KR101442083B1 - 락토바실러스 플란타룸의 배양액을 방부제 또는 기능성 성분으로 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Latobacillus plantarum)의 배양액을 방부제로 포함하는 화장료 조성물 또는 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Latobacillus plantarum) 배양액은 방부제로서 화장품에 사용이 가능하며, 피부 미백능, 자외선에 의한 피부 노화 방지용, 피부 자극 완화용 화장료 조성물의 원료로 사용될 수 있다.

Description

락토바실러스 플란타룸의 배양액을 방부제 또는 기능성 성분으로 포함하는 화장료 조성물{Cosmetic composition with culture meida of Latobacillus plantarum as antiseptic or functional component}

본 발명은 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 락토바실러스 플란타룸(Latobacillus plantarum)의 배양액을 방부제로 포함하는 화장료 조성물 또는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

현재 사용하는 수많은 화장품 중 적어도 90% 이상의 제품들에는 극소량이라도 방부제가 첨가되어 있다. 물론 제품의 특징상 변질되지 않는 성분으로 이루어져 있다거나, 제품 자체에 천연으로 이루어진 살균 성분이 포함되어 있는 경우도 있지만 결과적으로 화장품이라는 제품에 살균과, 방부의 역할은 반드시 필요하다는 것을 의미한다. 하지만, 화장품에 방부제가 극소량이라도 포함되어 있으면 아무리 효과가 있는 제품이라 해도, 유해 제품이라 구분해 버리는 인식과 항균제의 과다 사용을 금지하는 추세에 따라, 방부제의 사용은 자제되고 있는 실정이다.

최근 웰빙 시대와 맞물려 먹는 것뿐만 아니라, 피부미용 관심이 집중되면서 천연화장품이 많이 판매되고 있다. 그에 따라 방부제 역시 화학 성분이 아닌 천연물 유래의 것으로 관심이 많아지고 있다.

항균제는 사용 목적에 따라 방부제와 살균제로 분류되고 화장품의 보존성을 증가시키는 것 이외에도 피부를 청정히 하여 세균 등 미생물의 생육을 억제하는 목적으로 항균제가 사용되고 있다. 방부제는 미생물의 증가를 억제하고 정균적(靜菌的)으로 작용하며, 살균제는 미생물을 사멸시킨다. 그러나, 일반적으로 동일 물질이 저농도에서는 정균적으로 작용하고, 고농도에서는 살균적으로 작용하므로, 방부제와 살균제와의 사이에 본질적인 차이는 없는 것으로 말할 수 있으며, 방부제와 살균제를 일괄하여 항균제라고 한다.

화장품의 방부제에는 몇 가지 종류가 있는데 대부분의 제품은 파라벤(파라옥시안식향산 에스텔)이나, 이미다졸리 디닐유레아의 두 가지를 사용한다. 그 중 파라벤은 유방암 조직에서 발견되는 성분으로 밝혀져 많은 유방암 발병의 가능성 논란이 되고 있다. 뿐만 아니라, 파라벤은 남자의 정자수를 감소시키고 활성산소를 발생시켜 피부 노화를 촉진시키고, 주름살과 적갈색 반점을 형성한다는 연구결과도 있으며, 흔히 화장독으로 알고 있는 접촉성 피부염이나 피부 알레르기의 주요 원인이 되는 성분이기도 한다. 파라벤은 화장품뿐만 아니라 잼이나 간장, 소스 등 식품 방부제로도 널리 쓰였는데, 안정성 문제가 꾸준히 제기되자, 식약청이 부적합 판정을 내려 식품 내 첨가를 금지한 품목이다. 물론 화장품에 함유된 파라벤은 소량이긴 하지만, 중요한 것은 우리가 화장품을 거의 매일 바른다는 것이다. 그러므로 화장품이 흡수되는 성질을 가졌다는 것을 고려해 볼 때, 방부제가 체내에 쌓일 가능성은 충분히 있고, 특히, 립스틱이나 립글로즈의 경우 입 속으로 들어갈 수도 있다.

한편, 이미다졸리 디닐유레아는 파라벤 다음으로 많이 사용되는 방부제로서 파라벤류와 함께 혼합되어 많이 사용되기도 한다. 미국 피부과학회지에 발표된 연구결과에 따르면, 이미다졸리 디닐유레아는 호흡기나 피부를 자극하여 염증을 발생시키고, 심장 맥박수를 증가시켜 심계항진을 유발하고, 접촉성 피부염의 원인이 된다. 이 때문에 일본에서는 사용이 금지되었고, 유럽에서는 사용을 자제할 것을 권고하고 있다.

이와 같은 추세에 따라, 화장품 내에 첨가할 수 있는 천연물 유래의 새로운 항균제가 개발될 필요가 있는 것이다.

대한민국 특허공개번호 제10-2009-0075282호(공개일자: 2009. 07. 08)에는, "화장품, 생활용품 등에서 항균 및 항산화 및 노화억제 기능을 가짐으로써, 제품의 안전성과 안정성을 높이고, 인체에서 안전하고 내성이 유발되지 않으면서 적절한 항산화 및 노화억제 기능까지 보유하고 있어, 화장료 또는 생활용품에서 기존의 화학 합성방부제가 인체에 대하여 나타내는 부작용을 전혀 나타내지 않으면서, 방부능력이 더욱 우수한, 새로운 방부효과를 갖는 초피추출물을 함유하는 천연방부제"가 기재되어 있다.

본 발명에서는 화합물이 아닌 천연물 유래의 방부제를 개발하고, 이를 포함하는 화장료 조성물로 개발하고자 한다.

또한, 발굴한 천연물 유래의 방부제로부터 피부에 적용할 수 있는 기능성이 있는지 여부를 탐색하고, 이를 바탕으로 기능성 화장료 조성물로 개발하고자 한다.

본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Latobacillus plantarum)을 배양하는 단계; 상기의 배양 후, 얻어진 균체 배양액을 원심 분리하여 균체를 제거하고 상등액을 회수하는 단계; 상기에서 회수한 상등액을 여과하여 잔존 균체를 완전히 제거하는 단계;로부터 수득한 배양액을 방부제 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Latobacillus plantarum)을 배양하는 단계; 상기의 배양 후, 얻어진 균체 배양액을 원심 분리하여 균체를 제거하고 상등액을 회수하는 단계; 상기에서 회수한 상등액을 여과하여 잔존 균체를 완전히 제거하는 단계;로부터 수득한 배양액을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다. 이때, 상기 화장료 조성물은 일 예로, 피부 미백용, 자외선에 의한 피부 노화 방지용, 피부 자극 완화용일 수 있다.

본 발명에서는 락토바실러스(Lactobacillus) 속 유산균들 중에서 4개의 유산균주를 선택 배양하여 얻은 항균 배양액에 대하여 항균력을 비교한 결과, 락토바실러스 플란타룸(Latobacillus plantarum)을 배양한 배양액이 가장 높은 항균력을 보였다.

또한, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Latobacillus plantarum)을 배양한 배양액의 항균능력을 실험한 결과, 현재 쓰이고 있는 항생제 수준의 살균능력을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Latobacillus plantarum)을 배양한 항배양액은 온도, 유기용매 그리고 분해효소에 상당히 안전한 물질임을 확인할 수 있었다. 하지만, pH 안정성에서는 산성 pH인 5까지만 활성이 나타났다.

또한, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Latobacillus plantarum)을 배양한 항균 배양액으로부터 항균물질의 추출은 유기용매 중 클로로폼을 제외한 여러 유기용매에서 추출이 가능하였고, 그 중 메탄올과 에탄올에서 최대 추출이 가능하였다.

또한, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Latobacillus plantarum)을 배양한 항균 배양액은 항균 능력뿐만 아니라, UV에 의해 생성된 ROS 제거능력이 뛰어나 자외선에 의한 피부 주름 발생의 억제 능력이 확인되었고, 피부 미백과 관련이 있는 멜라닌의 제거능력이 확인되었으며, 피부 재생 능력 및 피부 자극 완화 능력이 확인되었다.

본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Latobacillus plantarum)의 배양액은 우수한 항균 활성이 있어, 방부제로서 화장품에 사용이 가능하다.

또한, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸(Latobacillus plantarum)의 배양액은 기능성 화장료 조성물의 원료 사용될 수 있는데, 피부 미백능, 자외선에 의한 피부 노화 방지용, 피부 자극 완화용 화장료 조성물의 원료로 사용될 수 있다.

도 1은 유산균별 배양액의 향균력을 보여주는 그래프이다.
도 2는 락토바실러스 플란타룸(Latobacillus plantarum)의 배양액인 CosLacto의 항균능력을 보여주는 브로스 테스트 결과이다.
도 3은 CosLacto의 살모넬라에 대한 항균능력을 보여주는 아가 플레이트 테스트 결과이다.
도 4는 젖산과 CosLacto의 항균능력을 비교한 브로스 테스트 결과이다.
도 5는 젖산과 CosLacto의 항균능력 차이를 비교한 디퓨즈 테스트(Diffuse Test) 결과이다.
도 6은 CosLacto에 대해 보관 기간별 안정성 테스트를 한 결과이다.
도 7은 CosLacto의 온도별 안정성 차이를 보여주는 브로스 테스트 결과이다.
도 8은 CosLacto의 온도별 안정성 차이를 보여주는 디퓨즈 테스트 결과이다.
도 9는 NaOH를 이용한 pH 변화에 따른 항균력 변화를 보여주는 브로스 테스트 결과이다.
도 10은 트리스(Tris)를 이용한 pH 변화에 따른 항균력 변화를 보여주는 브로스 테스트 결과이다.
도 11은 pH 변화에 따른 항균력 변화를 보여주는 디퓨즈 테스트 결과이다.
도 12는 CosLacto의 분해효소별 안정성을 시험한 브로스 테스트 결과이다.
도 13은 CosLacto의 분해효소별 안정성을 시험한 디퓨즈 테스트 결과이다.
도 14는 CosLacto의 유기용매별 안정성을 시험한 브로스 테스트 결과이다.
도 15는 CosLacto의 유기용매별 안정성을 시험한 디퓨즈 테스트 결과이다.
도 16은 CosLacto의 추출 후, 유기용매별 항균력 변화를 보여주는 브로스 테스트 결과이다.
도 17은 CosLacto의 추출 후, 유기용매별 항균력 변화를 보여주는 디퓨즈 테스트 결과이다.
도 18은 CosLacto에 의한 Hs68 세포의 증식률 변화를 보여주는 실험 결과이다.
도 19는 CosLacto에 의한 A431 세포의 증식률 변화를 보여주는 실험 결과이다.
도 20은 여드름 균주에 감염된 Hs68 세포에 대한 CosLacto의 항산화 능력을 보여주는 실험 결과이다.
도 21은 여드름 균주에 감염된 A431 세포에 대한 CosLacto의 항산화 능력을 보여주는 실험 결과이다.
도 22는 UV에 노출된 Hs68 세포에 대한 CosLacto의 항산화 능력을 보여주는 실험 결과이다.
도 23은 UV에 노출된 A431 세포에 대한 CosLacto의 항산화 능력을 보여주는 실험 결과이다.
도 24는 CosLacto의 주름 개선 효능을 보여주는 실험 결과이다.
도 25는 CosLacto의 티로신/티로시나아제 활성 저해 능력을 보여주는 실험 결과이다.
도 26은 CosLacto의 L-도파/티로시나아제 저해 능력을 보여주는 실험 결과이다.
도 27은 CosLacto의 멜라닌 분해 능력을 보여주는 실험 결과이다.
도 28은 CosLacto를 이용하여 제조한 시제품의 사진이다.
도 29는 시제품에 대해 항균력을 테스트한 실험 결과이다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[ 실시예 1: 유산균별 항균력 검증]

다양한 유산균 L.P( Latobacillus plantarum ) 및 L.B(Latobacillus brevis), L.C(Latobacillus casei), L.A (Latobacillus acidophilus)을 배양하여 얻은 배양액에 대해 항균력을 비교하고자 하였다.

L.P(Latobacillus plantarum), L.B(Latobacillus brevis), L.C(Latobacillus casei), L.A(Latobacillus acidophilus)을 MRS 배지에서 37℃, 72시간 배양 후 얻어진 균체 혼합 배양액을 8,000×g에서 20분간 원심 분리하여 균체를 제거하고, 상등액은 0.22㎛ 필터하여 잔존 균체를 완전히 제거함으로써, 각각의 순수 배양액을 수득하였다. 이후, 수득한 순수 배양액을 동결 건조기를 이용하여 동결 건조하여 준비하였다.

항균력 검사를 위해, 유해균 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium) (SL1344) 및 이 콜라이(E. coli) (K12), 프로피온박테리움 아크네(Propionbacterium acne), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)를 37℃, LB 및 해당 유해균주의 배양 배지에서 15시간 배양 후, 새로운 배지에 계대하여 37℃에서 5시간 진탕배양하고, 흡광도를 측정하여 균체 농도가 1×10⁷cfu/㎖가 되도록 해당 배지로 희석하였다. 항균력 검사를 위하여 15㎖ 코니칼 튜브(conical tube)에 실험에 필요한 항균력 검사 샘플을 농도별로 첨가하고 준비한 1×10⁷cfu/㎖의 유해균을 최종 1×10⁵cfu/㎖가 되도록 첨가하고, 최종 부피가 2㎖이 되도록 해당 배지를 채워 넣었다. 37℃에서 15시간(Overnight) 진탕 배양 후 OD₆₂₀에서 흡광도를 측정하여 유해균의 증식 억제 정도로 항균력(%)을 측정하였다.

실험결과, 도 1에서 보는 바와 같이, L.P 균주 이외에 L.B(Latobacillus brevis), L.C(Latobacillus casei), L.A(Latobacillus acidophilus)에서도 항균력이 어느 정도 나타났지만, L.P 유산균주에 비해 항균 효과가 낮았다.

따라서, 여러 유산균주 중에 가장 높은 항균력을 보이는 L.P( Latobacillus plantarum) 균주를 본 발명의 균주로 선정하고, 상기에서 제조한 이 균주의 배양액(이하, "CosLacto"라 함)에 대해 하기의 시험을 진행하였다.

[ 실시예 2: 락토바실러스 플란타룸( Lactobacillus Plantarum )의 배양]

1. M9 최소배지 이용 배양

락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus Plantarum) 유산균을 MRS 아가 플레이트(Agar plate)에 도말하여 24시간 동안 37℃ 배양기에서 배양하였다. MRS 15mL 브로스(broth)에 싱글 콜로니(single colony)를 접종하고, 튜브(Tube)를 완전 밀봉한 후, 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 대량 배양을 위해 M9 최소배지에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus Plantarum) 유산균을 1%로 (vol/vol) 접종하고, 1일에서 5일까지 37℃ 배양기에서 배양하였다. 배양이 끝나면 원심분리법과 필터방법을 이용하여 유산균과 배양액을 분리하고, 분리된 배양액을 -70℃ 초저온냉동고에 보관하였다.

2. 리치( Rich) 배지 이용 배양

락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus Plantarum) 유산균을 MRS 아가 플레이트에 도말하여 24시간 동안 37℃ 배양기에서 배양하였다. MRS 15mL 브로스에 싱글 콜로니를 접종하고 튜브를 완전 밀봉한 후, 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 대량 배양을 위해 각종 MRS 배지에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus Plantarum) 유산균을 1%(vol/vol) 접종하고, 1일에서 5일까지 37℃ 배양기에서 배양하였다. 배양이 끝나면 원심분리법과 필터방법을 이용하여 세포와 배양액을 분리하고, 분리된 배양액은 -70℃ 초저온냉동고에 보관하였다.

[ 실시예 3: 락토바실러스 플란타룸( Lactobacillus Plantarum )의 항균능력 검증]

1. 실험 방법

가. 유해균 배양방법

살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium) 및 마이크로코쿠스 레우투스(Micrococcus Leutus)를 루리아 브로스(Luria Broth, LB)에 37℃에서 15시간 배양 후, 새로운 배지에 유해균을 1%(vol/vol) 접종하여 OD₆₀₀=1 의 흡광도를 유지하여 37℃에서 배양하였다.

나. 브로스 테스트( Broth Test) 에 의한 항균력 테스트 방법

락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus Plantarum) 배양액, 즉 "CosLacto"의 항균력을 확인하기 위하여 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium)과 마이크로코쿠스 레우투스(Micrococcus Leutus)는 LB 아가 플레이트에 접종하여 24시간 동안 37℃ 배양기에서 배양하였다. 싱글 콜로니를 LB에 접종하여 12시간 동안 진탕 배양하였다. LB에 유해균을 1%(vol/vol)로 접종하고, CosLacto를 넣어 6시간 동안 진탕배양을 한 후, OD₆₀₀에서 흡광도를 측정하여 CosLacto에 의해 저해된 성장률을 항균력으로 측정하였다.

다. 아가 플레이트 테스트( Agar plate Test )에 의한 항균력 테스트 방법

CosLacto의 항균력을 확인하기 위하여 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium)과 마이크로코쿠스 레우투스(Micrococcus Leutus)는 LB 아가 플레이트에 접종하여 24시간 동안 37℃로 배양기에서 배양하였다. 새로운 LB 배지에 유해균을 1%(vol/vol)로 접종한 후, CosLacto를 넣어 2~12시간 진탕배양하고, 유해균을 LB 아가 플레이트에 희석 도말하여, 자란 콜로니 수를 계산하였다.

라. 디퓨즈 테스트( Diffuse Test )에 의한 항균력 테스트 방법

CosLacto의 항균력을 확인하기 위하여 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium)과 마이크로코쿠스 레우투스(Micrococcus Leutus)는 LB 아가 플레이트에 접종하여 24시간 동안, 37℃ 배양기에서 배양하였다. LB 아가는 고압멸균 후, 50℃를 유지시킨 후 유해균을 1%(vol/vol) 접종하였다. 이렇게 유해균이 접종된 LB 아가 플레이트는 상온에서 2시간 동안 굳히고, 5mm 직경으로 구멍을 내어 이 구멍에 CosLacto를 100㎕ 넣어 배양기에서 12~24 시간 동안 배양한 후, 직경으로 저해환의 크기를 가지고 항균력을 측정하였다.

2. 실험 결과

가. CosLacto 의 항균능력 검증

(1) 브로스 테스트에 의한 유해균에 대한 항균능력 검증

하기 표 1과 같이 접종 LB에 CosLacto를 혼합하여 6시간 뒤, OD₆₀₀에서의 흡광도를 가지고 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium)과 마이크로코쿠스 레우투스(Micrococcus Leutus)에 대한 항균력을 비교하였다.

샘플 조성	0	4%	8%	12%	16%	20%	24%
유해균 접종 배양액 (㎕)	190	190	190	190	190	190	190
CosLacto (㎕)	0	2.5	20	30	40	50	60
M9 배지 (㎕)	60	50	40	30	20	10	0
총량 (㎕)	250	250	250	250	250	250	250

실험 결과, 도 2에 보는 바와 같이, CosLacto에 의해 농도 의존적으로 항균력이 나타났으며, 그 중 20% 함유 시료에서 완전한 항균력이 나타났음을 확인하였다. CosLacto는 살모넬라(Salmonella)와 마이크로코쿠스(Micrococcus)에 대해 같은 양상의 항균력을 보였다.

(2) 아가 플레이트 테스트( Agar plate Test )에 의한 살모넬라에 대한 항균능력 검정

하기 표 2와 같이, 접종 LB에 CosLacto를 혼합하여 2시간 배양한 뒤, 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium)을 LB 아가 플레이트에 접종했다. 37℃ 배양기에서 12시간 배양한 뒤 콜로니 수를 측정해본 결과, 도 3에서 보는 바와 같이 브로스 테스트와 마찬가지로 CosLacto가 20%(vol/vol)로 첨가되었을 때부터 확실한 완전한 항균력이 나타났다. 10%(vol/vol)의 결과에서는 대조구(Control)과 비교해서 발생한 콜로니의 수가 확연히 줄었음을 확인할 수 있었으며, CosLacto 농도 의존적으로 항균력이 나타났다. 이로부터 적은 양의 CosLacto의 함유도 미생물의 성장을 저해하거나, 혹은 사멸시킬 수 있다는 것을 확인하였다.

샘플 조성	Control	1/10	1/5	1/2.5	1/2
살모넬라 접종 배양액 (㎕)	100	100	100	100	100
유산균 배양액 (㎕)	0	20	40	80	100
M9 배지 (㎕)	100	80	60	20	0
총량 (㎕)	200	200	200	200	200

나. 젖산( Lactic acid )과 CosLacto 의 항균능력 차이 검증

(1) 브로스 테스트에 의한 살모넬라에 대한 젖산과 CosLacto 의 항균능력 비교

Kor . J. Microbiol . Biotechnol . Vol . 36, No . 4, 276-284(2008)에 발표한 논문을 참고하면, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)이 MRS (Rich broth) 배지에서 배양될 시, 나타날 수 있는 젖산의 농도는 183mM이라 발표하였다. 이 논문을 가지고 CosLacto와 183mM 젖산의 항균력을 비교해 보았다. 실험 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 CosLacto는 젖산에 비해 더 좋은 항균력을 나타냈으며, 리치 브로스(Rich broth)가 아닌 최소배지를 이용한 CosLacto라는 것을 감안하면, 그 항균능력은 월등히 좋다는 것을 알 수 있었다.

(2) 디퓨즈 테스트( Diffuse Test )에 의한 마이크로코쿠스( Micrococcus Leutus ) 에 대한 젖산과 CosLacto 의 항균능력 차이 비교

농축된 183mM 젖산과 농축된 CosLacto를 하기 표 3과 같은 비율로 희석하여 MIC 테스트를 진행하였다.

샘플 조성	A	B	C
농축 CosLacto	3	6	0
농축 젖산	0	0	6
M9 배지	97	94	94
총량 (㎕)	100	100	100

실험 결과, 도 5에서 보는 바와 같이, 클리어 존의 크기를 비교하였을 때, 클리어존의 크기는 샘플 C(183mM의 젖산)의 클리어존보다 샘플 B(CosLacto)의 클리어존이 크다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 CosLacto는 젖산 외에 다른 항균물질이 추가적으로 포함되어 있음을 예상할 수 있었다.

[ 실시예 4: CosLacto 의 안정성 테스트]

1. 실험 방법

가. 기간별 안전성 테스트 샘플 준비

상기에서 제조한 CosLacto는 1~8주 동안 상온에서 보관하여 샘플로 준비하였다. 초기 샘플부터 각 기간이 도래하면 CosLacto를 -20℃ 냉동고에서 보관한 후, 모든 샘플이 준비되면, 항균력 테스트를 진행하였다.

나. 온도별 안정성 테스트 샘플준비

CosLacto는 37℃, 40℃, 60℃, 80℃, 100℃, 그리고 121℃ (15분)에서 2시간 동안 두어, 온도별로 보관된 CosLacto를 준비하였다. 이때, 121℃ 샘플은 오토클레이브를 이용하여 준비하였다. 온도별 CosLacto 시료에 대해 항균력 테스트를 진행하였다.

다. pH 별 안전성 테스트 샘플준비

(1) CosLacto에 1N NaOH를 넣어 pH를 변화시키며, 1N NaOH가 들어가지 않거나 적게 들어간 샘플들은 멸균 증류수를 넣어 전체 부피를 맞춰 pH별 배양액을 준비하였다. 이렇게 생성된 pH별 배양액에 대해 항균력 테스트를 진행하여 각각의 pH별 안정성 테스트를 진행하였다.

(2) CosLacto에 1M 트리스 버퍼(Tris buffer)를 넣어 pH를 변화시키며, 1M 트리스 버퍼가 들어가지 않거나, 적게 들어간 샘플은 멸균 증류수를 넣어 전체 부피를 맞춰 pH별로 배양액을 준비하였다. 이렇게 생성된 pH별 배양액은 항균력 테스트를 진행하여 각각의 pH별 안정성 테스트를 진행하였다.

라. 효소별 안정성 테스트 샘플 준비

아밀라아제(Amylase), 키모트립신(Chymotrypsin), 리파아제(Lipase), 트립신(Trypsin), 프로테아제(Protease), 프로테아제(Protease) K 그리고 아미노펩티다아제(Aminopeptidase)를 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)에서 구입하였다. CosLacto에 각각의 효소를 넣어 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 65℃에서 15분 동안 두어 각 효소의 잔존활성을 제거한 후, 효소별 안정성 테스트를 진행하였다.

마. 유기용매별 안정성 테스트 샘플준비

CosLacto는 'Speed-Vacuum'을 이용하여 수분을 제거하여 완전 농축을 시행하였다. 수분이 제거된 CosLacto 시료는 아세톤(Aceton), 부탄올(Butanol), 클로로포름(Chloroform), 에탄올(Ethanol), 헥산올(Hexanol), 이소프로판올(Isopropanol), 그리고 메탄올(Methanol)과 각각 혼합하여 완전 균질화를 시켰다. 유기용매와 혼합된 시료는 다시 한번 'Speed-Vacuum'을 이용하여 완전 농축을 시행하여 각각의 유기용매가 제거된 시료로 만들었다. 이렇게 생성된 시료는 멸균 증류수로 다시 한 번 녹여 유기용매별 안정성 테스트 샘플을 준비한 후, 잔존 항균력 테스트를 진행하였다.

2. 실험결과

가. 기간별 안정성 테스트

CosLacto의 안정성을 테스트하기 위하여 제조된 것으로, 상온에서 1주부터 8주까지 보관한 CosLacto 샘플의 항균력을 서로 비교하였다. 비교는 CosLacto의 확산에 의한 마이크로코쿠스 레우투스(Micrococcus Leutus)의 MIC 테스트를 진행하였으며, CosLacto의 경우, 도 6에서 보듯이, 최대 8주에서 나타난 클리어존과 1주간 보관한 클리어존의 크기가 서로 같음을 확인할 수 있었다. 이것은 CosLacto가 화장품 원료로 적용되었을 때, 상온에서 보관되는 특성을 감안하면 화장품 원료로의 적용이 용이하다는 것을 나타낸다.

나. 온도별 안정성 테스트

(1) 브로스 테스트에 의한 살모넬라에 대한 CosLacto 의 온도별 안정성 차이

CosLacto의 온도별 안정성 테스트를 실험하기 위하여 CosLacto를 각 온도에서 2시간 동안 반응시켰다. 121℃ (15") 보관 CosLacto는 고압멸균기 (Autoclave)를 이용하였다. 이렇게 준비된 CosLacto의 살모넬라 유해균에 대한 항균력을 테스트하기 위하여, LB 배지에 접종 후 6시간 뒤, OD₆₀ 의 흡광도를 가지고 항균력을 측정했다. 그 결과, 도 7에서 보듯이, 모든 온도에서 CosLacto는 안정적으로 항균력을 나타냄을 확인할 수 있었다.

(2) 디퓨즈 테스트에 의한 마이크로코쿠스 레우투스( Micrococcus Leutus )에 대한 CosLacto의 온도별 안정성 차이

CosLacto의 온도별 안정성에 대한 테스트를 마이크로쿠크스 레우투스(Micrococcus Leutus) 이용하여 MIC 방식으로 다시 한 번 진행하였다. 각각의 샘플을 가지고 진행된 결과를 보면, 도 8에서 보듯이 상기 브로스 테스트와 같이 모든 온도에서 안정적으로 항균력이 나타남을 확인할 수 있었다. 실험의 모든 온도에서 항균력이 유지될 수 있음이 나타났고, 고압멸균을 시도하더라도 안정적으로 항균력이 나타났다. 이는 화장품 원료로써 어떠한 온도에서도 적용 가능한 원료로 개발 가능한 것을 나타낸다.

다. pH 별 안정성 테스트

(1) 브로스 테스트에 의한 살모넬라에 대한 CosLacto 의 pH 별 안정성 차이

CosLacto의 pH 변화별 안정성 테스트를 진행하기 위하여 2가지 방법으로 실험을 진행하였다. 첫 번째는 CosLacto의 pH를 1N NaOH를 이용하여 변화를 주었고, 다른 하나는 1M의 트리스(Tris)를 이용하여 pH 변화를 주었다.

실험 결과를 보면, 도 9에서 보는 바와 같이 1N NaOH에 의해 pH가 변화됨에 따라 항균력이 감소하는 것을 알 수 있었다. pH 5부터는 50%의 항균력이 감소하였고, 중성 pH에서는 항균력이 85%가 감소함을 확인할 수 있었다. 즉, pH의 변화에 따라 항균력이 완전히 소멸하지는 않고, 유해균의 성장을 저해할 수 있다는 것을 확인하였다. 1M의 트리스(Tris)를 이용하여 pH에 변화를 주었을 때도, 도 10에서 보는 바와 같이, 상기와 동일하게 pH 5부터는 항균력이 감소함을 보였다.

한편, pH 9와 pH 10에서는 항균력이 회복되는 결과를 얻었는데, 이것은 CosLacto에 의한 항균력이 아니라, 트리스(Tris)의 농도가 너무 높아 배양액의 삼투압이 유지될 수 없는 상황이라는 것으로 추측된다.

한편, 1N NaOH를 이용한 pH 변화에 따른 항균력의 소멸은 다시 산성 pH인 4로 변화를 주면 항균력이 다시 나타난다는 것을 확인할 수 있었다. 이것은 CosLacto의 항균물질은 pH의 영향을 받고, 산성 pH에서 그 효능이 최대로 나타난다는 것을 의미한다.

따라서, CosLacto의 항균력은 산성 pH 상에서 최대의 활성을 나타내고, 중성 pH에서는 완전히 소멸하지는 않지만, 상당히 항균력이 감소하고, 약 15%의 정도 항균력만 유지된다고 말할 수 있다.

(2) 디퓨즈 테스트에 의한 마이크로코쿠스 레우투스( Micrococcus Leutus )에 대한 CosLacto 의 pH 별 안정성 차이

위 결과에서 CosLacto의 pH별 안정성 테스트를 마이크로코쿠스(Micrococcus) 유해균을 이용하여 MIC 방법으로 다시 한번 측정하였다. MIC 방법으로 테스트하기 위하여 CosLacto는 1N NaOH로 pH 변화를 주었다. 그 결과는 도 11에 나타난 바와 같이, 브로스 테스트와 비슷하게 나타났다. CosLacto의 pH는 5부터 항균력이 감소함을 확인하였고, pH 7부터는 MIC 방식으로는 항균력이 나타나지 않는 것을 확인하였다.

라. 분해효소별 안정성 테스트

(1) 브로스 테스트에 의한 살모넬라에 대한 CosLacto 와 분해효소별 안정성 차이

CosLacto의 효소별 안정성을 테스트하기 위하여 CosLacto와 아밀라아제(Amylase), 키모트립신(Chymotrypsin), 리파아제(Lipase), 트립신(Trypsin), 프로테아제(Protease), 프로테아제(Protease) K 그리고 아미노펩티다아제(Aminopeptidase)를 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응을 시켰다. 이렇게 반응한 샘플에서 각각 효소의 활성을 불활성화시키기 위해서 65℃에서 20분간 불활성화시켰다. CosLacto는 온도에 안정적이기 때문에, 65℃ 효소 불활성화에 영향을 받지 않고 효소만 불활성화할 수 있었다.

실험 결과, 도 12에서 보는 바와 같이, CosLacto는 당을 분해하는 아밀라아제, 단백질을 분해하는 키모트립신, 프로테아제, 프로테아제 K, 아미노펩티다아제, 그리고 지질분해효소인 리파아제까지 모든 효소에서 안정함을 확인할 수 있었다.

이런 결과를 종합해 볼 때 CosLacto의 항균력을 나타내는 물질은 당, 지질, 단백질이 아닌 작은 크기의 분자이거나 혹은 3~4개의 아미노산으로 구성되어 있을 수 있다는 것을 예측할 수 있었다.

(2) 디퓨즈 테스트에 의한 마이크로코쿠스 레우투스( Micrococcus Leutus )에 대한 CosLacto의 분해효소별 안정성 차이

브로스 테스트외 다시 한번 효소별 안정성 테스트를 검증하기 위하여 마이크로코쿠스 유해균을 가지고 MIC 테스트를 진행하였다. 실험 결과, 도 13에서 보는 바와 같이, 브로스 테스트와 동일하게 모든 효소에 안정적으로 항균력을 유지함을 확인할 수 있었다. 즉, CosLacto는 단백질 분해효소, 당 분해효소, 그리고 지질 분해효소 처리에도 상당히 안정적인 물질임을 확인할 수 있었다.

마. 유기용매별 안정성 테스트

(1) 브로스 테스트에 의한 살모넬라에 대한 CosLacto 의 유기용매별 안정성 차이

CosLacto의 유기용매 안정성 테스트를 실험하기 위하여, M9 브로스와 CosLacto를 'Speed-Vacuum'을 이용하여 수분을 제거하였다. 이렇게 생성된 시료는 아세톤(Aceton), 부탄올(Butanol), 클로로포름(Chloroform), 에탄올(Ethanol), 이소프로판올(Isopropanol), 그리고 메탄올(Methanol)을 이용하여 완전 균질화를 시켰다. 균질화된 유기용매 시료는 다시 한 번 'Speed-Vacuum'을 이용하여 유기용매를 제거하고, 농축된 시료는 멸균 증류수에 녹여 유기용매 안정성 시료를 만들었다. 이렇게 만들어진 시료를 가지고 항균력 테스트를 진행한 결과, 도 14에서 보듯이 모든 유기용매에 대하여 안정성을 유지할 수 있다는 것을 확인하였다. 각각의 유기용매에 대해여 큰 차이는 없었고, 대조군인 M9 브로스를 가지고 실험한 결과, 유기용매 안정성 실험에서 유기용매의 제거가 덜 되어 나타난 결과가 아님을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 종합해 볼 때 CosLacto의 항균 물질은 온도와 여러 효소뿐만 아니라, 유기용매에 의해서도 그 구조가 변성되지 않고, 안정적으로 항균능력을 유지하는 물질이라 판단되었다.

(2) 디퓨즈 테스트에 의한 마이크로코쿠스 레우투스( Micrococcus Leutus )에 대한 CosLacto 의 유기용매별 안정성 차이

하기 표 4와 같은 조성에 대해 유기용매 안정성 테스트를 마이크로코쿠스 유해균을 이용하여 MIC 방법으로 다시 한 번 확인하였다.

	조 건		조 건
A B C D E F G H	M9 media M9 media + Aceton M9 media + Ethanol M9 media + Methanol M9 media + Butanol M9 media + Chloroform M9 media + Isopropanol M9 media + Hexanol	1 2 3 4 5 6 7 8	CosLacto CosLacto + Aceton CosLacto + Ethanol CosLacto + Methanol CosLacto + Butanol CosLacto + Chloroform CosLacto + Isopropanol CosLacto + Hexanol

그 결과는 도 15에서 보듯이, 브로스 테스트와 동일하게 모든 유기용매에서 CosLacto가 안정하다는 것을 다시 한 번 확인할 수 있었다.

[ 실시예 5: 유기용매를 이용한 CosLacto 추출 샘플의 제조]

1. 실험 방법

CosLacto는 'Speed-Vacuum'을 이용하여 수분을 제거하여 완전 농축을 시행하였다. 건조 농축된 CosLacto 시료는 아세톤, 부탄올, 클로로포름, 에탄올, 헥산올, 이소프로판올, 그리고 메탄올과 각각 혼합하여 완전 균질화를 시켰다. 유기용매와 혼합된 시료는 초고속 원심분리기(High speed Centrifuge)를 이용하여 유기용매에 녹은 층과 녹지 않은 층으로 분리하고, 1.2 ㎛ 주사기 필터를 이용하여 이 둘을 완전 분리하였다. 이때, 유기용매층은 다시 한 번 'Speed-Vacuum'을 이용하여 유기용매를 제거하고 생성된 시료는 멸균 증류수로 녹여 각각의 유기용매 추출물 샘플을 만든 후 항균능력을 측정하였다.

2. 실험 결과

가. 유기용매별 추출

(1) 브로스 테스트에 의한 CosLacto 유기용매 추출물의 항균력 비교

상기에서 수행한 유기용매별 안정성 실험으로부터 CosLacto는 유기용매에 안정함을 확인할 수 있었다. 이 안정성을 가지고 이번에는 유기용매 추출을 시도하였다. 추출방법으로 CosLacto를 'Speed-Vaccum'을 이용하여 완전건조 시료를 만들고, 유기용매를 이용하여 1일간 완전 균질화를 시켰다. 이 시료를 원심분리를 이용하여 유기용매 층과 유기용매에 녹지 않는 시료층으로 분리한 후 유기용매층만 수거하여 다시 한번 완전 농축을 시도하였다. 이렇게 유기용매에 추출된 시료는 마지막으로 멸균증류수를 이용하여 유기용매 추출용 시료를 만들었다.

실험 결과, 도 16에서 보는 바와 같이, 클로로포름을 제외한 나머지 유기용매에서 모두 추출이 가능함을 확인할 수 있었다.

(2) 디퓨즈 테스트에 의한 CosLacto 유기용매 추출물의 항균력 비교

CosLacto의 유기용매 추출 실험에서 추출 정도를 더욱 정확히 확인하기 위하여, 하기 표 5의 조건으로 마이크로코쿠스 균을 이용하여 MIC 테스트를 진행하였다. 클리어존의 크기를 이용 항균력를 비교하였다.

조 건
A : Butanol 추출 B : Chloroform 추출 C : Ethanol 추출 D : Hexanol E : Iso-propanol	1 : M9 Broth 2 : CosLacto 3 : Lactic acid

실험 결과, 도 17에서 보듯이 CosLacto의 유기용매 추출은 유기용매의 종류에 따라 추출 정도가 다르게 나타났다. 아세톤, 부탄올, 이소프로판올은 50~70%의 추출 정도를 보였지만, 에탄올과 메탄올은 100%의 추출 정도를 확인할 수 있었다. 그러나, M9 브로스의 헥산올 추출 클리어존은 항균물질에 의한 것이 아니라, 실험상 헥산올의 완전 제거가 이루어지지 않았기 때문에 나타난 결과로 판단된다. 또한, 젖산의 헥산올 추출에서도 M9 브로스에 비슷한 결과였지만, CosLacto에서는 클리어존의 크기가 상대적으로 크다는 것을 확인할 수 있었다. 이것은 젖산 외 다른 항균물질이 존재한다는 것을 뒷받침해주는 결과라 할 수 있다.

[ 실시예 6: CosLacto 의 피부 생리활성 테스트]

1. 실험방법

가. 동물세포배양

Hs68 세포는 DMEM, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 배지에서 CO₂ 배양기를 이용하여 배양하였다. A431 세포는 RPMI-1640, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 배지에서 CO₂ 배양기를 이용하여 배양하였다. B-161F1 세포는 DMEM, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 배지에서 CO₂ 배양기를 이용하여 배양하였다.

나. 피부세포 증식 실험

Hs68 세포와 A431 세포는 100mm 배양 접시(Culture dish)에서 배양 후, 1×트립신/EDTA를 이용하여 부유시키고, 5×10⁴개 세포로 96 웰 플레이트에 접종하였다. CosLacto를 전체 배지에 1%, 2.5%로 혼합하여 2일 동안 세포 증식시킨 후, 그 수를 헤마사이토미터(Hemacytometer)를 이용하여 측정하였다.

다. 피부세포의 ROS ( 활성산소종 ) 억제 실험

Hs68 세포는 DMEM, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 배지에, A431 세포는 RPMI-1640, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 배지에서 배양하였다. 피부세포의 주요 감염원인 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium Acne)를 CosLacto과 동일한 방법으로 확보하여, 세포에 0~10%(vol/vol)으로 10분간 처리함으로써 ROS를 유도하였다. 또한, 피부세포의 주요 ROS 유도체인 U.V.에 의한 ROS를 유도하였다. 이렇게 생성된 ROS가 CosLacto에 의해 억제되는지를 몰레쿨라 프로브(Molecular probe)사의 "Amplex Red hydrogen peroxide/peroxidase assay kit (Catalog No. A22188)"로 측정하였다.

라. CosLacto 의 미백기능성평가 - qPCR

A431 세포는 RPMI-1640 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신에 배양하였다. 세포는 12시간 동안 1% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지에 12시간 동안 적응시켰으며, 이 세포에 0~1%(vol/vol)로 CosLacto을 처리하여 24시간 뒤 프로콜라겐(procollagen)의 양을 'Quantitative Real-Time PCR(qPCR)'로 측정하였다. qPCR에 사용한 프라이머는 β-actin은 정방향 5'-GGA CCT GAC AGA CTA CCT CA-3', 역방향 5'-GTT GCC AAT AGT GAT GAC CT -3', 타입 I 프로콜라겐은 정방향 5'-CTC GAG GTG GAC ACC ACC CT-3', 역방향 5'-CAG CTG GAT GGC CAC ATC GG-3' 이었다.

마. CosLacto 의 미백기능성평가

(1) 시험관 내( In vitro ) 티로시나아제 활성 저해실험 1

머쉬룸 티로시나아제(Mushroom tyrosinase) (T3824), L-티로신(Tyrosin) (T3754)은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)사에서 구입하였다. 1mM L-티로신과 1000unit/mL 티로시나아제 그리고 CosLacto을 혼합한 후, 10분 뒤 OD₄₉₀에서 흡광도를 측정하였다. 티로시나아제의 저해율 계산법은 아래의 수학식 1과 같았다.

[수학식 1]

Tyrosinase 활성 저해율 (%) = (100 - (b-b')/(a-a'))×100

a: 공시료액의 반응 후의 흡광도

b: 시료액의 반응 후의 흡광도

a',b': 완충액으로 대체하여 측정한 흡광도

(2) 시험관 내( In vitro ) 티로시나아제 활성 저해실험 2

머쉬룸 티로시나아제 (T3824), L-도파(Dopa) (D9628)는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)사에서 구입하였다. 1mM L-도파와 1000unit/mL 티로시나아제 그리고 CosLacto와 혼합하여 반응시키고, 10분 뒤 OD₄₇₅ L-도파 산화활성 저해율을 측정하였다. 계산법은 아래의 수학식 2와 같았다.

[수학식 2]

L-Dopa 산화 활성 저해율 (%) = 100 - (a/b) X 100

a: 각 샘플에 대한 반응후 흡광도

b: 공 시료에 대한 반응후 흡광도

바. CosLacto 의 미백 기능성 평가

B-16 F1 세포는 DMEM, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 배지에서 배양을 하였다. 배양된 세포에 CosLacto를 넣어 24시간 동안 배양 처리하였다. 대조군으로 M9 최소 배지를 사용하였다. 배지를 제거한 세포는 PBS(phosphated buffer saline)으로 세척하고, 1×트립신/EDTA로 처리하여 세포를 회수하였다. 각 샘플당 1×10⁶개의 세포를 사용, 원심분리를 통해 펠렛(pellet)을 얻었다. 이 펠렛을 60℃에서 50분간 건조한 후 10% DMSO가 함유된 1N NaOH로 세포막을 녹여 60℃에서, 세포 내 멜라닌을 얻었다. 490nm에서 흡광도를 측정하여 세포 일정 수 당 멜라닌의 양을 구하였다.

2. 실험 결과

가. 피부세포 증식율 ( Hs68 , A431)

CosLacto의 항균능력 이외 화장품 원료로 기능성 기능을 탐색하기 위하여 피부세포에 CosLacto를 처리하여 세포증식실험을 진행하였다. 실험은 Hs68(Human newborn foreskin) 세포와 A431(epidermoid carcinoma)의 세포를 이용하여 진행하였다. 도 18에서는 Hs68 세포와 CosLacto를 섞어 배양을 한 결과를 보여주는데, 대조군으로 쓰인 M9 브로스에서는 세포의 성장을 볼 수 없었던 반면에, CosLacto는 Hs68 세포의 증식을 유도 할 수 있었다. 특히, 3 Day 배양 결과에서 Hs68세포가 대조군 대비 185% 증가했음을 확인하였다. 또한, 도 19에서 나타난 것처럼, A431 세포에서도 세포의 증식은 앞선 결과와 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 이를 통해 본 발명의 CosLacto가 항균력뿐만 아니라, 피부재생의 한 지표인 피부 세포증식에 효능을 있음을 확인할 수 있었다.

나. 피부세포 항산화 능력 ( Hs68 , A431)

(1) 여드름 균주에 대한 항산화 능력

피부세포 증식실험 외 피부자극에 대한 복구능력실험을 진행하기 위하여 ROS 제거능력 실험을 진행하였다. ROS 생성물질은 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)를 M9 브로스에서 배양한 배양액을 이용하였다. 먼저 Hs68 세포에 여드름 균주 배양액을 처리하여 ROS 생성을 유도할 수 있었다. 그 조건은 전체 배지에서 여드름 균주의 배양액의 증가에 따라 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다. 그 수치는 10% 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)의 배양액이 처리되었을 때 6배의 증가를 가져왔다. 이렇게 증가된 ROS 수준은 CosLacto에 의해 현저하게 감소함을 확인할 수 있었다. 도 20 및 21에서 보는 바와 같이, Hs68 세포에서는 CosLacto에 의해 35%감소, A431 세포에서는 60%의 감소를 유도하였다. 이 결과는 CosLacto가 항균력뿐만 아니라 여드름균에 의한 ROS 증가를 효율적으로 막을 수 있다는 결과를 의미한다. 즉, 여드름 균에 의해 자극받은 피부세포의 진정 효과(자극 완화 효과)를 기대할 수 있는 것이다.

(2) UV 에 의한 항산화 능력

피부자극에 다른 요소인 U.V.에 의한 ROS 제거 능력에 대한 실험을 진행하였다. U.V.는 피부에 가장 큰 자극제로 알려져 있다. U.V.의 의해 발생한 ROS의 제거 능력은, 도 22에서 보는 바와 같이, Hs68의 세포에 CosLacto를 처리하면 전체 배지의 0.1%부터 U.V.에 의해 발생한 ROS 수치를 획기적으로 낮출 수 있음을 확인할 수 있었다. 0.1% 농도의 CosLacto부터 2.5%까지의 CosLacto는 그 수치를 정상세포 수준까지 낮출 수 있는 것으로 확인되었다. 또한, 도 23에서 보는 바와 같이, CosLacto는 어느 한 가지 세포에서만 작용하는 것이 아니라, 여러 피부세포에서 그 효과가 비슷하게 나타남을 확인할 수 있었다. 그러나, A431 세포에서 효능을 보이는 CosLacto의 농도는 Hs68 세포에서 보다는 고농도의 CosLacto가 필요하였다.

즉, CosLacto의 기능은 여러 피부세포에 작용할 수 있으며, 여드름 균주에 의한 피부 진정 효과뿐만 아니라, 피부노화에 가장 큰 요인으로 지목되는 U.V.에 의한 ROS 수치도 현저하게 낮춤을 확인할 수 있었다.

다. CosLacto 의 주름개선 효능

CosLacto의 피부재생과 ROS 제거능력에 관한 실험 이외에 주름개선능력에 관한 실험을 진행하였다. 실험방법은 Real-Time PCR 기기를 이용하여 상대적 정량 PCR을(qPCR) 이용하여 CosLacto에 의한 콜라겐 양의 증감을 확인함으로써 수행되었다. 프로콜라겐(Procollagen)의 양은 주름개선의 가장 큰 지표로 쓰이고 있으며, 프로콜라겐이 증가되었다는 것은 피부주름을 개선 시킬 수 있는 주름개선제로 사용가능하다는 것을 의미한다.

A431 세포에 CosLacto를 농도별로 적용해 본 결과, 도 24에서 보는 바와 같이, 프로콜라겐의 양이 많이 증가하지 않는다는 것을 확인할 수 있었다. 세포에 0.05~1%까지의 CosLacto를 처리했을 때, 실험군에서 특별히 증가한 프로콜라겐을 찾아 볼 수가 없었다. 즉, CosLacto는 주름개선제로의 효능은 미비하다고 할 수 있었다.

라. CosLacto 의 미백개선 효능

(1) 티로신/티로시나아제 활성 저해능력

CosLacto의 미백개선 효능실험중 하나인 티로시나아제(Tyrosinase) 활성 저해능력 시험을 진행하였다. CosLacto의 대조군으로는 현재 미백효능물질로 알려져 있는 알부틴을 이용하였다. 실험은 시험관 내(in vitro) 효소 저해(enzyme inhibition) 방법을 이용하였고, 도 25에서 보는 것처럼 CosLacto는 티로시나아제의 활성 저해에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 확인하였다.

(2) L- 도파 /티로시나아제 저해능력

미백기능성 실험중 두 번째인 L-도파 산화 억제 실험을 진행하였다. 그 결과, 도 26에서 보듯이, 상기 트로시나아제 억제 실험과 크게 다르지 않게, 티로시나아제 억제 능력이 없는 것으로 확인되었다.

(3) 멜라닌 분해능력

티로시나아제의 활성 저해에 대한 능력은 CosLacto에 없는 것으로 확인되었고, 마지막으로 현재 세포에 생성된 멜라닌의 직접적인 분해가 가능한지에 관한 실험을 진행하였다. 실험방법은 멜라닌을 생성하는 B-16F1 세포에 CosLacto를 농도별로 처리했을 때, 멜라닌의 양을 측정하는 실험이었다. 실험 결과, 도 27에서 보는 것처럼, B-16F1 세포에 CosLacto가 10% 농도로 처리가 되었을 때, 대조군에 비해 멜라닌의 농도가 상당히 감소함을 확인할 수 있었다. 그 감소폭은 상당히 유의성 있는 50% 정도까지 감소함을 확인할 수 있었다. 결론적으로, CosLacto는 피부세포에서 색소침착을 줄이는 능력은 미미하지만, 생성되어 있는 멜라닌의 분해능력을 보유하고 있는 것으로 실험을 통하여 확인할 수 있었다.

[ 실시예 7: CosLacto 이용 시제품 테스트]

1. 실험방법

CosLacto을 포함하는 시제품을 생산하였다. 시제품은 토너, 크림, 세럼의 각기 다른 형태로 제조되었으며, 이렇게 생산된 CosLacto 함유 화장품을 대상으로 항균력 테스트를 포함한 천연방부제로의 효능을 측정하였다.

2. 실험결과

가. CosLacto 화장품 시제품

제조한 화장품 시제품은 도 28과 같았다.

나. 디퓨즈 테스트에 의한 CosLacto 함유 화장품 항균력 비교 실험

CosLacto를 이용하여 개발한 화장품 시제품의 항균능력을 하기 표 6과 같은 시료에 대해 측정하였다. 실험에 적용한 화장품은 총 3가지 종류로, 무방부제 화장품, CosLacto 함유 화장품, 현재 시중에 사용되는 0.3% 파라벤 함유 (Phenonip) 화장품이었다.

시 료	조 성
A	100㎕ 무방부제 화장품
B	100㎕ CosLacto 화장품 (토너 타입)
C	100㎕ 0.3% 방부제 함유 화장품 (Phenonip)

상기와 같이 만들어진 시제품의 항균능력은 마이크로코쿠스 균을 이용한 MIC 테스트 방법으로 측정하였다. 실험 결과, 도 29에서 보듯이, 무방부제 화장품은 클리어존이 나타나지 않았고, CosLacto 함유 화장품은 0.3% 파라벤 함유 화장품보다 클리어존이 크게 나타남을 확인할 수 있었다.

Claims (5)

1. 삭제
2. 삭제
3. 락토바실러스 플란타룸(Latobacillus plantarum)을 배양하는 단계; 상기의 배양 후, 얻어진 균체 배양액을 원심 분리하여 균체를 제거하고 상등액을 회수하는 단계; 상기에서 회수한 상등액을 여과하여 잔존 균체를 완전히 제거하는 단계;로부터 수득한 락토바실러스 플란타룸(Latobacillus plantarum) 배양액을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
   
4. 락토바실러스 플란타룸(Latobacillus plantarum)을 배양하는 단계; 상기의 배양 후, 얻어진 균체 배양액을 원심 분리하여 균체를 제거하고 상등액을 회수하는 단계; 상기에서 회수한 상등액을 여과하여 잔존 균체를 완전히 제거하는 단계;로부터 수득한 락토바실러스 플란타룸(Latobacillus plantarum) 배양액을 포함하는 것을 특징으로 하는 자외선에 의한 피부 노화 방지용 화장료 조성물.
   
5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
   상기 락토바실러스 플란타룸(Latobacillus plantarum) 배양액은 방부제 성분으로도 사용가능한 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.

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