KR101716777B1

KR101716777B1 - 페디오코커스 펜토사우스 dk1를 이용한 감 발효 추출물을 포함하는 항노화 및 항주름용 조성물

Info

Publication number: KR101716777B1
Application number: KR1020160044962A
Authority: KR
Inventors: 김혜진; 민진우; 주광식; 홍소영; 강희철
Original assignee: (주)지에프씨
Priority date: 2016-04-12
Filing date: 2016-04-12
Publication date: 2017-03-15

Abstract

본 발명은 감 또는 홍시의 발효 추출물을 포함하는 항산화 또는 주름의 예방 또는 개선용 화장료 조성물, 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 감 발효 추출물은 정상세포에 대한 독성이 없음과 동시에 자유라디칼 소거능이 우수하고, 엘라스타아제의 활성을 억제하여 항산화 또는 주름의 예방 또는 개선용 화장료 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

페디오코커스 펜토사우스 DK1를 이용한 감 발효 추출물을 포함하는 항노화 및 항주름용 조성물{Composition for antiaging and antiwrinkle which comprises extracts of fermented persimmon using Pediococcus pentosaceus DK1}

본 발명은 감 또는 홍시 추출물의 발효물을 포함하는 주름 또는 피부 노화의 예방 또는 개선용 약학 조성물, 화장료 조성물, 의약외품 조성물, 및 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 주름 또는 피부 노화의 예방 또는 개선 방법에 관한 것이다.

최근 의학수준이 발전함에 따라 수명이 연장되면서 노화를 지연시키려는 연구가 활발히 이루어지고 있다. 특히, 화장품 분야에서 가장 관심이 많은 분야로 피부의 노화 지연을 들 수 있는데, 피부주름 생성에 관한 생리학적, 유효성 연구가 활발히 전개되고 있다. 피부노화의 가장 큰 특성인 주름은 표피가 얇아지면서 각질층의 수분 함유량이 줄어들고 진피층 내의 탄력섬유인 엘라스틴의 감소로 인해 피부가 건조해지고 쳐짐으로써 발생하는 것으로 알려져 있다(백근애, 주름개선 화장품의 인식과 만족도에 관한 연구, 숙명여자대학교 원격대학원, 2015).

피부의 노화 또는 주름을 예방하기 위한 화장품에 대한 연구 결과로 적하수오 부정근 추출물을 함유하는 피부 주름개선 화장료 조성물(국내공개특허 제2015-0143375호), 딱총나무 및 으아리 추출물을 유효성분으로 함유하는 주름개선용 화장료 조성물(국내공개특허 제2015-0009266호) 등 다양한 조성물이 개발된 바 있다.

다만, 주름개선 화장품의 사용시 화장품에 대하여 만족하지 못한 이유로 '기대만큼 효과를 얻지 못하다'를 들고 있어, 우수한 주름 개선 또는 노화 방지 효과를 나타내는 화장료 조성물에 대한 개발 및 연구가 여전히 필요한 실정이다(홍성림, 주름개선 기능성 한방 화장품의 선호도와 구매행동에 관한 연구: 40~50대를 중심으로, 중앙대학교 석사학위논문, 2007).

이에, 본 발명자들은 인체에 무해하면서 피부 노화 또는 주름의 예방 또는 개선의 효과가 우수한 조성물을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 감 또는 홍시의 발효 추출물이 항산화 효과 및 주름의 예방 및 개선 효과가 우수함을 규명하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 감 또는 홍시 추출물의 발효물을 포함하는 주름 또는 피부 노화의 예방 또는 개선용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 감 또는 홍시 추출물의 발효물을 포함하는 주름 또는 피부 노화의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 감 또는 홍시 추출물의 발효물을 포함하는 주름 또는 피부 노화의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 감 또는 홍시 추추물의 발효물을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 노화의 예방 또는 개선 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 하나의 양태는, 감 또는 홍시 추출물의 발효물을 포함하는 주름 또는 피부 노화의 예방 또는 개선용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명자는 천연물 소재를 이용하여 주름 또는 피부 노화의 방지효과를 갖는 조성물을 개발하기 위해 노력한 결과, 감의 추출물의 발효물이 자유 라디칼 소거능이 우수하고, 엘라스타아제 억제 활성이 우수함을 규명하였다. 구체적으로, 본 발명의 출원인은 감의 추출물의 발효물 감의 추출물보다 주름 또는 피부 노화의 방지 효과가 현저히 우수함을 규명하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서 사용되는 용어, "감"은 감나무의 열매인 알칼리성 과일로서, 영어로 persimmon이라고도 하며, 포도당, 과당 등의 당질이 풍부하고, 떫은맛을 내는 탄닌산이 풍부하며, 비타민 C의 함량은 동량의 사과보다 약 5~20배 높고 무기질이 풍부한 과일이다.

본 발명에서 사용되는 용어, "홍시"는 생감의 떫은맛이 자연적 또는 인위적인 방법으로 제거되어 붉은색으로 말랑말랑하게 무르익은 상태의 감을 의미하며, 연시(紅枾) 또는 연감이라고도 한다. 홍시는 감의 색깔이 붉다는 측면에서 붙여진 명칭이고, 연시는 질감이 말랑말랑하고 부드럽다는 측면에서 붙여진 명칭이다. 홍시는 당업계에서 알려진 방법으로 제조하거나 상업적으로 구입할 수 있다.

본 발명에서 상기 발효물은 감 또는 홍시의 추출물을 발효한 것일 수 있다. 상기 감 또는 홍시의 추출물은 감 또는 홍시를 물(정제수), 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 추출하여 제조할 수 있다. 구체적으로 25 내지 120에서 1시간 내지 10시간 동안 냉침 추출, 열수 추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출, 초고압 추출 또는 가열 추출법으로 추출할 수 있으나, 주름 또는 피부 노화를 억제하는 효과를 가지는 물질을 추출하는 방법이라면 그 종류에 특별히 제한되지 않는다. 상기 추출과정을 거친 후, 여과, 감압농축 및 건조 과정을 순차적으로 거쳐 본 발명의 추출물을 제조할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않고, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들의 조정제물 또는 정제물을 모두 포함한다. 또한, 상기 감 또는 홍시의 추출물은 천연, 잡종, 변종 식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 감을 에탄올로 환류추출하여 감압여과하여 감압 농축한 뒤, 증류수를 가하여 균질하게 현탁시킨 후 동결 건조하여 분말 상태의 감 추출물을 제조하였다(실시예 1).

본 발명에서 사용되는 용어 "발효"는 미생물을 이용하여 유기물을 분해시키는 과정을 의미한다. 본 발명에서는 감 또는 홍시 추출물의 통상적인 발효에 사용 가능한 미생물로 발효시킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "발효물"은 상기 발효 과정을 통해 생성된 유용한 물질 자체뿐만 아니라, 발효 균주 및 발효물이 공존하는 발효 균주 배양 배지, 상기 배양 배지로부터 발효 균주를 원심분리하여 제거한 발효물, 상기 배양 배지로부터 발효 균주를 여과시킨 발효물, 상기 배양 배지로부터 발효 균주를 멸균처리하고 이를 여과시킨 발효물, 상기 발효물을 희석시킨 희석액, 상기 발효물을 건조시킨 건조물 등, 상기 발효 균주로부터 발생한 발효물을 포함하는 모든 종류의 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 유산균의 배양물을 감 추출물에 접종하여 배양한 후, 균체를 제거하고 감압 농축한 뒤, 증류수를 가하여 균질하게 현탁시킨 후 동결 건조하여 분말 상태의 감 추출물의 발효물을 제조하였다(실시예 2-2).

상기 발효는 유산균에 의한 발효일 수 있으며, 상기 유산균은 구체적으로는 페디오코커스 펜토사우스 DK1(Pediococcus pentosaceus DK1, 기탁번호: KCTC12963BP)일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 페디오코커스 펜토사우스 DK1(Pediococcus pentosaceus DK1, 기탁번호: KCTC12963BP)와 표준균주인 페디오코커스 펜토사우스(Pediococcus pentosaceus)의 탄닌분해 활성을 비교하였다. 그 결과, 페디오코커스 펜토사우스 DK1(Pediococcus pentosaceus DK1, 기탁번호: KCTC12963BP)의 탄닌 분해 활성이 우수함을 확인하였다(표 1). 따라서, 상기 균주의 우수한 탄닌 분해 활성은 감 또는 홍시의 탄닌을 분해시켜 저분자의 유용성분이 증대되는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

본 발명의 약학 조성물 중 감 또는 홍시의 추출물의 발효물은 약학 조성물의 총 중량 대비 0.0001 내지 10 중량% 포함하며, 구체적으로 0.0005 내지 5 중량%를 포함할 수 있다.

상기 함량이 0.0001 중량% 미만일 경우 본래 목적하는 활성을 충분하게 달성할 수 없어 바람직하지 못하며, 10 중량%를 초과하는 경우 증가하는 함량만큼 뚜렷한 효과의 증대가 기대되지 않아 비경제적일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "주름"은 피부가 쇠하여 생긴 잔줄을 의미하는데, 유전자에 의한 원인, 피부 진피에 존재하는 콜라겐의 감소, 외부 환경 등에 의해 유발될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "피부 노화"는 피부의 탄력 감소, 윤기 감소, 주름 생성, 재생력 약화 또는 심한 건조 등의 증상이 나타나는 것으로, 시간의 흐름 또는 외부 환경 등에 의해 유발될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 엘라스타아제(elastase)의 활성을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "엘라스타아제(elastase)"는 피부 탄력에 관여하는 엘라스틴의 가수분해 반응을 촉매하는 역할을 갖는 효소로서, 240 아미노산 잔기로 구성되어 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 감 추출물의 발효물이 자유라디칼 소거능이 우수하고(표 5, 및 도 2), 엘라스타아제의 억제 활성이 높게 나타남을 확인하였다(표 6, 및 도 3). 따라서, 본 발명의 감 또는 홍시 추출물의 발효물이 주름 및 피부 노화의 예방 또는 치료에 효과가 있음을 알 수 있었다.

본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명에 따른 감 또는 홍시 추출물의 발효물을 이용하여 주름 또는 피부 노화를 저해 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개선"은 본 발명에 따른 감 또는 홍시 추출물의 발효물을 이용하여 주름 또는 피부 노화의 증상을 억제 또는 저해하거나, 이미 나타난 주름 또는 피부 노화의 증상을 완화시키는 것을 말한다.

본 발명의 약학 조성물은 단일제제로도 사용할 수 있고, 주름 또는 피부 노화에 개선 효과를 가진다고 알려진 약물을 추가로 포함하여 복합제제로 제조하여 사용할 수 있으며, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

상기 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체, 부형제 또는 희석제를 의미할 수 있으며, 구체적으로, 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)일 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

구체적으로, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.

상기 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 감 또는 홍시 추출물의 발효물은 각각 1일 0.0001 내지 1000mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여할 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, 감 또는 홍시 추출물의 발효물을 포함하는 주름 또는 피부 노화의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "감", "홍시", "추출물", "발효", "주름", "피부 노화", "예방" 또는 "개선"은 상기에서 서술한 바와 같다.

본 발명의 화장료 조성물은 필요에 따라 일반 피부화장료에 배합되는 보통의 성분, 예를 들면, 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제 및 향료 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 성분을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기와 같은 본 발명의 화장료 조성물의 제형은 특별히 제한되지 않으며, 피부에 사용하는 것으로서, 유연화장수 (영양유액), 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 피부접착용 패취, 피부접착용 겔, 파우더, 연고, 서스펜션, 에멀젼, 스프레이 또는 미용액 등의 통상의 화장료 형태로 제조될 수 있으며, 이들 각 제형에 적합하고 당 업계에 주지된 각종의 통상적인 담체와 첨가제를 포함할 수 있다.

상기 영양화장수 및 영양크림은 본 발명의 유효성분 이외에 오일류(스쿠알란 등의 하이드로카본계 오일과 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드, 옥틸도데칸올 등의 에스터계 오일, 올리브오일 등의 내츄럴 오일, 디메치콘, 사이클로펜타실록산 등의 실리콘계 오일 등) 1 내지 20 중량% 및 왁스성분(세틸알코올, 스테아릴알코올, 베헤닐알코올, 밀납, 세레신, 시어버터 등) 1 내지 15 중량%를 함유하도록 제조할 수 있다. 상기 에센스는 본 발명의 유효성분 이외에 다가 알코올류 5 내지 30 중량%를 함유하도록 제조할 수 있다. 상기 마사지 크림은 본 발명의 발효물 이외에 미네랄오일, 이소노닐이소노나노에이트 등의 오일 30 내지 70 중량%를 함유하도록 제조할 수 있다. 상기 팩은 본 발명의 유효성분 이외에 폴리비닐알코올 5 내지 20 중량%를 함유하는 필 오프(peel off) 팩 또는 일반 유화형 화장료에 본 발명의 유효성분 이외에 카올린, 탈크, 산화아연, 이산화티탄 등의 안료가 5~40 중량% 함유된 워시오프(wash off) 팩으로 제조할 수 있다. 또한 상기 화장료 조성물은 화장품, 세제 및 섬유 등의 피부에 접촉하는 피부접촉물질로 제조할 수도 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, 감 또는 홍시 추출물의 발효물을 포함하는 주름 또는 피부 노화의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적을 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것을 의미한다. 또한, 감염형 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미할 수 있다. 또한 상기 의약외품은 개인위생용품을 포함할 수 있다. 상기 개인위생용품은 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 또는 연고제일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 구체적으로, 본 발명의 조성물에 있어서, 상기 의약외품은 피부 외용제일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용 할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, 감 또는 홍시 추출물의 발효물을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 주름 또는 피부 노화의 예방 또는 개선방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 약학 조성물이 주름 또는 피부 노화에 효과가 있는 특성상, 상기 조성물의 투여 경로는 피부에 도포하여 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물을 매일 투여 또는 간헐적으로 투여해도 좋고, 1일당 투여 횟수는 1회 또는 2~3회로 나누어 투여하는 것이 가능하다. 두 유효성분이 각각 단제인 경우의 투여횟수는 같은 횟수여도 좋고, 다른 횟수로 해도 된다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 주름 또는 피부 노화의 예방 또는 개선을 위하여 단독으로, 또는 다른 약물 치료와 병용하여 사용할 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에서 용어, "개체"는 주름 또는 피부 노화가 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 구체적으로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

본 발명에 따른 감 또는 홍시의 발효 추출물은 정상세포에 대한 독성이 없음과 동시에 DPPH 라디칼 소거능이 우수하고, 엘라스타아제의 활성 억제 효과가 우수하여 피부의 주름 또는 노화의 예방 또는 개선용 화장료 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 감 추출물, 페디오코커스 펜토사우스 DK1(Pediococcus pentosaceus DK1)의 배양물, 및 감 발효 추출물을 인간 각질 형성 세포(HaCat)에 처리시, 상기 세포의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 감 추출물, 페디오코커스 펜토사우스 DK1의 배양물, 및 감 발효 추출물의 자율 라디칼 소거 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 감 추출물, 페디오코커스 펜토사우스 DK1의 배양물, 및 감 발효 추출물의 엘라스타아제 활성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 감 추출물의 제조

세절한 감 4Kg을 70% 에탄올로 24시간 동안 환류추출하여 감압여과한 뒤, 여과액을 40℃의 수조에서 감압 농축하였다. 그 후, 농축된 농축물에 농축물의 총량의 10배의 증류수를 가하여 균질하게 현탁 시킨 뒤, 동결 건조하여 분말 상태의 감 추출물을 제조하였다.

실시예 2: 감 발효 추출물의 제조

실시예 2-1: 페디오코커스 펜토사우스 DK1의 배양물의 제조

페디오코커스 펜토사우스 DK1(Pediococcus pentosaceus DK1, 기탁번호: KCTC12963BP)을 MRS 배지에 접종한 후, 37에서 교반하면서 3일 동안 배양하였다. 상기 배양물을 9,000 rpm, 20분 동안 원심분리하여 균체를 제거한 다음, 필터 및 살균 과정을 거쳤다. 그 후, 40℃의 수조에서 감압 농축한 뒤, 농축된 농축물에 농축물의 총량의 10배의 증류수를 가하여 균질하게 현탁 시킨 다음, 동결 건조시켜 분말 상태의 DK1 배양물을 제조하였다.

실시예 2-2: 감 발효 추출물의 제조

감의 발효 추출물을 제조하기 위해, 상기 실시예 2-1에서 제조한 페디오코커스 펜토사우스 DK1 균주의 배양물을 상기 실시예 1에서 제조한 감 추출물에 접종하였다. 상기 균주의 생장을 원활하게 하고, 효소 활성도를 증가시키기 위하여 10 ml의 MRS 배지를 첨가하였다. 7일 동안 배양하여 제조한 발효 배양물을 9,000 rpm, 20분 동안 원심분리하여 균체를 제거한 다음, 필터 및 살균 과정을 거쳤다. 그 후, 40℃의 수조에서 감압 농축한 뒤, 농축된 농축물에 농축물의 총량의 10배의 증류수를 가하여 균질하게 현탁 시킨 다음, 동결 건조시켜 분말 상태의 감 발효 추출물을 제조하였다.

실시예 3: 페디오코커스 펜토사우스 DK1의 탄닌분해효소 활성 효과

상기 실시예 2-1의 페디오코커스 펜토사우스 DK1(Pediococcus pentosaceus DK1, 기탁번호: KCTC12963BP)의 탄닌 분해 활성을 확인하기 위해 표준 균주인 페디오코커스 펜토사우스 ATCC33314 (Pediococcus pentosaceus ATCC33314)와 탄닌 분해 활성을 비교하였다.

구체적으로, 분리 균주(DK1)와 표준 균주(ATCC33314)를 각각 10ml의 MRS 배지에 24시간 동안 전 배양한 뒤 100ml의 MRS 배지에 접종하였고, 이를 72일간 37℃에서 교반 배양하였다. 이후, 8,000rpm의 원심분리를 통하여 균체를 제거하고 이의 상등액만을 취하여 탄닌 효소 분해 활성의 시료로 사용하였다. 상기 상등액 시료 100 ㎕에 탄닌 기질 1mM을 첨가하고 10분간 반응시켰다. 흡광 광도계를 사용하여 310nm에서 흡광도를 측정하여 분해되는 탄닌의 양을 탄닌가수분해 활성으로서 측정하였다.

상기 활성은 30℃에서 탄닌산 기질의 뎁시드(depside) 결합의 가수분해에 근거하였으며, 흡광광도계를 이용하여 310nm에서 흡광도의 차를 측정하였다. 1 Tannase unit는 상기 조건 하에서 1 분당 1μmol 만큼의 뎁시드(depside) 결합된 탄닌산 기질을 가수분해시키는 효소의 양으로 정의하였다.

상기 실험 결과, 페디오코커스 펜토사우스 type strain 균주에 비해 페디오코커스 펜토사우스 DK1의 탄닌 가수분해 활성이 매우 우수함을 확인하였다(표 1). 구체적으로, 배양 후 1일차에서부터 페디오코커스 펜토사우스 DK1의 탄닌 가수분해 활성이 표준 균주에 비해 약 23배 이상 높게 나타남을 확인하였다. 나아가, 배양 후 7일차에서 탄닌 가수분해 활성이 30 unit 이상으로 가장 높게 나타남을 확인하였다.

	균주에 따른 탄닌 가수분해 활성 (unit)
배양기간	0 일	1 일	2 일	3 일	7 일	14 일
분리균주	0	3.52	8.92	11.54	30.41	19.4
표준균주	0	0.15	0.62	3.4	4.1	0.5

실시예 4: 감 발효 추출물의 총 페놀 함량 측정

실시예 2에서 제조된 감 발효 추출물 또는 실시예 1에서 제조된 감 추출물 100 ㎕에 2ml의 탄산나트륨(sodium carbonate)을 첨가하여 혼합하였다. 그 후, 2N Folin & Ciocalteu 페놀 시약(Sigma)을 첨가하여 상온에서 30분간 반응시킨 다음 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도의 측정시, 지표물질로는 (+)-카테킨 수화물((+)-catechin hydrate, Sigma)을 사용하였다.

그 결과, 감 추출물에 비해 감의 발효 추출물에서 총 페놀의 함량이 높게 나타남을 확인하였다(표 2).

시료	감 발효 추출물	감 추출물
총 페놀 함량(mg/g of extract)	23.96	15.48

실시예 5: 감 발효 추출물의 총 플라보노이드 함량 측정

실시예 2에서 제조된 감 발효 추출물 또는 실시예 1에서 제조된 감 추출물 200 ㎕에 각각 2ml의 디에틸렌글라이콜(diethylene glycol)을 첨가하여 혼합하였다. 그 후, 1N 수산화 나트륨(sodium hydroxide)을 200 ㎕만큼 첨가하여 37℃ 워터 배스(water bath)에서 1시간 동안 반응시킨 다음 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도의 측정시, 지표물질로는 나린진(naringin)을 사용하였다.

그 결과, 감 추출물에 비해 감의 발효 추출물에 총 플라보노이드의 함량이 높게 나타남을 확인하였다(표 3).

시료	감 발효 추출물	감 추출물
총 페놀 함량(mg/g of extract)	3.27	2.39

실시예 6: 감 발효 추출물의 세포 독성

감 발효 추출물의 세포 독성을 확인하기 위해, 인간 각질형성 세포(HaCat, ACTT, CLS 300493, USA)의 생존율을 확인하였다.

구체적으로, 헤마사이토미터(Hemacytometer)를 이용하여 상기 인간 각질형성 세포를 96 웰 플레이트에 1.5 x 10⁴cell/well씩 동일하게 계수하여 분주한 후, 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포 배양액을 제거하고, 0, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 및 100 ㎍/㎖ 농도의 실시예 2-2에서 제조된 감 발효 추출물, 실시예 2-1의 페디오코커스 펜토사우스 DK 1 배양액 및 실시예 1에서 제조된 감 추출물을 각각 1 ㎕를 취하여 DMEM 배지와 혼합한 뒤, 각 웰에 농도별로 처리하였다. 그 후, 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 배지는 제거하고, DMEM 배지와 혼합한 10% WST-1(high sensitive Water Soluble Tetrazolium salt) 시약을 각 웰에 처리한 뒤 동일한 조건에서 2시간 동안 더 배양하였다. 2시간 뒤, Multi-reader(Biotec, synergy)를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 증류수(Distilled water)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 한편, 세포생존율은 다음과 같이 구하였다;

세포생존율(%) = (실험군의 흡광도 / 대조군의 흡광도) X 100.

그 결과, 감 추출물, 페디오코커스 펜토사우스 DK1의 배양물, 및 감 발효물 모두 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다(표 4, 및 도 1). 특히, 감 발효 추출물의 경우 모든 농도 군에서 100% 이상의 세포 생존율을 나타냄을 확인하였다. 이를 통해, 감 발효 추출물이 화장료 조성물에 사용되더라도, 인체에 무해함을 확인하였다.

	세포생존율(%)
시료(㎍/㎖)	0	3.125	6.25	12.5	25	50	100
감 추출물	100	100.3	107.85	105.38	103.83	101.04	94.27
DK1 발효물	100	96.99	98.40	97.98	99.18	99.01	103.34
감 발효 추출물	100	103.95	100.95	104.95	102.29	103.14	100.35

실시예 7: 감 발효 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성

감 발효 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해, 감 발효 추출물의 DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 소거 활성을 측정하였다.

구체적으로 0, 1.56, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 및 100 ㎍/㎖ 농도의 실시예 2-2에서 제조된 감 발효 추출물, 실시예 2-1의 페디오코커스 펜토사우스 DK 1 배양액 및 실시예 1에서 제조된 감 추출물과 100μM DPPH (1,1-diphenyl -2-picrylhydrazyl) 용액 및 에탄올(ethanol)을 혼합하였다. 4℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 96 웰 플레이트에 접종하였다. DPPH 양을 Multi-reader(Biotec, synergy)를 이용하여 520nm에서 측정하였다. 대조군으로는 시료의 무처리 군을 사용하여 흡광도를 측정하였다. 한편, DPPH 소거 활성은 다음과 같이 구하였다;

자유라디칼 소거능(%) = 100-(시료를 처리한 군의 흡광도/시료를 처리하지 않은 군의 흡광도) X 100.

그 결과, 페디오코커스 펜토사우스 DK 1 배양액과 달리, 감 추출물 및 감 발효 추출물은 모든 농도 군에서 자유라디칼 소거능이 나타남을 확인하였다. 구체적으로, 감 추출물 및 감 발효 추출물 모두 농도 의존적으로 자유라디칼 소거능이 증가함을 확인하였다. 특히, 감 추출물에 비해 감 발효 추출물의 자유라디칼 소거능이 모든 농도 군에서 높게 나타남을 확인하였으며, 시료의 농도가 6.25 내지 25 ㎍/㎖ 인 경우, 소거능이 약 2배 이상 높게 나타남을 확인하였다(표 5, 및 도 2)

이를 통해, 감 추출물 및 감 발효 추출물 모두 항산화 활성을 나타내며, 특히, 감 발효 추출물이 감 추출물에 비해 항산화 활성이 우수함을 확인하여, 상기 감 발효 추출물이 피부의 노화를 방지할 수 있음을 확인하였다.

	자유라디칼 소거능(%)
시료(㎍/㎖)	0	1.56	3.125	6.25	12.5	25	50	100
감 추출물	0	0.42	1.42	2.56	5.68	10.23	20.17	34.38
DK1 발효물	0	0.04	0.09	0.08	0.14	1.14	1.16	2.24
감 발효 추출물	0	1.42	2.84	7.10	10.80	20.17	35.80	47.72

실시예 8: 감 발효 추출물의 엘라스타아제( elastase ) 억제 확성

감 발효 추출물의 주름개선 효과를 확인하기 위해, 감 발효 추출물의 엘라스타아제(Elastase) 활성의 억제 효과를 측정하였다.

구체적으로 0, 1.56, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 및 100 ㎍/㎖ 농도의 실시예 2-2에서 제조된 감 발효 추출물, 실시예 2-1의 페디오코커스 펜토사우스 DK 1 배양액 및 실시예 1에서 제조된 감 추출물 40 ㎕를 E-tube에 취하였다. 그 후, 10mM Tris-HCl buffer(pH8.0)에 녹인 1.6 mM 농도의 N-succinyl-(Ala)3-p- nitroanilide (S4760, Sigma) 200㎕를 가한 뒤, 10mM Tris-HCl buffer(pH8.0)에 녹인 0.4U/mL의 엘라스타아제(돼지의 췌장 타입에서 유래, E0258, Sigma) 효소를 40 ㎕ 첨가하여 25℃에서 5분 동안 반응시켰다. 엘라스타아제 저해 활성을 Multi-reader(Biotec, synergy)를 이용하여 410 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 엘라스타아제 효소를 처리하지 않은 군을 사용하여 흡광도를 측정하였다. 한편, 엘라스타아제 저해 활성은 다음과 같이 구하였다;

엘라스타아제 저해 활성(%) = 100-(시료를 처리한 군의 흡광도/시료를 처리하지 않은 군의 흡광도) X 100.

그 결과, 페디오코커스 펜토사우스 DK 1 배양액과 달리, 감 추출물 및 감 발효 추출물은 모든 농도 군에서 엘라스타아제 저해 활성이 나타남을 확인하였다. 구체적으로, 감 추출물 및 감 발효 추출물 모두 농도 의존적으로 엘라스타아제 저해 활성이 증가함을 확인하였다. 특히, 감 추출물에 비해 감 발효 추출물의 엘라스타아제 저해 활성이 3.125 ㎍/㎖ 이상의 농도 군에서 높게 나타남을 확인하였으며, 시료의 농도가 12.5 내지 25 ㎍/㎖ 인 경우, 엘라스타아제 억제 활성이 약 2배 이상 높게 나타남을 확인하였다(표 6, 및 도 3).

이를 통해, 감 추출물 및 감 발효 추출물 모두 주름개선 효과를 나타내며, 특히, 감 발효 추출물이 감 추출물에 비해 주름개선 효과가 우수함을 확인하였다.

	자유라디칼 소거능(%)
시료(㎍/㎖)	0	1.56	3.125	6.25	12.5	25	50	100
감 추출물	0	0	4.76	7.10	8.09	14.29	32.04	52.02
DK1 발효물	0	0	0	0.24	1.33	1.69	2.45	2.98
감 발효 추출물	0	0.49	3.15	8.54	17.12	28.98	50.62	70.27

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국생명공학연구원

KCTC12963BP

20151214

Claims

기탁번호 KCTC12963BP로 기탁된 페디오코커스 펜토사우스 DK1(Pediococcus pentosaceus DK1)에 의한 감 또는 홍시 추출물의 유산균 발효물을 포함하는, 주름 또는 피부 노화의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 및 이들의 혼합용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출하여 제조되는 것인, 화장료 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 발효물을 전체 조성물 대비 0.0001 내지 10 중량% 포함하는 것인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 엘라스타아제(elastase)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 것인, 화장료 조성물.
삭제
기탁번호 KCTC12963BP로 기탁된 페디오코커스 펜토사우스 DK1(Pediococcus pentosaceus DK1)에 의한 감 또는 홍시 추출물의 유산균 발효물을 포함하는, 주름 또는 피부 노화의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
제8항에 있어서, 상기 조성물은 피부 외용제인 것인, 의약외품 조성물.
기탁번호 KCTC12963BP로 기탁된 페디오코커스 펜토사우스 DK1(Pediococcus pentosaceus DK1)에 의한 감 또는 홍시 추출물의 유산균 발효물을 포함하는 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 주름 또는 피부 노화의 예방 또는 개선 방법.