CN116162616A - 高效诱变方法在提高噬菌体辅助进化效率中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了高效诱变方法在提高噬菌体辅助进化效率中的应用，其中所述的高效诱变方法为物理诱变方法或化学诱变方法。还公开了一种提高噬菌体辅助进化效率的方法，使用M13噬菌体侵染宿主菌株后，用等离子、微波、电离辐射、紫外等高效物理诱变方式和硫酸二乙酯、亚硝基胍等高效化学诱变方式处理侵染噬菌体的宿主菌，然后释放子代噬菌体，完成一轮进化，重复上述进化过程，直至得到进化后的目的基因。相比传统利用突变质粒进行突变进化的方式，本发明方法可以将噬菌体的进化速度提高10‑1000倍，缩短噬菌体进化的时间，突变更加随机，种类更加均一。

Description

高效诱变方法在提高噬菌体辅助进化效率中的应用
技术领域
本发明涉及一种高效诱变方法在提高噬菌体辅助进化效率中的应用及提高噬菌体辅助进化效率的方法，属于基因进化技术领域。
背景技术
人工诱变是人为地引入物理、化学诱变因素诱发生物遗传变异，在较短的时间内获得有利用价值的突变体，是一种广泛应用的育种方法。利用秋水仙素、甲基磺酸乙酯、亚硝基乙基脲、亚硝酸、等离子体、紫外线、微波等方式诱导生物体基因突变，再筛选得到有利的突变体，大大提高进化效率。其中，辐射诱变技术问世虽然只有短短数十年的历史，但因其突变迅速，随机，操作相对安全，简单等优势，已经成为新品种改良的重要途径之一。
定向进化是近些年来兴起的生物技术，利用实验室规模的进化系统，可以在数月的时间内获得自然界中需要数十亿年的进化结果，是一项广泛使用的蛋白或RNA改造技术。正因如此，定向进化技术获得了2018年的诺贝尔化学奖。噬菌体辅助菌株连续进化技术，又称为PACE技术(phage assisted continuous evolution)，是哈佛大学David R.Liu于2011年开发的一种基于噬菌体的酶进化技术。这种技术的核心是将酶的活性与噬菌体的侵染能力进行偶联，即酶的活性越强，噬菌体的效价越高。再利用随机诱变的方法在进化过程不断的产生酶突变体，酶的基因整合到了噬菌体的基因组中，从而实现基因组上携带越高活性酶基因能够包装出侵染能力越强的噬菌体的目的。最终利用此方法筛选出高活性的酶变体。PACE具有操作简单、成本低廉和进化速度快等优点，因此广泛应用在各种酶进化的领域。
PACE使用的诱变方式是酶法随机诱变，通过表达低保真DNA聚合酶、DNA甲基化酶、DNA脱氨酶、DNA修复抑制蛋白等多个影响DNA复制保真性和DNA编辑的蛋白，来使得DNA基因组碱基上发生随机突变，这种随机突变方法没有靶向性，即宿主基因组和噬菌体基因组发生突变的概率基本相当，因此在PACE进化过程中，需要不断加入新鲜的宿主菌来防止突变后的宿主菌对噬菌体侵染不敏感或者出现错误的噬菌体包装。但是，低效的酶法随机诱变使得噬菌体进化的速度非常缓慢，一轮进化往往需要1-2天，且突变的积累需要更长的过程。这使得PACE用于蛋白进化的时间变得极长，需要数月。低效的诱变也使得优势噬菌体的包装变得很困难，影响了PACE的发展和应用。
发明内容
本发明的目的是提供等离子诱变在提高噬菌体辅助进化效率中的应用。
本发明采用的技术方案为：高效诱变方法在提高噬菌体辅助进化效率中的应用，其中所述的高效诱变方法为物理诱变方法或化学诱变方法。
优选的，所述物理诱变方法为等离子诱变、微波诱变、电离辐射诱变或紫外诱变，所述化学诱变方法为硫酸二乙酯诱变或亚硝基胍诱变；或者所述高效诱变方法为前述物理诱变方法与化学诱变方法的组合。
本发明还公开了一种提高噬菌体辅助进化效率的方法，依赖于噬菌体辅助进化体系完成，所述噬菌体辅助进化体系包括：
M13噬菌体，带有需进化的目的基因，且gⅢ基因缺失；
转化有gⅢ辅助质粒的宿主菌，所述辅助质粒表达gⅢ基因，且gⅢ基因的表达水平与目的基因活性呈正相关；
该方法具体为：使用M13噬菌体侵染宿主菌株后，用高效诱变方式处理侵染噬菌体的宿主菌，然后释放子代噬菌体，完成一轮进化，重复上述进化过程，直至得到进化后的目的基因。
优选的，所述的高效诱变方法为物理诱变方法或化学诱变方法，所述物理诱变方法为等离子诱变、微波诱变、电离辐射诱变或紫外诱变，所述化学诱变方法为硫酸二乙酯诱变或亚硝基胍诱变；
或者所述高效诱变方法为前述诱变方法的组合。
优选的，所述等离子诱变为将侵染噬菌体后的宿主菌分成3-5等份，至少取其中的三份放置于等离子诱变仪中分别诱变15-30s、30～60s、60～90s，然后全部合并在一起。
优选的，所述微波诱变为将侵染噬菌体后的宿主菌分成3-5等份，至少取其中的三份分别在微波发射仪中诱变10-20s、20-40s、40-50s，然后全部合并在一起。
优选的，所述电离辐射诱变为将侵染噬菌体后的宿主菌分成3-5等份，至少取其中的三份分别在电离辐射仪中诱变10-20s、20-40s、40-50s，然后全部合并在一起。
优选的，所述紫外诱变为将侵染噬菌体后的宿主菌分成3-5等份，至少取其中的三份分别在紫外线发射仪中诱变2-4、4-8、8-10min，然后全部合并在一起。
优选的，所述硫酸二乙酯诱变为将侵染噬菌体后的菌株离心，去除上清，再加入含体积比0.1-1％硫酸二乙酯的新鲜培养基孵育1-3小时以释放子代噬菌体。
优选的，所述硫酸二乙酯诱变为将侵染噬菌体后的宿主菌先进行上述的物理诱变，再将物理诱变后的菌株离心，去除上清，加入含体积比0.1-1％硫酸二乙酯的新鲜培养基孵育1-3小时以释放子代噬菌体。
优选的，所述亚硝基胍诱变为将侵染噬菌体后的菌株离心，去除上清，再加入含0.01-0.1g/L亚硝基胍的新鲜培养基孵育1-3小时以释放子代噬菌体。
优选的，所述亚硝基胍诱变为将侵染噬菌体后的宿主菌先进行上述的物理诱变，再将物理诱变后的菌株离心，去除上清，加入含0.01-0.1g/L亚硝基胍的新鲜培养基孵育1-3小时以释放子代噬菌体。
优选的，所述宿主菌是含F质粒的大肠杆菌。
本发明公布了一种提高噬菌体辅助进化效率的方法，该方法包含一个含F质粒的宿主菌株、一个基因组中含要进化的目的酶基因的M13噬菌体(gⅢ基因缺失)、一个含响应目的酶活性的gⅢ辅助质粒、一个高效诱变宿主菌基因的步骤。gIII辅助质粒转化到宿主菌株中，使用M13噬菌体侵染宿主菌株，引入等离子诱变高效突变噬菌体基因组，高活性的目的酶变体促进辅助质粒表达更多的pIII蛋白，最终将含目的酶变体相应DNA序列包装到高活性的新一代噬菌体中，进而进行下一轮的侵染和突变进化。进化池中的噬菌体逐渐被基因组中含高活性目的酶变体DNA序列的子代噬菌体所替代。相比传统利用突变质粒进行突变进化的方式，利用此方法，可以将噬菌体的进化速度提高10-1000倍，缩短噬菌体进化的时间，使突变更加随机，种类更加均一。本发明利用不同时间梯度的诱变来提高突变的复杂程度，单独诱变15s可能突变很少，进化效果不明显；单独诱变90s可能突变过多，导致菌株和噬菌体大量死亡，采用梯度突变，获得的突变效果明显优于单独时间的诱变。
附图说明
图1本发明与传统PACE的突变效率比较。本发明诱变3min的突变效率是传统PACE诱变3天突变效率的50倍。
图2本发明与传统PACE的突变类型比较。本发明和传统PACE的主要突变类型都是碱基替换，但本发明的突变类型中还包括插入缺失。
图3本发明与传统PACE的在点突变上的均一性比较。本发明在点突变上(替换)上的均一性高于传统PACE，本发明偏好性更小。
图4本发明与传统PACE在pIV蛋白进化上的噬菌体效价比较。
图5不同等离子诱变方式的噬菌体进化效率比较。
具体实施方式
下面通过提高噬菌体辅助进化效率方法的流程对本发明进一步说明，这些具体实例不应以任何方式被解释为限制本发明的应用范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
为了验证本发明和传统PACE(酶法诱变)的效率，利用超级辅助噬菌体(MaxHelper Phage，广州之星生物科技有限公司)的Kana抗性基因作为诱变效率的标准。Kana抗性基因不参与压力选择和噬菌体包装，因此其突变对噬菌体增殖是解偶联的，是诱变效率的有效评判指标。
传统PACE(酶法诱变)：JM109大肠杆菌菌株感受态(生物风)中转入DP6质粒(Addgene，#69669)，在含50mg/L氯霉素的LB培养基中培养至OD600值达到0.2左右时，加入1/100体积的效价为109pfu/ml的超级辅助噬菌体，37℃220rpm震荡培养1h后，12000rpm离心1min。去上清，加入含50mg/L氯霉素和10mM L-阿拉伯糖的LB培养基悬浮，37℃220rpm震荡培养3天。12000rpm离心1min。去上清，加入含50mg/L氯霉素和5ug/L的脱水四环素的LB培养基悬浮，37℃220rpm震荡培养2h。12000rpm离心1min，取上清。使用双层平板法分离单个噬菌斑，利用M13噬菌体单链基因组DNA快速提取试剂盒提取噬菌体基因组，利用一代测序检测Kana抗性基因的突变情况。
等离子法诱变PACE：JM109大肠杆菌菌株感受态(生物风)中转入DP6质粒(Addgene，#69669)，在含50mg/L氯霉素的LB培养基中培养至OD600值达到0.2左右时，加入1/100体积的效价为109pfu/ml的超级辅助噬菌体，37℃220rpm震荡培养1h后，将侵染噬菌体后的宿主菌平分成5等份，分别在等离子诱变仪中诱变15、30、45、60、90s，然后合并在一起。12000rpm离心1min。去上清，加入含50mg/L氯霉素和5ug/L的脱水四环素的LB培养基悬浮，37℃220rpm震荡培养2h。12000rpm离心1min，取上清。使用双层平板法分离单个噬菌斑，利用M13噬菌体单链基因组DNA快速提取试剂盒提取噬菌体基因组，利用一代测序检测Kana抗性基因的突变情况。
微波法诱变PACE：JM109大肠杆菌菌株感受态(生物风)中转入DP6质粒(Addgene，
#69669)，在含50mg/L氯霉素的LB培养基中培养至OD600值达到0.2左右时，加入1/100体积的效价为109pfu/ml的超级辅助噬菌体，37℃220rpm震荡培养1h后，将侵染噬菌体后的宿主菌平分成5等份，分别在微波诱变仪中诱变10、20、30、40、50s，然后合并在一起。12000rpm离心1min。去上清，加入含50mg/L氯霉素和5ug/L的脱水四环素的LB培养基悬浮，37℃220rpm震荡培养2h。12000rpm离心1min，取上清。使用双层平板法分离单个噬菌斑，利用M13噬菌体单链基因组DNA快速提取试剂盒提取噬菌体基因组，利用一代测序检测Kana抗性基因的突变情况。
电离辐射法诱变PACE：JM109大肠杆菌菌株感受态(生物风)中转入DP6质粒(Addgene，#69669)，在含50mg/L氯霉素的LB培养基中培养至OD600值达到0.2左右时，加入1/100体积的效价为109pfu/ml的超级辅助噬菌体，37℃220rpm震荡培养1h后，将侵染噬菌体后的宿主菌平分成5等份，分别在电离辐射仪中诱变10、20、30、40、50s，然后合并在一起。12000rpm离心1min。去上清，加入含50mg/L氯霉素和5ug/L的脱水四环素的LB培养基悬浮，37℃220rpm震荡培养2h。12000rpm离心1min，取上清。使用双层平板法分离单个噬菌斑，利用M13噬菌体单链基因组DNA快速提取试剂盒提取噬菌体基因组，利用一代测序检测Kana抗性基因的突变情况。
紫外辐射法诱变PACE：JM109大肠杆菌菌株感受态(生物风)中转入DP6质粒(Addgene，#69669)，在含50mg/L氯霉素的LB培养基中培养至OD600值达到0.2左右时，加入1/100体积的效价为109pfu/ml的超级辅助噬菌体，37℃220rpm震荡培养1h后，将侵染噬菌体后的宿主菌平分成5等份，分别在紫外辐射仪中诱变2、4、6、8、10min，然后合并在一起。12000rpm离心1min。去上清，加入含50mg/L氯霉素和5ug/L的脱水四环素的LB培养基悬浮，37℃220rpm震荡培养2h。12000rpm离心1min，取上清。使用双层平板法分离单个噬菌斑，利用M13噬菌体单链基因组DNA快速提取试剂盒提取噬菌体基因组，利用一代测序检测Kana抗性基因的突变情况。
硫酸二乙酯法诱变PACE：JM109大肠杆菌菌株感受态(生物风)中转入DP6质粒(Addgene，#69669)，在含50mg/L氯霉素的LB培养基中培养至OD600值达到0.2左右时，加入1/100体积的效价为109pfu/ml的超级辅助噬菌体，37℃220rpm震荡培养1h后。
12000rpm离心1min。去上清，加入含体积比0.1％硫酸二乙酯、50mg/L氯霉素和5ug/L的脱水四环素的LB培养基悬浮，37℃220rpm震荡培养2h。12000rpm离心1min，取上清。使用双层平板法分离单个噬菌斑，利用M13噬菌体单链基因组DNA快速提取试剂盒提取噬菌体基因组，利用一代测序检测Kana抗性基因的突变情况。
亚硝基胍诱变PACE：JM109大肠杆菌菌株感受态(生物风)中转入DP6质粒(Addgene，#69669)，在含50mg/L氯霉素的LB培养基中培养至OD600值达到0.2左右时，加入1/100体积的效价为109pfu/ml的超级辅助噬菌体，37℃220rpm震荡培养1h后。12000rpm离心1min。去上清，加入含0.01g/L亚硝基胍、50mg/L氯霉素和5ug/L的脱水四环素的LB培养基悬浮，37℃220rpm震荡培养2h。12000rpm离心1min，取上清。使用双层平板法分离单个噬菌斑，利用M13噬菌体单链基因组DNA快速提取试剂盒提取噬菌体基因组，利用一代测序检测Kana抗性基因的突变情况。
结果如图1-3所示，可以看出，本发明和传统PACE的主要突变类型都是碱基替换，但本发明的突变类型中还包括插入和缺失。本发明在点突变上(替换)上的均一性高于传统PACE，本发明偏好性更小。
实施例2
为验证不同进化方法的效率，我们将超级辅助噬菌体的gIV基因的编码氨基酸密码子随机替换成终止密码子(如将赖氨酸密码子AAA替换成终止密码子TAA，形成A>T突变；将谷氨酰胺密码子CAA突变成TAA，形成C>T；将酪氨酸密码子TAC替换成终止密码子TAG和TAA，形成C>A/G的突变等)。pIV蛋白是调控DP6质粒中pIII蛋白的关键，因此只有突变回有活性的pIV蛋白的噬菌体才能在进化过程中占优势。在此基础上，我们进行了两种PACE进化效率的对比。
传统PACE(酶法诱变)：JM109大肠杆菌菌株感受态(生物风)中转入DP6质粒(Addgene，#69669)，在含50mg/L氯霉素的LB培养基中培养至OD600值达到0.2左右时，加入1/100体积的效价为109pfu/ml的超级辅助噬菌体(pIV蛋白被终止密码子失活)，37℃220rpm震荡培养1h后，12000rpm离心1min。去上清，加入含50mg/L氯霉素和10mM L-阿拉伯糖的LB培养基悬浮，37℃220rpm震荡培养1天。12000rpm离心1min。去上清，加入含50mg/L氯霉素和5ug/L的脱水四环素的LB培养基悬浮，37℃220rpm震荡培养2h。12000rpm离心1min，取上清。作为第一轮进化的子代噬菌体。取上述宿主菌，加入1/100体积的效价为109pfu/ml的子代噬菌体，37℃220rpm震荡培养1h后，12000rpm离心1min。去上清，加入含50mg/L氯霉素和10mM L-阿拉伯糖的LB培养基悬浮，37℃220rpm震荡培养1天。12000rpm离心1min。去上清，加入含50mg/L氯霉素和5ug/L的脱水四环素的LB培养基悬浮，37℃220rpm震荡培养2h。12000rpm离心1min，取上清。作为第二轮进化的子代噬菌体。按照上述循环的方式进行进化。
等离子法诱变PACE：JM109大肠杆菌菌株感受态(生物风)中转入DP6质粒(Addgene，#69669)，在含50mg/L氯霉素的LB培养基中培养至OD600值达到0.2左右时，加入1/100体积的效价为109pfu/ml的超级辅助噬菌体(pIV蛋白被终止密码子失活)，37℃220rpm震荡培养1h后，将侵染噬菌体后的宿主菌平分成5等份，分别在等离子诱变仪中诱变15、30、45、60、90s，然后合并在一起。12000rpm离心1min。去上清，加入含50mg/L氯霉素和5ug/L的脱水四环素的LB培养基悬浮，37℃220rpm震荡培养1h。12000rpm离心1min，取上清。作为第一轮进化的子代噬菌体。取上述宿主菌，加入1/100体积的效价为109pfu/ml的子代噬菌体，37℃220rpm震荡培养1h后，将侵染噬菌体后的宿主菌平分成5等份，分别在等离子诱变仪中诱变15、30、45、60、90s，然后合并在一起。12000rpm离心1min。去上清，加入含50mg/L氯霉素和5ug/L的脱水四环素的LB培养基悬浮，37℃220rpm震荡培养1h。12000rpm离心1min，取上清。作为第二轮进化的子代噬菌体。按照上述循环的方式进行进化。
微波法诱变PACE：JM109大肠杆菌菌株感受态(生物风)中转入DP6质粒(Addgene，
#69669)，在含50mg/L氯霉素的LB培养基中培养至OD600值达到0.2左右时，加入1/100体积的效价为109pfu/ml的超级辅助噬菌体(pIV蛋白被终止密码子失活)，37℃220rpm震荡培养1h后，将侵染噬菌体后的宿主菌平分成5等份，分别在微波诱变仪中诱变10、20、30、40、50s，然后合并在一起。12000rpm离心1min。去上清，加入含50mg/L氯霉素和5ug/L的脱水四环素的LB培养基悬浮，37℃220rpm震荡培养1h。12000rpm离心1min，取上清。作为第一轮进化的子代噬菌体。取上述宿主菌，加入1/100体积的效价为109pfu/ml的子代噬菌体，37℃220rpm震荡培养1h后，将侵染噬菌体后的宿主菌平分成5等份，分别在微波诱变仪中诱变10、20、30、40、50s，然后合并在一起。12000rpm离心1min。去上清，加入含50mg/L氯霉素和5ug/L的脱水四环素的LB培养基悬浮，37℃220rpm震荡培养1h。12000rpm离心1min，取上清。作为第二轮进化的子代噬菌体。按照上述循环的方式进行进化。
硫酸二乙酯法诱变PACE：JM109大肠杆菌菌株感受态(生物风)中转入DP6质粒(Addgene，#69669)，在含50mg/L氯霉素的LB培养基中培养至OD600值达到0.2左右时，加入1/100体积的效价为109pfu/ml的超级辅助噬菌体(pIV蛋白被终止密码子失活)，37℃220rpm震荡培养1h后，12000rpm离心1min。去上清，加入含0.1％硫酸二乙酯、50mg/L氯霉素和5ug/L的脱水四环素的LB培养基悬浮，37℃220rpm震荡培养1h。12000rpm离心1min，取上清。作为第一轮进化的子代噬菌体。取上述宿主菌，加入1/100体积的效价为109pfu/ml的子代噬菌体，37℃220rpm震荡培养1h后，12000rpm离心1min。去上清，加入含0.1％硫酸二乙酯、50mg/L氯霉素和5ug/L的脱水四环素的LB培养基悬浮，37℃220rpm震荡培养1h。12000rpm离心1min，取上清。作为第二轮进化的子代噬菌体。按照上述循环的方式进行进化。
亚硝基胍法诱变PACE：JM109大肠杆菌菌株感受态(生物风)中转入DP6质粒(Addgene，#69669)，在含50mg/L氯霉素的LB培养基中培养至OD600值达到0.2左右时，加入1/100体积的效价为109pfu/ml的超级辅助噬菌体(pIV蛋白被终止密码子失活)，37℃220rpm震荡培养1h后，12000rpm离心1min。去上清，加入含0.01g/L亚硝基胍、50mg/L氯霉素和5ug/L的脱水四环素的LB培养基悬浮，37℃220rpm震荡培养1h。12000rpm离心1min，取上清。作为第一轮进化的子代噬菌体。取上述宿主菌，加入1/100体积的效价为109pfu/ml的子代噬菌体，37℃220rpm震荡培养1h后，12000rpm离心1min。去上清，加入含0.01g/L亚硝基胍、50mg/L氯霉素和5ug/L的脱水四环素的LB培养基悬浮，37℃220rpm震荡培养1h。12000rpm离心1min，取上清。作为第二轮进化的子代噬菌体。按照上述循环的方式进行进化。
等离子法和硫酸二乙酯法联用PACE:JM109大肠杆菌菌株感受态(生物风)中转入DP6质粒(Addgene，#69669)，在含50mg/L氯霉素的LB培养基中培养至OD600值达到0.2左右时，加入1/100体积的效价为109pfu/ml的超级辅助噬菌体(pIV蛋白被终止密码子失活)，37℃220rpm震荡培养1h后，将侵染噬菌体后的宿主菌平分成5等份，分别在等离子诱变仪中诱变15、30、45、60、90s，然后合并在一起。12000rpm离心1min。去上清，加入含0.1％硫酸二乙酯、50mg/L氯霉素和5ug/L的脱水四环素的LB培养基悬浮，37℃220rpm震荡培养1h。12000rpm离心1min，取上清。作为第一轮进化的子代噬菌体。取上述宿主菌，加入1/100体积的效价为109pfu/ml的子代噬菌体，37℃220rpm震荡培养1h后，将侵染噬菌体后的宿主菌平分成5等份，分别在等离子诱变仪中诱变15、30、45、60、90s，然后合并在一起。12000rpm离心1min。去上清，加入含0.1％硫酸二乙酯、50mg/L氯霉素和5ug/L的脱水四环素的LB培养基悬浮，37℃220rpm震荡培养1h。12000rpm离心1min，取上清。作为第二轮进化的子代噬菌体。按照上述循环的方式进行进化。
等离子法和亚硝基胍法联用PACE:JM109大肠杆菌菌株感受态(生物风)中转入DP6质粒(Addgene，#69669)，在含50mg/L氯霉素的LB培养基中培养至OD600值达到0.2左右时，加入1/100体积的效价为109pfu/ml的超级辅助噬菌体(pIV蛋白被终止密码子失活)，37℃220rpm震荡培养1h后，将侵染噬菌体后的宿主菌平分成5等份，分别在等离子诱变仪中诱变15、30、45、60、90s，然后合并在一起。12000rpm离心1min。去上清，加入含0.01g/L亚硝基胍、50mg/L氯霉素和5ug/L的脱水四环素的LB培养基悬浮，37℃220rpm震荡培养1h。12000rpm离心1min，取上清。作为第一轮进化的子代噬菌体。取上述宿主菌，加入1/100体积的效价为109pfu/ml的子代噬菌体，37℃220rpm震荡培养1h后，将侵染噬菌体后的宿主菌平分成5等份，分别在等离子诱变仪中诱变15、30、45、60、90s，然后合并在一起。12000rpm离心1min。去上清，加入含0.01g/L亚硝基胍、50mg/L氯霉素和5ug/L的脱水四环素的LB培养基悬浮，37℃220rpm震荡培养1h。12000rpm离心1min，取上清。作为第二轮进化的子代噬菌体。按照上述循环的方式进行进化。
每天利用双层平板法测定子代噬菌体的效价，作为进化效率的依据。结果如图4所示，从图4可以看出，本发明公布的高效诱变PACE技术的进化效率远高于传统酶法诱变，相较传统酶法诱变而言，噬菌体效价提升更快，进化效率更高。
实施例3
为保证进化的安全性，减少有毒化学试剂对人体的危害，在本实施例中，我们单独测试了不同程度等离子诱变时间对噬菌体进化效率的影响。
JM109大肠杆菌菌株感受态(生物风)中转入DP6质粒(Addgene，#69669)，在含50mg/L氯霉素的LB培养基中培养至OD600值达到0.2左右时，加入1/100体积的效价为109pfu/ml的超级辅助噬菌体(pIV蛋白被终止密码子失活)，37℃220rpm震荡培养1h后，分别在等离子诱变仪中诱变15、45、90s、(或将侵染噬菌体后的宿主菌平分成5等份，分别在等离子诱变仪中诱变15、30、45、60、90s，然后合并在一起)。12000rpm离心1min。去上清，加入含50mg/L氯霉素和5ug/L的脱水四环素的LB培养基悬浮，37℃220rpm震荡培养1h。12000rpm离心1min，取上清。作为第一轮进化的子代噬菌体。取上述宿主菌，加入1/100体积的效价为109pfu/ml的子代噬菌体，37℃220rpm震荡培养1h后，分别在等离子诱变仪中诱变15、45、90s、(或将侵染噬菌体后的宿主菌平分成5等份，分别在等离子诱变仪中诱变15、30、45、60、90s，然后合并在一起)。12000rpm离心1min。去上清，加入含50mg/L氯霉素和5ug/L的脱水四环素的LB培养基悬浮，37℃220rpm震荡培养1h。12000rpm离心1min，取上清。作为第二轮进化的子代噬菌体。按照上述循环的方式进行进化。
每天利用双层平板法测定子代噬菌体的效价，作为进化效率的依据。结果如图5所示，梯度诱变后的菌株合并在一起在进化效率更高、更稳定。

Claims (13)

1.高效诱变方法在提高噬菌体辅助进化效率中的应用，其中所述的高效诱变方法为物理诱变方法或化学诱变方法。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述物理诱变方法为等离子诱变、微波诱变、电离辐射诱变或紫外诱变，所述化学诱变方法为硫酸二乙酯诱变或亚硝基胍诱变；
或者所述高效诱变方法为前述物理诱变方法与化学诱变方法的组合。
3.一种提高噬菌体辅助进化效率的方法，依赖于噬菌体辅助进化体系完成，所述噬菌体辅助进化体系包括：
M13噬菌体，带有需进化的目的基因，且gⅢ基因缺失；
转化有gⅢ辅助质粒的宿主菌，所述辅助质粒表达gⅢ基因，且gⅢ基因的表达水平与目的基因活性呈正相关；
其特征在于该方法具体为：使用M13噬菌体侵染宿主菌株后，用高效诱变方式处理侵染噬菌体的宿主菌，然后释放子代噬菌体，完成一轮进化，重复上述进化过程，直至得到进化后的目的基因。
4.根据权利要求3所述的提高噬菌体辅助进化效率的方法，其特征在于所述的高效诱变方法为物理诱变方法或化学诱变方法，所述物理诱变方法为等离子诱变、微波诱变、电离辐射诱变或紫外诱变，所述化学诱变方法为硫酸二乙酯诱变或亚硝基胍诱变；
或者所述高效诱变方法为前述诱变方法的组合。
5.根据权利要求4所述的提高噬菌体辅助进化效率的方法，其特征在于所述等离子诱变为将侵染噬菌体后的宿主菌分成3-5等份，至少取其中的三份放置于等离子诱变仪中分别诱变15-30s、30～60s、60～90s，然后全部合并在一起。
6.根据权利要求4所述的提高噬菌体辅助进化效率的方法，其特征在于所述微波诱变为将侵染噬菌体后的宿主菌分成3-5等份，至少取其中的三份分别在微波发射仪中诱变10-20s、20-40s、40-50s，然后全部合并在一起。
7.根据权利要求4所述的提高噬菌体辅助进化效率的方法，其特征在于所述电离辐射诱变为将侵染噬菌体后的宿主菌分成3-5等份，至少取其中的三份分别在电离辐射仪中诱变10-20s、20-40s、40-50s，然后全部合并在一起。
8.根据权利要求4所述的提高噬菌体辅助进化效率的方法，其特征在于所述紫外诱变为将侵染噬菌体后的宿主菌分成3-5等份，至少取其中的三份分别在紫外线发射仪中诱变2-4、4-8、8-10min，然后全部合并在一起。
9.根据权利要求4所述的提高噬菌体辅助进化效率的方法，其特征在于所述硫酸二乙酯诱变为将侵染噬菌体后的菌株离心，去除上清，再加入含体积比0.1-1％硫酸二乙酯的新鲜培养基孵育1-3小时以释放子代噬菌体。
10.根据权利要求4所述的提高噬菌体辅助进化效率的方法，其特征在于所述硫酸二乙酯诱变为将侵染噬菌体后的宿主菌先进行权利要求5-8所述的物理诱变，再将物理诱变后的菌株离心，去除上清，加入含体积比0.1-1％硫酸二乙酯的新鲜培养基孵育1-3小时以释放子代噬菌体。
11.根据权利要求4所述的提高噬菌体辅助进化效率的方法，其特征在于所述亚硝基胍诱变为将侵染噬菌体后的菌株离心，去除上清，再加入含0.01-0.1g/L亚硝基胍的新鲜培养基孵育1-3小时以释放子代噬菌体。
12.根据权利要求4所述的提高噬菌体辅助进化效率的方法，其特征在于所述亚硝基胍诱变为将侵染噬菌体后的宿主菌先进行权利要求5-8所述的物理诱变，再将物理诱变后的菌株离心，去除上清，加入含0.01-0.1g/L亚硝基胍的新鲜培养基孵育1-3小时以释放子代噬菌体。
13.根据权利要求4所述的提高噬菌体辅助进化效率的方法，其特征在于所述宿主菌是含F质粒的大肠杆菌。
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