EA030297B1 - Способы выделения бактерий - Google Patents

Способы выделения бактерий Download PDF

Info

Publication number
EA030297B1
EA030297B1 EA201101096A EA201101096A EA030297B1 EA 030297 B1 EA030297 B1 EA 030297B1 EA 201101096 A EA201101096 A EA 201101096A EA 201101096 A EA201101096 A EA 201101096A EA 030297 B1 EA030297 B1 EA 030297B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
bacteria
sample
isolating
identifying
treatment
Prior art date
Application number
EA201101096A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201101096A1 (ru
Inventor
Жан-Поль Леонетти
Стефани Тексье
Original Assignee
Деинов
Сантр Насьональ Де Ля Решерш Сьентифик
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Деинов, Сантр Насьональ Де Ля Решерш Сьентифик filed Critical Деинов
Publication of EA201101096A1 publication Critical patent/EA201101096A1/ru
Publication of EA030297B1 publication Critical patent/EA030297B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/065—Microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07G—COMPOUNDS OF UNKNOWN CONSTITUTION
    • C07G11/00—Antibiotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

Изобретение касается композиций и способов идентификации новых бактерий и происходящих из них метаболитов. Более конкретно, в изобретении описан новый способ выделения бактерий, продуцирующих нужные метаболиты, из образцов окружающей среды. В частности, в изобретении изложен способ отбора редких бактерий, продуцирующих антибиотики. Изобретение может применяться из любых образцов и позволяет выделять бактерии, представляющие, к примеру, фармацевтический или агрохимический интерес.

Description

изобретение относится к композициям и способам идентификации новых бактерий и происходящих из них метаболитов. Более конкретно, в изобретении описан новый способ выделения бактерий, продуцирующих нужные метаболиты, из образцов окружающей среды. В частности, в изобретении изложен способ отбора новых бактерий, продуцирующих антибиотики. Изобретение может применяться для любых образцов и позволяет выделять бактерии, представляющие, к примеру, фармацевтический или агрохимический интерес.
Уровень техники
С незапамятных времен человечество искало и использовало микроорганизмы из окружающей среды для терапевтических целей, и большинство коммерческих антибиотиков до сих пор имеют естественное происхождение. За последние 10 лет в стремлении рационализировать и ускорить процессы открытия новых антибиотиков промышленность перешла от природных продуктов и стратегии, ориентированной на поиск природных молекул, к синтетическим молекулам и ориентированной на мишени стратегии.
После многих лет униформизации процесса поиска и разработки антибиотиков с беспрецедентно высокой интенсивностью расходования (запасов) необходимо вернуться к природным источникам. Действительно скринирование библиотек естественных продуктов обычно дает более высокий процент выхода антибиотиков по сравнению с химическими библиотеками и в результате обеспечивает более высокую вероятность получения лекарства. Первая причина, вероятно, заключается в экологической роли антибиотиков, которая подверглась оптимизации в процессе эволюции для защиты растений, животных и микроорганизмов от других живых организмов. Более того, природные продукты в основном так же липофильны, как и комбинаторные структуры, но они обладают непревзойденным структурным и пространственным разнообразием. Это помогает найти редкие гидрофильные случаи, которые могут быть оптимизированы для применения ίη νίνο.
Обычно предполагается, что от 20 до 30% бактерий, выделенных из природных источников, таких как почва или вода, являются продуцентами антибиотиков (Ветку, 2005). По очевидным причинам чаще всего выделяют наиболее приспособленные и распространенные бактерии. Вот почему многие антибиотики, продуцируемые ВасШик или Ркеикотопак, уже открыты, поэтому все труднее найти новые соединения, продуцируемые этими видами. Другие семейства менее распространенных бактерий, более приспособленных к выработке антибиотиков, вследствие большего размера генома могут быть легко выделены подходящими методами. Именно это происходит с актиномицетами, самыми лучшими продуцентами антибиотиков (Вегку, 2005). Они широко изучались фармацевтической промышленностью в период между 1950 и 1980 гг., и сейчас трудно установить штаммы, продуцирующие нераспространенные молекулы.
В последнее десятилетие предпринимались попытки выделения редких бактерий с тем, чтобы найти химические соединения, представляющие фармацевтический интерес. Миксобактерии, например, известны с 1940-х, но вследствие трудностей, встречающихся при их выделении, они были недостаточно представлены в коллекциях. Благодаря широкой кампании по собиранию коллекции, проведенной РеР скепЬаск Н. и коллегами, к настоящему времени изучено около 80 различных соединений и 450 структурных вариантов, вырабатываемых МухоЬас1ег1а (РшскепЬаск, 2001). Многие из этих соединений были новыми. Среди них есть противоопухолевое лекарство - эпотилон, которое сейчас проходит клинические испытания.
Обычно считается, однако, что микробиологи не способны культивировать большинство почвенных микроорганизмов (ЗскоепЬогп е! а1., 2005). Число культивируемых клеток в почве часто составляет лишь около 1% от общего числа присутствующих клеток. Большинство этих бактерий трудно обнаружить и выделить, используя стандартные методы выделения, либо потому, что они редки в окружающей среде, либо потому, что они менее приспособлены к условиям окружающей среды, чем другие бактерии типа Ркеикотопак крр. или ВасШик крр., которые их быстро перерастают. Были опубликованы некоторые методы, направленные на увеличение разнообразия изолятов. Так для улучшения культивируемости и облегчения выделения бактерий из разнообразной окружающей среды успешно использовали серийное разведение жидкой культуры (ЗскоепЬогп е! а1., 2005). А Уапд е! а1., 2008, также описали использование микроволновой обработки для выделения редких актиномицетов. АО 02/059351 касается способа обогащения микробной популяции из естественной среды с использованием, к примеру, воды из горячих источников.
Однако микроорганизмы окружающей среды все еще представляют богатый и неиспользованный источник новых соединений и активностей, и в данной области существует потребность в усовершенствованных или альтернативных способах идентификации нужных бактерий.
Сущность изобретения
В настоящей заявке представлен новый подход к идентификации и выделению бактерий из образцов окружающей среды. Более конкретно, в изобретении изложен эффективный и быстрый способ идентификации или выделения редко встречающихся бактерий из образцов окружающей среды с помощью обработки, повреждающей ДНК.
Целью настоящего изобретения, таким образом, является способ идентификации или выделения
- 1 030297
бактерий, вырабатывающих (вторичные) метаболиты, который включает подвергание образца, содержащего неизученные бактерии, обработке, разрушающей клетки и повреждающей ДНК, и идентификацию или выделение из подвергнутого такой обработке образца бактерий, вырабатывающих вторичные метаболиты. В предпочтительном воплощении обработка заключается в неоднократном облучении.
В этом отношении конкретным предметом данного изобретения является способ определения или выделения продуцирующих метаболит бактерий, который включает:
a) получение образца, содержащего неизученные бактерии;
b) подвергание образца повторяющейся обработке облучением;
c) идентификацию или выделение живых или растущих бактерий из данного обработанного образца; и
ά) отбор из стадии с) бактерий, продуцирующих метаболит.
В отдельном воплощении обработка включает последовательную УФ-обработку, например повторение по меньшей мере 2, предпочтительно 3 или более облучений через практически регулярные интервалы.
В отдельном воплощении обработка включает повторяющееся УФ-облучение.
Согласно другому отдельному воплощению изобретение касается способа идентификации или выделения бактерий, продуцирующих метаболит, который включает:
a) получение образца, содержащего неизученные бактерии;
b) добавление к образцу антибиотика из семейства блеомицинов;
c) идентификацию или выделение живых или растущих бактерий из данного обработанного образца; и
ά) отбор из стадии с) бактерий, продуцирующих метаболит.
Предпочтительным антибиотиком из семейства блеомицинов является блеоцин. Метаболит может представлять собой любой фармацевтический продукт, как-то антибиотики, бактериостатики, антиметаболические средства, химиотерапевтические соединения, противогрибковые средства, противовирусные соединения, соединения с активностью цитокинов или факторы роста клеток.
Другим предметом настоящего изобретения является способ идентификации или выделения бактерий, продуцирующих антибиотик или бактериостатик, который включает:
a) получение образца, содержащего неизученные бактерии;
b) подвергание образца повторяющейся обработке облучением, предпочтительно повторяющейся УФ-обработке;
c) идентификацию или выделение живых или растущих бактерий из данного обработанного образца; и
ά) воздействие идентифицированных или выделенных бактерий из стадии с) либо их экстракта на контрольный штамм бактерий и идентификацию или выделение бактерий, проявляющих антибиотическую или бактериостатическую активность.
В предпочтительном воплощении способы настоящего изобретения включают дополнительную стадию выделения или очистки метаболита, продуцируемого данными бактериями.
Кроме того, способы изобретения необязательно включают дополнительную стадию модификации генетической, биологической или химической - идентифицированных или выделенных бактерий либо их ДНК любым техническим способом, известным рег ке специалистам, причем данная модификация направлена на улучшение, например, жизнеспособности, роста или функции данных бактерий, например, для того, чтобы улучшить активность или продукцию антибиотика. Это включает слияние клеток, ускоренную эволюцию, технологию перетасовки ДНК, вставку эукариотической, прокариотической или синтетической нуклеиновой кислоты (например, ДНК) из другого штамма или любую генно-инженерную технологию. Такая стадия модификации может выполняться на выделенных бактериях или на любой более ранней стадии процесса, например, на образце из стадии а), к примеру.
Другим предметом изобретения являются бактерии дикого типа или модифицированные бактерии, полученные вышеизложенным способом, либо их экстракты.
Следующим предметом данного изобретения является способ получения метаболитов, в частности фармацевтических соединений, который включает: (ί) идентификацию или выделение бактерий, продуцирующих данный метаболит, с помощью вышеприведенного способа, и (ίί) продуцирование данного антибиотика.
Следующим предметом данного изобретения является способ идентификации, выделения или продуцирования фармацевтических соединений (как-то антибиотиков) с использованием штамма дикого типа или модифицированного штамма бактерий Эетососсик.
Следующим предметом данного изобретения является применение бактерий дикого типа или модифицированных бактерий Оешососсик для получения фармацевтических соединений (как-то антибиотиков).
Следующим предметом данного изобретения является антибиотик, полученный из бактерий дикого типа или модифицированных бактерий Оешососсик.
Следующим предметом данного изобретения является способ получения рекомбинантных клеток
- 2 030297
хозяина, который включает идентификацию или выделение бактерий согласно вышеприведенному способу и клонирование одного или нескольких генов (либо соответствующих синтетических или рекомбинантных нуклеиновых кислот) из данной бактерии в клетки другого хозяина, получая при этом рекомбинантные клетки хозяина.
Способы настоящего изобретения могут применяться с различными образцами, как-то образцами из окружающей среды, причем они успешно применялись для выделения новых бактерий, обладающих полезными фармацевтическими и/или агрохимическими свойствами.
Краткое описание чертежа
На чертеже изображена бактериальная пленка, полученная после: а) однократного воздействия УФ при 0,4 и 17 мДж/см2; и Ь) неоднократного воздействия УФ-обработки при 4 мДж/см2. Темные колонии Б. таЛоридиаик. Остальные бактерии относятся к почвенному сообществу.
Раскрытие сущности изобретения
В настоящей заявке описан новый способ идентификации или выделения бактерий из образцов. Более конкретно, в изобретении изложен эффективный и быстрый способ идентификации или выделения бактерий из образцов окружающей среды или выделения редких бактерий из образцов окружающей среды с помощью обработки, разрушающей клетки и повреждающей ДНК.
Устойчивость бактерий к обработке или облучению УФ широко изучалась для того, чтобы понять, как бактерии могут выжить в такой агрессивной среде (Макатоуа с1 а1., 2001). Кашеу с1 а1. (2005) показали, что Сеобегта1орЬу1ик крр. и Бетососсик крр. входят в число наиболее устойчивых к облучению бактерий, собранных из почв пустыни Сонора. Также были выделены и другие бактерии, а именно Бешососсик, НетшоЬас1ет, Ктеососсик, Косшта и МеЛу1оЬас1етшт.
В настоящем изобретении предлагается использовать разрушающую клетки и повреждающую ДНК обработку для выделения новых (недостаточно представленных) бактерий, вырабатывающих метаболиты. В настоящем изобретении показано, что именно такая обработка, которая в норме могла бы вызвать значительную гибель клеток, вне ожидания позволяет отобрать недостаточно представленные бактерии, обладающие замечательным свойством вырабатывать ценные метаболиты.
В изобретении впервые показано, что после разрушающей клетки и повреждающей ДНК обработки можно выделить большое число бактерий, способных вырабатывать ценные вторичные метаболиты.
Целью настоящего изобретения, таким образом, является способ идентификации или выделения вырабатывающих метаболиты бактерий, который включает подвергание образца, содержащего неизученные бактерии, обработке, разрушающей клетки и повреждающей ДНК, и идентификацию или выделение из подвергнутого такой обработке образца бактерий, вырабатывающих метаболит.
В отдельном воплощении способ включает:
a) получение образца, содержащего неизученные бактерии;
b) подвергание образца обработке, разрушающей клетки и повреждающей ДНК;
c) идентификацию или выделение живых или растущих бактерий из данного обработанного образца; и
ά) отбор из стадии с) бактерий, продуцирующих метаболит.
Способ может выполняться с различными образцами, содержащими неизученные бактерии, в частности с образцами, представляющими собой или происходящими из образцов окружающей среды. В контексте данного изобретения образцы окружающей среды включают любые образцы, содержащие неизученные (микро)организмы, в частности некультивированные (т.е. микроорганизмы, которые не подвергались целенаправленно культивированию и размножению в выделенном виде). Образцы могут быть получены из естественной среды либо из искусственной или специально созданной среды.
Как указано выше, образцы могут представлять собой любые образцы окружающей среды, как-то полученные или происходящие из почвы, воды, растительного экстракта, биологического материала, отложений, торфяников, промышленных стоков или отбросов, минеральных экстрактов, песка и др. Образцы могут быть собраны из различных регионов или условий, как-то тропических, вулканических регионов, лесов, ферм, промышленных зон и т.д. Образцы обычно содержат различные виды (неизученных, некультивированных) микроорганизмов, как-то наземных микроорганизмов, морских микроорганизмов, пресноводных микроорганизмов, симбиотических микроорганизмов и др. Микроорганизмы могут включать экстремофильные организмы, такие, к примеру, как термофилы. Как правило, образцы содержат различные виды таких (некультивированных) микроорганизмов, причем в различном количестве. Кроме того, образцы могут также содержать и известные и/или культивируемые микроорганизмы (например, прокариотические или эукариотические).
Следует иметь в виду, что настоящее изобретение не ограничивается каким-либо определенным типом образцов или микроорганизмов окружающей среды, а может выполняться на любых образцах, содержащих некультивированные микроорганизмы.
В предпочтительном воплощении образец представляет собой или происходит из почвы, воды, термальных источников, морской среды, ила, древесины, камня, мха, растительного экстракта, лишайника, биологического материала, отложений, биопленки, промышленных стоков, газа, песка, нефти, сточных вод либо испражнений животных или человека.
- 3 030297
Для настоящего изобретения образцы могут быть влажными, растворимыми, сухими, в виде суспензии, пасты и т.п. Более того, перед стадией способа Ь) образец может быть подвергнут обработке для улучшения процесса, например, для обогащения его микроорганизмами, например, посредством фильтрования, смыва, концентрирования, разбавления, замачивания, высушивания и т.д.
В отдельном воплощении образец имеет вид профильтрованной суспензии. В частности, образец может быть подвергнут стерильному фильтрованию и/или помещен в стерильную воду перед стадией обработки Ь).
Стадия способа Ь) включает подвергание образца (т.е. микроорганизмов, содержащихся в образце) обработке, разрушающей клетки и повреждающей ДНК.
Разрушающая клетки и повреждающая ДНК обработка означает такую обработку, которая вызывает существенную гибель клеток в образце в отличие от простой мутагенной обработки, которая вызывает модификации ДНК. В частности, разрушающая клетки и повреждающая ДНК обработка есть такая обработка, которая достаточна, чтобы вызвать гибель 90% или больше клеток в культуре бактерий Е. сой. Еще более предпочтительно разрушающая клетки и повреждающая ДНК обработка есть такая обработка, которая достаточна, чтобы уменьшить по меньшей мере на 2 1од титр бактерий в культуре Е. сой. Неожиданно изобретение показало, что такая обработка, которая в норме была бы летальной для большинства клеточных популяций, позволяет эффективно и быстро выделить новые микроорганизмы из различных типов образцов, причем эти микроорганизмы вырабатывают ценные (вторичные) метаболиты. Такой результат особенно неожидан, поскольку следовало бы ожидать, что подвергание микроорганизмов такой разрушающей клетки и повреждающей ДНК обработке воспрепятствует выделению живых микроорганизмов. Неожиданно оказалось, что изобретение позволяет выделить редкие микроорганизмы из образцов, в особенности микроорганизмы, обладающие способностью заново собирать свой геном либо противодействовать повреждению ДНК.
Таким образом, в изобретении впервые раскрыто применение разрушающей клетки и повреждающей ДНК обработки для отбора с большой эффективностью недостаточно представленных бактерий, вырабатывающих ценные (вторичные) метаболиты. Как показано в примерах, изобретение позволило выделить новые штаммы бактерий Оетососсиз 8р., Васй1и8 8р., Ме1йу1оЬас1егшт зр., Зр1йпдоЬас1спит зр., Се11и1о81тюгоЬшт зр., ТерШтоиаз зр., Тгиерега зр., РотрйутоЬас1ег зр., ЫоуозрйтдоЬшт зр., ЕхщиоЬасЮпит зр., ЫосагФа зр., Лт1йтоЬас1ег зр., Кйобососсиз зр., МюгоЬас1етшт зр., Ктеососсиз зр. и ^ййатз1а зр.
Повреждающая ДНК обработка может включать подвергание образца облучению и/или одному или нескольким генотоксическим реагентам. Обработка проводится в таких условиях и в течение такого периода времени, которые достаточны для того, чтобы вызвать существенную гибель клеток у микроорганизмов, находящихся в образце.
В предпочтительном воплощении повреждающая ДНК обработка включает подвергание образца одному или нескольким облучениям. Предпочтительная обработка включает подвергание образца (т.е. микроорганизмов в образце) неоднократной (например, последовательной) обработке облучением.
Облучение может быть выбрано из УФ-, гамма- и/или рентгеновского облучения, как поодиночке, так и в комбинации, наиболее предпочтительно УФ-облучения. Как правило, обработка облучением включает подвергание микроорганизмов одному или нескольким последовательным облучениям (например, от 1 до 5), которые могут иметь одинаковый или разный характер, предпочтительно одинаковый характер. Повторная обработка облучением обычно проводится с интервалом от 1 до 8 ч, предпочтительно от 3 до 5 ч, более предпочтительно около 4 ч.
Особенно предпочтительная обработка включает подвергание образца разрушающему клетки УФоблучению. В изобретении показано, что такая обработка позволяет с большой эффективностью выделить из образцов окружающей среды (например, почвы или воды) недостаточно представленные виды бактерий, вырабатывающих (вторичные) метаболиты (как-то антибиотики). Как правило, разрушающая клетки УФ-обработка составляет от 0,5 до 400 мДж/см2, более предпочтительно от 1 до 200 мДж/см2, обычно от 1 до 100 мДж/см2 в течение времени от 5 с до 5 мин. Предпочтительная УФ-обработка составляет 4 мДж/см2 в течение 30 с.
В отдельном воплощении разрушающая клетки и повреждающая ДНК обработка включает подвергание образца по меньшей мере 2, предпочтительно по меньшей мере 3 УФ-обработкам по 0,5-400 мДж/см2, предпочтительно по 4 мДж/см2 с интервалом от 1 до 8 ч, предпочтительно от 3 до 5 ч, более предпочтительно около 4 ч.
В альтернативном способе разрушающая клетки и повреждающая ДНК обработка включает контактирование образца с генотоксическим реагентом, как-то растворителем, митомицином, блеомициновым антибиотиком или Н2О2. Следует иметь в виду, что генотоксические реагенты могут применяться и в комбинации с облучением. В предпочтительном воплощении обработка на стадии Ь) включает добавление к образцу эффективного количества блеоцина, антибиотика из семейства блеомицина. Как показано в примерах, добавление блеоцина вызывает существенную гибель бактериальных клеток, но способствует росту редких, вырабатывающих метаболиты бактерий.
Во время фазы обработки образец предпочтительно помещают в подходящую культуральную среду
- 4 030297
типа ΡΟΥ (бакто-пептон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, глюкоза 20 г/л) или ЬВ (бакто-триптон 10 г/л, дрожжевой экстракт 2,5 г/л, ЫаС1 10 г/л). Следует иметь в виду, что специалистам известны и другие подходящие культуральные среды (ВисЬаиаи е! а1., 1974; Όίίεο, 1995) либо они могут быть приготовлены специалистами из таких известных сред.
Обработка на стадии Ь), как правило, проводится в твердой или полутвердой культуральной среде, как-то в присутствии геля (например, агара). Наиболее предпочтительной средой обработки является агаризованная среда типа мягкого агара. В предпочтительном воплощении для культивирования бактерий применяется агаровая среда ΤΟΥ. Однако можно использовать и другие твердые среды, содержащие источник углерода, источник азота и минеральные соли. Также можно использовать метод серийных разведений согласно 8сйоеиЬот е! а1., 2004.
На стадии с) идентифицируют или выделяют живые или растущие бактерии из обработанного образца. Живые или растущие бактерии можно идентифицировать разными способами, известными рег ке в этой области. В предпочтительном воплощении идентифицируют колонии, которые образуются в культуральной среде. Живые или растущие бактерии можно выделить и поместить в свежую среду для дальнейшего культивирования или размножения.
Как указано выше, способ данного изобретения предпочтительно включает стадию ά) отбора из идентифицированных или выделенных живых или растущих бактерий одной или нескольких бактерий, вырабатывающих определенный метаболит. В этом отношении нужно отметить, что стадии с) и ά) можно выполнять последовательно, в любом порядке или одновременно. Например, бактерии в образце можно поставить в такие условия, которые подходят для селекции требуемой активности на стадии Ь) или с) с тем, чтобы растущие или живые бактерии, идентифицированные или выделенные на стадии с), проявляли нужную активность. С другой стороны, бактерии, идентифицированные или выделенные на стадии с), можно поставить в такие условия, которые подходят для селекции требуемой активности только на стадии ά) с тем, чтобы растущие или живые бактерии были сначала идентифицированы или выделены на стадии с), а затем подвергнуты селекции на требуемую активность.
Метаболит может представлять собой любое соединение, представляющее фармацевтический и/или агрохимический интерес. В предпочтительном воплощении метаболит представляет собой фармацевтическое соединение (для медицинского или ветеринарного применения), предпочтительно выбранное из числа антибиотиков, бактериостатиков, антиметаболических средств, химиотерапевтических соединений, противопаразитарных средств, противогрибковых средств, противовирусных соединений, соединений с активностью цитокинов или факторов роста клеток.
Метаболит также может быть полезным, например, в косметике или сельском хозяйстве, как-то пигменты, инсектициды, пестициды, разлагающие химикаты соединения и т.п.
Отбор или идентификация бактерий, вырабатывающих выбранный метаболит, может проводиться методами, известными рег ке в этой области. В предпочтительном воплощении стадия ά) включает воздействие идентифицированных или выделенных бактерий из стадии с) либо их экстракта на одну или несколько индикаторных клеток и отбор бактерий, влияющих на жизнеспособность, рост, метаболизм, подвижность, экспрессию РНК, экспрессию белка, секрецию белка или продукцию вируса по меньшей мере у одной из данных индикаторных клеток.
В случае антибиотиков или бактериостатиков индикаторными клетками обычно являются контрольные бактериальные штаммы, а отбираются такие бактерии, которые ингибируют рост или уничтожают данные контрольные штаммы.
В случае же противовирусных соединений индикаторными клетками обычно являются продуцирующие вирус клетки, а отбираются такие бактерии, которые влияют на продукцию вируса или жизнеспособность зараженных вирусом клеток.
В этом отношении в предпочтительном воплощении способ изобретения дополнительно включает стадию выделения или очистки метаболита, вырабатываемого данными бактериями.
В предпочтительном воплощении выбранная активность представляет собой продукцию антибиотика или бактериостатическую активность. В настоящем изобретении показано, что продуцирующие антибиотики бактерии с большой эффективностью можно выделить из образцов окружающей среды, обработанных в соответствии с настоящим способом. В частности, как показано в примерах, из различных образцов окружающей среды, в том числе воды, почвы, испражнений животных, древесины и др. были выделены продуцирующие антибиотики бактерии из рода ВасШик, Ме!йу1оЬас!етшт, 8рЫидоЬас1етшт, СейШоытютоЬшт, Τер^ά^тοηак, ЫосаМ1а, Эетососсих Тгиерега, РотрЬугоЬас!ет, ЫоуокрЫидоЬшт, Ех1диоЬас!етшт, СйтотоЬас!етшт, Лт!йгоЬас!ег, ΡΗοάοсοссик. МюгоЬас!етшт, Кшеососсик и ХУППатЧа.
Отбор бактерий, продуцирующих антибиотики, может проводиться различными методами, известными рег ке в этой области (§шдй, 2008; 1аиккеи, 2002; Натай, 2005; ЗсйоеиЬот Ь. е! а1., 2005). В предпочтительном воплощении тестируемые бактерии (либо их экстракт) приводятся в контакт с одним или несколькими контрольными бактериальными штаммами, и измеряется способность тестируемых бактерий ингибировать рост или уничтожать контрольные штаммы в качестве показателя антибиотической активности. Примеры контрольных штаммов включают без ограничения Е. сой, 8!арйу1ососсик аигеик или Саиά^άа йорюайк (Ьопаи, 1996).
- 5 030297
В этом отношении изобретение касается способа идентификации или выделения бактерий, вырабатывающих антибиотики или бактериостатики, который включает:
a) получение образца, содержащего неизученные бактерии;
b) подвергание образца разрушающей клетки и повреждающей ДНК обработке, предпочтительно повторяющейся обработке облучением, например, УФ-обработке;
c) идентификацию или выделение живых или растущих бактерий из данного обработанного образца; и
ά) воздействие идентифицированных или выделенных бактерий из стадии с) либо их экстракта на контрольный штамм бактерий и идентификацию или выделение бактерий, проявляющих антибиотическую или бактериостатическую активность.
Способ может дополнительно включать стадию выделения или очистки антибиотика, продуцируемого данными бактериями.
Следующим предметом данного изобретения является способ идентификации или выделения бактерий, вырабатывающих антиметаболиты или химиотерапевтические соединения или противогрибковые средства или соединения с активностью цитокинов или факторы роста клеток, который включает:
a) получение образца, содержащего неизученные бактерии;
b) подвергание образца разрушающей клетки и повреждающей ДНК обработке, предпочтительно повторяющейся обработке облучением, например УФ-обработке;
c) идентификацию или выделение живых или растущих бактерий из данного обработанного образца; и
ά) воздействие идентифицированных или выделенных бактерий из стадии с) либо их экстракта на один или несколько контрольных типов эукариотических клеток и идентификацию таких бактерий, которые влияют на жизнеспособность, рост, метаболизм, подвижность, экспрессию РНК, экспрессию белка или секрецию белка у некоторых из этих типов эукариотических клеток.
Способ может дополнительно включать стадию выделения или очистки антиметаболита или химиотерапевтического соединения или противогрибкового средства или соединения с активностью цитокинов или фактора роста клеток, продуцируемого данными бактериями.
Следующим предметом данного изобретения является способ идентификации или выделения бактерий, вырабатывающих противовирусные соединения, который включает:
a) получение образца, содержащего неизученные бактерии;
b) подвергание образца разрушающей клетки и повреждающей ДНК обработке, предпочтительно повторяющейся обработке облучением, например УФ-обработке;
c) идентификацию или выделение живых или растущих бактерий из данного обработанного образца; и
ά) воздействие идентифицированных или выделенных бактерий из стадии с) либо их экстракта на один или несколько типов продуцирующих вирус клеток для отбора таких бактерий, которые влияют на продукцию вируса или жизнеспособность зараженных вирусом клеток.
Способ может дополнительно включать стадию выделения или очистки противовирусного средства, продуцируемого данными бактериями.
Способы настоящего изобретения также могут включать стадию определения рода/вида идентифицированных или выделенных бактерий. В этом отношении изобретение особенно подходит для идентификации или выделения бактерий Осиюсоссик. продуцирующих выбранный метаболит.
Соответственно в предпочтительном воплощении изобретение касается способа идентификации или выделения бактерий, проявляющих выбранную активность (например, вырабатывающих нужный метаболит), который включает:
a) получение образца, содержащего неизученные бактерии;
b) подвергание образца разрушающей клетки и повреждающей ДНК обработке, предпочтительно повторяющейся обработке облучением;
c) идентификацию или выделение живых или растущих бактерий Эсиюсоссик из данного обработанного образца; и
ά) отбор из стадии с) бактерий Пешососсик, проявляющих выбранную активность.
Бактерии можно охарактеризовать и классифицировать, например, согласно НйксЬ, 2004 и КатрГег, 2008. Физиологическая характеристика включает, к примеру, определение профилей жирных кислот, дыхательных хинонов, полярных липидов и полиаминов, определение метаболического профиля различных источников углерода и/или определение последовательностей гена 168 рРНК.
Кроме того, способы данного изобретения могут включать одну или несколько дополнительных стадий отбора бактерий с определенными свойствами. В частности, в предпочтительном воплощении способ дополнительно включает одну или несколько стадий отбора таких бактерий, которые жизнеспособны или растут при выбранных условиях культивирования, таких как среда, температура, рН, соленость, питательные вещества, насыщение кислородом или источник углерода. Для этого образец или бактерии можно поставить в соответствующие условия отбора на любой из стадий Ь), с) или ά) либо во время предшествующей или последующей стадии и проводить отбор по данному свойству на любой из
- 6 030297
этих стадий.
В отдельном аспекте настоящего изобретения бактерии культивируют при определенных температурных условиях для того, чтобы идентифицировать или выделить такие бактерии, которые жизнеспособны или могут расти в интервале температур от примерно 4 до 70°С. В частности, бактерии содержатся при выбранной температуре на стадии Ь), с) и/или б) и/или на дополнительной стадии е) с тем, чтобы идентифицировать или выделить бактерии, которые жизнеспособны или могут расти при данной температуре.
В другом отдельном аспекте настоящего изобретения бактерии культивируют при определенных условиях солености для того, чтобы идентифицировать или выделить такие бактерии, которые жизнеспособны или могут расти в условиях концентрации ЫаС1 или эквивалентной соли, которая может достигать около 5% вес./об. В частности, бактерии содержатся при выбранной солености на стадии Ь), с) и/или б) и/или на дополнительной стадии е) с тем, чтобы идентифицировать или выделить бактерии, которые жизнеспособны или могут расти при данной солености.
В следующем отдельном и предпочтительном воплощении настоящего изобретения бактерии культивируют при определенных условиях рН для того, чтобы идентифицировать или выделить такие бактерии, которые жизнеспособны или могут расти в интервале рН от 4 до 9,5, предпочтительно от 4 до 8. В частности, бактерии содержатся при выбранном рН на стадии Ь), с) и/или б) и/или на дополнительной стадии е) с тем, чтобы идентифицировать или выделить бактерии, которые жизнеспособны или могут расти при данном рН.
В следующем отдельном воплощении настоящего изобретения бактерии культивируют при определенных условиях насыщения кислородом для того, чтобы идентифицировать или выделить такие бактерии, которые жизнеспособны или могут расти в аэробных и/или анаэробных условиях. В частности, бактерии содержатся при выбранных условиях насыщения кислородом на стадии Ь), с) и/или б) и/или на дополнительной стадии е) с тем, чтобы идентифицировать или выделить бактерии, которые жизнеспособны или могут расти в данных условиях.
В следующем отдельном воплощении настоящего изобретения бактерии культивируют в определенной культуральной среде для того, чтобы идентифицировать или выделить такие бактерии, которые жизнеспособны или могут расти в присутствии выбранного источника углерода. В частности, бактерии содержатся в этой среде на стадии Ь), с) и/или б) и/или на дополнительной стадии е) с тем, чтобы идентифицировать или выделить бактерии, которые жизнеспособны или могут расти на данном источнике углерода.
Следует иметь в виду, что отбор по вышеприведенным характеристикам может проводиться по отдельности или в любой комбинации. Например, способ может применяться идентификации бактерий, которые жизнеспособны или могут расти при заданной температуре и солености либо при заданной температуре и рН либо при заданной температуре, рН и насыщении кислородом.
Кроме того, способы изобретения могут включать дополнительную стадию модификации, например, биологической, генетической или химической, идентифицированных или выделенных бактерий либо их ДНК любым способом, известным рег ке в этой области, причем данная модификация направлена на улучшение, например, жизнеспособности, роста или функций данных бактерий, например, для того, чтобы улучшить активность антибиотика. Такая стадия модификации может включать слияние клеток, ускоренную эволюцию, перетасовку ДНК, мутагенез, вставку эукариотической, прокариотической или синтетической нуклеиновой кислоты (например, ДНК) из другого штамма или любую генноинженерную технологию. Модификация также может включать стадию введения маркерного гена (например, устойчивости к канамицину) в бактерии.
Многие (поступающие на рынок) антибактериальные препараты являются полусинтетическими аналогами природных продуктов, и их получают при модификации исходных продуктов брожения. Именно так обстоит дело в отношении кетолидов, β-лактамовой группы антибиотиков. Так что для улучшения исходного попадания можно использовать полусинтез и даже манипулирование ферментов, участвующих в биосинтезе антибиотика (Уои ЫикккЬаит, 2006; Магкбеп. 1998).
Соответственно в отдельном воплощении изобретение касается способа получения бактерий, обладающих выбранной активностью, который включает выделение бактерий в соответствии с любым из вышеприведенных способов и модифицирование данных бактерий, например, путем генетической, биологической или химической обработки для улучшения данной активности.
Как показано в примерах, способ настоящего изобретения позволил эффективно и быстро выделить УФ-устойчивые бактерии, вырабатывающие вторичные метаболиты (например, антибиотики). Эти бактерии ранее были неизвестны и они могут расширить разнообразие и спектр активности антибиотиков (или других вторичных метаболитов) для терапевтических или иных промышленных целей.
Поэтому следующий аспект данного изобретения также касается бактерий, получаемых вышеизложенным способом, или их экстрактов. Экстракт может представлять собой любой препарат, полученный из клеточной культуры, как-то супернатант, лизат, клеточные мембраны или полученные из них обогащенные/очищенные препараты, предпочтительно содержащие вторичный метаболит.
Бактерии могут принадлежать к различным родам, таким, к примеру, как ВасШик, МеШу1оЬас1етшт,
- 7 030297
8рЫпдоЪас!егшт, Се11и1о81Ш1сгоЫит, ТерШтоиак, ЫосагФа, Петососсик, Тгиерега, РогрйугоЬас!ег, ΝοуокрЫпдоЫит, ЕхЦиоЪасЮпиш. СНгошо-ЪасЮпиш. Лг1НгоЪас1ег. Кйобососсик, МюгоЪасЮпит Кшеососсик или Аййатыа.
Изобретение также касается способа получения рекомбинантных клеток хозяина, который включает идентификацию или выделение или получение бактерий согласно любому из вышеприведенных способов и клонирование генов (или генных кластеров либо оперонов или соответствующих синтетических или рекомбинантных нуклеиновых кислот) из данной бактерии в клетки другого хозяина, получая при этом рекомбинантные клетки хозяина. Клетками хозяина могут быть прокариотические или эукариотические клетки, предпочтительно прокариотические клетки. Клонирование может осуществляться в соответствии с методами, известными рег ке в этой области, как-то с помощью клонирующих векторов (например, плазмид, фагов, бактериальных хромосом и др.). В предпочтительном воплощении из идентифицированных бактерий выделяют гены или кластеры генов, кодирующие весь биосинтетический путь или часть его (например, гены, кодирующие ферменты, задействованные в таких путях), клонируют в соответствующие вектора и вставляют в выбранные клетки хозяина, чтобы создать новые биосинтетические пути.
Изобретение также касается способа получения фармацевтических средств (типа антибиотиков), который включает идентификацию или выделение или получение бактерий в соответствии с любым из вышеприведенных способов, причем данные бактерии вырабатывают фармацевтическое средство и продукцию данного антибиотика. Продукция фармацевтического средства может включать культивирование бактерий (или их потомства или производных) в соответствующих условиях и сбор или очистку средства. Продукция средства может также включать и искусственный синтез (например, химический, рекомбинантный, энзиматический и др.).
Следующим предметом данного изобретения является способ идентификации, выделения или получения фармацевтических средств (типа антибиотиков) с помощью штамма бактерий Эешососсик дикого типа.
Следующим предметом данного изобретения является способ идентификации, выделения или получения фармацевтических средств (типа антибиотиков) с помощью модифицированного штамма бактерий Иешососсик.
Следующим предметом данного изобретения является применение бактерий Эешососсик для получения фармацевтических средств (типа антибиотиков).
Следующим предметом данного изобретения является антибиотик, полученный из бактерий Эейюсоссик.
Настоящее изобретение также может применяться для отбора бактерий и создания метагеномных библиотек. Как правило, из таких бактерий экстрагируют геномную ДНК, и большие фрагменты ДНК (непосредственно) клонируют в челночный вектор, получая метагеномную библиотеку, репрезентативную для данных бактерий. Эту метагеномную библиотеку можно перенести в другие бактерии хозяина, чтобы идентифицировать штаммы, вырабатывающие вторичные метаболиты. В качестве примера можно провести скрининг ферментов, отвечающих за продукцию поликетидов, согласно Ошо1йас, 2007.
Кроме того, изобретение также касается усовершенствованных промышленных способов применения микроорганизмов. Так изобретение предполагает включение одной или нескольких разрушающих клетки и повреждающих ДНК обработок в промышленные процессы для того, чтобы устранить возможные примесные бактерии. В самом деле, поскольку бактерии настоящего изобретения способны расти и выжить при таких разрушающих клетки обработках, то они могут использоваться, к примеру, в любых промышленных устройствах или установках для ферментации или культивирования, чтобы избежать загрязнения. В этом отношении отдельным предметом данного изобретения является способ применения бактерий, получаемых вышеописанным способом, при ферментации или непрерывном культивировании, причем этот способ включает стадию облучения бактерий до или после запуска ферментации или непрерывного культивирования, чтобы ограничить загрязнение другими бактериями или клетками. Следующим предметом данного изобретения является способ применения бактерий Оетососсик, получаемых вышеописанным способом, при ферментации или непрерывном культивировании, причем этот способ включает стадию облучения бактерий до или после запуска ферментации или непрерывного культивирования, чтобы ограничить загрязнение другими бактериями или клетками. Облучение может проводиться неоднократно, как правило, при описанных выше условиях.
Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения будут раскрыты в следующих примерах, которые нужно рассматривать как иллюстративные, а не ограничивающие. Все ссылки (патентные заявки, патенты, научные публикации), приведенные в данной заявке, включены в нее путем ссылки.
Примеры
Пример 1. Определение улучшенных условий для отбора продуцирующих метаболиты бактерий.
На предварительной стадии тестировали 5 штаммов на устойчивость к УФ. Этими штаммами были Е. сой, Эешососсик табюридпапк, Эетососсик табюбитапк, Эешососсик кр. и Эешососсик деоШеттайк.
Культуры 5 тестируемых штаммов в стационарной фазе последовательно разводили от 100 до 10-8. Все разведения наносили (5 мкл) на богатую агаровую среду ΤΟΥ (триптон 10 г/л, глюкоза 20 г/л и
- 8 030297
дрожжевой экстракт 5 г/л) и проводили различные УФ-обработки: 0, 4, 17, 42 и 167 мДж/см2 с помощью установки для сшивания ВюЬшк (УйЪеП-Ьоигша!).
В табл. 1 представлена плотность бактерий после различных УФ-обработок.
Таблица 1
Штамм 0 мДж/см2 4 мДж/см2 17 мДж/см2 42 мДж/см2 167 мДж/см2
Ζ). гасИориупстз (КОЕ/мл) 4Д0Е+09 Ι,ΟΟΕ+09 1,60Е+08 6Д0Е+05 Ο,ΟΟΕ+ΟΟ
И. гасИснЫгапз (КОЕ/мл) 2Д0Е+07 6Д0Е+06 2Д0Е+06 2Д0Е+03 Ο,ΟΟΕ+ΟΟ
Е. соИ (КОЕ/мл) ЗД0Е+07 2Д0Е+04 Ο,ΟΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΟΕ+ΟΟ
И. уеоЛегтаИз (КОЕ/мл) 1Д0Е+09 6.00Е+08 8ДОЕ+О5 Ο,ΟΟΕ+ΟΟ Ο,ΟΟΕ+ΟΟ
Ретососсиз зр. (КОЕ/мл) 8Д0Е+08 2,20Е+08 6Д0Е+06 4Д0Е+03 Ο,ΟΟΕ+ΟΟ
Как видно, обработка в 4 мДж/см2 уменьшает титр бактерий на 3 1од в культуре Е. ео1т Обработка в 17 мДж/см2 тоже выявляет различия между бактериями Е. сой и Ьетососсиз.
На второй стадии различной обработке облучением подвергали почвенную суспензию исходя из результатов в табл. 1. Почвенную суспензию готовили следующим образом: 5 г влажной почвы разводили в 20 мл дистиллированной воды. После вибромешалки и обработки ультразвуком (1 мин) отбирали почвенный супернатант и смешивали с 350 мкл культуры Ό. габюридиаиз в стационарной фазе роста. Одну порцию (50 мкл) наносили шпателем на агар ΤΟΥ, содержащий противогрибковое средство (циклогексимид, 100 мкл/мл), и проводили повторяющуюся последовательную обработку облучением: 1, 2 и 3 обработки. Соблюдали интервал в 4 ч между каждой УФ-обработкой.
На фиг. 1а представлены результаты, полученные после 1 обработки при 0, 4 и 17 мДж/см2. На фиг. 1Ъ представлены результаты, полученные после 1, 2 и 3 обработок при 4 мДж/см2.
Как видно, наилучшими из протестированных условий являются 3 обработки УФ-облучением по 4 мДж/см2. Такие условия обеспечивают наибольшее количество растущих бактерий Ьетососсиз из обработанного образца почвы. Значительное количество бактерий Ьетососсиз получено и после одной обработки образца УФ-облучением в 17 мДж/см2.
Пример 2. Выделение УФ-устойчивых бактерий из образцов воды.
Образцы воды концентрировали фильтрованием через нитроцеллюлозный фильтр на 0,22 мкм (ΜΪ1Нроге, Егаисе), а затем суспендировали в 10 мл стерильной воды. Затем профильтрованный раствор обрабатывали ультразвуком в течение примерно 60 с, чтобы ресуспендировать бактерии.
После обработки ультразвуком от 150 мкл до 2 мл суспензий наносили шпателем на стерилизованный автоклавированием (20 мин при 120°С) твердый агар с богатой культуральной средой ΡΟΥ, содержащей глюкозу (31§ша-Л1бпсй, Егаисе) 1 г/л, пептон (Е1ика, Егаисе) 10 г/л и дрожжевой экстракт (Е1ика, Егаисе) 5 г/л. Затем посеянные культуры подвергали 3 УФ-обработкам по 4 мДж/см2 с помощью установки для сшивания ВюЬшк ВЬХ-Е254 (УйЪег1-Еоигша1, Егаисе), которые проводили с интервалом в 4 ч. После инкубации при 30-50°С в течение 3-4 дней появлялись жизнеспособные колонии.
Примеры идентифицированных колоний приведены ниже в табл. 2.
Пример 3. Выделение УФ-устойчивых бактерий из образцов древесины и гравия.
Образцы древесины и гравия погружали в стерильную воду, а затем перемешивали на вибромешалке и обрабатывали ультразвуком в течение примерно 60 с.
После обработки ультразвуком от 150 мкл до 2 мл суспензий наносили шпателем на стерилизованный автоклавированием (20 мин при 120°С) твердый агар с богатой культуральной средой ΡΟΥ, содержащей глюкозу (31§ша-Л1бпсй, Егаисе) 1 г/л, пептон (Е1ика, Егаисе) 10 г/л и дрожжевой экстракт (Е1ика, Егаисе) 5 г/л. Затем посеянные культуры подвергали 3 УФ-обработкам по 4 мДж/см2 с помощью установки для сшивания ВюЬшк ВЬХ-Е254 (УйЪег1-Еоигша1, Егаисе), которые проводили с интервалом в 4 ч. После инкубации при 30-50°С в течение 3-4 дней появлялись жизнеспособные колонии.
Примеры идентифицированных колоний приведены ниже в табл. 2.
Пример 4. Выделение УФ-устойчивых бактерий из камней, мха, лишайника, ила, отложений, биопленки, почвы и испражнений животных.
Образцы мха, лишайника, ила, почвы и испражнений животных суспендировали в стерильной воде, а затем перемешивали на вибромешалке. После этого образцы обрабатывали ультразвуком в течение примерно 60 с.
После обработки ультразвуком от 150 мкл до 2 мл суспензий наносили шпателем на стерилизованный автоклавированием (20 мин при 120°С) твердый агар с богатой культуральной средой ΡΟΥ, содержащей глюкозу (31§ша-Л1бпсй, Егаисе) 1 г/л, пептон (Е1ика, Егаисе) 10 г/л и дрожжевой экстракт (Е1ика, Егаисе) 5 г/л. Затем посеянные культуры подвергали 3 УФ-обработкам по 4 мДж/см2 с помощью установки для сшивания ВюЬшк ВЬХ-Е254 (УйЪег1-Еоигша1, Егаисе), которые проводили с интервалом в 4 ч. После инкубации при 30-50°С в течение 3-4 дней появлялись жизнеспособные колонии.
Примеры идентифицированных колоний приведены ниже в табл. 2.
- 9 030297
Таблица 2
Биотоп Род Выделение при 1°С
Гравий ВасШиз зо°с
Камни Ме1ку1оЪас1еггит зо°с
Испражнения животных 8рЫп§оЪас1епит зо°с
Камни Се11и1о81т1сгоЫит зо°с
Вода ТериИтопаз 45°С
Вода Детососсиз 45°С
Гравий Детососсиз 30°С
Навоз, гравий, почва С1тготоЬас(егшт ЗО°С
Пример 5. Выделение бактерий из обработанных блеоцином образцов.
Образцы почвы, содержащие штамм ΌΚΉ40 Иетососсиз габюридпапз, суспендировали в условиях, аналогичных условиям из примера 2. Вместо облучения суспензии содержали в отсутствие (контроль) или в присутствии 50 или 100 мкг/мл блеоцина.
В отсутствие блеоцина не наблюдалось растущих розовых колоний (Иешососсиз), а лишь природная микрофлора. В присутствии 50 мкг/мл блеоцина природная микрофлора сильно уменьшалась, и появлялись розовые колонии. Такие же явления наблюдались при 100 мкг/мл блеоцина.
Пример 6. Идентификация продуцирующих антибиотики бактерий.
УФ-устойчивые штаммы, приведенные в табл. 2, тестировали на их способность ингибировать рост нескольких контрольных штаммов бактерий. Вкратце, проводили ферментацию в 10 мл среды ΡΟΥ, содержащей пептон 5 г/л, дрожжевой экстракт 2,5 г/л и глюкозу 0,5 г/л, при 30-50°С с аэрацией и встряхиванием. Через 3 дня проверяли и определяли продукцию антибиотиков исследуемыми штаммами методом диффузии в агаре по нескольким контрольным штаммам, культивируемым на среде кВ.
ТВ: бакто-триптон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, ЫаС1 10 г/л.
ΡΟΥ: пептон 5 г/л, дрожжевой экстракт 2,5 г/л, глюкоза 0,5 г/л.
Контрольные штаммы:
81арГу1ососсиз аигеиз С1Р 76.25,
ЕзсГепсЫа соН С1Р 76.24,
СапФТа 1гор1саГз С1Р 1275.
Результаты представлены ниже в табл. 3.
Таблица 3
+ - есть заметный антибиоз.
Результаты показывают, что было выделено несколько штаммов, проявляющих антибиотическую активность. Эти штаммы вырабатывают антибиотическую активность, направленную против 81арГу1ососсиз аигеиз, ЕзсГепсЫа соН и/или СапШба ИорюаНз. Вырабатывающие штаммы устойчивы к УФ и могут расти при повышенной температуре, тем самым иллюстрируя эффективность способа настоящего изобретения.
Пример 7. Методика скрининга на продукцию антибиотиков.
7.1. Материалы и методы.
Культуральные среды.
Готовили различные среды для тестирования на продукцию антибиотиков.
Раствор А состоит из 0,1 г МпС12-4Н2О, 0,1 г Ζηδϋ4·7Η2Ο, 0,1 г ТеС13 на 100 мл.
Среда 1 состоит из бакто-пептона из казеина 5 г/л, бакто-дрожжевого экстракта 3 г/л и доводится до рН 7,1.
Среда 2 состоит из целлобиозы 10 г/л, К2НРО4 1 г/л, М§ЗО4-Н2О 1 г/л, ЫаС1 1 г/л, (ΝΗ4)28Ο4 2 г/л, СаСО3 2 г/л и доводится до рН 7,2. Раствор А добавляется до 1 мл/л.
Среда 3 состоит из овсянки 20 г/л и раствора А до 1 мл/л.
Получение культур тестируемых штаммов.
Штаммы инокулировали в 5 мл жидкой среды ΡΟΥ. Предварительные культуры затем инкубировали при 30 или 45°С в течение 48 ч со встряхиванием при 150 об/мин.
В стеклянные пробирки на 15 мл инокулировали по 100 мкл предварительной культуры в 5 мл сред 1-3. Затем культуры инкубировали при 30 или 45°С в течение 48, 96, 168 и 336 ч со встряхиванием при 150 об/мин.
Получение культур штаммов-мишеней.
Штаммы-мишени: 81арГу1ососсиз аигеиз С1Р 76.25, ЕзсГепсЫа соН С1Р 76.24, Рзеибошопаз аеги§1поза С1Р 76.110, 81гер1ососсиз рпеишоша С1Р 104485 и СапШба ГорюаНз Ό8Μ 1346.
- 10 030297
Их культивировали в среде ЬВ при 37°С в течение 18 ч. Затем предварительные культуры штаммовмишеней инокулировали при 2 об.% в 10 мл мягкого агара (среда ЬВ с агаром при 7 г/л) в чашки Петри.
Оценка продукции антибиотиков.
После инкубации при 30 или 45°С в течение 48, 96, 168 и 336 ч отбирали 1 мл тест-культуры и центрифугировали при 13000 об/мин в течение 3 мин. Супернатант фильтровали через фильтр на 0,22 мкм. 10 мкл фильтрованного супернатанта культуры наносили на мягкий агар, содержащий штаммы-мишени. После инкубации при 37°С в течение 18ч были видны бляшки лизиса.
7.2. Результаты.
В табл. 4 представлены примеры различных полученных антибиотических профилей. Штамм М105Н Ктеососсиз вырабатывал антибиотики против грамположительных штаммов-мишеней и Е. сой С1Р 76.24. Штамм МС5-7Р Иешососсиз вырабатывал антибиотики против 8. аигеиз С1Р 76.25. Штамм МА370 М1сгоЪас1егшш вырабатывал антибиотики против С. 1гор1саЙ8 С1Р 1275, а штамм МА3-6В ^ййашз1а вырабатывал антибиотики против грамположительных штаммов-мишеней и Р. аегидшоза С1Р 76.110.
Таблица 4
Результаты тестов на продукцию антибиотиков
81арку1ососсиз аигеиз С1Р 76.25 81гер1ососсиз рпеитота С1Р 104485 Рзеис1отопаз аегиутоза С1Р 76.110 ЕзскеггсЫа соН С1Р 76.24 Οαηάϊάα {горгсаИз С1Р 1275
Ктеососсиз М10-5Н + + - + +
Оегпососсиз МС5-7Р + - - - -
ШсгоЪас1епит МАЗ-70 - - - - +
]¥ИИатз1а МАЗ6В + + + - -
+ - наблюдался антибиоз;
- - не наблюдался антибиоз.
Библиография
ВеМу I. В1оасНуе т1сгоЫа1 те1аЬоП1ез. 1 ΑηΐϊΡποί. (Токуо) 2005 1ап;58(1):1-26. ЕггаШт ΐη: 1 АпОЫоР (Токуо) 2005 Арг;58(4):С-1.
ВисЬапап К. апй СЬЬЬопз Ν. Вег§еу'з тапиа1 о Г с1е1егттаЬуе Ьас1епо1о§у (1974) 8Ш её.
И1РСО тапиак ИеЬус1га1ес1 СиЬиге МесЬа ап<1 Кеа§еп1з Гог М1сгоЫо1о§у (1995) Еёз ШРСО, 1НЬ есГ
ОтоШас А, 1агпп С, ОП1е1 В, К.оЬе Р, РиЦс Р, ТирЬПе К, ВеНгапО Н, Уо§е1 ТМ, Ретеге О, δΐιηοηεΐ Р, ИаНп К. РЬу1о§епеОс апа1уз1з о£ ро1укеОде зуШЬазе I Оотатз Ггот зоП терщепогтс ПЪгапез аИолуз зексОоп оГ ргогшзт§ с1опез. Αρρΐ Εηνΐτοη МхсгоЫок 2004 8ер;70(9):5522-7.
Натак1 Τ, Зигик М, Риски К., 1оДта Υ, КаДига Т, ТаЬисЫ А, Зеп К, 8ЫЬа1 Н. 1зо1а1юп оГ ηονεί Ъас1епа апс! асИпотусе1ез изтд зоП-ех1гас1 а§аг тесЬит. 1 Βϊοδοΐ Βϊοεη§. 2005 Мау;99(5):485-92.
НкзсЪ Р, ОаШко1¥зк1 СА, δϊεΠειΓ 1, Ре1зз1 К, Кгоррепз1есЬ К., ЗсНитапп Р, 31аскеЪгапсЬ Е, АпОегзоп К.. Детососсиз /пуепз зр. ηον,, Детососсиз зстсо1а зр. ηον., ап4 Детососсиз тагтопз зр. ηον., 1ο\ν 1етрега1иге апё с1гаияЬ1-1о1ега1т£, иУ-гез1з1ап1 Ьас1епа Ггот соп1теп!а1 Ап1агсИса. 3уз1 Арр1 М1сгоЫо1. 2004 Νον;27(6):636-45.
Ъпззеп Р, Уа1ез Ρ, Οπηΐοη В, Тау1ог Р, ап<1 8аЬ М. 1тргоуе4 сиКигаЬИйу оГ зоП Ъас1епа ап<3 13о1аЬоп ϊη риге сиЬиге оГ ηονεί тетЬегз оГ 1Ье άΐνΐδΐοηδ АсМоЪасАепа, АсйпоЪас1ег1а, Рго1еоЪас1ег1а, апс! УеггисотгсгоЫа. Αρρΐ ΕηνΪΓοη ΜΐοΓοΠΐοΙ. 2002 Мау;68(5):2391-2396.
КатрГег Р, Роскегз Ν, НиЬег В, Ра1зеп Е, Виззе Ш. Дегпососсиз сщиайИз зр. ηον., 1зо1а1ед Ггот у/а!ег. Ιηΐ I 8уз1 Ενοί ΜϊογοΠϊοΙ. 2008 Иес;58(Р1 12):2803-6.
Ьопап V (εά.) АпЕЫоНсз ΐη ЬаЬогакгу МесЬсте. УОШатз & \УПктз, ВаШтоге, МИ,
1996.
Макагоуа КЗ, Агаутс! Ь, \Уо1Г ΥΙ, Та1изоу КЬ, Μίηΐοη Κ\ν, Κοοηϊη ЕУ, Оа1у МР Оепоте оГ Ше ех1гете1у гасИа1юп-гез1з1ап| Ъас1егшт Детососсиз гасИоЛигапз νΐεννβά Ггот 1Ье регзресЕуе оГ сотрагаЬуе яепоппсз. МкгоЪк1 ΜοΙ Βΐοΐ Кеу. 2001 Маг;65(1):44-79.
Магзскп АР, УЫктзоп В, СогГез Д Иипз1ег №, 81аип1оп 1, ЬеасПау РР. ЕпДпееппя Ъгоас1ег зресШску ΐηίο ап апЬЪкЬс-ргоскстя ро1укейс!е зупГЬазе. 3с1епсе 1998 1ап 9; 279(5348):199-202.
Катеу Р, Кау К, РеггеЬа Μ, ОаГг В, ЬкЪге М, Ва§а1еу И, КазЬ В, Рагк М, Еаг1 А, ЗЪапк Ν, 8та11 А, Непк М, Вай1з1а 1, КатрГег Р, апд На СозГа Μ. Εχίεηδΐνε сЪуегзЬу оГ 1ошгт§-гасНайоп-ге5151ап1 Ьас1епа гесоуегей Ггот 8опогап ёезег! зоП ап<3 дезспрйоп оГ пте
- 11 030297
ηε\ν зреиез οί Πιε §епиз Оегпососсих оЫатеб Ргот а зт§1е зоб затр1е. Αρρΐ Εηνϊτοη ΜϊετοΗοΙ. 2005 δερ;71(9): 5225-5235.
КеюЬепЬасН Н. МухоЬасТепа, ргобисегз оГ ηονεί Ыоасбуо зиЬз1апсез. 1 1пб Μϊετοβϊοΐ Βϊοΐεείιηοΐ. 2001 8ερ;27(3): 149-56.
ЗсНоепЬогп Ь, Уа1ез Ρ, Οπηΐοη В, ΗιΐββηΗοΙΐζ Р, апб бапззеп Ρ. Πςιπά зепа1 ббибоп 1з тГепог ΐο зоНб теска Гог 1зо1айоп о£ сиНигез гергезеп1аНуе оГ ΐΗε рНу1ит-1еуе1 ОХегзПу оГ зоб Ъас1епа. Αρρΐ Εηνϊτοη ΜχετοΡίοΙ. 2004 1и1у;70(7):4363-4366.
δϊη§Η 8В, Ре1аег Р. ВюбАегзку, сЬеппса1 6ϊνετ5Ϊΐγ апб бги§ 6Ϊ3εονετγ. Ргод Огид К.ез. 2008;65:141, 143-74.
νοη ЫиззЪаит Р, Вгапбз Μ, Ηϊηζεη В, АМдапб 8, НаЫсЬ ϋ, АпбЪас1епа1 па!ига1 ргобис1з ϊη теб1ста1 сЬеппзйу--гхобиз ог геуХа1? Αη§ε\ν СНет Ιηί Еб Епд1. 2006 Аид 4;45(31):5072-129.
Уапд В, Хие ОН, СЬеп ΖΟ, ΖΗοιι Υζ), ΖΙίΒηβ ХЬ, Хи ΥΙ, Оио ΖΥ. Είϊεεΐ3 о Г гшсгоч/ауе бгабхабоп оп 1зо1абоп о Г зоб ас11потусе!ез. Υΐη§ Уопд 8Непд Та1 Хие Вао. 2008 Мау; 19(5):1091-8.

Claims (16)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ идентификации или выделения из образца бактерии, продуцирующей фармацевтическое соединение, которое представляет собой антибиотик, бактериостатик или противогрибковый агент, который включает:
    a) обеспечение образца, содержащего ^охарактеризованные бактерии;
    b) подвергание образца разрушающей клетки и повреждающей ДНК обработке, включающей повторяющееся облучение, выбранное из УФ-, гамма- и/или рентгеновского облучения, как отдельно, так и в комбинации, которая достаточна для снижения по меньшей мере в 2 1од бактериального титра в культуре Е. сой;
    c) идентификацию или выделение живых бактерий из указанного обработанного образца, которые образуют колонии или растут в культуральной среде; и
    б) приведение идентифицированных или выделенных бактерий стадии с) либо их экстракта в контакт с эталонным бактериальным штаммом или эукариотической клеткой, и идентификацию или выделение бактерий, которые ингибируют рост или убивают эталонный штамм или клетку.
  2. 2. Способ по п.1, в котором образец получают из окружающей среды, предпочтительно из почвы, воды, термальных источников, морской среды, ила, древесины, камня, мха, растительного экстракта, лишайника, торфяников, биопленки, промышленных стоков, газа, песка, нефти, сточных вод либо испражнений животных или человека.
  3. 3. Способ по п.1, в котором указанная обработка включает повторяющееся УФ-облучение(я).
  4. 4. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанная обработка повторяется с интервалом от 1 до 8 ч, предпочтительно от 3 до 5 ч, наиболее предпочтительно около 4 ч.
  5. 5. Способ по п.3, в котором образец подвергается по меньшей мере 2, предпочтительно по меньшей мере 3 УФ-обработкам с интенсивностью 0,5-400 мДж/см2, предпочтительно с интенсивностью 1-200 мДж/см2, более предпочтительно с интенсивностью 1-100 мДж/см2 каждая, которые проводятся с интервалом от 1 до 8 ч.
  6. 6. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором стадия Ь) выполняется на твердой культуральной среде.
  7. 7. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором на стадии с) идентифицируют или выделяют колонии.
  8. 8. Способ по любому из предыдущих пунктов, который включает дополнительную стадию выделения или очистки указанного фармацевтического соединения из культуры, содержащей указанную идентифицированную или выделенную бактерию.
  9. 9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где фармакологическое соединение представляет собой антибиотик или бактериостатическое соединение, и эталонный штамм является эталонным штаммом бактерий.
  10. 10. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадии Ь), с) и/или б) проводятся при температуре в диапазоне приблизительно 4-70°С.
  11. 11. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадии Ь), с) и/или б) проводятся при солености, соответствующей концентрации ЫаС1 или эквивалентных солей, вплоть до 5% мас./об.
  12. 12. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадии Ь), с) и/или б) проводятся при рН, составляющем от 4 до 8.
  13. 13. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадии Ь), с) и/или б) проводятся при условиях оксигенации, выбранных из аэробных или анаэробных условий.
  14. 14. Бактерии, получаемые способом по любому из пп.1-13.
  15. 15. Бактерии по п.14, которые принадлежат к роду ВасШиз, МеШу1оЬас4егшш, 8рйтдоЬас4егшш,
    - 12 030297
    Се11и1о51Ш1сгоЪшш, ТерШшоиаз. ЫоеагШа, 1)еп1ососснз. Тгиерега, РогрЬугоЬае1ег зр.. Νονοδρίιίιιμοΰίιιιη зр.. ЕхщиоЪаНепиш зр.. СИготоЪасГОпнт зр. ЛпИгоЪас1ег зр. РИоОососснз зр. М1сгоЪас1епнт зр. Ктеососсиз зр. или УППатз1а зр.
  16. 16. Способ получения фармацевтического соединения. выбранного из числа антибиотиков. бактериостатиков или противогрибковых агентов. который включает идентификацию или выделение продуцирующих фармацевтическое соединение бактерий в соответствии со способом по любому из пп.1-13. культивирование указанных бактерий и сбор и очистку указанного фармацевтического соединения из указанной культуры.
EA201101096A 2009-01-19 2010-01-18 Способы выделения бактерий EA030297B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14560609P 2009-01-19 2009-01-19
EP20090305041 EP2210935A1 (en) 2009-01-19 2009-01-19 Methods for isolating bacteria
PCT/EP2010/050513 WO2010081899A1 (en) 2009-01-19 2010-01-18 Methods for isolating bacteria

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201101096A1 EA201101096A1 (ru) 2011-12-30
EA030297B1 true EA030297B1 (ru) 2018-07-31

Family

ID=40578079

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201101096A EA030297B1 (ru) 2009-01-19 2010-01-18 Способы выделения бактерий

Country Status (10)

Country Link
US (2) US9005954B2 (ru)
EP (2) EP2210935A1 (ru)
JP (1) JP2012514991A (ru)
CN (1) CN102282248A (ru)
AU (1) AU2010205590B2 (ru)
BR (1) BRPI1006861B8 (ru)
CA (1) CA2749375C (ru)
EA (1) EA030297B1 (ru)
WO (1) WO2010081899A1 (ru)
ZA (1) ZA201105741B (ru)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2923491B1 (fr) 2007-11-14 2012-12-14 Deinove Sa Utilisation de bacteries pour la production de sources de bioenergie
EP2218773A1 (en) 2009-02-17 2010-08-18 Deinove Compositions and methods for degrading lignocellulosic biomass
EP2251414A1 (en) 2009-05-14 2010-11-17 Deinove High performance metabolic bacteria
EP2251415A1 (en) 2009-05-14 2010-11-17 Deinove Recombinant bacteria and the uses thereof for producing ethanol
EA033901B1 (ru) 2010-03-02 2019-12-06 Деинов Применение бактерии deinococcus и ее экстракта для получения метаболитов, лекарственных средств и белков, а также для разложения биомассы
WO2012058630A2 (en) * 2010-10-29 2012-05-03 The Regents Of The Unviversity Of California A method to generate novel bioactive molecules
CA2859718C (en) 2011-12-23 2021-03-30 Deinove Deinococcus bacterium and methods of use thereof for bioconversion of substrates or production of compounds
IN2014DN10762A (ru) 2012-07-02 2015-09-04 Deinove Sa
CN104663328B (zh) * 2015-03-20 2017-05-10 福建农林大学 一种利用稻秆粉加粘细菌抑制稻田杂草生长的方法
WO2016207403A1 (en) 2015-06-24 2016-12-29 Deinove Method of producing muconic acid
EP3112470A1 (en) * 2015-07-01 2017-01-04 Deinobiotics Method for producing antimicrobial agents
WO2018109194A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Deinove Methods of producing phytoene
WO2021022046A1 (en) * 2019-07-31 2021-02-04 Bioskryb, Inc. Genetic mutational analysis
CN114181852B (zh) * 2021-12-02 2023-03-10 四川农业大学 放线菌菌株scaut001及其应用
CN115011480B (zh) * 2022-01-12 2023-07-25 昆明理工大学 一种从动物组织中分离微生物的方法及其用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002059351A2 (en) * 2001-01-26 2002-08-01 Prokaria Ehf. Accessing microbial diversity by ecological methods
KR100836093B1 (ko) * 2007-02-01 2008-06-09 한국생명공학연구원 신규한 데이노코커스 종 ａ2 및 이를 이용하여아스타잔틴을 생산하는 방법

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3716453A (en) * 1969-06-25 1973-02-13 Ajinomoto Kk Method of producing l-histidine by fermentation
EP0263684A3 (en) * 1986-10-06 1989-01-25 The University of Calgary Lipid based radiation protection
US4975365A (en) * 1987-05-12 1990-12-04 The John Hopkins University Assay for measuring DNA cell repair potential
US5482846A (en) 1988-08-31 1996-01-09 University Of Florida Ethanol production in Gram-positive microbes
US5821088A (en) * 1990-05-11 1998-10-13 Siga Pharmaceuticals, Inc. Use of gram-positive bacteria to express recombinant proteins
US6384013B1 (en) * 1992-03-19 2002-05-07 Eli Lilly And Company Cyclic peptide antifungal agents and process for preparation thereof
JPH06319578A (ja) * 1993-03-18 1994-11-22 Takeda Chem Ind Ltd トレハロースの製造法
US5854271A (en) * 1994-05-02 1998-12-29 Cytos Pharmaceuticals, L.L.C. Effective method for the amelioration and prevention of tissue and cellular damage
WO1997010352A1 (en) 1995-09-14 1997-03-20 Lockheed Martin Energy Systems, Inc. Processing of cellulosic materials by cellulase producing bacteria
US6102690A (en) 1997-04-07 2000-08-15 Univ. Of Florida Research Foundation, Inc. Recombinant organisms capable of fermenting cellobiose
US6410305B1 (en) * 1997-08-04 2002-06-25 Biosun Systems Corporation Treatment of animal waste
US6183736B1 (en) * 1998-04-07 2001-02-06 Usda/Ars Southern Regional Research Center Small peptides with antipathogenic activity, treated plants and methods for treating same
KR20000062691A (ko) * 1999-03-01 2000-10-25 존슨 앤드 존슨 비젼 케어, 인코포레이티드 살균방법
AU7720800A (en) 1999-09-27 2001-04-30 Henry M. Jackson Foundation, The Engineered radiation resistant bioremediating bacteria
US7034140B2 (en) * 2001-04-24 2006-04-25 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes involved in isoprenoid compound production
CN1204398C (zh) * 2001-05-15 2005-06-01 松下电器产业株式会社 生物传感器
US6984523B2 (en) * 2001-08-02 2006-01-10 E.I. Du Pont De Nemours And Company Carotenoid ketolase gene
JP4111369B2 (ja) * 2001-08-14 2008-07-02 独立行政法人 日本原子力研究開発機構 Ｄｎａ修復促進活性を有するタンパク質
US7063955B2 (en) * 2001-11-20 2006-06-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for production of asymmetric carotenoids
CA2473716A1 (en) * 2002-01-18 2003-07-31 Cargill, Incorporated Alanine 2,3- aminomutase
US7105634B2 (en) * 2002-02-11 2006-09-12 E. I. Du Pont De Nemours And Company Genetic constructs encoding carotenoid biosynthetic enzymes
US7160715B2 (en) * 2002-04-30 2007-01-09 Westinghouse Savannah River Company Llc Radiation-resistant microorganism
US20040219629A1 (en) * 2002-12-19 2004-11-04 Qiong Cheng Increasing carotenoid production in bacteria via chromosomal integration
US7232665B2 (en) * 2002-12-19 2007-06-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Mutations affecting carotenoid production
KR100570520B1 (ko) * 2003-06-16 2006-04-13 주식회사 참 존 피부보호용 디이노코커스 라디오두란스 세포막 추출물 및이를 함유하는 피부외용제 조성물
CA2550376A1 (en) * 2003-12-19 2005-07-14 E.I. Du Pont De Nemours And Company Novel carotenoids ketolases
US7759057B2 (en) * 2004-02-04 2010-07-20 Ut-Battelle, Llc Method for analyzing microbial communities
CN1281761C (zh) * 2004-03-16 2006-10-25 浙江大学 利用耐辐射球菌生产天然类胡萝卜素的生产工艺
US7074604B1 (en) * 2004-12-29 2006-07-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Bioproduction of astaxanthin using mutant carotenoid ketolase and carotenoid hydroxylase genes
TW200630380A (en) * 2005-02-18 2006-09-01 Nat Univ Chung Hsing N-acylamino acid racemase of Deinococcus radiodurans and producing method thereof, and L-amino acid production method therefrom
US20070031951A1 (en) * 2005-05-19 2007-02-08 Huang Lixuan L Method for the production of resveratrol in a recombinant bacterial host cell
GB0511602D0 (en) 2005-06-07 2005-07-13 Tmo Biotec Ltd Microorganisms
US7217537B2 (en) * 2005-09-15 2007-05-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method to increase carotenoid production in a microbial host cell by down-regulating glycogen synthase
ATE513053T1 (de) * 2006-05-10 2011-07-15 Deinove Sa Verfahren zur chromosomenmanipulation unter verwendung eines neuen dna-reparatursystems
US20090093015A1 (en) * 2007-10-09 2009-04-09 Kemin Foods, L.C. Beta-cryptoxanthin production using a novel lycopene beta-monocyclase gene
FR2923491B1 (fr) * 2007-11-14 2012-12-14 Deinove Sa Utilisation de bacteries pour la production de sources de bioenergie
US20110098267A1 (en) * 2008-02-07 2011-04-28 Synta Pharmaceuticals Corporation Topical formulations for the treatment of psoriasis
WO2009151728A2 (en) * 2008-03-27 2009-12-17 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of adipic acid and other compounds
EP2218773A1 (en) 2009-02-17 2010-08-18 Deinove Compositions and methods for degrading lignocellulosic biomass
EP2251414A1 (en) 2009-05-14 2010-11-17 Deinove High performance metabolic bacteria
EP2251415A1 (en) 2009-05-14 2010-11-17 Deinove Recombinant bacteria and the uses thereof for producing ethanol
EA033901B1 (ru) 2010-03-02 2019-12-06 Деинов Применение бактерии deinococcus и ее экстракта для получения метаболитов, лекарственных средств и белков, а также для разложения биомассы
AU2011355209B2 (en) * 2010-12-20 2015-09-17 Lek Pharmaceuticals D.D. Enzymatic synthesis of active pharmaceutical ingredient and intermediates thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002059351A2 (en) * 2001-01-26 2002-08-01 Prokaria Ehf. Accessing microbial diversity by ecological methods
KR100836093B1 (ko) * 2007-02-01 2008-06-09 한국생명공학연구원 신규한 데이노코커스 종 ａ2 및 이를 이용하여아스타잔틴을 생산하는 방법

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BERDY JANOS: "Bioactive microbial metabolites - A personal view", THE JOURNAL OF ANTIBIOTICS, NATURE PUBLISHING GROUP, GB, vol. 58, no. 1, 1 January 2005 (2005-01-01), GB, pages 1 - 26, XP002471302, ISSN: 0021-8820 *
BIBB, M.J.: "Regulation of secondary metabolism in streptomycetes", CURRENT OPINION IN MICROBIOLOGY, CURRENT BIOLOGY LTD, GB, vol. 8, no. 2, 1 April 2005 (2005-04-01), GB, pages 208 - 215, XP025370548, ISSN: 1369-5274 *
CHUNG, B.Y. ; LEE, Y.B. ; BAEK, M.H. ; KIM, J.H. ; WI, S.G. ; KIM, J.S.: "Effects of low-dose gamma-irradiation on production of shikonin derivatives in callus cultures of Lithospermum erythrorhizon S.", RADIATION PHYSICS AND CHEMISTRY, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 75, no. 9, 1 September 2006 (2006-09-01), AMSTERDAM, NL, pages 1018 - 1023, XP025103596, ISSN: 0969-806X, DOI: 10.1016/j.radphyschem.2005.11.001 *
DIB JULIAN ET AL. "Occurrence of resistance to antibiotics, UV-B, and arsenic in bacteria isolated from extreme environments in high-altitude (Above 4400 m) andean wetlands" CURRENT MICROBIOLOGY, vol. 56, no. 5, May 2008 (2008-05), pages 510-517, XP019587492 ISSN: 0343-8651 the whole document *
GHOSAL, D. OMELCHENKO, M.V. GAIDAMAKOVA, E.K. MATROSOVA, V.Y. VASILENKO, A. VENKATESWARAN, A. ZHAI, M. KOSTANDARITHE: "How radiation kills cells: Survival of Deinococcus radiodurans and Shewanella oneidensis under oxidative stress", FEMS MICROBIOLOGY REVIEWS, ELSEVIER, AMSTERDAM; NL, vol. 29, no. 2, 1 April 2005 (2005-04-01), AMSTERDAM; NL, pages 361 - 375, XP004819769, ISSN: 0168-6445, DOI: 10.1016/j.femsre.2004.12.007 *
KELLER MARTIN; ZENGLER KARSTEN: "Tapping into microbial diversity.", NATURE REVIEWS. MICROBIOLOGY, NATURE PUBLISHING GROUP, GB, vol. 2, no. 2, 1 February 2004 (2004-02-01), GB, pages 141 - 150, XP009116441, ISSN: 1740-1526, DOI: 10.1038/nrmicro819 *
MAKAROVA KIRA S ET AL: "Genome of the extremely radiation-resistant bacterium Deinococcus radiodurans viewed from the perspective of comparative genomics", MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 65, no. 1, 1 March 2001 (2001-03-01), US, pages 44 - 79, XP002491113, ISSN: 1092-2172, DOI: 10.1128/MMBR.65.1.44-79.2001 *
RAINEY FRED A; RAY KEREN; FERREIRA MARGARIDA; GATZ BRIDGET Z; NOBRE M FERNANDA; BAGALEY DANIELLE; RASH BRIAN A; PARK MIE-JUNG; EAR: "Extensive diversity of ionizing-radiation-resistant bacteria recovered from Sonoran Desert soil and description of nine new species of the genus Deinococcus obtained from a single soil sample", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 71, no. 9, 1 September 2005 (2005-09-01), US, pages 5225 - 5235, XP009116344, ISSN: 0099-2240, DOI: 10.1128/AEM.71.9.5225-5235.2005 *
REICHENBACH H: "MYXOBACTERIA, PRODUCERS OF NOVEL BIOACTIVE SUBSTANCES", JOURNAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, BASINGSTOKE, GB, vol. 27, no. 03, 1 January 2001 (2001-01-01), GB, pages 149 - 156, XP009027664, ISSN: 1367-5435, DOI: 10.1038/sj.jim.7000025 *
SINGH SHEO B; PELAEZ FERNANDO: "Biodiversity, chemical diversity and drug discovery.", PROGRESS IN DRUG RESEARCH - FORTSCHRITTE DERARZNEIMITTELFORSCHUNG - PROGRES DES RECHERCHES PHARMACEUTIQUES., BIRKHAEUSER VERLAG, BASEL., CH, vol. 65, 1 January 2008 (2008-01-01), CH, pages 141, 143 - 174, XP009116403, ISSN: 0071-786X *
SINHA, R.P. HADER, D.P.: "UV-protectants in cyanobacteria", PLANT SCIENCE, ELSEVIER IRELAND LTD, IE, vol. 174, no. 3, 23 December 2007 (2007-12-23), IE, pages 278 - 289, XP022489460, ISSN: 0168-9452 *
YANG BIN; XUE QUAN-HONG; CHEN ZHAN-QUAN; ZHOU YONG-QIANG; ZHANG XIAO-LU; XU YING-JUN; GUO ZHI-YING: "Effects of microwave irradiation on isolation of soil actinomycetes", YINGYONG SHENGTAI XUEBAO - JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, GAI KAN BIAN-WEI-HUI, SHENYANG, CN, vol. 19, no. 5, 1 May 2008 (2008-05-01), CN, pages 1091 - 1098, XP001539336, ISSN: 1001-9332 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2010205590B2 (en) 2015-09-03
BRPI1006861B1 (pt) 2020-10-27
US9005954B2 (en) 2015-04-14
JP2012514991A (ja) 2012-07-05
CA2749375C (en) 2021-04-13
EP2379701B1 (en) 2018-05-23
EP2210935A1 (en) 2010-07-28
CN102282248A (zh) 2011-12-14
US20110294979A1 (en) 2011-12-01
US20140017724A1 (en) 2014-01-16
AU2010205590A1 (en) 2011-08-11
WO2010081899A1 (en) 2010-07-22
US9279134B2 (en) 2016-03-08
EP2379701A1 (en) 2011-10-26
BRPI1006861A2 (pt) 2017-06-13
BRPI1006861B8 (pt) 2021-05-25
CA2749375A1 (en) 2010-07-22
EA201101096A1 (ru) 2011-12-30
ZA201105741B (en) 2012-04-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA030297B1 (ru) Способы выделения бактерий
US20180273437A1 (en) Methods and compositions for improving plant traits
Weinbauer Ecology of prokaryotic viruses
US20060240506A1 (en) Method for isolating and culturing unculturable microorganisms
JP2012514991A5 (ru)
CN109161480B (zh) 拟茎点霉的原生质体制备方法及基因敲除方法
Kakar et al. A novel rhizobacterium Bk7 for biological control of brown sheath rot of rice caused by Pseudomonas fuscovaginae and its mode of action
CN113583973B (zh) 一株高裂解性肺炎克雷伯菌噬菌体rdp-kp-20007及其应用
CN111607607B (zh) 一种提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成的方法
JP6605637B2 (ja) 寄生性、病原性又は外部寄性生物系の核酸を含む、前記系の増殖を阻害及び／又は制御するための組成物
CN105624181B (zh) 一种高通量鉴定产生1-脱氧野尻霉素菌株的方法
Wernet et al. Establishment of Arthrobotrys flagrans as biocontrol agent against the root pathogenic nematode Xiphinema index
Yamaichi et al. Transposon insertion site sequencing for synthetic lethal screening
Hoikkala et al. Cooperation between CRISPR-Cas types enables adaptation in an RNA-targeting system
Adeoti et al. The Molecular Characterization of Rhizobacteria Isolates from Saki, Nigeria
CN110214181A (zh) 新型副溶血弧菌噬菌体vib-pap-4及其用于抑制副溶血弧菌细菌增殖的用途
Kumar et al. Isolation, Screening and Identification of Potential Thermo Stable Bacterial Enzyme Producers in Sangameshwar, Tural Hot Spring.
Sharma et al. Microbiome Engineering and Biotechnology: The Real Finenesses of a Robust Rhizosphere
Gomma et al. Development of stable marker-free nuclear transformation strategy in the green microalga Chlorella vulgaris
US20220049282A1 (en) Methods for Discovery of Antimicrobial Compounds
Keren et al. Root-secreted nucleosides: signaling chemoattractants of rhizosphere bacteria
Ganesan et al. Transposon-insertion sequencing as a tool to elucidate bacterial colonization factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa beetles
Shekhar Nautiyal et al. Screening of plant growth-promoting rhizobacteria
Cheng et al. Genomic and biological control of Sclerotinia sclerotiorum using an extracellular extract from Bacillus velezensis 20507
Castillo Villamizar et al. Functional Metagenomics Approach for the Discovery of Novel Genes Encoding Phosphatase Activity

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM