CN116926098A - 增强t7rnap对胶原蛋白/弹力蛋白转录活性的定向进化系统和方法 - Google Patents
增强t7rnap对胶原蛋白/弹力蛋白转录活性的定向进化系统和方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116926098A CN116926098A CN202310944052.3A CN202310944052A CN116926098A CN 116926098 A CN116926098 A CN 116926098A CN 202310944052 A CN202310944052 A CN 202310944052A CN 116926098 A CN116926098 A CN 116926098A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- collagen
- t7rnap
- elastin
- directed evolution
- strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims abstract description 59
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims abstract description 59
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 58
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 title claims abstract description 24
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 title claims abstract description 23
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 17
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims abstract description 6
- 101100273253 Rhizopus niveus RNAP gene Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 claims description 13
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- 101000851054 Homo sapiens Elastin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000054289 human ELN Human genes 0.000 claims description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 2
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 claims description 2
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 claims description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 abstract description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 241000702224 Enterobacteria phage M13 Species 0.000 abstract 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 6
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 3
- 108020004513 Bacterial RNA Proteins 0.000 description 2
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 2
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010054814 DNA Gyrase Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000251511 Holothuroidea Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 208000010428 Muscle Weakness Diseases 0.000 description 1
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 210000000795 conjunctiva Anatomy 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000009759 skin aging Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/73—Expression systems using phage (lambda) regulatory sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12Y207/07006—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种增强T7RNAP对胶原蛋白/弹力蛋白转录活性的定向进化系统，包括：(1)M13‑T7噬菌体，所述M13‑T7噬菌体为gIII基因被T7RNAP的编码基因所替代的噬菌体M13；(2)辅助质粒，所述辅助质粒上包含T7启动子介导的胶原蛋白/弹性蛋白‑内含肽‑pIII融合蛋白的表达基因；(3)含F质粒的进化菌株，所述辅助质粒转化到进化菌株中。还公开了相应的进化方法及筛选到的T7RNAP突变体。本发明公开的菌株定向进化方法，可以获得具有高转录胶原蛋白和弹力蛋白活性的T7RNAP突变体，将T7RNAP突变体整合到宿主菌基因组后，可以获得胶原蛋白和弹性蛋白合成能力增强的菌株。
Description
技术领域
本发明涉及一种增强T7 RNAP对胶原蛋白/弹力蛋白转录活性的定向进化系统及方法，涉及生物进化领域。
背景技术
胶原蛋白家族包含28个亚型44个成员，是人体组织结构的主要组成部分之一，是人体中含量最多的蛋白质，约占25-33％。在皮肤层，胶原蛋白占总蛋白质的70％-90％。一个成年人的身体含有大约2-4公斤的胶原蛋白，随着皮肤老化，胶原蛋白会降解和丢失。胶原蛋白是由三条同源或异源肽链组成的三螺旋纤维蛋白，是维持皮肤、组织和器官形态结构的主要成分。胶原蛋白广泛存在于结膜和结缔组织中，在皮肤、关节和骨骼等生物结构中起连接作用。经证实，胶原纤维的厚度和强度随着年龄的增长而被破坏，这与皮肤老化现象有很强的关系，如皱纹、骨稀疏、肌肉无力等。当真皮层的胶原蛋白被氧化断裂时，对表皮的支撑作用消失，导致不均匀的塌陷和皱纹。
由于胶原蛋白对维持身体结构很重要，免疫原性较弱，所以胶原蛋白是美容和医疗领域的明星分子。在医疗中，胶原蛋白可与血小板相互作用产生凝血现象，加速伤口愈合。胶原蛋白与伤口紧密结合，渗透到新的组织中，并作为细胞生长的支架。美容方面，胶原蛋白回填疗法是一种临床证明安全的治疗面部皱纹、疤痕或面部皮肤缺陷的方法。在饮食和涂抹中，补充胶原蛋白裂解液将保持皮肤的年轻状态。因此，胶原蛋白产品有着巨大的市场需求。
市场上主要有两种胶原蛋白。一种是动物来源的胶原蛋白，主要来自猪、牛和鱼，主要通过酸法和酶法工业化。该方法具有成本低、产量大、技术成熟等优点，但存在纯度控制困难和动物源性疾病感染的风险，异基因胶原蛋白应用于人体时可能引起免疫排斥反应或过敏反应。另一种是重组人源胶原蛋白，主要是利用基因工程方法对菌株进行修饰以产生胶原蛋白，如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和转基因作物。该方法具有蛋白纯度高、免疫原性低的优点，在先进市场上具有更大的应用前景。然而，由于胶原蛋白分子量大，结构可重复性强，天然菌株合成胶原蛋白的能力较弱，这使得重组人胶原蛋白的制备成本极高。
发明内容
本发明公开了一种增强T7 RNAP对胶原蛋白/弹力蛋白转录活性的定向进化系统，包括：
(1)M13-T7噬菌体，所述M13-T7噬菌体为gIII基因被T7 RNAP的编码基因所替代的噬菌体M13；
(2)辅助质粒，所述辅助质粒上包含T7启动子介导的胶原蛋白/弹性蛋白-内含肽-pIII融合蛋白的表达基因；
(3)含F质粒的进化菌株，所述辅助质粒转化到进化菌株中。
优选的，所述T7 RNAP的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
优选的，所述T7 RNAP的编码DNA序列如SEQ ID No.2所示。
优选的，所述辅助质粒在T7启动子下游插入阻碍T7 RNAP延伸的序列。
优选的，所述阻碍T7 RNAP延伸的序列如SEQ ID No:5所示。
优选的，所述胶原蛋白为人胶原蛋白I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII、XIX、XX、XXI、XXII、XXIII、XXIV、XXV、XXVI、XXVII或XXVIII；所述弹性蛋白为人弹性蛋白Elastin。
优选的，所述胶原蛋白/弹性蛋白-内含肽-pIII融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示，编码DNA序列如SEQ ID No.4所示。
本发明还公开了一种增强T7 RNAP对胶原蛋白/弹力蛋白转录活性的定向进化方法，其特征在于其步骤包括：
(1)构建上述的定向进化系统；
(2)将M13-T7噬菌体转化到进化菌株中，作为初级噬菌体，采用已知的诱导技术，例如ARTP、诱导质粒等方法诱导突变一段时间后，得到滴度提高的M13噬菌体子代，M13噬菌体子代作为下一轮进化的初级噬菌体，重复上述诱导突变的过程，以获得相较于初始的噬菌体M13效价滴度更高的突变体。
采用上述方法，本发明获得了一种T7 RNAP突变体，其序列为在SEQ ID No.1所示序列的基础上进行K345E、P474L两点突变。
本发明还公开了一种BL21(DE3)菌株，其特征在于其基因组中通过CRISPR转座的方式整合有上述的T7 RNAP突变体的编码基因。该菌株可用于改造成表达胶原蛋白或弹力蛋白的工程菌，比如在菌株中转入表达胶原蛋白或弹力蛋白的质粒，或者对菌株的基因组进行改造，使其直接表达胶原蛋白或弹力蛋白。
本发明公开的菌株定向进化方法，可以获得具有高转录胶原蛋白和弹力蛋白活性的T7RNAP突变体，将T7 RNAP突变体整合到宿主菌基因组后，可以获得胶原蛋白和弹性蛋白合成能力增强的菌株。
附图说明
图1为定向进化菌株原理示意图。
图2为定向进化菌株流程示意图。
图3为定向进化过程中效价的变化。
图4为定向进化后测序结果。
图5为RT-qPCR检测定向进化前后对胶原蛋白-GyrA-pIII融合蛋白基因的表达水平。
图6为RT-qPCR检测定向进化前后对胶原蛋白和弹性蛋白基因的表达水平。
图7为Western blot检测定向进化前后对胶原蛋白的表达水平。
图8为Western blot检测定向进化前后对弹性蛋白的表达水平。
具体实施方式
以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1对胶原蛋白和弹性蛋白合成能力增强的T7 RNAP定向进化。
使用噬菌体来辅助T7 RNAP的定向进化，使其对胶原蛋白和弹性蛋白的转录能力增强,原理如图1所示。将噬菌体M13基因组上的gIII基因替换成T7 RNAP，作为待进化的噬菌体。挑选S1030作为进化使用的宿主菌。为了将胶原蛋白的合成与pIII蛋白的表达结合起来，使用内含肽系统将胶原蛋白和pIII重组成一个融合蛋白。当融合蛋白被翻译出来时，内含肽GyrA可切割释放pIII，从而实现胶原蛋白和pIII表达的共偶联。当突变后的T7 RNAP转录的胶原蛋白越多，释放的pIII就越多，包装的子代噬菌体就越多，原理见图2。因此，胶原蛋白CO3A1-内含肽Mxe GyrA-pIII融合蛋白的DNA序列以及阻碍T7 RNAP延伸的序列合成于广州艾基生物，构建到pET28a载体上，并转化到S1030菌株中。
构建待进化的噬菌体及进化使用的宿主菌的步骤如下：
T7 RNAP DNA片段(引物A(tggagcctttttttttggagattttcaacatgaacac-gattaacatcgctaagaacg，SEQ ID No.6)和引物B(ggagggaaggtaaatattgacggaaattacgcgaacgcgaag-tccgactctaagatgtc，SEQ ID No.7))使用Hieff Gold High FidelityDNA Polymerase(Yeasen Biotechnology Shanghaico.ltd,Cat.No.10148ES60)进行扩增。以M13噬菌体为模板，以引物A(tttttgaaaatctccctccctcaatcgg，SEQ ID No.8)和引物B(catgttgaaaatctccaaaaaaaggctccaaaagg，SEQ ID No.9)为引物，利用DNA聚合酶(DNAPolymerase)扩增不含gIII的M13基因组骨架。利用Hieff /> Plus Multi One Stepclone mix(翌圣生物，10912ES10)克隆试剂盒，克隆T7 RNAP到不含gIII的M13基因组骨架中。克隆产物转化到含pJC175e质粒的S1030菌株。将转化后的S1030-pJC175e在37℃培养过夜，用于M13噬菌体复制、包装和释放。瞬时离心后稀释含噬菌体上清液，感染新鲜菌株S1030-pJC175e，采用双层琼脂糖板法测定滴度。从新鲜菌株S1030-pJC175e中选取单克隆噬菌体进行扩增。采用细菌PCR鉴定片段插入的正确性，PCR产物通过Sanger测序进一步验证。
每一轮进化分为三个步骤。首先，将T7 RNAP的M13初级噬菌体添加到100μL含有胶原蛋白CO3A1-内含肽Mxe GyrA-pIII融合蛋白质粒的新鲜S1030菌株中，最终浓度为10,000-100,000CFU/mL；37℃孵育20min后，瞬时离心除去培养基上清。然后用10μL新鲜LB培养基加100mg/L氨苄西林再悬浮细菌沉淀。我们采用30s ARTP处理4次，使含噬菌体菌株发生突变，然后加入90μl新鲜LB培养基，加入100mg/L氨苄青霉素稀释至100μl。突变菌株在37℃、转速为100rpm的条件下培养。直至噬菌体滴度达到1,000,000CFU/mL。如果噬菌体滴度仍低于1,000,000CFU/mL，则使用S1030-pJC175e扩增M13噬菌体。最后，收集10000rpm离心1min的培养基上清，得到M13噬菌体子代。M13子代噬菌体作为下一轮进化的初级噬菌体。噬菌体效价检测结果见图3。我们将进化后的噬菌体进行测序，获得突变位点(见图4)，突变后的T7 RNAP为在SEQ ID No.1的基础上具有K345E、P474L两点突变。我们利用CRISPR转座的方法(doi.org/10.1021/acssynbio.0c00073)，将进化后的T7 RNAP序列整合到大肠杆菌BL21的基因组IS1位点，获得进化后的大肠杆菌BL21菌株。
实施例2
将含有胶原蛋白CO3A1-内含肽Mxe GyrA-pIII融合蛋白的pET28a质粒转入实施例1获得的BL21菌株。在50mg/L卡那霉素平板上挑取单克隆后，在含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中充分培养后，使用细菌RNA提取试剂盒(翌圣生物，Cat#19301ES50)提取总RNA，并用翌圣生物的V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR和/>qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox)对gIII基因的转录水平进行定量，定量引物使用cggttgaatgtcgcccttttgtctttgg(SEQ ID No.10)和ggtgctcgagttaagactccttattacgcag(SEQ ID No.11)。操作按照说明书指示进行。定量结果见图5。
实施例3
人胶原蛋白III、人弹性蛋白DNA经密码子优化后，合成于广州艾基生物，并分别构建于pET-28a载体上。将构建好的载体转入实施例1获得的BL21菌株。在50mg/L卡那霉素平板上挑取单克隆后，在含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中培养至OD600值达到0.6时，加入1mM IPTG诱导表达过夜，使用细菌RNA提取试剂盒提取总RNA，并用翌圣生物的Vone-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR和/> qPCR SYBR Green MasterMix(No Rox)对gIII基因的转录水平进行定量，定量引物使用aagcttgcggccgcactc和gctcagcggtggcagcag。操作按照说明书指示进行。定量结果见图6。
此外，将获得的菌液离心，加入1X SDS-PAGE loading buffer煮沸10min。12000rpm离心2min取上清，使用Hepes-Tris 12％高分辨率预制胶(Hepes-Tris)按照说明书进行电泳。使用湿转仪将PAGE胶上的蛋白转移至PVDF膜上，250mA转移3h。加入5％脱脂奶粉封闭过夜，使用abclonal的HRP-conjugated Mouse anti His-Tag mAb按照1：5000稀释后孵育PVDF膜2h。PBST充分清洗膜4次，使用翌圣生物的ECL化学发光超敏显色试剂盒对PVDF膜进行显影检测。结果见图7和图8，进化后的菌株具有更强的合成胶原蛋白和弹性蛋白的能力。
Claims (13)
1.一种增强T7 RNAP对胶原蛋白/弹力蛋白转录活性的定向进化系统，其特征在于包括：
(1)M13-T7噬菌体，所述M13-T7噬菌体为gIII基因被T7 RNAP的编码基因所替代的噬菌体M13；
(2)辅助质粒，所述辅助质粒上包含T7启动子介导的胶原蛋白/弹性蛋白-内含肽-pIII融合蛋白的表达基因；
(3)含F质粒的进化菌株，所述辅助质粒转化到进化菌株中。
2.根据权利要求1所述的定向进化系统，其特征在于，所述T7 RNAP的氨基酸序列如SEQID No.1所示。
3.根据权利要求2所述的定向进化系统，其特征在于，所述T7 RNAP的编码DNA序列如SEQ ID No.2所示。
4.根据权利要求1所述的定向进化系统，其特征在于，所述辅助质粒在T7启动子下游插入阻碍T7 RNAP延伸的序列。
5.根据权利要求4所述的定向进化系统，其特征在于，所述阻碍T7 RNAP延伸的序列如SEQ ID NO:5所示。
6.根据权利要求1所述的定向进化系统，其特征在于，所述胶原蛋白为人胶原蛋白I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII、XIX、XX、XXI、XXII、XXIII、XXIV、XXV、XXVI、XXVII或XXVIII；
所述弹性蛋白为人弹性蛋白Elastin。
7.根据权利要求6所述的定向进化系统，其特征在于，所述胶原蛋白/弹性蛋白-内含肽-pIII融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
8.一种增强T7 RNAP对胶原蛋白/弹力蛋白转录活性的定向进化方法，其特征在于其步骤包括：
(1)构建权利要求1-7中任一项所述的定向进化系统；
(2)将M13-T7噬菌体转化到进化菌株中，作为初级噬菌体，诱导噬菌体突变后培养，得到滴度提高的M13噬菌体子代，M13噬菌体子代作为下一轮进化的初级噬菌体，重复上述诱导突变的过程，以获得相较于初始的噬菌体M13效价滴度更高的突变体。
9.一种T7 RNAP突变体，其特征在于其序列为在SEQ ID No.1所示序列的基础上进行K345E、P474L两点突变。
10.权利要求1所述的T7 RNAP突变体的编码基因。
11.一种BL21(DE3)菌株，其特征在于其基因组中整合有权利要求10所述的T7 RNAP突变体的编码基因。
12.权利要求11所述的BL21(DE3)菌株在表达胶原蛋白或弹力蛋白中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于所述BL21(DE3)菌株中还含有表达胶原蛋白或弹力蛋白的质粒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310944052.3A CN116926098B (zh) | 2023-07-31 | 2023-07-31 | 增强t7 rnap对胶原蛋白/弹力蛋白转录活性的定向进化系统和方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310944052.3A CN116926098B (zh) | 2023-07-31 | 2023-07-31 | 增强t7 rnap对胶原蛋白/弹力蛋白转录活性的定向进化系统和方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116926098A true CN116926098A (zh) | 2023-10-24 |
| CN116926098B CN116926098B (zh) | 2024-07-23 |
Family
ID=88384213
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310944052.3A Active CN116926098B (zh) | 2023-07-31 | 2023-07-31 | 增强t7 rnap对胶原蛋白/弹力蛋白转录活性的定向进化系统和方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116926098B (zh) |
Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106554410A (zh) * | 2016-06-02 | 2017-04-05 | 陕西东大生化科技有限责任公司 | 一种重组人源胶原蛋白及其编码基因和制备方法 |
| CN109943581A (zh) * | 2017-12-20 | 2019-06-28 | 深圳先进技术研究院 | 一种质粒以及噬菌体辅助的连续定向进化系统和定向进化方法 |
| CN111212905A (zh) * | 2017-08-18 | 2020-05-29 | 摩登纳特斯有限公司 | Rna聚合酶变体 |
| CN111417724A (zh) * | 2017-06-30 | 2020-07-14 | 科德克希思公司 | T7 rna聚合酶变体 |
| CN111534533A (zh) * | 2020-04-27 | 2020-08-14 | 北京化工大学 | 一种t7rna聚合酶和t7启动子的表达系统及使用其在真核生物中表达蛋白质的方法 |
| CN114540394A (zh) * | 2020-11-25 | 2022-05-27 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种噬菌体相关的基因诱导表达系统 |
| CN114807202A (zh) * | 2021-12-15 | 2022-07-29 | 广州先进技术研究所 | 噬菌体辅助的纤维寡糖转运蛋白连续定向进化系统和方法 |
| CN115074377A (zh) * | 2022-06-30 | 2022-09-20 | 广州市乾相生物科技有限公司 | 效价可控的噬菌体辅助进化方法 |
| CN115948439A (zh) * | 2022-09-07 | 2023-04-11 | 广州市乾相生物科技有限公司 | 噬菌体辅助内含肽进化系统及进化方法 |
| CN116162616A (zh) * | 2023-01-28 | 2023-05-26 | 态创生物科技(广州)有限公司 | 高效诱变方法在提高噬菌体辅助进化效率中的应用 |
| CN116240221A (zh) * | 2022-12-26 | 2023-06-09 | 态创生物科技(广州)有限公司 | 噬菌体辅助自环化环状rna进化体系 |
-
2023
- 2023-07-31 CN CN202310944052.3A patent/CN116926098B/zh active Active
Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106554410A (zh) * | 2016-06-02 | 2017-04-05 | 陕西东大生化科技有限责任公司 | 一种重组人源胶原蛋白及其编码基因和制备方法 |
| CN111417724A (zh) * | 2017-06-30 | 2020-07-14 | 科德克希思公司 | T7 rna聚合酶变体 |
| CN111212905A (zh) * | 2017-08-18 | 2020-05-29 | 摩登纳特斯有限公司 | Rna聚合酶变体 |
| CN109943581A (zh) * | 2017-12-20 | 2019-06-28 | 深圳先进技术研究院 | 一种质粒以及噬菌体辅助的连续定向进化系统和定向进化方法 |
| CN111534533A (zh) * | 2020-04-27 | 2020-08-14 | 北京化工大学 | 一种t7rna聚合酶和t7启动子的表达系统及使用其在真核生物中表达蛋白质的方法 |
| CN114540394A (zh) * | 2020-11-25 | 2022-05-27 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种噬菌体相关的基因诱导表达系统 |
| CN114807202A (zh) * | 2021-12-15 | 2022-07-29 | 广州先进技术研究所 | 噬菌体辅助的纤维寡糖转运蛋白连续定向进化系统和方法 |
| CN115074377A (zh) * | 2022-06-30 | 2022-09-20 | 广州市乾相生物科技有限公司 | 效价可控的噬菌体辅助进化方法 |
| CN115948439A (zh) * | 2022-09-07 | 2023-04-11 | 广州市乾相生物科技有限公司 | 噬菌体辅助内含肽进化系统及进化方法 |
| CN116240221A (zh) * | 2022-12-26 | 2023-06-09 | 态创生物科技(广州)有限公司 | 噬菌体辅助自环化环状rna进化体系 |
| CN116162616A (zh) * | 2023-01-28 | 2023-05-26 | 态创生物科技(广州)有限公司 | 高效诱变方法在提高噬菌体辅助进化效率中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116926098B (zh) | 2024-07-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20240100145A1 (en) | Vlp enteroviral vaccines | |
| CN109666685B (zh) | Hpv卵黄抗体及其在制备治疗hpv感染的药物的应用 | |
| CN107815441B (zh) | 一种ⅱ型伪狂犬病毒减毒株及其制备方法和应用 | |
| WO2018107088A2 (en) | Respiratory virus nucleic acid vaccines | |
| CN109575126B (zh) | 多肽、其生产方法和用途 | |
| US9745351B2 (en) | Truncated L1 protein of human papillomavirus type 6 | |
| CN104593388B (zh) | 一种鲫鱼疱疹病毒病jdorf25疫苗及制备方法和应用 | |
| CN113736750B (zh) | 一株盖他病毒毒株及其应用 | |
| JPH05508538A (ja) | 馬ヘルペスウィルス―４ ｔｋ￣ワクチン | |
| US9364529B2 (en) | Truncated L1 protein of human papillomavirus type 18 | |
| CN116926098B (zh) | 增强t7 rnap对胶原蛋白/弹力蛋白转录活性的定向进化系统和方法 | |
| CN113106098B (zh) | 一种在红系细胞中特异表达人β珠蛋白的重组序列及其应用 | |
| WO2017211052A1 (zh) | 一种fliC蛋白微胶囊疫苗 | |
| CN114703152B (zh) | 类鼻疽伯克霍尔德菌噬菌体vB_BpP_HN01及应用 | |
| CN113337506B (zh) | CRISPRi介导的抑制瘢痕形成的外泌体及其制备方法和应用 | |
| CN101560247B (zh) | 大肠杆菌热敏性肠毒素双突变体作为疫苗黏膜免疫佐剂 | |
| CN110891597B (zh) | 防治家禽滑膜霉浆菌感染的组合物 | |
| CN108840950A (zh) | 一种由猪白细胞介素2、猪干扰素γ和猪干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN115521881A (zh) | 柯萨奇病毒16型重组病毒样颗粒表达系统、该表达系统制备的病毒样颗粒及手足口病疫苗 | |
| CN114058524A (zh) | 一种法氏囊亚病毒颗粒疫苗及其制备方法 | |
| NZ530780A (en) | Nucleic acid free ghost preparations | |
| CN112159480A (zh) | 一种鸡传染性法氏囊病病毒多抗原表位蛋白及其应用 | |
| KR102659073B1 (ko) | 인간 제6형 콜라겐 유전자를 포함하는 발현 컨스트럭트로 형질전환된 균주를 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 | |
| CN112778423B (zh) | 猪蓝耳病亚单位疫苗组合物及其制备方法和应用 | |
| CN114480301B (zh) | 预防或治疗禽病毒感染症的疫苗 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |