KR100570520B1

KR100570520B1 - 피부보호용 디이노코커스 라디오두란스 세포막 추출물 및이를 함유하는 피부외용제 조성물

Info

Publication number: KR100570520B1
Application number: KR1020030038640A
Authority: KR
Inventors: 정호권; 김광년; 강병찬; 오철; 서원상
Original assignee: 주식회사 참 존
Priority date: 2003-06-16
Filing date: 2003-06-16
Publication date: 2006-04-13
Also published as: KR20040107942A

Abstract

본 발명은 그람양성 세균인 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)의 세포표면에 존재하는 소수성물질의 추출물 및 이를 이용한 피부보호용 피부외용제 조성물에 관한 것으로서,

본 발명에 따르면 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)의 균체를 고온의 50~85% 에탄올 및 고주파초음파기를 이용하여 추출하여 얻어지는 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans) 세포막 추출물 및 이를 함유하는 피부보호용 피부외용제 조성물이 제공되는바,

세포막 추출물 및 이를 함유하는 조성물은 자외선에 대한 피부방어 및 자외선에 의한 손상회복, 지질과산화방지 및 미백효과, 항알러지 효과를 지니는 유용한 발명이다.

디이노코커스 라디오두란스, 항산화제, 지질과산화, 히스타민

Description

피부보호용 디이노코커스 라디오두란스 세포막 추출물 및 이를 함유하는 피부외용제 조성물{EXTRACT OF CELL MEMBRANE OF Deinococcus Radiodurans FOR SKIN PROTECTION AND COMPOSITION CONTAINING THE SAME}

도 1은 배양조건에서 EMP경로 및 PPP경로 각각의 당대사 과정을 거쳐 생육한 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus Radiodurans) 세포막 추출물의 TLC 분석결과를 나타낸 것이며,

도 2는 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus Radiodurans) 세포막 추출물의 항산화력을 측정하고자 지질과산화 억제력을 시험한 결과를 나타내며,

도 3a 및 3b는 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus Radiodurans) 세포막 추출물의 항산화력을 기반으로하여 멜라노마 셀에서의 멜라닌 생성억제력을 특정하여 미백효과를 시험한 결과를 나타내며,

도 4는 대장균(ATCC 14169) 배양시 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus Radiodurans) 세포막 추출물을 첨가하여 약 36시간 배양 후 세포를 회수하여 자외선(UV-B, 306nm)조사 후의 미생물의 생존력을 측정한 결과를 나타내며,

도 5는 각질형성세포(Human keratinocyte)인 A431 셀을 배양시에 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus Radiodurans) 세포막 추출물을 첨가하여 약 48시간 2회 계대배양 후 세포를 회수하여 대조구와 같이 자외선(UV-B, 306nm)을 조사하고 A431세포의 생존력을 측정한 결과를 나타내며, 및

도 6은 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus Radiodurans) 세포막 추출물을 처리한 비만세포에 알러젠(allergen)을 접촉시킨 후에도 알러지 반응 첫 단계인 칼슘레벨의 상승이 일어나지 않음을 보여, 히스타민이 생성 방출되지 못하는 것을 확인할 수 있는 실험결과 도면이다.

본 발명은 피부보호용 피부외용제 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 그람양성 세균인 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)의 세포막에 존재하는 소수성물질의 추출물 및 이를 함유하여 알러젠 혹은 자외선으로부터 피부세포를 보호하는 피부외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)는 건조한(desiccation) 조건, 또한 자외선 및 이온화 광선(ionizing radiation)의 조건에서도 생존할 수 있는 거의 유일한 미생물로서 그람양성 세균이고, 포자를 형성하지 않는다. Tim Lottman(www.bacteriamuseum.org/species/Dradiodurans.shtml) 등에 의하면 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)가 이러한 조건에서 생육이 가능한 것은 세포막의 카로테노이드(carotenoid) 및 특이 소수성물질들의 원인과 함께 균주자체의 유전자 재생 시스템(DNA repair system)이 타 생물의 세포보다 뛰어난 것에 기인한다고 보고하였다. 그러나 디이노코커스(Deinococcus) 속의 미생물에 관한 대부분의 연구는 유전자의 재생 시스템에 맞추어져 있으며, M.A. Carbonneau(Arch. Biochem and Biophy., Vol. 275, No. 1, pp.244-251, 1989) 등에 의한 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)의 카로테노이드(carotenoids)에 관한 연구가 있었으나 그 수는 매우 적다.

한편, 2000년 Y.M.Zhang(Appl. and Environ. Microb., Jan. 2000, p. 105-112) 등의 보고에 의하면 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)의 대사경로인 펜토우즈 포스페이트 경로(Pentose Phosphate pathway, 이하 PPP경로)를 Mn의 첨가로 인하여 엠브덴-메이어호프-파르나스 경로(Embden-Meyerhof-Parnas pathway, 이하 EMP경로)로 유도한 결과 자외선에 의한 방어력이 급격히 감소함을 확인하였다. Y.M.Zhang 등은 이러한 결과를 EMP 로 인해 유전자 재생 시스템(DNA repair system)발달의 저해가 발생되었다고 결론을 맺었으나, EMP 혹은 PPP 로 인해 생성되는 세포막의 성분이 변화가 나타나는 것으로 유추해 볼 때 그러한 자외선 방어력의 감소는 세포막의 소수성물질 생성의 양적감소와 관련되어 있다는 것을 알 수 있다.

이에 본 발명자들은 상기의 사실에 주목하고 연구를 거듭한 결과, EMP 보다 PPP 에서 지질의 생합성에 필요한 NADPH를 얻기 용이하며, 실제로 TLC분석 등을 통하여 확인하였을 때 소수성물질의 비율 및 조성에서의 변화를 인정할 수 있었다. 그리고 Mn을 첨가하여 배양된 미생물세포 추출물과 Mn을 첨가하지 않고 배양된 미생물세포 추출물을 각각 대장균 배양시 첨가한 후 지질과산화억제력 및 자외선 방 어능을 확인해본 결과, 다소의 차이를 확인할 수 있었다. 따라서 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)의 세포막 소수성 물질은 유전자 재생시스템과 함께 세균세포를 자외선 및 이온화 광선 등으로부터 보호하는 역할을 하며, 이러한 물질들은 인간의 세포에 있어서 뛰어난 자외선 방어능력을 갖도록 해 줄 수 있을 것으로 판단하고, 디이노코커스 라디오두란스 세포막의 소수성 물질의 추출물이 피부의 자외선방어 및 재생, 지질과산화억제 및 미백효과부여, 알러젠과 접촉된 비만세포가 히스타민을 방출시키는 과정을 막음으로써 효과적인 항알러지 효과를 나타냄을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 피부보호용의 디이노코커스 라디오두란스 세포막의 소수성물질의 추출물 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 추출물을 유효성분으로 함유하며 피부에의 자외선 방어 및 재생에 효과가 있는 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 추출물을 유효성분으로 함유하며 지질과산화방지 및 미백효과를 가지는 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 추출물을 유효성분으로 함유하며 항알러지효과를 가지는 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 상기한 목적 및 다른 목적들은 하기 발명의 구성으로부터 당업자들에게 명백해질 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위해서, 본 발명에 따른 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)의 세포막 추출물은, 디이노코커스 라디오두란스( Deinococcus radiodurans)의 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하고, 얻어진 균체를 유기용매, 바람직하게는 고온의 50~85% 에탄올 및 고주파초음파기를 이용하여 추출하여 얻어지는 것임을 특징으로 한다.

또한 본 발명에 따른 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)의 세포막 추출물의 제조방법은 그람양성 세균 디이노코커스 라디오두란스( Deinococcus radiodurans)의 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하고, 회수된 균체를 추출용매로서 에탄올이나, 또는 클로로포름과 메탄올을 2:1로 혼합한 용매를 사용하며 가열초음파처리를 함으로써 유효성분을 추출하는 방법인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명에 따른 피부외용제 조성물은 건조한 조건 및 자외선의 조사 하에서도 생육이 가능한 미생물인 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)의 세포막 추출물을 전체 조성물의 중량에 대하여 0.01∼10.0중량% 함유하는 것을, 더욱 바람직하게는 0.1∼5.0중량%함유하는 것을 특징으로 한다. 그 함유량이 0.01중량% 보다 작은 경우에는 효능이 극미하고, 그 함유량이 10.0중량% 보다 큰 경우에는 효능면에서 10.0%이하의 농도와 차이가 없다.

본 발명의 피부보호효과를 가지는 피부외용제 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤 또는 점착타입의 제형을 갖는 화장료 조성물일 수 있으며, 또한, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제의 제형을 갖는 의약제제일 수 있다. 또한 각 제형의 외용제 조성물에 있어서, 상기한 추출물이외의 다른 성분들은 기타 외용제의 제형 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.

이하 실시예, 시험예등을 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 하나, 이러한 실시예 등은 본 발명을 제한하고자하는 것은 아니다.

실시예 1. 디이노코커스 라디오두란스 세포막 추출물의 제조

세균균체의 회수

본 발명에 있어서 사용된 균주 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)는 트립톤(tryptone) 0.5%, 효모엑스(yeast extract) 0.3%, 글루코스 0.1%, 메티오닌(methionine) 0.1%(TGY medium)의 배지조성으로 30℃에서, 대수증식기 후반까지 약 60시간동안 120rpm으로 진탕배양하였다. 또한 Mn의 첨가로 인한 당대사 EMP 경로를 유도하기 위해서 MnCl₂를 0.1mM 농도로 첨가하여 배양함으로 PPP 경로를 억제하고 세포분열을 유도한 후, 이하의 과정을 Mn을 첨가하지 않고 배양한 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)와 동일하게 추출과정을 진행하였다.

배양액으로부터 세포막 추출물을 얻기 위하여 배양액을 7,500rpm으로 45분간 원심분리하고 균체를 회수하여 증류수로 분산시키고 상기의 조건과 동일하게 원심분리 과정을 2회 반복함으로써 세균 균체 이외의 물질로부터 세균 균체를 세척하였 다.

추출

(1) 추출용매로서 클로로포름과 에탄올을 사용

얻어진 디이노코커스(Deinococcus) 균체를 클로로포름과 메탄올을 2:1로 혼합한 용매를 균체 농축액의 2배부피로 첨가하여 40℃에서 약 3시간동안 진탕하였고, 이를 원심분리하여 유기용매 층으로 추출된 물질을 회수하였다.

클로로포름과 에탄올 2:1 추출물은 하기의 에탄올 추출물과 동일한 효능을 나타내며 독성학적인 면에서 약 10%에서도 독성을 나타내지 않았다.

(2) 추출용매로서 헥산, 메탄올 아세톤을 사용

얻어진 디이노코커스(Deinococcus) 균체를 헥산과 아세톤, 메탄올을 2: 1: 0.5로 혼합한 용매를 균체 농축액의 2배부피로 첨가하여 40℃에서 약 3시간동안 진탕하였고, 이를 원심분리하여 유기용매 층으로 추출된 물질을 회수하였다.

그런데 헥산과 메탄올, 아세톤을 2: 1: 0.5로 혼합한 용매를 이용한 추출물은 TLC 분석결과 고분자물질의 분해를 일으키는 등의 결과를 나타내었다.

따라서 이후의 모든 추출물은 에탄올로 고온에서 가열한 후 고주파초음파기를 이용하는 방법으로 추출과정을 실시하였다.

(3) 추출용매로서 에탄올을 사용

얻어진 디이노코커스(Deinococcus) 균체를 에탄올을 50~85% 농도로 첨가하여 60℃에서 1시간동안 진탕하고, 고주파초음파기를 사용하여 미생물 세포가 파괴되지 않을 정도의 약한 충격을 주어서 세포막 물질이 용매에 완전히 추출되도록 한 후 다시 2시간동안 고온에서 세포막의 소수성물질을 추출하였다.

회전식 증발농축기(evaporator)를 이용하여 유기용매를 증발시키고 남은 소수성물질을 에탄올에 용해시킨 후 다시 증발시키는 것을 2회 반복한 후 최종적으로 에탄올 혹은 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시켜 물질을 회수하였으며, 이를 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus Radiodurans) 세포막 추출물(DR extr.)이라 명명하고, 이를 이용하여 지질과산화억제력(LPO inhibition) 및 미백효과, 자외선 방어능력, 비만세포에 대한 히스타민 생성억제 효과 시험, 그리고 TLC를 이용한 소수성물질의 분석시험을 실시하였다.

실시예 2. 디이노코커스 라디오두란스 세포막추출물을 함유하는 조성물의 제조

상기 실시예 1(3)의 추출물(DR extr.)을 0.01∼10.0% 함유하고 제제학적으로 허용가능한 부가물을 첨가하여 피부보호용 조성물을 제조한다.

(1) 디이노코커스 라디오두란스 세포막추출물을 함유하는 화장료의 제조

하기와 같은 조성 성분으로 구성되는 본 발명에 따른 화장료 조성물을 제조가능하다.

디이노코커스 라디오두란스 세포막 추출물 함유 화장료 조성물의 조성(중량%)

성 분	중량(%)
에탄올 디이노코커스 라디오두란스 세포막 추출물 글리세린 1,3-부틸렌글리콜 멸균 정제수	5.0 1.0 4.0 4.0 잔량

(2) 디이노코커스 라디오두란스 세포막 추출물을 함유하는 약제학적 조성물 의 제조

국소사용을 위해 적합한 피부외용제의 약제학적 형태는 다음과 같다.

디이노코커스 라디오두란스 세포막 추출물 함유 피부외용제 조성물의 조성(중량%)

성 분	중량(%)
디이노코커스 라디오두란스 세포막 추출물 에탄올 글리세롤 프로필렌 글리콜 4000 레시친 POE(20)-솔비탄모노스테아레이트 글리세롤 모노스테아린산 에스테르 염화나트륨 방부제 멸균 정제수	4.0 5.0 10.0 5.0 0.5 1.0 1.0 적량 적량 55.0

시험예 1. EMP 경로를 통한 세포물질의 변화

트립톤(Tryptone) 0.5%, 효모엑스(yeast extract) 0.3%, 글루코스(glucose) 0.1%, 메티오닌(methionine) 0.1%(TGY medium)의 액체배지에 0.1mM MnCl₂를 첨가하고, Mn을 첨가하지 않는 배지와 함께 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)를 배양한 후, 30℃에서 120rpm으로 약 48간 배양한다. 배양 후, 균체 를 얻기위하여 7,500rpm으로 40분간 원심분리하여 상등액을 제거하고, 세척을 위하여 증류수로 균체를 현탁하고 재차 원심분리하는 과정을 2회 반복하여 불순물이 극히 적은 순수균체를 얻는다. 이렇게 얻어진 각 균체를 실시예와 같이 추출물제조에 이용하였다.

Mn의 첨가에 따른 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans) 세포막 성분의 변화를 조사하기 위하여 2차원 TLC 법을 사용하였다. 첫 번째 전개시 사용된 용매는 클로로포름, 메탄올, 그리고 증류수를 7 : 1.6 : 0.2의 비율로 조제하였으며, 두 번째 전개 시에는 클로로포름, 메탄올, 암모니아, 그리고 증류수를 3.3 : 1.0 ; 001 : 0.05의 비율로 조제하였고, 25℃에서 각 TLC 분석을 실시하였다. 분석을 위한 TLC 플레이트는 실시카겔 플레이트(silica-gel plate)를 사용하였으며, 검출(detection)을 위해서 큐프릭 설페이트(CuSO4)를 8% 인산(phosphoric acid)에 용해시켜 분무하고 고온에서 가열함으로 추출물의 성분들이 산화되는 현상으로 생겨나는 스팟(spots)의 위치를 비교하였다.

[실험결과]

그 결과는 도 1과 같다.

Y.M.Zhang 등(Appl. and Environ. Microb., Jan. 2000, p. 105-112)에 의하면 Mn을 첨가하여 EMP 경로를 유도하여 배양된 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)는 정상적인 대사경로인 PPP 경로로 배양된 세포일 때 보다 자외선 방어력이 감소한다고 보고하였다. 또한 본 연구자에 의해 수행된 실험에서도 그러한 동일한 결과를 나타내었으며, Y.M.Zhang 등은 유전자 재 생 시스템(DNA repair system)이 정상적으로 성숙되지 못함으로 인하여 발생되는 현상이라 결론을 맺었으나 항산화력을 나타내는 세포지질에서 양적인 그리고 질적인 면에서 큰 변화가 있다. 양적인 면으로는 카로테노이드 등의 전반적인 소수성물질이 감소하며, 질적으로는 도 1의 결과처럼 두 대사경로를 통해 증가되고 혹은 감소된 세포막 물질의 변화를 확인할 수 있다. 물론 자외선 방어력의 감소가 전부 이러한 세포막 소수성물질의 감소에 기인하는 것은 아닐지라도 상당 부분의 자외선 및 이온화광선 등에 대한 저항성에 영향을 주었다고 판단한다.

세포 배양시 Mn을 첨가하면 세포증식(Cell growth)이 약 70%이상 높아진다. 물론 셀의 크기나 형태(morphology)의 변화는 고려하지 않았다. 따라서, 만일 동일한 세포막성분이 생산되었다면 전반적인 스팟(spot)의 발색이 진하게 나타날 것이다. 두 TLC 플레이트의 스팟(spot)을 비교해보면, 3번과 4번, 5번, 6번, 7번, 8번, 그리고 9번의 차이를 확인할 수 있다.

먼저, 3, 4번의 경우는 PPP군과 비교하였을 때, 급격히 증가 한 것으로 보아 체구성 물질일 가능성이 크다. 세포증식(Cell growth)이 70%이상 증가한 것과 함께 증가하였기 때문에 1, 2번과 함께 체구성 물질이라 판단한다. 6번의 경우는 PPP군의 스팟(spot) 농도가 더 높지만 큰 차이는 나타나지 않았으나 7번 스팟(spot)은 EMP 군의 4번과 같이 매우 큰 차이를 나타내었다. 또한 8, 9번 스팟(spot)도 PPP 군의 스팟(spot) 농도가 더 높다. 따라서 6, 7, 8, 9 번의 물질이 항산화 및 자외선 저항성에 관계된 물질일 것이라 판단한다.

시험예 2. 지질과산화 억제력 시험

지질과산화 억제력(LPO inhibition)시험은 Yagi K.등(Biochem. Med., 15, 212-216, 1976)의 방법을 변형하여 행하였다. tert-부틸 하이드록사이드(t-BuOOH)에 의해 생성된 ㆍOH 라디칼에 의해 지질과산화(lipid peroxidation)를 진행시켜 생성된 MDA(malondialdehyde)를 TBA(tribarbituric acid)와 반응시켜 생성된 TBA 반응물질(TBARS)의 흡광도를 측정하는 방법을 사용하였다. 먼저 샘플 0.1mL을 PBS 버퍼 0.8mL에 희석한 후, 0.3M t-BuOOH 0.1mL을 첨가하고 리놀레인산(linoleic acid) 용액(70mg/mL in ethyl alcohol) 0.1mL을 첨가하여 37℃ 수조에서 1시간동안 반응시킨다. 반응을 종료시키기 위하여 0.2% BHT(Butylated hydroxytoluene, in ethyl alcohol)을 가한다. TBARS를 생성시키기 위하여 0.333M TBA 용액(in 0.05N NaOH)과 아세트산과 DW를 1:1:3 비율로 제조한 용액 0.9mL을 가하고 95℃에서 1시간동안 반응시킨 후 얼음물에 넣어서 급속 냉각하여 반응을 정지시킨다. 그 후 3mL의 n-부틸알콜을 가하여 강하게 볼텍싱(vortexing)하고, 3000rpm으로 10분간 원심분리한 후, n-부틸 알콜 층에 대하여 분광광도계(spectrophotometer) 520nm에서 흡광도를 측정한다. 저해율은 다음과 같이 정의하였다.

Inhibition rate(%) = (Cp-T)/(Cp-Cn)×100

* Cp : Positive control, Cn : Negative control, T : Test

디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)의 배지 성분을 변화시 켜가며 최적의 항산화조건을 찾고자 하였다.

[실험결과]

그 결과는 도 2와 같다. 0.2%의 글루코스를 첨가하였을 때 가장 높은 저해율을 나타내었으며, 항산화력을 비교하고자 항산화력이 높은 것으로 알려진 실리마린(silymarin)을 비교물질로 사용하였다

시험예 3. 멜라노마 셀을 이용한 미백효과 시험

(1) 세포배양

B16/BL6 마우스 멜라노마 세포주(mouse melanoma cell line)를 DMEM(Dulbecco's modified essential medium )에 5% 우아혈청(Bovine calf serum)을 처리하였고 필요한 경우 멜라닌생성(melanogenesis)을 유도하는 호르몬으로 알려진 α-MSH을 배지에 첨가하였다. 셀이 컨플루언트(confluent) 되었을 때 1×트립신-EDTA sol'n(Gibco)으로 회수하였다.

(2) 멜라닌 양 측정

디이노코커스 라디오두란스 세포막추출물과 0.2% 실리마린의 멜라닌 생성억제(Melanogenesis inhibition)효과를 비교하기 위해 각 물질을 동량이 되도록 첨가하여 배양하였다. 7일간 배양 후 상등액을 분광광도계(spectrophotometer)로 405nm에서 흡광도를 측정함으로써 외부로 배출된 멜라닌의 함량을 측정하였으며, 미백효과를 나타내는 것으로 인정된 유효농도는 독성을 나타내지 않는 범위로 설정하였다.

[실험결과]

그 결과는 도3a, 도3b와 같다. 비교물질로 사용된 실리마린은 독성이 심했고, 독성이 나타나지 않는 농도에서도 미백효과가 나타나지 않았으나 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus Radiodurans) 세포막 추출물은 독성이 나타나지 않은 농도인 0.56%에서 약 50%가까운 멜라닌의 생성을 억제하는 결과를 나타냈다. 이는 항산화력에 기인한 현상이라고 판단되며, 다양한 항산화 기능을 나타낼 수 있다는 결과이므로 피부에 적용될 수 있는 화장료 및 의약품의 소재로서 매우 유리한 물질임을 확인한 것이다.

시험예 4. 디이노코커스 라디오두란스 추출물을 처리한 대장균 세포의 자외선 방어력 향상 시험

살균된 NB배지(nutrient broth media)에 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus Radiodurans) 세포막 추출물을 최종농도 1% 혹은 5%가 되도록 첨가하고, 대장균(E.coli ATCC 14169)을 접종한다. 온도 37℃에서 약 36시간동안 120rpm으로 진탕배양하고 배양액을 3,000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 제거한 균체를 얻었으며, PBS 버퍼를 사용하여 2회 세척하였다. 동일한 조건에서 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus Radiodurans) 세포막 추출물을 넣지 않고 1% 혹은 5%의 DMSO(추출물의 용매)를 첨가하여 대조군으로 사용하였다. 이렇게 얻어진 4종의 대장균 세포를 살균된 PBS 버퍼로 적당량 희석하여 주고, 이들에 대하여 자외선(UV-B, 306nm)에 의한 세균세포 생육저해율을 측정하였다. 세균 세포의 자외선에 의한 생육저해율 측정은 즉, 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus Radiodurans) 세포막 추출물에 의한 자외선 방어능력 향상에 의한 생존율의 향상의 정도를 측정하는 시험이다. 먼저, 위의 PBS에 희석된 2종류(대조군 및 실험군의 대장균 세포)의 대장균 세포를 일정량 지름 60mm 페트리 접시(petri dish)에 각각 도포한 후 1.5J/cm²의 자외선(UV-B, 306nm)을 조사하고, 균체를 회수하여 NB배지(nutrient broth media)에 접종한다. 37℃에서 120rpm으로 약 18시간 진탕 배양한 후 분광광도계에서 620nm로 흡광도를 측정한 결과를 도 4에 나타내었다.

[실험결과]

도 4의 결과에서 볼 수 있듯이, 대조구에 비하여 약 16~26% 높은 생존율을 나타내고 있다. 대조군에 비하여 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus Radiodurans) 세포막 추출물을 첨가한 시험군의 대장균 세포는 붉은 색을 갖게 되며, 이는 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus Radiodurans) 세포막 추출물이 대장균 세포막으로 유입되어서 발생되는 것이라 판단된다. 이는 Daniel C.L. 등(Arch. Biochem. and Biophy., Vol.338, No.2, Febr.15, pp.244-250, 1997)의 보고에서 리포좀(Liposome) 등 세포유사체 내부에서 발생된 자유 라디칼을 소거하는 능력은 항산화력이 높다고 여겨지는 α-토코페롤보다 β-카로틴이 더 효율적이라고 주장하는 것처럼 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus Radiodurans) 세포막 추출물은 세포막에 침투하여 자외선 등에 의한 인자로부터 생성되는 자유 라디칼을 효율적으로 소거 또는 완화하여 줌으로 인해 자외선조사에서도 생존율을 높일 수 있었다고 판단된다.

시험예 5. 각질형성세포(Human keratinocyte) A431의 자외선 방어력 향상 시험

DMEM(Dulbeco's modified eagles media)에 0.417% HEPES(N-[2-hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfoneic acid]), 0.245% 소디움 바이카보네이트(Sodium bicarbonte), 10% FBS(Fetal bovine serum), 1% 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-streptomycin)의 조성으로 제조된 배지에 A431세포를 배양할 때 10% 토코페릴 아세테이트(Tocopheryl acetate)와 에탄올, 5% 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus Radiodurans) 세포막 추출물을 전체 배지부피 중 시료농도 부피를 약 1% 농도로 첨가하여 37℃, 5% CO₂에서 48시간 배양한 후, 0.25% 트립신으로 세포를 떼어내어 PBS 버퍼로 세척하여주고, 적당한 농도로 희석한다. 각 A431 세포를 동물세포배양용 98mm 페트리접시의 중앙에 300㎕의 세포 희석액을 점적하여 1.2mW/cm²·sec 에너지를 갖는 자외선(UV-B)을 약 40초간 조사한 후 바로 배지를 첨가하여 고르게 분산시키고 위와 동일한 방법으로 배양한다. 그 후 24시간이상 배양하고 NR(Neutral red) 측정법으로 확인한 A431 세포 생존율을 도 5에 나타내었다.

[실험 결과]

도 5의 결과와 같이 대조구에 비하여 토코페롤(tocopherol)과 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus Radiodurans) 세포막 추출물을 첨가하여 배양한 세포는 더 높은 세포생존율을 나타내었다. 그러나 세포생존율을 비교하였을 때 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus Radiodurans) 세포막 추출물은 토코페롤(tocopherol)보다 약 20 ~ 30 % 더 높은 세포생존율을 나타내었으며, 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus Radiodurans) 세포막 추출물을 첨가한 세포는 세포의 생존뿐만 아니라 정상적인 세포증식이 가능하다고 판단할 정도로 정상적인 형태를 보였으나, 대조구와 토코페롤을 첨가하여 배양한 세포는 그 형태가 비정상적인 형태로 생존해 있는 것을 현미경 관찰에서도 볼 수 있었다. 이것은 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus Radiodurans) 세포막 추출물이 자외선으로부터 발생되는 세포내의 라디칼로 인한 지질과산화로부터 세포를 보호해주는 역할을 함에 기인한 것이며, 더 나아가 자외선에 의한 세포의 DNA손상을 방어하여 주었기에 정상세포증식이 가능했던 결과라고 판단한다.

시험예 6. 디이노코커스 라디오두란스 추출물의 비만세포 히스타민 방출 억제력 시험

98mm 접시에서 배양한 비만세포(Mast cell)을 회수하여 칼슘 농도가 1~1.5mM 버퍼로 2~3회 세척하여 준 후, 동일 버퍼 500㎕에 분산시키고, 형광염색시약 퓨라(fura)-2를 최종농도 4μM이 되도록 첨가하여 적당히 교반하며 37℃에서 30분 동안 반응시킨다. 반응 후 셀을 회수하여 동일 버퍼로 2~3회 세척하여주고, 최종 부피 200~300㎕되도록 분산시키고 각 시료의 실험에 사용하기 위하여 0℃에서 보관 한다. 그리고 형광 큐벳(cuvette)에 2mL의 동일 버퍼를 넣고 보관된 셀을 50㎕첨가한 다음 각 시료를 첨가하였고, 약물처리하여 시간에 따른 형광도를 측정한다. 형광도의 측정은 형광분광계(spectrofluorometer)를 이용하였고, 파장은 exitation 340nm/380nm, emmition 505nm의 조건에서 형광도를 측정하였다.

[실험결과]

그 결과는 도 6에 나타내었으며, 다른 항산화 물질과 비교하여 볼 때 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus Radiodurans) 세포막 추출물의 수치는 C48/80을 처리 하였음에도 비만세포 표면의 칼슘이온농도의 변화가 없는, 즉 피크(peak)상승이 일어나지 않는 정도로 완전 소실된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus Radiodurans) 세포막 추출물이 항산화력을 갖고 있는 것에서 유추해 볼 때, 비만세포(mast cell)가 히스타민을 방출하는 메카니즘에 관여하는 활성산소의 작용을 막음으로 인해서 발생되는 현상으로 볼 수 있으며, 그러한 항산화현상이 효과적으로 작용하기에 C48/80의 처리에 의해서도 Ca²⁺의 농도가 상승하지 않으며 히스타민의 방출 현상도 일어나지 않았다고 판단된다.

이상의 실시예 및 시험예에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 의해 제공되는 디이노코커스 라디오두란스 추출물 및 이를 함유하는 피부외용제 조성물은 t-부틸 하이드로퍼옥사이드(butyl hydroperoxide)에 의해 발생되는 라디칼에 의한 지질과산화(LPO ;lipid peroxidation)를 억제하는 등의 항산화력을 나타냄과 아울러, 간지러움 및 알러지 등 피부부작용이 심한 사람들에게 나타나는 증상의 하나인 비 만세포(master cell)의 히스타민(histamine) 방출을 억제하는 기능을 하며, 또한 대장균 또는 인간피부세포(A-431 ; human skin cells, keratinocyte, epidermoid carcinoma, human)의 사멸조건인 자외선 B(약 306nm) 혹은 자외선 C(약 253nm)의 조사 하에서도 추출물을 처리한 실험군은 대조구에 비하여 비교적 높은 세포생존율(survivability)을 나타냄으로써 피부의 노화를 촉진하는 자외선으로부터 피부를 보호하고 더 나아가 자외선으로부터 손상된 피부의 재생을 촉진시킬 수 있는 화장료 혹은 외용의약품의 조제가 가능하므로, 본 발명은 화장품 및 의약품 산업에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims

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그람양성 세균 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)의 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하고, 추출용매로서 50∼85%의 에탄올 또는 클로로포름과 메탄올을 2:1로 혼합한 용매를 사용하고 가열초음파처리를 행하여 추출하여 얻어지는 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans) 세포막 추출물의 0.01∼10.0 중량%를 유효성분으로 함유하는 지질과산화방지효과 및 미백용 화장용 피부외용제 조성물.
그람양성 세균 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)의 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하고, 추출용매로서 50∼85%의 에탄올 또는 클로로포름과 메탄올을 2:1로 혼합한 용매를 사용하고 가열초음파처리를 행하여 추출하여 얻어지는 디이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans) 세포막 추출물의 0.01∼10.0 중량%를 유효성분으로 함유하는 항알러지용 화장용 피부외용제 조성물.