNAP S43A*变体和/或T7 RNAP G47A*变体)产生的RNA刺激相对于使用野生型RNA聚合酶产生的RNA低至少2倍、3倍、4倍或5倍的细胞因子应答。在一些实施方案中，用于测试细胞因子应答的细胞是人成纤维细胞(例如，BJ(
Figure BDA0002448127370000241
CRL-2522TM)细胞)。在一些实施方案中，用于测试细胞因子应答的细胞是单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)。
在一些实施方案中，使用RNA聚合酶变体产生的dsRNA转录物的浓度相对于使用野生型聚合酶产生的dsRNA转录物低至少50％(例如，55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％)。在一些实施方案中，产生的dsRNA转录物的浓度相对于使用野生型聚合酶产生的dsRNA转录物低50％-60％、50％-70％、50％-80％、50％-90％、50％-100％、60％-70％、60％-80％、60％-90％、60％-100％、70％-80％、70％-90％、70％-100％、80％-90％、80％-100％或90％-100％。在一些实施方案中，产生的dsRNA转录物的浓度相对于使用野生型聚合酶产生的dsRNA转录物低至少2倍、3倍、4倍或5倍。
使用本公开的RNA聚合酶变体还出乎意料地导致产生双链污染物和较少的连缀转录物。
在一些实施方案中，例如通过IVT使用RNA聚合酶变体产生的RNA转录物的少于50％(例如少于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％)是双链污染物。在一些实施方案中，产生的RNA转录物的1％-50％、1％-40％、1％-30％、1％-20％、1％-10％、1％-5％、5％-50％、5％-40％、5％-30％、5％-20％、5％-10％、10％-50％、10％-40％、10％-30％或10％-20％是双链污染物。
在一些实施方案中，使用RNA聚合酶变体产生的RNA转录物的少于50％(例如少于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％)是连缀RNA转录物。在一些实施方案中，产生的RNA转录物的1-50％、1-40％、1-30％、1-20％、1-10％、1-5％、5-50％、5-40％、5-30％、5-20％、5-10％、10-50％、10-40％、10-30％或10-20％是连缀RNA转录物。
在一些实施方式中，使用RNA聚合酶变体产生的全长RNA转录物的量比DNA模板的量大至少15倍。例如，所产生的全长RNA转录物的量可以比DNA模板的量大至少20、30、40、45、50、60、70、80、90或100倍。在一些实施方案中，所产生的全长RNA转录物的量比DNA模板的量大15-100、15-90、15-80、15-70、15-60、15-50、15-40、15-30、15-20、20-100、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40或20-30倍。在一些实施方式中，所产生的全长RNA转录物的量比DNA模板的量大2倍、3倍、4倍或5倍。
在一些实施方案中，使用RNA聚合酶变体产生的双链污染物∶全长RNA转录物的比率小于1∶1。例如，所产生的双链污染物∶全长RNA转录物的比率可以是0.9∶1、0.8∶1、0.7∶1、0.6∶1、0.5∶1、0.4∶1、0.3∶1、0.2∶1或0.1∶1。
在一些实施方案中，使用RNA聚合酶变体产生的RNA转录物相对于DNA模板每100个核苷酸具有少于1个突变。例如，相对于DNA模板，所产生的RNA转录物每200、300、400、500、600、700、800、900或1000个核苷酸可以具有少于1个突变。
RNA聚合酶
RNA聚合酶(DNA依赖性RNA聚合酶)是催化将核糖核苷酸依序添加到生长RNA链的3’末端(RNA沿5′→3′方向的转录)的酶，其中三磷酸核苷(NTP)充当酶的底物，并且核苷酸序列由DNA模板指定。转录依赖于碱基的互补配对。双螺旋的两条链局部分开，并且一条分开的链充当模板(DNA模板)。RNA聚合酶然后通过模板中其互补碱基催化DNA模板上的游离核苷酸的对准。因此，如果RNA聚合酶催化将核糖核苷酸依序添加到生长RNA链的3’末端，则该聚合酶被认为具有RNA聚合酶活性。
T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)是由噬菌体T7基因组编码的99kDa DNA依赖性RNA聚合酶，并且对T7噬菌体启动子具有高度特异性。T7 RNAP的结构研究显示，N末端结构域的构象在转录的起始阶段与延伸阶段之间显著变化。N末端结构域包含C螺旋子结构域和启动子结合结构域，包括由子结构域H分隔的两个片段。启动子结合结构域和结合的启动子在合成8-nt RNA转录物后旋转约45度，从而允许在扩展活性位点以容纳生长的异源双链体的同时保持启动子接触。C螺旋子结构域适度地向其延伸构象移动，而子结构域H保留在其起始而非延伸阶段位置，距离超过70埃。T7 RNAP起始和延伸复合物的结构比较揭示，N末端267个残基(N末端结构域)内构象变化很大，而RNAP的其余部分几乎没有变化。启动子结合域的刚体旋转以及N末端C螺旋(残基28-71)和H(残基151-190)子结构域的重折叠负责消除启动子结合位点，扩大了活性位点并且为RNA转录物创建出口通道。N末端结构域内的结构变化解释了延伸复合物的稳定性和连续性提高(参见例如Durniak，K.J.等人，Science 322(5901)：553-557，2008，其通过引用并入本文)。
本文在某些方面提供了RNA聚合酶变体(例如，T7 RNAP变体)，其促进从RNAP起始复合物向RNA延伸复合物的构象变化。RNA聚合酶变体是具有RNA聚合酶活性并且相对于对应的野生型RNA聚合酶具有至少一个取代的酶。如上文所指示，如果RNA聚合酶催化将核糖核苷酸依序添加到生长RNA链的3’末端，则该聚合酶被认为具有RNA聚合酶活性。例如，包含在位置S43(例如S43A)或G47(例如G47A)处具有氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO：1并且保持RNA聚合酶活性的酶被认为是野生型T7 RNAP(SEQ ID NO：1)的T7 RNAP变体。
在一些实施方案中，RNA聚合酶变体相对于野生型RNA聚合酶包含至少一个氨基酸取代，所述至少一个氨基酸取代导致所述RNA聚合酶变体的至少一个三维环结构随着所述RNA聚合酶变体从起始复合物转变成延伸复合物经历向螺旋结构的构象变化。因此，在一些实施方案中，相对于野生型氨基酸，至少一个氨基酸修饰具有高螺旋倾向性。
环结构的实例包括但不限于T7 RNA聚合酶起始复合物(IC)构象的C螺旋结构中的氨基酸(aa)42-47(例如SEQ ID NO：1的aa 28-71)和IC的C接头结构中的aa 257-262(例如，SEQ ID NO：1的aa 258-266)。
本文还提供了RNA聚合酶变体(例如，T7 RNAP变体)，其在C末端处包括至少一个额外氨基酸。在一些实施方案中，至少一个额外氨基酸选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，至少一个额外氨基酸是极性氨基酸。在一些实施方案中，至少一个额外氨基酸是非极性氨基酸。在一些实施方案中，至少一个额外氨基酸是甘氨酸。在一些实施方案中，至少一个额外氨基酸是丙氨酸。在一些实施方案中，至少一个额外氨基酸是丝氨酸。
在一些实施方案中，RNA聚合酶的C末端包含以下共有序列：FAFAXn(SEQ ID NO：294)，其中x是任何氨基酸并且n是任何整数，例如在1与5之间的整数(例如1、2、3、4或5)。在一些实施方案中，RNA聚合酶的C末端包含以下共有序列：FAFAGn(SEQ ID NO：295)，其中n是任何整数，例如在1与5之间的整数。在一些实施方案中，RNA聚合酶的C末端包含以下共有序列：FAFAAn(SEQ ID NO：296)，其中n是任何整数，例如在1与5之间的整数。在一些实施方案中，RNA聚合酶的C末端包含以下共有序列：FAFARn(SEQ ID NO：297)，其中n是任何整数，例如在1与5之间的整数。在一些实施方案中，RNA聚合酶的C末端包含以下共有序列：FAFANn(SEQ ID NO：298)，其中n是任何整数，例如在1与5之间的整数。在一些实施方案中，RNA聚合酶的C末端包含以下共有序列：FAFADn(SEQ ID NO：299)，其中n是任何整数，例如在1与5之间的整数。在一些实施方案中，RNA聚合酶的C末端包含以下共有序列：FAFACn(SEQ ID NO：300)，其中n是任何整数，例如在1与5之间的整数。在一些实施方案中，RNA聚合酶的C末端包含以下共有序列：FAFAEn(SEQ ID NO：301)，其中n是任何整数，例如在1与5之间的整数。在一些实施方案中，RNA聚合酶的C末端包含以下共有序列：FAFAQn(SEQ ID NO：302)，其中n是任何整数，例如在1与5之间的整数。在一些实施方案中，RNA聚合酶的C末端包含以下共有序列：FAFAHn(SEQ ID NO：303)，其中n是任何整数，例如在1与5之间的整数。在一些实施方案中，RNA聚合酶的C末端包含以下共有序列：FAFAIn(SEQ ID NO：304)，其中n是任何整数，例如在1与5之间的整数。在一些实施方案中，RNA聚合酶的C末端包含以下共有序列：FAFALn(SEQ ID NO：305)，n是任何整数，例如在1与5之间的整数。在一些实施方案中，RNA聚合酶的C末端包含以下共有序列：FAFAKn(SEQ ID NO：306)，其中n是任何整数，例如在1与5之间的整数。在一些实施方案中，RNA聚合酶的C末端包含以下共有序列：FAFAMn(SEQ ID NO：307)，其中n是任何整数，例如在1与5之间的整数。在一些实施方案中，RNA聚合酶的C末端包含以下共有序列：FAFAFn(SEQ ID NO：308)，其中n是任何整数，例如在1与5之间的整数。在一些实施方案中，RNA聚合酶的C末端包含以下共有序列：FAFAPn(SEQ ID NO：309)，其中n是任何整数，例如在1与5之间的整数。在一些实施方案中，RNA聚合酶的C末端包含以下共有序列：FAFASn(SEQ ID NO：310)，其中n是任何整数，例如在1与5之间的整数。在一些实施方案中，RNA聚合酶的C末端包含以下共有序列：FAFATn(SEQ ID NO：311)，其中n是任何整数，例如在1与5之间的整数。在一些实施方案中，RNA聚合酶的C末端包含以下共有序列：FAFAWn(SEQID NO：312)，其中n是任何整数，例如在1与5之间的整数。在一些实施方案中，RNA聚合酶的C末端包含以下共有序列：FAFAYn(SEQ ID NO：313)，n是任何整数，例如在1与5之间的整数。在一些实施方案中，RNA聚合酶的C末端包含以下共有序列：FAFAVn(SEQ ID NO：314)，其中n是任何整数，例如在1与5之间的整数。
在一些实施方案中，C末端基序(FAFA或FAFAXn)在相对于野生型T7 RNAP(例如，SEQ ID NO：1)的位置880、881、882或883中的一个或多个处包含氨基酸取代。因此，本公开包含各种C末端F880A881F882A883基序，其中在相对于野生型T7 RNAP，例如SEQ ID NO：1的位置880、881、882或883中的一个或多个处的氨基酸经修饰以包括至少一个氨基酸取代，具有或不具有额外的C末端氨基酸(Xn)。
氨基酸取代
相对于WT RNA聚合酶，本公开的RNA聚合酶变体包含至少一个氨基酸取代。例如，对于具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的WT T7 RNA聚合酶，位置43处的丝氨酸被认为是“野生型氨基酸”，而位置43处丝氨酸对丙氨酸的取代被认为是具有高螺旋倾向性的“氨基酸取代”。
平均球状蛋白含有30％α螺旋，这是最常见的二级结构类型。有些氨基酸在α螺旋中的发生频率比其他氨基酸高，这种倾向被称为螺旋倾向性。参见例如Pace，N.C.和Scholtz，J.M.Biophysical Journal，75：422-427(1998)，其通过引用并入本文。在一些实施方案中，相对于野生型氨基酸，至少一个氨基酸取代具有高螺旋倾向性。通常，选择高螺旋倾向性氨基酸取代以使聚合酶构象异构体热力学上偏向延伸复合物。使用公开可用的软件(例如，华盛顿大学的Rosetta和
Figure BDA0002448127370000301
的Maestro)计算IC和延伸复合物(EC)中取代的相对ΔΔG(自由能)。然后基于计算和额外知识，包括例如氨基酸螺旋倾向性和/或多肽主链phi-psi相容性，选择取代基。
在一些实施方案中，RNA聚合酶变体是相对于WT T7 RNA聚合酶(例如，具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的WT T7 RNA聚合酶)包含至少一个(一个或多个)氨基酸取代的T7 RNA聚合酶变体。在一些实施方案中，氨基酸取代是高螺旋倾向性氨基酸取代。高螺旋倾向性氨基酸的实例包括丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸。
在一些实施方案中，RNA聚合酶变体是在C末端处包含至少一个额外氨基酸的T7RNA聚合酶变体(例如，SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：294、SEQ ID NO：295或SEQ ID NO：296，或与SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：294、SEQ ID NO：295或SEQID NO：296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，RNA聚合酶变体是T7 RNA聚合酶变体，其在C末端处包含至少一个额外氨基酸并且相对于WT T7 RNA聚合酶包含氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是高螺旋倾向性氨基酸取代。
本文提供了两种可以用于识别热力学偏向/偏好向EC的构象平衡的高或较高螺旋倾向性氨基酸取代的方法。在两种方法中，应注意避免对直接参与启动子结合或催化的任何位置进行氨基酸取代(基于结构检验、文献检索)。在方法A中，使用专用软件来计算由于EC和IC中的突变(ΔΔGmut)而导致的蛋白质折叠自由能的变化。通过此方法评估所需序列位置处所有可能的氨基酸取代。所需的氨基酸取代(即相比于IC偏好EC的那些)是其ΔΔGmut差值
Figure BDA0002448127370000311
为负的那些。在方法B中，检查IC和EC二级结构注释(例如，如使用DSSP软件(Dictionary of protein secondary structure：pattern recognitionof hydrogen-bonded and geometrical features.Kabsch W，Sander C，Biopolymers.1983222577-2637)从IC和EC三级结构的3D模型确定)，以识别IC中具有环且EC中具有螺旋的区域。然后将具有低螺旋倾向残基(例如Gly)的序列位置用高螺旋倾向性氨基酸(例如Ala)取代。例如，对于T7 RNAP，识别了方法A和方法B的突变(例如取代)重叠以及方法B的顶变体。
在一些实施方案中，氨基酸取代是在SEQ ID NO：1的氨基酸位置42-47(E42、S43、Y44、E45、M46和/或G47)中的任何一个处的高螺旋倾向性氨基酸(例如，丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸)取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置42-47(E42、S43、Y44、E45、M46和/或G47)中的任何一个处的高螺旋倾向性氨基酸(例如，丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸)取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ IDNO：1的氨基酸位置42处的高螺旋倾向性氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQID NO：1的氨基酸位置43处的高螺旋倾向性氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的氨基酸位置44处的高螺旋倾向性氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的氨基酸位置45处的高螺旋倾向性氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的氨基酸位置46处的高螺旋倾向性氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的氨基酸位置47处的高螺旋倾向性氨基酸取代。
在一些实施方案中，氨基酸取代是在SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置42-47(E42、S43、Y44、E45、M46和/或G47)中的任何一个处的高螺旋倾向性氨基酸(例如，丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸)取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置42-47(E42、S43、Y44、E45、M46和/或G47)中的任何一个处的高螺旋倾向性氨基酸(例如，丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸)取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置42处的高螺旋倾向性氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置43处的高螺旋倾向性氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置44处的高螺旋倾向性氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置45处的高螺旋倾向性氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置46处的高螺旋倾向性氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ IDNO：99、100、294、295或296的氨基酸位置47处的高螺旋倾向性氨基酸取代。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的氨基酸位置42-47中的任一个处的丙氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置42-47中的任何一个处的丙氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置42处的丙氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置43处的丙氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置44处的丙氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置45处的丙氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQID NO：1的位置46处的丙氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置47处的丙氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置42-47中的任一个处的丙氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置42-47中的任何一个处的丙氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置42处的丙氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置43处的丙氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置44处的丙氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置45处的丙氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置46处的丙氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置47处的丙氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的氨基酸位置42-47中的任一个处的异亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置42-47中的任何一个处的异亮氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ IDNO：1的位置42处的异亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置43处的异亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置44处的异亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置45处的异亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置46处的异亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ IDNO：1的位置47处的异亮氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置42-47中的任一个处的异亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置42-47中的任何一个处的异亮氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置42处的异亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置43处的异亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置44处的异亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置45处的异亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置46处的异亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置47处的异亮氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的氨基酸位置42-47中的任一个处的亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置42-47中的任何一个处的亮氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置42处的亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置43处的亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置44处的亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置45处的亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQID NO：1的位置46处的亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置47处的亮氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置42-47中的任一个处的亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置42-47中的任何一个处的亮氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置42处的亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置43处的亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置44处的亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置45处的亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置46处的亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置47处的亮氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的氨基酸位置42-47中的任一个处的精氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置42-47中的任何一个处的精氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置42处的精氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置43处的精氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置44处的精氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置45处的精氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQID NO：1的位置46处的精氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置47处的精氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置42-47中的任一个处的精氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置42-47中的任何一个处的精氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置42处的精氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置43处的精氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置44处的精氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置45处的精氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置46处的精氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置47处的精氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的氨基酸位置42-47中的任一个处的甲硫氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置42-47中的任何一个处的甲硫氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ IDNO：1的位置42处的甲硫氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置43处的甲硫氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置44处的甲硫氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置45处的甲硫氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置46处的甲硫氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ IDNO：1的位置47处的甲硫氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置42-47中的任一个处的甲硫氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置42-47中的任何一个处的甲硫氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置42处的甲硫氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置43处的甲硫氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置44处的甲硫氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置45处的甲硫氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置46处的甲硫氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置47处的甲硫氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的氨基酸位置42-47中的任一个处的赖氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置42-47中的任何一个处的赖氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置42处的赖氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置43处的赖氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置44处的赖氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置45处的赖氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQID NO：1的位置46处的赖氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置47处的赖氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置42-47中的任一个处的赖氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置42-47中的任何一个处的赖氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置42处的赖氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置43处的赖氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置44处的赖氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置45处的赖氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置46处的赖氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置47处的赖氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的氨基酸位置42-47中的任一个处的谷氨酰胺。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置42-47中的任何一个处的谷氨酰胺。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ IDNO：1的位置42处的谷氨酰胺。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置43处的谷氨酰胺。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置44处的谷氨酰胺。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置45处的谷氨酰胺。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置46处的谷氨酰胺。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ IDNO：1的位置47处的谷氨酰胺。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置42-47中的任一个处的谷氨酰胺。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置42-47中的任何一个处的谷氨酰胺。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置42处的谷氨酰胺。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置43处的谷氨酰胺。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置44处的谷氨酰胺。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置45处的谷氨酰胺。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置46处的谷氨酰胺。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置47处的谷氨酰胺。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的氨基酸位置42-47中的任一个处的谷氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置42-47中的任何一个处的谷氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置42处的谷氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置43处的谷氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置44处的谷氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置45处的谷氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQID NO：1的位置46处的谷氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置47处的谷氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置42-47中的任一个处的谷氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置42-47中的任何一个处的谷氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置42处的谷氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置43处的谷氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置44处的谷氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置45处的谷氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置46处的谷氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置47处的谷氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代是在SEQ ID NO：1的氨基酸位置257-262(R257、A258、G259、A260、L261和/或A262)中的任何一个处的高螺旋倾向性氨基酸(例如，丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸)取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置257-262(R257、A258、G259、A260、L261和/或A262)中的任何一个处的高螺旋倾向性氨基酸(例如，丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸)取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的氨基酸位置257处的高螺旋倾向性氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的氨基酸位置258处的高螺旋倾向性氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的氨基酸位置259处的高螺旋倾向性氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的氨基酸位置260处的高螺旋倾向性氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的氨基酸位置261处的高螺旋倾向性氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的氨基酸位置262处的高螺旋倾向性氨基酸取代。
在一些实施方案中，氨基酸取代是在SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置257-262(R257、A258、G259、A260、L261和/或A262)中的任何一个处的高螺旋倾向性氨基酸(例如，丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸)取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置257-262(R257、A258、G259、A260、L261和/或A262)中的任何一个处的高螺旋倾向性氨基酸(例如，丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸)取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置257处的高螺旋倾向性氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ IDNO：99、100、294、295或296的氨基酸位置258处的高螺旋倾向性氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置259处的高螺旋倾向性氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置260处的高螺旋倾向性氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置261处的高螺旋倾向性氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置262处的高螺旋倾向性氨基酸取代。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的氨基酸位置257-262中的任一个处的丙氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置257-262中的任何一个处的丙氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ IDNO：1的位置257处的丙氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置258处的丙氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置259处的丙氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置260处的丙氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置261处的丙氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置262处的丙氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置257-262中的任一个处的丙氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置257-262中的任何一个处的丙氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置257处的丙氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置258处的丙氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置259处的丙氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置260处的丙氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置261处的丙氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置262处的丙氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的氨基酸位置257-262中的任一个处的异亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置257-262中的任何一个处的异亮氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQID NO：1的位置257处的异亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置258处的异亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置259处的异亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置260处的异亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置261处的异亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置262处的异亮氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置257-262中的任一个处的异亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置257-262中的任何一个处的异亮氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置257处的异亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置258处的异亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置259处的异亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置260处的异亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置261处的异亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置262处的异亮氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的氨基酸位置257-262中的任一个处的亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置257-262中的任何一个处的亮氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ IDNO：1的位置257处的亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置258处的亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置259处的亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置260处的亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置261处的亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置262处的亮氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置257-262中的任一个处的亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置257-262中的任何一个处的亮氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置257处的亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置258处的亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置259处的亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置260处的亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置261处的亮氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置262处的亮氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的氨基酸位置257-262中的任一个处的精氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置257-262中的任何一个处的精氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ IDNO：1的位置257处的精氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置258处的精氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置259处的精氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置260处的精氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置261处的精氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置262处的精氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置257-262中的任一个处的精氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置257-262中的任何一个处的精氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置257处的精氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置258处的精氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置259处的精氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置260处的精氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置261处的精氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置262处的精氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的氨基酸位置257-262中的任一个处的甲硫氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置257-262中的任何一个处的甲硫氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQID NO：1的位置257处的甲硫氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置258处的甲硫氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置259处的甲硫氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置260处的甲硫氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置261处的甲硫氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置262处的甲硫氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置257-262中的任一个处的甲硫氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置257-262中的任何一个处的甲硫氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置257处的甲硫氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置258处的甲硫氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置259处的甲硫氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置260处的甲硫氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置261处的甲硫氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置262处的甲硫氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的氨基酸位置257-262中的任一个处的赖氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置257-262中的任何一个处的赖氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ IDNO：1的位置257处的赖氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置258处的赖氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置259处的赖氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置260处的赖氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置261处的赖氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置262处的赖氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置257-262中的任一个处的赖氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置257-262中的任何一个处的赖氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置257处的赖氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置258处的赖氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置259处的赖氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置260处的赖氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置261处的赖氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置262处的赖氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的氨基酸位置257-262中的任一个处的谷氨酰胺。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置257-262中的任何一个处的谷氨酰胺。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQID NO：1的位置257处的谷氨酰胺。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置258处的谷氨酰胺。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置259处的谷氨酰胺。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置260处的谷氨酰胺。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置261处的谷氨酰胺。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置262处的谷氨酰胺。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置257-262中的任一个处的谷氨酰胺。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置257-262中的任何一个处的谷氨酰胺。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置257处的谷氨酰胺。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置258处的谷氨酰胺。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置259处的谷氨酰胺。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置260处的谷氨酰胺。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置261处的谷氨酰胺。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置262处的谷氨酰胺。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的氨基酸位置257-262中的任一个处的谷氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置257-262中的任何一个处的谷氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ IDNO：1的位置257处的谷氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置258处的谷氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置259处的谷氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置260处的谷氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置261处的谷氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：1的位置262处的谷氨酸。
在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸位置257-262中的任一个处的谷氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是在与SEQ ID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置257-262中的任何一个处的谷氨酸。因此，在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置257处的谷氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置258处的谷氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置259处的谷氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置260处的谷氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置261处的谷氨酸。在一些实施方案中，氨基酸取代是SEQ ID NO：99、100、294、295或296的位置262处的谷氨酸。
在一些实施方案中，T7 RNA聚合酶变体包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，该氨基酸序列经修饰以在位置G47、S43、R257和/或G259处包括高螺旋倾向性氨基酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，T7 RNA聚合酶变体包含与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，该氨基酸序列经修饰以在位置G47、S43、R257和/或G259处包括高螺旋倾向性氨基酸的氨基酸取代。
在一些实施方案中，T7 RNA聚合酶变体包含SEQ ID NO：99、100、294、295或296的氨基酸序列，该氨基酸序列经修饰以在位置G47、S43、R257和/或G259处包括高螺旋倾向性氨基酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，T7 RNA聚合酶变体包含与SEQ ID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，该氨基酸序列经修饰以在位置G47、S43、R257和/或G259处包括高螺旋倾向性氨基酸的氨基酸取代。
在一些实施方案中，T7 RNA聚合酶变体包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在一些实施方案中，T7 RNA聚合酶变体包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。在一些实施方案中，T7 RNA聚合酶变体包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一些实施方案中，T7 RNA聚合酶变体包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
在一些实施方案中，T7 RNA聚合酶变体包含SEQ ID NO：107或108的氨基酸序列。在一些实施方案中，T7 RNA聚合酶变体包含SEQ ID NO：109或110的氨基酸序列。在一些实施方案中，T7 RNA聚合酶变体包含SEQ ID NO：111或112的氨基酸序列。在一些实施方案中，T7 RNA聚合酶变体包含SEQ ID NO：113或114的氨基酸序列。
本文还提供了具有至少2个(2个或更多个)取代的RNA聚合酶变体。在一些实施方案中，RNA聚合酶在SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置42-47(E42、S43、Y44、E45、M46和/或G47)和/或氨基酸位置257-262(R257、A258、G259、A260、L261和/或A262)中的任何一个处包含至少2个高螺旋倾向性氨基酸(例如，丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸)取代。
例如，RNA聚合酶变体可以在SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的位置E42和S43、E42和Y44、E42和E45、E42和M46、E42和G47、S43和Y44、S43和E45、S43和M46、S43和G47、Y44和E45、Y44和M46、Y44和G47、E45和M46、E45和G47或M46和G47处包含氨基酸取代(例如丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸)。
在一些实施方案中，RNA聚合酶变体在SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的位置R257和A258、R257和G259、R257和A260、R257和L261、R257和A262、A258和G259、A258和A260、A258和L261、A258和A262、G259和A260、G259和L261、G259和A262、A260和L261、A260和A262或L261和A262处包含氨基酸取代(例如丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸)。
在一些实施方案中，RNA聚合酶变体在SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的位置E42和R257、E42和A258、E42和G259、E42和A260、E42和L261、E42和A262、S43和R257、S43和A258、S43和G259、S43和A260、S43和L261、S43和A262、Y44和R257、Y44和A258、Y44和G259、Y44和A260、Y44和L261、Y44和A262、E45和R257、E45和A258、E45和G259、E45和A260、E45和L261、E45和A262、M46和R257、M46和A258、M46和G259、M46和A260、M46和L261、M46和A262、G47和R257、G47和A258、G47和G259、G47和A260、G47和L261或G47和A262处包含氨基酸取代(例如丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸)。
在一些实施方案中，RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸取代S43A和G47A。在一些实施方案中，RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1或与SEQID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸取代S43A和R257A。在一些实施方案中，RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸取代S43A和G259A。在一些实施方案中，RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸取代G47A和R257A。在一些实施方案中，RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸取代G47A和R257A。在一些实施方案中，RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1或与SEQ IDNO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸取代R257A和G259A。在一些实施方案中，RNA聚合酶包含SEQID NO：1或与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸取代G47A和G259A。
在一些实施方案中，RNA聚合酶变体在SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置42-47(E42、S43、Y44、E45、M46和/或G47)和/或氨基酸位置257-262(R257、A258、G259、A260、L261和/或A262)中的任何一个处包含至少3个(或至少4个或至少5个)高螺旋倾向性氨基酸(例如，丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸)取代。
在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包含SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列中的至少1个(或至少2个或至少3个或至少4个或至少5个)氨基酸取代，所述取代选自以下：E42R、S43A、S43E、S43L、S43R、E45R、E45L、M46A、G47A、G47E、G47L、G47R、N165W、E167M、E167N、E168I、E168T、E168V、A181F、A181W、G184M、E187F、A255Q、A255K、A255I、A255Y、R257A、R257E、R257L、R257W、G259A、G259E、G259L、G259R、A260W和A260R。
在一些实施方案中，RNA聚合酶在SEQ ID NO：99、100、294、295或296或与SEQ IDNO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置42-47(E42、S43、Y44、E45、M46和/或G47)和/或氨基酸位置257-262(R257、A258、G259、A260、L261和/或A262)中的任何一个处包含至少2个高螺旋倾向性氨基酸(例如，丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸)取代。
例如，RNA聚合酶变体可以在SEQ ID NO：99、100、294、295或296或与SEQ ID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的位置E42和S43、E42和Y44、E42和E45、E42和M46、E42和G47、S43和Y44、S43和E45、S43和M46、S43和G47、Y44和E45、Y44和M46、Y44和G47、E45和M46、E45和G47或M46和G47处包含氨基酸取代(例如丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸)。
在一些实施方案中，RNA聚合酶变体在SEQ ID NO：99、100、294、295或296或与SEQID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的位置R257和A258、R257和G259、R257和A260、R257和L261、R257和A262、A258和G259、A258和A260、A258和L261、A258和A262、G259和A260、G259和L261、G259和A262、A260和L261、A260和A262或L261和A262处包含氨基酸取代(例如丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸)。
在一些实施方案中，RNA聚合酶变体在SEQ ID NO：99、100、294、295或296或与SEQID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的位置E42和R257、E42和A258、E42和G259、E42和A260、E42和L261、E42和A262、S43和R257、S43和A258、S43和G259、S43和A260、S43和L261、S43和A262、Y44和R257、Y44和A258、Y44和G259、Y44和A260、Y44和L261、Y44和A262、E45和R257、E45和A258、E45和G259、E45和A260、E45和L261、E45和A262、M46和R257、M46和A258、M46和G259、M46和A260、M46和L261、M46和A262、G47和R257、G47和A258、G47和G259、G47和A260、G47和L261或G47和A262处包含氨基酸取代(例如丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸)。
在一些实施方案中，RNA聚合酶包含SEQ ID NO：99、100、294、295或296或与SEQ IDNO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸取代S43A和G47A。在一些实施方案中，RNA聚合酶包含SEQ ID NO：99、100、294、295或296或与SEO ID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸取代S43A和R257A。在一些实施方案中，RNA聚合酶包含SEQ ID NO：99、100、294、295或296或与SEQ ID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸取代S43A和G259A。在一些实施方案中，RNA聚合酶包含SEQ ID NO：99、100、294、295或296或与SEQ ID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸取代G47A和R257A。在一些实施方案中，RNA聚合酶包含SEQ ID NO：99、100、294、295或296或与SEQ ID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸取代G47A和R257A。在一些实施方案中，RNA聚合酶包含SEQ ID NO：99、100、294、295或296或与SEQ ID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸取代R257A和G259A。在一些实施方案中，RNA聚合酶包含SEQ ID NO：99、100、294、295或296或与SEQ ID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸取代G47A和G259A。
在一些实施方案中，RNA聚合酶变体在SEQ ID NO：99、100、294、295或296或与SEQID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的氨基酸位置42-47(E42、S43、Y44、E45、M46和/或G47)和/或氨基酸位置257-262(R257、A258、G259、A260、L261和/或A262)中的任何一个处包含至少3个(或至少4个或至少5个)高螺旋倾向性氨基酸(例如，丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸)取代。
在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包含SEQ ID NO：99、100、294、295或296或与SEQ ID NO：99、100、294、295或296共有90％-99％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列中的至少1个(或至少2个或至少3个或至少4个或至少5个)氨基酸取代，所述取代选自以下：E42R、S43A、S43E、S43L、S43R、E45R、E45L、M46A、G47A、G47E、G47L、G47R、N165W、E167M、E167N、E168I、E168T、E168V、A181F、A181W、G184M、E187F、R257A、R257E、R257L、R257W、G259A、G259E、G259L、G259R、A260W和A260R。
在一些实施方案中，RNA聚合酶变体包含选自以下的至少1个(或至少2个或至少3个或至少4个或至少5个)氨基酸取代：E42R、S43A、S43E、S43L、S43R、E45R、E45L、M46A、G47A、G47E、G47L、G47R、N165W、E167M、E167N、E168I、E168T、E168V、A181F、A181W、G184M、E187F、R257A、R257E、R257L、R257W、G259A、G259E、G259L、G259R、A260W和A260R，进一步包含至少1个(或至少2个或至少3个或至少4个或至少5个)其他氨基酸取代(例如文本所提供的氨基酸取代)。
因此，本公开涵盖RNA聚合酶变体，其包含选自以下的至少1个(或至少2个或至少3个或至少4个或至少5个)氨基酸取代：E42R、S43A、S43E、S43L、S43R、E45R、E45L、M46A、G47A、G47E、G47L、G47R、N165W、E167M、E167N、E168I、E168T、E168V、A181F、A181W、G184M、E187F、A255K、A255Q、A255Y、A255I、R257A、R257E、R257L、R257W、G259A、G259E、G259L、G259R、A260W和A260R，并且与SEQ ID NO：1至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
术语“同一性”是指如通过比较序列确定的两个或更多个多肽(例如酶)或多核苷酸(核酸)的序列之间的关系。同一性还指如通过两个或更多个氨基酸残基或核酸残基的串之间的匹配数确定的两个序列之间或多个序列之间的序列相关性程度。“同一性”使用由具体数学模型或计算机程序(即，“算法”)解决的空位比对(如果有的话)测量两个或更多个序列中较小序列之间的相同匹配的百分比。相关蛋白质或核酸的同一性可以通过已知方法容易地计算出。适用于多肽或多核苷酸序列的“同一性百分比(％)”定义为在比对序列并引入空位(如果需要)以实现最大同一性百分比之后，候选氨基酸或核酸序列中与第二序列的氨基酸序列或核酸序列中的残基相同的残基(氨基酸残基或核酸残基)的百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域熟知的。应了解，同一性取决于同一性百分比的计算，但是值可能会由于计算中引入的空位和罚分有所不同。通常，如通过本文所述并且是本领域技术人员已知的序列比对程序和参数所确定，特定多核苷酸或多肽(例如抗原)的变体与特定参考多核苷酸或多肽具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％但小于100％的序列同一性。此类比对工具包括BLAST套件的那些(Stephen F.Altschul等人(1997)，“Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs“，Nucleic AcidsRes.25：3389-3402)。另一种流行的局部比对技术是基于Smith-Waterman算法(Smith，T.F.&Waterman，M.S.(1981)“Identification of common molecular subsequences.”J.Mol.Biol.147：195-197)。基于动态规划的通用全局比对技术是尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman，S.B.&Wunsch，C.D.(1970)“A generalmethod applicable to the search for similarities in the amino acid sequencesof two proteins.”J.Mol.Biol.48：443-453)。最近，开发了一种快速最优全局序列比对算法(FOGSAA)，据称它比其他最优全局比对方法(包括尼德曼-翁施算法算法)更快地产生核苷酸和蛋白质序列的全局比对。
三核苷酸帽
本文还提供了用于核糖核酸(RNA)合成的共转录加帽方法。也就是说，RNA是通过“一锅法”反应产生的，不需要单独的加帽反应。因此，在一些实施方案中，所述方法包括使多核苷酸模板与T7 RNA聚合酶变体、三磷酸核苷，以及帽类似物在体外转录反应条件下反应以产生RNA转录物。
帽类似物可以是例如二核苷酸帽、三核苷酸帽或四核苷酸帽。在一些实施方案中，帽类似物是二核苷酸帽。在一些实施方案中，帽类似物是三核苷酸帽。在一些实施方案中，帽类似物是四核苷酸帽。
在一些实施方案中，三核苷酸帽包含式(I)
Figure BDA0002448127370000571
化合物或其立体异构体、互变异构体或盐，其中
Figure BDA0002448127370000572
环B1是修饰或未修饰的鸟嘌呤；
环B2和环B3各自独立地是核碱基或修饰的核碱基；
X2是O、S(O)p、NR24或CR25R26，其中p是0、1或2；
Y0是O或CR6R7；
Y1是O、S(O)n、CR6R7或NR8，其中p是0、1或2；
每个---是单键或不存在，其中当每个---是单键时，Yi是O、S(O)n、CR6R7或NR8；并且当每个---不存在时，Y1无效。
Y2是(OP(O)R4)m，其中m是0、1或2；或-O-(CR40R41)u-Q0-(CR42R43)v-，其中Q0是键、O、S(O)r、NR44或CR45R46，r是0、1或2，并且u和v中的每一个独立地是1、2、3或4；
每个R2和R2′独立地是卤素、LNA或OR3；
每个R3独立地是H、C1-C6烷基、C2-C6烯基或C2-C6炔基，并且R3在是C1-C6烷基、C2-C6烯基或C2-C6炔基时任选地被卤素、OH和C1-C6烷氧基中的一个或多个取代，所述C1-C6烷氧基任选地被一个或多个OH或OC(O)-C1-C6烷基取代；
每个R4和R4′独立地是H、卤素、C1-C6烷基、OH、SH、SeH或BH3 -；
R6、R7和R8中的每一个独立地是-Q1-T1，其中Q1是键或任选地被卤素、氰基、OH和C1-C6烷氧基中的一个或多个取代的C1-C3烷基连接基团，并且T1是H、卤素、OH、COOH、氰基或Rs1，其中Rs1是C1-C3烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、C(O)O-C1-C6烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、NR31R32、(NR31R32R33)+、4至12元杂环烷基或5元或6元杂芳基，并且Rs1任选地被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：卤素、OH、氧代、C1-C6烷基、COOH、C(O)O-C1-C6烷基、氰基、C1-C6烷氧基、NR31R32、(NR31R32R33)+、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、4至12元杂环烷基和5元或6元杂芳基；
R10、R11、R12、R13、R14和R15中的每一个独立地是-Q2-T2，其中Q2是键或任选地被卤素、氰基、OH和C1-C6烷氧基中的一个或多个取代的C1-C3烷基连接基团，并且T2是H、卤素、OH、NH2、氰基、NO2、N3、Rs2或ORs2，其中Rs2是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、NHC(O)-C1-C6烷基、NR31R32、(NR31R32R33)+、4至12元杂环烷基或5元或6元杂芳基，并且Rs2任选地被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：卤素、OH、氧代、C1-C6烷基、COOH、C(O)O-C1-C6烷基、氰基、C1-C6烷氧基、NR31R32、(NR31R32R33)+、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、4至12元杂环烷基，和5元或6元杂芳基；或者可替代地R12与R14一起是氧代，或者R13与R15一起是氧代，
R20、R21、R22和R23中的每一个独立地是-Q3-T3，其中Q3是键或任选地被卤素、氰基、OH和C1-C6烷氧基中的一个或多个取代的C1-C3烷基连接基团，并且T3是H、卤素、OH、NH2、氰基、NO2、N3、Rs3或ORs3，其中RS3是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、NHC(O)-C1-C6烷基、单-C1-C6烷基氨基、二-G1-C6烷基氨基、4至12元杂环烷基、或5元或6元杂芳基，并且Rs3任选地被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：卤素、OH、氧代、C1-C6烷基、COOH、C(O)O-C1-C6烷基、氰基、C1-C6烷氧基、氨基、单-C1-C6烷基氨基、二-C1-C6烷基氨基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、4至12元杂环烷基和5元或6元杂芳基；R24、R25和R26中的每一个独立地是H或C1-C6烷基；
R27和R28中的每一个独立地是H或OR29；或者R27和R28共同形成O-R30-O；每个R29独立地是H、C1-C6烷基、C2-C6烯基或C2-C6炔基，并且R29在是C1-C6烷基、C2-C6烯基或C2-C6炔基时任选地被卤素、OH和C1-C6烷氧基中的一种或多种取代，所述C1-C6烷氧基任选地被一个或多个OH或OC(O)-C1-C6烷基取代；
R30是任选地被卤素、OH和C1-C6烷氧基中的一种或多种取代的C1-C6亚烷基；
R31、R32和R33中的每一个独立地是H、C1-C6烷基、C3-C8环烷基、C6-C10芳基、4至12元杂环烷基或，5元或6元杂芳基；
R40、R41、R42和R43中的每一个独立地是H、卤素、OH、氰基、N3、OP(O)R47R48或任选地被一个或多个OP(O)R47R48取代的C1-C6烷基，或者一个R41和一个R43与它们所连接的碳原子和Q0一起形成C4-C10环烷基、4至14元杂环烷基、C6-C10芳基或5元至14元杂芳基，并且环烷基、杂环烷基、苯基或元5元至6元杂芳基中的每一个任选地被OH、卤素、氰基、N3、氧代、OP(O)R47R48、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、COOH、C(O)O-C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基、氨基、单-C1-C6烷基氨基和二-C1-C6烷基氨基中的一个或多个取代；
R44是H、C1-C6烷基或胺保护基；
R45和R46中的每一个独立地是H、OP(O)R47R48或任选地被一个或多个OP(O)R47R48取代的C1-C6烷基，并且
R47和R48中的每一个独立地是H、卤素、C1-C6烷基、OH、SH、SeH或BH3 -。
应理解，如本文所提供的帽类似物可以包括在2017年4月20日公布的国际公开案WO 2017/066797中所述的任何帽类似物，所述公开案通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，B2中间位置可以是非核糖分子，诸如阿拉伯糖。
在一些实施方案中，R2是基于乙基的。
因此，在一些实施方案中，三核苷酸帽包含以下结构：
Figure BDA0002448127370000601
在其他实施方案中，三核苷酸帽包含以下结构：
Figure BDA0002448127370000611
在又其他实施方案中，三核苷酸帽包含以下结构：
Figure BDA0002448127370000612
在仍其他实施方案中，三核苷酸帽包含以下结构：
Figure BDA0002448127370000613
在一些实施方案中，三核苷酸帽包含选自以下序列的序列：GAA、GAC、GAG、GAU、GCA、GCC、GCG、GCU、GGA、GGC、GGG、GGU、GUA、GUC、GUG和GUU。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含GAA。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含GAC。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含GAG。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含GAU。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含GCA。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含GCC。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含GCG。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含GCU。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含GGA。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含GGC。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含GGG。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含GGU。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含GUA。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含GUC。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含GUG。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含GUU。
在一些实施方案中，三核苷酸帽包含选自以下序列的序列：m7GpppApA、m7GpppApC、m7GpppApG、m7GpppApU、m7GpppCpA、m7GpppCpC、m7GpppCpG、m7GpppCpU、m7GpppGpA、m7GpppGpC、m7GpppGpG、m7GpppGpU、m7GpppUpA、m7GpppUpC、m7GpppUpG，和m7GpppUpU。
在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppApA。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppApC。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppApG。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppApU。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppCpA。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppCpC。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppCpG。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppCpU。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppGpA。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppGpC。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppGpG。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppGpU。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppUpA。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppUpC。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppUpG。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppUpU。
在一些实施方案中，三核苷酸帽包含选自以下序列的序列：m7G3′OMepppApA、m7G3′ OMepppApC、m7G3′OMepppApG、m7G3′OMepppApU、m7G3′OMepppCpA、m7G3′OMepppCpC、m7G3′OMepppCpG、m7G3′OMepppCpU、m7G3′OMepppGpA、m7G3′OMepppGpC、m7G3′OMepppGpG、m7G3′OMepppGpU、m7G3′ OMepppUpA、m7G3′OMepppUpC、m7G3′OMepppUpG，以及m7G3′OMepppUpU。
在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppApA。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppApC。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppApG。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppApU。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppCpA。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppCpC。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppCpG。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppCpU。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppGpA。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppGpC。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppGpG。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′ OMepppGpU。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppUpA。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppUpC。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppUpG。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppUpU。
在其他实施方案中，三核苷酸帽包含选自以下序列的序列：m7G3′OMepppA2′OMepA、m7G3′OMepppA2′OMepC、m7G3′OMepppA2′OMepG、m7G3′OMepppA2′OMepU、m7G3′OMepppC2′OMepA、m7G3′ OMepppC2′OMepC、m7G3′OMepppC2′OMePG、m7G3′OMepppC2′OMepU、m7G3′OMepppG2′OMepA、m7G3′OMepppG2′ OMepC、m7G3′OMepppG2′OMepG、m7G3′OMepppG2′OMepU、m7G3′OMepppU2′OMepA、m7G3′OMepppU2′OMepC、m7G3′ OMepppU2′OMepG，和m7G3′OMepppU2′OMepU。
在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppA2′OMepA。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppA2′OMepC。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppA2′OMepG。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppA2′OMepU。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppC2′OMepA。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppC2′OMepC。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppC2′OMepG。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′ OMepppC2′OMepU。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppG2′OMepA。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppG2′OMepC。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppG2′ OMepG。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppG2′OMepU。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppU2′OMepA。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppU2′OMepC。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppU2′OMepG。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7G3′OMepppU2′OMepU。
在仍其他实施方案中，三核苷酸帽包含选自以下序列的序列：m7GpppA2′OMepA、m7GpppA2′OMepC、m7GpppA2′OMepG、m7GpppA2′OMepU、m7GpppC2′OMepA、m7GpppC2′OMepC、m7GpppC2′ OMepG、m7GpppC2′OMepU、m7GpppG2′OMepA、m7GpppG2′OMepC、m7GpppG2′OMepG、m7GpppG2′OMepU、m7GpppU2′OMepA、m7GpppU2′OMepC、m7GpppU2′OMepG，和m7GpppU2′OMepU。
在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppA2′OMepA。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppA2′OMepC。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppA2′OMepG。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppA2′OMepU。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppC2′OMepA。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppC2′OMepC。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppC2′OMepG。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppC2′OMepU。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppG2′OMepA。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppG2′OMepC。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppG2′OMepG。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppG2′ OMepU。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppU2′OMepA。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppU2′OMepC。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppU2′OMepG。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含m7GpppU2′OMepU。
在一些实施方案中，三核苷酸帽包含GAG。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含GCG。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含GUG。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含GGG。
体外转录方法
本公开的一些方面提供了产生(合成)RNA转录物(例如mRNA转录物)的方法，其包括使DNA模板与RNA聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶，诸如T7 RNA聚合酶变体)在导致产生RNA转录物的条件下接触。
在一些实施方案中，这些方法包括使DNA模板与具有S43A取代的T7 RNA聚合酶(例如，SEQ ID NO：1、99或100)变体(例如，S43A T7 RNAP变体或S43A* T7 RNAP变体)在导致产生RNA转录物的条件下接触。在其他实施方案中，这些方法包括使DNA模板与具有G47A取代的T7 RNA聚合酶(例如，SEQ ID NO：1、99或100)变体(例如，G47A T7 RNAP变体或G47A* T7RNAP变体)在导致产生RNA转录物的条件下接触。在又其他实施方案中，这些方法包括使DNA模板与具有R257A取代的T7 RNA聚合酶(例如，SEQ ID NO：1、99或100)变体(例如，R257A T7RNAP变体或R257A*T7 RNAP变体)在导致产生RNA转录物的条件下接触。在仍其他实施方案中，这些方法包括使DNA模板与具有G259A取代的T7 RNA聚合酶(例如，SEQ ID NO：1、99或100)变体(例如，G259A T7 RNAP变体或G259A*T7 RNAP变体)在导致产生RNA转录物的条件下接触。
在一些实施方案中，所述方法包括使DNA模板与包含(至少一个)额外C末端氨基酸(例如，Gly、Ala、GlyGly、AlaAla、GlyAla或AlaGly)的T7 RNA聚合酶变体接触。
在一些实施方案中，这些方法包括使DNA模板与T7 RNA聚合酶变体接触，所述T7RNA聚合酶变体包含E42R、S43A、S43E、S43L、S43R、E45R、E45L、M46A、G47A、G47E、G47L、G47R、N165W、E167M、E167N、E168I、E168T、E168V、A181F、A181W、G184M、E187F、A255Q、A255K、A255I、A255Y、R257A、R257E、R257L、R257W、G259A、G259E、G259L、G259R、A260W或A260R取代，或前述取代中两个或更多个的组合以及任选地额外C末端氨基酸(例如Gly、Ala、GlyGly、AlaAla、GlyAla或AlaGly)。
在一些方面，本公开提供了进行IVT反应的方法，其包括使DNA模板与RNA聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶，诸如T7 RNA聚合酶变体)在存在三磷酸核苷和缓冲液的情况下在导致产生RNA转录物的条件下接触。
本公开的其他方面提供了共转录加帽方法，其包括使多核苷酸模板与T7 RNA聚合酶变体、三磷酸核苷，以及帽类似物在体外转录反应条件下反应以产生RNA转录物。
在一些实施方案中，用于RNA合成的共转录加帽方法包括使多核苷酸模板与以下各项在体外转录反应条件下反应以产生RNA转录物：(a)T7 RNA聚合酶变体，其相对于野生型RNA聚合酶包含至少一个氨基酸取代，所述至少一个氨基酸取代导致所述RNA聚合酶变体的至少一个环结构随着所述RNA聚合酶变体从起始复合物转变成延伸复合物经历向螺旋结构的构象变化；(b)三磷酸核苷；和(c)三核苷酸帽，其包含序列GpppA2′OmepG，其中所述多核苷酸模板在模板位置+1处包含2′-脱氧胸苷残基。
IVT条件通常需要含有启动子的经纯化线性DNA模板、三磷酸核苷、包括二硫苏糖醇(DTT)和镁离子的缓冲体系以及RNA聚合酶。转录反应中使用的确切条件取决于特定应用所需的RNA量。典型的IVT反应通过将DNA模板与RNA聚合酶和三磷酸核苷(包括GTP、ATP、CTP和UTP(或核苷酸类似物))在转录缓冲液中一起孵育来进行。从此反应中产生具有5’末端三磷酸鸟苷的RNA转录物。
脱氧核糖核酸(DNA)只是RNA聚合酶的核酸模板。DNA模板可以包括编码所关注多肽(例如，抗原性多肽)的多核苷酸。在一些实施方案中，DNA模板包含位于编码所关注多肽的多核苷酸的5’末端并且与所述多核苷酸可操作地连接的RNA聚合酶启动子(例如，T7 RNA聚合酶启动子)。DNA模板还可以包含位于所关注基因的3′末端处的编码多腺苷酸化(polyA)尾部的核苷酸序列。
所关注多肽包括但不限于生物制剂、抗体、抗原(疫苗)和治疗性蛋白质。术语“蛋白质”涵盖肽。
在一些实施方案中，RNA转录物是IVT反应的产物。在一些实施方案中，RNA转录物是信使RNA(mRNA)，其包括编码与polyA尾部连接的所关注多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，mRNA是修饰mRNA(mmRNA)，其包含至少一个修饰核苷酸。
核苷酸包含氮碱基、五碳糖(核糖或脱氧核糖)和至少一个磷酸基团。核苷酸包括单磷酸核苷、二磷酸核苷和三磷酸核苷。单磷酸核苷(NMP)包含与核糖连接的核碱基和单个磷酸；二磷酸核苷(NDP)包含与核糖连接的核碱基和两个磷酸；三磷酸核苷(NTP)包含与核糖连接的核碱基和三个磷酸。核苷酸类似物是具有核苷酸的一般结构或在结构上与核苷酸类似的化合物。核苷酸类似物例如包括核碱基的类似物、糖的类似物和/或核苷酸的一个或多个磷酸基团的类似物。
核苷包含氮碱基和5碳糖。因此，核苷加上磷酸基团产生核苷酸。核苷类似物是具有核苷的一般结构或在结构上与核苷类似的化合物。核苷类似物例如包括核碱基的类似物和/或核苷糖的类似物。
应了解，除非另外指出，否则术语“核苷酸”包括天然存在的核苷酸、合成核苷酸和修饰核苷酸。如本文所提供的用于例如在IVT反应中产生RNA的天然存在的核苷酸的实例包括三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸鸟苷(GTP)、三磷酸胞苷(CTP)、三磷酸尿苷(UTP)和三磷酸5-甲基尿苷(m5UTP)。在一些实施方案中，使用二磷酸腺苷(ADP)、二磷酸鸟苷(GDP)、二磷酸胞苷(CDP)和/或二磷酸尿苷(UDP)。
核苷酸类似物的实例包括但不限于抗病毒核苷酸类似物、磷酸类似物(可溶性或固定化、可水解或不可水解)、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸(例如帽类似物)，或用于酶促加帽的前体/底物(牛痘或连接酶)、标记有官能团以促进帽或5’部分的连接/缀合的核苷酸(IRES)、标记有5’PO4以促进帽或5’部分连接的核苷酸，或标记有可以被化学或酶切割的官能团/保护基的核苷酸。抗病毒核苷酸/核苷类似物的实例包括但不限于更昔洛韦、恩替卡韦、替比夫定、维达拉滨和西多福韦。
修饰核苷酸可以包括修饰核碱基。例如，本公开的RNA转录物(例如，mRNA转录物)可以包括选自以下的修饰核碱基：假尿苷(ψ)、1-甲基假尿苷(m1ψ)、1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4′-硫尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷(mo5U)和2′-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，RNA转录物(例如，mRNA转录物)包括至少两个(例如，2、3、4或更多个)前述修饰核碱基的组合。
如本文提供的三磷酸核苷(NTP)可以包括未修饰或修饰的ATP、修饰或未修饰的UTP、修饰或未修饰的GTP，和/或修饰或未修饰的CTP。在一些实施方案中，IVT反应的NTP包括未修饰ATP。在一些实施方案中，IVT反应的NTP包括修饰ATP。在一些实施方案中，IVT反应的NTP包括未修饰UTP。在一些实施方案中，IVT反应的NTP包括修饰UTP。在一些实施方案中，IVT反应的NTP包括未修饰GTP。在一些实施方案中，IVT反应的NTP包括修饰GTP。在一些实施方案中，IVT反应的NTP包括未修饰CTP。在一些实施方案中，IVT反应的NTP包括修饰CTP。
IVT反应中存在的三磷酸核苷和帽类似物的浓度可能不同。在一些实施方案中，NTP和帽类似物以等摩尔浓度存在于所述反应中。在一些实施方案中，在反应中帽类似物(例如三核苷酸帽)与三磷酸核苷的摩尔比大于1∶1。例如，在反应中帽类似物与三磷酸核苷的摩尔比可以是2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、50∶1或100∶1。在一些实施方案中，在反应中帽类似物(例如三核苷酸帽)与三磷酸核苷的摩尔比小于1∶1。例如，在反应中帽类似物(例如三核苷酸帽)与三磷酸核苷的摩尔比可以是1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶50或1∶100。
IVT反应中NTP的组成也可能不同。例如，可以使用超过GTP、CTP和UTP的ATP。作为非限制性实例，IVT反应可以包括7.5毫摩尔GTP、7.5毫摩尔CTP、7.5毫摩尔UTP和3.75毫摩尔ATP。相同的IVT反应可以包括3.75毫摩尔帽类似物(例如三核苷酸帽)。在一些实施方案中，G∶C∶U∶A∶帽的摩尔比是1∶1∶1∶0.5∶0.5。在一些实施方案中，G∶C∶U∶A：帽的摩尔比是1∶1∶0.5∶1∶0.5。在一些实施方案中，G∶C∶U∶A∶帽的摩尔比是1∶0.5∶1∶1∶0.5。在一些实施方案中，G∶C∶U∶A∶帽的摩尔比是0.5∶1∶1∶1∶0.5。
在一些实施方案中，RNA转录物(例如，mRNA转录物)包括选自假尿苷(ψ)、1-甲基假尿苷(m1ψ)、5-甲氧基尿苷(mo5U)、5-甲基胞苷(m5C)、α-硫代鸟苷和α-硫代腺苷的修饰核碱基。在一些实施方案中，RNA转录物(例如，mRNA转录物)包括至少两个(例如，2、3、4或更多个)前述修饰核碱基的组合。
在一些实施方案中，RNA转录物(例如，mRNA转录物)包括假尿苷(ψ)。在一些实施方案中，RNA转录物(例如，mRNA转录物)包括1-甲基假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，RNA转录物(例如，mRNA转录物)包括5-甲氧基尿苷(mo5U)。在一些实施方案中，RNA转录物(例如，mRNA转录物)包括5-甲基胞苷(m5C)。在一些实施方案中，RNA转录物(例如，mRNA转录物)包括α-硫代-鸟苷。在一些实施方案中，RNA转录物(例如，mRNA转录物)包括α-硫代-腺苷。
在一些实施方案中，对多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)进行均匀修饰(例如，完全修饰、在整个序列中修饰)以进行特定修饰。例如，多核苷酸可以用1-甲基假尿苷(m1ψ)均匀修饰，这意指mRNA序列中的所有尿苷残基都被1-甲基假尿苷(m1ψ)取代。类似地，可以通过用修饰残基(例如上文阐述的那些中的任一个)置换来对序列中存在的任何类型的核苷残基进行均匀修饰。可替代地，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，例如mRNA多核苷酸)可以不被均匀修饰(例如，部分修饰、部分序列被修饰)。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
在一些实施方案中，缓冲液体系含有tris。在IVT反应中使用的tris浓度例如可以是至少10mM、至少20mM、至少30mM、至少40mM、至少50mM、至少60mM、至少70mM、至少80mM、至少90mM、至少100mM或至少110mM磷酸盐。在一些实施方案中，磷酸盐的浓度是20-60mM或10-100mM。
在一些实施方案中，缓冲液体系含有二硫苏糖醇(DTT)。在IVT反应中使用的DTT的浓度例如可以是至少1mM、至少5mM或至少50mM。在一些实施方案中，IVT反应中使用的DTT浓度是1-50mM或5-50mM。在一些实施方案中，IVT反应中使用的DTT浓度是5mM。
在一些实施方案中，缓冲液体系含有镁。在一些实施方案中，IVT反应中存在的NTP与镁离子(Mg2+；例如，MgCl2)的摩尔比是1∶1至1∶5。例如，NTP与镁离子的摩尔比可以是1∶1、1∶2、1∶3、1∶4或1∶5。
在一些实施方案中，IVT反应中存在的NTP加帽类似物(例如三核苷酸帽，诸如GAG)与镁离子(Mg2+；例如，MgCl2)的摩尔比是1∶1至1∶5。例如，NTP+三核苷酸帽(例如GAG)与镁离子的摩尔比可以是1∶1、1∶2、1∶3、1∶4或1∶5。
在一些实施方案中，缓冲液体系含有Tris-HCl、亚精胺(例如，浓度为1-30mM)、
Figure BDA0002448127370000711
X-100(聚乙二醇对-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯基醚)和/或聚乙二醇(PEG)。
通过聚合酶(诸如T7 RNA聚合酶，例如任何一种或多种T7 RNA聚合酶变体(例如S43A和/或G47A))催化将三磷酸核苷(NTP)添加到生长RNA链的3’末端。在一些实施方案中，RNA聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶变体)以0.01mg/ml至1mg/ml的浓度存在于反应(例如，IVT反应)中。例如，RNA聚合酶可以0.01mg/mL、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml或1.0mg/ml的浓度存在于反应中。
令人惊讶的是，在体外转录反应中组合使用如本文提供的T7RNAP变体(例如，E42、S43、Y44、E45、M46、G47、A255、R257或G259，例如S43A或G47A)与帽类似物(例如，GpppA2′ OmepG)例如导致产生RNA转录物，其中所产生的大于80％的RNA转录物具有功能性帽。在一些实施方案中，所产生的RNA转录物的大于85％包括功能性帽。在一些实施方案中，所产生的RNA转录物的大于90％包括功能性帽。在一些实施方案中，所产生的RNA转录物的大于95％包括功能性帽。在一些实施方案中，所产生的RNA转录物的大于96％包括功能性帽。在一些实施方案中，所产生的RNA转录物的大于97％包括功能性帽。在一些实施方案中，所产生的RNA转录物的大于98％包括功能性帽。在一些实施方案中，所产生的RNA转录物的大于99％包括功能性帽。
还令人惊奇的是，发现使用在模板位置+1处包含2′-脱氧胸苷残基或2′-脱氧胞苷残基的多核苷酸模板导致产生RNA转录物，其中大于80％(例如，大于85％、大于90％或大于95％)的产生的RNA转录物包含功能性帽。因此，在一些实施方案中，例如在IVT反应中使用的多核苷酸(例如DNA)模板在模板位置+1处包含2′-脱氧胸苷残基。在其他实施方案中，例如在IVT反应中使用的多核苷酸(例如DNA)模板在模板位置+1处包含2′-脱氧胞苷残基。
应用
根据本公开产生的RNA转录物包括mRNA(包括修饰的mRNA和/或未修饰的RNA)、lncRNA、自我复制RNA、环状RNA、CRISPR引导RNA等。在实施方案中，RNA是编码多肽(例如，治疗性多肽)的RNA(例如，mRNA或自我复制RNA)。因此，使用本公开的RNA聚合酶变体产生的RNA转录物可以用于多种应用中。
例如，RNA转录物可以用于产生所关注多肽，例如治疗性蛋白质、疫苗抗原等。在一些实施方案中，RNA转录物是治疗性RNA。治疗性mRNA是编码治疗性蛋白质(术语“蛋白质”涵盖肽)的mRNA。治疗性蛋白质在宿主细胞或受试者中介导多种作用以治疗疾病或改善疾病的征象和症状。例如，治疗性蛋白质可以置换有缺陷或异常的蛋白质，增强内源性蛋白质的功能，为细胞提供新的功能(例如，抑制或激活内源性细胞活性)，或充当另一种治疗性化合物(例如抗体-药物缀合物)的递送剂。治疗性mRNA可以用于治疗以下疾病和病状：细菌感染、病毒感染、寄生虫感染、细胞增殖异常、遗传异常和自身免疫性疾病。本文涵盖其他疾病和病状。
如本文提供的由mRNA编码的所关注蛋白质可以基本上是任何蛋白质。在一些实施方案中，治疗性蛋白是细胞因子、生长因子、抗体或融合蛋白。治疗性蛋白质的非限制性实例包括血液因子(诸如因子VIII和因子VII)、补体因子、低密度脂蛋白受体(LDLR)和MUT1。细胞因子的非限制性实例包括白介素、干扰素、趋化因子、淋巴因子等。生长因子的非限制性实例包括促红细胞生成素、EGF、PDGF、FGF、TGF、IGF、TNF、CSF、MCSF、GMCSF等。抗体的非限制性实例包括阿达木单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗、伊匹木单抗、托珠单抗、卡那吉努单抗、艾托利珠单抗、曲洛吉努单抗。融合蛋白的非限制性实例包括例如依那西普、阿他西普和贝他西普。
在一些实施方案中，所关注蛋白质是人促红细胞生成素、LDLR(用于抑制胆固醇)或MUT1(用于治疗甲基丙二酸血症(MMA))。在其他实施方案中，由mRNA编码的所关注蛋白质是治疗性抗体，包括但不限于以上列出的抗体。
使用如本文公开的RNA聚合酶变体产生的RNA转录物可以编码一种或多种生物制剂。生物制剂是一种基于多肽的分子，可以用于治疗、治愈、缓解、预防或诊断严重或威胁生命的疾病或医学病状。生物制剂包括但不限于过敏原提取物(例如用于过敏注射和测试)、血液组分、基因治疗产品、用于移植的人组织或细胞产品、疫苗、单克隆抗体、细胞因子、生长因子、酶、溶栓剂和免疫调节剂等。
当前正在销售或正在开发的一种或多种生物制剂可以由本发明的RNA编码。尽管不希望受到理论的束缚，但据信，将已知生物制剂的编码多核苷酸掺入本公开的RNA将导致改善的治疗功效，这至少部分地是由于构造设计的特异性、纯度和/或选择性。
使用如本文公开的RNA聚合酶变体产生的RNA转录物可以编码一种或多种抗体。术语“抗体”包括单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、双抗体和单链分子)，以及抗体片段。术语“免疫球蛋白”(Ig)与本文的“抗体”可互换使用。单克隆抗体是从基本均匀的抗体群获得的抗体，即，除了可能少量存在的可能的天然发生的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)之外，构成该群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。
单克隆抗体具体地包括嵌合抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体分类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而所述链的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及这类抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要它们展现出所需的生物活性。嵌合抗体包括但不限于“灵长类化”抗体，这些抗体包含衍生自非人灵长类动物(例如，旧大陆猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。
本公开的RNA中编码的抗体可以用于治疗许多治疗领域的病状或疾病，诸如但不限于血液、心血管、CNS、中毒(包括抗蛇毒)、皮肤病学、内分泌学、胃肠道、医学影像学、肌肉骨骼、肿瘤、免疫学、呼吸道、感觉和抗感染。
使用如本文公开的RNA聚合酶变体产生的RNA转录物可以编码一种或多种疫苗抗原。疫苗抗原是提高对特定疾病或传染原的免疫力的生物制剂。当前正在销售或正在开发的一种或多种疫苗抗原可以由本公开的RNA编码。RNA中编码的疫苗抗原可以用于治疗许多治疗领域的病状或疾病，诸如但不限于癌症、过敏和传染性疾病。在一些实施方案中，癌症疫苗可以是呈多联体或编码肽表位或其组合的单独RNA形式的个性化癌症疫苗。
使用如本文公开的RNA聚合酶变体产生的RNA转录物可以设计成编码一种或多种抗微生物肽(AMP)或抗病毒肽(AVP)。AMP和AVP已从多种动物中分离和描述，这些动物诸如但不限于微生物、无脊椎动物、植物、两栖动物、鸟类、鱼类和哺乳动物。抗微生物多肽可以通过一种或多种包膜病毒(例如，HIV、HCV)阻断细胞融合和/或病毒进入。例如，抗微生物多肽可以包含对应于一个区域的合成肽或由其组成，例如病毒包膜蛋白(例如HIV-1 gp120或gp41)的跨膜亚基的至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个氨基酸的连续序列。HIV-1 gp120或gp41的氨基酸和核苷酸序列描述于例如Kuiken等人，(2008).“HIVSequence Compendium，”Los Alamos National Laboratory中。
在一些实施方案中，RNA转录物用作放射性标记的RNA探针。在一些实施方案中，RNA转录物用于非同位素RNA标记。在一些实施方案中，RNA转录物用作用于基因靶向的引导RNA(gRNA)。在一些实施方案中，RNA转录物(例如mRNA)用于体外翻译和微量注射。在一些实施方案中，RNA转录物用于RNA结构、加工和催化研究。在一些实施方案中，RNA转录物用于RNA扩增。在一些实施方案中，RNA转录物用作基因表达实验的反义RNA。本公开涵盖其他应用。
组合物
在一些实施方案中，本公开的T7 RNAP变体在IVT反应中与帽类似物(诸如三核苷酸帽)组合使用时，产生即使在没有IVT后纯化的情况下也不诱导可检测的细胞因子应答的RNA。因此，在一些实施方案中，本文提供了包含IVT RNA和药学上可接受的赋形剂的组合物，其中该组合物基本上不含(例如，不包含或包含小于10％、小于1％、小于0.1％，或小于0.01％)的在没有IVT后纯化的情况下诱导RNA污染物的细胞因子。
如本文其他地方所述，本公开的T7 RNAP变体和方法产生RNA转录物，其中至少80％(例如80％-90％，80％-95％，90％-95％，80％-99％，90％-99％或90-100％)的转录物包含功能性帽。因此，本文还提供了包含IVT RNA和药学上可接受的赋形剂的组合物，其中该组合物包含小于20％(例如5％-15％、5％-10％、1％-15％或1％-10％)的未加帽RNA类别。在一些实施方案中，组合物包含小于15％(例如5％-10％、1％-10％或1％-5％)的未加帽RNA类别。在一些实施方案中，该组合物包含少于10％的未加帽RNA类别。在一些实施方案中，该组合物包含少于5％的未加帽RNA类别。
在一些实施方案中，大于80％的IVT RNA包括功能性帽。在一些实施方案中，大于85％的IVT RNA包括功能性帽。在一些实施方案中，大于90％的IVT RNA包括功能性帽。在一些实施方案中，大于95％的IVT RNA包括功能性帽。
在一些实施方案中，IVT RNA未经化学修饰，而在其他实施方案中，IVT RNA经化学修饰。
在一些实施方案中，出乎意料地，大于80％的IVT RNA包含单链全长转录物。例如，大于85％的IVT RNA可以包含单链全长转录物。在一些实施方案中，大于90％的IVT RNA包含单链全长转录物。大于95％的IVT RNA包含单链全长转录物。
在一些实施方案中，所述RNA通过包括以下的方法产生：使多核苷酸模板与以下各项在体外转录反应条件下反应以产生RNA转录物：(a)T7 RNA聚合酶变体，其相对于野生型RNA聚合酶包含至少一个氨基酸取代，所述至少一个氨基酸取代导致所述RNA聚合酶变体的至少一个环结构随着所述RNA聚合酶变体从起始复合物转变成延伸复合物经历向螺旋结构的构象变化；(b)三磷酸核苷；和(c)三核苷酸帽，其包含序列GpppA2′OmepG，其中所述多核苷酸模板在模板位置+1处包含2′-脱氧胸苷残基。
试剂盒
本文还提供了试剂盒，诸如包含本公开的RNA聚合酶变体的体外转录试剂盒。试剂盒可以包含本文所述的任何一种或多种(至少一种)IVT组分和任何一种或多种(至少一种)RNA聚合酶变体。例如，试剂盒可以包含缓冲体系、NTP和T7 RNA聚合酶变体，所述T7 RNA聚合酶变体具有SEQ ID NO：1、99或100的氨基酸序列，所述氨基酸序列在位置E42、S43、Y44、E45、M46、G47、A255、R257、A258、G259、A260、L261和/或A262处具有至少一个(或至少两个、或至少三个)氨基酸取代，以及任选地在C末端上的至少一个氨基酸添加。
附加实施方案
以下编号的段落涵盖了本公开的附加实施方案：
1.一种核糖核酸(RNA)聚合酶变体，其相对于野生型RNA聚合酶包含至少一个氨基酸取代，所述至少一个氨基酸取代导致所述RNA聚合酶变体的至少一个环结构随着所述RNA聚合酶变体从起始复合物转变成延伸复合物经历向螺旋结构的构象变化。
2.如段落1所述的RNA聚合酶变体，其中所述至少一个氨基酸取代相对于野生型氨基酸具有较高的螺旋倾向性。
3.如段落1或2所述的RNA聚合酶变体，其中所述RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶。
4.如段落1-3中任一项所述的RNA聚合酶变体，其中所述至少一个环结构呈C螺旋结构。
5.如段落1-4中任一项所述的RNA聚合酶变体，其中所述至少一个环结构呈C接头结构。
6.如段落1-4中任一项所述的RNA聚合酶变体，其中所述至少一个氨基酸取代是至少一个高螺旋倾向性氨基酸取代。
7.如段落6所述的RNA聚合酶变体，其中所述至少一个高螺旋倾向性酸取代选自丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸。
8.如段落7所述的RNA聚合酶变体，其中所述至少一个高螺旋倾向性氨基酸取代是丙氨酸。
9.如段落4-8中任一项所述的RNA聚合酶变体，其中所述T7RNA聚合酶包含由SEQID NO：1、SEQ ID NO：99或SEQ ID NO：100识别的氨基酸序列，所述氨基酸序列经修饰以在选自E42、S43、Y44、E45、M46、G47、R257和G259的位置处包含高螺旋倾向性氨基酸的至少一个氨基酸取代。
10.如段落9所述的RNA聚合酶变体，其中所述至少一个氨基酸取代包括S43A。
11.如段落9所述的RNA聚合酶变体，其中所述至少一个氨基酸取代包括G47A。
12.如段落5-8中任一项所述的RNA聚合酶变体，其中所述T7RNA聚合酶包含由SEQID NO：1、SEQ ID NO：99或SEQ ID NO：100识别的氨基酸序列，所述氨基酸序列经修饰以在选自R257、A258、G259、A260、L261和A262的位置处包含高螺旋倾向性氨基酸的至少一个氨基酸取代。
13.如段落12所述的RNA聚合酶变体，其中所述至少一个氨基酸取代包括R257A。
14.如段落12所述的RNA聚合酶变体，其中所述至少一个氨基酸取代包括G259A。
15.一种T7核糖核酸(RNA)聚合酶，其包含由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：99或SEQ IDNO：100识别的氨基酸序列，所述氨基酸序列经修饰以在位置G47、S43、R257或G259处包含高螺旋倾向性氨基酸的氨基酸取代。
16.如段落15所述的T7 RNA聚合酶，其中所述高螺旋倾向性氨基酸选自丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸。
17.如段落16所述的T7 RNA聚合酶，其中所述高螺旋倾向性氨基酸是丙氨酸。
18.一种T7 RNA聚合酶，其包含由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：107或SEQ ID NO：108识别的氨基酸序列。
19.一种T7 RNA聚合酶，其包含由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：109或SEQ ID NO：110识别的氨基酸序列。
20.一种T7 RNA聚合酶，其包含由SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：111或SEQ ID NO：112识别的氨基酸序列。
21.一种T7 RNA聚合酶，其包含由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：113或SEQ ID NO：114识别的氨基酸序列。
22.一种制备核糖核酸(RNA)的方法，其包括使DNA模板与如段落1-21中任一项所述的RNA聚合酶在导致产生RNA转录物的条件下接触。
23.一种进行体外转录(IVT)反应的方法，其包括在存在三磷酸核苷和缓冲液的情况下，使DNA模板与如段落1-21中任一项所述的RNA聚合酶在导致产生RNA转录物的条件下接触。
24.如段落23所述的方法，其中所产生的所述RNA转录物，在任选地以未纯化形式递送至细胞中时，刺激相对于使用野生型RNA聚合酶所产生的RNA低至少50％的细胞因子应答。
25.如段落23-24中任一项所述的方法，其中通过IVT产生的双链RNA转录物的浓度相对于使用野生型聚合酶产生的dsRNA转录物低至少50％。
26.如段落23-25中任一项所述的方法，其中少于20％的所产生的所述RNA转录物展现出3’异质性。
27.如段落23-26中任一项所述的方法，其中少于50％的所产生的所述RNA转录物是截短RNA转录物。
28.如段落23-28中任一项所述的方法，其中少于50％的所产生的所述RNA转录物是连缀RNA转录物。
29.如段落23-28中任一项所述的方法，其中所产生的全长RNA转录物的量比所述DNA模板的量大至少15倍。
30.如段落23-29中任一项所述的方法，其中截短RNA转录物：全长RNA转录物的比率小于1∶1。
31.如段落23-30中任一项所述的方法，其中所产生的所述RNA转录物相对于所述DNA模板每100个核苷酸具有少于1个突变。
32.一种核酸，其编码如段落1-21中任一项所述的RNA聚合酶。
33.一种载体，其包含如段落33所述的核酸。
34.一种宿主细胞，其包含如段落33所述的核酸或如段落34所述的载体。
35.一种试剂盒，其包含如段落1-21中任一项所述的RNA聚合酶。
36.一种组合物，其包含如段落1-21中任一项所述的RNA聚合酶。
37.一种由段落22-31中任一项所述的方法产生的核糖核酸(RNA)。
38.如段落37所述的RNA，其配制在脂质纳米颗粒中。
39.如段落38所述的RNA，其中所述脂质纳米颗粒包含20％-60％可电离氨基脂质、5％-25％非阳离子脂质、25％-55％固醇和0.5％-15％PEG修饰的脂质的摩尔比。
40.一种用于核糖核酸(RNA)合成的共转录加帽方法，所述方法包括使多核苷酸模板与T7 RNA聚合酶变体、三磷酸核苷，以及帽类似物在体外转录反应条件下反应以产生RNA转录物。
41.如段落40所述的方法，其中所产生的RNA转录物的大于80％、大于85％或大于90％包括功能性帽。
42.如段落41所述的方法，其中所产生的RNA的大于95％转录物包括功能性帽。
43.如段落40-42中任一项所述的方法，其中所述三磷酸核苷包括未修饰或修饰的ATP、修饰或未修饰的UTP、修饰或未修饰的GTP，和/或修饰或未修饰的CTP。
44.如段落40-43中任一项所述的方法，其中所述T7 RNA聚合酶变体是如段落1-21中任一项所述的T7聚合酶变体。
45.如段落44所述的方法，其中所述T7聚合酶变体包含由SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：99或SEQ ID NO：100识别的氨基酸序列，所述氨基酸序列经修饰以在选自E42、S43、Y44、E45、M46、G47、R257和G259的位置处包含高倾向氨基酸的至少一个氨基酸取代。
46.如段落40-45中任一项所述的方法，所述T7聚合酶变体包含由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：99或SEQ ID NO：100识别的氨基酸序列，所述氨基酸序列经修饰以包含G47A的氨基酸取代。
47.如段落40-45中任一项所述的方法，所述T7聚合酶变体包含由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：99或SEQ ID NO：100识别的氨基酸序列，所述氨基酸序列经修饰以包含S43A的氨基酸取代。
48.如段落40-47中任一项所述的方法，其中所述三磷酸核苷和帽类似物以等摩尔浓度存在于所述反应中。
49.如段落40-47中任一项所述的方法，其中在反应中帽类似物与三磷酸核苷的摩尔比大于1∶1。
50.如段落40-47中任一项所述的方法，其中在反应中帽类似物与三磷酸核苷的摩尔比小于1∶1。
51.如段落40-50中任一项所述的方法，其中所述帽类似物是二核苷酸帽、三核苷酸帽或四核苷酸帽。
52.如段落40-50中任一项所述的方法，其中所述帽类似物是三核苷酸帽。
53.如段落51所述的方法，其中所述三核苷酸帽包含选自以下序列的序列：GAA、GAC、GAG、GAU、GCA、GCC、GCG、GCU、GGA、GGC、GGG、GGU、GUA、GUC、GUG和GUU。
54.如段落53所述的方法，其中所述三核苷酸帽包含选自以下序列的序列：m7GpppApA、m7GpppApC、m7GpppApG、m7GpppApU、m7GpppCpA、m7GpppCpC、m7GpppCpG、m7GpppCpU、m7GpppGpA、m7GpppGpC、m7GpppGpG、m7GpppGpU、m7GpppUpA、m7GpppUpC、m7GpppUpG，和m7GpppUpU。
55.如段落53所述的方法，其中所述三核苷酸帽包含选自以下序列的序列：m7G3′ OMepppApA、m7G3′OMepppApC、m7G3′OMepppApG、m7G3′OMepppApU、m7G3′OMepppCpA、m7G3′OMepppCpC、m7G3′OMepppCpG、m7G3′OMepppCpU、m7G3′OMepppGpA、m7G3′OMepppGpC、m7G3′OMepppGpG、m7G3′ OMepppGpU、m7G3′OMepppUpA、m7G3′OMepppUpC、m7G3′OMepppUpG，以及m7G3′OMepppUpU。
56.如段落53所述的方法，其中所述三核苷酸帽包含选自以下序列的序列：m7G3′ OMepppA2′OMepA、m7G3′OMepppA2′OMepC、m7G3′OMepppA2′OMepG、m7G3′OMepppA2′OMepU、m7G3′OMepppC2′ OMepA、m7G3′OMepppC2′OMepC、m7G3′OMepppC2′OMepG、m7G3′OMepppC2′OMepU、m7G3′OMepppG2′OMepA、m7G3′ OMepppG2′OMepC、m7G3′OMepppG2′OMepG、m7G3′OMepppG2′OMepU、m7G3′OMepppU2′OMepA、m7G3′OMepppU2′ OMepC、m7G3′OMepppU2′OMepG，和m7G3′OMepppU2′OMepU。
57.如段落53所述的方法，其中所述三核苷酸帽包含选自以下序列的序列：m7GpppA2′OMepA、m7GpppA2′OMepC、m7GpppA2′OMepG、m7GpppA2′OMepU、m7GpppC2′OMepA、m7GpppC2′ OMepC、m7GpppC2′OMepG、m7GpppC2′OMepU、m7GpppG2′OMepA、m7GpppG2′OMepC、m7GpppG2′OMepG、m7GpppG2′OMepU、m7GpppU2′OMepA、m7GpppU2′OMepC、m7GpppU2′OMepG，和m7GpppU2′OMepU。
58.如段落53-57中任一项所述的方法，其中所述三核苷酸帽包含选自以下序列的序列：GAG、GCG、GUG和GGG。
59.如段落58所述的方法，其中所述三核苷酸帽包含序列GAG。
60.如段落59所述的方法，其中所述三核苷酸帽包含GpppA2′OmepG。
61.如段落40-60中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸模板在模板位置+1处包括2′-脱氧胸苷残基。
62.如段落40-60中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸模板在模板位置+1处包括2′-脱氧胞苷残基。
63.一种用于RNA合成的共转录加帽方法，所述方法包括使多核苷酸模板与以下各项在体外转录反应条件下反应以产生RNA转录物：(a)T7 RNA聚合酶变体，其相对于野生型RNA聚合酶包含至少一个氨基酸取代，所述至少一个氨基酸取代导致所述RNA聚合酶变体的至少一个环结构随着所述RNA聚合酶变体从起始复合物转变成延伸复合物经历向螺旋结构的构象变化；(b)三磷酸核苷；和(c)三核苷酸帽，其包含序列GpppA2′OmepG，其中所述多核苷酸模板在模板位置+1处包含2′-脱氧胸苷残基。
64.如段落40-63中任一项所述的方法，其中所产生的所述RNA转录物，在任选地以未纯化形式递送至细胞中时，未刺激可检测的细胞因子应答。
65.一种组合物，其包含体外转录的(IVT)RNA和药学上可接受的赋形剂，其中所述组合物在不存在IVT后纯化的情况下基本上不含细胞因子诱导的RNA污染物。
66.一种组合物，其包含体外转录的(IVT)RNA和药学上可接受的赋形剂，其中所述组合物具有少于5％未加帽的RNA类别。
67.如段落65或66所述的组合物，其中所述IVT RNA的大于80％、85％或90％包括功能性帽。
68.如段落67所述的组合物，其中所述IVT RNA的大于95％包含功能性帽。
69.如段落65-68中任一项所述的组合物，其中所述IVT RNA未经化学修饰。
70.如段落65-68中任一项所述的组合物，其中所述IVT RNA经化学修饰。
71.如段落65-70中任一项所述的组合物，其中所述IVT RNA的大于95％包含单链全长转录物。
72.如段落65-71中任一项所述的组合物，其中所述RNA通过包括以下的方法来产生：
使多核苷酸模板与以下各项在体外转录反应条件下反应以产生RNA转录物：(a)T7RNA聚合酶变体，其相对于野生型RNA聚合酶包含至少一个氨基酸取代，所述至少一个氨基酸取代导致所述RNA聚合酶变体的至少一个环结构随着所述RNA聚合酶变体从起始复合物转变成延伸复合物经历向螺旋结构的构象变化；(b)三磷酸核苷；和(c)三核苷酸帽，其包含序列GpppA2′OmepG，其中所述多核苷酸模板在模板位置+1处包含2′-脱氧胸苷残基。
73.一种T7 RNA聚合酶，其相对于野生型T7 RNA聚合酶包含至少一个额外的C末端氨基酸。
74.如段落73所述的T7 RNA聚合酶，其包含至少两个额外的C末端氨基酸。
75.如段落74所述的T7 RNA聚合酶，其中所述至少两个额外的C末端氨基酸包括相同类型的氨基酸或至少两个不同类型的氨基酸。
76.如段落73-75中任一项所述的T7 RNA聚合酶，其包含1至10个额外的C末端氨基酸。
77.如段落76所述的T7 RNA聚合酶，其包含1至5个额外的C末端氨基酸。
78.如段落73-77中任一项所述的T7 RNA聚合酶，其中所述T7RNA聚合酶包含C末端，所述C末端包含FAFAXn基序，其中X是任何氨基酸并且n是大于零的任何整数。
79.如段落78所述的T7 RNA聚合酶，其中X是G或A，并且任选地其中Xn是GG或AA。
80.如段落78或79所述的T7 RNA聚合酶，其中n是1、2、3、4或5。
81.一种T7 RNA聚合酶，其包含C末端，所述C末端包含FAFAG基序。
82.一种T7 RNA聚合酶，其包含C末端，所述C末端包含XAFAXn基序、FXFAXn基序、FAXAXn基序或FAFXXn基序，其中每个X是任何氨基酸，并且n是大于零的任何整数。
83.如段落73-82中任一项所述的T7 RNA聚合酶，其中所述T7RNA聚合酶在与野生型T7 RNA聚合酶的位置S43、G47、R257或G259对应的位置处包含至少一个取代基，以及任选地至少一个额外的氨基酸取代。
84.如段落83所述的T7 RNA聚合酶，其中所述野生型T7 RNA聚合酶包含由SEQ IDNO：1识别的氨基酸序列。
85.一种T7 RNA聚合酶，其包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列，所述氨基酸序列经修饰以包含选自G47、S43、R257和G259的至少一个取代以及任选地至少一个额外的氨基酸取代。
86.一种T7 RNA聚合酶，其包含SEQ ID NO：100、294、296或296中任一种的氨基酸序列，所述氨基酸序列经修饰以包含选自G47、S43、R257和G259的至少一个取代以及任选地至少一个额外的氨基酸取代。
87.如段落83-86中任一项所述的T7 RNA聚合酶，其包含选自S43A、G47A、R257A和G259A的至少一个取代。
88.一种T7 RNA聚合酶，其包含SEQ ID NO：294-313中的任一种的氨基酸序列，其中x是任何氨基酸并且n是任何整数，例如在1与5之间的整数(例如1、2、3、4或5)，并且任选地其中所述T7 RNA聚合酶进一步包含至少一个额外的氨基酸取代。
89.一种进行体外转录(IVT)反应的方法，其包括在存在三磷酸核苷和缓冲液的情况下，使DNA模板与如段落73-88中任一项所述的RNA聚合酶在导致产生RNA转录物的条件下接触。
90.如段落89所述的方法，其中所产生的RNA在递送至细胞中时刺激相对于使用WTT7 RNAP所产生的dsRNA低至少50％的细胞因子应答。
91.如段落90所述的方法，其中所述RNA以未纯化形式递送至细胞中。
92.如段落89-92中任一项所述的方法，其中所产生的所述RNA转录物的少于30％展现出3’异质性。
93.一种核酸，其编码如段落73-92中任一项所述的RNA聚合酶。
94.一种载体，其包含如段落93所述的核酸。
95.一种宿主细胞，其包含如段落93所述的核酸或如段落94所述的载体。
96.一种试剂盒，其包含如段落73-92中任一项所述的RNA聚合酶。
97.一种组合物，其包含如段落73-92中任一项所述的RNA聚合酶。
98.一种由段落89-92中任一项所述的方法产生的核糖核酸(RNA)。
99.如段落98所述的RNA，其配制在脂质纳米颗粒中。
100.如段落98所述的RNA，其中所述脂质纳米颗粒包含20％-60％可电离氨基脂质、5％-25％非阳离子脂质、25％-55％固醇和0.5％-15％PEG修饰的脂质的摩尔比。
101.一种RNA聚合酶，其相对于对应的野生型RNA聚合酶包含至少一个额外的C末端氨基酸，任选地其中至少一个额外C末端氨基酸包含甘氨酸(G)和/或丙氨酸(A)。
102.如段落101所述的RNA聚合酶，其中所述RNA聚合酶选自T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶。
103.如段落101或102所述的RNA聚合酶，其中所述RNA聚合酶进一步包含至少一个额外的氨基酸取代，任选地进一步包含与选自S43A、G47A、R257A和G259A的SEQ ID NO：1的氨基酸取代对应的氨基酸取代。
104.如段落101-104中任一项所述的RNA聚合酶，其中所述RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶，其包含与SEQ ID NO：1至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列，所述氨基酸序列经修饰以在位置43、47、257和/或259位置处包含氨基酸取代，任选地其中氨基酸取代是丙氨酸(A)。
105、如段落101-104中任一项所述的RNA聚合酶，其中所述RNA聚合酶是T3 RNA聚合酶，其包含与SEQ ID NO：6至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列，所述氨基酸序列经修饰以在位置44、48、258和/或260位置处包含氨基酸取代，任选地其中氨基酸取代是丙氨酸(A)。
106、如段落101-104中任一项所述的RNA聚合酶，其中所述RNA聚合酶是SP6 RNA聚合酶，其包含与SEQ ID NO：7至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列，所述氨基酸序列经修饰以在位置15、19、230和/或232位置处包含氨基酸取代，任选地其中氨基酸取代是丙氨酸(A)。
107、一种T7 RNA聚合酶，其包含与SEQ ID NO：1至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列，所述氨基酸序列经修饰以在位置43、47、257和/或259位置处包含氨基酸取代，任选地其中氨基酸取代是丙氨酸(A)。
108、一种T3 RNA聚合酶，其包含与SEQ ID NO：6至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列，所述氨基酸序列经修饰以在位置44、48、258和/或260位置处包含氨基酸取代，任选地其中氨基酸取代是丙氨酸(A)。
109、一种SP6 RNA聚合酶，其包含与SEQ ID NO：7至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列，所述氨基酸序列经修饰以在位置15、19、230和/或232位置处包含氨基酸取代，任选地其中氨基酸取代是丙氨酸(A)。
表1.RNA聚合酶序列
Figure BDA0002448127370000891
Figure BDA0002448127370000901
Figure BDA0002448127370000911
表2.RNA聚合酶C末端变体序列
Figure BDA0002448127370000921
Figure BDA0002448127370000931
Figure BDA0002448127370000941
Figure BDA0002448127370000951
Figure BDA0002448127370000961
实施例
实施例1.变体T7 RNA聚合酶的产生
产生具有表3和4中所示的取代的C螺旋和C接头T7 RNA聚合酶变体。
表3.T7 RNA聚合酶变体
Figure BDA0002448127370000962
Figure BDA0002448127370000971
Figure BDA0002448127370000981
Figure BDA0002448127370000991
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表4.T7 RNA聚合酶C末端变体
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实施例2.使用T7 RNA聚合酶变体产生的hEPO mRNA纯度与使用野生型T7 RNA聚合酶产生的hEPO mRNA纯度相当。
使用hEPO DNA模板和(1)野生型(WT)T7 RNA聚合酶(WT#1和WT#2)、(2)G47A C末端G T7 RNA聚合酶变体(“G47A*”)(SEQ ID NO：110)，和(3)S43A C末端G T7 RNA聚合酶变体(“S43A*)(SEQ ID NO：108)进行体外转录反应。DBAA(乙酸二丁铵)HPLC分析显示，所有hEPO转录物的纯度均大约相同(图1)。
实施例3.使用T7 RNA聚合酶变体产生的hEPO mRNA不会诱发细胞因子应答。
用实施例2中所述的IVT反应产生的hEPO mRNA转染BJ成纤维细胞。未纯化mRNA或通过反相(RP)色谱纯化mRNA。如图2(左图)所示，使用S43A* T7 RNA聚合酶变体或G47A* T7RNA聚合酶变体产生的未纯化mRNA与使用WT T7聚合酶产生的纯化mRNA一样‘冷淡’(未诱发细胞因子应答)。大约等效的mRNA表达水平示于图2中(右图)。这些实验中使用的mRNA不含任何核苷酸修饰。
使用含有m1ψ核苷酸修饰(图3，上图)或mo5U核苷酸修饰(图3，下图)的hEPO mRNA重复相似的细胞转染测定。使用G47A*和S43A* T7 RNA聚合酶变体产生的未纯化m1ψ hEPOmRNA转染的BJ成纤维细胞比使用WT T7 RNA聚合酶产生的未纯化m1ψ hEPO mRNA转染的细胞展现出更低的IFNβ应答。大约等效的mRNA表达水平示于图4中。
然后使用单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)进一步检查细胞因子应答。在用在实施例2中所述的条件下产生的hEPO mRNA转染的MDM中，测量IP10与次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)的比率。MDM对未修饰的化学物质非常敏感，因此使用未修饰的hEPOmRNA无法观察到样品之间的巨大差异。然而，使用G47A*和S43A* T7 RNA聚合酶变体产生的未纯化m1ψ hEPO mRNA转染的MDM比使用WT T7 RNA聚合酶产生的纯化的m1ψ hEPO mRNA转染的MDM展现出更低的IP10应答(图5，上图)。
实施例4.与WT T7 RNA聚合酶相比，T7 RNA聚合酶变体产生与较少污染性dsRNA相关的mRNA。
使用标准dsRNA ELISA评估用于产生未修饰的hEPO mRNA(图7)或含有m1ψ核苷酸修饰的hEPO mRNA(图8，上图)或mo5U核苷酸修饰(图8，下图)的IVT反应中的dsRNA污染物(例如，长于40个核苷酸碱基对)。dsRNA测定表明，S43A* T7 RNA聚合酶变体和G47A* T7 RNA聚合酶变体产生比WT T7 RNA聚合酶更少的dsRNA(图7和8)。
实施例5.T7 RNA聚合酶变体降低mRNA的3’异质性。
转录物的3’异质性可以使用RNA酶T1消化来测量。RNA酶T1特异性地在G核苷酸之后切割mRNA。核酸内切切割产生5’氢氧化物(OH)和3’一磷酸(mP)‘疤痕’。因此，RNA酶T1消化可以用于区分在3’末端处具有和不具有非模板化添加的转录物。在此实施例中，在实施例2中产生的hEPO mRNA以polyA尾部和XbaI限制位点(例如AnUCUAG)封端。使用WT T7 RNA聚合酶、S43A* T7 RNA聚合酶变体或G47A* T7 RNA聚合酶变体产生的hEPO mRNA用RNA酶T1消化，并且通过LCMS分析以产生寡核苷酸指纹。发现纯净的3’末端(5’OH/3’OH)在32780Da处达到峰值，而‘疤痕’(5’OH/3’mP)在32860Da处达到峰值(图9A)。‘疤痕’指示转录物在羧基末端处具有非模板化添加。使用T7 RNA聚合酶变体S43A*或G47A*产生的hEPO mRNA具有更高的3’末端群体分布，指示它们具有更纯净的3’末端和改善的3’末端异质性(图9B)。
实施例6.T7 RNA聚合酶变体产生‘更纯净’的3’末端
使用测定法来探究由T7 RNAP变体G47A*和S43A*产生的非模板化添加的程度。在此测定中，使用酶促聚合酶制备连接左聚体(参见例如图11A)。然后将左聚体连接至与5′-单磷酸化的右聚体RNA紧邻的完全互补的DNA夹板。DNA夹板通常是40nt长，而右聚体的5’末端通常装饰有荧光团。然后在催化条件下添加DNA连接酶I，并且使连接进行所需的反应时间，之后用EDTA淬灭反应。然后将混合物在95℃的4M脲中变性5分钟，然后上样到变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE-D)上(图11B)。凝胶中丙烯酰胺的百分比取决于预期构建体的长度，但对于长度大于50nt的左聚体，通常是6％丙烯酰胺，并且对于接近典型mRNA长度的左聚体，通常是20％丙烯酰胺。6％丙烯酰胺凝胶在恒定的180V下运行25分钟，而20％丙烯酰胺凝胶在恒定的180V下运行120分钟。然后使用适于右聚体和新连接产物上存在的荧光团的激发和发射波长，使凝胶在Typhoon或类似的扫描仪上成像。基于大小，右聚体和连接产物在凝胶上不同地迁移，并且两个带的强度将精确对应于连接反应的效率。在左聚体的酶促合成期间未模板化核苷酸添加的程度越大，预期的连接产率越低。
连接产率计算为对应于未连接右聚体和连接的全长产物的带的比率。尽早终止反应以扩大反应产率的差异。基于这些结果，T7 RNAP变体G47A*在左聚体RNA的3’处末端掺入最少的未模板化核苷酸。
实施例7.在单一体外转录反应中产生加帽mRNA
在标准的体外转录(IVT)测定中，T7 RNA聚合酶偏好以5’GTP起始转录。通过此类标准的IVT测定产生的单链RNA(ssRNA)分子需要单独的酶促加帽步骤(图13)。例如，可以使用牛痘加帽酶和2′-O-甲基转移酶(2′OMT酶)在加帽测定中产生帽1RNA(7mGpppN2′-Om-RNA)。帽1通常用于细胞中有效的蛋白质翻译和mRNA稳定性。但是，有些mRNA序列难以加帽，并且加帽/甲基化酶非常昂贵。
在一些实施方案中，本公开提供了使用本文所述的T7 RNA聚合酶变体(例如，T7RNA聚合酶变体G47A*)在体外转录测定中用三核苷酸共转录地将ssRNA(例如mRNA)加帽的方法。有效的共转录加帽通常包括双链DNA(dsDNA)模板，该模板起始5′ATP和等摩尔浓度的NTP和三核苷酸的转录。通常，T7 RNA聚合酶的5’ATP起始活性大大降低。然而，在存在XAG(其中X是任何核苷酸，例如5′mGppp)三核苷酸的情况下，T7 RNA聚合酶对5’ATP的有限起始活性驱动三核苷酸而不是5’ATP的起始，从而共转录地产生加帽的mRNA产物。
示例性市售二核苷酸和三核苷酸帽示于图14A中。牛痘帽1是典型的二核苷酸帽并且不能共转录地添加。可以共转录添加的另一种二核苷酸帽是抗逆帽类似物(ARCA)，其也是市售的(例如，购自Thermo Fisher，目录号：AM8045)。ARCA是一种经修饰帽类似物，其中3′OH基团(更接近m7G)被-OCH3置换。在本研究中所述的某些共转录加帽测定中，ARCA被用作对照。
在共转录加帽测定中，使用了人EPO(hEPO)DNA模板。在测定混合物中还存在含或不含5mM三核苷酸尸GpppAG、mGmpppAG和ARCA)的5mM NTP。通过RNA酶H帽测定或LCMS分析未修饰的mRNA产物。如表5所示，野生型(WT)T7 RNA聚合酶和T7 RNA聚合酶变体G47A*都能够以同样高的效率产生完全加帽的mRNA。在不同的IVT反应之间，RNA产量相当(图14B)，并且产生了具有高完整度的mRNA产物(图14C)。
表5.WT T7 RNA聚合酶或T7 RNA聚合酶变体G47A＊的加帽效率
T7 RNA聚合酶 三核苷酸 加帽效率(％)
WT - 0.0
T7 RNA聚合酶变体G47A<sup>*</sup> - 0.0
WT m<sup>7</sup>GpppAG 93.9
T7 RNA聚合酶变体G47A<sup>*</sup> m<sup>7</sup>GpppAG 100.0
WT m<sup>7</sup>GpppAG 100.0
T7 RNA聚合酶变体G47A<sup>*</sup> m<sup>7</sup>GpppAG 100.0
通过评估mRNA产物在BJ成纤维细胞中诱导细胞因子(IFNβ)产生的能力来评估其免疫刺激活性。有趣的是，WT T7 RNA聚合酶产生了诱导高细胞因子应答的未修饰mRNA，而T7 RNA聚合酶变体G47A*产生了在BJ成纤维细胞中未刺激细胞因子产生的未修饰mRNA(图14D)，从而将在IVT/加帽测定之后进一步纯化RNA的需要降至最低。还评估了来自mRNA产物的hEPO表达。从WT T7 RNA聚合酶产生的mRNA中未观察到hEPO表达，而由T7 RNA聚合酶变体G47A*产生的mRNA导致与用牛痘帽1加帽的1-甲基-假尿苷修饰的mRNA相当的hEPO表达(图14E)。LCMS实验还显示T7 RNA聚合酶变体G47A*产生比WT T7 RNA聚合酶更纯净的RNA，但三核苷酸掺入效率对于两种酶而言似乎是等效的(图15)。
在另一个实验中，将T7 RNA聚合酶变体G47A*的加帽效率与使用牛痘帽1的标准加帽测定中获得的效率进行了比较。在此实验中，反应混合物含有在模板链上的位置+1处具有脱氧胸苷(对于第一个模板化核苷酸也称为“Astart”)的hEPO dsDNA模板、T7 RNA聚合酶变体G47A*和等摩尔(7.5mM)NTP和GAG三核苷酸。使用寡核苷酸dT纯化所得的mRNA产物，并且分析其加帽效率、体外细胞因子反应和体外表达。结果显示，T7 RNA聚合酶变体G47A*产生了与标准加帽方法相当高效的加帽mRNA(表6)，mRNA在BJ成纤维细胞中未诱导细胞因子应答(图16A)，并且mRNA在BJ成纤维细胞中导致高hEPO表达(图16B)。
表6.共转录加帽和标准方法的加帽效率
帽同一性 功能性帽％
未加帽 0
GAG(一锅法) 96.0
牛痘帽1(+RP) 99.8
总之，本文表明，在存在XAG三核苷酸(例如GAG或GmAG)的情况下，T7 RNA聚合酶变体G47A*可以有效地在模板链的3’dTTP处起始转录。以与测定中的NTP等摩尔浓度提供，可以共转录添加三核苷酸以产生不刺激免疫反应并导致高蛋白表达的完全加帽的nRNA(图17)。
实施例8.用5’GTP(Gstart)或5’ATP(Astart)进行转录起始的比较
使用实施例7中所述的共转录加帽测定，比较了转录起始需要5’-GTP(Gstart)或5’-ATP(Astart)的模型构建体的加帽效率。编码5'UTR和47聚体RNA寡核苷酸的模型构建体用作IVT的模板。通过质谱法评估了总RNA产物，并且结果表明，与Gstart构建体相比，Astart构建体更有效地掺入了GAG或GmAG三核苷酸(图18A)。尽管此处未示出数据，但也观察到Cstart和Ustart构建体产生少量的加帽产物。
此外，将RNA产物进行RNA酶H切割，并且使用质谱分析RNA产物的切割5’末端以确定帽的存在。获得了与总RNA产物类似的结果(图18B)。
还使用图18A和18B中使用的模型构建体进行了三核苷酸滴定实验。在共转录加帽测定中，使用5mM NTP(等摩尔比的A、经修饰的U、G、C)，同时改变三核苷酸(GAG或GmAG)的浓度以评估NTP与三核苷酸不同摩尔比的加帽效率。然后通过LC-MS分析粗RNA产物。结果显示，对于GAG和GmAG，当NTP和三核苷酸处于等摩尔比时，加帽效率最高(表7)。
表7.三核苷酸滴定
三核苷酸浓度(mM) 帽％(GAG) 帽％(GmAG)
5(EQ) 96.0 88.3
4 92.8 85.6
3 90.3 82.8
2 81.7 74.5
1 66.1 57.0
0.5 42.5 48.6
0 0 0
实施例9. 1-甲基-假尿苷化学修饰的mRNA的加帽
还评估了用1-甲基-假尿苷化学修饰的mRNA的共转录加帽。使用了三种模型构建体：hEPO、Luc(编码荧光素酶)和eGFP。所有IVT模板都是Astart模板。模板可以是PCR片段或质粒。加帽测定反应混合物含有模板、T7 RNA聚合酶变体G47A*、7.5mM NTP和7.5mM三核苷酸(GAG或GmAG)。NTP中的UTP被1-甲基假尿苷置换以产生化学修饰的mRNA。牛痘帽1用作标准加盖测定中的生产对照。使用RNA酶H帽测定、T1指纹分析和片段分析仪分析mRNA产品以确定其完整性。还测试了mRNA产物在BJ成纤维细胞中诱导细胞因子应答和表达编码蛋白的能力。
如表8所示，对于由PCR片段模板产生的所有三种模型构建体，用1-甲基-假尿苷化学修饰的mRNA被有效地加帽，加帽效率与牛痘帽1对照相当。化学物质A表示使用未修饰的三磷酸尿苷核苷酸，并且化学物质B表示使用1-甲基-假尿苷三磷酸核苷酸。化学物质C表示5-甲基-胞苷三磷酸和1-甲基-假尿苷三磷酸核苷酸。对于用由质粒模板产生的1-甲基-假尿苷化学修饰的mRNA，获得了类似的结果(表9)。此外，RNA酶T1指纹分析显示，使用PCR片段模板由模型构建体产生的mRNA具有正确的序列(图19A)。由PCR片段模板(图19B)或质粒模板(图20C)产生的mRNA也显示具有高完整度。由PCR片段模板以及质粒模板产生的加帽mRNA在BJ成纤维细胞中未诱导任何细胞因子表达(图19C，图20D)。此外，由质粒模板产生的mRNA导致在BJ成纤维细胞中表达编码蛋白(图20E-20G)。GAG加帽的mRNA的表达水平比牛痘帽1对照mRNA的表达水平稍高、相当或略低。
表8. 1-甲基-假尿苷化学修饰的mRNA的加帽效率-PCR片段模板
构建体 帽 帽％(报告％)
hEPO 未加帽 0
hEPO 帽1(牛痘) 99.8(n/a)
hEPO GAG(三核苷酸) 96.1
hEPO GmAG(三核苷酸) 94.9
Luc 未加帽 0
Luc 帽1(牛痘) 85.7(100％)
Luc GAG(三核苷酸) 94.4
Luc GmAG(三核苷酸) 93.3
eGFP 未加帽 0
eGFP 帽1(牛痘) 99.4(88％)
eGFP GAG(三核苷酸) 93.8
eGFP GmAG(三核苷酸) 94.9
表9. 1-甲基-假尿苷化学修饰的mRNA的加帽效率-质粒模板
Figure BDA0002448127370002481
Figure BDA0002448127370002491
还使用用于模型构建体hEPO(图20A)和eGFP(图20B)的质粒模板针对反应评估了共转录加帽测定中的NTP消耗。结果显示，在整个测定持续过程中(2小时)几乎不消耗三核苷酸GAG和GmAG。这与测定中三核苷酸的浓度极端过量的事实是一致的。测定完成之后有可能回收三核苷酸。
实施例10.T7 RNA聚合酶C末端处的取代影响RNA产量
G47A*聚合酶在翻译蛋白的C末端处含有额外的甘氨酸(“脚甘氨酸”)。通过胰蛋白酶消化和纯化的G47A*蛋白的质谱分析确认了此脚甘氨酸的存在(数据未示出)。由于G47A*的C末端脚区域靠近G47A*的活性位点，因此对其作用进行了更详细的检查。
使用hEPO DNA模板和以下各项进行体外转录(IVT)反应：(1)野生型(WT)T7 RNA聚合酶(WT)，(2)具有脚甘氨酸的WT T7 RNA聚合酶(WT+G)，(3)具有两个脚甘氨酸的WT T7RNA聚合酶(WT+GG)，(4)具有两个脚丙氨酸的野生型RNA聚合酶(WT+AA)，(5)G47A T7 RNA聚合酶变体，(6)具有脚甘氨酸的G47A* T7 RNA聚合酶变体(G47A+G)，(7)具有两个脚甘氨酸的G47A T7 RNA聚合酶变体(G47A+GG)，(7)具有两个脚丙氨酸的G47A T7 RNA聚合酶变体(G47A+AA)，(9)S43A/G47A T7 RNA聚合酶变体(S43A/G47A)，和(10)具有脚甘氨酸的S43A/G47A T7 RNA聚合酶变体(S43A/G47A+G)。IVT反应混合物含有hEPO DNA模板，上文列出的T7RNA聚合酶变体之一和NTP。使用标准NTP(ATP、CTP、GTP、UTP)进行使用未修饰化学物质的IVT反应(图22)，而使用假尿苷修饰(m1ψ)的化学物质的IVT反应(图23)含有1-甲基假尿苷而不是UTP产生化学修饰的mRNA。通过UV吸收测量RNA产量。
在WT或G47A*变体T7 RNA聚合酶中存在脚甘氨酸的情况下，hEPO mRNA产量降低(图22-23)。使用两个脚甘氨酸残基或两个脚丙氨酸残基，mRNA产量持续下降，但与使用WTT7 RNA聚合酶相比，使用G47A*的下降幅度更少。
实施例11.T7 RNA聚合酶脚甘氨酸对3′-mRNA异质性的影响
将用WT或G47A* T7 RNAP与脚甘氨酸产生的hEPO mRNA用RNA酶T1消化，并且通过LCMS分析以产生寡核苷酸指纹，如实施例5中所述。使用等摩尔浓度的NTP(WT EQ)或摩尔过量的GTP和ATP(WTα(A))进行WT T7 RNAP IVT反应。LCMS分析揭示纯净的3’末端(5’OH/3’OH)在32780Da处达到峰值，而‘疤痕’(5’OH/3’mP)在32860Da处达到峰值(图24A)。‘疤痕’指示转录物在3’末端处具有非模板化添加。使用WT T7 RNAP和等摩尔浓度的NTP(WT EQ)产生的hEPO mRNA具有减少的3′末端群体分布，指示3′同质性降低并且具有非模板添加的连缀产物更多(图24B)。然而，使用G47A* T7 RNAP与足甘氨酸产生的hEPO mRNA具有更高的3’末端群体分布，指示它们具有更纯净的3’末端和改善的3’末端异质性(图24B)。
为了直接检查T7 RNAP脚区域对hEPO 3′mRNA同质性的影响，使用hEPO DNA模板和以下各者进行IVT反应：(1)野生型T7 RNAP聚合酶(WT)，(2)具有脚甘氨酸的WT T7 RNAP(WT+G)，(3)具有两个脚甘氨酸的WT T7 RNAP(WT+GG)，(4)具有两个脚丙氨酸的野生型T7 RNAP(WT+AA)，(5)G47A T7 RNAP变体，(6)具有脚甘氨酸的G47A* T7 RNAP变体(G47A+G)，(7)具有两个脚甘氨酸的G47A T7 RNAP变体(G47A+GG)，(8)具有两个脚丙氨酸的G47A T7 RNAP变体(G47A+AA)，(9)S43A/G47A T7 RNAP变体(S43A/G47A)，和(10)具有脚甘氨酸的S43A/G47AT7 RNAP变体(S43A/G47A+G)。IVT反应混合物含有hEPO DNA模板，上文列出的T7 RNAP变体之一和等摩尔NTP。进行IVT反应，其产生未修饰的mRNA(图24C)或假尿苷修饰的mRNA(图24D)。如实施例5及上文，用RNA酶T1消化hEPO mRNA。脚甘氨酸的存在使hEPO mRNA 3’末端同质性提高了60％(图24C-24D)。与WT或G47A T7 RNAP相比，T7 RNAP中的两个脚甘氨酸或两个脚丙氨酸也将3′末端同质性提高了60-70％(图24C-24D)。这些结果指示在T7 RNAP中单脚甘氨酸的存在可以增加图24B中观察到的3′末端同质性。
实施例12.T7 RNAP脚甘氨酸对免疫刺激的影响
如实施例7中所述，通过评估T7 RNAP脚甘氨酸在BJ成纤维细胞中诱导细胞因子(IFNβ)产生的能力来评估T7 RNAP脚甘氨酸在刺激对hEPO mRNA产物的免疫应答中的作用。有趣的是，虽然WT T7 RNAP产生的未修饰的和假尿苷修饰的hEPO mRNA诱导了高细胞因子应答，但是具有脚甘氨酸的WT T7 RNAP产生的未修饰的和假尿苷修饰的hEPO mRNA在BJ成纤维细胞中刺激了较少的细胞因子产生(图25)。由具有脚甘氨酸的G47A*变体T7 RNAP产生的hEPO mRNA在BJ成纤维细胞中未能刺激细胞因子产生，指示脚甘氨酸和G47A T7 RNA聚合酶变体之间的加成效应未能诱导免疫应答(图25)。
实施例13.T7 RNA聚合酶脚甘氨酸对mRNA产生的影响
开发了一种测定法，以探究脚甘氨酸残基对WT和G47A变异T7 RNAP产生的hEPOmRNA类别的影响。所测试的T7 RNAP酶是：(1)WT+G(脚甘氨酸)、(2)G47A变体，或(3)G47A变体+G(G47A*变体)。IVT反应含有列出的T7 RNAP之一、shORFan模板、NTP(未修饰或修饰的UTP)和32p-CTP。在所需的时间量之后，用EDTA终止反应。然后将反应混合物在95℃的4M脲中变性5分钟，然后上样到变性聚丙烯酰胺凝胶(20％丙烯酰胺)上(图26A)。将凝胶在20瓦特下运行30分钟并且然后在40瓦特下运行2h。将图像转移到磷光成像仪屏幕上(曝光时间为1小时)，之后使用Typhoon扫描仪进行成像。使用32P-CTP标记全长产物(箭头表示shORFanmRNA)、连缀转录产物(上方方框)(图26A)和反向互补mRNA产物(图26A，下方方框)。结果也汇总于下表10中。这些数据表明，与WT或G47A T7 RNAP相比，具有脚甘氨酸的T7 RNAP与污染较少的dsRNA相关(图26A(下方方框)和图26B)。此外，与WT或G47A变体T7 RNAP相比，脚甘氨酸与减少的连缀转录相关(图26A(上方方框)，图26B)。
表10.反向补体(RC)比率：全长(FL)mRNA
Figure BDA0002448127370002521
实施例14.重复剂量的编码萤火虫荧光素酶的三核苷酸加帽的G47A＊ mRNA的评估
通常，例如通过反相色谱法(RP)纯化体外转录的mRNA，以除去诱导细胞因子的杂质(dsRNA)和加工杂质(例如蛋白质/DNA)，并且提高总RNA的纯度。然而，此纯化方法通常导致mRNA产物的显著损失。消除RP减少周转时间，消除大规模的操作和工程复杂性，并节省成本。此外，在RP期间使用的高温会水解一部分mRNA，因此消除RP增加mRNA表达水平。因此，我们开发了一种mRNA生产和纯化策略来消除对RP的需求。通过此实施例中提供的方法产生的mRNA称为“三核苷酸加帽的G47A* mRNA”，其是在体外转录测定中使用G47A* T7 RNAP变体(具有G47A取代和额外的C端末G)用三核苷酸GpppA2′OmepG共转录加帽的mRNA。
在此实施例中，在MC3脂质纳米颗粒中配制了单次0.5mpk剂量的编码萤火虫荧光素酶(ffLuc)的mRNA，并且每周向C57B1/6只小鼠(n＝5)施用6周(第1天、第8天、第15天、第22天、第29天和第36天)。施用以下mRNA：(1)在存在等摩尔浓度的NTP的情况下使用野生型T7聚合酶产生，并通过寡核苷酸dT纯化(化学物质A方法1 dT)来纯化的未修饰mRNA；(2)在存在过量浓度的GTP/ATP的情况下，使用野生型T7聚合酶产生并通过反相色谱法(化学物质B方法2 RP)纯化的假尿苷修饰的mRNA；(3)在存在过量浓度的GTP/ATP的情况下，使用野生型T7聚合酶产生，并通过寡核苷酸dT纯化(化学物质B方法2dT)来纯化的假尿苷修饰的mRNA；(4)在存在等摩尔浓度的NTP的情况下，使用野生型T7聚合酶产生，并通过寡核苷酸dT纯化(化学物质B方法1 dT)来纯化的假尿苷修饰的mRNA；(5)通过反相色谱法(化学物质B方法3 RP)纯化的假尿苷修饰的三核苷酸加帽的G47A* Mrna(使用G47A* T7 RNAP变体加帽并产生的三核苷酸)；(6)通过寡核苷酸dT纯化(化学物质B方法3dT)来纯化的假尿苷修饰的三核苷酸加帽的G47A* mRNA；以及(7)使用G47A* T7 RNAP变体产生并通过寡核苷酸dT纯化(化学物质B方法4dT)来纯化的未加帽的假尿苷修饰的mRNA。每次给药后六小时，评估以下各者：血清细胞因子水平、mRNA表达和抗PEG IgM水平。在第36天给药后六小时评估B细胞活化。化学物质A表示使用未修饰的三磷酸尿苷核苷酸，并且化学物质B表示使用1-甲基-假尿苷三磷酸核苷酸。方法1是指IVT中的等摩尔NTP和牛痘帽1；方法2是指含有4∶2∶1∶1 GTP∶ATP∶CTP∶UTP的IVT(参见WO 2018/053209 A1，于2018年3月22日公布，通过引用全文并入本文)和牛痘帽1；方法3是指IVT中的等摩尔NTP和GAG；方法4是指IVT中的等摩尔NTP并且无帽。
在第1天和第29天，来自小鼠的血清细胞因子评估(IP-10)的结果示于图27A和图27B中，显示了三核苷酸加帽的G47A* mRNA在体内诱导类似于αmRNA对照的血清细胞因子水平。对于将mRNA递送至BJ人成纤维细胞中(图28A)和单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)中(图28B)的体外实验，结果类似。
mRNA表达研究(图29)显示，在6次每周剂量后，三核苷酸加帽的G47A* mRNA在体内保持高表达。
抗PEG IgM评估(图30)显示N1U三核苷酸加帽的G47A* mRNA在6次每周剂量后产生低抗PEG IgM水平。
B细胞活化分析(图31)显示，用三核苷酸加帽的G47A* mRNA转染的脾脏B细胞的活化较低，类似于αmRNA对照。
总体而言，这些结果指示，未进行RP纯化的编码ffLuc的三核苷酸加帽的G47A*mRNA不诱导高于基线的细胞因子应答，体内维持高表达水平，体内维持低抗PEG IgM水平，以及展现出低B细胞活化。
实施例15.重复剂量的编码人促红细胞生成素的三核苷酸加帽的G47A＊ mRNA的评估
在此实施例中，在MC3脂质纳米颗粒中配制了单次0.5mpk剂量的编码人促红细胞生成素(hEPO)的mRNA，并且每周向C57B1/6只小鼠(n＝5)施用6周(第1天、第8天、第15天、第22天、第29天和第36天)。施用以下mRNA：(1)在存在等摩尔浓度的NTP的情况下使用野生型T7聚合酶产生，并通过寡核苷酸dT纯化(化学物质A方法1 dT)来纯化的未修饰mRNA；(2)在存在过量浓度的GTP/ATP的情况下，使用野生型T7聚合酶产生并通过反相色谱法(化学物质B方法2 RP)纯化的假尿苷修饰的mRNA；(3)在存在过量浓度的GTP/ATP的情况下，使用野生型T7聚合酶产生，并通过寡核苷酸dT纯化(化学物质B方法2dT)来纯化的假尿苷修饰的mRNA；(4)在存在等摩尔浓度的NTP的情况下，使用野生型T7聚合酶产生，并通过寡核苷酸dT纯化(化学物质B方法1 dT)来纯化的假尿苷修饰的mRNA；(5)通过反相色谱法(化学物质B方法3 RP)纯化的假尿苷修饰的三核苷酸加帽的G47A* mRNA(使用G47A* T7 RNAP变体加帽并产生的三核苷酸)；(6)通过寡核苷酸dT纯化(化学物质B方法3dT)来纯化的假尿苷修饰的三核苷酸加帽的G47A* mRNA；以及(7)使用G47A* T7 RNAP变体产生并通过寡核苷酸dT纯化(化学物质B方法4dT)来纯化的未加帽的假尿苷修饰的mRNA。每次给药后六小时，评估以下各者：血清细胞因子水平、mRNA表达和抗PEG IgM水平。在第36天给药后六小时评估B细胞活化。化学物质A表示使用未修饰的三磷酸尿苷核苷酸，并且化学物质B表示使用1-甲基-假尿苷三磷酸核苷酸。方法1是指IVT中的等摩尔NTP和牛痘帽1；方法2是指含有4∶2∶1∶1 GTP∶ATP∶CTP∶UTP的IVT和牛痘帽1；方法3是指IVT中的等摩尔NTP和GAG；方法4是指IVT中的等摩尔NTP并且无帽。
在第1天和第22天，来自小鼠的血清细胞因子评估(IP-10)的结果示于图32A和图32B中，显示了三核苷酸加帽的G47A* mRNA在体内诱导类似于αmRNA对照的血清细胞因子水平。对于将mRNA递送至BJ人成纤维细胞中(图33A)和单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)中(图33B)的体外实验，结果类似。
mRNA表达研究(图34)显示，在6次每周剂量后，三核苷酸加帽的G47A* mRNA在体内保持高表达。
抗PEG IgM评估(图35)显示三核苷酸加帽的G47A* mRNA在6次每周剂量后产生低抗PEG IgM水平。
B细胞活化分析(图36)显示，用三核苷酸加帽的G47A* mRNA转染的脾脏B细胞的活化较低，类似于αmRNA对照。
总体而言，这些结果指示，未进行RP纯化的编码hEPO的三核苷酸加帽的G47A*mRNA不诱导高于基线的细胞因子应答，体内维持高表达水平，体内维持低抗PEG IgM水平，以及展现出低B细胞活化。
实施例16.插入缺失频率和点突变频率的评估
使用方法1(等摩尔NTP)或方法2(4∶2∶1∶1 GTP∶ATP∶CTP∶UTP)，用WT或G47A*酶制备mRNA。对于下一代测序(NGS)，通过逆转录酶将mRNA转换为cDNA，并连接衔接子以制备测序文库。将NGS数据与亲本序列进行比较，并且将观察到的插入缺失制成表格。对于WT和G47A*，插入缺失频率相当(图37A)。同样，分析了NGS数据的任何点突变。对于WT和G47A*，点突变频率相当(图37B)。
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Claims (77)

1.一种核糖核酸(RNA)聚合酶变体，其相对于野生型RNA聚合酶包含氨基酸取代，所述氨基酸取代导致所述RNA聚合酶变体的环结构随着所述RNA聚合酶变体从起始复合物转变成延伸复合物经历向螺旋结构的构象变化。
2.如权利要求1所述的RNA聚合酶变体，其中所述氨基酸取代相对于野生型氨基酸具有较高的螺旋倾向性。
3.如权利要求1或2所述的RNA聚合酶变体，其中所述RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶。
4.如权利要求1-3中任一项所述的RNA聚合酶变体，其中所述环结构呈C螺旋结构。
5.如权利要求1-4中任一项所述的RNA聚合酶变体，其中所述环结构呈C接头结构。
6.如权利要求1-4中任一项所述的RNA聚合酶变体，其中所述氨基酸取代是高螺旋倾向性氨基酸取代。
7.如权利要求6所述的RNA聚合酶变体，其中所述高螺旋倾向性酸取代选自丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸。
8.如权利要求7所述的RNA聚合酶变体，其中所述高螺旋倾向性氨基酸取代是丙氨酸。
9.如权利要求1-8中任一项所述的RNA聚合酶变体，其中所述T7 RNA聚合酶变体包含与SEQ ID NO：1具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或至少99％同一性的氨基酸序列。
10.如权利要求9所述的RNA聚合酶变体，其中所述T7 RNA聚合酶包含与SEQ ID NO：1具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，所述氨基酸序列经修饰以包含在选自E42、S43、Y44、E45、M46、G47、A255、R257、A258、G259、A260、L261以及A262的位置处的高螺旋倾向性氨基酸的氨基酸取代。
11.如权利要求10所述的RNA聚合酶变体，其中所述氨基酸取代包括S43A。
12.如权利要求10所述的RNA聚合酶变体，其中所述氨基酸取代包括G47A。
13.如权利要求1-12中任一项所述的RNA聚合酶变体，其进一步包含额外的C末端氨基酸。
14.如权利要求13所述的RNA聚合酶变体，其中所述额外的C末端氨基酸包括甘氨酸(G)。
15.如权利要求11、13或14中任一项所述的RNA聚合酶变体，其中所述RNA聚合酶变体包含SEQ ID NO：108的氨基酸序列。
16.如权利要求12-14中任一项所述的RNA聚合酶变体，其中所述RNA聚合酶变体包含SEQ ID NO：110的氨基酸序列。
17.一种核糖核酸(RNA)聚合酶变体，其相对于野生型RNA聚合酶包含额外的C末端氨基酸。
18.如权利要求17所述的RNA聚合酶变体，其中所述RNA聚合酶变体是T7 RNA聚合酶变体。
19.如权利要求18所述的RNA聚合酶变体，其中所述RNA聚合酶变体与野生型T7 RNA聚合酶具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
20.如权利要求17或18所述的RNA聚合酶变体，其中所述RNA聚合酶变体相对于野生型T7 RNA聚合酶包含氨基酸取代。
21.如权利要求17-20中任一项所述的RNA聚合酶变体，其包含两个额外的C末端氨基酸。
22.如权利要求21所述的RNA聚合酶变体，其中所述两个额外的C末端氨基酸包括相同类型的氨基酸或两个不同类型的氨基酸。
23.如权利要求17-22中任一项所述的RNA聚合酶变体，其包含1-5个或1-10个额外的C末端氨基酸。
24.一种RNA聚合酶变体，其包含C末端，所述C末端包含FAFAXn基序，其中X是任何氨基酸并且n是大于零的任何整数。
25.如权利要求24所述的RNA聚合酶变体，其中X是G或A。
26.如权利要求24或25所述的RNA聚合酶变体，其中n是大于零的任何整数，任选地其中n是1、2、3、4或5。
27.一种RNA聚合酶变体，任选地T7 RNA聚合酶变体，其包含C末端，所述C末端包含FAFAG基序。
28.一种RNA聚合酶变体，任选地T7 RNA聚合酶变体，其包含C末端，所述C末端包含XAFAXn基序、FXFAXn基序、FAXAXn基序或FAFXXn基序，其中每个X是任何氨基酸，并且n是大于零的任何整数。
29.如权利要求17-28中任一项所述的RNA聚合酶变体，其进一步包含氨基酸取代。
30.如权利要求29所述的RNA聚合酶变体，其中所述氨基酸取代是选自野生型RNA聚合酶的E42、S43、Y44、E45、M46、G47、R257、A258、G259、A260、L261和A262的位置处的高螺旋倾向性氨基酸，任选地其中所述野生型RNA聚合酶包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与SEQ IDNO：1的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
31.如权利要求30所述的RNA聚合酶变体，其中所述高螺旋倾向性氨基酸是丙氨酸。
32.如权利要求31所述的RNA聚合酶变体，其中所述氨基酸取代是S43A或G47A。
33.一种产生核糖核酸(RNA)的方法，其包括使DNA模板与如权利要求1-32中任一项所述的RNA聚合酶在导致产生RNA转录物的条件下接触。
34.一种进行体外转录(IVT)反应的方法，所述方法包括在存在三磷酸核苷和缓冲液的情况下，使DNA模板与如权利要求1-32中任一项所述的RNA聚合酶在导致产生RNA转录物的条件下接触。
35.如权利要求33或34所述的方法，其中所产生的所述RNA转录物在任选地以未纯化形式递送至细胞中时刺激相对于使用野生型RNA聚合酶所产生的RNA低至少50％的细胞因子应答。
36.如权利要求33-35中任一项所述的方法，其中所产生的双链RNA(dsRNA)转录物的浓度相对于使用野生型聚合酶产生的dsRNA转录物低至少50％。
37.如权利要求33-36中任一项所述的方法，其中所产生的RNA转录物的小于20％展现出3′异质性。
38.如权利要求33-37中任一项所述的方法，其中所产生的RNA转录物的小于50％是双链污染物。
39.如权利要求33-38中任一项所述的方法，其中所产生的RNA转录物的小于50％是连缀RNA转录物。
40.如权利要求33-39中任一项所述的方法，其中所产生的全长RNA转录物的量比所述DNA模板的量大至少15倍。
41.如权利要求33-40中任一项所述的方法，其中所产生的双链污染物：全长RNA转录物的比率小于1∶1。
42.如权利要求33-41中任一项所述的方法，其中所产生的所述RNA转录物相对于所述DNA模板每100个核苷酸具有少于1个突变。
43.一种核酸，其编码如权利要求1-32中任一项所述的RNA聚合酶变体。
44.一种载体，其包含如权利要求43所述的核酸。
45.一种宿主细胞，其包含如权利要求43所述的核酸或如权利要求44所述的载体。
46.一种组合物或试剂盒，其包含如权利要求1-32中任一项所述的RNA聚合酶变体和任选地体外转录(IVT)试剂。
47.一种核糖核酸(RNA)，任选地信使RNA(mRNA)，其通过如权利要求33-42中任一项所述的方法产生。
48.如权利要求47所述的RNA，其被配制在脂质纳米颗粒中，任选地其中所述脂质纳米颗粒包含20％-60％可电离氨基脂质、5％-25％非阳离子脂质、25％-55％固醇和0.5％-15％PEG修饰的脂质的摩尔比。
49.一种用于核糖核酸(RNA)合成的共转录加帽方法，所述方法包括使多核苷酸模板与RNA聚合酶变体、任选地T7 RNA聚合酶变体，三磷酸核苷，以及帽类似物在体外转录反应条件下反应以产生RNA转录物。
50.如权利要求49所述的方法，其中所产生的RNA转录物的大于80％、大于85％、大于90％或大于95％包含功能性帽。
51.如权利要求49或50所述的方法，其中所述三磷酸核苷包括未修饰或修饰的ATP、修饰或未修饰的UTP、修饰或未修饰的GTP，和/或修饰或未修饰的CTP。
52.如权利要求49-51中任一项所述的方法，其中所述RNA聚合酶变体是如权利要求1-32中任一项所述的RNA聚合酶变体。
53.如权利要求49-52中任一项所述的方法，其中所述三磷酸核苷和帽类似物以等摩尔浓度存在于所述反应中。
54.如权利要求49-53中任一项所述的方法，其中在所述反应中，帽类似物与三磷酸核苷的摩尔比大于1∶1或等于1∶1，任选地其中所述三磷酸核苷包括GTP和/或ATP。
55.如权利要求49-54中任一项所述的方法，其中所述帽类似物是二核苷酸帽、三核苷酸帽或四核苷酸帽。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述帽是三核苷酸帽，其包含选自以下序列的序列：GAA、GAC、GAG、GAU、GCA、GCC、GCG、GCU、GGA、GGC、GGG、GGU、GUA、GUC、GUG和GUU。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述三核苷酸帽包含选自以下序列的序列：
(a)m7GpppApA、m7GpppApC、m7GpppApG、m7GpppApU、m7GpppCpA、m7GpppCpC、m7GpppCpG、m7GpppCpU、m7GpppGpA、m7GpppGpC、m7GpppGpG、m7GpppGpU、m7GpppUpA、m7GpppUpC、m7GpppUpG，和m7GpppUpU；
(b)m7G3′OMepppApA、m7G3′OMepppApC、m7G3′OMepppApG、m7G3′OMepppApU、m7G3′OMepppCpA、m7G3′OMepppCpC、m7G3′OMepppCpG、m7G3′OMepppCpU、m7G3′OMepppGpA、m7G3′OMepppGpC、m7G3′ OMepppGpG、m7G3′OMepppGpU、m7G3′OMepppUpA、m7G3′OMepppUpC、m7G3′OMepppUpG，以及m7G3′ OMepppUpU；
(c)m7G3′OMepppA2′OMepA、m7G3′OMepppA2′OMepC、m7G3′OMepppA2′OMepG、m7G3′OMepppA2′OMepU、m7G3′OMepppC2′OMepA、m7G3′OMepppC2′OMepC、m7G3′OMepppC2′OMepG、m7G3′OMepppC2′OMepU、m7G3′ OMepppG2′OMepA、m7G3′OMepppG2′OMepC、m7G3′OMepppG2′OMepG、m7G3′OMepppG2′OMepU、m7G3′OMepppU2′ OMepA、m7G3′OMepppU2′OMepC、m7G3′OMepppU2′OMepG，和m7G3′OMepppU2′OMepU；或
(d)m7GpppA2′OMepA、m7GpppA2′OMepC、m7GpppA2′OMepG、m7GpppA2′OMepU、m7GpppC2′OMepA、m7GpppC2′OMepC、m7GpppC2′OMepG、m7GpppC2′OMepU、m7GpppG2′OMepA、m7GpppG2′OMepC、m7GpppG2′ OMepG、m7GpppG2′OMepU、m7GpppU2′OMepA、m7GpppU2′OMepC、m7GpppU2′OMepG，和m7GpppU2′OMepU。
58.如权利要求56或57所述的方法，其中所述三核苷酸帽包含选自以下序列的序列：GAG、GCG、GUG和GGG。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述三核苷酸帽包含序列GAG。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述三核苷酸帽包含GpppA2′OmepG。
61.如权利要求49-60中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸模板在模板位置+1处包含2′-脱氧胸苷残基。
62.如权利要求49-60中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸模板在模板位置+1处包含2′-脱氧胞苷残基。
63.一种用于RNA合成的共转录加帽方法，所述方法包括使多核苷酸模板与以下各项在体外转录反应条件下反应以产生RNA转录物：(a)T7 RNA聚合酶变体，其相对于野生型RNA聚合酶包含至少一个氨基酸取代，所述至少一个氨基酸取代导致所述RNA聚合酶变体的至少一个环结构随着所述RNA聚合酶变体从起始复合物转变成延伸复合物经历向螺旋结构的构象变化；(b)三磷酸核苷；和(c)三核苷酸帽，其包含序列GpppA2′OmepG，其中所述多核苷酸模板在模板位置+1处包含2′-脱氧胸苷残基。
64.如权利要求49-63中任一项所述的方法，其中所产生的RNA转录物在任选地以未纯化形式递送至细胞中时未刺激可检测的细胞因子应答或未刺激高于基线对照的细胞因子应答。
65.一种组合物，其包含体外转录的(IVT)RNA和药学上可接受的赋形剂，其中所述组合物在不存在IVT后纯化的情况下基本上不含细胞因子诱导的RNA污染物。
66.一种组合物，其包含体外转录的(IVT)RNA和药学上可接受的赋形剂，其中所述组合物具有少于5％未加帽的RNA类别。
67.如权利要求65或66所述的组合物，其中大于80％、85％、90％或95％的所述IVT RNA包含功能性帽。
68.如权利要求65-67中任一项所述的组合物，其中所述IVT RNA是未经化学修饰的。
69.如权利要求65-67中任一项所述的组合物，其中所述IVT RNA是经化学修饰的。
70.如权利要求65-69中任一项的组合物，其中大于95％的所述IVT RNA包含单链全长转录物。
71.如权利要求65-70中任一项的组合物，其中所述RNA通过包括以下的方法来产生：
使多核苷酸模板与以下各项在体外转录反应条件下反应以产生RNA转录物：(a)T7 RNA聚合酶变体，其相对于野生型RNA聚合酶包含至少一个氨基酸取代，所述至少一个氨基酸取代导致所述RNA聚合酶变体的至少一个环结构随着所述RNA聚合酶变体从起始复合物转变成延伸复合物经历向螺旋结构的构象变化；(b)三磷酸核苷；和(c)三核苷酸帽，其包含序列GpppA2′OmepG，其中所述多核苷酸模板在模板位置+1处包含2′-脱氧胸苷残基。
72.一种T7核糖核酸(RNA)聚合酶，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与野生型T7RNA聚合酶具有至少90％的同一性，并且经修饰以包含(a)在与SEQ ID NO：1的氨基酸位置47相对应的氨基酸位置处的丙氨酸和(b)额外的C末端甘氨酸。
73.如权利要求72所述的T7 RNA聚合酶，其进一步包含三核苷酸帽。
74.如权利要求73所述的T7 RNA聚合酶，其中所述三核苷酸帽是GpppA2′OmepG。
75.一种T7核糖核酸(RNA)聚合酶，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与野生型T7RNA聚合酶具有至少90％的同一性，并且经修饰以包含(a)在与SEQ ID NO：1的氨基酸位置43相对应的氨基酸位置处的丙氨酸和(b)额外的C末端甘氨酸。
76.如权利要求75所述的T7 RNA聚合酶，其进一步包含三核苷酸帽。
77.如权利要求76所述的T7 RNA聚合酶，其中所述三核苷酸帽是GpppA2′OmepG。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113795579A (zh) * 2019-02-20 2021-12-14 摩登纳特斯有限公司 用于共转录加帽的rna聚合酶变体
CN114703162A (zh) * 2022-04-24 2022-07-05 江南大学 一种具有高转录活性的t7 rna聚合酶突变体及其应用
CN116926098A (zh) * 2023-07-31 2023-10-24 态创生物科技(广州)有限公司 增强t7rnap对胶原蛋白/弹力蛋白转录活性的定向进化系统和方法

Families Citing this family (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3981437A1 (en) 2014-04-23 2022-04-13 ModernaTX, Inc. Nucleic acid vaccines
US11364292B2 (en) 2015-07-21 2022-06-21 Modernatx, Inc. CHIKV RNA vaccines
ES2937963T3 (es) 2015-07-21 2023-04-03 Modernatx Inc Vacunas de enfermedad infecciosa
WO2017031232A1 (en) 2015-08-17 2017-02-23 Modernatx, Inc. Methods for preparing particles and related compositions
EP3364950A4 (en) 2015-10-22 2019-10-23 ModernaTX, Inc. VACCINES AGAINST TROPICAL DISEASES
SI3718565T1 (sl) 2015-10-22 2022-08-31 Modernatx, Inc. Cepiva za respiratorni virus
AU2016342045A1 (en) 2015-10-22 2018-06-07 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
EA201891001A1 (ru) 2015-10-22 2018-11-30 МОДЕРНАТиЭкс, ИНК. Вакцины на основе нуклеиновых кислот против вируса ветряной оспы (vzv)
WO2017099823A1 (en) 2015-12-10 2017-06-15 Modernatx, Inc. Compositions and methods for delivery of therapeutic agents
MX2019002904A (es) 2016-09-14 2019-09-26 Modernatx Inc Composiciones de arn de alta pureza y métodos para su preparación.
JP6980780B2 (ja) 2016-10-21 2021-12-15 モデルナティーエックス， インコーポレイテッド ヒトサイトメガロウイルスワクチン
EP3538146A4 (en) 2016-11-11 2020-07-15 ModernaTX, Inc. INFLUENZA VACCINE
EP3551193A4 (en) 2016-12-08 2020-08-19 Modernatx, Inc. NUCLEIC ACID VACCINES AGAINST RESPIRATORY VIRUSES
US11384352B2 (en) 2016-12-13 2022-07-12 Modernatx, Inc. RNA affinity purification
MA52262A (fr) 2017-03-15 2020-02-19 Modernatx Inc Vaccin à large spectre contre le virus de la grippe
US11752206B2 (en) 2017-03-15 2023-09-12 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
WO2018170270A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (vzv) vaccine
EP3595713A4 (en) 2017-03-15 2021-01-13 ModernaTX, Inc. RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS VACCINE
US20200030432A1 (en) 2017-03-17 2020-01-30 Modernatx, Inc. Zoonotic disease rna vaccines
EP3607074A4 (en) 2017-04-05 2021-07-07 Modernatx, Inc. REDUCTION OR ELIMINATION OF IMMUNE RESPONSES TO NON-INTRAVENOUS THERAPEUTIC PROTEINS, FOR EXAMPLE SUBCUTANEOUSLY
US11786607B2 (en) 2017-06-15 2023-10-17 Modernatx, Inc. RNA formulations
WO2019036685A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Modernatx, Inc. METHODS FOR HPLC ANALYSIS
US11866696B2 (en) 2017-08-18 2024-01-09 Modernatx, Inc. Analytical HPLC methods
CN111212905A (zh) 2017-08-18 2020-05-29 摩登纳特斯有限公司 Rna聚合酶变体
WO2019046809A1 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Modernatx, Inc. METHODS OF MANUFACTURING LIPID NANOPARTICLES
MA50253A (fr) 2017-09-14 2020-07-22 Modernatx Inc Vaccins à arn contre le virus zika
WO2019148101A1 (en) 2018-01-29 2019-08-01 Modernatx, Inc. Rsv rna vaccines
US11072808B2 (en) * 2018-10-04 2021-07-27 New England Biolabs, Inc. Methods and compositions for increasing capping efficiency of transcribed RNA
US11351242B1 (en) 2019-02-12 2022-06-07 Modernatx, Inc. HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition
US11851694B1 (en) 2019-02-20 2023-12-26 Modernatx, Inc. High fidelity in vitro transcription
WO2020185811A1 (en) * 2019-03-11 2020-09-17 Modernatx, Inc. Fed-batch in vitro transcription process
BR112022014837A2 (pt) 2020-01-28 2022-09-27 Modernatx Inc Vacinas de rna contra coronavírus
EP4100052A2 (en) 2020-02-07 2022-12-14 ModernaTX, Inc. Sars-cov-2 mrna domain vaccines
CN113521268A (zh) 2020-04-22 2021-10-22 生物技术Rna制药有限公司 冠状病毒疫苗
WO2021222304A1 (en) 2020-04-27 2021-11-04 Modernatx, Inc. Sars-cov-2 rna vaccines
WO2021159130A2 (en) 2020-05-15 2021-08-12 Modernatx, Inc. Coronavirus rna vaccines and methods of use
US11406703B2 (en) 2020-08-25 2022-08-09 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
EP4217371A1 (en) 2020-09-25 2023-08-02 ModernaTX, Inc. Multi-proline-substituted coronavirus spike protein vaccines
US20240026317A1 (en) 2020-10-14 2024-01-25 Dong Shen PAN-RAS mRNA CANCER VACCINES
JP2023545503A (ja) * 2020-10-15 2023-10-30 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド メッセンジャーｒｎａの大規模合成
CN116438306A (zh) * 2020-10-20 2023-07-14 St制药株式会社 用于5'-加帽的rna合成的寡核苷酸
EP4274607A1 (en) 2021-01-11 2023-11-15 ModernaTX, Inc. Seasonal rna influenza virus vaccines
CN112831484B (zh) * 2021-01-13 2022-09-20 华中科技大学 T7-rna聚合酶突变体及其应用
CA3208486A1 (en) 2021-01-15 2022-07-21 Modernatx, Inc. Variant strain-based coronavirus vaccines
AU2022207495A1 (en) 2021-01-15 2023-08-03 Modernatx, Inc. Variant strain-based coronavirus vaccines
US11524023B2 (en) 2021-02-19 2022-12-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same
EP4308156A1 (en) 2021-03-15 2024-01-24 ModernaTX, Inc. Therapeutic use of sars-cov-2 mrna domain vaccines
JP2024512780A (ja) 2021-04-01 2024-03-19 モデルナティエックス インコーポレイテッド 多価ｒｎａ組成物中のｒｎａ種の識別及び比率決定のための方法
WO2022221335A1 (en) 2021-04-13 2022-10-20 Modernatx, Inc. Respiratory virus combination vaccines
JP2024513999A (ja) 2021-04-14 2024-03-27 モデルナティエックス インコーポレイテッド インフルエンザ－コロナウイルス組み合わせワクチン
WO2022245888A1 (en) 2021-05-19 2022-11-24 Modernatx, Inc. Seasonal flu rna vaccines and methods of use
WO2022266389A1 (en) 2021-06-17 2022-12-22 Modernatx, Inc. Alternative rna purification strategies
TW202321446A (zh) 2021-08-13 2023-06-01 美商現代公司 多管柱層析ｍＲＮＡ純化
WO2023031788A1 (en) * 2021-09-01 2023-03-09 Glaxosmithkline Biologicals Sa T7 rna polymerase variants for rna synthesis
CA3235867A1 (en) 2021-10-22 2023-04-27 Munir MOSAHEB Mrna vaccine composition
WO2023076658A1 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Modernatx, Inc. Mass spectrometry of mrna
WO2023081311A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 Modernatx, Inc. Methods of purifying dna for gene synthesis
WO2023092069A1 (en) 2021-11-18 2023-05-25 Modernatx, Inc. Sars-cov-2 mrna domain vaccines and methods of use
WO2023096858A1 (en) 2021-11-23 2023-06-01 Senda Biosciences, Inc. A bacteria-derived lipid composition and use thereof
WO2023107999A2 (en) 2021-12-08 2023-06-15 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus mrna vaccines
WO2023122080A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Senda Biosciences, Inc. Compositions comprising mrna and lipid reconstructed plant messenger packs
WO2023132885A1 (en) 2022-01-04 2023-07-13 Modernatx, Inc. Methods of purifying dna for gene synthesis
WO2023137149A1 (en) 2022-01-14 2023-07-20 Modernatx, Inc. In vitro transcription dna purification and recycling
WO2023147352A1 (en) * 2022-01-27 2023-08-03 Trilink Biotechnologies, Llc Trinucleotide cap analogs and methods of use thereof
WO2023196914A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Modernatx, Inc. Influenza nucleic acid compositions and uses thereof
WO2023201204A1 (en) 2022-04-11 2023-10-19 Modernatx, Inc. Detection of mrna purity in a mixture
WO2023201296A1 (en) 2022-04-15 2023-10-19 Modernatx, Inc. Ribosomal engagement potency assay
WO2023225524A1 (en) 2022-05-17 2023-11-23 Modernatx, Inc. Preparation of highly concentrated mrna
WO2023230481A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Modernatx, Inc. Orthopoxvirus vaccines
WO2023235362A1 (en) * 2022-05-31 2023-12-07 Nutcracker Therapeutics, Inc. Rna cap analogs and methods of use
WO2023250119A1 (en) 2022-06-24 2023-12-28 Modernatx, Inc. Methods of producing rna
US11878055B1 (en) 2022-06-26 2024-01-23 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2024010993A1 (en) 2022-07-06 2024-01-11 Modernatx, Inc. Primer design for cell-free dna production
WO2024015890A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 Modernatx, Inc. Norovirus mrna vaccines
WO2024026287A2 (en) * 2022-07-25 2024-02-01 University Of Utah Research Foundation Synthesis of substoichiometric chemically modified mrnas by in vitro transcription
WO2024026005A1 (en) 2022-07-28 2024-02-01 Modernatx, Inc. Methods of rna purification
WO2024044741A2 (en) * 2022-08-26 2024-02-29 Trilink Biotechnologies, Llc Efficient method for making highly purified 5'-capped oligonucleotides
WO2024050483A1 (en) 2022-08-31 2024-03-07 Modernatx, Inc. Variant strain-based coronavirus vaccines and uses thereof
WO2024102434A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Senda Biosciences, Inc. Rna compositions comprising lipid nanoparticles or lipid reconstructed natural messenger packs

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110136181A1 (en) * 2008-08-08 2011-06-09 Tosoh Corporation Rna polymerase mutant with improved functions
CN102220294A (zh) * 2010-04-16 2011-10-19 霍夫曼-拉罗奇有限公司 具有增强的热稳定性的新颖的t7 rna聚合酶变体
JP2011223982A (ja) * 2010-03-30 2011-11-10 Tosoh Corp Ｔ７ｒｎａポリメラーゼ融合蛋白質
US20120252071A1 (en) * 2011-04-01 2012-10-04 Roche Diagnostics Operations, Inc. T7 rna polymerase variants with cysteine-serine substitutions
CN106459879A (zh) * 2014-03-20 2017-02-22 德克萨斯大学系统董事会 具有扩展的底物范围和提高的转录产率的t7 rna 聚合酶变体
WO2017070624A1 (en) * 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Tropical disease vaccines
WO2017123748A1 (en) * 2016-01-13 2017-07-20 New England Biolabs, Inc. Thermostable variants of t7 rna polymerase

Family Cites Families (174)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2279669A1 (en) 1995-12-15 1997-06-16 Enzo Therapeutics, Inc. Property effecting and/or property exhibiting constructs for the expression of non-native nucleic acid processing components for therapeutic and diagnostic uses
FR2822164B1 (fr) 2001-03-19 2004-06-18 Centre Nat Rech Scient Polypeptides derives des arn polymerases, et leurs utilisations
US9012219B2 (en) * 2005-08-23 2015-04-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNA preparations comprising purified modified RNA for reprogramming cells
SI3611266T1 (sl) 2005-08-23 2023-02-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modificirani nukleozidi, ki vsebujejo RNA, in postopki za njihovo uporabo
EP2010659B1 (en) 2006-04-14 2014-06-18 CellScript, Inc. Kits and methods for generating 5' capped RNA
WO2009021191A2 (en) 2007-08-08 2009-02-12 Barnes Wayne M Improved t7 expression system
CA2771540C (en) 2009-08-21 2019-01-15 Merial Limited Recombinant avian paramyxovirus vaccine and method for making and using thereof
EP2377938A1 (en) 2010-04-16 2011-10-19 Eukarys Capping-prone RNA polymerase enzymes and their applications
US8822663B2 (en) 2010-08-06 2014-09-02 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
CA3162352A1 (en) 2010-10-01 2012-04-05 Modernatx, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
JP6072766B2 (ja) 2011-04-08 2017-02-01 バイオ−ラッド ラボラトリーズ インコーポレーティッド 非特異的活性が低下したｐｃｒ反応混合物
WO2012158736A1 (en) 2011-05-17 2012-11-22 modeRNA Therapeutics Engineered nucleic acids and methods of use thereof for non-human vertebrates
PL2721153T3 (pl) 2011-06-16 2020-03-31 The Regents Of The University Of California Syntetyczne klastry genów
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3384938A1 (en) 2011-09-12 2018-10-10 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
FR2981088B1 (fr) 2011-10-06 2013-11-29 Biomerieux Sa Arn polymerases mutees
WO2013130161A1 (en) 2011-12-14 2013-09-06 modeRNA Therapeutics Methods of responding to a biothreat
EP2791160B1 (en) 2011-12-16 2022-03-02 ModernaTX, Inc. Modified mrna compositions
WO2013096709A2 (en) 2011-12-21 2013-06-27 modeRNA Therapeutics Methods of increasing the viability or longevity of an organ or organ explant
EP3677678B1 (en) * 2011-12-30 2024-01-31 Cellscript, Llc Making and using in vitro-synthesized ssrna for introducing into mammalian cells to induce a biological or biochemical effect
US9045740B2 (en) 2012-02-24 2015-06-02 University Of Massachusetts Modified T7-related RNA polymerases and methods of use thereof
WO2013148867A1 (en) 2012-03-27 2013-10-03 Massachusetts Institute Of Technology Artificial sigma factors based on bisected t7 rna polymerase
AU2013243946A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of membrane proteins
US10501513B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of oncology-related proteins and peptides
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
EP2885419A4 (en) 2012-08-14 2016-05-25 Moderna Therapeutics Inc ENZYMES AND POLYMERASES FOR RNA SYNTHESIS
US20150307542A1 (en) 2012-10-03 2015-10-29 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleic acid molecules and uses thereof
EP2912180A1 (en) 2012-10-29 2015-09-02 Technische Universität Dortmund T7 rna polymerase variants and methods of using the same
LT2922554T (lt) 2012-11-26 2022-06-27 Modernatx, Inc. Terminaliai modifikuota rnr
EP2931914A4 (en) 2012-12-13 2016-08-17 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES FOR CHANGING THE CELL PHENOTYPE
EP2968391A1 (en) 2013-03-13 2016-01-20 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
EP2971010B1 (en) 2013-03-14 2020-06-10 ModernaTX, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
WO2014144039A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Characterization of mrna molecules
WO2014152027A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Manufacturing methods for production of rna transcripts
WO2014152031A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Ribonucleic acid purification
US10590161B2 (en) 2013-03-15 2020-03-17 Modernatx, Inc. Ion exchange purification of mRNA
PL3019619T3 (pl) 2013-07-11 2022-01-10 Modernatx, Inc. Kompozycje zawierające syntetyczne polinkleotydy kodujące białka powiązane z crispr i syntetyczne sgrna oraz sposoby ich stosowania
US10023626B2 (en) 2013-09-30 2018-07-17 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
WO2015051169A2 (en) 2013-10-02 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
CA2926218A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
US20160243221A1 (en) 2013-10-18 2016-08-25 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods for tolerizing cellular systems
EP3981437A1 (en) 2014-04-23 2022-04-13 ModernaTX, Inc. Nucleic acid vaccines
WO2015196128A2 (en) 2014-06-19 2015-12-23 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
CA2955250A1 (en) 2014-07-16 2016-01-21 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
AU2015289573A1 (en) 2014-07-17 2017-02-02 Modernatx, Inc Terminal modifications of polynucleotides
WO2016118724A1 (en) 2015-01-21 2016-07-28 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
WO2016164762A1 (en) 2015-04-08 2016-10-13 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor egf-a and intracellular domain mutants and methods of using the same
EP3303575B1 (en) 2015-05-29 2022-03-16 CureVac AG Method for adding cap structures to rna using immobilized enzymes
WO2016201377A1 (en) 2015-06-10 2016-12-15 Moderna Therapeutics, Inc. Targeted adaptive vaccines
WO2017011773A2 (en) 2015-07-15 2017-01-19 Modernatx, Inc. Codon-optimized nucleic acids encoding antibodies
WO2017015457A1 (en) 2015-07-21 2017-01-26 Modernatx, Inc. Ebola vaccine
ES2937963T3 (es) 2015-07-21 2023-04-03 Modernatx Inc Vacunas de enfermedad infecciosa
US20190008887A1 (en) 2015-07-30 2019-01-10 ModernaTX Inc. Multimeric mrna
WO2017020026A1 (en) 2015-07-30 2017-02-02 Modernatx, Inc. Concatemeric peptide epitopes rnas
US20180237849A1 (en) 2015-08-17 2018-08-23 Modernatx, Inc. Rna mapping/fingerprinting
WO2017031232A1 (en) 2015-08-17 2017-02-23 Modernatx, Inc. Methods for preparing particles and related compositions
EP3736261B1 (en) 2015-09-17 2023-10-11 ModernaTX, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
CN117025590A (zh) * 2015-09-21 2023-11-10 垂林克生物技术有限公司 用于合成5’-加帽rna的组合物和方法
AU2016336344A1 (en) 2015-10-05 2018-04-19 Modernatx, Inc. Methods for therapeutic administration of messenger ribonucleic acid drugs
EP3362555B1 (en) 2015-10-14 2021-01-13 Translate Bio, Inc. Modification of rna-related enzymes for enhanced production
WO2017066789A1 (en) * 2015-10-16 2017-04-20 Modernatx, Inc. Mrna cap analogs with modified sugar
AU2016342045A1 (en) 2015-10-22 2018-06-07 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
EA201891001A1 (ru) 2015-10-22 2018-11-30 МОДЕРНАТиЭкс, ИНК. Вакцины на основе нуклеиновых кислот против вируса ветряной оспы (vzv)
MA46317A (fr) 2015-10-22 2019-08-07 Modernatx Inc Vaccin contre le virus respiratoire syncytial
CN108430456B (zh) 2015-10-22 2022-01-18 摩登纳特斯有限公司 癌症疫苗
SI3718565T1 (sl) 2015-10-22 2022-08-31 Modernatx, Inc. Cepiva za respiratorni virus
WO2017070620A2 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Broad spectrum influenza virus vaccine
WO2017070623A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
EP3364982A4 (en) 2015-10-22 2019-04-17 ModernaTX, Inc. VACCINES AGAINST SEXUALLY TRANSMITTED DISEASES
WO2017099823A1 (en) 2015-12-10 2017-06-15 Modernatx, Inc. Compositions and methods for delivery of therapeutic agents
JP7065036B2 (ja) 2015-12-17 2022-05-11 モダーナティエックス・インコーポレイテッド メチルマロニルＣｏＡムターゼをコードするポリヌクレオチド
HUE057877T2 (hu) 2015-12-22 2022-06-28 Modernatx Inc Vegyületek és készítmények terápiás szerek intracelluláris bejuttatására
US10465190B1 (en) 2015-12-23 2019-11-05 Modernatx, Inc. In vitro transcription methods and constructs
WO2017127750A1 (en) 2016-01-22 2017-07-27 Modernatx, Inc. Messenger ribonucleic acids for the production of intracellular binding polypeptides and methods of use thereof
CA3024509A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Mrna combination therapy for the treatment of cancer
US11801227B2 (en) 2016-05-18 2023-10-31 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for the treatment of cystic fibrosis
WO2017201340A2 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding relaxin
EP4186518A1 (en) 2016-05-18 2023-05-31 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding interleukin-12 (il12) and uses thereof
WO2017201317A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polyribonucleotides containing reduced uracil content and uses thereof
WO2017201342A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding jagged1 for the treatment of alagille syndrome
CA3024507A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding .alpha.-galactosidase a for the treatment of fabry disease
MA45032A (fr) 2016-05-18 2019-03-27 Fundacion Para La Investig Medica Aplicada Polynucléotides codant pour la porphobilinogène désaminase destinés au traitement de la porphyrie intermittente aiguë
US20190298657A1 (en) 2016-05-18 2019-10-03 Modernatx, Inc. Polynucleotides Encoding Acyl-CoA Dehydrogenase, Very Long-Chain for the Treatment of Very Long-Chain Acyl-CoA Dehydrogenase Deficiency
EP3458081A1 (en) 2016-05-18 2019-03-27 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding citrin for the treatment of citrullinemia type 2
EP3458106A4 (en) 2016-05-18 2020-03-18 Modernatx, Inc. POLYNUCLEOTIDES ENCODING LIPOPROTEIN LIPASE FOR THE TREATMENT OF HYPERLIPIDEMIA
WO2017201348A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding galactose-1-phosphate uridylyltransferase for the treatment of galactosemia type 1
JP2019525901A (ja) 2016-06-14 2019-09-12 モデルナティエックス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａＴＸ，Ｉｎｃ． 脂質ナノ粒子の安定化製剤
MX2019002904A (es) * 2016-09-14 2019-09-26 Modernatx Inc Composiciones de arn de alta pureza y métodos para su preparación.
US10487105B2 (en) 2016-10-19 2019-11-26 Arcturus Therapeutics, Inc. Trinucleotide MRNA cap analogs
JP6980780B2 (ja) 2016-10-21 2021-12-15 モデルナティーエックス， インコーポレイテッド ヒトサイトメガロウイルスワクチン
MA46643A (fr) 2016-10-26 2019-09-04 Modernatx Inc Méthodes et compositions pour le mappage d'arn
AU2017347837A1 (en) 2016-10-26 2019-06-06 Modernatx, Inc. Messenger ribonucleic acids for enhancing immune responses and methods of use thereof
US10907165B2 (en) 2016-10-31 2021-02-02 Cornell University Methods of enhancing translation ability and stability of RNA molecules, treatments, and kits
WO2018089540A1 (en) 2016-11-08 2018-05-17 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
EP3538146A4 (en) 2016-11-11 2020-07-15 ModernaTX, Inc. INFLUENZA VACCINE
EP3551193A4 (en) 2016-12-08 2020-08-19 Modernatx, Inc. NUCLEIC ACID VACCINES AGAINST RESPIRATORY VIRUSES
US11384352B2 (en) 2016-12-13 2022-07-12 Modernatx, Inc. RNA affinity purification
US20180243225A1 (en) 2017-01-25 2018-08-30 Modernatx, Inc. Ebola/marburg vaccines
WO2018144778A1 (en) 2017-02-01 2018-08-09 Modernatx, Inc. Polynucleotide secondary structure
US20190351039A1 (en) 2017-02-01 2019-11-21 Modernatx, Inc. Immunomodulatory therapeutic mrna compositions encoding activating oncogene mutation peptides
AU2017397458A1 (en) 2017-02-01 2019-08-15 Modernatx, Inc. RNA cancer vaccines
MA47515A (fr) 2017-02-16 2019-12-25 Modernatx Inc Compositions immunogènes très puissantes
US20200368162A1 (en) 2017-02-24 2020-11-26 Modernatx, Inc. Nucleic Acid-Based Therapy of Muscular Dystrophies
EP3595713A4 (en) 2017-03-15 2021-01-13 ModernaTX, Inc. RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS VACCINE
US11969506B2 (en) 2017-03-15 2024-04-30 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle formulation
WO2018170270A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (vzv) vaccine
ES2940259T3 (es) 2017-03-15 2023-05-04 Modernatx Inc Compuesto y composiciones para la administración intracelular de agentes terapéuticos
MA52262A (fr) 2017-03-15 2020-02-19 Modernatx Inc Vaccin à large spectre contre le virus de la grippe
US11752206B2 (en) 2017-03-15 2023-09-12 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
US20200030432A1 (en) 2017-03-17 2020-01-30 Modernatx, Inc. Zoonotic disease rna vaccines
US20200038499A1 (en) 2017-03-22 2020-02-06 Modernatx, Inc. Rna bacterial vaccines
EP3607074A4 (en) 2017-04-05 2021-07-07 Modernatx, Inc. REDUCTION OR ELIMINATION OF IMMUNE RESPONSES TO NON-INTRAVENOUS THERAPEUTIC PROTEINS, FOR EXAMPLE SUBCUTANEOUSLY
EP3641810A4 (en) 2017-04-26 2021-08-18 Modernatx, Inc. VACCINES AGAINST HERPES SIMPLEX VIRUS
US11786607B2 (en) 2017-06-15 2023-10-17 Modernatx, Inc. RNA formulations
WO2018232355A1 (en) 2017-06-15 2018-12-20 Modernatx, Inc. Rna antibodies
US10034951B1 (en) * 2017-06-21 2018-07-31 New England Biolabs, Inc. Use of thermostable RNA polymerases to produce RNAs having reduced immunogenicity
CN111032863A (zh) 2017-06-30 2020-04-17 科德克希思公司 T7 rna聚合酶变体
CA3066767A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Codexis, Inc. T7 rna polymerase variants
MA50751A (fr) 2017-08-18 2020-06-24 Modernatx Inc Vaccins à base d'arnm efficaces
CN111212905A (zh) 2017-08-18 2020-05-29 摩登纳特斯有限公司 Rna聚合酶变体
US11866696B2 (en) 2017-08-18 2024-01-09 Modernatx, Inc. Analytical HPLC methods
WO2019036685A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Modernatx, Inc. METHODS FOR HPLC ANALYSIS
WO2019046809A1 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Modernatx, Inc. METHODS OF MANUFACTURING LIPID NANOPARTICLES
MA50253A (fr) 2017-09-14 2020-07-22 Modernatx Inc Vaccins à arn contre le virus zika
ES2922462T3 (es) 2017-10-31 2022-09-15 Astrazeneca Ab Nanopartículas lipídicas para suministrar ARN modificado que codifica un polipéptido de VEGF-A
US20190192646A1 (en) 2017-11-03 2019-06-27 Modernatx, Inc. Salmonella vaccines
EP3713601A4 (en) 2017-11-21 2022-03-09 Modernatx, Inc. VACCINES AGAINST EPSTEIN-BARR VIRUS
WO2019148101A1 (en) 2018-01-29 2019-08-01 Modernatx, Inc. Rsv rna vaccines
KR20210038886A (ko) 2018-06-27 2021-04-08 모더나티엑스, 인크. 개인화된 암 백신 에피토프 선택
CA3111836A1 (en) 2018-09-13 2020-03-19 Modernatx, Inc. Modified mrna for the treatment of progressive familial intrahepatic cholestasis disorders
CA3113353A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. High-purity peg lipids and uses thereof
US20220409536A1 (en) 2018-09-19 2022-12-29 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
CA3113025A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. Peg lipids and uses thereof
JP2022501367A (ja) 2018-09-20 2022-01-06 モデルナティエックス インコーポレイテッドModernaTX, Inc. 脂質ナノ粒子の調製及びその投与方法
JP2022506839A (ja) 2018-11-07 2022-01-17 モデルナティエックス インコーポレイテッド Ｒｎａがんワクチン
JP2022519557A (ja) 2019-01-31 2022-03-24 モデルナティエックス インコーポレイテッド 脂質ナノ粒子の調製方法
US11351242B1 (en) 2019-02-12 2022-06-07 Modernatx, Inc. HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition
CN113795579A (zh) 2019-02-20 2021-12-14 摩登纳特斯有限公司 用于共转录加帽的rna聚合酶变体
WO2020185811A1 (en) 2019-03-11 2020-09-17 Modernatx, Inc. Fed-batch in vitro transcription process
EP3938379A4 (en) 2019-03-15 2023-02-22 ModernaTX, Inc. HIV RNA VACCINE
WO2020243561A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 Modernatx, Inc. Expanded t cell assay
BR112022002548A2 (pt) 2019-08-14 2022-06-14 Modernatx Inc Processos para purificar produtos a jusante de transcrição in vitro
WO2021050864A1 (en) 2019-09-11 2021-03-18 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
JP2022548304A (ja) 2019-09-19 2022-11-17 モデルナティエックス インコーポレイテッド 治療薬の細胞内送達のための分岐状尾部脂質化合物及び組成物
EP4031666A4 (en) 2019-09-19 2023-11-15 ModernaTX, Inc. CAP GUIDES AND METHODS OF USE FOR RNA MAPPING
WO2021142306A1 (en) 2020-01-10 2021-07-15 Modernatx, Inc. Variational autoencoder for biological sequence generation
US20210228707A1 (en) 2020-01-28 2021-07-29 Modernatx, Inc. Coronavirus rna vaccines
EP4096683A4 (en) 2020-01-30 2024-04-10 Modernatx Inc IMMUNIZATION COMPOSITIONS FOR RESPIRATORY VIRUSES
US20230285297A1 (en) 2020-01-31 2023-09-14 Modernatx, Inc. Methods of preparing lipid nanoparticles
EP4100052A2 (en) 2020-02-07 2022-12-14 ModernaTX, Inc. Sars-cov-2 mrna domain vaccines
WO2021211343A1 (en) 2020-04-13 2021-10-21 Modernatx, Inc. Zika virus mrna vaccines
WO2021222304A1 (en) 2020-04-27 2021-11-04 Modernatx, Inc. Sars-cov-2 rna vaccines
WO2021159130A2 (en) 2020-05-15 2021-08-12 Modernatx, Inc. Coronavirus rna vaccines and methods of use
US20230142529A1 (en) 2020-05-15 2023-05-11 Modernatx, Inc. Rna formulations for high volume distribution
EP4153238A1 (en) 2020-05-21 2023-03-29 ModernaTX, Inc. Methylene blue stabilized mrna compositions
WO2021247817A1 (en) 2020-06-05 2021-12-09 Modernatx, Inc. Bacterial strains for dna production
US11406703B2 (en) 2020-08-25 2022-08-09 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
EP4217371A1 (en) 2020-09-25 2023-08-02 ModernaTX, Inc. Multi-proline-substituted coronavirus spike protein vaccines
EP4274607A1 (en) 2021-01-11 2023-11-15 ModernaTX, Inc. Seasonal rna influenza virus vaccines
CA3208486A1 (en) 2021-01-15 2022-07-21 Modernatx, Inc. Variant strain-based coronavirus vaccines
AU2022207495A1 (en) 2021-01-15 2023-08-03 Modernatx, Inc. Variant strain-based coronavirus vaccines
WO2022187698A1 (en) 2021-03-05 2022-09-09 Modernatx, Inc. Vlp enteroviral vaccines
JP2024511179A (ja) 2021-03-26 2024-03-12 モデルナティエックス インコーポレイテッド 百日咳ワクチン
TW202304944A (zh) 2021-03-31 2023-02-01 美商現代公司 用於產生ｍＲＮＡ之三核苷酸及四核苷酸帽的合成
WO2022212191A1 (en) 2021-04-01 2022-10-06 Modernatx, Inc. Mucosal expression of antibody structures and isotypes by mrna
JP2024512780A (ja) 2021-04-01 2024-03-19 モデルナティエックス インコーポレイテッド 多価ｒｎａ組成物中のｒｎａ種の識別及び比率決定のための方法
WO2022221335A1 (en) 2021-04-13 2022-10-20 Modernatx, Inc. Respiratory virus combination vaccines
CA3216490A1 (en) 2021-04-13 2022-10-20 Modernatx, Inc. Epstein-barr virus mrna vaccines
WO2022221336A1 (en) 2021-04-13 2022-10-20 Modernatx, Inc. Respiratory syncytial virus mrna vaccines
JP2024513999A (ja) 2021-04-14 2024-03-27 モデルナティエックス インコーポレイテッド インフルエンザ－コロナウイルス組み合わせワクチン
WO2023092069A1 (en) 2021-11-18 2023-05-25 Modernatx, Inc. Sars-cov-2 mrna domain vaccines and methods of use

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110136181A1 (en) * 2008-08-08 2011-06-09 Tosoh Corporation Rna polymerase mutant with improved functions
JP2011223982A (ja) * 2010-03-30 2011-11-10 Tosoh Corp Ｔ７ｒｎａポリメラーゼ融合蛋白質
CN102220294A (zh) * 2010-04-16 2011-10-19 霍夫曼-拉罗奇有限公司 具有增强的热稳定性的新颖的t7 rna聚合酶变体
US20120252071A1 (en) * 2011-04-01 2012-10-04 Roche Diagnostics Operations, Inc. T7 rna polymerase variants with cysteine-serine substitutions
CN106459879A (zh) * 2014-03-20 2017-02-22 德克萨斯大学系统董事会 具有扩展的底物范围和提高的转录产率的t7 rna 聚合酶变体
WO2017070624A1 (en) * 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Tropical disease vaccines
WO2017123748A1 (en) * 2016-01-13 2017-07-20 New England Biolabs, Inc. Thermostable variants of t7 rna polymerase

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RAJIV P. BANDWAR等: "The Transition to an Elongation Complex by T7 RNA Polymerase Is a Multistep Process" *
生田哲等, 世界图书出版公司 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113795579A (zh) * 2019-02-20 2021-12-14 摩登纳特斯有限公司 用于共转录加帽的rna聚合酶变体
CN114703162A (zh) * 2022-04-24 2022-07-05 江南大学 一种具有高转录活性的t7 rna聚合酶突变体及其应用
CN114703162B (zh) * 2022-04-24 2023-08-08 江南大学 一种具有高转录活性的t7 rna聚合酶突变体及其应用
CN116926098A (zh) * 2023-07-31 2023-10-24 态创生物科技(广州)有限公司 增强t7rnap对胶原蛋白/弹力蛋白转录活性的定向进化系统和方法

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